CN106138040A - 石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用。所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。所述石斛碱在制备抑制甲型流感病毒在宿主细胞复制、并能够抑制病毒核糖核蛋白复合物vRNP的出核或核糖核蛋白复合物vRNP活性。其中，石斛碱与流感病毒NP蛋白结合的位点为267位上的精氨酸(Arg267)，270位上的缬氨酸(Val270)，338位上的苯丙氨酸(Phe338)，339位上的谷氨酸(Glu339)。

Description

石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及石斛碱在抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种亚型。甲型流感病毒容易发生抗原变异、适应和重组，会形成新的高致命性的毒株而引起世界性大流行。除了历史上的几次流感大爆发给人类与社会造成的极大的损伤之外，近年来出现的新型流感病毒，如H5N1、H7N9、H9N2，H5N6等，也严重威胁到人类的健康。因此，迫切地需要有效的方法防治流感。早期发现与及早用药可获得较好的疗效。而针对这一点，抗流感病毒药物比疫苗更加有优势。
目前，FDA批准上市的两类抗流感病毒药物，M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)与神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦和奥司他韦)。然而，甲型流感病毒的不断演变和极速的耐药性，尤其是对金刚烷胺和奥司他韦，限制了这两类药物的使用。因此，研究新型的抗流感病毒药物和寻找新的有效药物作用靶点控制禽流感或人类大流行的甲型流感成为了人类亟待解决的问题。
近年来，流感病毒NP蛋白因其高度的保守性已成为抗流感病毒药物研究和开发的新靶标，设计和开发相应的抑制剂，成为抗流感药物研究的一个新方向。NP蛋白是核糖核蛋白复合体(vRNP)的一个重要组成部分。NP蛋白包裹着病毒的基因组，帮助vRNA躲避RNA酶降解，还与vRNA结合，形成具有双螺旋结构的同源寡聚复合物，维持vRNP的活性，包括病毒的复制、出核以及基因组的包装。NP蛋白这种的多功能性使其成为一个潜在的药物作用靶点，而针对NP蛋白功能区的抗流感病毒药物将会阻断流感病毒在宿主中的有效复制。
我国是天然资源极其丰富的大国，从天然产物中开发抗病毒药物具有独特的优势。石斛碱属于倍半萜类生物碱，以含有一个氮原子的五元和六元并环结构为母核，其结构如下，是石斛中的主要药用成分之一，具有止痛、解热作用，可降低心率、血压，减慢呼吸，但其在抗流感病毒方面的应用未见报道。本发明首次发现石斛碱具有抗甲型流感病毒的用途，实验结果表明石斛碱可结合NP蛋白的功能区，影响病毒的复制，揭示其有开发成抗流感病毒药物的前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供石斛碱的新用途。所述的石斛碱具有显著的抗甲型流感病毒的活性，可以作为新的抗流感病毒药物进行开发，具有广泛的应用前景。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用。
其中，所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。
本发明另一个方面提供了石斛碱在制备抑制甲型流感病毒在宿主细胞复制的药物中的应用。
本发明再一个方面提供了石斛碱在制备抑制病毒核糖核蛋白复合物vRNP的出核或核糖核蛋白复合物vRNP活性的药物中的应用。
其中，石斛碱与流感病毒NP蛋白结合的位点为267位上的精氨酸(Arg267)，270位上的缬氨酸(Val270)，338位上的苯丙氨酸(Phe338)，339位上的谷氨酸(Glu339)。
其中，石斛碱与NP蛋白Arg267和Val270结合，主要影响vRNP的出核；与Phe338和Glu339结合，主要阻碍NP蛋白与病毒RNA的结合，影响vRNP的活性。
本发明再一个方面提供了石斛碱在制备治疗针对M2离子通道和神经氨酸酶靶点耐药的甲型流感病毒的药物中的应用。
所述石斛碱可抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2在宿主细胞中的复制。
所述石斛碱能够靶向流感病毒的NP蛋白，从而抑制vRNP的出核及其活性，具有明显的抗病毒活性，可用于制备成抗流感的药物。
