KR20200031144A - 식물 보호, 성장 및 생산성 향상을 위한 생물활성 폴리펩타이드 - Google Patents

식물 보호, 성장 및 생산성 향상을 위한 생물활성 폴리펩타이드 Download PDF

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Abstract

농업 제형으로 식물에 적용되는 경우 유용한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 제공된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 제형을 사용하는 방법이 또한 제공되며, 이 방법은 식물의 표면 또는 식물 세포막에 외인적으로 적용되거나 또는 식물의 내부 또는 식물 세포에 내인적으로 적용된다. 식물, 식물 부분, 또는 식물 성장 매질 또는 식물 또는 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 적용되는 경우 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시킨다.

Description

식물 보호, 성장 및 생산성 향상을 위한 생물활성 폴리펩타이드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 7월 20일자로 출원 된 미국 가출원 제62/534,710호를 우선권으로 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
농업 제형으로 전달될 수 있는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(bioactive priming polypeptide)가 제공된다. 폴리펩타이드는 작물학적으로 목적하는 결과, 예컨대, 식물에서의 향상된 표현형(해충, 질병 작용제 및 비생물학적 스트레스(abiotic stress)에 대해서 보호를 나타내는 것), 증가된 식물 성장, 생산성 및 수확률을 달성하기 위해서 작물에 적용될 수 있다.
목적하는 작물학적 표현형, 예컨대, 증가된 수확률, 질병 예방, 질병 저항성 및개선된 비생물학적 스트레스 내성을 달성하기 위한 종래의 방법은 대부분 선택적인 육종(breeding), 접목(grafting), 유전자이식(transgenic) 및 농화학적 접근법을 사용하였다.
식물 방어 반응에 관여하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드
식물은 질병을 유발할 수 있는 미생물을 검출하고, 이에 대해서 보호하는 면역계를 보유한다. 식물에서 항미생물 펩타이드(antimicrobial peptide: AMP)는 보통 침입 병원체에 대한 제1 라인의 방어이며, 식물에 선천적인 면역력을 부여할 수 있는 방어 반응의 개시에 관여된다. 다수의 AMP는 일반적으로 다양한 부류의 감염원(infectious agent)에 대해서 활성이다. 이것은 일반적으로 항박테리아성, 항진균성, 항바이러스성 및/또는 항기생충성으로서 분류된다.
식물 표면과 접촉하여, 그것에 서식할 수 있는 특정 병원성 유기체에 대한 주어진 식물 종의 저항성은 특정 미생물(예를 들어, 특정 박테리아 또는 진균 균주)에 의해서만 생산되는 분자에 대한 고도로 전문화된 인식 시스템을 기초로 한다. 식물은 패턴-인식 수용체(pattern-recognition receptor: PRR)를 사용함으로써 잠재적인 미생물 침입자를 감지하여 그들과 연관된 병원체-연관된 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern: PAMP)을 인식한다.
플라젤린(flagellin)/플라젤린-연관된 폴리펩타이드
플라젤린 및 플라젤린으로부터 유래된 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 식물의 선천적인 면역 반응에서 주로 기능적인 역할을 갖는다고 보고되어 있다. 이러한 폴리펩타이드는 유박테리아(eubacterial) 플라젤린의 고도로 보존된 도메인으로부터 유래된다. 플라젤린은 박테리아 편모(flagellum)의 주요 빌딩 블록이다. 박테리아 편모의 필라멘트를 구성하는 플라젤린 단백질 소단위는 세포에서 강력한 유도인자(elicitor)로서 작용하여 다양한 식물 종에서 방어-관련 반응을 보유할 수 있다.
"플라젤린"은 그 자체로 중공 원통형으로 배열되어 박테리아 편모에서 필라멘트를 형성하는 구상 단백질이다. 플라젤린은 박테리아 편모의 주요 치환물질이며, 플라젤화된(flagellated) 박테리아에 존재한다. 식물은 보존된 에피토프, 예컨대, 전장 플라젤린 암호 서열의 N-말단에 위치된 22개 아미노산의 스트레치(Flg22)의 인식을 통해서 박테리아 미생물을 감지하고, 감염을 방제하고, 이에 대한 방어를 보유한다. Flg22 폴리펩타이드의 유도인자 활성도는 플라젤린 단백질의 N-말단의 이러한 보존된 도메인으로 인한 것이다(Felix et al., 1999). 식물은, 원형질막에 배치되고, 식물 세포 표면에서 입수 가능한 류신-풍부 반복부 수용체 카이나제인, 플라젤린 감응성 수용체로서 공지된 식물의 세포 표면에서 패턴 인식 수용체(PRR)를 통해서 박테리아 플라젤린을 감지할 수 있다. 식물에서, 가장 양호하게 특징규명된 PRR은 플라젤린 감지 2(FLS2)인데, 이것은 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 둘 다에서 고도로 보존된다.
아라비돕시스(Arabidopsis)에서, Flg22에 대한 선천적인 면역 반응은 FLS2 류신 풍부 반복부(LRR) 수용체 카이나제를 함유하는 숙주 인식 단백질 복합체와 관련된다(Gσmez-Gσmez L. and Boller T., "FLS2: An LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis," Molecular Cell 5: 1003-1011, 2000). 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서, FLS2는 플라젤린 지각을 결정하고, 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(들)의 결합에 대해서 특이적인 PRR이다. 예를 들어, 외부 식물 FLS2 막-결합된 수용체에 대한 Flg22의결합은 패턴-촉발 면역력의 활성화에 관여되는 고도로 특이적인 신호전달-연관된 캐스케이드를 보유하도록 식물을 유도하는 선천적인 면역 반응에 관여된 신호전달 캐스케이드를 촉발시킨다(Chinchilla et al., "The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds Flg22 and determines the specificity of flagellin perception," Plant Cell 18: 465-476, 2006). 따라서, 아라비돕시스 FLS2 막-결합된 수용체에 대한 Flg22의 결합은, 결합이 식물에서 방어 반응의 활성화 캐스케이드를 도출하는 제1 활성화 단계를 촉진시킨다. Flg22-FLS2 상호작용은 또한 산화성 버스트(oxidative burst)의 유도, 세포 배지 알칼리화, 병원체-반응성 유전자의 하류 유도 및 방어-관련 반응(이후에 이것은 식물에 질병 저항성을 부여할 수 있음)에 기여하는 반응성 산소종(반응성 산소 종: ROS)의 생산으로 이어질 수 있다(Felix G. et al., "Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin," The Plant Journal 18: 265-276, 1999, Gσmez-Gσmez L. and Boller T., "FLS2: An LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis," Molecular Cell 5: 1003-1011, 2000, Meindi et al., "The bacterial elicitor flagellin activates its receptor in tomato cells according to the address-message concept," The Plant Cell 12: 1783-1794, 2000). 토마토에서, 두 무손상 세포뿐만 아니라 마이크로솜막 제제 둘 다를 사용하여 FLS 수용체에 대한 Flg22의 고친화성 결합이 관찰되었다. 이러한 연구에서, 원형질막 표면에서 FLS2 수용체(들)에 대한 Flg22의 결합은 생리 조건 하에서는 비가역적이었는데, 이는 토마토 세포로의 내수송과 함께 Flg22 유도인자의 흡수를 반영한다(Meindi et al., "The bacterial elicitor flagellin activates its receptor in tomato cells according to the address-message concept," The Plant Cell 12: 1783-1794, 2000). FLS2에 의한 Flg22의 인식은 국지 식물 면역 반응 및 전신 식물 면역 반응 둘 다를 촉발한다. Flg22-결합된 활성화된 FLS2 수용체 복합체는 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해서 식물 세포에 내재화되고, 식물 전체에서 전신으로 이동하는데(Jelenska et al., "Flagellin peptide flg22 gains access to long-distance trafficking in Arabidopsis via its receptor, FLS2," Journal of Experimental Botany 68: 1769-1783, 2017), 이것은 전신 Flg22 면역 반응에 기여할 수 있다.
Flg22에 관여된 플라젤린 수용체 지각 매개는 다양한 식물 분류군에 걸쳐서 고도로 보존된다(Taki et al., "Analysis of flagellin perception mediated by flg22 receptor OsFLS2 in rice," Molecular Plant Microbe Interactions 21: 1635-1642, 2008). 플라젤린 단백질의 보존된 도메인으로부터의 15 내지 22 또는 28개의 아미노산을 포함하는 합성 폴리펩타이드의 마이크로몰 미만의 농도는 유도인자로서 작용하여 다양한 식물 종에서 방어 반응을 개시한다.
유전자이식 식물의 생성은 플라젤린-특이적 PRR에 결합하는 플라젤린-특이적 PAMP를 확인하는 데 사용되어 왔다. 아라비돕시스 식물에서의 FLS2의 이소성 발현은 플라젤린 반응과 FLS2 발현 수준 간의 직접적인 상관관계를 나타내었고, 이는, FLS2가 플라젤린의 인식(박테리아 존재의 신호)에 관여되고, 식물에서 방어 반응의 활성화로 이어진다는 것을 나타낸다(Gσmez-Gσmez L. and Boller T., "FLS2: An LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis," Molecular Cell 5: 1003-1011, 2000). 플라젤린 결합 수용체를 발현하는 유전자이식 식물은 특정 병원체에 대해서 효능을 나타내었다. FLS2에 대한 플라젤린 결합은 플라젤린 수용체 FLS2의 하류에서 기능하는 특정 MAP 카이나제 전사 인자의 발현의 개시에 관여되었다. FLS2 수용체가 결핍된 돌연변이체 식물(fls2)은Flg22에 대해서 불감성이고(Gσmez-Gσmez L. and Boller T., "FLS2: An LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis," Molecular Cell 5: 1003-1011, 2000), FLS2 수용체에 대한 Flg22 결합을 손상시켰다. 돌연변이체 식물(fls2)은 또한 병원성 박테리아로 처리되는 경우 감염 및 질병에 대해서 향상된 민감성을 나타내었다(Zipfel et al., "Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception," Nature 428: 764-767, 2004).
전통적으로, 질병 저항성을 개선시키는 방법은 이러한 발견 및 다른 이러한 발견을 활용하고, 유전자이식 접근법을 취하였다. 플라젤린-감지(FLS) 수용체 단백질(전문이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO2016007606A2호) 또는 FLS의 하류 신호전달에 관여되는 전사 인자(전문이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO2002072782A2호)로 형질전환된 유전자이식 식물 및 종자는 특정 병원성 미생물에 질병 저항성을 부여한 식물을 생성하였다. 또 다른 예에서, 플라젤린-감지(FLS3) 수용체를 발현하는 유전자이식 식물은 또한 FLS3 수용체를 발현하지 않는 비-유전자 이식 식물과 비교할 때 향상된 질병 저항성을 나타내었다(전문이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 제WO2016007606A2호).
식물 디펜신(defensin)/티오닌(thionin)
식물 디펜신은 또한 항미생물 펩타이드(anti-microbial peptide: AMP)로서 특징규명되어 있다. 식물 디펜신은 다이설파이드 브리지를 형성하고, 이의 구조적 안정성에 기여하는 몇몇 보존된 시스테인일 잔기를 함유한다. 디펜신은 식물에서 가장 양호하게 특징규명된 시스테인-풍부 AMP이다. 디펜신 패밀리의 구성원은 구상 구조로 접히는 4개의 다이설파이드 브리지를 갖는다. 이러한 고도로 보존된 구조는 미생물 병원성 유기체에 대한 식물 보호에서 상당히 전문적인 역할을 부여한다(Nawrot et al., "Plant antimicrobial peptides," Folia Microbiology 59: 181-196, 2014).
티오닌은 디펜신 패밀리로 분류된 시스틴-풍부 식물 AMP이고, 전형적으로 45 내지 48개의 아미노산 잔기를 포함하는데, 여기서 이들 아미노산 중 6 내지 8개는 고등 식물에서 3 내지 4개의 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인이다. 티오닌은 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물 둘 다에서 존재하는 것으로 밝혀져 있고, 이의 발현은 다양한 미생물로의 감염에 의해서 유도될 수 있다(Tam et. al., "Antimicrobial peptides from plants," Pharmaceuticals 8: 711-757, 2015). 티오닌의 특정 아미노산, 예컨대, 고도로 보존된 Lys1 및 Tyr13은 이러한 AMP의 기능적 독성에서 필수적인 것으로 밝혀져 있다.
하핀(harpin) 및 하핀-유사(HpaG-유사)
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드와 유사하게, 하핀은 더 큰 전구체 단백질로부터 유래된 박테리아-유래된 유도인자의 군을 포함한다. 하핀은 식물 세포의 세포내 공간 또는 아포플라스트(apoplast) 에 침윤되는 경우 과민성 반응(hypersensitive response: HR)의 유발에 중요하다(Kim et al., "Mutational analysis of Xanthomonas harpin HpaG identifies a key functional region that elicits the hypersensitive response in nonhost plants," Journal of Bacteriology 186: 6239-6247, 2004). 원위 하핀-유사(HpaG-유사) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들)를 식물에 적용하는 것은 질병 및 곤충 압박으로부터 식물을 보호하기 위한 대안적인 길을 제공한다. 하핀은 식물 형질 세포막을 구성하는 지질 이중층을 통해서 단백질을 수송할 수 있는 타입 III 분부 시스템을 사용한다. 형질 세포막의 표면에 대한 하핀의 결합은 병원체-연관된 분자 패턴(PAMP)에 의해서 촉발되는 것과 유사하고, PAMP-촉발된 면역력을 활성화시킨다고 공지된 선천적인 면역 반응을 촉발시킬 수 있다(Engelhardt et al., "Separable roles of the Pseudomonas syringae pv. phaseolicola accessory protein HrpZ1 in ion-conducting pore formation and activation of plant immunity," The Plant Journal 57: 706-717, 2009). 하핀-유사 HpaG 유래된 폴리펩타이드의 돌연변이 분석은, 본래 133 아미노산 하핀 유도인자 전구체 단백질의 Leu-39와 Leu50 사이의 12개 아미노산 잔기가 담배에서 과민성(HR)의 유발 및 후속 선천적인 면역 반응에 중요하였음을 나타내었다(Kim et al., "Mutational analysis of Xanthomonas harpin HpaG identifies a key functional region that elicits the hypersensitive response in nonhost plants," Journal of Bacteriology 186: 6239-6247, 2004). 이는, (다른 AMP과 유사한) 하핀의 특정 아미노산 영역이 유발 반응에 대한 책임이 있음을 나타낸다. 하핀, 예컨대, HpaG-유사는 식물 병원체뿐만 아니라 곤충에 대한 저항성을 향상시키는 데 사용될 수 있다(Choi et al., "Harpins, multifunctional proteins secreted by gram-negative plant pathogenic bacteria," Molecular Plant Microbe Interactions 26: 1115-1122, 2013). 하핀은 식물에서 질병 저항성을 유도하고, 곤충 체관부-섭식 곤충, 예컨대, 진딧물에 의한 집락화 및 섭식으로부터 식물을 보호하기 위해서 사용되었다(Zhang et al., "Harpin-induced expression and transgenic overexpression of phloem protein gene At.PP2A1 in Arabidopsis repress phloem feeding of the green peach aphid Myzus persicae," BMC Plant Biology 11: 1-11, 2011).
연장 인자 Tu(EF-Tu)
연장 인자 Tu는 박테리아에서 발견되는 풍부한 단백질이고, 미생물 병원성 유기체에 대한 식물 질병 저항성 및 식물 선천적인 면역력에 관여되는 신호전달 캐스케이드를 개시시키기 위한 병원체-연관된 분자 패턴(PAMP)으로서 작용한다. 흥미롭게도, 일부 EF-Tu 폴리펩타이드는 또한 식물에 존재하는 것이 발견된다. elf18이라고 지칭되는, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 EF-Tu의 N-말단의 첫 번째 18개 아미노산 잔기가 식물에서 PAMP-촉발된 면역 반응의 강력한 유도자인 것으로 공지되어 있다(Zipfel et al., "Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR restricts Agrobacterium-mediated transformation," Cell 125: 749-760, 2006). 이. 콜라이(E. coli) EF-Tu로부터 유래된 폴리펩타이드는 식물 세포-표면 국지화된 수용체 EF-Tu 수용체(EFR)에 의해서 감지된다(Zipfel et al., 2006). EFR의 EF-Tu 결합 및 활성화는 Flg 펩타이드-FLS2 수용체 복합체의 것과 비교할 때 유사한 작용 모드를 따른다(Mbengue et al., "Clathrin-dependent endocytosis is required for immunity mediated by pattern recognition receptor kinases," Proc Natl Acad Sci U.S.A. 113: 11034-9, 2016).
성장 변경 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드
파이토설포카인(Phytosulfokine: PSKα)
파이토설포카인(PSK)은 고등 식물에서 도처에 존재하고, 고도로 보존된 전구체 유전자에 의해서 암호화된 설페이트화된 식물 폴리펩타이드의 군에 속한다(Sauter M., "Phytosulfokine peptide signaling," Journal of Experimental Biology 66: 1-9, 2015). PSK 유전자는 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 둘 다에 존재하고, 펜타펩타이드 또는 C-말단 절두된 테트라펩타이드로서 활성일 수 있는 PSK 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 작은 유전자 패밀리에 의해서 암호화된다(Lorbiecke R, Sauter M, "Comparative analysis of PSK peptide growth factor precursor homologs," Plant Science 163: 348-357, 2002).
파이토설포카인 단백질은 보존된 신호 폴리펩타이드에 의해서 식물에서 분비 경로에 표적화된다(Lorbiecke R, Sauter M, "Comparative analysis of PSK peptide growth factor precursor homologs," Plant Science 163: 348-357, 2002). 파이토설포카인 전구체 단백질의 처리는 식물 분비 경로, 구체적으로 트랜스-골지 내에서 타이로실단백질 설포트랜스퍼라제에 의한 설포닐화, 그 다음 PSK를 생산하기 위한 아포플라스트에서의 분비 및 단백질분해 절단을 포함한다(Sauter M., "Phytosulfokine peptide signaling," Journal of Experimental Biology 66: 1-9, 2015). PSK는 더 큰 전구체 폴리펩타이드로부터 처리된 후, 폴리펩타이드는 타이로신 설페이트화를 경험한다(Ryan et al., "Polypeptide hormones," The Plant Cell Supplement, S251-S264, 2002). 이어서, 분비된 폴리펩타이드는 류신-풍부 반복 패밀리의 막-결합된 수용체 카이나제에 의해서 세포 표면에서 감지되는데(Sauter M., "Phytosulfokine peptide signaling," Journal of Experimental Biology 66: 1-9, 2015) 여기서 PSK는 그 다음 식물 원형질막 표면 상에 위치된 류신-풍부 반복 영역을 갖는 전문화된 PSK 수용체(예를 들어, 아라비돕시스로부터의 PSK1)에 결합될 수 있다. PSK의 특이적 결합은 벼 및 메이즈(maize)로부터 유래된 세포 현탁 배양물로부터의 원형질막 분획에서 검출되었고, 수용체에 대한 결합은 세포 증식을 개시 및 자극시키는 것으로 밝혀졌다(Matsubayashi et al., "Phytosulfokine-α, a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and low-affinity binding sites," Proceedings National Academy of Science USA 94:13357-13362, 1997).
파이토설포카인(PSK)은 생물자극 활성(biostimulant activity)을 갖는 설페이트화된 성장 인자로서 작용하고, 뿌리 및 슈트 정단 분열조직(shoot apical merimeristem)의 발달, 성장 조절 및 생식 과정의 제어에 관련된다. PSK는 세포 증식, 휴지 조직의 분화를 개시한다고 보고되어 있으며, 물관 요소(tracheary element)의 형성 및 자극 및 분화에 관련된다(Matsubayashi et al., "The endogenous sulfated pentapeptide phytosulfokine-α stimulates tracheary element differentiation of isolated mesophyll cells of zinnia, Plant Physiology 120: 1043-1048, 1999). PSK 신호전달은 또한 아라비돕시스 묘목에서 일어나는 뿌리 및 배축(hypocotyl) 연장의 조절에 관여된다고 보고되어 있다(Kutschmar et al., "PSK-α promotes root growth in Arabidopsis," New Phytologist 181: 820-831, 2009).
근모 촉진 폴리펩타이드(Root Hair Promoting polypeptide: RHPP)
근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)는 대두 쿠니츠 트립신 저해제(Kunitz trypsin inhibitor: KTI) 단백질로부터 유래된 12개 아미노산 단편인데, 이것은 바실러스 서쿨란스(Bacillus circulans) HA12로부터의 알칼리성 프로테아제를 사용하여 분해된 대두박(soybean meal)으로부터 검출되었다(Matsumiya Y. and Kubo M. "Soybean and Nutrition, Chapter 11: Soybean Peptide: Novel plant growth promoting peptide from soybean," Agricultural and Biological Sciences, Sheny H.E. (editor), pgs. 215-230, 2011). 대두 뿌리에 적용되는 경우, RHPP는 브라시카(Brassica)에서 뿌리에 축적되고, 세포 분열의 및 근모 분화의 자극을 통해서 뿌리 성장을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
폴리펩타이드는 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍을 위해서 제공된다. 폴리펩타이드는 하기 중 하나를 포함하고:
(a) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 1 내지 225, 227 내지 375, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 541, 751 및 752 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(b) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571 내지 579 및 753 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(c) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 580 내지 586 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(d) 레트로 인버소(retro inverso) Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450, 527, 531, 533, 535, 537 및 539 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(e) 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(f) 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 529를 포함함); 또는
(g) 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587, 589, 591, 593, 594 및 595 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(h) 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 588, 590, 592, 596 및 597 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(i) 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)(RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603 및 604 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(j) 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드(KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함함); 또는
(k) 레트로 인버소 근모 촉진 폴리펩타이드(RI RHPP)(RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605 및 606 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(l) 연장 인자 Tu(EF-Tu) 폴리펩타이드(EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 607 내지 623 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(m) 레트로 인버소 연장 인자 Tu(RI EF-Tu) 폴리펩타이드(RI EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 624 내지 640 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(n) 서열번호 750을 포함하는 융합 폴리펩타이드; 또는
(o) 파이토설포카인(PSK) 폴리펩타이드(PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함함); 또는
(p) 레트로 인버소 파이토설포카인(RI PSK) 폴리펩타이드(RI PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 599를 포함함); 또는
(q) 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 650 내지 749 중 임의의 하나를 포함함), 그리고
선택적으로, 여기서 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전(inversion), 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유한다.
조성물은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍을 위해서 제공된다. 조성물은 상기에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물 및 농화학적 또는 담체; 또는 폴리펩타이드의 임의의 조합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 코팅된 종자가 또한 제공된다.
폴리펩타이드를 발현 또는 과발현하는 재조합 미생물이 또한 제공된다. 폴리펩타이드는 조성물에 대해서 상기에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다.
식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 방법이 제공된다. 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드 또는 조성물을 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질 또는 식물 또는 식물 부분 주변의 영역 내의 근권(rhizosphere)에 도포하여 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함할 수 있다.
대안적으로, 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물을 식물 성장 매질에 도포하여 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분을 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 보호하고/하거나 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 미생물을 식물, 식물 부분, 또는 식물 성장 매질 또는 식물 또는 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 도포하여 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함한다. 재조합 미생물은 폴리펩타이드를 발현하고, 폴리펩타이드의 발현은 동일한 조건 하에서 동일한 부류의 야생형 미생물에서의 폴리펩타이드의 발현 수준과 비교할 때 증가된다.
폴리펩타이드의 생산 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 폴리펩타이드 및 엔테로카이나제(EK) 절단 부위를 포함하는 융합 단백질을 발효를 통해서 생산하는 단계를 포함하며, 엔테카이나제 절단 부위는 폴리펩타이드의 활성도 및 안정성을 향상시킨다.
본 발명의 특징은 첨부된 청구범위 및 "실시형태"라는 제목의 섹션에 하기에 제공된 실시형태의 목록 추가로 정의된다. 다른 목적 및 특징은 부분적으로 자명하고, 하기에 부분적으로 제시되어 있다.
도 1은 네이티브 L 구성의 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226) 및 상응하는 레트로 인버소 또는 D 구성 형태(서열번호 375)를 도시한 도면.
도 2는 12개의 위치에서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)로의 엽면(foliar) 도포(패널 A) 및 10개 위치에서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 375) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 레트로 인버소(RI) 버전으로의 엽면 시비(패널 B) 가 제공된 옥수수에서의 총 수확 가능한 수확률을 미처리 대조군에서의 수확률과 비교하여 Bu/Ac로 보고한 도면.
도 3은 6개 위치에서 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226)로의 엽면 시비가 제공된 옥수수에서의 총 수확 가능한 수확률을 미처리 대조에서의 수확률과 비교하여 Bu/Ac로 보고한 도면.
도 4는 11개 위치에서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)(패널 A) 및 레트로 인버소(RI) Bt.4Q7Flg22(서열번호 375)(패널 B) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로의 엽면 시비가 제공된 대두에서의 총 수확 가능한 수확률을 대조군에서의 수확률과 비교하여 Bu/Ac로 보고한 도면.
도 5는 12개 위치에서 Ec.Flg22(서열번호 526)(패널 A) 및 레트로 인버소 Ec.Flg22(서열번호 527)(패널 B) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로의 엽면 시비가 제공된 옥수수에서의 총 수확 가능한 수확률을 미처리 대조군에서의 수확률과 비교하여 Bu/Ac로 보고한 도면.
도 6은 옥수수(패널 A) 또는 대두(패널 B)에서 첨가제로서 상이한 농도의 셀로비오스와 조합하여 Bt.4Q7Flg22를 사용한 반응성 산소 종(ROS) 활성도 검정에 관한 도면.
도 7은 피크 활성도 및 검정에 대한 시기를 식별하기 위해서 상이한 농도에서 Bt.4Q7Flg22를 사용한 반응성 산소 종(ROS) 활성도 검정에 관한 도면.
도 8은 속도 의존적인 방식으로 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주 GV3101의 성장에 영향을 미치기 위해서(성장을 감소시키기 위해서) 티오닌을 사용한 도포 전달을 도시한 도면.
도 9는HLB 감염된 감귤 나무에서 칸디다투스 리베리박터 종(Candidatus Liberibacter spp)의 성장을 감소시키기 위해서 티오닌으로 태그화되거나 태그화되지 않은 Bt4Q7 Flg22 폴리펩타이드의 도포 전달에 관한 도면. 처리된 감염된 나무로부터 취한 잎 샘플에서 C. 리버리박터(C. Liberibacter)의 정량 PCR 결과(Ct 값).
도 10은 HLB 감염된 감귤 나무에서 칸디다투스 리베리박터 종의 성장을 감소시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 나무에서의 감귤에 대한 도포 전달에 관한 도면. 처리된 감염된 나무로부터 취한 잎 샘플에서 C. 리버리박터(C. Liberibacter)의 정량 PCR 결과(Ct 값).
