CN107898778A - 杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用。所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。所述杨梅素抗甲型流感病毒中的作用机制是通过与PB2cap蛋白的结合抑制核糖核蛋白复合物vRNP活性，制备用于预防和治疗流感的药物。其中，杨梅素与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸(His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)，429位的天冬酰胺(Asn429)。

Description

杨梅素在制备抗流感病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及杨梅素在抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
流感病一直是人们关注的焦点，尤其是甲型流感病毒所引起的疫情严重威胁着人类的健康。历史上甲型流感病毒引起的流感大爆发已有数次，自1918-1919年爆发的“西班牙流感”席卷了世界各地，造成了上千万人的死亡病例，随后又爆发的“亚洲流感”、“香港流感”、“墨西哥流感”。由于甲型流感病毒的抗原易转变和漂移，流感的防治形势依然不容乐观。目前，流感的防治策略主要是流感疫苗的接种和抗流感药物的使用，虽然接种疫苗是抗甲型流感病毒最有效的途径之一，但在应对新出现的流感病毒株时，疫苗的研究和使用总滞后0.5～1年。科研人员目前也致力于通用疫苗的研究，但尚处于临床试验阶段，而且是否能应对新的流感病毒株仍有存疑。因此，抗甲型流感病毒药物的研究是最有效的措施。
临床上使用的抗流感药物可分为三类，经典的两类抗流感病毒药物：神经氨酸酶(NA)抑制剂和M2离子通道抑制剂，由于药物的耐药性和副作用限制了它们的使用。第三类是广谱的RNA聚合酶抑制剂，包括利巴韦林及法匹拉韦，目前未被广泛使用。由此可见，因此，急需寻找新的药物靶点，研究不同于现有药物作用机制的新型抗流感药物，对于流感的防治具有重要的意义。
甲型流感病毒属正粘科单股负链RNA病毒，由八个全基因组构成，至少编码13种以上蛋白，包括编码蛋白和非编码蛋白。由于甲型流感病毒的表面抗原易发生漂移和转变，人们将抗流感病毒药物的研究聚焦在可选位点多且不易突变的RNA聚合酶上。流感病毒的RNA聚合酶是由PA、PB1、PB2三个亚基构成，各自发挥着不同的功能。尤其PB2亚基上存在一个独立折叠的“帽子”(cap)结构域，其作用是在病毒进入宿主细胞后，利用这个帽子结构抢夺宿主的mRNA，用于流感病毒本身的转录起始。因此，PB2cap结构可作为潜在的药物靶点进行研究，从该靶点寻找新型抗流感病毒药物，可从源头上阻断病毒的复制。
我国物产资源丰富，对传统中药的使用由来已久，从天然单体中寻找低毒有效的抗流感病毒小分子化合物能有效的解决抗流感药物使用紧张的局势，也可为抗流感病毒药物的进一步研究奠定基础。杨梅素，是一类广泛存在于双子叶的黄酮类化合物，具有多重生物活性，在护肝、抗氧化、免疫调节、肿瘤、抗菌以及抗病毒等方面已有一定的研究进展，但在抗流感病毒方面的应用尚未见报道。本发明首次发现杨梅素具有抗甲型流感病毒的活性，能特异性地破坏PB2cap和宿主细胞帽状结构的相互结合，影响流感病毒的复制。不仅如此，杨梅素还具有一定抗炎作用，可以减少流感病毒感染导致的组织损伤，其有望成为一种新型的流感病毒先导化合物进行研发。
发明内容
本发明的目的在于从天然产物中发现一种新型的抗流感病毒抑制剂。所述的杨梅素，具有显著的抗甲型流感病毒的活性，可以作为新的抗流感病毒药物和先导化合物进行开发，具有广泛的应用前景。
所述杨梅素可抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2在宿主细胞中的复制。
所述杨梅素能够靶向流感病毒的PB2cap蛋白，从而抑制其与宿主细胞帽状结构的结合以及vRNP的活性，具有明显的抗病毒活性，可用于制备成新型的抗流感病毒药物。
所述杨梅素与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸(His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)，429位的天冬酰胺(Asn429)，可抑制vRNP活性与病毒复制，从而发挥抗病毒作用。
所述杨梅素可制成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。