所述石斛碱与流感病毒NP蛋白结合的位点为267位上的精氨酸(Arg267)，270位上的缬氨酸(Val270)，338位上的苯丙氨酸(Phe338)，339位上的谷氨酸(Glu339)，可抑制vRNP出核与病毒复制，从而发挥抗病毒作用。
所述石斛碱可制成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。
上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1.石斛碱均能抑制甲型流感病毒H1N1和H3N2对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。
2.石斛碱对细胞的毒性较小，在500μg/ml的浓度范围内对MDCK细胞和A549细胞几乎无毒。石斛碱对甲型流感病毒H1N1和H3N2的IC50分为18.70±0.68，19.19±1.86μg/mL，安全指数大于26.0，可作为安全有效的抗流感病毒药物开发。
3.石斛碱作用于流感病毒NP蛋白的保守功能区域，可减少免疫交叉保护效应，亦能解决针对靶点M2离子通道和神经氨酸酶的耐药性，是一个潜在有效的抗病毒药物。
附图说明
图1石斛碱在病毒单轮复制周期内加入被感染细胞中的时间。A.Westernblotting实验中石斛碱加入的时间；B.Q-PCR实验中石斛碱加入的时间。
图2石斛碱细胞毒性检测。A.石斛碱对MDCK细胞的毒性；B.石斛碱对A549细胞的毒性。
图3石斛碱抗甲型流感病毒的活性。A.石斛碱对H1N1和H3N2的抑制活性；B.石斛碱抑制甲型流感病毒引起的CPE。
图4石斛碱抑制流感病毒在细胞中的复制。A.石斛碱降低病毒在MDCK细胞中HAmRNA的表达；B.石斛碱降低病毒在A549细胞中HA mRNA的表达；C.石斛碱在24h、48h和72h均能降低病毒HA mRNA的表达；D.石斛碱抑制病毒HA蛋白的表达。
图5石斛碱对病毒吸附入侵的影响。A.石斛碱对H5N1假病毒感染的抑制活性；B.CL-385319石斛碱对H5N1假病毒感染的抑制活性。
图6石斛碱对子代病毒释放的影响。A.石斛碱对神经氨酸酶的抑制活性。B.扎那米韦对神经氨酸酶的抑制活性。
图7石斛碱抑制病毒的前期复制。A.三种不同的加药方式下，石斛碱的抗病毒活性；B.石斛碱对病毒单轮复制HA蛋白表达的影响；C.石斛碱对病毒NP RNA复制的影响。
图8石斛碱抑制NP蛋白出核。
图9石斛碱与NP蛋白的分子对接。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合实验和结果对石斛碱在抗甲型流感病毒中的应用进一步说明。
本发明所用的材料1细胞与病毒
犬肾上皮细胞(MDCK细胞)、人肺癌上皮细胞(A549)和293T细胞生长于含10％胎牛血清，100U/L青霉素、链霉素的DMEM或1640培养基。甲型流感病毒A/FM/1/47(H1N1)和A/Aichi/2/68(H3N2)经本实验室SPF鸡胚传代扩增，-80℃保存。质粒A/Thailand/Kan353/2004-HA、A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc用于H5N1假病毒的制备。其中pNL4-3R-E-Luc是在pNL4-3进行移码突变使其不表达Env蛋白和Vpr蛋白，并插入荧光素酶报告基因的一个重组质粒。所有与活病毒相关试验是在生物安全2级或3级设施中进行。
实施例1石斛碱的细胞毒性检测
石斛碱对细胞毒性的检测采用MTT法。具体方法如下:
MDCK或A549细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层，将DMEM或1640梯度稀释的石斛碱加入到96孔板中，每孔200μl，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/ml MTT的1640或DMEM培养基，37℃孵育4h。采用多功能酶标仪(Genios Pro,Tecan,US)检测570nm处吸光度。以细胞的存活率作为石斛碱对MDCK或A549细胞的毒性的指标。
细胞存活率(％)＝E/N×100
E为药物组的吸光度，N为细胞对照组的吸光度。
试验结果:石斛碱细胞毒性小，生物安全性高
结果如图2所示，石斛碱对细胞的毒性较小，在500μg/ml的浓度范围内对MDCK细胞和A549细胞几乎没有毒性。本发明的实验研究中选用的药物浓度在50μg/ml以内，是在安全无毒性浓度范围内。
实施例2石斛碱体外抗甲型流感病毒的活性检测
本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型流感病毒，包括H1N1和H3N2，具体方法如下：