도 11은 가지당 착과를 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '발렌시아(Valencia)' 오렌지 나무에 관한 도면.
도 12는 센티미터 단위로 측정된 열매 성장을 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '발렌시아' 오렌지 나무에 관한 도면.
도 13은 가지당 예측된 열매 부피에 의해서 나타낸 바와 같은 착과를 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '발렌시아' 오렌지 나무에 관한 도면.
도 14는 가지당 착과를 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '루비 레드(Ruby Red)' 자몽 나무에 관한 도면.
도 15는 센티미터 단위로 측정된 열매 성장을 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '루비 레드' 자몽 나무에 관한 도면.
도 16은 가지당 예측된 열매 부피에 의해서 나타낸 바와 같은 착과를 증가시키기 위해서 1X 또는 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 '루비 레드' 자몽에 관한 도면.
정의
단수 표현이 본 명세서에서 사용되는 경우, 이것은 달리 지시되지 않는 한 "적어도 하나"또는 "하나 이상"을 의미한다.
"포함하는", "비롯한" 및 "갖는"이라는 용어는 포괄적인 것으로 의도되며 열거 된 요소 이외의 추가 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에서 사용 된 "비생물적 스트레스"는 식물에 부정적인 영향을 가질 수 있는 환경 조건으로 정의된다. 비생물학적 스트레스는 온도(고 또는 저) 스트레스, 방사선 스트레스(가시광 또는 UV), 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 염류 스트레스, 삼투성 스트레스, 영양-결핍 또는 고금속 스트레스, 또는 수분 결핍, 홍수 또는 산소 결핍을 초래하는 수분 스트레스를 포함할 수 있다. 다른 비생물학적 스트레스 인자는 탈수, 상처, 오존 및 다습 또는 저습을 포함한다.
"생물활성 프라이밍"은 식물 또는 식물 부분을 개선시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 효과를 지칭한다. 생물활성 프라이밍은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "생물활성 프라이밍 폴리펩타이드"는 용어 "프라이밍제(들)"와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 플라겔린 및 플라 겔린-연고나된 폴리펩타이드, 하핀 및 하핀-유사 폴리펩타이드(HpaG-유사), 티오닌, 연장 인자 Tu(EF-Tu) 및 이의 폴리펩타이드, 파이토설포카인 α(PSKα), 쿠니츠 트립신 저해제(KTI), 및 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP) 및 이들의 임의의 레트로 인버소 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 클래스에 대해서 기술된 바와 같다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "착색제"는 생성물 브랜딩 및 적용을위한 시각적 생성물 식별자로서 작용한다. 착색제는 염료 및 안료, 무기 안료, 유기 안료, 중합체 착색제 및 다양한 고농축 음영으로 입수 가능한 제형화된 안료 코팅 분산액을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "내인적으로" 적용되는은 식물 표면의 내부에 대한 적용을 지칭한다. 작은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 식물 내에서 신호전달 및 통신에 특히 적합하다. 식물 표면 내부는 임의의 식물 막에 대한 내부 표면 또는 식물 세포를 지칭한다. 내부는 식물 세포에 대한 세포외 또는 세포내를 의미하는 데 사용될 수 있고, 목질부(xylem), 체관부(phloem), 가도관(tracheid) 등을 포함한다. 내인적은 식물의 세포 대 세포 이동을 지칭하는 것과 같이 전신으로 또는 식물을 통한 이동을 지칭할 수 있다. 내인적 적용은 재조합 내생 박테리아 또는 진균을 사용하는 생물활성 프라이밍 폴리 펩타이드의 전달을 포함할 수 있으며, 여기서 내인적 미생물은 식물 외부로 전달되고 자연 기전을 통해 식물 내부로 이동한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "외인적으로" 적용되는은 식물 표면의 외부에 대한 적용을 지칭한다. 식물 표면은 임의의 외부 식물 표면, 예를 들어 원형질막, 표피, 트리콤(trichome), 잎, 근모, 종자 코트 등일수 있다.
"-연관된" 또는 "-유사" 폴리펩타이드는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 언급된 폴리펩타이드로부터 유래되거나 이와 구조적으로 유사하지만, 언급된 폴리펩타이드와 구별되는 아미노산 서열 및/또는 공급원을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 브라시카 라파(Brassica rapa)(서열번호 694)로부터의 티오닌-유사 단백질은 브라시카 나푸스(Brassica napus)(서열번호 693)로부터의 티오닌과 상이한 서열을 갖지만, 구조적 및 기능적으로 유사하다.
"엽면 처리제"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 식물 또는 식물 부분의 땅 위 부분 또는 나뭇잎에 적용되는 조성물을 지칭하며, 잎, 줄기, 꽃, 가지 또는 임의의 안테나 식물 부분, 예를 들어, 접순(scion)을 가질 수 있다.
"주입"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 백신화 또는 면역화와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 식물 또는 식물 부분에 내인적으로 전달되는 과정을 제공한다.
"접종"은 프라이밍 폴리펩타이를 생산하는 박테리아 또는 살아있는 미생물을 식물 또는 식물 부분에 전달하는 것을 의미한다. 접종은 또한 식물 또는 식물 부분 내의 또는 그 상의 기공 또는 임의의 개구부를 통한 수동 진입을 위한 프라이밍 폴리펩타이드의 전달을 지칭할 수 있다."식물"은 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 또는 겉씨식물 식물을 지칭하지만 이들로 제한되지 않는다. 용어 "식물"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 전체 식물, 식물 기관, 전체 식물 또는 식물 기관의 자손, 배아, 체세포 배아 배아-유사 구조물, 원생동물, 원생동물-유사체 및 식물 세포의 현탁물을 포함한다. 식물 기관은 슈트 영양 기관/구조(예를 들어, 잎, 줄기 및 괴경), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조(예를 들어, 포엽, 꽃받침, 꽃잎, 수술, 심피, 꽃밥 및 밑씨), 종자, 예컨대, 배아 배젖 및 종자 코트 및 열매(성숙한 씨방), 식물 조직(예를 들어, 체관부 조직, 관다발 조직, 기본 조직 등) 및 세포(예를 들어, 공변 세포(guard cell), 난세포, 트리콤 등)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 고등 식물, 구체적으로 속씨 식물 단자엽(외떡잎) 및 쌍자엽(쌍떡잎) 식물 및 겉씨식물의 부류만큼 넓다. 그것은 이수성, 다배체, 이배체, 일배체, 동형접합체 및 반접합체를 비롯한 다양한 배수성 식물을 포함한다. 본 명세서에 기재된 식물은 외떡잎 작물, 예컨대, 수수, 메이즈, 밀, 벼, 보리, 귀리, 호밀, 낱알 곡물(millet), 및 트리티케일(triticale)일 수 있다. 본 명세서에 기재된 식물은 또한 쌍떡잎 작물, 예컨대, 사과, 배, 복숭아, 플럼, 오렌지, 레몬, 라임, 자몽, 키위, 석류, 올리브, 땅콩, 담배, 토마토 등일 수 있다. 또한, 식물은 원예 식물, 예컨대, 장미, 매리골드, 프림로즈, 층층나무, 팬지, 제라늄 등일 수 있다.
식물 "생물자극제(biostimulant)"는 영양 효율, 비생물학적 스트레스 내성 및/또는 임의의 다른 식물 품질 특징(들)을 향상시키는데 사용되는 식물 또는 식물 부분에 적용되는 임의의 물질 또는 미생물이다.
"식물 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 임의의 식물 세포를 지칭하고, 식물 표면 또는 식물 원형질막 내부의 세포, 예를 들어, 표피 세포, 트리콤 세포, 목질 세포, 체관 세포, 체관(sieve tube) 요소 또는 반세포를 포함할 수 있다.
"식물 부분"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 식물 세포, 잎, 줄기, 꽃, 꽃 기관, 열매, 화분, 채소, 괴경, 구경, 구근, 위구경, 깍지(pod), 뿌리, 근경, 분형근, 뿌리 줄기, 접순 또는 종자를 지칭한다.
"폴리펩타이드"는 본 명세서에 기재된 바와 같이 임의의 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"프라이밍" 또는 "펩타이드 프라이밍"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 식물 성능을 개선시키기 위해서 사용되는 기술을 지칭한다. 특히, 프라이밍은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 식물, 식물 부분, 식물 세포 또는 식물의 세포내 공간에 외인적 또는 내인적으로 적용되어 식물에게 이득, 예컨대, 향상된 성장, 생산성, 비생물학적 스트레스 내성, 해충 및 질병 내성 또는 예방을 제공하는 결과를 산출하는 과정이다.
"레트로-인버소" 폴리펩타이드는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 자연 발생 L-아미노산의 역순으로 비자연 발생 D-아미노산을 사용하여 재구성되고 구축된 정상(normal)-올 -L 쇄로부터의 자연 유래 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 쇄를 지칭한다. 올-D-아미노산 형태 및 올 L-형태를 함유하는 모 쇄는 단백질 구조의 위상 거울상이다.
"종자 처리제"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 종자를 처리 또는 코팅하기 위해서 사용되는 물질 또는 조성물을 지칭한다. 샘플 종자 처리제는 종자, 묘목 또는 식물을 공격하는 식물 병원체, 곤충 또는 다른 해충을 억제, 방제 또는 격퇴시키기 위해서 제공되는 생물학적 유기체, 화학 성분, 접종제, 제초제 약해경감제(herbicide safener), 미량영양소, 식물 성장 조절제, 종자 코팅제 등 또는 식물 성장 및 건강을 촉진시키기 위한 임의의 유용한 작용제의 응용을 포함한다.
"상승작용" 효과는 2종 이상의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 물질, 화합물 또는 다른 작용제의 상호작용 또는 협력 사이에서 발생하여 이들의 개별 효과의 합보다 큰 조합 효과를 생성하는 효과를 지칭한다.
"상승작용적 유효 농도"는 개별 효과의 합보다 큰 효과를 생성시키는 2종 이상의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 물질, 화합물 또는 다른 작용제의 농도(들)를 지칭한다.
바람직한 실시형태의 설명
농업에 이득을 제공하기 위한 "프라이밍제"로서 작용하는 생물활성 폴리펩타이드에 대한 필요성이 증가하고 있다. 농업 실시에서 생물활성 "프라이밍" 폴리펩타이드의 사용은 예를 들어, 질병, 비생물학적 스트레스 및 수확률 프로그램을 제어하기 위한, 통합된 작물 관리 실시에 대한 패러다임 이동을 제공한다. 생물활성(자연 발생, 재조합 또는 합성) 프라이밍 폴리펩타이드는 농업 제형으로 전달된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용하는 조성물 및 방법은 작물학적으로 목적하는 결과를 달성하기 위해서 작물에 적용되는 멀티-티어드(multi-tiered) 처리 요법을 제공하도록 기재된다. 이러한 바람직한 결과는, 식물에서의 향상된 표현형, 예컨대, 해충, 질병 작용제 및 비생물학적 스트레스에 대해서 보호를 나타내는 것, 뿐만 아니라 증가된 식물 성장, 생산성 및 수확률을 포함한다. 보다 구체적으로, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 제형은 다양한 처리 요법을 사용하여 외인적으로 그리고/또는 내인적으로 식물 또는 식물 부분에 적용될 수 있고, 이것은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 해충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 것을 발견하였다.
플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(바실루스 속 사이에서 보존된 것 포함), 티오닌, 하핀-유사 폴리펩타이드(HpaG-유사), 연장 인자 Tu(EF-Tu), 파이토설포카인(PSKα) 및 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)를 포함하는 합성 유래 또는 자연 발생 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 구체적인 부류는 이의 구별되는 작용 모드에 대해서 선택되었고, 상기에 기재된 구체적인 농업 요구를 수용하기 위해서 다른 폴리펩타이드와 조합하여 또는 개별적으로 사용될 수 있다. 이것은 상업적으로 입수 가능한 농화학물질, 생물자극제, 보충 생물활성제 및/또는 살해충 화합물 대신에 또는 이것에 더하여 사용될 수 있다.
해충, 병원체의 방제를 제공하고, 식물 성장을 향상시키고, 식물 건간을 촉진시키는 이득을 추가로 제공하기 위해서 상승작용적으로 유효량으로 적용되는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물이 또한 제공된다.
I. 폴리펩타이드
박테리아 또는 식물로부터 유래되는 자연 발생, 재조합 또는 화학적으로 합성된 형태로서의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 제공된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 정상 L 및 비자연 레트로-인버소 D 아미노산 형태로 제공된다. 또한, N-말단 및 C-말단 변형을 비롯한 비자연 변형, 고리화, β-아미노산 및 D-아미노산 함유, 및 폴리펩타이드의 안정성 또는 성능을 향상시키는 다른 화학적 변형을 함유하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 제공된다. 예를 들어, 플라젤린 및 22개 아미노산 길이를 포함하고, 플라젤린의 전체 암호 영역으로부터 유래된 Flg-연관된 폴리펩타이드를 먼저 단리시키고, 박테리아 균주, 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 4Q7을 위해서 조립된 소유권이 있는 게놈으로부터 식별하였다. 이러한 Flg22 유래된 폴리펩타이드를 표준(L) 형태 및 레트로-인버소(D) 형태로 제공하였다. 이것을 Bt.4Q7Flg22 및 레트로-인버소(RI) Bt.4Q7Flg22로서 기재한다. 다른 박테리아 유래된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 Ec.Flg22(에쉐리키아 콜라이), HpaG-유사(산토모나스 종)이며, 식물 유래된 폴리펩타이드는 티오닌(시트러스 종(Citrus spp.) 및 다른 식물 종), PSKα(아라비돕시스 탈리아나 및 다른 식물), EF-Tu(박테리아 또는 식물 유래 둘 다) 및 RHPP(글라이신 맥스(Glycine max))를 포함한다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 전장 단백질을 포함할 수 있고, 박테리아 또는 식물로부터 유래되는 자연 발생, 합성 또는 재조합 형태로서 제공된다. 예를 들어, 플라젤린, EF-Tu, KTI 및 HpaG 모두는 식물에 전달될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 또한 프로테아제 절단 부위, 결합 단백질 및 식물 또는 식물 부분에 대한 특이적 전달을 위한 표적화 단백질을 비롯한 다른 단백질 서열에 대한 융합 파트너로서 전달될 수 있다.
또한 자연 또는 화학적으로 합성될 수 있는 시그니처, 신호 앵커 분류 및 분비 서열 및 표적화 서열, 예컨대, 재조합 미생물을 사용하여 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들)와 함께 생산되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 함께 융합 또는 보조 폴리펩타이드로서 사용되는 체관부-표적화 서열이 제공된다.
비자연 발생 폴리펩타이드가 또한 본 명세서에 기재된다. 보다 구체적으로, 폴리펩타이드는 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 해충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍을 위해서 제공된다. 폴리펩타이드는 하기 중 하나를 포함하고:
(a) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 1 내지 225, 227 내지 375, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540 및 541 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(b) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571 내지 579 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(c) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 580 내지 586 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(d) 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450, 527, 531, 533, 535, 537 및 539 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(e) 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(f) 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 529를 포함함); 또는
(g) 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587, 589, 591, 593, 594 및 595 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(h) 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 588, 590, 592, 596 및 597 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(i) 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)(RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603 및 604 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(j) 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드(KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함함); 또는
(k) 레트로 인버소 근모 촉진 폴리펩타이드(RI RHPP)(RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605 및 606 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(l) 연장 인자 Tu(EF-Tu) 폴리펩타이드(EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 607 내지 623 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(m) 레트로 인버소 연장 인자 Tu(RI EF-Tu) 폴리펩타이드(RI EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 624 내지 640 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(n) 서열번호 750을 포함하는 융합 폴리펩타이드; 또는
(o) 파이토설포카인(PSK) 폴리펩타이드(PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함함); 또는
(p) 레트로 인버소 파이토설포카인(RI PSK) 폴리펩타이드(RI PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 599를 포함함); 또는
(q) 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 650 내지 749 중 임의의 하나를 포함함), 그리고
선택적으로, 여기서 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전, 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유한다.
플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스(Lysinibacillus), 패니바실루스(Paenibacillus), 애뉴리니바실루스(Aneurinibacillus) 속 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 주요 부류 중 하나는 플라젤린(들) 및 플라젤린-연관된 프라이밍 폴리펩타이드(들)이다. 보존된 전장 및 부분 길이의 아미노산 플라젤린 암호 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 바실루스 및 비-바실루스 박테리아의 다양한 종으로부터 식별되었다.
플라젤린은 이러한 단백질의 N-말단 및 C-말단 영역에서 보존을 나타낼 수 있지만, 중심 또는 중간 부분에서 가변적일 수 있는 플라젤화된 박테리아 종으로부터의 편모 필라멘트의 주요 부분을 형성하는 구조 단백질이다(Felix G. et al., "Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin," The Plant Journal 18: 265-276, 1999). 플라젤린 단백질의 내부 코어를 형성하는 플라젤린으로부터의 N- 및 C-말단의 보존된 영역은 단백질의 필라멘트로의 중합, 단백질의 운동성 및 수송 및 펩타이드 단편의 식물 세포막/식물의 세포 표면 수용체에 대한 표면 부착에서 역할을 가질 수 있다.
바실루스 및 비-바실루스 플라젤린(표 3 및 표 5)으로부터 유래된 전장 또는 부분적인 플라젤린(표 1 및 표 2) 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드가 제공된다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 768 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 플라젤린 암호화 폴리펩타이드(예컨대, Flg22의 전구체 단백질)로부터 생산된다. 보다 구체적으로, 식물을 프라이밍 또는 처리하는데 사용될 수 있는 생물활성 프라이밍 Flg 폴리펩타이드를 달성하기 위해서 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드로부터 유래된 절단된 단편이 제공된다. 더 큰 전구체로부터의 Flg22 단편의 절단은 더 큰 폴리펩타이드로부터 활성 생물펩타이드를 가공하는 것을 용이하게 하기 위해서 Flg22 근처에 단백질분해 절단 부위를 도입함으로써 달성될 수 있다.
플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 전장 플라젤린 단백질(또는 바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스, 또는 애뉴리니바실루스 또는 다른 미관련 박테리아 속로부터의 Flg-연관된 폴리펩타이드로부터의 전구체 단백질)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 예컨대, Flg22 및 FlgII-28(바실루스 속) 및 Flg15 및 Flg22(이. 콜라이(E. coli))로부터의 PCR 정제된 DNA를 재조합 벡터 내에서 클로닝하고, 증폭시켜 적절한 양의 정제된 DNA를 달성하고, 이어서 이것을 당업자에게 공지되고, 사용되는 종래의 방법을 사용하여 서열결정한다. 동일한 방법을 플라젤린 암호 또는 플라젤린 부분 서열(표 1), N- 또는 C-말단 플라젤린 폴리펩타이드(표 2) 및 Flg-연관된 폴리펩타이드(표 3 내지 표 5) 중 임의의 것과 함께 사용할 수 있다
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 식물에 의해서 인식되는 보존된 22개 아미노산 영역을 함유하는 유박테리아의 임의의 구성원으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스, 애뉴리니바실루스 속 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물로부터 유래될 수 있다. 추가로 바람직한 플라젤린 및 Flg22 서열은 감마프로테오박테리아로부터 획득될 수 있고, 이것은 68% 초과의 동일성의 보존된 22개 아미노산 서열을 함유한다.
바실루스로부터의 보존된 플라젤린 서열
플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 바실루스 종 및 다른 유박테리아 플라젤린의 N-말단 보존된 도메인에 상응하고, 합성, 재조합 또는 자연 발생 형태로 제공된다. Flg22, Flg15 및 FlgII-28의 플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(표 3)를 식별하였고, 이것은 식물에서 성장 반응을 상승작용적으로 자극하고 촉진시키면서, 선택된 질병(들)의 확산을 예방 및 치료하기 위한 광범위한 작물 및 채소에 대한 강력한 유도인자로서 작용한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린 및 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여 사용되거나 또는 개별적으로 사용되기 위해서 제공되며, 이것은 바실루스로부터의 보존된 전장 및 부분 플라젤린(표 1), 플라젤린 폴리펩타이드로부터의 보존된 N- 및 C-말단 영역(표 2), 바실루스 유래된 Flg22 및 FlgII-28-유래된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(표 3) 및 바실루스 Flg22 및 FlgII-28로부터 유래된 거울상인 레트로-인버소 서열(표 4)을 포함한다. 표 1 및 표 3에서의 서열의 밑줄 부분은 각각 식별된 신호 앵커 분류 똔느 분비 서열 및 신호 앵커링 서열을 나타낸다. 기능성 등가물이어서, 유사한 방식으로 활용될 수 있는 다른 비-바실루스 유래된 폴리펩타이드 및 단백질이 또한 기재된다(표 5).
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플라젤린의 N-말단 및 C-말단 보존된 영역
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 N-말단 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 절두된 N-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106,108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182,184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 C-말단 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 절두된 C-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
N-말단 및 C-말단 보존된 영역을 바실루스 종 및 다른 유박테리아의 다양한 균주로부터의 전장 플라젤린 서열로부터 식별하였다(표 2). 보존된 N- 및 C-말단 도메인을 BLAST 다중 정렬 소프트웨어를 사용하여 식별하였고, 바실루스 및 다른 유박테리아 박테리아 데이터베이스에 대한 개별 히트 탐색에 기초하여 기능성 주석에 배정하였다. 암호 서열의 N-말단 영역에 대한 시작 부위는 볼드체 메티오닌( M )이다. 보존된 도메인은 아미노산 서열 N-말단(좌측 칼럼) 및 C-말단(우측 칼럼)으로서 제공된다.
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플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301을 포함할 수 있다.
바실루스 투린기엔시스(Bt.) 균주 4Q7로부터의 소유권이 있는 "인 하우스" 라이브러리로부터 Bt4Q7Flg22(서열번호 226)에 대한 플라젤린-유래된 폴리펩타이드 서열을 식별하였다. 이. 콜라이로부터의 전장 플라젤린에 대한 보존된 프라이머를 사용하여 Bt.4Q7 균주 라이브러리를 스크리닝하고, 기능성 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 Flg22 폴리펩타이드를 식별하였다.
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레트로-인버소 플라젤린-연관된 폴리펩타이드
프라이밍에 유용한 생물활성 Flg 폴리펩타이드(들)는 비-자연 이성질체 또는 레트로-인버소(RI) 형태로 생성될 수 있다.
레트로-인버소 Flg 폴리펩타이드는 FLS 수용체 단백질(들)에 대해서 향상된 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 식물 플라젤린 수용체, 예컨대, FLS2는 레트로 인버소 Flg 폴리펩타이드 단편, 예컨대, 플라젤린의 N-말단 보존된 도메인 내에 위치된 Flg22 또는 FlgII-28은 인식할 수 있다. 이러한 Flg 폴리펩타이드의 레트로-인버소 형태는 생물학적 활성 형태로 제공되는데, 이것은 식물 세포막의 표면 상의 Flg-연관된 or FLS 수용체 단백질을 인식하고, 이와 상호작용할 수 있다.
레트로-인버소 Flg 폴리펩타이드는 식물막 표면에서 단백질분해 절단에 대한 증가된 안정성 및 증가된 활성도를 보유할 수 있다. 예를 들어, 바실루스 Flg22 또는 FlgII-28 폴리펩타이드의 레트로 인버소 형태는 식물 표면 또는 뿌리 표면에서 단백질분해 절단에 대한 보호를 증가시키고, Flg 폴리펩타이드(들)의 활성도 및 안정성을 증가시킬 수 있다. 레트로 인버소 형태는 또한 경작지 내에 또는 토양 상에 또는 토양 내에 적용되는 경우 향상된 안정성을 나타낸다.
레트로-인버소 폴리펩타이드는 모 폴리펩타이드의 네이티브 구조의 위상 거울상이다. 폴리펩타이드 서열의 레트로 인버소 합성 형태는 폴리펩타이드 서열을 역전시키고, 레트로-올-D 또는 레트로-인엔티오(enantio)-펩타이드를 사용함으로써 생성된다. 올 D-쇄 아미노산 Flg 폴리펩타이드(들)는 이의 관련된 L-펩타이드 또는 L-쇄 아미노의 3차원 구조의 "거울상"을 채택한다.
이것은, 표 3의 바실루스 또는 다른 유박테리아로부터 유래된 모 Flg 폴리펩타이드 중 임의의 것의 레트로-인버소 변경을 생성시킴으로써 추가로 달성된다. Flg22(RI Flg22: 서열번호 376 내지 450) 및 FlgII-28(RI-FlgII-28: 서열번호 451 내지 525)에 대해서 설계된 레트로-인버소 폴리펩타이드를 표 4에 제공한다. 표 5에 제동된 바와 같은 Ec.Flg22(서열번호 526) 및 EcFlg15(서열번호 529)의 레트로 인버소 형태는 또한 이. 콜라이 유래된 서열로부터 생성되었다.
폴리펩타이드는 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드는 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
표 3의 바실루스 또는 다른 유박테리아 Flg22 또는 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함하는 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것은 이의 레트로-인버스 형태로 사용될 수 있다(표 4 참고).
본 명세서에 언급된 바와 같은 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 레트로 인버소 형태는, 식물에서 목적하는 표면형을 달성하기 위해서 아미노산 카이랄성의 역전이 정상-올-D(인버소), 올-L(레트로) 및/또는 레트로-올-D(레트로-인버소) 또는 이들 형태의 조합물을 함유하는 3가지 형태 중 임의의 것으로 제공될 수 있다.
표 3에서의 바실루스-유래된 L-Flg22 및 L-FlgII-28 폴리펩타이드 및 표 5에서의 E.c. 네이티브 L-Flg22 및 L-Flg15 폴리펩타이드는 레트로-인버소 D-Flg22 폴리펩타이드(서열번호 376 내지 450), D-FlgII-28(서열번호 451 내지 525) 및 E.c. D-Flg22 폴리펩타이드(서열번호 527, 529)를 형성하도록 조작된 레트로-인버소를 통해서 합성에 의해서 생성되었다.
작은 선형 폴리펩타이드 단편으로서 제공되고, 레트로 인버소 변형이라고 지칭되는 Bt.4Q7 Flg22(서열번호 376)에 대한 아미노산 카이랄성(올-L 대 올-D)의 역전은 폴리펩타이드 골격의 방향의 반전 및 하기에 기술된 바와 같이 달성되었다.
(DADIADLDGDADADDDDDSDADSDNDIDRDKDGDSDSDLDRDD)
레트로 인버소 올 D-쇄 아미노산 Flg22 폴리펩타이드는 관련된 네이티브 L-Bt.4Q7Flg 22 폴리펩타이드의 3차원 구조의 "거울상"을 채택하고, 올 D Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드에 대한 등가의 거울상을 갖는다. 올 L-아미노산 잔기는 이의 D-거울상이성질체에 의해서 대체되어, 아마이드 링키지를 함유하는 올 D-펩타이드 또는 레트로 올 D-이성질체-펩타이드로 이어진다. 레트로-인버소 합성 올-D 입체구조를 생성시키도록 역전된 Bt.4Q7 Flg22 폴리펩타이드 쇄의 네이티브 L-아미노산 쇄 형태는 모든 L-아미노산 잔기를 이의 상응하는 D-거울상이성질체로 대체함으로써 제조된다.