上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1.杨梅素均能抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。
2.杨梅素对细胞的毒性较小，对MDCK细胞和A549细胞的CC50分别是749.4±12.3、355.3±7.2μM。杨梅素对甲型流感病毒H1N1和H3N2的IC50分为9.82±1.81，17.44±4.44μM，安全指数分别是76.3和43.4，可作为安全有效的抗流感病毒药物进行开发。
3.杨梅素作用于流感病毒PB2蛋白的帽子结合区域，能竞争性抑制PB2蛋白与宿主mRNA 5’端帽状结构的结合，阻止病毒的转录复制。
附图说明
图1杨梅素细胞毒性的检测。A.杨梅素对MDCK细胞的毒性；B.杨梅素对A549细胞的毒性。
图2杨梅素抗甲型流感病毒的活性。A.杨梅素对不同甲型流感病毒株的抑制活性；B.杨梅素抑制甲型流感病毒引起的细胞病变；C.杨梅素抑制甲型流感病毒引起的空斑形成。
图3杨梅素抑制流感病毒在细胞中的复制。A.杨梅素抑制流感病毒在MDCK细胞中NP蛋白的表达；B.杨梅素抑制流感病毒在MDCK细胞中NP蛋白的表达；C.杨梅素降低病毒在MDCK细胞中NP mRNA的表达水平。
图4杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。
图5杨梅素作用于流感病毒感染后阶段。
图6杨梅素抑制流感病毒的前期复制。
图7杨梅素能与PB2cap蛋白浓度依赖性结合。A.FP实验证明杨梅素能够与PB2cap蛋白浓度依赖性结合；C.SPR实验证明杨梅素与PB2cap蛋白有结合作用。
图8杨梅素对流感病毒vRNP的活性的影响。
图9杨梅素与PB2cap蛋白的分子对接。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合实验和结果对杨梅素在抗甲型流感病毒中的应用进一步说明。
本发明所用的材料1细胞与病毒
犬肾上皮细胞(MDCK细胞)、人肺癌上皮细胞(A549)和293T细胞在含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM或1640培养基进行培养。甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、H1N1FM-1和A/Aichi/2/68(H3N2)选择8-9天的鸡胚传代扩增，-80℃保存。质粒A/Thailand/Kan353/2004-HA、A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc用于H5N1假病毒的制备。其中pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并插入荧光素酶报告基因的一个重组质粒。pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP和pPolI-Flu以及hRluc-TK用于mini-replicon试验，其中pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP在细胞转染后形成RNP复合物。其中所有与活病毒相关试验是在生物安全2级或3级设施中进行。
实施例1杨梅素对细胞毒性的检测
杨梅素对细胞毒性的检测采用MTT法，从而确定药物的作用浓度。具体方法如下:
MDCK或A549细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层，用不含血清的DMEM或1640梯度稀释杨梅素后加入到96孔板中，每孔200μl，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/ml MTT的1640或DMEM培养基，37℃孵育4h。采用多功能酶标仪(Genios Pro,Tecan,US)检测570nm处吸光度。以细胞的存活率作为杨梅素对MDCK或A549细胞的毒性的指标。
细胞存活率(％)＝E/N×100
E为药物组的吸光度，N为细胞对照组的吸光度。
试验结果：杨梅素细胞毒性小，生物安全性高
结果如图1所示，杨梅素对两种细胞的毒性较小。本发明的实验研究中选用的药物浓度在100μM以内，是在安全无毒性浓度范围内。
实施例2杨梅素体外抗甲型流感病毒的活性检测
本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型流感病毒，包括H1N1和H3N2，具体方法如下：