MDCK细胞按2×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的甲型流感病毒感染细胞，每孔100μl，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的石斛碱，每孔200μl，继续培养48h。石斛碱的抗病毒活性通过石斛碱对细胞的保护作用来测定，包括观察石斛碱抑制病毒引起的细胞病毒现象(CPE)和检测细胞的存活率，并进一步计算半数有效浓度IC50。利巴韦林(ribavirin)作阳性对照。
试验结果:石斛碱可抑制流感病毒的感染
图3A表明，石斛碱对甲型流感病毒H1N1和H3N2有明显的抑制作用，且存在着明显的剂量关系。石斛碱对病毒的抑制率随着浓度的增加而增加，对H1N1和H3N2的半数有效浓度IC50分为18.70±0.68μg/ml和19.19±1.86μg/ml，选择性安全指数分别大于26.7和26.0(表1)。同时，观察石斛碱对病毒引起的细胞病毒现象(CPE)的抑制效应。结果如图3B所示，100TCID50的病毒液在感染细胞24h后能引起明显的细胞病变，而50μg/ml的石斛碱能够抑制病毒所导致的病变效应，结果与阳性化合物利巴韦林相一致。
表1石斛碱抗甲型流感病毒活性
实施例3石斛碱对甲型流感病毒复制的抑制实验
为了评价石斛碱对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用Q-PCR和Westernblotting两种方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测石斛碱对病毒复制的影响。具体方法如下：
MDCK细胞按2×104/孔接种于6孔板中，在37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的甲型流感病毒感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的石斛碱，每孔2ml，继续培养24h。此后，用1ml TRIzol充分裂解细胞并提取总RNA，样品用于Q-PCR；而用80μl含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞并提取总蛋白，样品用于Western blotting实验。此外，为了观察石斛碱对病毒复制的时效性，延长病毒感染时间，检测石斛碱对病毒复制的抑制效果，选取的时间点分别是24h，48h，72h。
试验结果:石斛碱可抑制流感病毒在细胞中的复制
图4A和图4B分别是病毒HA基因mRNA在MDCK和A549中的表达情况。从结果可以看出，石斛碱能够显著地降低mRNA的表达量，且抑制效果具有浓度的依赖性。随后，为了检测石斛碱对病毒复制的时效性，延长病毒感染的时间，观察石斛碱对病毒mRNA表达的影响。从图4C结果可以看出，无论是在24h、48h还是72h，石斛碱皆能明显得抑制病毒的复制，说明石斛碱抗病毒的作用时间长，可为临床用药提供参考。图4D为Western blotting的结果，结果表明石斛碱能够抑制病毒HA蛋白的表达，且具有浓度依赖性，该结果与Q-PCR结果相一致。
实施例4石斛碱对病毒吸附入侵和子代病毒释放的影响
本发明采用H5N1假病毒体系检测石斛碱对病毒吸附入侵宿主细胞的影响。H5N1假病毒体系是指用A/Thailand/Kan353/2004-HA、A/Thailand/Kan353/2004-NA和pNL4-3R-E-Luc三个质粒共转染293T细胞，组装成的假病毒含有包膜蛋白血凝素HA，介导病毒的吸附入侵，且无病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成。具体方法如下：
MDCK细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至80～90％。将50μl 2倍倍比稀释的石斛碱与50μl假病毒在37℃下孵育30min。30min后，将病毒与石斛碱的混合物共同加入到96孔板中，在37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养。48h后，弃培养上清，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入50μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min，接着吸取40μl 96孔板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入40μl的荧光素酶底物；用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。根据化学发光值的大小，判断石斛碱抑制病毒吸附进入的活性。