도 1은 올 D Bt.4Q7 Flg22 거울상이성질체 폴리펩타이드를 형성하기 위한 자연(올 L) Bt.4Q7 Flg22 및 이의 레트로 인버소 또는 거울상의 다이어그램 표현을 제공한다. Bt.4Q7 Flg22(서열번호 226)에 상응하는 레트로-인버소 Flg 폴리펩타이드를 서열번호 376로 기재한다.
짧은 폴리펩타이드, 예컨대, Flg22, Flg15 및 FlgII-28의 경우, L-대-D 전환 상태로부터의 입체구조에서의 측쇄 위치의 미러링(mirroring)은 마찬자기로 측쇄의 대칭 형질전환의 미러링을 초래한다.
레트로-올-D 유사체는 생물학적 활성도를 보유하는 것으로 밝혀져 있다(Guptasarma, "Reversal of peptide backbone direction may result in mirroring of protein structure, FEBS Letters 310: 205-210, 1992). 레트로-인버소 D-Flg 폴리펩타이드(들)는 상응하는 네이티브 L-Flg 폴리펩타이드 서열과 유사한 이의 연장된 입체구조에서 측쇄 위상을 추정하여, 단백질분해 절단에 완전히 저항성이면서 네이티브 L-모 분자의 생물확정 활성도를 모방하여, 폴리펩타이드가 식물 또는 주변 환경과 접촉할 때 안정성을 증가시킬 수 있다.
레트로-인버소 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 표 4 또는 표 5에 기재한다. 표 4에 제공된 레트로 인버소 Flg-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 이의 향상된 활성도 및 안정성 및 다양한 조건 및 환경 하에서의 생존 능력에 대해서 선택되었다. D 거울상이성질체 특성에 기초하여, 이것은 단백질분해 절단에 보다 저항성이고, 더 가혹한 환경 조건에서 생존 및 존재할 수 있다.
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다양한 유기체로부터의 Flg 서열
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플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 식물에 안내하는 데 도움을 주는 서열
시그니처, 신호 앵커 분류 및 분비 서열은 별개로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 중 임의의 것과 조합하여 함께 사용될 수 있다. 이러한 지원(assistance) 서열은 플라젤린 폴리펩타이드를 식물 세포막 표면에 효율적으로 전달하는 데 유용하다. 다른 지원 서열이 또한 원형질막을 통한 Flg 폴리펩타이드 단편의 전좌에 도움이 될 수 있다. 식물(또는 식물 부분)의 원형질막 표면으로의 플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 전달은 하류 신호전달 과정에 기여할 수 있고, 식물 또는 식물 부분에 유리한 결과, 예컨대, 향상된 식물 건강 및 생산성을 초래할 수 있다.
폴리펩타이드는 지원 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
지원 폴리펩타이드는 시그니처 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 표 6에 열거된 서열번호 542 내지 548 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함할 수 있다.
지원 폴리펩타이드는 신호 앵커 분류 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 표 7에 열거된 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549를 포함할 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 미생물에 의해서 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 바실루스, 슈도모나스, 패니바실루스, 애뉴리니바실루스 또는 라이시니바실루스를 포함할 수 있다.
지원 폴리펩타이드는 분비 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563 내지 570 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563을 포함할 수 있다.
이러한 3가지 유형의 지원 서열은 표 6(N-말단 시그니처 서열), 표 7(신호 앵커 분류 서열) 및 표 8(분비 서열)에 추가로 기재된다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 중 임의의 것과 조합하여 보존된 시그니처 서열(표 6; 서열번호 542 내지 548), 신호 앵커 분류 서열(표 7; 서열번호 549 내지 562) 및 분비 서열(표 8; 서열번호 563 내지 570)을 갖는 "지원" 서열이 제공된다. Flg 폴리펩타이드를 세포외 식물막 표면, 예컨대, 식물 또는 식물 부분의 표면에 효율적으로 전달하기 위해서 시그니처, 신호 앵커 분류 및 분비 지원 서열과 네이티브 L-Flg 폴리펩타이드(표 3. 서열번호 226 내지 375) 또는 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(표 4. 서열번호 376 내지 525) 중 임의의 것의 조합물이 특히 유용하다.
N-말단 시그니처 서열
바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스 또는 애뉴리니바실루스 박테리아(속) 및 다른 유박테리아 속 내에서 보존된 아미노산 "시그니처" 서열은 플라젤린 폴리펩타이드를 적절한 Flg-연관된 수용체 단백질(들), 예컨대, 식물 세포막 표면에서 노출된 결합 부위를 갖고, Flg 폴리펩타이드-수용체 결합을 향상시키는 데 사용될 수 있는 FLS 수용체에 표적화하는 기능을 하여, Flg-연관된 수용체(들)의 증가된 활성화 가능성으로 이어질 수 있다. 표 6에 식별된 바와 같은 플라젤린 시그니처 서열은 FLS 또는 FLS-유사수용체(들)에 대한 결합을 위해서 Flg 폴리펩타이드를 표적화하고 안정적으로 전달하여 막 수용체와 Flg 폴리펩타이드 간의 접촉 및 결합을 증가시키는 데 유용하다.
보존된 N-말단 시그니처 서열(서열번호 542 내지 548)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있다. 식물 막 표면에 Flg-연관된 폴리펩타이드를 효율적으로 전달하기 위해서 네이티브 L-Flg 폴리펩타이드(L-Flg22 서열번호 226 내지 300; L-FlgII-28 서열번호 301 내지 375) 또는 레트로 인버소 D-Flg 폴리펩타이드(D-Flg22 서열번호 376 내지 450; FlgII-28 서열번호 451 내지 525) 중 임의의 것 또는 표 5에 제공된 다른 Flg-연관된 서열(서열번호 526 내지 541) 중 임의의 것 시그니처 서열이 특히 유용하다.
시그니처 서열은 수용체(들)를 활성화시켜 기능적으로 활성으로 만들기 위해서, 적절한 Flg-연관된 수용체(들)에 대한 결합 시에 Flg22 및 FlgII-28 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 서열을 돕는다.
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N-말단 신호 앵커 분류 서열
바실루스, 라이시니바실루스, 애뉴리니바실루스 및 패니바실루스 속 및 다른 유박테리아 속의 박테리아 내에 보존된 아미노산 "신호 앵커 분류" 서열은 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 식물 세포막 표면에 앵커링시키고, 국지화시키는 기능을 하고, 적절한 Flg-연관된 수용체(들)에 대한 고친화성 결합에 도움을 줌으로써 결합된 수용체(들)의 활성화 가능성을 증가시킬 수 있다.
보존된 신호 앵커 서열(서열번호 549 내지 562; 표 7)은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 사전-절단된 또는 전장 암호 또는 부분 암호 플라젤린 서열(서열번호 1 내지 75; 표 1)의 하류에 위치된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 신호 앵커 분류 도메인은 막 부착에 유용하다. 이것은 표면 막 수용체에 대한 Flg-연관된 폴리펩타이드의 국지화 및 결합에 도움을 주기 위해서 사용될 수 있고, 분비 경로를 표적화하기 위해서 엔도솜(소포) 트래피킹되거나(trafficked) 예정된 단백질에 대한 아미노산 수준에서 일부 기능적 유사성을 갖는다. Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 식물 세포막에 앵커링시키기에 유용한 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 신호 앵커 분류 서열은 또한 식물 세포 내의 생물활성 프라이밍 Flg 폴리펩타이드의 막 통합을 향상시키는 데 사용된다.
표 7에 기재된 바와 같은 이러한 서열은 내수송 수용체 신호 앵커 서열로서 기능적으로 추가로 지칭될 수 있는데, 이것은 식물에 대한 Flg-연관된 폴리펩타이드의 표적화 또는 전달 및 효율적인 막 앵커링을 개선시키고, 식물 세포의 사이토졸 내의 막 통합에 도움을 주기 위해서 사용될 수 있다.
신호 앵커 서열(서열번호 549 내지 562; 표 7)과 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합은 이러한 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(들)의 식물 내의 부착 및 내수송을 가능하게 하는 데 유용하다.
이러한 신호 앵커 분류 서열은 Flg-연관된 폴리펩타이드와 조합하여 사용될 수 있고, 표적화, 효율적인 막 앵커링, 막 통합 및 골지(Golgi)-대-리소좀/공포성(vacuolar) 트래피킹에 유용하다. 신호 앵커 분류 서열은 Flg 폴리펩타이드를 식물 막 표면에 안정적으로 전달하고, 그것을 식물에 완전하게 혼입시키기 위해서 사용된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 서열은 식물계에서 엔도사이토시스 기능을 부여한다고 언급된 다이-류신 아미노산을 함유한다(Pond et al. 1995, "A role for acidic residues in di-leucine motif-based targeting to the endocytic pathway", Journal of Biological Chemistry 270: 19989-19997, 1995).
기재된 바와 같은 이러한 신호 앵커 분류 서열은 또한 전신 신호를 감염 부위에 효율적으로 전달하여, 식물 세포에서 식물의 선천적인 면역력을 자극시키는데 사용될 수 있다.
Figure pct00048
C-말단 분비 서열
플라젤린(들)의 C-말단에 위치된 보존된 서열은 분비 서열(서열번호 563 내지 570; 표 8)로 추가로 기재된다.
보존된 서열은 바실루스, 라이시니바실루스 및 패니바실루스 박테리아 (속) 및 다른 유박테리아 속 유래된 플라젤린 단백질의 C-말단에서 식별되었고, 6개의 아미노산, 예를 들어 LGATLN, LGSMIN 또는 LGAMIN을 포함한다. 이러한 서열은 박테리아 데이터베이스에 대해서 BLAST를 사용하여 분비 폴리펩타이드에 대해서 최고 상동성을 갖는 모티프로서 기능적으로 명명되었다. 식별된 6개의 아미노산 보존된 폴리펩타이드가 이.콜라이에서 타입 III 분비 시스템에서 발견되는 것과 가장 유사한 것을 발견하였다. 타입 III 외수송 시스템은 식물 세포막을 통한 폴리펩타이드의 전좌에 관여된다고 언급되어 있다. 플라젤린의 필라멘트 조립은 분비될 플라젤린의 유용성에 좌우되며, 분비 과정에 도움을 주는 샤페론(chaperone)이 필요할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 분비 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 중 임의의 것과 조합하여 사용되어 숙주 식물의 사이토졸에 이러한 폴리펩타이드/펩타이드를 전달하여, 식물에 이로운 결과를 제공할 수 있다.
Figure pct00049
본 명세서에 제공된 바와 같은 시그니처(서열번호 542 내지 548; 표 6), 신호 앵커 분류(서열번호 549 내지 562; 표 7) 및 분비(서열번호 563 내지 570; 표 8) 서열은 플라젤린 폴리펩타이드 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 중 임의의 것과 함께 사용되어 성장을 촉진시키고, 건강을 제공하고, 식물 또는 식물 부분에 보호 이득을 제공할 수 있다.
Flg 폴리펩타이드 서열 기능의 변형
표 3, 4 또는 5에 제공되는 L 또는 D Flg-연관된 서열 중 임의의 것은 표 6 내지 표 8에 기재된 바와 같은 지원 서열 중 임의의 것에 대한 융합에서와 같이 유사하게 변형될 수 있다. 일례로, 이러한 지원 서열 중 임의의 것의 융합은 서열번호 226으로서 식별되는 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 서열에 대한 변형을 제공할 것이다.
반응성 산소 종에 대한 반응 또는 폴리펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 Flg-연관된 폴리펩타이드에 대한 돌연변이
폴리펩타이드는 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스 또는 애뉴리니바실루스 속 박테리아로부터 유래될 수 있다. 엔테로박테리아새(Enterobacteraciae)를 비롯한 다른 유박테리아 클래스로부터의 다른 폴리펩타이드가 또한 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 관심대상의 다른 속은 슈도모나스, 에쉐리키아(Escherichia), 산토모나스, 버크홀데리아, 에르위니아 등을 포함한다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751 내지 768 중 임의의 하나를 포함할 수 있다, 예를 들어, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571, 574 및 752 또는 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
임의의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이는, 자연 발생이든 비자연 발생이든 간에, 폴리펩타이드의 성능뿐만 아니라 안정성을 증가시키기 위해서 화학적 변형을 통해서 추가로 변형될 수 있다. 이러한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 플라젤린 폴리펩타이드, 레트로 인버소 폴리펩타이드, 하핀 유래된 폴리펩타이드, 하핀-유사 유래된 폴리펩타이드, EF-Tu 폴리펩타이드, 티오닌 폴리펩타이드, RHPP 폴리펩타이드 및 PSK 폴리펩타이드를 포함한다. 화학적으로 변형될 수 있는 특정 서열은 서열번호 226 내지 592, 594 내지 601, 603 내지 749 및 751 내지 766을 포함한다.
이러한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 또한 식물 결합 도메인 및 폴리펩타이드, 식물 부분 결합 도메인 및 폴리펩타이드, 및 다른 담체, 예컨대, 오일, 플라스틱, 비드, 세라믹, 토양, 비료, 펠릿 및 대부분의 구조 물질을 비롯한 다른 모이어티에 접합될 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 이의 N 또는 C 말단 상에서 화학적으로 변형될 수 있다. N 및 C-말단의 일반적인 변형은 아세틸화, 지질 첨가, 유레아 첨가, 파이로글루탐일 첨가, 카바메이트 첨가, 설폰아마이드 첨가, 알킬아마이드 첨가, 바이오틴일화, 포스포릴화, 글리코실화, 페길화, 메틸화, 바이오틴일화, 산 첨가, 아마이드 첨가, 에스터 첨가, 알데하이드 첨가, 하이드라자이드 첨가, 하이드록시아믹산 첨가, 클로로메틸 케톤 첨가 또는 정제 태그의 첨가를 포함한다. 이러한 태그는 폴리펩타이드의 활성도를 증가시키고, 안정성, 폴리펩타이드에 프로테아제 저해제 능력을 부가하고, 프로테아제를 직접 차단하고, 트래킹(tracking)을 허용하고, 식물 조직에 대한 결합에 도움을 줄 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 가교 또는 고리화를 통해서 변형될 수 있다. 가교는 서로에 또는 2차 표면 또는 모이어티에 폴리펩타이드를 결합시켜 폴리펩타이드의 전달 또는 안정성에 도움을 줄 수 있다. 고리화는, 예를 들어, 폴리펩타이드의 활성도를 증가시킬 뿐만 아니라 폴리펩타이드와 프로테아제 상호작용을 예방하기 위해서 수행될 수 있다.
서열 변형 또는 돌연변이는 표 4 및 5에 기재된 바와 같이 임의의 아미노산 서열(들)에 대해서 수행될 수 있고, 자연에 공지된 20개의 표준 아미노산 서열 중 임의의 것으로 대체되거나 비표준 또는 비-정규(canonical) 아미노산 서열, 예컨대, 셀레노시스테인, 피롤라이신, N-폼일메티오닌 등으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 변형 또는 돌연변이는 서열번호 571에 제시된 바와 같이 내부 서열에 대해서, 서열번호 572 또는 서열번호 753에 제시된 바와 같이 C-말단에 대해서 또는 서열번호 573에 제시된 바와 같이 N 말단에 대해서 일어나서 향상된 ROS 활성 및 식물 또는 식물 부분에서의 증가된 기능성을 갖는 Flg 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 또한 서열번호 752(N-말단 절두)에 제시된 바와 같이 N 또는 C 말단에서 절두되어 식물 또는 식물 부분에서 기능성을 추가로 증가시킬 수 있다. 표 9A는 변형된 ROS 활성도를 제공하는 식별된 플라젤린 폴리펩타이드를 요약한다.
[표 9a]
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Figure pct00051
Figure pct00052
Flg22의 코어 활성 도메인
표 9A에서의 서열의 밑줄친 부분은 Flg22의 코어 활성 도메인을 나타낸다. 이러한 코어 도메인은 예를 들어, 작물 및 장식용 식물에서 성장, 질병, 감소 및/또는 예방을 촉진시킬 수 있는 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 서열번호 754(서열번호 755 내지 765로 나타냄)를 포함한다. 참고 용이성을 위해서, 이러한 코어 도메인은 서열번호 766을 갖는 공통 서열로 제시된다. 서열번호 754 내지 765를 갖는 다양한 네이티브 및 돌연변이체 Flg22 폴리펩타이드를 하기 표 9B에 공통 서열과 함께 기재한다. 따라서, 폴리펩타이드는 코어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 코어 서열은 서열번호 754- 내지 766 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드는 또한 서열번호 1 내지 753 또는 767 내지 768 중 임의의 하나를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함하는 코어 서열을 추가로 포함한다. 유사하지 않은 기능의 폴리펩타이드 또는 전장 단백질에 코어 서열을 포함시키는 것은 폴리펩타이드의 생물활성 프라이밍 활성도를 증가시킬 수 있다.
[표 9b]
Figure pct00053
하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587 내지 592 및 594 내지 597(표 10 및 표 11)을 포함할 수 있다.
하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드는 판토에아 세사미(Pantoea sesami), 에르위니아 게루덴시스(Erwinia gerudensis), 판토에아 세사미(Pantoea sesami), 또는 에르위니아 게루덴시스(Erwinia gerudensis)를 비롯한 산토모나스 종 또는 다양한 박테리아 속으로부터 유래될 수 있다.
추가적인 하핀-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 서열번호 593을 포함하는 산타모나스 시트리(Xanthamonas citri)로부터의 전장 HpaG-유사 단백질로부터 유래될 수 있다.
표 10 또는 표 11에 제시된 바와 같은 네이티브 L-하핀-유사서열(서열번호 587) 또는 레트로 인버소 D-하핀-유사서열(서열번호 588) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 형태를 사용한 HpaG-유사 폴리펩타이드의 적용은 식물 또는 식물 부분에 외인적 또는 내인적으로 적용되는 경우 식물에서 성장 및 면역 반응을 증가시키는데 유용하다. 레트로-인버소 HpaG-유사(예를 들어 서열번호 588) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 비생물학적 스트레스의 조건 하에서 성장되거나 이에 노출되는 식물에 적용되는 경우 HpaG-유사 폴리펩타이드의 활성도 및 안정성을 향상시키는데 특히 유용하다. 레트로-인버소 HpaG-유사 형태는 이러한 환경 하에서 성장되는 식물에서 성장 및 보호 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다.
Figure pct00054
Figure pct00055
파이토설포카인(PSKα) 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 PSK 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598 내지 599를 포함할 수 있다.
파이토설포카인 알파(PSKα)는 본래 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래되었으며, 설폰화된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드이다. PSKα 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들)는 표 11에 존재한다.
PSKα는 재조합 미생물에서 발현되고, 정제되고, 식물 또는 식물 부분에 적용하기 위해서 농업 제형에서 사용되는 합성 폴리펩타이드 또는 자연 폴리펩타이드로서 제공된다.
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근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)
폴리펩타이드는 RHPP를 포함할 수 있다.
RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600 내지 601 및 603 내지 606을 포함할 수 있다. 예를 들어, RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함할 수 있다.
RHPP를 포함하는 폴리펩타이드와 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 조합물이 또한 제공된다. 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 226, 752 및 571 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 600을 포함하는 RHPP 및 서열번호 226을 포함하는 플라젤린을 포함한다.
폴리펩타이드는 PSK 폴리펩타이드, RHPP, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
추가적인 RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 서열번호 602를 포함하는 글리신 맥스로부터의 전장 쿠니츠 트립신 저해제 단백질로부터 유래될 수 있다. RHPP 폴리펩타이드는 C-말단 아마이드화, N-말단 아세틸화 또는 다른 변형을 통해서 변형될 수 있다. RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 쿠니츠 트립신 저해제 및/또는 대두박의 조물질 프로테아제 소화물의 첨가를 통해서 획득될 수 있다.
대두(글리신 맥스)로부터 본래 유래된 RHPP가 예를 들어, 옥수수, 대두 및 다른 채소에서 이로운 표현형을 제공하기 위해서 엽면 시비(foliar application)로서 제공될 수 있다.
Figure pct00057
Figure pct00058
폴리펩타이드는 레트로 인버소(RI) RHPP를 포함할 수 있다.
레트로 인버소 RHPP는 서열번호 601, 605 또는 606을 포함할 수 있다.
레트로 인버소(RI) RHPP는 C-말단 아마이드화 또는 N-말단 아세틸화를 통해서 변형될 수 있다.
Figure pct00059
연장 인자 Tu(EF-Tu) 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
연장 인자 Tu(EF-Tu)로부터 유래된 펩타이드를 별개로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여, 예컨대, Flg22 폴리펩타이드와 조합하여 사용하여 병원성 유기체, 일반적으로 박테리아 및 진균 미생물뿐만 아니라 다른 감염제(infection agent), 예컨대, 바이러스에 대한 다중 모드의 방어를 제공할 수 있다.
표 16은 식물 및 박테리아 둘 다로부터 선택된 다양한 EF-Tu 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로부터 유래된 바람직한 N-말단 폴리펩타이드를 제공한다. EF-Tu 유래된 폴리펩타이드는 18 내지 26개 아미노산 또는 26개 아미노산 길이의 임의의 길이일 수 있다. 표 17은 박테리아 및 조류로부터 유래된 EF-Tu 폴리펩타이드의 레트로-인버스(올-D) 버전을 추가로 제공한다.
EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 607 내지 640 중 하나를 포함할 수 있다.
EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 또는 617을 포함할 수 있다.
EF-Tu 폴리펩타이드는 N-말단 아세틸화를 통해서 변형될 수 있다. 예를 들어, EF-Tu 폴리펩타이드는 N-말단 아세틸화를 통해서 변형될 수 있고, 서열번호 607, 608, 610, 611, 613, 614, 616, 617, 619 또는 622 중 임의의 것을 포함한다.
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Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
티오닌 및 티오닌-표적화 폴리펩타이드
폴리펩타이드는 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는, 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성할 수 있는데, 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, AMP 폴리펩타이드, 예컨대, 티오닌 또는 Flg 폴리펩타이드를 관다발 조직(목질부 및 체관부)에 표적화하는데 유용한 표적화 서열은 유체 및 영양분(예를 들어, 수용성 영양분, 당, 아미노산, 호르몬 등)의 수송에 관여되는 제한된 조직에 서식하는 질병을 표적화하는 데 매우 유용할 수 있다. 관다발 조직, 예컨대, 목질부는 물 및 수용성 영양분을 수송 및 저장하고, 체관 세포는 식물에서 당, 단백질, 아미노산, 호르몬 및 다른 기관 분자를 수송한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 티오닌 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 표적화하는데 유용한 바람직한 관다발/체관부 표적화 폴리펩타이드를 표 18에 제공한다.
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Figure pct00065
체관부 표적화 폴리펩타이드(서열번호 641)의 합성 버전이 항-미생물 폴리펩타이드를 체관부 체관 및 반세포에 표적화하는데 특히 유용하다.
항-미생물 티오닌 폴리펩타이드가 또한 제공되며(표 19), 이것은 티오닌 서열을 감귤뿐만 아니라 다른 식물의 체관부 조직에 표적화하기 위해서 표 18에 제공된 체관부 표적화 서열과 함께 사용된다.
티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 650 내지 749 중 임의의 하나, 예컨대, 서열번호 651을 포함할 수 있다.
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폴리펩타이드는 융합 단백질을 포함할 수 있다.
표 20(서열번호 750)은 합성 티오닌 폴리펩타이드(서열번호 650)를 갖는 합성 체관부 표적화 폴리펩타이드(서열번호 641)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 번역 융합을 제조하는 데 사용되는 서열을 기재한다. 대문자(볼드체 아님) 폰트의 서열을 체관부 표적화 서열을 나타내고, 대문자 볼드 폰트는 체관부 표적화 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 암호화하는 이러한 2개의 펩타이드 서열의 융합(표 20)을 나타낸다.
Figure pct00075
추가적인 변형
또한, 폴리펩타이드는 D-아미노산, β2-아미노산, β3-아미노산, 동종 아미노산, 감마 아미노산, 펩토이드, N-메틸 아미노산 및 다른 비-자연 아미노산 유사체 및 유도체를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
폴리펩타이드는 자연 과정, 예컨대, 번역후 가공에 의해서 또는 당업계에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해서 변형될 수 있다. 변형은 폴리펩타이드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카복시 말단을 비롯한 폴리펩타이드 내의 어디에서도 일어날 수 있다. 동일한 유형의 변형은 폴리펩타이드 내의 몇몇 부위에서 동일하거나 상이한 정도로 존재할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 다수의 유형의 변형을 함유할 수 있다.
펩타이드는, 예를 들어, 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로서 분지화될 수 있고, 그것은 분지화와 함께 또는 분지화 없이 고리화될 수 있다. 환식, 분지형 및 분지형의 환식 폴리펩타이드는 번역후 자연 과정으로부터 생성될 수 있고, 합성 방법에 의해서 제조될 수 있다.
변형은 아세틸화, 산 첨가, 아실화, ADP-리보실화, 알데하이드 첨가, 알킬아마이드 첨가, 아마이드화, 아미노화, 바이오틴일화, 카바메이트 첨가, 클로로메틸 케톤 첨가, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 가교, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 에스터 첨가, 공유 가교부의 형성, 시스테인-시스테인 다이설파이드 결합의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 폼일화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드라자이드 첨가, 하이드록시아믹산 첨가, 하이드록실화, 아이오딘화, 지질 첨가, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질가수분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 팔미토일화, 정제 태그의 첨가, 파이로글루탐일 첨가, 라세미화, 셀레노일화(selenoylation), 설폰아마이드 첨가, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 트랜스퍼-RNA 매개된 첨가, 예컨대, 아르기닐화, 유비퀴틴화 및 유레아 첨가를 포함한다. (예를 들어, 문헌[Creighton et al. (1993) Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York; Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol., 182: 626-646; Rattan et al.(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci., 663: 48-62] 등 참고).
