CN107898783A

CN107898783A - 1，3‑二羟基‑6‑苯并[c]色烯酮在制备抗流感病毒药物中的应用

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Publication number: CN107898783A
Application number: CN201711135461.XA
Authority: CN
Inventors: 杨洁; 刘叔文; 刘腾
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN107898783B

Abstract

本发明公开了1，3‑二羟基‑6‑苯并[c]色烯酮在制备抗流感病毒药物中的应用。所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。所述1，3‑二羟基‑6‑苯并[c]色烯酮抗甲型流感病毒中的作用机制是通过与PB2cap蛋白的结合抑制核糖核蛋白复合物vRNP活性，制备用于预防和治疗流感的药物。其中，1，3‑二羟基‑6‑苯并[c]色烯酮与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸(His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)，429位的天冬酰胺(Asn429)。

Description

1，3-二羟基-6-苯并[C]色烯酮在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及1，3-二羟基-6-苯并[C]色烯酮在抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种亚型。最近，爆发的高致病性H5N1禽流感对人类和动物均造成严重威胁，其致死率高达60％。2013年，中国报道了一种新型的重组禽流感病毒亚型继续威胁着人类生命。此外，在过去的两年里，其他的重组禽流感病毒不断出现，这表明我们在未来预防流感病毒感染方面将面临无法预测的情况。目前，由于抗病毒药物抵抗和疫苗脱逃，特别是高致病性流感病毒，致使针对流感感染的有效治疗药物仍然不足。因此，迫切需要开发新的抗病毒方法。

目前临床上使用的抗流感病毒药物主要有三类：1)M2离子通道抑制剂，包括金刚烷胺和金刚烷乙胺；2)神经氨酸酶抑制剂，包括奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦；3)RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，法匹拉韦。然而，甲型流感病毒的不断演变和极速的耐药性，尤其是对金刚烷胺和奥司他韦，限制了这两类药物的使用。法匹拉韦是一种RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，为广谱抗病毒药物，目前只在日本以抗流感病毒药物上市，未被广泛使用。因此，研究新型的抗流感病毒药物控制禽流感或人类大流行的甲型流感成为了人类亟待解决的问题。

近年来，流感病毒PB2蛋白因其高度的保守性已成为抗流感病毒药物研究和开发的新靶标，设计和开发相应的抑制剂，成为抗流感药物研究的一个新方向。 PB2蛋白是RNA聚合酶复合体的一个重要组成部分。PB2蛋白由759个氨基酸组成，具有RNA聚合酶活性，能与PB1结合，并能识别宿主细胞的mRNA 5’端的帽状结构。同时其C端的核定位信号能与不同的α输入蛋白结合帮助vRNP 被主动运送至细胞核内，进行病毒基因组的转录和复制。然后，通过N端含有的PB1结合的区域，有助于将PB1和PA二聚体滞留在细胞核。

此外，在甲型流感病毒聚合酶PB2亚基上，保守的氨基酸残基318–483是一个独立折叠的帽结合域(PB2cap)，其具有对其他宿主细胞帽状结构的明显结合。这是一种独特的被称作“cap-snatching”的机制，能允许流感病毒欺骗它的宿主细胞来产生病毒蛋白。在人细胞中，mRNA链翻译成蛋白需要一种被称作“帽子(cap)”的特殊结构，其中这种帽子结构位于每个mRNA的始端。当流感病毒感染宿主细胞时，PB2cap结构域抢夺来自宿主细胞的mRNA上的帽子结构。流感病毒RNA聚合酶的另一部分然后利用它作为合成病毒mRNA的起点。利用起始处正确的帽子结构，病毒mRNA然后能够劫持靶细胞的蛋白产生装置来制造病毒蛋白，接着这些病毒蛋白组装到新的病毒当中从而继续扩散病毒感染。PB2蛋白这种的多功能性使其成为一个潜在的药物作用靶点，而针对PB2 蛋白功能区的抗流感病毒药物将会阻断流感病毒在宿主中的有效复制。