MDCK细胞按2×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的PR8感染细胞，每孔100μl，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的杨梅素，每孔200μl，继续培养48h。结合MTT法和空斑实验，检测杨梅素的抗病毒活性。通过观察杨梅素抑制病毒引起的细胞病毒现象(CPE)和检测细胞的存活率，评价杨梅素对细胞的保护作用，并进一步计算半数有效浓度IC50。
试验结果：杨梅素可抑制流感病毒的感染。
试验结果：图2A表明，杨梅素对甲型流感病毒H1N1和H3N2有明显的抑制作用，且存在着明显的剂量关系。对H1N1和H3N2这两种毒株的半数有效浓度IC50分为9.82±1.81，17.44±4.44μM，选择性安全指数分别76.3和43.4(表1)。图2B所示，100TCID50的病毒液在感染细胞48h后能引起明显的细胞病变，杨梅素对细胞能产生保护作用。图2C表明，杨梅素能够浓度依赖性的抑制空斑的形成。
表1杨梅素对不同甲型流感病毒株的抑制活性
实施例3杨梅素对甲型流感病毒复制的抑制实验
为了评估杨梅素对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用间接免疫荧光法、Q-PCR以及Western blotting三种方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测杨梅素对病毒复制的影响。具体方法如下：
间接免疫荧光法：MDCK细胞按5×104/孔接种于48孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的PR8感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的杨梅素，每孔500μl，继续培养24h。此后，用4％的多聚甲醛固定20min后对NP蛋白和细胞核染色，随机选取多个视野拍下NP蛋白的表达情况；
Q-PCR及Western blot：MDCK细胞按4×105/孔接种于6孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的PR8感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的杨梅素，每孔1ml，继续培养24h后，用1mlTRIzol充分裂解细胞并提取总RNA，样品用于Q-PCR；或用70-80μl含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞并提取总蛋白，样品用于Western blot实验。
试验结果:杨梅素可抑制流感病毒在细胞中的复制
图3A和图3B是检测病毒NP在MDCK细胞中的表达情况。从结果可以看出，杨梅素能够显著地降低病毒NP蛋白的表达水平，且具有浓度依赖性。此外图3C是采用Q-PCR的方法检测病毒NP mRNA的表达情况，与病毒对照组比较，杨梅素能够抑制NP基因mRNA的表达量，且随着浓度的增加，抑制作用越明显。该结果与间接免疫荧光法以及Western blotting结果相一致。每个实验独立重复3次，用One-Way ANOVA的统计学分析方法进行分析。
实施例4杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。
本发明采用H5N1假病毒体系检测杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。H5N1假病毒体系是指用流感病毒包膜蛋白的A/Thailand/Kan353/2004-HA和A/Thailand/Kan353/2004-NA质粒以及HIV的核心蛋白pNL4-3R-E-Luc质粒共转染293T细胞，组装成的假病毒含有包膜蛋白血凝素HA，介导病毒的吸附入侵，且无病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成。具体方法如下：