단백질 조작 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하여 변이체를 생성시켜 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 특징을 개선 또는 변경시킬 수 있다. 이러한 변이체는 활성도에 거의 효과가 없도록 당업계에 널리 공지된 일반적인 규칙에 따라서 선택된 결실, 삽입, 역전, 반복, 중복, 연장 및 치환(예를 들어, 보본적 치환)을 포함한다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
II. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 제조
당업자가 널리 이해하고, 일반적으로 사용하는 방법을 사용하여 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(예를 들어, 플라젤린) 및 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(예를 들어, Bt.4Q7Flg22)를 클로닝, 유전자 변형 및 발현시키기 위한 방법 및 접근법이 제공된다. 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있고, 따라서 플라젤린, 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 티오닌, 하핀-유사(HpaG-유사), EF-Tu, PSKα 또는 RHPP 및/또는 이들의 임의의 조합물 중 임의의 것을 포함한다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 입자의 표면 상에 고정되거나 또는 매트릭스 상에 또는 매트릭스 내에 함침된 유리 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 몇몇 발현 시스템이 유리 폴리펩타이드의 생산을 위해서 사용될 수 있다.
플라젤린-유래된 전체-암호, 부분 암호 (플라젤린 폴리펩타이드) 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스 균주, 예를 들어, 바실루스 투린기엔시스 균주 BT013A, 바실루스 세레우스 또는 바실루스 섭틸리스에서 발현될 수 있다. 플라젤린 및 플라젤린-유래된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 풍부한 생산을 가능하게 하기 위해서 적절한 발현 벡터를 사용하여 클로닝된다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 표적 뉴클레오타이드의 클로닝을 용이하게 하기 위해서, 호환성 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 상기에 기재된 pBC 플라스미드 골격을 이. 콜라이 pUC57 클로닝 벡터와 융합시킴으로써 호환성 셔틀 벡터 pSUPER를 작제하였다. 생성된 pSUPER 벡터는 이중 선택 마커(이. 콜라이에서 암피실린 선택 및 바실루스 종에서 테트라사이클린 선택)를 보유한다. 클로닝은 pSUPER 삽입 부위와 중첩된 15bp를 사용하여 합성된 특이적 프라이머를 사용한 표적 뉴클레오타이드의 PCR 증폭에 의해서 수행하였다. 폴리펩타이드를 암호화하는 특이적 유전자를 In-Fusion HD Cloning Kit(클론테크사(Clontech))를 사용하여 pSUPER 벡터에 융합시켰다. pBC 적합한 골격 역방향 및 정방향 프라이머를 사용하여 서열 검증된 pSUPER 작제물을 증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 자가 결찰시켜 B30 공여자 바실루스 종 균주를 형질전환시키는데 사용된 pBC 플라스미드를 생성시켰다. 생어 서열결정(Sanger sequencing)에 의해서 완전히 인트라제닉(intrageneric)인 최종 작제물을 검증하였다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드/펩타이드는 이종 발현 균주로서 지정된 바실루스 섭틸리스 및/또는 바실루스 투린기엔시스 균주를 사용할 수 있는 자유 발현 시스템을 사용함으로써 경작지 및 재배자 적용을 위해서 다량으로 생산된다. pFEe4B라고 지정된 베이스 발현 플라스미드는 이. 콜라이 섹션(= e) 및 바실루스 섹션(= pFE)으로 이루어진다. e 섹션은 pUC19 로부터 유래되었고, 클로닝 목적을 위해서 이. 콜라이에서 벡터의 선택 및 증폭을 가능하게 한다. 그것은 베타-락탐 항생제, 예컨대, 암피실린 및 다른 페니실린 유도체에 대한 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자(bla)뿐만 아니라 벡터 증식을 허용하는 이. 콜라이 복제 기점을 포함한다. pFE 섹션은 바실루스 종에서 선택 및 플라스미드 증폭을 제공하고, 관심대상 이종 폴리펩타이드/펩타이드의 발현을 유도한다. 이와 같이, 그것은 테트라사이클린(tetL)에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 뿐만 아니라 바실루스 종에서 플라스미드을 증폭시키는 책임이 있는 복제 단백질(repU)에 대한 유전자를 함유하는데, 이들 모두는 네이티브 바실루스 세레우스 플라스미드 pBC16로부터 유래되었다. pFEe4B의 발현 카세트는 분비 신호(amyQ), 클로닝 부위 및 종결인자(rspD)를 함유하는데, 전자는 발현된 단백질/펩타이드를 숙주 균주 세포로부터 주변 배지로 분비하고, 후자는 관심대상 오픈 리딩 프레임을 초과하는 전사를 예방한다. pFEe4B에서의 발현은 변형된 자가유도성 프로모터에 의해서 유도되는데, 이것은 배양물이 충분한 광학 밀도에 도달하면 발현을 개시한다. pFEe4b 발현 시스템에서, 발현은 바실루스 섭틸리스로부터의 IPTG-유도성 프로모터 서열에 의해서 제어된다. 이러한 프로모터는 이. 콜라이 lac 리프레서(lacI)와 조합된 변형된 구성적 프로모터 및 리보솜 결합 부위로 이루어진다. 따라서, pFEe4B-암호화된 폴리펩타이드/펩타이드로부터의 발현은 적합한 유도제, 예컨대, 아이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재에 좌우된다. 그러나 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 발현에 유용한 다른 pFe 시스템은 이의 발현을 위한 이러한 유도 시스템에 좌우되지 않는다. pFEe4 플라스미드는 추가로 바실루스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 페니실라제 프로모터의 제어 하에서 이. 콜라이 lacI 유전자를 추가로 보유하여 임의의 유도제의 부재 하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드/펩타이드의 발현을 예방한다.
다른 상업적으로 입수 가능한 발현 벡터, 예를 들어, 바실루스 섭틸리스로부터 유래된 것 중 임의의 것이 또한 유용할 수 있다. 하기 목적하는 기준으로 인해서 재조합 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 생산하기 위해서 다른 발현 벡터를 선택하였다: 재조합 미생물은 비-병원성이고, 일반적으로 안전하다고 간주되는(generally regarded as safe: GRAS) 유기체인 것으로 간주되고, 그것은 코돈 사용에서 상당한 편향이 없고, 세포외 단백질을, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 무세포 버전(들)을 제공하는 배양 배지로 직접 분비할 수 있다.
당업계에서 일반적인 다른 발현 시스템을 사용하여 동일한 방식으로 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 친화도 정제를 사용한 단백질 태그(들)의 사용에 의해서 또는 태그화되지 않은 폴리펩타이드(들)를 방출하는 칼럼 프로테아제 절단 방법을 사용함으로써 생산될 수 있다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 유리 버전을 제조하기 위해서 이러한 접근법을 사용하는 방법은 일반적으로 공지되어 있고, 당업자에게 이해된다.
단백질 태그는 보통 번역된 폴리펩타이드 내에 혼입된 아미노산의 비교적 작은 서열을 포함하여, 기본적으로 관심대상 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 위한 분자 테더를 제공한다. 이것은 일반적으로 재조합 폴리펩타이드의 발현 및 정제에 도움을 주기 위해서 사용된다. 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 친화도 정제의 목적을 위해서 폴리히스티딘(His) 태그를 선택하였다. His 태그를 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단에 융합시킬 수 있다. His 태그는 이중-표지를 위해서 다른 태그와 빈번하게 조합된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드에 대한 태그는 그것을 친화도 정제시키는데 유용할 수 있다. 태그는 또한 특이적 프로테아제 및 칼럼-특이적 프로테아제 절단 방법을 사용하여 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로부터 절단되어 관심대상의 정제된 비태그화된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 전장 전구체 단백질을 방출한다. 이러한 방법은 또한 일반적으로 당업자에게 널리 공지되어 있다. 사용될 수 있는 다른 태그는 당업계에 공지되어 있고, 다른 정제 툴 중에서 FLAG 태그, 항체, 에피토프, 스트렙타비딘/바이오틴을 포함한다. 또 다른 유용한 태그는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그이다.
단백질 태그가 플라스미드 내에 제공되어 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 이상적으로, 플라스미드는 관심대상 폴리펩타이드를 암호화하는 서열과 함께, 분비를 촉진시키기 위한 분비 신호(예를 들어, amyE 또는 amyQ 분비 신호), 및 폴리펩타이드의 안정성을 향상시킴으로써 생산 및 안정성을 향상시키기 위한 단백질 태그(예를 들어, 글루타티온 S 트랜스퍼라제)를 포함한다. 바람직한 경우에, 단백질 태그(예를 들어, GST)는 공통 절단 서열을 포함하는 링커 서열을 사용하여 폴리펩타이드에 연결된다. 이것은 태그를 절단하여, 정제되고 단리된 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 표적화 카이나제의 첨가를 허용할 수 있다. 적합한 공통 절단 서열은 엔테로카이나제 절단 서열(서열번호 772)을 포함할 수 있는데, 이것은 예를 들어, 소 엔테로카이나제의 단순한 적용에 의해서 절단될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩타이드 및 엔테로카이나제(EK) 절단 부위를 포함하는 융합 단백질을 발효를 통해서 생산하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 제공되며, EK 절단 부위는 폴리펩타이드의 활성도 및 안정성을 향상시키는 작용을 한다. 플라스미드에 의해서 암호화된 융합 단백질은 단백질 태그(예를 들어, 폴리-히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 항체 에피토프, 스트렙타비딘/바이오틴, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 또는 이들의 임의의 조합물)를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 엔테로카이나제 절단 부위는 폴리펩타이드와 단백질 태그를 연결하는 연결 영역을 포함한다. 융합 단백질은 또한 분비 신호를 포함할 수 있다. 분비 신호는 amyE 또는 amyQ 분비 신호(예를 들어, 서열번호 769)를 포함할 수 있거나, 또는 상기에 기재된 바와 같은 서열번호 563 내지 570 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 엔테로카이나제(EK) 절단 부위를 포함하는 폴리펩타이드는 엔테로카이나제(EK) 절단 부위가 없는 폴리펩타이드보다 발효를 사용하여 더 높은 수확률로 생산되고, 더 안정적일 수 있다. 바람직한 경우, 엔테로카이나제(예를 들어, 소 엔테로카이나제)를 융합 단백질에 적용하여 관심대상 폴리펩타이드를 활성화(예를 들어, 단리)시킬 수 있다. 엔테로카이나제를 온-사이트(on-site)에 적용하여 투여 전에 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 최대 안정성을 가능하게 할 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 고순도 폴리펩타이드를 제조하기 위한 상업적으로 입수 가능한 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성 형태로 제공될 수 있다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 합성 생산은 당업자에게 널리 공지된 일반적인 고체상 펩타이드 합성 방법을 사용한다. 화학적 합성 방법은 아미노산 전구체로부터의 펩타이드의 단계식 조립을 포함하며, 이에 의해서 펩타이드 연장은 아미노산들 간의 커플링 반응, 그 다음 가역적인 보호기의 제거에 의해서 진행된다. 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 신생 펩타이드 쇄를 불용성 중합체 지지체에 연결하는 공유 부착 단계를 첨가하는데, 이에 의해서 앵커링된 펩타이드는 일련의 사이클에 의해서 연장될 수 있다. 이러한 연장 반응은 완결로 이어지고, 이어서 합성된 폴리펩타이드는 여과 및 세척 단계에 의해서 고체 지지체로부터 제거된다. 합성 및 정제의 완결 이후에 MS 및 HPLC 분석을 수행한다.
플라젤린-연관된 폴리펩타이드(표 1 내지 표 5), 하핀-유사(HpaG-유사) 폴리펩타이드(표 10 및 표 11), 파이토설포카인(PSKα) 폴리펩타이드(표 12), RHPP(표 13 내지 표 15), 연장 인자 Tu(EF-Tu 폴리펩타이드)(표 16 및 표 17), 티오닌 및 티오닌-유사 폴리펩타이드(표 19)에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것은 합성 형태로 제공될 수 있다.
추가로, 이러한 방법은 바람직하게는 시그니처(서열번호 542-548), 신호 앵커 분류(서열번호 549-562) 및 분비(서열번호 563-570) 서열이라고 명명된 보존된 지원 서열을 제조 및 사용하기 위해서 사용될 수 있다.
레트로 인버소는 또한 합성적으로 또는 화학적으로 제조될 수 있다. 올-D 입체구조로 생산된 합성 폴리펩타이드는 모든 L-아미노산 잔기를 이의 D-거울상이성질체로 대체시킴으로써 제조되어, 역 또는 레트로-올-D-이성질체 Flg 폴리펩타이드를 초래한다. 고체상 합성을 사용하여 Flg 폴리펩타이드(들)의 레트로-인버소 버전을 제조한다. 레트로-인버소 폴리펩타이드(들)의 합성 및 정제 후, Flg 폴리펩타이드(들)의 질량 분석법을 사용하여 아미노산 조성을 확인한다. 이어서 레트로-인버소 폴리펩타이드(들)의 순도는 HPLC 분석을 사용하여 95% 이상의 수준으로 확인된다. Flg 폴리펩타이드(들)의 레트로-인버소 버전을 HPLC 체류 시간, 상대 분자량 및 및 아미노산 조성값(IC50μM)을 사용하여 추가로 특징규명한다. 재조합 DNA 기술을 사용한 레트로 인버소 생산은 일반적으로 비-리보솜 단백질 합성 기전의 사용을 포함한다.
고체상 합성에 의해서 제조된 레트로-인버소 합성 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 FLS2 또는 대안적인 FLS 수용체, 예를 들어, 식물에서 또한 발견되는 FLS3에 결합하는 능력에 대해서 시험한다. 경쟁적 ELISA 실험을 사용하여 식물 FLS 수용체에 대한 레트로 인버소 Flg-연관된 폴리펩타이드의 결합 친화도를 확인한다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 박테리아
폴리펩타이드를 발현 또는 과발현하는 재조합 미생물이 또한 제공된다. 폴리펩타이드는 조성물에 대해서 상기에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 하기를 포함할 수 있다: (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 (i)의 RHPP; 또는 (j)의 KTI 폴리펩타이드; 또는 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는(n)의 융합 폴리펩타이드; 또는 (o)의 PSK 폴리펩타이드; 또는 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드.
폴리펩타이드는 미생물에 의해서 발현될 수 있다.
재조합 미생물은 재조합 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 이의 전구체를 효과적인 방식으로 제조할 수 있는 미생물을 포함할 수 있다. 바람직한 미생물은 바실루스 속, 패니바실루스 속의 박테리아, 페니실리엄(Penicillium) 속의 박테리아, 글로무스(Glomus) 속의 박테리아, 슈도모나스 속의 박테리아, 안트로박터(Arthrobacter) 속의 박테리아, 파라코쿠스(Paracoccus)속의 박테리아, 리조븀(Rhizobium) 속의 박테리아, 브래디리조븀(Bradyrhizobium) 속의 박테리아, 아조스프릴리엄(Azosprillium) 속의 박테리아, 엔테로박터 속의 박테리아, 에쉐리키아 속의 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물로부터 유래될 것이다.
재조합 미생물은 바실루스 속의 박테리아, 패니바실루스 속의 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 미생물은 바실루스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실루스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실루스 세레우스, 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 섭틸리스, 바실루스 피르무스, 바실루스 아리아브하타이, 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 리체니포르미스, 바실러스 서쿨란스, 바실루스 플렉서스(Bacillus flexus), 바실루스 네알소니(Bacillus nealsonii), 바실루스 푸물리스, 패니바실루스 박테리아 속 또는 이들의 조합물 포함할 수 있다.
방법 및 접근법은 박테리아 속 및 종을 결정 및 검증하기 위해서 당업자에 의해서 일반적으로 사용된다. 일반적인 방법은 범용 프라이머(ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT) 및 (GGGTTGCGCTCGTTG/AC)를 사용한 16s rRNA 영역의 PCR 증폭으로 박테리아로부터 단리된 염색체 DNA를 제공한다. 이어서 PCR 앰플리콘을 정제시키고, 적절한 박테리아 균주, 예를 들어 바실루스 속의 특정 균주의 올바른 식별에 대해서 서열결정한다.
샘플 프로토콜은 일반적으로 염색체 DNA의 제조, 플라스미드를 사용한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 DNA의 형질전환, 숙주 박테리아 예를 들어, 바실루스 균주에서의 폴리펩타이드의 생산에 대해서 당업자에게 공지되어 있다.
제공된 바실루스 균주는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 균주는 하기를 포함할 수 있다:
(a) 바실루스 아리아브하타이 CAP53(NRRL 번호 B-50819),
(b) 바실루스 아리아브하타이 CAP56(NRRL 번호 B-50817),
(c) 바실루스 플렉서스 BT054(NRRL 번호 B-50816),
(d) 파라코쿠스 콘드라티바에(Paracoccus kondratievae) NC35(NRRL 번호 B-50820),
(e) 바실루스 마이코이데스 BT155(NRRL 번호 B-50921),
(f) 엔테로박터 클로카에(Enterobacter cloacae) CAP12(NRRL 번호 B-50822),
(g) 바실루스 네알소니 BOBA57(NRRL 번호 NRRL B-50821),
(h) 바실루스 마이코이데스 EE118(NRRL 번호 B-50918),
(i) 바실루스 섭틸리스 EE148(NRRL 번호 B-50927),
(j) 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis) EE107(NRRL 번호 B-50920),
(k) 바실루스 마이코이데스 EE141(NRRL 번호 B-50916),
(l) 바실루스 마이코이데스 BT46-3(NRRL 번호 B-50922),
(m) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE128(NRRL 번호 B-50917),
(n) 패니바실루스 마실리엔시스(Paenibacillus massiliensis) BT23(NRRL 번호 B-50923),
(o) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE349(NRRL 번호 B-50928),
(p) 바실루스 섭틸리스 EE218(NRRL 번호 B-50926),
(q) 바실루스 메가테리움 EE281(NRRL 번호 B-50925),
(r) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE-B00377(NRRL B-67119);
(s) 바실루스 슈도마이코이데스 EE-B00366(NRRL B-67120),
(t) 바실루스 마이코이데스 EE-B00363(NRRL B-67121),
(u) 바실루스 푸밀러스 EE-B00143(NRRL B-67123),
(v) 바실루스 투린기엔시스 EE-B00184(NRRL B-67122),
(w) 바실루스 마이코이데스 EE116(NRRL 번호 B-50919),
(x) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE417(NRRL 번호 B-50974),
(y) 바실루스 섭틸리스 EE442(NRRL 번호 B-50975),
(z) 바실루스 섭틸리스 EE443(NRRL 번호 B-50976),
(aa) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE444(NRRL 번호 B-50977),
(bb) 바실루스 섭틸리스 EE405(NRRL 번호 B-50978),
(cc) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE439(NRRL 번호 B-50979),
(dd) 바실루스 메가테리움 EE385(NRRL 번호 B-50980),
(ee) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE387(NRRL 번호 B-50981),
(ff) 바실러스 서쿨란스 EE388(NRRL 번호 B-50982),
(gg) 바실루스 투린기엔시스 EE319(NRRL 번호 B-50983),
(hh) 바실루스 세레우스 패밀리 구성원 EE377(NRRL 번호 B-67119),
(ii) 바실루스 마이코이데스 EE363(NRRL 번호 B-67121),
(jj) 바실루스 슈도마이코이데스 EE366(NRRL 번호 B-67120);
(kk) 바실루스 투린기엔시스 BT013A(NRRL 번호 B-50924);
또는 이들의 임의의 조합물. 이들 균주 각각은 미국 농무부(미국 농업 연구소: USDA) 미국 농업 연구소(Agricultural Research Service: ARS)(미국 일리노이주 61604 페오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815 소재)에 기탁되어 있고, 괄호로 제공된 NRRL 기탁 번호에 의해서 식별된다. 균주 (a) 내지 (d), (f) 및 (g)는 2013년 3월 11일에 기탁하였다. 균주 (e), (h) 내지 (q), (w) 및 (kk)는 2014년 3월 10일에 기탁하였다. 균주 (x) 내지 (ff)는 2014년 9월 10일에 기탁하였다. 균주 (gg)는 2014년 9월 17일에 기탁하였다. 균주 (r) 내지 (v), (hh), (ii) 및 (jj)는 2015년 19일에 기탁하였다. 바실루스 투린기엔시스 BT013A는 바실루스 투린기엔시스 4Q7라고도 공지되어 있다.
이러한 균주의 단리 및 특징규명은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO/2017/161091호의 실시예에 기재되어 있다. 유기체의 식별 용이성을 위해서, 국제 특허 공개 제WO/2017/161091 A1은 또한 서열 목록 및 표 17에서 이러한 균주 각각에 대한 부분 16S 리보솜 RNA 서열을 제공한다.
재조합 미생물 중 임의의 것을 사용하여 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(표 1-5), 하핀 또는 하핀-유사(HpaG-유사) 폴리펩타이드(표 10 또는 표 11), 파이토설포카인(PSKα) 폴리펩타이드(표 12), RHPP(표 13 내지 표15), EF-Tu 폴리펩타이드(표 16-17), 및 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(표 19)에 대해서 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 과발현시킬 수 있다.
재조합 미생물은 본 명세서에 기재된 재조합 미생물 중 임의의 것의 2종 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.
재조합 미생물은 불활성화될 수 있다. 불활성화는 재생산이 불가능한 미생물을 초래한다. 미생물의 불활성화가 이로울 수 있는데, 그 이유는 예를 들어, 살아있는 미생물이 식물 또는 환경에 대해서 가질 수 있는 임의의 해로운 효과를 감소 또는 제거하면서, 식물 또는 식물 성장 매질로의 미생물의 전달을 허용하기 때문이다. 재조합 미생물은 임의의 물리학 또는 화학 수단에 의해서, 예를 들어, 열 처리, 감마 방사선, x-선 방사선, UV-A 방사선, UV-B 방사선에 의해서, 또는 용매, 예컨대, 글루타르알데하이드, 폼알데하이드, 과산화수소, 아세트산, 표백제, 클로로폼, 또는 페놀 또는 이들의 임의의 조합물로의 처리에 의해서 불활성화될 수 있다.
III. 조성물
조성물은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍을 위해서 제공된다. 조성물은 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물 및 농화학적 또는 담체; 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 임의의 조합물을 포함한다.
조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드로 본질적으로 이루어질 수 있다.
조성물은 대부분 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 포함하고, 조성물의 나머지는 농화학물질 또는 담체이다. 보다 구체적으로, 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.00001% 내지 약 95%의 폴리펩타이드, 약 0.1 내지 약 80wt%의 농화학물질, 및 약 5 내지 약 50wt%의 담체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 담체 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.01 내지 약 5wt%의 폴리펩타이드, 약 0.2 내지 약 70wt%의 농화학물질, 및 약 10 내지 약 30wt%의 담체를 포함할 수 있거나, 또는 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.05wt% 내지 약 1wt%의 폴리펩타이드, 약 30 내지 약 60wt%의 농화학물질, 및 약 40 내지 약 69wt%의 담체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 임의의 검출 가능한 양의 폴리펩타이드, 및 약 0.1 내지 약 80wt%의 농화학물질 및 약 5 내지 약 50wt%의 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 자연에서 폴리펩타이드와 연관된 농화학물질 또는 담체를 포함할 수 있다.
농화학물질은 폴리펩타이드와 조합되어 자연적으로 발생하지 않을 수 있다.
농화학물질은 보존제, 완충제, 습윤제, 계면활성제, 코팅제, 단당류, 다당류, 연마제, 살충제, 살곤충제, 제초제, 살선충제, 살박테리아제, 살진균제, 살진드기제, 비료, 생물자극제, 착색제, 보습제, 삼투억제제, 항생제, 아미노산, 생물학적 제어제 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
조성물이 아미노산을 포함하는 경우, 아미노산은 폴리펩타이드를 포함하는 아미노산과 별개로 제공될 수 있다. 예를 들어, 단리된 아미노산이 사용될 수 있다. 적합한 아미노산은 임의의 자연 또는 비자연 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 시스테인을 포함할 수 있다.
농화학물질은 산, 예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩타이드의 화학적 합성법으로부터 존재하는 산을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드가 예컨대, 발효에 의해서 합성되는 경우 예를 들어, 염산, 아세트산 또는 트라이플루오로아세트산이 존재할 수 있다.
농화학물질이 산인 경우, 그것은 조성물의 총 중량의 약 0.001 내지 약 30wt%, 약 0.01 내지 약 20wt%, 또는 약 0.1 내지 약 5wt%를 차지할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 각가의 농화학물질은 조성물의 총 중량의 약 0.1 내지 약 60wt%, 약 0.5 내지 약 50wt% 또는 약 10 내지 약 30wt%를 차지할 수 있다.
조성물이 보존제를 포함하는 경우, 보존제는 다이클로로펜 및 벤질알코올 헤미 폼알을 기재로 하는 것(ICI로부터의 PROXE 또는또는 토르 케미사(Thor Chemie)로부터의 ACTICIDE RS 및 다우 케미컬사(Dow Chemical)로부터의 KATHON MK) 및 아이소티아졸리논 유도체, 예컨대, 알킬아이소티아졸리논 및 벤즈아이소티아졸리논(토르 케미사로부터의 ACTICIDE MBS)를 포함할 수 있다. 추가 예로서, 적합한 보존제는 MIT(2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온), BIT(1,2-벤즈아이소티아졸린-3-온, 아베시아사(Avecia, Inc.)로부터 수산화나트륨 및 다이프로필렌 글리콜의 용액으로서 Proxel GXL로 입수될 수 있음), 5-클로로-2-(4-클로로벤질)-3(2H)-아이소티아졸론, 5-클로로- 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온, 5-클로로-2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온, 5-클로로- 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온-염산염, 4,5-다이클로로-2-사이클로헥실-4- 아이소티아졸린-3-온, 4,5-다이클로로-2-옥틸-2H-아이소티아졸-3-온, 2-메틸-2H- 아이소티아졸-3-온, 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온-염화칼슘 복합체, 2-옥틸-2H-아이소티아졸-3-온, 벤질 알코올 헤미폼알 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
조성물이 완충제를 포함하는 경우, 완충제는 칼륨, 인산, 포스페이트염, 스트르산, 시트레이트염, 설페이트염, MOPS 또는 HEPES를 포함할 수 있다. 완충제는 조성물에서 폴리펩타이드를 안정화시킬 수 있다.
조성물이 습윤제를 포함하는 경우, 습윤제는 유기실리콘, 폴리옥시에톡실레이트, 폴리솔베이트, 폴리에틸렌글리콜 및 이의 유도체, 에톡실레이트, 작물 오일 및 다당류를 포함할 수 있다.
조성물이 계면활성제를 포함하는 경우, 계면활성제는 중질 석유 오일, 중질 석유 증류물, 폴리올 지방산 에스터, 폴리에톡실화 지방산 에스터, 아릴 알킬 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 모노부틸 에터, 알킬 아민 아세테이트, 알킬 아릴 설포네이트, 다가 알코올, 알킬 포스페이트, 알코올 에톡실레이트, 알킬페놀 에톡실레이트, 알킬페놀 에톡실레이트, 알콕실화 폴리올, 알킬폴리에톡시 에터, 알킬폴리옥시에틸렌 글리세롤, 에톡실화 및 대두 오일 유도체, 유기실리콘계 계면활성제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 계면활성제는 옆면 사용을 위한 것을 비롯한 다양한 조성물에 포함될 수 있다.