1，3-二羟基-6-苯并[C]色烯酮，简称为化合物J2，在抗流感病毒方面的应用未见报道。本发明首次发现化合物J2具有抗甲型流感病毒的用途，实验结果表明化合物J2能特异性地破坏PB2cap和宿主细胞帽状结构的相互结合，影响病毒的复制，其有望成为一种新型的流感病毒抑制剂。因此，1，3-二羟基-6-苯并[C] 色烯酮有开发成抗流感病毒药物的前景。

发明内容

本发明的目的在于针对临床上治疗流感病毒药物不足而提供一种新型的抗流感病毒抑制剂。所述的1，3-二羟基-6-苯并[C]色烯酮，简称为化合物J2，具有显著的抗甲型流感病毒的活性，可以作为新的抗流感病毒药物进行开发，具有广泛的应用前景。

所述化合物J2可抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2在宿主细胞中的复制。

所述化合物J2能够靶向流感病毒的PB2cap蛋白，从而抑制与宿主细胞帽状结构的结合以及vRNP的活性，具有明显的抗病毒活性，可用于制备成抗流感的药物。

所述化合物J2与流感病毒PB2cap蛋白结合的位点为357位的组氨酸 (His357)，404位的苯丙氨酸(Phe404)，323位的苯丙氨酸(Phe323)，361 位的谷氨酸(Glu361)，376位的赖氨酸(Lys376)，363位的苯丙氨酸(Phe363)， 429位的天冬酰胺(Asn429)，可抑制vRNP活性与病毒复制，从而发挥抗病毒作用。

所述化合物J2可制成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.化合物J2均能抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。

2.化合物J2对细胞的毒性较小，对MDCK细胞和A549细胞的 CC50 200μM。1，3-二羟基-6-苯并[C]色烯酮对甲型流感病毒H1N1和 H3N2的IC₅₀分为1.702±0.021，4.300±1.103μM，安全指数分别大于 117.5和46.5，可作为安全有效的抗流感病毒药物开发。

3.化合物J2作用于流感病毒PB2蛋白的帽子结合区域，能竞争性抑制PB2 蛋白与宿主mRNA 5’端帽状结构的结合，阻止病毒的转录复制。

附图说明

图1化合物J2细胞毒性检测。A.化合物J2对MDCK细胞的毒性；B.化合物J2对A549细胞的毒性。

图2化合物J2抗甲型流感病毒的活性。A.化合物J2对H1N1和H3N2的抑制活性；B.化合物J2抑制甲型流感病毒引起的CPE；C.化合物J2抑制甲型流感病毒引起的空斑形成。

图3化合物J2抑制流感病毒在细胞中的复制。A.化合物J2降低病毒在 A549细胞中NP蛋白的表达；B.化合物J2降低病毒在MDCK细胞中NP蛋白 mRNA的表达；C.化合物J2降低病毒在MDCK细胞中HA mRNA的表达。

图4化合物J2对病毒吸附入侵的影响。A.化合物J2对H5N1假病毒感染的抑制活性；B.阳性对照化合物CL-385319对H5N1假病毒感染的抑制活性。

图5化合物J2对子代病毒释放的影响。A.化合物J2对神经氨酸酶的抑制活性。B.扎那米韦对神经氨酸酶的抑制活性。

图6化合物J2抑制病毒的前期复制。A.三种不同的加药方式下，化合物J2 的抗病毒活性；B.化合物J2对病毒单轮复制NP蛋白表达的影响；C.化合物J2 对病毒单轮复制HAmRNA复制的影响。

图7化合物J2能与PB2cap蛋白结合抑制病毒vRNP的复制。A.化合物J2 对vRNP的活性的影响；B.化合物J2与PB2cap蛋白的结合能力；C.化合物J2 竞争与PB2cap蛋白结合的作用。

图8化合物J2与PB2cap蛋白的分子对接。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合实验和结果对化合物J2在抗甲型流感病毒中的应用进一步说明。