化合物抑制率(％)＝[1-(E-N)/(P-N)]×100
其中，E代表实验组的化学发光值，N代表阴性对照组的化学发光值，P代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(IC50)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。阳性对照药为CL-385319。
同时，为了检测石斛碱对子代病毒的释放，本发明采用神经氨酸酶的抑制实验。原理：底物4-methylumbelliferyl-N-acetyba-D-neuraminicacid(4-MUNANA)可被流感病毒包膜蛋白神经氨酸酶NA催化产生荧光物质。此荧光物质的最大激发波长为340nm，最大发射波长为440nm。采用多功能酶标仪测定该荧光即可实现石斛碱对神经氨酸酶抑制作用的检测。具体方法如下：
在96孔荧光酶标板内每孔加入15μl病毒液和5μl 2倍倍比稀释的石斛碱的混合液，37℃孵育30min，然后每孔加入30μl 20μM 4-MUNANA，稀释液为32.5mM MES，4mM CaCl2，pH＝6.5。于微孔板振荡器上振动1min，37℃避光孵育1h。其中扎那米韦(zanamivir)作为阳性对照。最后用多功能酶标仪测定荧光值，计算出抑制率。
抑制率(％)＝(FNA-Fsam)/(FNA-Fbla)×100％
试验结果:石斛碱不作用于病毒的吸附入侵和子代病毒的释放
为了研究石斛碱的抗病毒作用机制，本发明首先检测石斛碱是否影响病毒的吸附入侵和子代病毒的释放。H5N1假病毒检测体系采用实验室合成的阳性化合物CL-385319，神经氨酸酶抑制实验采用扎那米韦作阳性对照。从图5H5N1假病毒感染抑制实验和图6神经氨酸酶抑制实验的结果可以看出，石斛碱不能抑制假病毒H5N1感染细胞，也不能抑制病毒包膜蛋白神经氨酸酶的活性，表明了石斛碱既不影响流感病毒对宿主细胞的吸附入侵，也不能阻止子代病毒的释放。
实施例5石斛碱对病毒转录复制的影响
为了确定石斛碱干扰病毒生命周期中的哪个阶段，本发明通过改变石斛碱作用方式和时间进行研究。具体方法如下：
MDCK细胞接种100TCID50的甲型流感病毒后，采用三种不同的加药方式，即石斛碱在病毒进入细胞前(pre-treatment)、病毒感染细胞1h后(post infection)、病毒感染的整个过程(entire treatment)。具体为：pre-treatment指病毒与石斛碱孵育后加入细胞感染1h，而后更换新鲜的不含石斛碱的培养基；post infection指病毒感染细胞后加入石斛碱；entire treatment指病毒、石斛碱与细胞共孵育1h后替换成新鲜的含石斛碱的培养基。病毒感染细胞48小时后，用上述1.3的方法检测石斛碱抗病毒作用。
另外，在病毒单轮复制期间，石斛碱按照病毒感染细胞后的时间间隔(0-2，2-4，4-6，6-8，0-8h)，加入到细胞中，然后在病毒感染8h后，利用Western blotting技术检测细胞内病毒蛋白的表达量。同时，在病毒单轮复制期间，病毒感染细胞后，石斛碱加入到细胞中，继续培养6h后，用Q-PCR在病毒感染后的3h和6h检测病毒基因组的复制情况。石斛碱加入细胞中的时间如图1所示。
试验结果:石斛碱作用于病毒的复制前期
为了确定石斛碱作用于病毒生命周期的哪个阶段，本发明采用多种加药方式进行研究。通过pre-treatment、post infection和entire treatment三种不同的加药方式，本发明发现石斛碱作用于病毒感染细胞进入之后(图7A)。随后，在病毒的单轮复制期间的不同时间间隔给药(图7B)，石斛碱在0-2h和2-4h能够明显得抑制流感病毒HA的表达，表明石斛碱作用于病毒的复制前期。为了验证这一实验结果，我们分别在病毒感染后的3h和6h检测病毒RNA(vRNA)的复制情况，结果发现石斛碱在病毒感染后的3h内即可抑制核蛋白(nuclear protein，NP)RNA的复制(图7C)。
实施例6石斛碱对病毒核物质出核的影响
NP蛋白是核糖核蛋白复合体(vRNP)的一个重要组成部分。在流感病毒完成后期复制之后，NP蛋白与病毒的RNA及多聚酶结合形成vRNP，协助vRNP出核，而后在M1的引导下被运送到出芽部位与HA、NA和M2一起装配成成熟的子代病毒粒子以出芽方式释放到细胞外，完成病毒的整个生命周期。因此，NP蛋白在细胞中的定位可以反映vRNP的出核情况。具体方法如下：