조성물이 코팅제를 포함하는 경우, 코팅제는 증점제, 중합체, 충전제 또는 벌킹제를 포함할 수 있다.
증점제는 카복시메틸셀룰로스 및 분말, 과립 또는 라텍스 형태의 자연 및 합성 중합체, 예컨대, 아라비아검, 키틴, 폴리바이닐 알코올 및 폴리바이닐 아세테이트, 뿐만 아니라 자연 인지질, 예컨대, 세팔린 및 레시틴 및 합성 인지질을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 증점제는 코팅될 종자에 대한 식물독성 효과 없이 자연 또는 합성 유래될 수 있는 접착 중합체로 바람직하게 구성되는 것을 포함한다. 단독으로 또는 조합하여 포함될 수 있는 추가적인 증점제는, 예를 들어, 폴리에스터, 폴리에터 에스터, 폴리언하이드라이드, 폴리에스터 우레탄, 폴리에스터 아마이드; 폴리바이닐 아세테이트; 폴리바이닐 아세테이트 공중합체; 폴리바이닐 알코올 및 타일로스; 폴리바이닐 알코올 공중합체; 폴리바이닐피롤리돈; 다당류, 예컨대, 전분, 변형된 전분 및 전분 유도체, 덱스트린, 말토덱스트린, 알지네이트, 키토산 및 셀룰로스, 셀룰로스 에스터, 셀룰로스 에터 및 셀룰로스 에터 에스터, 예컨대, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 카복시메틸셀룰로스; 지방; 오일; 단백질, 예컨대, 카제인, 젤라틴 및 제인; 아라비아검; 쉘락; 바이닐리덴 클로라이드 및 바이닐리덴 클로라이드 공중합체; 리그노설포네이트, 특히 칼슘 리그노설포네이트; 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 및 아크릴 공중합체; 폴리바이닐아크릴레이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리부텐, 폴리아이소부텐, 폴리스타이렌, 폴리부타다이엔, 폴리에틸렌아민, 폴리에틸렌아마이드; 아크릴아마이드 중합체 및 공중합체; 폴리하이드록시에틸 아크릴레이트, 메틸아크릴아마이드 단량체; 및 폴리클로로프렌 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 증점제는 종자 처리용을 비롯한 다양한 조성물에서 사용될 수 있다.
조성물이 연마제를 포함하는 경우, 연마제는 탤크, 흑연 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
보습제는 수분 보유를 보조하는 흡습성 물질이다. 조성물이 보습제를 포함하는 경우, 보습제는 하기를 포함할 수 있다: 글리세롤, 글리세린, 글리세롤 유도체(예를 들어 글리세롤 모노스테아레이트, 글리세롤 트라이아세테이트, 트라이아세틴, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜 또는 부틸렌 글리콜), 트라이에틸렌 글리콜, 트라이폴리프로필렌 글리콜, 글리세릴 트라이아세테이트, 수크로스, 태가토스, 당 알코올 또는 당 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 솔비톨, 자일리톨, 만니톨 또는 만티톨(mantitol)), 중합체 폴리올(예를 들어 폴리덱스트로스, 콜라겐, 알로에 또는 알로에 베라 겔) 또는 알파 하이드록시산(예를 들어, 락트산, 꿀, 당밀, 퀼라이아(quillaia), 소듐 헥사메타포스페이트, 염화리튬 또는 유레아). 합성 보습제는 또한 부틸렌 글리콜 및 트레멜라 추출물을 포함할 수 있다.
조성물이 살충제를 포함하는 경우, 살충제는 살곤충제, 제초제, 살진균제, 살박테리아제, 살선충제, 살진드기제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
조성물이 살곤충제를 포함하는 경우, 살곤충제는 클로티아니딘, 이미다클로프리드, 유기포스페이트, 카바메이트, 피레트로이드, 살비제, 알킬 프탈레이트, 붕산, 붕산염, 플루오라이드, 황, 할로방향족 치환된 유레아, 탄화수소 에스터, 생물계 살곤충제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 살곤충제는 클로티아니딘 또는 이미다클로프리드를 포함할 수 있다.
농화학물질은 제초제를 포함할 수 있다. 제초제는 하기를 포함할 수 있다: 2,4-D, 2,4-DB, 아세토클로르, 아시플루오르펜, 알라클로르, 아메트린, 아트라진, 아미노피랄리드, 베네핀, 벤설퓨론, 벤설퓨론 메틸 벤설파이드, 벤타존, 비스피리박 소듐, 브로마실, 브로목시닐, 부틸레이트, 카르펜트라존, 클로리뮤론, 2-클로로페녹시 아세트산, 클로르설퓨론, 클로리뮤론 에틸, 클레토딤, 클로마존, 클로피랄리드, 클로란설람, CMPP-P-DMA, 사이클로에이트, DCPA, 데스메디팜, 디캄바, 다이클로베닐, 다이클로폽, 2,4-다이클로로페놀, 다이클로로페녹시아세트산, 다이클로프롭, 다이클로프롭-P, 다이클로설람, 다이플루펜조피르, 다이메텐아미드, 2,4-다이클로로페녹시아세트산의 다이메틸 아민염, 다이쿼트, 다이유론, DSMA, 엔도탈, EPTC, 에탈플루랄린, 에토퓨메세이트, 페녹사프롭, 플루지폽-P, 플루카바존, 플루페나세트, 플루메트설람, 플루미클락, 플루미옥사진, 플루오메투론, 플루록시피르, 플루오르자이피르 1-메틸엡틸에스터, 포메사펜, 포메사펜 나트륨염, 포람설퓨론, 글루포시네이트, 글루포시네이트-암모늄, 글리포세이트, 할로설퓨론, 할로설퓨론-메틸, 헥사지논, 2-하이드록시페녹시 아세트산, 4-하이드록시페녹시 아세트산, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자퀸, 이마제타피르, 아이속사벤, 아이속사플루톨, 락토펜, 리누론, 마자피르, MCPA, MCPB, 메코프롭, 메코프롭-P, 메소트라이온, 메톨라클로르-s, 메트리부진, 메트설퓨론, 메트설퓨론-메틸, 몰리네이트, MSMA, 나프롭아마이드, 납탈람, 니코설퓨론, 노르플루라존, 오리잘린, 옥사디아존, 옥시플루오르펜, 파라쿼트, 펠라곤산, 펜다이메탈린, 펜메디팜, 피클로람, 프리미설퓨론, 프로다이아민, 프로메트린, 프론아마이드, 프로파닐, 프로설퓨론, 피라존, 피리티오박, 피록사설폰, 퀸클로락, 퀴잘로폽, 림설퓨론, 세톡시딤, 시두론, 시마진, 설펜트라존, 설포메투론, 설포설퓨론, 테부티우론, 터바실, 티아조피르, 티펜설퓨론, 티펜설퓨론-메틸, 티오벤카르브, 트랄콕시딤, 트라이랄레이트, 트라이아설퓨론, 트라이베뉴론, 트라이버뉴론-메틸, 트라이클로피르, 트라이플루랄린, 트라이플루설퓨론 또는 이들의 임의의 조합물.
조성물이 살선충제를 포함하는 경우, 살선충제는 바실루스 피르무스, 플루오피람, 항생제 살선충제, 예컨대, 아바멕틴; 카바메이트 살선충제, 예컨대, 아세토프롤, 바실루스 키토노스포러스(Bacillus chitonosporus), 클로로피크린, 벤클로티아즈, 베노밀, 버홀데리아 세파시아(Burholderia cepacia), 카보푸란, 카보설판 및 클레오토카드; 다조메트, DBCP, DCIP, 알라니캅, 알디캅, 알독시캅, 옥사밀, 다이아미다포스, 페나미포스, 포스티에탄, 포스파마이돈, 카두사포스, 클로르피리포스, 다이클로펜티온, 다이메토에이트, 에토프로포스, 펜설포티온, 포스티아제이트, 하핀즈, 헤테로포스, 이미시아포스, 이사피도포스, 이사조포스, 메토밀, 메카폰, 마이로테큠 버루카리(Myrothecium verrucaria), 패실로마이세스 리라시누스(Paecilomyces lilacinus), 파스테우리아 니쉬자왜(Pasteuria nishizawae)(이의 포자 포함), 포레이트, 포스포캅, 터부포스, 티오나진, 트라이아조포스, 티옥사자펜, 다조메트, 1,2-다이클로로프로판, 1,3-다이클로로프로펜, 퍼퍼랄, 아이오도메탄, 메탐, 메틸 브로마이드, 메틸 아이소티오사이아네이트, 자일렌올 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 살선충제는 바실루스 피르무스 균주 i-2580, 파스테우리아 니쉬자왜(이의 포자 포함) 또는 플루오피람을 포함할 수 있다.
조성물이 살박테리아제를 포함하는 경우, 살박테리아제는 스트렙토마이신, 페니실린, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 카수가마이신, 암피실린, 옥솔린산, 클로로테트라사이클린, 구리 옥사이드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 살박테리아제는 옥시테트라사이클린을 포함할 수 있다.
생물학적 제어제는 합성 살충제 또는 비료 대신에 사용될 수 있는 미생물로서 넓게 정의된다. 조성물이 생물학적 제어제를 포함하는 경우, 생물학적 제어제는 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 마이코이데스 아이솔레이트 J, 바실루스 메틸로트로피쿠스, 바실루스 발리스모티스, 크로모박테리움 서브츠개(Chromobacterium subtsugae), 델프티아 아시도보란스, 스트렙토마이세스 리디쿠스, 스트렙토마이세스 콜롬비엔시스, 스트렙토마이세스 갈부스 K61, 페니실리엄 빌라이, 당단백질-생산 바실루스 섭틸리스 균주, 당단백질-생산 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 균주, 바실루스 피르무스 균주 또는 바실루스 푸밀러스 균주를 포함할 수 있다.
농화학물질은 살진균제를 포함할 수 있다. 살진균제는 하기를 포함할 수 있다: 알디모르프, 암프로필포스, 암프로필포스 포타슘, 안도프림, 아닐라진, 아자코나졸, 아족시스트로빈, 베날락실, 베노다닐, 베노밀, 벤자마크릴, 벤자마크릴-아이소부틸, 벤조빈드플루피르, 비알라포스, 비나파크릴, 바이페닐, 비테르타놀, 블라스티시딘-S, 보스칼리드, 브로무코나졸, 부피리메이트, 부티오베이트, 칼슘 폴리설파이드, 캅시마이신, 캅타폴, 캅탄, 카벤다짐, 카르본(carvon), 퀴노메티오네이트, 클로벤티아존, 클로르페나졸, 클로로넵, 클로로피크린, 클로로탈로닐, 클로졸리네이트, 클로질라콘, 쿠프라넵, 시목사닐, 사이프로코나졸, 사이프로디닐, 사이프로푸람, 데바캅, 다이클로로펜, 다이클로부트라졸, 다이클로플루아니드, 다이클로메진, 다이클로란, 다이에토펜캅, 다이메티리몰, 다이메토모르프, 다이목시스트로빈, 다이니코나졸, 디니코나졸-M, 디노캅, 다이페닐아민, 다이피리티온, 디탈림포스, 다이티아논, 도데모르프, 도딘, 드라족솔론, 에디펜포스, 에폭시코나졸, 에타코나졸, 에티리몰, 에트리디아졸, 파목사돈, 페나파닐, 페나리몰, 펜부코나졸, 펜푸람, 페니트로판, 펜피클로닐, 펜프로피딘, 펜프로피모르프, 펜틴 아세테이트, 수산화 펜틴, 페르밤, 페림존, 플루아지남, 플루다이옥소닐, 플루메토버, 플루오로마이드, 플루옥사스트로빈, 플루퀸코나졸, 플루프리미돌, 플루실라졸, 플루설파마이드, 플루톨라닐, 플루트라이아폴, 폴페트, 포세틸-알루미늄, 포세틸-소듐, 프탈리드, 푸베리다졸, 푸랄락실, 푸라메트피르, 푸르카보닐, 푸르코나졸, 푸르코나졸-시스, 푸르메사이클록스, 구아자틴, 헥사클로로벤젠, 헥사코나졸, 하이멕사졸, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이미녹타딘, 이미녹타딘 알베실레이트, 이미녹타딘 트라이아세테이트, 아이오도캅, 이프로벤포스(IBP), 이프로다이온, 이루마마이신, 아이소프로티올란, 아이소발레디온, 카수가마이신, 크레속심-메틸, 구리 제제, 예를 들어 수산화 구리, 구리 나프테네이트, 옥시염화구리, 황산구리, 산화구리, 옥신-구리 및 보르도(Bordeaux) 혼합물, 만쿠퍼, 만코젭, 마넵, 메페림존, 메파니피림, 메프로닐, 메트코나졸, 메탈락실, 메타설포캅, 메트푸록삼, 메티람, 메토메클람, 메트설포박스, 밀디오마이신, 마이클로부타닐, 마이클로졸린, 니켈 다이메틸다이티오카바메이트, 니트로탈-아이소프로필, 누아리몰, 오푸라스, 옥사딕실, 옥사모캅, 옥솔린산, 옥시카복심, 옥시펜티인, 파클로부트라졸, 페푸라조에이트, 펜코나졸, 펜시쿠론, 포스다이펜, 피콕시스트로빈, 피마리신, 피페랄린, 폴리옥신, 폴리옥소림, 프로베나졸, 프로클로라즈, 프로사이미돈, 프로파모캅, 프로파노신-소듐, 프로피코나졸, 프로피넵, 프로티오시나졸, 피라조포스, 피리페녹스, 피리메타닐, 피로퀼론, 피록시푸르, 퀸코나졸, 퀸토젠(PCNB), 스트로빌루린, 황 및 황 제제, 테부코나졸, 테클로프탈람, 테크나젠, 테트사이클라시스, 테트라코나졸, 티아벤다졸, 티사이오펜, 티플루자마이드, 티오파네이트-메틸, 티옥시미드, 톨클로포스-메틸, 톨릴플루아니드, 트라이아디메폰, 트라이아디메놀, 트라이아즈부틸, 트라이아졸, 트라이아족사이드, 트라이클라미드, 트라이사이클라졸, 트라이이클로피르, 트라이데모르프, 트라이플록시스트로빈, 트라이플루미졸, 트라이포린, 유니코나졸, 발리다마이신 A, 빈클로졸린, 비니코나졸, 자릴라마이드, 지넵, 지람 및 또한 다거(Dagger) G, OK-8705, OK-8801, a-(1,1-다이메틸에틸)-(3-(2-페녹시에틸)-1H-1,2,4-트라이아졸론-1-에탄올, a-(2,4-다이클로로페닐)-[3-플루오로-3-프로필-1 H--1,2,4-트라이아졸론-1-에탄올, a-(2,4-다이클로로페닐)-[3-메톡시-a-메틸-1 H-1,2,4-트라이아졸론-1 -에탄올, a-(5-메틸 -1,3-다이옥산-5-일)-[3-[[4-(트라이플루오로메틸) -페닐]-메틸렌]-1 H-1,2,4-트라이아졸론-1 -에탄올, (5RS,6RS)-6-하이드록시-2,2,7,7-테트라메틸-5-(1 H-1,2,4-트라이아졸론-1-일)-3-옥탄오에이트, (E)-a-(메톡시이미노)-N-메틸-2-페녹시-페닐아세트아마이드, 1-아이소프로필{2-메틸-1-[[[1-(4-메틸페닐)-에틸]-아미노]-카보닐]-프로필}카바메이트, 1-(2,4-다이클로로페닐)-2-(1 H-1,2,4-트라이아졸론-1-일)-에탄온-O-(페닐 메틸)-옥심, 1-(2-메틸-1-나프탈렌일)-1 H-피롤-2,5-다이온, 1-(3,5-다이클로로페닐)-3-(2-프로펜일)-2,5-피롤리딘다이온, 1-[(다이아이오도메틸)-설폰일]-4-메틸-벤젠, 1-[[2-(2,4-다이클로로페닐)-1, 3-다이옥솔란-2-일]-메틸]-1 H-이미다졸, 1-[[2-(4-클로로페닐)-3-페닐옥시란일]-메틸]-1 H-1,2,4-트라이아졸론, 1-[1-[2-[(2,4-다이클로로페닐)-메톡시]-페닐]-에텐일]-1 H-이미다졸, 1-메틸 -5-노닐-2-(페닐메틸)-3-피롤리딘올, 2',6'-다이브로모-2-메틸-4'-트라이플루오로메톡시-4'-트라이플루오로-메틸-1, 3-티아졸 -카복스아닐리드, 2,2-다이클로로-N-[1-(4-클로로페닐)-에틸]-1-에틸-3-메틸-사이클로프로판카복스아마이드, 2,6-다이클로로-5-(메틸티오)-4-피리미딘일-티오사이아네이트, 2,6-다이클로로-N-(4-트라이플루오로메틸벤질)-벤즈아마이드, 2,6-다이클로로-N-[[4-(트라이플루오로메틸)-페닐]-메틸]-벤즈아마이드, 2-(2,3,3-트라이아이오도-2-프로펜일)-2H-테트라졸, 2-[(1-메틸에틸)-설폰일]-5-(트라이클로로메틸)-1,3,4-티아디아졸, 2-[[6-데옥시-4-O-(4-0-메틸-(3-D-글리코피라노실)-a-D-글루코피라노실]-아미노]-4-메톡시-1 H-피롤로 [2,3-d]피리미딘-5-카보나이트릴, 2-아미노부탄, 2-브로모-2-(브로모메틸)-펜탄다이나이트릴, 2-클로로-N-(2,3-다이하이드로-1,1,3-트라이메틸-1 H-인덴-4-일)-3-피리딘카복스아마이드, 2-클로로-N-(2,6-다이메틸페닐)-N-(아이소티오사이아네이토메틸)-아세트아마이드, 2-페닐페놀(OPP), 3,4-다이클로로-1-[4-(다이플루오로메톡시)-페닐]-피롤-2,5-다이온, 3,5-다이클로로-N-[사이아노[(1-메틸-2-프로핀일)-옥시]-메틸]-벤즈아마이드, 3-(1,1-다이메틸프로필-1-옥소-1H-인덴-2-카보나이트릴, 3-[2-(4-클로로페닐)-5-에톡시-3-아이속사졸리딘일]-피리딘, 4-클로로-2-사이아노-N,N-다이메틸-5-(4-메틸페닐)-1 H-이미다졸-1-설폰아마이드, 4-메틸-테트라졸로[1,5-a]퀴나졸린-5(4H)-온, 8-(1,1-다이메틸에틸)-N-에틸-N-프로필-1,4-다이옥사스피로[4, 5]데칸-2-메탄아민, 8-하이드록시퀴놀린 설페이트, 9H-잔텐-2-[(페닐아미노)-카보닐]-9-카복실 하이드라자이드, 비스-(1-메틸에틸)-3-메틸-4-[(3-메틸벤조일)-옥시]-2,5-티오펜다이카복실레이트, 시스-1-(4-클로로페닐)-2-(1 H-1,2,4-트라이아졸론-1-일)-사이클로헵탄올, 시스-4-[3-[4-(1,1-다이메틸프로필)-페닐-2-메틸프로필]-2,6-다이메틸-몰폴린 염산염, 에틸 [(4-클로로페닐)-아조]-사이아노아세테이트, 중탄산칼륨, 메탄테트라티올-나트륨염, 메틸 1-(2,3-다이하이드로-2,2-다이메틸-인덴-1-일)-1 H-이미다졸-5-카복실레이트, 메틸 N-(2,6-다이메틸페닐)-N-(5-아이속사졸릴카보닐)-DL-알라니네이트, 메틸 N-(클로로아세틸)-N-(2,6-다이메틸페닐)-DL-알라니네이트, N-(2,3-다이클로로-4-하이드록시페닐)-1-메틸-사이클로헥산카복스아마이드, N-(2,6-다이메틸 페닐)-2-메톡시-N-(테트라 하이드로-2-옥소-3-퓨란일)-아세트아마이드, N-(2,6-다이메틸 페닐)-2-메톡시-N-(테트라하이드로-2-옥소-3-티엔일)-아세트아마이드, N-(2-클로로-4-나이트로페닐)-4-메틸-3-나이트로-벤젠설폰아마이드, N-(4-사이클로헥실페닐)-1,4,5,6-테트라하이드로-2-피리미딘아민, N-(4-헥실페닐)-1,4,5,6-테트라하이드로-2-피리미딘아민, N-(5-클로로-2-메틸페닐)-2-메톡시-N-(2-옥소-3-옥사졸리딘일)-아세트아마이드, N-(6-메톡시)-3-피리딘일)-사이클로프로판카복스아마이드, N-[2,2,2-트라이클로로-1-[(클로로아세틸)-아미노]-에틸]-벤즈아마이드, N-[3-클로로-4,5-비스(2-프로핀일옥시)-페닐]-N'-메톡시-메탄이미다마이드, N-폼일-N-하이드록시-DL-알라닌-나트륨염, 0,0-다이에틸 [2-(다이프로필아미노)-2-옥소에틸]-에틸포스포르아미도티오에이트, 0-메틸 S-페닐 페닐프로필포스포르아미도티오에이트, S-메틸 1,2,3-벤조티아디아졸-7-카보티오에이트 및 스피로[2H]-1-벤조피란-2,1'(3'H)-아이소벤조퓨란]-3'-온, N-트라이클로로메틸)티오-4- 사이클로헥산-1,2-다이카복스이미드, 테트라메틸티오퍼옥시다이카본산 다이아마이드, 메틸 N-(2,6-다이메틸페닐)-N-(메톡시아세틸)-DL-알라니네이트, 4-(2,2-다이플루오로-1,3-벤조다이옥솔-4-일)-1-H-피롤-3-카보나이트릴 또는 이들의 임의의 조합물.
폴리펩타이드가 상업적으로 입수 가능한 살진균제와 조합하여 제형화되거나 적용되는 경우, 조성물은 식물에서 질병 예방 또는 확산을 개선시키기 위해서 추가 보호층을 제공할 수 있다. 폴리펩타이드와 살진균제의 조합물은 식물이 비생물학적 스트레스 또는 질병에 대한 노출로 인한 훼손되거나 약해지는 경우 일어날 수 있는 1차 또는 2차 진균 감염에 대해서 식물을 보호할 수 있다.
스트로빌루린(strobilurin) 살진균제는 스트로빌루린 A, 스트로빌루린 B, 스트로빌루린 C, 스트로빌루린 D, 스트로빌루린 E, 스트로빌루린 F, 스트로빌루린 G, 스트로빌루린 H, 아족시스트로빈, 트라이플록시스트로빈, 크레속심 메틸, 플루옥사스트로빈, 피콕시스트로빈 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
스트로빌루린 살진균제는 비-자연 발생 스트로빌루린 살진균제, 예컨대, 아족시스트로빈, 트라이플록시스트로빈, 크레속심 메틸, 플루옥사스트로빈 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스트로빌루린 살진균제는 트라이플록시스트로빈, 플루옥사스트로빈 또는 피콕시스트로빈을 포함할 수 있다. 스트로빌루린 살진균제는 물곰팡이, 노균병, 백분병, 잎 반점 및 마름병 진균, 열매 로터(fruit rotter), 및 녹병을 비롯한 다양한 진균병의 방제를 위해서 사용된다. 이것은 곡물, 농작물, 열매, 견과, 채소, 잔디풀 및 장식식물을 비롯한 다양한 작물의 처리에 유용하다.
트라이아졸론 살진균제는 프로티오코나졸, 이미다졸, 이미다질, 프로클로라즈, 프로피코나졸, 트라이플루미졸, 다이니코나졸, 플루실라졸, 펜코나졸, 헥사코나졸, 사이프로코나졸, 마이클로부타닐, 테부코나졸, 다이페노코나졸, 테트라코나졸, 펜부코나졸, 에폭시코나졸, 메트코나졸, 플루퀸코나졸, 트라이티코나졸 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 스트로빌루린 및 트라이아졸론 살진균제와 조합하여, 특히 프로티오코나졸과 조합된 플루옥사스트로빈 또는 트라이플록시스트로빈과 조합하여 전달될 수 있다.
또한, 살진균제는 아족시스트로빈, 카복신, 다이페노코나졸, 플루다이옥소닐, 플룩사피로자드, 이프코나졸, 메페녹삼, 피라클로스트로빈, 실티오팜, 세닥산, 티람, 트라이티코나졸 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 엽면 시비되는 살진균제에 더하여, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 살진균제, 살곤충제, 살선충제, 살박테리아제 및 살진드기제 또는 생물제인 임의의 농화학물질과 조합하여 제공될 수 있다.
농화학물질은 비료를 포함할 수 있다. 비료는 암모늄 설페이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 설페이트 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 바이설페이트, 암모늄 폴리설파이드, 암모늄 티오설페이트, 수성 암모니아, 무수 암모니아, 암모늄 폴리포스페이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 나이트레이트, 칼슘 암모늄 나이트레이트, 칼슘 설페이트, 하소된 마그네사이트, 방해석질 석회암, 칼슘 옥사이드, 칼슘 나이트레이트, 백운석질 석회암, 소석회, 칼슘 카보네이트, 다이암모늄 포스페이트, 모노암모늄 포스페이트, 마그네슘 나이트레이트, 마그네슘 설페이트, 포타슘 나이트레이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 마그네슘 설페이트, 포타슘 설페이트, 소듐 나이트레이트, 마그네시아질 석회암, 마그네시아, 유레아, 유레아-폼알데하이드, 유레아 암모늄 나이트레이트, 황-코팅된 유레아, 중합체-코팅된 유레아, 아이소부틸리덴 다이유레아, K2SO4-Mg2SO4, 카이나이트, 실비나이트, 키젤석, 엡솜(Epsom)염, 황 원소, 이회암, 패분(ground oyster shell), 어분, 오일 케이크, 어비, 혈분, 인광석, 과인산염, 슬래그, 골분, 나무재, 거름, 박쥐 구아노(bat guano), 초탄, 퇴비, 산사(green sand), 면실박, 우모분, 갑각류분(crab meal), 어류 에멀션(fish emulsion), 휴믹산 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
비료는 액체 비료 또는 건조 비료를 포함할 수 있다.