MDCK细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至80～90％。将50μl倍比稀释的杨梅素与50μl的假病毒在37℃下孵育30min。30min后，将病毒与杨梅素的混合物共同加入到96孔板中，在37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养。48h后，弃培养上清，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入50μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min，接着吸取40μl 96孔板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入40μl的荧光素酶底物；用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。根据化学发光值的大小，判断杨梅素抑制病毒吸附进入的活性。
化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100
其中，E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC50)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。阳性对照药为CL-385319。
试验结果:杨梅素不影响流感病毒进入靶细胞。
为了研究杨梅素是否影响病毒的吸附入侵。从图4实验结果所示杨梅素不能抑制H5N1假病毒感染靶细胞，表明杨梅素不作用于流感病毒进入靶细胞的阶段。
实施例4杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。
为了确定杨梅素干扰流感病毒生命周期中的哪个阶段，我们采用不同的给药方式，包括感染前给药、感染后给药、全程给药进行研究。方法如下：MDCK细胞接种100TCID50的甲型流感病毒后，采用三种不同的加药方式，感染前给药(pre-treatment)指病毒与杨梅素孵育30min后再加入细胞感染1h，而后更换新鲜的不含杨梅素的维持液；感染后给药(postinfection)指病毒感染细胞后加入杨梅素；全程给药(entire treatment)指病毒、杨梅素与细胞共孵育1h后替换成新鲜的含杨梅素的维持液。病毒感染细胞48小时后，用上述1-3的方法检测杨梅素的抗病毒作用。
试验结果:杨梅素作用于流感病毒感染后的阶段。
图5表明杨梅素对病毒感染后的抑制率高于病毒感染前，表明了杨梅素主要作用于病毒感染后的阶段。
实施例6杨梅素对病毒转录复制的影响
为了确定杨梅素干扰病毒生命周期中的哪个阶段，本发明通过改变杨梅素作用方式和时间进行研究。具体方法如下：
在病毒单轮复制期间，按照病毒感染细胞后的时间间隔(0-1，1-3，3-5，5-8，8-10h)，加入含杨梅素的维持液于细胞中，其他时间加入不含化合物的维持液然后在病毒感染10h后，收集样品，采用Western blot检测病毒蛋白NP的表达。杨梅素加入细胞中的时间如图6所示。
试验结果:杨梅素作用于病毒的复制前期
病毒的单轮复制期间(0-10h)的不同时间间隔给药，杨梅素在1-3h能够明显得抑制流感病毒NP蛋白的表达，表明杨梅素作用于病毒的复制前期而发挥抗病毒的作用。
实施例7杨梅素能够竞争性地结合PB2cap
我们采用荧光能量偏振转移(FP)和表面等离子共振(SPR)测定了杨梅素与PB2cap蛋白的结合。
FP实验：将PB2cap蛋白与FITC-m7GTP的混合液加入到96孔黑板，每孔50μl中，室温下孵育30min；用缓冲液将杨梅素进行2倍倍比稀释后加入上述溶液，每孔50μl，室温下孵育1h；最后用多功能酶标仪测定荧光偏振值。
SPR实验：将待测杨梅素通过光交联仪器固定于3D光交联芯片上，室温点样；采用PlexArray HT生物分子相互作用分析仪室温下检测杨梅素与PB2cap蛋白的相互作用：PB2cap蛋白先用0.05％PBS-T(pH 7.0)稀释到250nM，500nM，1000nM，不同浓度的蛋白样品作为分析物以2μL·s-1的速度通过分析仪；结合时间为300s，解离时间为300s，选用甘氨酸盐酸(pH 2.0)作为重生液对芯片进行重生，流速为3μL·s-1；采用PlexeraDE软件对实验结果进行分析与处理，用origin 8.0软件进行作图。
试验结果:FP试验结果表明杨梅素能够竞争性地结合PB2cap，且呈浓度依赖性(图7A)。SPR试验进一步表明杨梅素能够与PB2cap蛋白结合，结合常数KD值为8.28×10-6mol/L(图7B)。
实施例8杨梅素对vRNP活性的影响
本实验采用反向遗传技术，将PB1、PB2、PA、NP四种构建的质粒在293T细胞进行共转染形成vRNP复合物，验证杨梅素是否通过抑制PB2cap的活性抑制RNP的活性。具体方法如下：