本发明所用的材料1细胞与病毒

犬肾上皮细胞(MDCK细胞)、人肺癌上皮细胞(A549)和293T细胞生长于含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM或1640培养基。甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、H1N1FM_1和A/Aichi/2/68(H3N2)经本实验室SPF 鸡胚传代扩增，-80℃保存。质粒A/Thailand/Kan353/2004-HA、 A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc用于H5N1假病毒的制备。其中 pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并插入荧光素酶报告基因的一个重组质粒。所有与活病毒相关试验是在生物安全2 级或3级设施中进行。

实施例1化合物J2的细胞毒性检测

化合物J2对细胞毒性的检测采用MTT法。具体方法如下:

MDCK或A549细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层，将DMEM或1640梯度稀释的化合物J2加入到96 孔板中，每孔200μl，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/ml MTT的1640或DMEM培养基，37℃孵育4h。采用多功能酶标仪(Genios Pro, Tecan,US)检测570nm处吸光度。以细胞的存活率作为化合物J2对MDCK或 A549细胞的毒性的指标。

细胞存活率(％)＝E/N×100

E为药物组的吸光度，N为细胞对照组的吸光度。

试验结果：化合物J2细胞毒性小，生物安全性高

结果如图1所示，化合物J2对细胞的毒性较小，在200μM的浓度范围内对 MDCK细胞和A549细胞几乎没有毒性，其CC50>200μM。本发明的实验研究中选用的药物浓度在40μM以内，是在安全无毒性浓度范围内。

实施例2化合物J2体外抗甲型流感病毒的活性检测

本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型流感病毒，包括H1N1和 H3N2，具体方法如下：

MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID₅₀的甲型流感病毒感染细胞，每孔100μl，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的化合物J2，每孔200μl，继续培养48h。结合MTT法和空斑实验，检测化合物J2的抗病毒活性。通过观察化合物J2抑制病毒引起的细胞病毒现象(CPE)和检测细胞的存活率，评价化合物J2对细胞的保护作用，并进一步计算半数有效浓度IC₅₀。利巴韦林(ribavirin)作阳性对照。

试验结果：化合物J2可抑制流感病毒的感染

图2A表明，化合物J2对甲型流感病毒H1N1和H3N2有明显的抑制作用，且存在着明显的剂量关系。化合物J2对病毒的抑制率随着浓度的增加而增加，对H1N1和H3N2的半数有效浓度IC₅₀分为1.702±0.021μM和4.300±1.103μM，选择性安全指数分别大于117.5和46.5(表1)。同时，观察化合物J2对病毒引起的细胞病毒现象(CPE)的抑制效应。结果如图2B和2C所示，100TCID₅₀的病毒液在感染细胞24h后能引起明显的细胞病变并形成空斑，而20μM的化合物J2能够抑制病毒所导致的病变效应，且可减少空斑的形成，并具有浓度依赖性。结果与阳性化合物利巴韦林相一致。

表1化合物J2抗甲型流感病毒活性

实施例3化合物J2对甲型流感病毒复制的抑制实验

为了评价化合物J2对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用间接免疫荧光法、Q-PCR以及Western blotting三种方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测化合物J2对病毒复制的影响。具体方法如下：

MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于6孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID₅₀的甲型流感病毒感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的化合物J2，每孔2ml，继续培养24h。此后，用4％的多聚甲醛固定20min后对NP蛋白和细胞核染色，随机选取3个视野拍下NP蛋白的表达情况；而用1mlTRIzol充分裂解细胞并提取总RNA，样品用于Q-PCR；或用70μl含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞并提取总蛋白，样品用于Western blotting实验。