농화학물질은 미량영양분 비료 물질, 미량영양분 비료 물질 포함 붕산, 붕산염, 붕소 프릿, 구리 설페이트, 구리 프릿, 구리 킬레이트, 소듐 테트라붕산염 10수화물, 철 설페이트, 철 옥사이드, 철 암모늄 설페이트, 철 프릿, 철 킬레이트, 망간 설페이트, 망간 옥사이드, 망간 킬레이트, 망간 클로라이드, 망간 프릿, 소듐 몰리브데이트, 몰리브덴산, 아연 설페이트, 아연 옥사이드, 아연 카보네이트, 아연 프릿, 아연 포스페이트, 아연 킬레이트 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
농화학적물질은 살곤충제를 포함할 수 있고, 살곤충제는 유기포스페이트, 카바메이트, 피레트로이드, 살비제, 알킬 프탈레이트, 붕산, 붕산염, 플루오라이드, 황, 할로방향족 치환된 유레아, 탄화수소 에스터, 생물계 살곤충제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
조성물이 생물자극제를 포함하는 경우, 생물자극제는 해조류 추출물, 유도인자, 다당류, 단당류, 단백질 추출물, 대두 추출물, 휴믹산, 식물 호르몬, 식물 성장 조절제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
나이트로소, 나이트로로서 분류된 발색단, 아조, 예컨대, 모노아조, 비스아조, 및 폴리아조, 다이페닐메탄, 트라이아릴메탄, 잔텐, 메탄, 아크리딘, 티아졸, 티아진, 인다민, 인도페놀, 아진, 옥사진, 안트라퀴논, 프탈로사이아닌 또는 이들의 임의의 조합물을 비롯한 다양한 착색제가 사용될 수 있다.
조성물은 담체를 추가로 포함할 수 있다.
조성물의 담체는 물, 토탄, 밀, 겨, 질석, 점토, 살균 토양, 칼슘 카보네이트, 칼슘 바이카보네이트, 백운석, 석고, 벤토나이트, 점토, 인광석, 인 화합물, 타이타늄 다이옥사이드, 부엽토, 탤크, 알지네이트, 활성 차콜 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
조성물은 수성 용액, 슬러리 또는 분산물, 에멀션, 고형물, 예컨대, 분말 또는 과립 또는 식물 또는 식물 부분에 조성물을 적용하기에 바람직한 임의의 다른 형태로 존재할 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, 플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 티오닌(디펜신 패밀리), 하핀-유사HpaG, EF-Tu 또는 다른 성장 촉진 또는 변경 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, PSKα 및 RHPP는 식물 또는 식물 부분에 외인적 및/또는 내인적으로 적용될 수 있고, 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같은 식물 또는 식물 부분의 향상된 식물 성장, 생산성 및 향상된 건강을 제공할 수 있는 조성물로서 제공될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 별개로 또는 식물 및/또는 식물 부분에 이득을 제공하기 위한 적용으로서 유용한 조성물로서 조합하여 첨가될 수 있다.
조합물에서, 폴리펩타이드는 동일한 재조합 벡터 상의 유전자 융합체로서 정제된 폴리펩타이드로 또는 상이한 재조합 벡터를 사용하여 별개로 제형화되고, 전달될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 또한 융합 단백질 중의 다수의 활성물질로부터의 폴리펩타이드로서 생성되고, 식물 또는 식물 부분에 전달될 수 있다. 이의 예는 당업자의 기술 범위에 포함되는 바와 같은 각각의 폴리펩타이드 사이의 프로테아제 절단 부위를 사용하여 연속하여 생산된 다수의 플라젤린 연관된 폴리펩타이드의 전달을 포함한다. 이러한 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 임의의 조합물, 예컨대, 상이한 클래스로부터의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, 플라젤린 연관된 폴리펩타이드와 RHPP의 조합물을 포함할 수 있다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 또한 식물 결합 도메인에 대한 단백질 융합으로서 이용될 수 있는데, 이것은 폴리펩타이드가 그들의 활성이 유리하기 위해 가장 바람직하거나 필요한 식물 내의 별개의 위치로 폴리펩타이드를 안내할 수 있다.
추가로, 폴리펩타이드는 합성 화합물 형태로 제공된 제형에 첨가될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 플라젤린 및 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 개별적으로 또는 적어도 2종 내지 다수의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 조합물로 제공되어 광범위한 목적하는 숙주 반응 및 재배 시스템에 걸쳐서 식물의 구체적인 요구를 충족시키는 조성물을 제공한다.
조성물이 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 레트로-인버소 형태(예를 들어, RI Bt.4Q7 Flg 22(서열번호 376))를 포함하는 경우, 폴리펩타이드는 시간에 따라서 향상된 안정성 및 적은 분해를 나타내어, 식물 세포막 표면에서 더 양호한 활성도를 제공하는데, 이것은 수용체에 결합하고, 식물 내에 전달되는 폴리펩타이드의 능력을 향상시킨다. 이러한 Flg-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 레트로 인버소 형태를 사용하여 농업적으로 적용되는 제형의 개선된 안정성을 제공하고, 이로 인해서 Flg 폴리펩타이드(들)는 단백질분해 절단으로부터 향상된 보호를 나타내는데, 이것은 조성물의 더 높은 전체 활성도 및 저장 수명에 기여한다.
폴리펩타이드가 RHPP 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 조성물은 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. RHPP 폴리펩타이드는 서열번호 600을 포함할 수 있다. 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 525, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751-752 또는 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 226, 571 및 752 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 예에서, RHPP 폴리펩타이드는 서열번호 600을 포함할 수 있고, 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 226을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드는 지원 폴리펩타이드와 조합하여 제형화될 수 있다. 시그니처(서열번호 542 내지 548), 신호 앵커 분류(서열번호 549 내지 562) 및 분비(서열번호 563 내지 570) 폴리펩타이드는 Flg-연관된 수용체의 개선된 결합 및 활성화를 위해서 폴리펩타이드/펩타이드(표 1 내지 표 5)를 식물 세포막 표면에 표적화하기 위해서 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합될 수 있다. 식물에 대한 폴리펩타이드의 효율적인 전달 및 결합을 위한 이러한 수단은 식물 또는 식물 부분에 성장 촉진 이득뿐만 아니라 보호를 제공한다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은하핀 또는 HpaG-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 표 6 내지 표 8에 기재된 바와 같은 지원 폴리펩타이드, 시그니처 폴리펩타이드(서열번호 542 내지 548), 신호 앵커 분류(서열번호 549 내지 562) 및/또는 분비(서열번호 563 내지 570) 폴리펩타이드와 조합하여 사용될 수 있다. HpaG-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여 사용되는 이러한 지원 폴리펩타이드는 하핀-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 식물 세포막 표면에 표적화하고 전달하는 데 유용하여 식물 세포막과의 접촉을 향상시키고, 도관을 제공하여 하핀-유사(HpaG-유사)가 효율적으로 접촉하여 식물 내로 또는 식물 세포 환경(아포플라스트)에 유입되는 것을 용이하게 한다.
EF-Tu 폴리펩타이드 중 하나 이상은 선택적으로, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드와 조합될 수 있다. EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 폴리펩타이드는 서열번호 616 및/또는 617을 포함할 수 있다. 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 525, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751 내지 753 또는 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 조성물은 서열번호 616 및 617을 포함하는 EF-Tu 폴리펩타이드, 및 서열번호 226, 571, 572 또는 이들의 조합물을 포함하는 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 서열번호 616 및/또는 617을 갖는 EF-Tu 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드는 서열번호 226을 갖는 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드와 조합될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 1종 이상의 EF-Tu 폴리펩타이드 단독(예를 들어, 서열번호 616 및/또는 617 포함)을 포함할 수 있다. EF-Tu 폴리펩타이드(예를 들어, 서열번호 616 및 617)는 N-말단 아세틸화를 통해서 추가로 변형될 수 있다.
추가로, EF-Tu 폴리펩타이드 또는 EF-Tu 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드와 조합될 수 있다. 예를 들어, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함할 수 있다.
조성물은 하기 조합물 중 임의의 하나를 포함할 수 있다: (a) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571, 295, 300, 293 및 580; 또는 295, 300, 293 및 580; 또는 571, 295, 293 및 580; 또는 571, 300, 293 및 580; 또는 571, 293 및 580; 또는 571, 295, 293을 포함함; 또는 (b) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 및 셀로비오스, 셀룰로스, 키틴, 키토산 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함; 또는 (c) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하고, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 및 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 591을 포함함; 또는 (d) 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 및 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함하고, PSK 폴리펩타이드 및 PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함함; 또는 (e) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752 또는 571 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, EF-Tu 폴리펩타이드 및 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함함; 또는 (f) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 752 또는 571 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함; 또는 (g) RHPP 폴리펩타이드 및 RHPP폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함함; 또는 (h) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 226, 752 또는 571 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, RHPP 폴리펩타이드 및 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함함; 또는 (i) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하고, RHPP 폴리펩타이드 및 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함함.
IV. 응용분야
본 명세서에 기재된 농업 조성물 및 방법은 임의의 식물 종 및/또는 이의 종자와 함께 사용될 수 있다. 조성물 및 방법은 전형적으로 작물학적으로 중요한 종자와 함께 사용된다.
종자는, 예를 들어, 특정 제초체 또는 제초제의 조합물에 대한 내성, 증가된 질병 저항성, 곤충, 가뭄, 스트레스에 대한 향상된 내성 및/또는 향상된 수확률을 부여하는 유전자이식 사건을 혼입한 유전자이식 식물이 성장할 수 있는 유전자이식 종자일 수 있다.
종자는 예를 들어, 질병 내성 육종 특질을 비롯한 육종 특질을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 종자는 적어도 하나의 유전자이식 특질 및 적어도 하나의 육종 특질을 포함한다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 조성물 및 폴리펩타이드를 적용하기 위한 방법은 줄뿌림 작물 및 채소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 정자 유형의 처리를 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 식물 또는 식물 부분 또는 1종 이상의 식물의 종자는 하기를 포함할 수 있다: 마닐라삼(마닐라 헴프)(무사 텍스틸리스(Musa textilis)), 사료용 알팔파(메디카고 사티바(Medicago sativa), 종자용 알팔파(메디카고 사티바), 아몬드(프루너스 둘시스(Prunus dulcis)), 아니스 종자(핌피넬라 아니섬(Pimpinella anisum)), 사과(말루스 실베스트리스(Malus sylvestris)), 살구(프루너스 아르메니아카(Prunus armeniaca)), 아레카(빈랑)(아레카 카테추(areca catechu)), 아라차(arracha)(아라카시아 잔토리자(Arracacia xanthorrhiza)), 애로루트(arrowroot)(마란타 아룬디나세아(Maranta arundinacea)), 아티초크(시나라 스콜리무스(Cynara scolymus)), 아스파라거스(아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis)), 아보카도(퍼세아 아메리카나(Persea americana)), 바즈라(bajra)(펄 밀렛(pearl millet))(페니세툼 아메리카눔(Pennisetum americanum)), 밤바라 땅콩(비그나 섭터라네아(Vigna subterranea)), 바나나(무사 파라디시아카(Musa paradisiaca)), 보리(호데움 불가레(Hordeum vulgare)), 콩, 무수, 식용, 곡물용(파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)), 콩류, 수확된 푸른콩(파세올러스(Phaseolus) 및 비그나(Vigna) 종), 비트, 사료(맹글(mangel))(베타 불가리스(Beta vulgaris)), 비트, 적색(베타 불가리스), 비트, 당(베타 불가리스), 비트, 사료용 당(베타 불가리스), 비트, 종자용 당(베타 불가리스), 베가모트(시트러스 버가미아(Citrus bergamia)), 비틀넛(betel nut)(아레카 카테추(Areca catechu)), 후추(피퍼 니그룸(Piper nigrum)), 블랙 와플(black wattle)(아카시아 메아른시(Acacia mearnsii)), 다양한 종의 블랙베리(루부스종(Rubus spp.)), 블루베리(박시넘종(Vaccinium spp.)), 브라질넛(버톨레티아 엑셀사(Bertholletia excelsa)), 빵나무열매(아르토카푸스 알틸리스(Artocarpus altilis)), 누에콩, 건조(비시아 파바(Vicia faba)), 누에콩, 수확된 푸른콩(비시아 파바), 브로콜리(브라시카 올레라세아 바. 보트리티스), 브룸 밀렛(broom millet)(소검 비콜로(Sorghum bicolor), 브룸 수수(소검 비콜로), 방울다다기양배추(브라시카 올레라세아 바. 젬미페라), 메밀(파고피럼 에스쿨레텀(Fagopyrum esculentum)), 양배추, 적색, 백색, 사보이(브라시카 올레라세아 바. 카피타타(Brassica oleracea var. capitata), 양배추, 중국(브라시카 치넨시스), 양배추, 사료용(브라시카 종), 카카오(코코아)(테오브로마 카카오), 칸탈루프(쿠쿠미스 멜로), 캐러웨이 종자(Carum carvi), 카더멈(cardamom)(엘레타리아 카다모뭄(Elettaria cardamomum)), 카르둔(cardoon)(시나라 카르둔쿨러스), 캐롭(carob)(세라토니아 실리쿠아(Ceratonia siliqua)), 당근, 식용(다쿠스 카로타 종 사티바), 당근, 사료용(다쿠스 카로타 사티바), 캐슈넛(아나카르듐 오시덴탈레(Anacardium occidentale)), 카사바(cassava)(마니옥(manioc))(마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 피마자(리시너스 코무니스(Ricinus communis)), 콜리플라워(브라시카 올레라세아 바. 보트리티스(Brassica oleracea var. botrytis)), 셀러리악(아퓸 그라베올렌스 바. 라파세움(Apium graveolens var. rapaceum)), 셀러리(아퓸 그라베올렌스), 차요테(세치움 에듈(Sechium edule)), 체리, 모든 종(프루누스 종(Prunus spp.)), 밤(카스타네아 사티바(Castanea sativa)), 병아리콩(그램 피(gram pea))(시서 아리에티넘(Cicer arietinum)), 치커리(시코리움 이티부스(Cichorium intybus)), 녹색 치커리(시코리움 이티부스), 칠리, 건조(모든 종)(캅시쿰 종(Capsicum spp.)(아눔(annuum))), 칠리, 프레쉬(모든 종)(캅시쿰 종(아눔)), 시나몬(시나모눔 베룸(Cinnamomum verum)), 시트론(시트러스 메디카(Citrus medica), 시트로넬라(심보포곤 시트레이츠(Cymbopogon citrates); 심보포곤 나르두스(Cymbopogon nardus)), 클레멘틴(시트러스 레티쿨라타(Citrus reticulata), 정향(유게니아 아로마티카(Eugenia aromatica); 시지? 아로마티쿰(Syzygium aromaticum)), 클로버 사료용(모든 종)(트리폴리움 종(Trifolium spp), 종자용 클로버(모든 종)(트리폴리움 종), 코코아(카카오)(테오브로마 카카오), 코코넛(코코스 누시페라), 코코얌(콜로카시아 에스쿨렌타(Colocasia esculenta)), 커피(코페아종(Coffea spp.), 콜라넛, 모든 종(콜라 아쿠미나타(Cola acuminata)), 평지(유채)(브라시카 나푸스), 옥수수(메이즈), 곡물용(제아 메이스(제아 메이스)), 옥수수(메이즈), 저장용(제아 메이스), 옥수수(메이즈), 채소용(제아 메이스), 샐러드용 옥수수(발러리아넬라 로커스타(Valerianella locusta)), 목화, 모든 종(고시피움 종(Gossypium spp.), 목화씨, 모든 종(고시피움 종), 동부, 곡물용(비그나 운귀쿨라타(Vigna unguiculata)), 동부, 수확된 녹색(비그나 운귀쿨라타), 크랜베리(박시늄 종(Vaccinium spp.)), 크레스(cress)(레피듐 사티붐(Lepidium sativum)), 오이(쿠쿠미스 사티부스), 커런트, 모든 종(리베스 종(Ribes spp.)), 커스터드 애플(애노나 레티쿨레이트(Annona reticulate)), 토란(콜로카시아 에스쿨렌타(Colocasia esculenta)), 대추야자(포에닉스 닥틸리페라(Phoenix dactylifera)), 드럼스틱 트리(drumstick tree)(모린가 올레이페라(Moringa oleifera)), 듀라(durra)(수수)(소검 비콜러(Sorghum bicolour)), 듀럼 밀(트리티쿰 듀럼(Triticum durum)), 어쓰 피(earth pea)(비그나 섭테라네아(Vigna subterranea)), 에도(edo)(에도에(eddoe))(잔토소마 종(Xanthosoma spp.); 콜로카시아 종(Colocasia spp.), 가지(솔라넘 멜론게나(Solanum melongena)), 엔다이브(endive)(시코리움 엔디비아(Cichorium endivia)), 펜넬(fennel)(포에니쿨럼 불가레(Foeniculum vulgare)), 페뉴그릭(fenugreek)(트리고넬라 포에눔-그래쿰(Trigonella foenum - graecum), 무화과(피쿠스 카리카(Ficus carica)), 개암(헤이즐넛)(코릴러스 아벨라나(Corylus avellana)), 피큐(fique)(퍼크래아 마크로필라(Furcraea macrophylla), 섬유용 아마(리눔 유시타티시멈(Linum usitatissimum)), 오일 종자용 아마(아마인)(리눔 유시타티시멈), 포미오(formio)(뉴질랜드 아마)(포르뮴 타낙스(Phormium tenax)), 마늘, 건조(알리움 사티붐(Allium sativum)), 마늘, 비건조(알리움 사티붐), 제라늄(펠라고늄 종(Pelargonium spp.); 제라늄 종), 생강(진기버 오피시날레(Zingiber officinale)), 구스베리, 모든 종(리베스 종(Ribes spp.)), 박(gourd)(라게나리아 종(Lagenaria spp); 쿠커비타 종(Cucurbita spp.)), 그램피(병아리콩)(시서 아리에티넘), 포도(비티스 비니페라), 자몽(시트러스 파라디시), 건포도용 포도(비티스 비니페라), 과일 포도(비티스 비니페라), 와인용 포도(비티스 비니페라), 그래스 에스파토(grass esparto)(리게움 스파툼(Lygeum spartum)), 과수원 그래스(닥틀리스 글로머라타(Dactylis glomerata)), 그래스, 수단(소검, 비콜로 바. 수다넨스(Sorghum bicolor var. sudanense)), 낙화생(땅콩)(아라치스 하이포가에(Arachis hypogaea)), 구아바(시듐 쿠가자바(Psidium guajava)), 팥수수(수수)(소럼 비콜로(Sorghum bicolor)), 헤이즐넛(개암)(코릴러스 아벨라나(Corylus avellana)), 마펄프(카나비스 사티바 종 인디카(Cannabis sativa spp. indica), 삼, 마닐라(마닐라삼)(무사 텍스틸리스(Musa textilis)), 태양마(크로탈라리아 준세아(Crotalaria juncea), 삼종자(마리주아나(marijuana))(칸비스 사티바(Cannabis sativa)), 용설란(henequen)(아가베 포크로이데스(Agave fourcroydes)), 헤나(라우소니아 이너미스(Lawsonia inermis)), 홉(휴물러스 루풀러스(Humulus lupulus)), 누에콩(비시아 파바(Vicia faba)), 호스래디쉬(아모라시아 러스티카나(Armoracia rusticana)), 잡종 메이즈(제아 메이스(Zea mays)), 인디고(인디고페라 틴크토리아(Indigofera tinctoria)), 자스민(자스미넘 종(Jasminum spp.)), 돼지감자(헬리안투스 투버로서스(Helianthus tuberosus)), 조와(jowar)(수수)(소럼 비콜로), 황마(코르코루스 종), 케일(브라시카 올레라세아 바. 아세팔라(Brassica oleracea var. acephala)), 케이폭(세이바 펜탄드라((Ceiba pentandra)), 양마(히비스쿠스 카나비너스(Hibiscus cannabinus)), 콜라비(브라시카 올레라세아 바. 곤기로데스(Brassica oleracea var. gongylodes), 라벤더(라반둘라 종(Lavandula spp.), 리크(알리움 암펠로프라섬(Allium ampeloprasum); 알리움 포럼(Allium porrum)), 레몬(시트러스 리몬, 레몬그래스(심보포곤 시트라투스(Cymbopogon citratus)), 렌틸(렌스 쿨리나리스(Lens culinaris)), 싸리, 모든 종(레스페데자 종(Lespedeza spp.)), 상추(락투카 사티바 바. 카피타타(Lactuca sativa var. capitata), 라임, 소어(sour)(시트러스 오란티폴리아(Citrus aurantifolia)), 라임, 스위트(시트러스 라임타(Citrus limetta)), 아마인(오일 종자용 아마)(리넘 우시타티시멈(Linum usitatissimum)), 감초(글리시리자 글라브라(Glycyrrhiza glabra)), 리치(리치 치넨시스(Litchi chinensis)), 비파(에리오보트리야 자포니카(Eriobotrya japonica)), 루핀, 모든 종(루피너스 종(Lupinus spp.), 마카다미아(퀸즈랜드 넛)(마카다미아 종 터니폴리아(Macadamia spp. ternifolia)), 메이스(mace)(미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)), 용설란(아가베 아트로비렌스(Agave atrovirens)), 옥수수(메이즈)(제아 메이스), 저장용 메이즈(옥수수)(제아메이스), 메이즈(잡종)(제아 메이스), 메이즈, 일반(제아 메이스), 만다린(시트러스 레티쿨라타), 맹글(사료용 비트)(베타 불가리스), 망고(망기페라 인디카), 마니옥(카사바)(마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 마슬린(maslin)(혼합 곡물)(트리티쿰 종(Triticum spp.)과 세칼레 세레알(Secale cereale)의 혼합물), 서양모과(메스필루스 게르마니카(Mespilus germanica)), 멜론(수박 제외)(쿠쿠미스 멜로), 미에 브룸(millet broom)(소검 비콜로), 미에, 바즈라(페니세툼 아메리카눔), 미에, 부들(페니세툼 아메리카눔(Pennisetum americanum)), 손가락조(millet, finger)(엘레우신 코라카나(Eleusine coracana)), 강아지풀(millet, foxtail)(세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 피(millet, Japanese)(에치노클로아 에스쿨렌타(Echinochloa esculenta)), 진주 기장(millet, pearl)(바즈라, 부들)(페니세툼 아메리카눔(Pennisetum americanum)), 밀레, 프로소(millet, proso)(파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 민트, 모든 종(멘타 종(Mentha spp.)), 열매용 뽕나무, 모든 종(모러스 종(Morus spp.)), 누에용 뽕나무(모러스 알바(Morus alba)), 버섯(아가리쿠스 종(Agaricus spp.; 플레우로투스 종(Pleurotus spp.); 볼바리엘라(Volvariella)), 머스타드(브라시카 니그라(Brassica nigra); 시나피스 알바(Sinapis alba)), 승도복숭아(프루너스 퍼시카 바. 넥타리나(Prunus persica var. nectarina)), 뉴질랜드 아마(포미오(formio))(포르미늄 네낙스(Phormium tenax)), 나이저(Niger) 종자(구이조티아 아비시니카(Guizotia abyssinica)), 육두구(미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)), 귀리, 사료용(아베나 종), 오일 팜(엘래이스 구이닌시스(Elaeis guineensis)), 오크라(아벨모추스 에스쿨렌투스(Abelmoschus esculentus)), 올리브(올레아 유로파애(Olea europaea)), 양파 종자(알리움 세파(Allium cepa)), 양파, 건조(알리움 세파), 양파, 생(알리움 세파), 아편(파파버 솜니페룸(Papaver somniferum)), 오렌지(시트러스 시넨시스), 광귤(시트러스 오란티움), 장식용 식물(다양함), 팜 팜미라(palm palmyra)(보라수스 플라벨리퍼(Borassus flabellifer)), 팜, 커넬유(엘래이스 구이닌시스(Elaeis guineensis)), 팜, 오일(엘래이스 구이닌시스), 팜, 사고(sago)(메트록실론 사구(Metroxylon sagu)), 파파야(포포(pawpaw))(카리카 파파야(Carica papaya)), 파스닙(파스티나카 사티바(Pastinaca sativa), 완두, 식용 건조물, 곡식용(피숨 사티붐(Pisum sativum)), 완두, 수확된 녹색(피숨 사티붐), 복숭아(프루너스 퍼시카(Prunus persica)), 땅콩(그라운드넛)(아라치스 하이포가애), 배(피러스 코무니스(Pyrus communis)), 피칸 넛(카리아 일리노엔시스(Carya illinoensis)), 후추(피퍼 니그럼(Piper nigrum)), 고추, 건조(캅시컴 종), 감(디오스피로스 카키(Diospyros kaki); 디오스피로스 비르기니아나(Diospyros virginiana)), 나무콩(카자너스 카잔(Cajanus cajan)), 파인애플(아나나스 코모수스(Ananas comosus)), 피스타치오넛(피스타시아 베라(Pistacia vera)), 플랜틴(무사 사피엔툼(Musa sapientum)), 플럼(프루너스 도메스티카(Prunus domestica)), 석류(푸니카 그라나툼(Punica granatum)), 포멜로(시트러스 그란디스), 양귀비 종자(파파버 솜니페룸(Papaver somniferum)), 감자(솔라뭄 투베로섬), 팜, 커넬(엘래이스 귀닌시스), 고구마(이포모에아 바타타스(Ipomoea batatas)), 프룬(프루너스 도메스티카(Prunus domestica)), 호박, 식용(쿠쿠비타 종(Cucurbita spp.)), 호박, 사료용(쿠쿠비타 종), 피레텀(pyrethum)(크리산테멈 시네라리애폴리엄(Chrysanthemum cinerariaefolium)), 캐브라초(quebracho)(아시피도스퍼마 종(Aspidosperma spp.)), 퀸즈랜드 넛(마카다미아 종 터니폴리아(Macadamia spp. ternifolia)), 마르멜로(시도니아 오블론가(Cydonia oblonga)), 퀴닌(신코나 종(Cinchona spp.)), 퀴노아(체노포디엄 퀴노아(Chenopodium quinoa)), 모시풀(보에메리아 니베아(Boehmeria nivea)), 유채(평지)(브라시카 나푸스), 산딸기, 모든 종(루부스 종(Rubus spp.)), 레드 비트(베타 불가리스), 흰겨이삭(아그로스티스 종(Agrostis spp.)), 레아(rhea)(보에메리아 니베아), 루바브(레엄 종(Rheum spp.)), 벼(오리자 사티바(Oryza sativa); 오리자 글라베리마 (Oryza glaberrima)), 장미(로즈 종(Rose spp.)), 러버(rubber)(헤바아 브라실리엔시스(Hevea brasiliensis)), 루타바가(스웨덴 순무)(브라시카 나푸스 바. 나포브라시카(Brassica napus var. napobrassica)), 호밀(세칼레 세랠레(Secale cereale)), 라이그래스(ryegrass) 종자(롤리엄 종(Lolium spp.)), 잇꽃(카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius)), 사인포인(sainfoin)(오노브리치스 비시폴리아(Onobrychis viciifolia)), 샐서피(salsify)(트라고포곤 포리폴리어스(Tragopogon porrifolius)), 사포딜라(아크라스 사포타(Achras sapota)), 사추마(satsuma)(만다린/탠저린)(시트러스 레티쿨라타), 쇠채(scorzonera)(블랙 살시파이(black salsify))(사코조네라 히스파니카(Scorzonera hispanica)), 참깨(세사뭄 인디쿰), 쉬어 버터(넛))(비텔라리아 파라독사(Vitellaria paradoxa)), 사이잘(아가베 시살라나(Agave sisalana)), 수수(소검 비콜로), 수수, 브룸(소검 비콜로), 수수, 두라(소검 비콜로), 수수, 팥수수(소검 비콜로), 수수, 조와(소검 비콜로), 사탕수수(소검 비콜로), 대두(글리신 맥스) 대두 건초(글리신 맥스), 스펠트 밀(트리티컴 스펠타(Triticum spelta)), 시금치(스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea)), 스쿼시(squash)(쿠커비타 종(Cucurbita spp.)), 딸기(프라가리아 종), 사탕무(베타 불가리스(Beta vulgaris), 사탕무 사료용(베타 불가리스), 종자용 사탕무(베타 불가리스), 사탕수수 사료용 (사카룸 오피시나럼(Saccharum officinarum)), 당 또는 알코올용 사탕수수(사카룸 오피시나럼), 지붕용(thatching) 사탕수수(사카룸 오피시나), 사료용 해바라기(헬리안투스 아누스), 오일 종자용 해바라기(헬리안투스 아누스), 태양마(크로탈라리아 준세아), 스웨덴 순무(브라시카 나푸스 바. 나포브라시카), 사료용 스웨덴 순모(브라시카 나푸스 바. 나포브라시카), 단옥수수(제아 메이스(Zea mays)), 스위트 라임(시트러스 라임타(Citrus limetta)), 파프리카(캅시컴 아눔(Capsicum annuum)), 고구마(롭모에아 바타타스(Lopmoea batatas)), 단수수(소검 비콜로), 탄제린(시트러스 레티쿨라타, 타니아(tannia)(잔토소마 사기티폴리엄(Xanthosoma sagittifolium)), 타피오카(카사바)(마니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 타로(콜로카시아 에스쿨렌타(Colocasia esculenta)), 차(카멜리아 시넨시스), 테프(teff)(에라그로스티스 아비시니카(Eragrostis abyssinica)), 티모시(timothy)(펠럼 프라텐스(Phleum pratense)), 담배(니코티아나 타바쿰), 토마토(리코퍼시콘 에스쿨렌텀(Lycopersicon esculentum)), 트레포일(trefoil)(로투스 종(Lotus spp.)), 트리티케일, 사료용(트리티컴애스티붐(Triticum aestivum)과 세칼레 세레알레(Secale cereale)의 잡종), 유동 나무(알레우리테스 종(Aleurites spp.); 포리디(Fordii)), 순무, 식용(브라시카 라파), 터닙, 사료용(브라시카 라파), 유리너(콩고 황마(Congo jute))(유레나 로바타(Urena lobata)), 바닐라(바닐라 플라니폴리아(Vanilla planifolia)), 베치(vetch), 곡물용(비시아 사티바(Vicia sativa)), 호두(저글란스 종(Juglans spp.), 특히 저글란스 레지아(Juglans regia)), 수박(시트룰러스 라나투스(Citrullus lanatus)), 밀(트리컴 애스티붐(Triticum aestivum)), 얌(디오스코레아 종(Dioscorea spp.)) 또는 에르바 마테(yerba mate)(렉스 파라구아리엔시스(Ilex paraguariensis)).