Mini-replicon实验:293T细胞以2×105个/孔接种于24孔板，待细胞长至90％左右，根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行质粒的转染。将25μl含有50ng pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP和pPolI-Flu以及10ng hRluc-TK的空白DMEM培养基加入到25μl含有1μg Lipofectamine 2000的空白DMEM培养基中，将形成的转染复合物加入到细胞培养上清中，继续培养5h，更换新鲜的含化合物以及10％FBS的DMEM培养液；继续培养24h后，弃培养上清，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测，具体的操作如下：每孔加入100μl的被动裂解液，振荡器后取20μl的细胞裂解液到96孔白色荧光素酶检测板中；每孔加入50μl的荧光素酶底物，立即用多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶的荧光值；每孔加入50μl配制好的终止反应液，立即用多功能酶标仪检测海肾萤光素酶的荧光值；RNA聚合酶的活性用萤火虫萤光素酶的荧光值与海肾萤光素酶的荧光值的比值来表示，根据比值计算出化合物对RNA聚合酶的抑制率：
抑制率(％)＝(RRNP-Fsample)/(FRNP-Fblank)×100％
试验结果:杨梅素影响流感病毒vRNP的活性
通过对病毒的PB1、PB2、PA以及NP四种蛋白转染293T细胞，本发明发现杨梅素能够抑制病毒vRNP的活性(图8)，且具有浓度依赖性。结合图7结果说明了杨梅素是通过与PB2cap蛋白的结合作用，抑制vRNP的活性，从而影响病毒的复制。
实施例9分子对接分析杨梅素与PB2cap蛋白的结合
本发明从Protein Data Bank上下载PB2cap蛋白(PDB编号：4CB4，分辨率：)。采用AutoDock软件模拟杨梅素与PB2cap蛋白的结合。进行分子对接前，先使用Dock Prep模块添加氢原子，分别为蛋白和配体分子添加AMBER ff4SB力场和AM1-BCC电荷。采用Chimera中的DMS工具以半径为的探针生成蛋白的分子表面，使用sphgen模块生成围绕活性位点的球状集合(Spheres)，使用Grid模块生成Grid文件，该文件用于快速的基于Grid的能量打分评价。然后采用DOCK6程序进行柔性对接，生成10000个不同的构象取向以及获得化合物与结合口袋中残基间的静电和范德华相互作用，并由此计算得到Grid打分。通过聚类分析(RMSD阈值为)，得到打分最佳的构象。最后，通过蛋白-配体相互作用在线分析工具Protein-Ligand Interaction Profier分析计算结果，并采用PyMOL生成图片(图9)。
试验结果:杨梅素通过与PB2cap结构中的保守型氨基酸残基的结合，影响vRNP的活性，抑制病毒的转录和复制。
结合以上的研究结果，杨梅素作用于病毒的复制前期，通过与PB2cap蛋白作用抑制流感病毒的复制。于是，本发明采用AutoDock软件模拟杨梅素与PB2cap蛋白的结合。结果如图9所示，杨梅素分子与PB2cap蛋白的结合位点分别是357位的组氨酸(His357)、404位的苯丙氨酸(Phe404)、323位的苯丙氨酸(Phe323)、361位的谷氨酸(Glu361)、376位的赖氨酸(Lys376)形363位的苯丙氨酸(Phe363)以及429位的天冬酰胺(Asn429)，经由分析，所结合的氨基酸残基中大多是高保守的，如表2所示。
表2杨梅素与PB2cap结合位点的保守性分析
综合以上所述的结果，杨梅素具有抗甲型流感病毒的作用，其作用机制是杨梅素与PB2cap蛋白的结合从而抑制RNA聚合酶的活性，从而影响流感病毒的复制。因此，杨梅素作为新的抗流感病毒药物和先导化合物，具有毒性低、活性高、价廉易得、机制明确的特点，具有很好的应用前景。

Claims (6)

1.一种式I所示化合物在制备抗流感病毒药物中的应用
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型流感病毒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。
4.式I所示化合物在制备抑制甲型流感病毒复制前期的药物中的应用。
5.式I所示化合物在制备抑制甲型流感病毒在靶细胞复制的药物中的应用。
6.式I所示化合物在制备能与PB2cap蛋白结合抑制与宿主细胞帽状结构的结合以及vRNP的活性的药物。
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