试验结果:化合物J2可抑制流感病毒在细胞中的复制

为了评价化合物J2对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用间接免疫荧光法、Q-PCR以及Western blotting三种方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测化合物J2对病毒复制的影响。图3A和图3B是检测病毒NP在MDCK细胞中的表达情况。从结果可以看出，化合物J2能够显著地降低病毒NP蛋白和基因 mRNA的表达量，且抑制效果具有浓度的依赖性。此外图3C是采用Q-PCR的方法检测病毒HA基因的表达情况，与病毒对照组比较，化合物J2能够抑制HA 基因mRNA的表达量，且随着浓度的增加，抑制作用越明显。该结果与间接免疫荧光法以及Western blotting结果相一致。每个实验独立重复3次，用One-Way ANOVA的统计学分析方法进行分析。

实施例4化合物J2对病毒吸附入侵宿主细胞和子代病毒释放的影响

本发明采用H5N1假病毒体系检测化合物J2对病毒吸附入侵宿主细胞的影响。H5N1假病毒体系是指用A/Thailand/Kan353/2004-HA、 A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc三个质粒共转染293T细胞，组装成的假病毒含有包膜蛋白血凝素HA，介导病毒的吸附入侵，且无病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成。具体方法如下：

MDCK细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养至80～90％。将50μl 2倍倍比稀释的化合物J2与50μl假病毒在37℃下孵育30min。30min后，将病毒与化合物J2的混合物共同加入到96孔板中，在37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养。48h后，弃培养上清，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入50μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min，接着吸取40μl 96孔板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入40μl的荧光素酶底物；用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。根据化学发光值的大小，判断化合物J2抑制病毒吸附进入的活性。

化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100

其中，E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。阳性对照药为CL-385319。

同时，为了检测化合物J2对子代病毒的释放，本发明采用神经氨酸酶的抑制实验。原理：底物4-methylumbelliferyl-N-acetyba-D-neuraminicacid (4-MUNANA)可被流感病毒包膜蛋白神经氨酸酶NA催化产生荧光物质。此荧光物质的最大激发波长为340nm，最大发射波长为440nm。采用多功能酶标仪测定该荧光即可实现化合物J2对神经氨酸酶抑制作用的检测。具体方法如下：

在96孔荧光酶标板内每孔加入15μl病毒液和5μl 2倍倍比稀释的化合物 J2的混合液，37℃孵育30min，然后每孔加入30μl 20μM 4-MUNANA，稀释液为32.5mM MES，4mMCaCl₂，pH＝6.5。于微孔板振荡器上振动1min，37℃避光孵育1h。其中扎那米韦(zanamivir)作为阳性对照。最后用多功能酶标仪测定荧光值，计算出抑制率。

抑制率(％)＝(F_NA-F_sam)/(F_NA-F_bla)×100％

试验结果:化合物J2不作用于病毒的吸附入侵和子代病毒的释放

为了研究化合物J2的抗病毒作用机制，本发明首先检测化合物J2是否影响病毒的吸附入侵和子代病毒的释放。H5N1假病毒检测体系采用实验室合成的阳性化合物CL-385319，神经氨酸酶抑制实验采用扎那米韦作阳性对照。从图4 H5N1假病毒感染抑制实验和图5神经氨酸酶抑制实验的结果可以看出，化合物J2不能抑制假病毒H5N1感染细胞，也不能抑制病毒包膜蛋白神经氨酸酶的活性，表明了化合物J2既不影响流感病毒对宿主细胞的吸附入侵，也不能阻止子代病毒的释放。

实施例5化合物J2对病毒转录复制的影响

为了确定化合物J2干扰病毒生命周期中的哪个阶段，本发明通过改变化合物J2作用方式和时间进行研究。具体方法如下：

MDCK细胞接种100TCID₅₀的甲型流感病毒后，采用三种不同的加药方式，即化合物J2在病毒进入细胞前(pre-treatment)、病毒感染细胞1h后(post infection)、病毒感染的整个过程(entire treatment)。具体为：pre-treatment指病毒与化合物J2孵育后加入细胞感染1h，而后更换新鲜的不含化合物J2的培养基；post infection指病毒感染细胞后加入化合物J2；entire treatment指病毒、化合物J2与细胞共孵育1h后替换成新鲜的含化合物J2的培养基。病毒感染细胞48小时后，用上述1.3的方法检测化合物J2抗病毒作用。