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 또한 산림(turf grass), 관상 초본, 꽃, 장식식물, 나무, 관목에 적용될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 또한 묘포(nursery), 진디밭 및 정원, 화훼원예 또는 절화 산업에 사용하기에 적합하고, 향상된 식물 생산성, 보호 건강, 활력 및 수명에 대한 이득을 제공한다. 예를 들어, 이것은 다년생 식물, 한해살이 식물, 포스트(forced) 구근 또는 위구근(pseudo bulb), 허브, 지피식물(groundcover), 나무, 관목, 장식식물(예를 들어, 난초 등), 열대식물 및 묘목(nursery stock)에 적용될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 식물, 식물 부분 및 식물 번식 물질(들), 예를 들어, 임의의 식물 또는 식물 부분, 예컨대, 종자, 뿌리, 줄기, 꽃 기관, 뿌리 줄기, 접순, 구근, 위구경, 근경, 괴경 등을 처리하기에 적합하다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 종자 처리제로서 적용되어 식물 성장 및 생산성을 향상시키면서 다수의 해충, 질병, 영양분 결핍을 치료할 수 있다.
종자 코팅 또는 드레싱 조성물은 예를 들어, 종자 처리가 종자를 고착시키고 코팅하기 위해서 끈적끈적한 특성을 갖도록 제공되는 통상적인 첨가제가 적용된 액체 담체 조성물, 슬러리 조성물 또는 분말 조성물일 수 있다. 종자 조성물에 적합한 첨가제는 탤크, 흑연, 검, 안정화 중합체, 코팅 중합체, 마감 중합체, 종자 유동 및 식재성을 위한 슬립제, 화장제(cosmetic agent), 및 셀룰로스 물질, 예컨대, 카복시메틸 셀룰로스 등을 포함한다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 종자 처리제는 착색제 및 다른 이러한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 종자 처리제로서 개별적으로 또는 다른 첨가제, 예컨대, 살진균제, 살곤충제, 접종제, 식물 성장 조절제, 식물 성장 촉진 미생물, 비료 및 비료 향상제, 종자 영양분, 생물학적 제어제, 제초제 해독제 및 묘목 질병 처리제와 조합하여 그리고 다른 종래의 종자 처리제와 조합하여 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 종자 처리 조성물은 종자 또는 환경에 유해하지 않은 적합한 담체, 예컨대, 물 또는 분말 중의 시드에 적용될 수 있다. 이어서, 종자는 종래의 방식으로 심어진다.
바람직한 종자 처리제, 예컨대, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226 또는 서열번호 571), Ec.Flg22(서열번호 526) 및 Gm.RHPP(서열번호 600)는 묘목 발달을 향상시키고, 발아 시간을 감소시키고, 발아하는 종자의 수를 증가시키고, 묘? 생존력을 향상시키는 데 유용하다. 또한, 종자 처리 조성물은 종자 또는 종자 주변의 토양과 접촉하여 초기 묘목 확립 동안 확산된다고 공지된 미생물 기반 질병으로부터의 종자 보호를 향상시킨다.
종자 처리 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 살진균제, 살곤충제, 살선충제, 생물학적 제어제, 생물자극제, 미생물 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
종자 처리 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 클로티아니딘, 바실루스 피르무스, 메탈락실(metalaxyl) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
종자 처리 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 클로티아니딘 및 플루오피람을 포함할 수 있다.
종자 처리제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 메탈락실 및 플루오피람을 포함할 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 용액으로서 또는다른 상업적으로 입수 가능한 첨가제와 조합하여 종자에 직접 적용될 수 있다. 수용성 폴리펩타이드를 함유하는 용액은 분무될 수 있거나 또는 종자 슬러리 또는 종자 담금액(soak)로서 종자에 달리 적용될 수 있다. 가용성 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 고형물 또는 건조 물질이 또한 초기 묘목 확립 동안 효과적인 묘목 발아, 성장 및 보호를 촉진시키기에 유용하다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 가용화 담체, 예컨대, 물, 완충제(예를 들어, 시트레이트 또는 포스페이트 완충제) 및 다른 처리제(즉, 알코올, 다른 용매) 또는 임의의 가용화제와 함께 제형화될 수 있다. 또한, 소량의 건조제 향상제, 예컨대, 저급 알코올 등이 조성물에서 사용될 수 있다. 계면활성제, 유화제 및 보존제가 또한 종자 코팅 생성물의 안정성을 향상시키기 위해서 낮은(0.5% v/v 이하) 수준으로 첨가될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 종자 처리제는 임의의 상업적으로 입수 가능한 종자 처리 기계를 사용하여 적용될 수 있거나 또는 임의의 허용 가능한 비상업적인 방법(들)을 사용하여, 예컨대, 주입기 또는 임의의 다른 종자 처리 장치의 사용에 의해서 또한 적용될 수 있다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 일반적인 종자 처리제 코팅 절차는 Wintersteiger HEGE 11(윈터스타이거사(Wintersteiger AG), 독일 오스트리아 소재))를 사용하여 수행되고, 주요 작물, 즉, 옥수수, 대두, 밀, 벼 및 각종 채소의 종자에 적용될 수 있다. 이러한 종자 처리 기계의 용량은 다량의 상이한 종자 유형, 종자의 크기 및 양을 수용할 수 있다(20 내지 3000그램). 종자를 종자 처리 기계의 용기에 넣는다. 용기 선택은 요구되는 처리 종자 양 및 선택된 용기의 크기에 좌우된다: 대형 14.5L 용기(500 내지 3000g 종자/코팅); 중형 7L 용기(80 내지 800g 종자/코팅); 및 소형 1L 용기(20 내지 100g 종자/코팅). 다른 더 큰 종자 처리 시스템이 또한 사용 가능하다.
종자는 원심분리 코팅 장치를 사용한 원심력의 적용을 통해서 회전 가능한 용기의 방사상 주변에 대해서 분포된다. 용기의 바닥에 위치된 회전 디스크가 종자 처리제를 종자 상에 균일하게 분포시킨다. 이 지점에서, 회전 사이클은 시작되는데, 이것은 종자를 용기 중심 주변에서 원형으로 회전시켜서 종자를 균일하게 코팅한다. 종자 처리제 코팅 공정은 종자가 스프레더(spreader) 주변에 균일하게 분산된 후에 시작된다. 종자 처리제 샘플 물질(예컨대, 분말, 반액체, 액체 또는 슬러리)은, 디스크가 종자 처리제를 분포시키는 데 사용되는 회전 가능한 용기 내에서 회전됨에 따라서 회전 가능한 디스크 상에 적용되어 종자의 표면에 균일한 코트 및 드레스를 균일하게 제공한다.
용기 내의 종자를 균일하게 코팅하는 것을 돕기 위해서 종자 코팅 동안 압축 공기(2 내지 6bar)를 사용하여 전달된 일정한 기류가 제공될 수 있다. 종자의 코팅을 위한 시간은 종자의 양, 종자 처리제의 점도 및 처리에 사용되는 종자의 유형에 좌우된다. 종자 처리 계산기를 사용하여 적용될 종자 처리제의 유형 및 대부분의 중요하고 상업적으로 성장된 작물을 위해서, 모든 부피를 조정한다.
종자는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 수성 용액을 종자 상에 또는 종자 위에 붓거나 또는 펌핑하거나, 드리즐링(drizzling)하거나 또는 분무하는 것, 컨베이어 시스템을 사용하거나 사용하지 않고 종자의 층 상에 분부 또는 적용하는 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 방법을 사용하여 코팅될 수 있다. 적합한 혼합 장치는 텀블러, 혼합 용기 또는 드럼 또는 코팅 동안 종자를 함유하는 대 사용되는 용기 또는 드럼을 포함하는 다른 유체 적용 장치를 포함한다.
종자는 처리 및 건조한 후, 종자는 더 큰 저장 용기(들)에 분포된다. 종자는 공기 건조되거나 또는 종자 위로 통과하는 연속적인 공기 스트림으로 건조된다. 이어서 종자는 선적, 이송 또는 저장을 위해서 용기 또는 백에 전달된다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 식물 또는 식물 부분 주위의 영역에 엽면 분무 또는 종자 처리제로서 식물 표면 또는 식물 원형질막으로 전달하기 위해 추가로 제공될 수 있다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 제형(들)은 또한 종자 처리 적용제로서 또는 예컨대, 전면 처리(broadcast treatment)에 사용되는 입자 또는 과립 상에 고정되거나 함침된 매트릭스 상에 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 분무제, 토양 처리제, 토양 처리제, 고랑 내, 종자 처리제, 침지액 또는 세척액으로서 외인성 적용을 사용하거나 또는 주입, 접종, 관주법, 침윤 등의 내인성 적용으로서 식물 또는 식물 부분에 적용될 수 있다.
폴리펩타이드는 식물에 직접 적용되거나 또는 식물 또는 식물 부분 주변 영역에 적용될 수 있다.
이것은 매트릭스 물질 상에 또한 제공될 수 있고, 이어서 식물 또는 식물 부분에 제공된다.
다양한 전달 방법, 예를 들어, 주입, 접종 또는 침윤(예를 들어, 잎 상의 기공 내로의 침윤)에 의해서 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 직접 전달하기 위해서 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 조성물이 제공될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드는 또한 이것이 식물을 통해서 전신으로 이동하여, 식물의 신호전달 캐스케이드에 영향을 미쳐서, 그 다음 식물 또는 식물 부분에 이롭고 생산적인 결과를 제공하는 방식으로 제공될 수 있다.
표 4 또는 표 5에 기재된 바와 같은 레트로-인버소 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 개별적으로 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 플라젤린, 플라젤린-연관된 또는 다른 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 서열과 조합하여 적용될 수 있다. 이러한 RI 플라젤린 및 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물은 식물 보호제로서 뿐만 아니라 식물 성장 촉진 향상제로서 유용하다.
시그니처(서열번호 542 내지 548; 표 6), 신호 앵커 분류(서열번호 549 내지 562, 표 7) 및 분비 지원 폴리펩타이드(서열번호 563 내지 570; 표 8)는 플라젤린 암호(표 1), 바실루스-유래된 플라젤린으로부터의 N 및/또는 C-말단 보존된 서열(표 2), 플라젤린-연관된 폴리펩타이드: Flg22 및 FlgII-28(표 3), Flg22 및 FlgII-28의 레트로 인버소 형태(표 4) 중 임의의 것 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 Flgs(표 5) 중 임의의 것과 조합하여 사용될 수 있다.
예를 들어, Flg-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것 또는 이들의 조합물은 개별 제형으로 제공되어, 동시에, 개별 제형으로 순차적으로 적용되거나, 또는 표 6 내지 표 8에 기재된 바와 같은 지원 서열을 함유하는 융합 단백질(들)로서 제공되고, 식물 또는 식물 부분에 직접 또는 별개로 적용될 수 있다.
하핀-유사 폴리펩타이드 또는 RHPP 폴리펩타이드는, 모두 외인적으로, 예를 들어, 엽면 분무로서 식물 표면에 적용되거나, 또는 아포플라스트에 의해서(식물 세포막의 외부 공간에) 또는 내인적(식물 세포/식물 세포막 내부)으로 제공되는 경우 기능성 이득을 제공할 수 있다. RHPP 폴리펩타이드는 또한 종자 처리제로서 적용되는 경우 기능성 이득을 제공할 수 있다.
하핀-유사, HpaG-유사 폴리펩타이드의 엽면 또는 고랑 내 적용은 식물의 성장 향상, 바이오매스 및 신선함 또는 엽록소 생산 증가에 유용하다.
PSKα 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 식물, 식물 부분 또는 식물 세포 주위의 영역에 엽면 분무 또는 종자 처리제로서 식물 표면/식물 원형질막으로 전달하기 위해 제공될 수 있다.
다양한 전달 방법, 예를 들어, 주입, 접종 또는 침윤(예를 들어, 세포 배양물에 직접 또는 전제 조건으로 첨가됨)에 의해서 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 전달하기 위해서 PSKα 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 조성물이 제공될 수 있다.
V. 사용 방법
식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 방법이 제공된다. 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드 또는 조성물을 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질 또는 식물 또는 식물 부분 주변의 영역 내의 근권(rhizosphere)에 도포하여 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함할 수 있다.
대안적으로, 방법은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물을 식물 성장 매질에 도포하여 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분을 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 보호하고/하거나 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 미생물을 식물, 식물 부분, 또는 식물 성장 매질 또는 식물 또는 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 도포하여 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함한다. 재조합 미생물은 폴리펩타이드를 발현하고, 폴리펩타이드의 발현은 동일한 조건 하에서 동일한 부류의 야생형 미생물에서의 폴리펩타이드의 발현 수준과 비교할 때 증가된다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 사용 방법은 또한 경작지, 과수원, 식재상(planting bed), 묘포, 삼림지, 농장, 진디밭, 정원, 종묘점(garden center) 또는 에이커에서 전체 식물 생산성을 증가시키기 위해서 제공된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 및 사용 방법은 또한 다양한 작물(외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물), 예를 들어, 옥수수, 밀, 벼, 사탕수수, 대두, 수수, 감자 및 다양한 채소에서 식물 성장, 건강 및 생산성을 증가시키기에 유용하다.
"생물활성 폴리펩타이드 프라이밍" 접근법은 또한 폴리펩타이드의 직접 적용에 의해서 제공되는데, 이것은 식물 세포 표면에 외인적으로 또는 식물 및/또는 식물 세포의 내부에 내인적으로 적용될 수 있다. 폴리펩타이드는 식물 표면 또는 형질 세포막 또는 식물, 식물 조직 또는 세포에 전달하기 위해서 제공되며, 이것은 향상된 성장 표현형을 초래하는, 예컨대, 전체 바이오매스, 영양 성장, 종자 필(fill), 종자 크기, 및 작물 식물의 총 수확률의 증가에 기여하는 종자의 수를 증가시키는 발달 과정을 조절하는 데 유용하다.
농업 제형으로 제공되는 레트로-인버소 Flg 폴리펩타이드의 적용은, 더 긴 기간 동안 향상된 식물 성능과 함께 증가된 식물 건강을 유시키면서 성장, 생산성 및 수확률을 상승작용적으로 향상시키면서 질병 및 비생물학적 스트레스로부터 향상된 식물 보호를 야기할 수 있다.
Flg-연관된 폴리펩타이드의 네이티브 L(표 3) 또는 레트로-인버소 D(표 4) 형태의 선택은 환경, 식물/작물, 또는 식물/ 작물과 환경의 조합에 좌우될 수 있다. 성장 시기 동안 또한, 처리제 적용(예를 들어, 엽면 분무 적용) 시기는 모든 관련 고려사항이다. 레트로 인버소 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 세포 표면 막에 대해서 향상된 결합 친화도를 갖는다. 이러한 특징으로 인해서, Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 RI 형태를 사용하여 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스 내성을 개선시킬 수 있다.
추가로, RI Ec.Flg22 및 RI Bt.4Q7Flg22의 레트로 인버소 형태는 가뭄 기후 및 고온 스트레스 하에서 기공의 폐쇄를 자극하여, 이러한 기후에서 수확률을 개선시키는 데 유용할 수 있다. 환경 스트레스 기간 동안 식물에 제공된 Flg-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 기공 폐쇄의 제어는 환경 조건이 바람직하지 않은 경우 물 손실의 조절에 도움을 주고, 식물에서 팽압을 안전화시킬 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하기를 포함할 수 있다: Flg22 폴리펩타이드(Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함함); 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나를 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하기를 포함할 수 있다: FlgII-28 폴리펩타이드(FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나를 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나를 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역을 증가시키기 위해서, 서열번호 226, 571, 또는 752 중 임의의 하나 및/또는 EF-Tu 폴리펩타이드(EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함함)를 포함할 수 있다. 방법에서, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 질병, 곤충 또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하기 위해서, 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586, 및 751-766 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 이것은 반응성 산소 종에 대해서 증가된 활성도를 나타내는 돌연변이체 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571 574, 751 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
질병은 아시아 감귤 녹화, 감귤그린(Huanglonging: HLB)병, 아시아 대두 녹병, 스클레로티니아 줄기 썩음병(Sclerotinia stem rot)(또는 흰곰팡이(white mold)), 슈도모나스 잎 반점병(Pseudomonas leaf spot) 또는 세르코스포라 잎 마름병(Cercospora leaf blight)을 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 Flg22 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226-300 및 571-573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 Flg22 폴리펩타이드 및 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 조합물을 포함하고, FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 폴리펩타이드 또는 조성물은 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드, 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 추가로 포함할 수 있고, 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분의 수확률, 성장 및/또는 생산성을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서 RHPP 폴리펩타이드 및/또는 RI RHPP 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
방법이 RHPP 폴리펩타이드 및/또는RI RHPP 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 조성물을 포함하는 경우, 성장은 뿌리 성장, 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 또는 조성물이 RHPP 폴리펩타이드를 포함하는 경우, RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함할 수 있다.
방법이 RHPP 폴리펩타이드 및/또는 RI RHPP 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 조성물을 포함하는 경우, 식물은 대두를 포함할 수 있고, 성장은 전체 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 식물당 뿌리혹, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있고, 생산성은 총 깍지 또는 마디당 깍지의 수를 포함할 수 있다.
식물 구조는 식물 또는 식물 부분에 대한 이로운 결과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이로운 결과는 식물의 경작지의 증가된 경작 밀도를 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 RHPP 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 고온 및 가뭄 경향이 있는 환경에서 식물 또는 식물 부분의 수확률을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 꽃 형성 직전에 또는 개화기 이전에 적용될 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분의 성장을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드, RHPP, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
성장은 뿌리 및 꽃 정단 분열조직, 꽃 기관 생산, 열매 발달, 열매 생산, 꽃 기관의 수, 꽃 기관 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 성장을 위한 스트레스 및 비-스트레스 조건 둘 다의 경향이 있는 환경에서 식물 또는 식물 부분의 성장 및 생산성을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드 및 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는, 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성할 수 있는데, 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
방법에서, 질병으로부터의 식물 또는 식물 부분의 보호는 식물 또는 식물 부분 상에서 또는 그 내에서의 예방적 처리, 처리, 예방 및 감소된 질병 진행을 포함할 수 있다.
질병은 아시아 감귤 녹화병 (HLB), 감귤 궤양병(Citrus canker disease), 세르코스포라 잎 마름병 또는 박테리아 유발 질병을 포함할 수 있다.
박테리아 유발 질병은 박테리아 잎 마름병, 박테리아 잎 줄무늬병(leaf streak), 박테리아 줄기 썩음병(stalk rot), 박테리아 잎 반점병, 박테리아 잎 그을음병(leaf scorch), 박테리아 상부 썩음병, 박테리아 줄무늬병, 갈색 무늬병(chocolate spot disease), 고스 박테리아 시드름 및 마름병(Goss's bacterial wilt and blight), 홀커스 반점병(Holcus spot), 자색 잎자루병(purple leaf sheath), 종자 썩음병, 묘목 마름병, 스테바르트병(Stewart's diease)(박테리아 시드름병), 옥수수 생육저해병(corn stunt), 화상병(fire blight), 피어스병(Pierce's disease), 감귤 얼룩 백화증(citrus variegated chlorosis), 감귤 궤양병, 슈도모나스 시린개 세로바스(Pseudomonas syringae serovar) 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드, 및 서열번호 226 내지 525 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질에 외인적으로 적용될 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 식물 또는 식물 부분에 내인적으로 적용될 수 있다.
식물 부분은 식물 세포, 잎, 가지, 줄기, 꽃, 나뭇잎, 꽃 기관, 열매, 화분, 채소, 괴경, 근경, 구경, 구근, 위구경, 깍지, 뿌리, 분형근, 뿌리 줄기, 접순 또는 종자를 포함할 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 식물의 표면, 식물의 나뭇잎 또는 식물의 종자의 표면에 적용될 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 종자의 표면에 적용될 수 있고, 식물 또는 식물 부분은 종자로부터 재배된다.
방법에서, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 엽면 시비로서 적용될 수 있다.
식물은 열매 식물 또는 채소 식물일 수 있고, 방법은 열매 또는 채소의 증가된 수확률을 제공한다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 성장 시기 동안 2회 이상 적용되는 방법에서, 제1 적용은 V2 발달기 에 또는 그 이전에 일어나고, 후속 적용은 식물 꽃 이전에 일어날 수 있다. 예를 들어, 제1 적용은 VE 발달기에/또는 그 이전에, V1 발달기에 또는 그 이전에, V2 발달기에 또는 그 이전에, V3 발달기에 또는 그 이전에, V4 발달기에 또는 그 이전에, V5 발달기에 또는 그 이전에, V6 발달기에 또는 그 이전에, V7 발달기에 또는 그 이전에, V8 발달기에 또는 그 이전에, V9 발달기에 또는 그 이전에, V10 발달기에 또는 그 이전에, V11 발달기에 또는 그 이전에, V12 발달기에 또는 그 이전에, V13 발달기에 또는 그 이전에, V14 발달기에 또는 그 이전에, V15 발달기에 또는 그 이전에, VT 발달기에 또는 그 이전에, R1 발달기에 또는 그 이전에, R2 발달기에 또는 그 이전에, R3 발달기에 또는 그 이전에, R4 발달기에 또는 그 이전에, R5 발달기에 또는 그 이전에, R6 발달기에 또는 그 이전에, R7 발달기에 또는 그 이전에, 또는 R8 발달기에 또는 그 이전에 종자 처리제로서 일어날 수 있다. 예로서, 제1 적용은 발아기에 또는 그 이전에, 묘목기에 또는 그 이전에, 분얼기(tillering stage)에 또는 그 이전에, 줄기 신장기에 또는 그 이전에, 수잉기(booting stage)에 또는 그 이전에, 또는 출수기(heading stage)에 또는 그 이전에 일어날 수 있다. 예를 들어, 피케스 척도(Feekes scale)를 사용하여 곡물 작물의 성장기를 식별하는 경우, 제1 적용은 1기에 또는 그 이전에, 2기에 또는 그 이전에, 3기에 또는 그 이전에, 4기에 또는 그 이전에, 5기에 또는 그 이전에, 6기에 또는 그 이전에, 7기에 또는 그 이전에, 8기에 또는 그 이전에, 9기에 또는 그 이전에, 10기에 또는 그 이전에, 10.1기에 또는 그 이전에, 10.2기에 또는 그 이전에, 10.3기에 또는 그 이전에, 10.4기에 또는 그 이전에, 또는 10.5기에 또는 그 이전에 일어날 수 있다.