MDCK细胞按1×104/孔接种于激光共聚焦培养皿中，待细胞长至60-70％，用1000TCID50的甲型流感病毒感染细胞，每孔100μl，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/ml TPCK)梯度稀释的石斛碱，每孔100μl，继续培养6h。弃培养上清，细胞用4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3次，每次5min。随后用3％BSA封闭1h，加入一抗anti-influenza Avirus nucleoprotein(NP)antibody，4℃过夜；再加入二抗FITC-labeled secondaryantibody，室温孵育1h，最后用4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)室温染色10min，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察NP蛋白的胞浆胞核定位情况。
试验结果:石斛碱能够抑制病毒核物质的出核
如图8所示，流感病毒感染细胞6h之后，vRNP出核，因此在胞质中检测到大量的NP蛋白，而胞核中的NP蛋白的表达量则相对较少。病毒感染细胞之后，用石斛碱进行处理，结果显示石斛碱能够抑制vRNP的出核，而且还能降低NP蛋白的表达量，且具有剂量关系；而扎那米韦作用于神经氨酸酶，因此不影响病毒NP蛋白的出核。
实施例7分子对接分析石斛碱与NP蛋白的结合
本发明从Protein Data Bank上下载NP蛋白(PDB编号：2IQH，分辨率：)，采用AutoDock软件模拟石斛碱与NP蛋白的结合。进行分子对接前，先采用Dock Prep模块添加氢原子，分别为蛋白和配体分子添加AMBER ff4SB力场和AM1-BCC电荷，然后采用DOCK6程序进行柔性对接，生成1000个不同的构象取向以及获得化合物与结合口袋中残基间的静电和范德华相互作用，并由此计算得到Grid打分。通过聚类分析(RMSD阈值为)，得到打分最佳的构象。最后，通过Chimera分析计算结果，并采用PyMOL生成图片。
试验结果:石斛碱与NP蛋白的结合能够影响NP蛋白与RNA的结合及vRNP出核
结合以上的研究结果，石斛碱作用于病毒的复制前期，且能够抑制病毒核物质的出核，这很有可能与NP蛋白的活性有关。于是，本发明采用AutoDock软件模拟石斛碱与NP蛋白的结合。结果如图9所示，石斛碱通过盐桥与流感病毒NP蛋白267位上的精氨酸(Arg267)和339位上的谷氨酸(Glu339)结合；通过疏水键与270位上的缬氨酸(Val270)结合，通过氢键与338位上的苯丙氨酸(Phe338)结合。根据先前的研究报道，石斛碱与NP蛋白Arg267和Val270结合，主要影响病毒核物质的出核；与Phe338和Glu339结合，主要阻碍NP蛋白与RNA的结合。同时对比来源于NCBI的猪流感、禽流感和人流感各种亚型的甲型流感病毒NP蛋白序列，发现四个位点的保守性大于99％，这些数据表明了石斛碱结合的位置是保守的蛋白功能区域。石斛碱与NP蛋白结合能够干扰蛋白的功能，阻碍病毒的复制。因此，石斛碱可作为一个潜在的抗流感病毒药物进行开发。

Claims (7)

1.石斛碱在制备抗流感病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型流感病毒，优选为H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2或H10N8。
3.石斛碱在制备抑制甲型流感病毒在宿主细胞复制的药物中的应用。
4.石斛碱在制备抑制病毒核糖核蛋白复合物vRNP的出核或核糖核蛋白复合物vRNP活性的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：石斛碱与流感病毒NP蛋白结合的位点为267位上的精氨酸(Arg267)，270位上的缬氨酸(Val270)，338位上的苯丙氨酸(Phe338)，339位上的谷氨酸(Glu339)。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：石斛碱与NP蛋白Arg267和Val270结合，主要影响vRNP的出核；与Phe338和Glu339结合，主要阻碍NP蛋白与病毒RNA的结合，影响vRNP的活性。
7.石斛碱在制备治疗针对M2离子通道和神经氨酸酶靶点耐药的甲型流感病毒的药物中的应用。
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