另外，在病毒单轮复制期间，化合物J2按照病毒感染细胞后的时间间隔 (0-2，2-5，5-8，8-10，0-10h)，加入到细胞中，然后在病毒感染10h后，利用Western blotting技术和Q-PCR检测细胞内病毒蛋白和mRNA的表达量。化合物J2加入细胞中的时间如图1所示。

试验结果:化合物J2作用于病毒的复制前期

为了确定化合物J2作用于病毒生命周期的哪个阶段，本发明采用多种加药方式进行研究。通过pre-treatment、post infection和entire treatment三种不同的加药方式，本发明发现化合物J2作用于病毒感染细胞进入之后(图6A)。随后，在病毒的单轮复制期间的不同时间间隔给药(图6B和6C)，化合物J2在 0-2h和2-5h能够明显得抑制流感病毒NP蛋白和HA的mRNA表达，表明化合物J2作用于病毒的复制前期而发挥抗病毒的作用，而对病毒的吸附、进入和子代病毒的释放无明显抑制活性。

实施例6化合物J2对vRNP活性的影响

vRNP复合体包含RNA聚合酶(PB1、PB2、PA)和NP蛋白，在流感病毒完成后期复制之后，NP蛋白与病毒的RNA及多聚酶结合形成vRNP，协助vRNP 出核，而后在M1的引导下被运送到出芽部位与HA、NA和M2一起装配成成熟的子代病毒粒子以出芽方式释放到细胞外，完成病毒的整个生命周期。为了确定化合物J2的作用靶点与病毒蛋白中的哪一个或者哪几个有关，本发明采用 Mini-replicon实验、表面等离子共振(SPR)技术检测以及荧光偏振(FP)的方法进行研究。具体方法如下：

Mini-replicon实验:293T细胞以2×10⁵个/孔接种于24孔板，待细胞长至90％左右，根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行质粒的转染。将25μl含有 50ng pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP和pPolI-Flu以及 10ng hRluc-TK的空白DMEM培养基加入到25μl含有1μg Lipofectamine 2000 的空白DMEM培养基中，将形成的转染复合物加入到细胞培养上清中，继续培养5h，更换新鲜的含化合物以及10％FBS的DMEM培养液；继续培养24h后，弃培养上清，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测，具体的操作如下：每孔加入100μl的被动裂解液，振荡器后取20μl的细胞裂解液到96 孔白色荧光素酶检测板中；每孔加入50μl的荧光素酶底物，立即用多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶的荧光值；每孔加入50μl配制好的终止反应液，立即用多功能酶标仪检测海肾萤光素酶的荧光值；RNA聚合酶的活性用萤火虫萤光素酶的荧光值与海肾萤光素酶的荧光值的比值来表示，根据比值计算出化合物对RNA聚合酶的抑制率：

抑制率(％)＝(RRNP-Fsample)/(FRNP-Fblank)×100％

SPR实验：将待测化合物J2通过光交联仪器固定于3D光交联芯片上，室温点样；采用PlexArray HT生物分子相互作用分析仪室温下检测化合物J2与 PB2cap蛋白的相互作用：PB2cap蛋白先用0.05％PBS-T(pH 7.0)稀释到250nM， 500nM，1000nM，不同浓度的蛋白样品作为分析物以2μL·s^-1的速度通过分析仪；结合时间为300s，解离时间为300s，选用甘氨酸盐酸(pH 2.0)作为重生液对芯片进行重生，流速为3μL·s^-1；采用PlexeraDE软件对实验结果进行分析与处理，用origin 8.0软件进行作图。

FP实验：将PB2cap蛋白与FITC-m⁷GTP吹打混匀，每孔50μl加入96孔黑板中，室温下孵育30min；用缓冲液将化合物J2进行2倍倍比稀释后加入上述溶液，每孔50μl，室温下振荡混匀30min；最后用多功能酶标仪测定荧光偏振值。

试验结果:化合物J2能够与PB2cap蛋白结合抑制病毒vRNP的活性

为了确定化合物J2作用于甲型流感病毒的靶点，本发明采用Mini-replicon 实验、SPR技术以及FP技术检测化合物J2与病毒蛋白的作用。通过对病毒的PB1、PB2、PA以及NP四种蛋白转染293T细胞，本发明发现化合物J2能够抑制病毒vRNP的活性(图7A)，且具有浓度依赖性。随后采用SPR和FP技术检测化合物J2与PB2cap蛋白的结合，结果显示化合物J2与PB2cap蛋白的结合具有浓度依赖性，K_D值为1.18×10^-7(Mol/L)(图7B和7C)。这说明了化合物J2 是通过与PB2cap蛋白的结合作用，抑制vRNP的活性，从而影响病毒的复制。

实施例7分子对接分析化合物J2与PB2cap蛋白的结合

本发明从Protein Data Bank上下载PB2cap蛋白(PDB编号：4CB4，分辨率：)。采用AutoDock软件模拟化合物J2与PB2cap蛋白的结合。进行分子对接前，先使用DockPrep模块添加氢原子，分别为蛋白和配体分子添加 AMBER ff4SB力场和AM1-BCC电荷。采用Chimera中的DMS工具以半径为的探针生成蛋白的分子表面，使用sphgen模块生成围绕活性位点的球状集合(Spheres)，使用Grid模块生成Grid文件，该文件用于快速的基于Grid 的能量打分评价。然后采用DOCK6程序进行柔性对接，生成10000个不同的构象取向以及获得化合物与结合口袋中残基间的静电和范德华相互作用，并由此计算得到Grid打分。通过聚类分析(RMSD阈值为)，得到打分最佳的构象。最后，通过蛋白-配体相互作用在线分析工具Protein-Ligand Interaction Profier分析计算结果，并采用PyMOL生成图片。

试验结果:化合物J2与PB2cap蛋白的结合能够影响PB2cap蛋白识别宿主细胞mRNA5’端的帽状结构及vRNP复制结合以上的研究结果，化合物J2作用于病毒的复制前期，通过与PB2cap蛋白作用抑制流感病毒的复制。于是，本发明采用AutoDock软件模拟化合物J2与 PB2cap蛋白的结合。结果如图8所示，化合物J2分子可以与357位的组氨酸 (His357)和404位的苯丙氨酸(Phe404)形成π-π共轭，也能与323位的苯丙氨酸(Phe323)形成π-π共轭；与361位的谷氨酸(Glu361)和376位的赖氨酸(Lys376)形成双氢键；同时与363位的苯丙氨酸(Phe363)和429位的天冬酰胺(Asn429)形成氢键。根据先前的研究报道，PB2与宿主细胞内m⁷GTP 结合的主要位点位于PB2cap结构域上的Phe-323、Ser-324、Arg-355、Lys-339、Glu-341、His-357、Phe-404和Asn-429。而化合物J2与PB2cap结构域上结合的位点大多为m⁷GTP结合的位点，但从SPR的结果显示化合物J2与PB2cap结合的亲和力比m⁷GTP高出500多陪。这些数据表明了化合物J2与PB2cap蛋白结合能够干扰蛋白的功能，阻碍病毒的复制。因此，化合物J2作为一种新型抗流感病毒的小分子抑制剂，在临床应用方便具有很好前景，是一个潜在的抗流感病毒药物。

Claims

1.一种式I所示化合物在制备抗流感病毒药物中的应用

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型流感病毒。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。

4.式I所示化合物在制备抑制甲型流感病毒复制前期的药物中的应用。

5.式I所示化合物在制备抑制甲型流感病毒在靶细胞复制的药物中的应用。

6.式I所示化合物在制备能与PB2cap蛋白结合抑制与宿主细胞帽状结构的结合以及vRNP的活性的药物。