비생물학적 스트레스
비생물학적 스트레스는 상당한 작물 손실을 야기하며 작물 생산 및 수확률의 주요 감소를 초래할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 및 조성물은 하나 이상의 비생물학적 스트레스에 대한 식물의 내성을 증가시키기 위해서 화학적 프라이밍제로 사용될 수 있다. 플라젤린 폴리펩타이드, 바실루스 종으로부터 유래된 Flg22 또는 FlgII-28의 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 이. 콜라이 및 다른 유기체(표 5)로부터 유래된 Flg15 및 Flg22 및 글리신 맥스(표 13 내지 15)로부터 유래된 RHPP 폴리펩타이드가 비생물학적 스트레스에 대한 식물, 식물의 군, 식물의 경작지 및/또는 식물의 부분의 내성을 증가시키기에 유용하다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물은 식물 또는 식물 부분에 비생물학적 스트레스 내성을 부여한다. 식물 또는 식물 부분에 부여되는 비생물학적 스트레스 내성은 온도(고 또는 저) 스트레스, 방사선 스트레스, 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 염류 스트레스, 삼투성 스트레스, 영양-결핍 또는 고금속 스트레스 및 수분 결핍, 홍수 또는 산소 결핍으로부터 초래한 수분 스트레스를 비생물학적 스트레스를 포함하지만 이들로 제한되지 않은 비생물학적 스트레스에 대한 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 및 조성물을 사용한 화학적 프라이밍은 식물 또는 식물 부분에 적용되어 식물 또는 식물 부분을 개별적, 다중 또는 조합된 비 생물적 스트레스로부터 보호하기 위한 다양한 접근법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물은 식물, 식물 부분, 식물 뿌리, 식물 종자, 식물 성장 매질 또는 식물 주변 면적 또는 식물 종자 주변의 면적에 지상부 엽면 시비로서 적용되는 경우 비생물학적 스트레스원에 대해서 식물을 보호하는데 효과적이다. 예를 들어, 나무의 경우, 하나 이상의 적용은 플러시(flush) 전, 그 동안 또는 그 후; 착과 전, 그 동안 또는 그 후; 열매 수확 전 또는 그 후를 비롯한 시기를 비롯한 나무의 상이한 성장 시기에 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은, 식물이 더 신속하게 활성화될 수 있는 방어 기전을 이미 준비 및 시작하여, 성장 시기 동안 동시에 또는 상이한 시기에 일어나는 비생물학적 스트레스 또는 다수의 스트레스원에 대한 내성을 증가시키는 방식으로 비생물학적 스트레스(들)에 대한 보호를 위해서 식물을 화학적으로 프라이밍한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 Flg22 폴리펩타이드의 레트로 인버소 형태는 과도한 열, 물 및 가뭄 스트레스 시기 동안 엽면 분무 적용으로서(또는 마찬가지로, 예를 들어, 뿌리 관주(root drench)로서 다른 적용 방법을 사용하여) 외부로 적용될 수 있고, 식물을 통한 증산 손실로 일반적으로 일어날 수 있는 기공개도(stomatal aperture) 및 동요(oscillation)에 영향을 줄 수 있는 가뭄, 고온 스트레스 및/또는 다른 비생물학적 스트레스에 대해서 식물을 보호하기 위해서 사용될 수 있다.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하기를 포함할 수 있다: Flg22 폴리펩타이드(Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하기를 포함할 수 있다: FlgII-28 폴리펩타이드(FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하기를 포함할 수 있다: 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물.
방법에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서, RHPP 폴리펩타이드(RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603, 604 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드(KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함함); 레트로-인버소 RHPP 폴리펩타이드(RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605, 606 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
비생물학적 스트레스는 고온 스트레스, 온도 스트레스, 방사선 스트레스, 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 염류 스트레스, 영양-결핍 스트레스, 고 금속 스트레스, 물 스트레스, 삼투성 스트레스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
식물 성장 및 발달에 따른 면역 반응의 균형
면역 반응이 병원체 공격으로부터 식물을 보호할 수 있지만, 과도한 면역 반응은 식물 성장에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 따라서, 성장 촉진 반응이 증가된 식물에서 향상된 면역력 또는 질병 예방 및 보호의 균형은 식물 건강을 최적화하기 위한 바람직한 조합이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 반응을 향상시키기에 유용한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 식물 성장 및 생산성에 긍정적인 영향을 제공하는 폴리펩타이드와 조합될 수 있다. 폴리펩타이드 조합물은 식물 또는 식물 부분에 적용될 때 그들의 구별되는 작용/조절 모드에 대해 구체적으로 선택된다. 그러나, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 일부(Flg, HpGa-유사, PSKα, 티오닌)는 수용체-유사 단백질에 의해서 인지되고, 이어서 식물에서 이의 유입 및 수송을 개시하는 과정이 이어지는데, 이것은 다른 것이 능동 흡수(예를 들어, RHPP)에 의해서 식물 내로 취해지는 동안 기능적 결과를 초래한다. 예를 들어, PSKα 및 Flg-연관된 폴리펩타이드, 예컨대, Flg22, Flg25 및 FlgII-28은 원형질막의 표면 상에 위치된 류신-풍부 수용체 카이나제에 의해서 인지되고, 면역력, 질병 저항성 또는 질병 예방으로 이어지는 병원체-촉발된 반응에 관여된 복합체 신호전달 경로에 관여한다(Kutschmar et al. "PSKα promotes root growth in Arabidopsis," New Phytologist 181: 820-831, 2009).
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, Flg22 HpaG-유사 폴리펩타이드 및 티오닌은 유도인자로서 작용하고, 항미생물 활성(예를 들어, 항살충제; 박테리아, 진균 또는 바이러스 활성)를 나타낼 수 있다. 폴리펩타이드의 특정 조합물이 제공되는데, 예를 들어, 플라젤린- 및 하핀-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물은 식물을 병원성 질병으로부터 예방 및 보호하기에 유용하고, 그것은 다른 폴리펩타이드, 예를 들어, PSKα 및 RHPP와 함께 적용되는 경우, 식물, 식물 부분 및/또는 식물의 경작지에서 식물 성장 및 생산성을 향상시키는 이중 유용성을 제공한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물은 엽면 분모, 고랑 내 처리, 종자 처리, 관주 또는 세척액으로서 외인적으로 또는 식물에 내인적으로 적용되어 집합적으로 개선된 수확률 성능을 초래하는 식물의 면역 반응 및 성장 특징 둘 다를 자극할 수 있다. 이것은 또한 식물의 상이한 부분(예를 들어, 잎, 뿌리, 괴경, 구경, 근경, 구근, 위구경, 꽃, 깍지, 열매 및 생장점)에 보호 및 성장 이득을 제공할 수 있다.
PSKα와 HpaG-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합된 엽면 시비 또는 순차적인 적용은 표준(비-스트레스 또는 최적 성장) 환경 하에서 식물의 성장 또는 비생물학적 스트레스(예를 들어, 열 및 물 부족 스트레스)에 노출된 식물의 성장을 향상시키는데 유용할 수 있다.
X.spp HpaG-유사 및 At.PSKα 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비 처리제는 최적(비-스트레스) 환경 및 스트레스 환경에서 식물에 적용되는 경우 상이한 작용 모드를 갖는다. 두 부류의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 순차적으로 또는 엽면 시비의 조합물로 유용하게 제공되며, 비생물학적 스트레스(들)가 있거나 없는 환경에서 식물 성장을 개선시킬 수 있다.
X.spp.HpGa-유사는 온도, 물, 영양분 및 다른 환경 파라미터가 최적의 식물 성장에 유익한 비-스트레스 환경에서 옥수수에 식물 성장 이득을 제공한다. 다른 한편, 엽면 분무로서 적용된 At.PSKα는 고온 및 가뭄 또는 물 부족 스트레스의 환경 조건 하에서 식물 성장에 이득을 제공한다. 따라서, 엽면 시비로서 함께 제형 중에서 조합물로 사용되는 경우, 그것은 스트레스가 없는 환경 및 스트레스 환경 모두에 걸쳐 있고, 다양한 환경 조건에서 재배된 옥수수 식물의 성장에 부가적인 이득을 제공할 수 있다.
At.PSKα에 대한 식물 생산성 및 성장의 증가는 또한 비생물학적 스트레스가 있는 환경 및 비생물학적 스트레스가 없는 환경에서 재배된 대두 식물에서도 인지된다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 At.PSKα가 엽면 시비로 제공되고, 고온 및 가뭄 스트레스에서 재배된 대두 식물은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드가 없이 물 및 계면활성제가 제공된 대조군 대두 식물에 비해서 증가된 수확률을 갖는다.
X. spp. HpaG-유사 및 At.PSKα가 함께 엽면 분무로 적용되는 경우, 정상 및 스트레스 환경 하에서 식물 생산에 상승작용적 효과를 제공하기에 유용하다. At.PSKα는 분무 적용으로서 적용되는 경우 옥수수에서 증가된 전체 성장을 나타내는 반면, X. spp. HpaG-유사 폴리펩타이드는 상반되는 경향을 초래한다. 따라서, 두 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함께 적용하는 것은 "고온 스트레스" 환경에서 식물 성장의 균형을 조절하는 작용을 하여 대조군 식물과 비교할 때 식물 성장의 변화가 개별적으로 적용된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 효과의 합보다 더 클 수 있다.
이들 두 부류의 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 상승작용적 상호작용은 고온 스트레스 환경 하에서 식물 성장을 향상시킨다(예를 들어, 증가된 식물 바이오 매스를 동반한 성장 속도 증가).
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것은 식물의 성장 및 생산성을 향상시키기 위해서 조합물로 또는 개별적으로 식물에 1회 이상 적용될 수 있다. 환경의 조건에 적절한 적응으로 성장 시기에 걸쳐서 수확률 이득을 촉진시키기 위해서 다중 적용이 적용될 수 있는데, 예를 들어, 성장 시기에 덥고 건조한 날씨 기간이 예상되는 경우, 비생물학적 스트레스 하에서 성장을 촉진하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 추가 분무가 식물에 대한 부정적인 영향을 완화시킬 수 있다.
수확률을 증가시키기 위한 파이토설포카인 알파(PSKα)의 엽면 시비
At.PSKα를 활발하게 성장하는 대두 식물에 엽면 시비로서 적용하여 고온 및 가뭄 스트레스가 있는 환경에서 수확률 이익을 제공하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 생물활성 프라이밍 At.PSKα 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 적용하는 수단은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적용 방법을 사용하여 V1기 내지 V4기에서 대두에 엽면 분무로서 제공된다. At.PSKα의 엽면 시비로로 처리된 대두 식물은 비-스트레스 및 스트레스(열 및 물 부족) 환경을 생성하는 조건 하에서 경작지 환경에서 재배될 수 있다. At.PSKα로의 처리는 비생물학적 스트레스원을 비롯한 다양한 환경 조건에서 재배된 식물에서 성장 및 수확률 이득을 초래할 수 있다.
표 12 내지 표 14에 제공된 RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 중 임의의 것은 엽면, 고랑 내, 종자 처리 또는 뿌리 관주 적용으로서 식물 표면에 적용될 수 있다.
RHPP의 엽면 시비는 식물 구조의 변경을 초래한다.
RHPP 폴리펩타이드를 엽면 시비로서 식물에 적용하여, 구별되는 잎 구조(옥수수) 및 향상된 뿌리 시스템(대두)을 초래하는 방법이 제공된다. RHPP를 이용한 엽면 처리를 사용한 잎 각도 및 뿌리 바이오 매스의 증가는 두 주요 농업 작물(옥수수 및 대두)에서 농업에 사용하기에 효과적인 이익을 갖는다.
식물 구조를 변경시키기 위한 RHPP의 적용
V5-V8 옥수수에 엽면 시비로서 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, RHPP를 적용하면 곧은 잎 배향 및 보다 똑바로 선 잎을 갖는 구별되는 잎 구조 표현형을 초래한다. 이는 특히 경작지 환경에서 수확률을 극대화하는데 사용되는 더 높은 경작 밀도와 관련이 있다. 메이즈(옥수수)에서 RHPP 폴리펩타이드의 엽면 비시는 잎 각도를 변화 시키는데 유용하여 더 작은 잎 각도에 기여하는데, 이는 곧은 잎 배향을 초래한다. 이러한 표현형은 잎 면적 지수를 증가시키고, 옥수수 그늘 증후군을 감소시키고, 광합성 효율을 개선시키는 데 유리할 수 있다. 또한, 캐노피 발달 및 총 광 투과율을 최대화시키기 위해서 엽면 제형으로 RHPP를 제공하는 것이 등숙기(grain filling stage)의 시작 이전에 식물의 영양 성장을 증가시키는 열쇠이다.
메이즈 식물은 잎 컬 또는 잎 구조에서 보다 곧은 잎 배향으로의 변화를 나타내어 물을 보존하고, 가뭄 및 열에 대한 식물 내성을 향상시킨다. RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들) 조성물로의 적용 후 옥수수에 대한 잎 표현형에 대한 곧은 변화는 유용하며, 잎 구조를 정형화하고, 가뭄 및 고온에 대한 내성을 향상시키기 위한 대안적인 비-육종 접근법을 제공한다.
옥수수 식물에서의 곧은 소엽 배향 표현형은 잎 온도의 감소, 전체 식물의 증산 및 물 사용 효율의 개선에 작용할 뿐만 아니라 식물 캐노피에 대한 구조적 변화를 제공하는데, 이는 보다 높은 밀도의 식재를 가능하게 하여 수확률을 크게 증가시킨다.
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, RHPP를 대두에 적용하는 것이 또한 이득을 제공할 수 있다. 예를 들어, 개화 콩에 대한 RHPP의 엽면 시비는 각지 세트를 증가시킬 수 있다. 깍지 세트는 R4의 중간에서 R5의 중간까지 발생하는 대두 발달기이며, 이는 수확률에 직접 기여한다. 초기 깍지 세트는 주 줄기의 4개의 최상위 마디 중 하나에서 ¾ 인치 깍지의 출현으로 표시된다. 이어서, 이것은 각지 성장이 빠르며 종자 발달이 시작되는 전체 깍지기로 진행된다. 깍지 세트의 증가는 수확률 증가(즉, 식물의 마디당 깍지 수 또는 식물당 당 깍지의 전체 수)에 의해 정량화된다.
뿌리 바이오매스 및 수확률을 증가시키기 위한 RHPP
엽면 적용된 RHPP(서열번호 600) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(들)로 처리된 대두 식물은 비처리 식물에 비해서 증가된 깍지 충전 및 보다 완전한 깍지 충전을 나타낼 수 있으며, 이는 질소 고정의 증가의 결과 일 수 있다.
뿌리 구조, 특히 심토양을 신속하게 이용하는 뿌리 시스템은 질소 포집 및 수분 흡수를 최적화할 수 있으며, 이는 건조 및 질소 고갈 토양에서 특히 중요하다. 콩 식물에 대한 엽면 처리로서 적용되는 경우 본 명세서에 기재된 바와 같은 RHPP 폴리펩타이드(들)는 물 및 미네랄(질소) 획득, 특히 질소-결핍 토양에서 유용한 뿌리 표현형을 초래한다. 뿌리 구조를 향상시킴으로써 영양분 흡수 효율을 증가시키는 것은 광범위한 토양 유형에서 대두 재배 관행과 함께 사용되는 경우 식물 생산성을 향상시키는 핵심 인자이다.
대두 VE-V5 또는 V2-V3 발달기의 초기 영양성장기(early vegetative stage)에서 제공된 RHPP의 엽면 시비로 인한 강화된 뿌리 바이오매스는 심토양(깊은 뿌리)의 신속한 이용을 갖는 뿌리 시스템을 초래하고, 뿌리 바이오매스의 전반적인 증가를 초래한다. 예를 들어, 근모 촉진 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, RHPP(서열번호 600)는 V2 내지 V3 발달기에서 대두 식물에 대한 엽면 처리로서 적용되어 뿌리 바이오매스의 전체적인 증가를 초래할 수 있다. 뿌리 바이오매스 외에 다른 주목할 만한 향상은 더 긴 측면 뿌리의 생산, 뿌리 가지화의 증가, 근모 및 뿌리 흡수 표면적의 증가이다.
RHPP는 주요 발달기(VE - V8 또는 V2-V8)에서 또는 건조하거나 영양분이 부족한 토양 유형과 같은 뿌리 생산의 빠른 증가가 요구되는 환경에서 잎 처리제로서 적용될 수 있다. 토양 유형은 특히 뿌리 발달 및 확장에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 잠토 토양에서 식물이 생겨나기 어려운 경우, 그것은 뿌리 형성 및 뿌리 증식에 영향을 줄 수 있다. 뿌리 질량의 증가는 식물 출현에 유리하게 영향을 미칠 뿐만 아니라 식물의 확립에 기여할 수 있다. 또한 뿌리혹에서 서식하는 박테리아는 공기로부터 질소를 끌어와서 대두가 그 질소를 종자를 성장시키고, 생산하는 질소로 변환시키는 것을 허용하기 때문에 뿌리혹 형성 및 수가 중요하다.
HPP 폴리펩타이드(표 13 내지 표 15) 는 토양에 직접, 토양 관주로서, 고랑 내 처리로서, 엽면 시비로서 지상부 식물 부분에 적용될 수 있는 이러한 처리 즉용 방법 중 임의의 것을 사용하여 적용되는 경우 뿌리혹 형성의 증가 및 대두 뿌리의 뿌리혹 생성을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다.
뿌리혹의 증가는 뿌리혹에 서식하는 질소 고정 박테리아, 예컨대, 리조븀 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) 또는 자포니컴(japonicum)에 의해서 증가된 질소 고정을 초래할 수 있다. 뿌리혹 형성은 VE 직후에 인지될 수 있고, 질소 고정을 증가시킬 수 있다. 대두 뿌리의 효과적인 근류형성은 종자 또는 에이커 단위당 더 높은 수확률 및 더 높은 품질의 종자 생산, 단백질 및 오일을 초래한다. 대두 식물은 질소 고정을 위한 피크 타임으로 추정되는 V1-V2 발달기에서 질소 고정의 피크 시간으로 추정되는 첫 번째 트리폴리에이트 잎을 완전히 형성했다.
다양한 비료 처리제(들)와 함께 Gm.RHPP 생물활성 프라이밍 폴리 펩타이드의 조합물 적용은 수확률 증가를 제공할 수 있고, 특히 질소 고갈 토양에서의 작물 관리 적용에 권장된다.
박테리아 질병
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 옥수수에서 박테리아 질병의 예방, 처리 및 방제에 유용하고, 특히 산토모나스 캠페스트리스 pv. 바스쿨로럼(Xanthomnas campestris pv. vasculorum)으로도 인식되는 산토모나스 바시콜라 pv. 바스쿨로럼(Xanthomonas vasicola pv. vasculorum)에 의해서 유발되는 옥수수에서 박테리아 잎 줄무늬병의 처리에 특히 유용하다.
조사에 따르면 박테리아 잎 줄무늬병이 확산되어 미국 옥수수 벨트((U.S. Corn Belt)(미국 웨스턴 인디아나주, 일리노이주, 아이오와와, 미주리주, 동부 네브라스카주 및 동부 캔사스주) 전역에 널리 분포되어 있을 수 있다. 질병 확산은 윤작(crop rotation) 실시에서 옥수수를 심는 경우 가장 빈번하다. 박테리아 잎 줄무늬병은 덴트 옥수수(경작지) 종자 옥수수, 팝콘 및 단옥수수에 감염을 일으킬 수 있다. 옥수수의 증상은 잎맥 사이의 폭이 좁거나 황갈색 줄무늬 및 황갈색 스트립을 포함한다. 병변은 보통 더 작거나 더 오래된 식물 잎에서 발생하고, 초기에 식물의 더 높거나 더 어린 잎으로 퍼진다. 황변이 또한 병변 주위에 존재할 수 있다.
옥수수의 박테리아 잎 줄무늬병은 아마도 이미 감염된 숙주 잔해에서 생존한다. 감염된 잎 조직의 표면에서 발견되는 박테리아 삼출물은 이차 접종원으로 작용할 수 있다. 박테리아는 바람, 쏟아지는 비 및 관개수에 의해서 확산된다. 병원체는 기공과 같은 자연적인 개구부를 통해서 옥수수 잎에 침투하는데, 이것은 잎에 걸쳐 띠 패턴의 병변을 초래할 수 있다. 잎 조직의 집락화는 주 잎맥에 의해서 제한된다.
질병이 박테리아 병원체에 의해서 유발되기 때문에, 살박테리아제의 현재 사용은 그것을 방제하는데 문제가 있다. 예를 들어, 대부분의 살박테리아제는 접촉 생성물로서 작용하고, 전신성이 아니기 때문에, 그것은 흡수되지 않거나 다른 기전을 통해서 취해질 것이다. 살박테리아제는 비 또는 바람으로 씻겨나가 일부 옥수수 작물에 사용하기에 비경제적이거나 실용적이지 않기 때문에, 살박테리아제 처리제는 반복적인 적용이 필요할 수 있다.
현재까지 현재의 질병 관리 관행은 윤작 실시(예를 들어, 옥수수, 대두 및 그 다음 옥수수로)를 권장하고, 질병 진행을 늦추기 위해서 경작지 사용 사이의 세척 장비와 같은 소독 실시의 구현을 권장한다.
Flg(표 4 내지 5) 및 티오닌 폴리펩타이드(표 19) 또는 두 부류의 조합물의 엽면 시비는 질병을 치료하기 위한 대안적인 접근법을 제공한다. 무증상 또는 증상이 있는 식물의 잎 표면에 분무로서 제공되는 이들 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비는 옥수수에서 박테리아 잎 줄무늬병을 예방, 치료 및 방제하는 수단을 제공한다.
대안적으로, 플라젤린- 및 티오닌 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물은 옥수수가 감염되는 다른 박테리아 질병의 예방, 처리 및 방제에 유용할 수 있다(표 21).
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대두의 세르코스포라 잎 마름병 질병
세르코스포라는 대두의 질병 세르코스포라 잎 마름병을 유발하는 진균 병원체이다. 자색 종자 착색병이라고도 지칭되는 세르코스포라 잎 마름병은 대두의 잎 및 종자를 감염시킨다. 대두 종자의세르코스포라 감염은 종자 외관 및 품질을 약화시킨다. 세르코스포라 잎 마름병의 원인이 되는 유기체는 세르코스포라 키쿤치(Cercospora kikuchii)인데, 이것은 대두 잔기 및 종자 코트에서 겨울을 난다. 질병의 확산은 진균의의 포자가 감염된 잔류물, 잡초 또는 다른 감염된 대두 식물로부터 대두 식물로확산될 때 일어난다. 따뜻하고 습한 날씨에는 질병 확산과 증상 발달이 가속화된다. 증상은 일반적으로 개화 후 시작되며 대두 잎의 원형 병변은 합쳐져서 병변을 형성할 수 있는 적갈색 내지 적색 반점으로 나타날 수 있다. 증상은 상부 캐노피, 일반적으로 가장 높은 3 개 또는 4 개의 삼출엽 잎에서 나타난다. 감염된 대두 식물은 작물이 성숙함에 따라 악화되는 증상을 나타내며, 깍지 충전 중에 영향을 받은 잎의 조기 탈엽이 일어날 수 있다. 세르코스포라 증상 발달은 줄기, 잎자루 및 깍지에 병변으로 나타날 수도 있다. 종자는 깍지에 부착되어 감염된다. 세르코스포라 감염된 종자는 자색 변색을 나타내며, 이것은 전체 종자 코트를 덮는 반점 또는 얼룩으로 나타날 수 있다.
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(표 4 및 표 5)의 엽면 시비는 질병 치료를 위한 대안적인 접근법을 제공한다. 무증상 또는 증상이 있는 식물의 잎 표면에 분무로서 제공되는 이들 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비는 대두에서 세르코스포라 잎 마름병을 예방, 치료 및 방제하는 수단을 제공한다. 특히, 높은 사용률(예를 들어, 4.0Fl.oz/Ac)의 바실루스 투린기엔시스로부터 유래된 Flg22의 엽면 시비는 초기 증상 발달을 관리하는 수단을 제공할 수 있으며, 세르코스포라의 영향을 받은 경작지 위치에서 재배된 대두 식물에 더 건강하고, 활력있는 콩 식물을 제공할 수 있다.
세르코스포라의 증상을 치료 또는 감소시키는데 유용할 수 있는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 구체적인 조합물은 하기를 포함한다: 서열번호 226, 751 또는 752를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 서열번호 600을 포함하는 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드; 또는 서열번호 226, 751 및 572 중 임의의 하나를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드와, 서열번호 600을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드의 조합물.
예를 들어, 식물 또는 식물 부분에서 세르코스포라의 증상을 치료 또는 감소시키기 위한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 유용한 조합물은 서열번호 226을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 폴리펩타이드 단독 또는 서열번호 600을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드와의 조합물이다. 추가적인 처리제는 이러한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여 살진균제를 추가로 포함할 수 있다.
아시아 대두 녹병
아시아 대두 녹병은 파콥소라 파치리치(Phakopsora pachyrhizi)에 의해서 유발되는 진균 질병이다. 병인 및 증상은 세르코스포라와 유사하며, 이를 치료하는데 유용한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 조합물도 유사하다. 구체적으로, 세르코스포라의 증상을 치료 또는 감소시키는데 유용할 수 있는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물은 하기를 포함한다: 서열번호 226, 751 또는 752를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 서열번호 600을 포함하는 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드; 또는 서열번호 226, 751 및 572 중 임의의 하나를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드와, 서열번호 600을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드의 조합물.
예를 들어, 식물 또는 식물 부분에서 아시아 대두 녹병의 증상을 치료 또는 감소시키기 위한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 유용한 조합물은 서열번호 226을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 폴리펩타이드 단독 또는 서열번호 600을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 RHPP 폴리펩타이드와의 조합물이다. 추가적인 처리제는 이러한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여 살진균제를 추가로 포함할 수 있다.
홀커스 반점병
홀커스 반점병은 슈도마나스 시린개 pv. 악티니다에(Pseudomanas syringae pv. actinidae)에 의해서 유발되는 박테리아 질병이다. P. 시린개의 성장을 제한하여 식물 또는 식물 부분에서 홀커스 반점병을 예방 또는 치료하기 위해서 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드를 사용하는 방법이 본 명세서에 기재된다. P. 시린개의 치료에 유용한 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 226, 540, 751 및 572 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.
스클레로티니아 줄기 썩음(흰곰팡이)병
스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)은 흰곰팡이에 의해서 유발되는 질병을 유발하는 식물 병원성 진균이다. 그것은 목화 썩음병, 물 무름병(water soft rot), 줄기병, 드롭(drop), 관부 썩음병(crown rot) 및 꽃 마름병이라고도 한다. 흰썩음병의 진단 증상은 감염된 식물에서 경화증 및 균사체의 흰색 퍼지 성장으로 공지된 흑색 휴지 구조를 포함한다. 스클레오티아(sclerotia)는 결국 주머니에 포자를 생산하는 자실체를 생성한다. 스클레로티니아는 초본, 다육 식물, 특히 열매 및 채소 또는 목재 장식식물 상의 어린 조직에 영향을 줄 수 있다. 또한 콩과 식물 및 덩이 식물, 예컨대, 감자에도 영향을 줄 수 있다. 흰곰팡이는 묘목, 성숙 식물 및 수확된 생성물을 비롯한 임의의 성장기에서 숙주에 영향을 줄 수 있다. 그것은 일반적으로 수분 함량이 높고 토양에 가까운 조직에서 발견된다. 처리되지 않은, 토양 라인의 줄기 상의 창백하거나 어두운 갈색 병변은 흰색의 솜털 같은 균사체 성장에 의해서 덮여있다. 이것은 목질부에 영향을 미치는데, 이는 위황병, 시드름병, 낙엽 및 사멸로 이어진다. 흰곰팡이는 또한 경작지에서 또는 저장소의 열매에서 발생할 수 있으며, 열매를 덮는 백색 진균 균사체 및 그에 따른 붕괴를 특징으로 한다. S. 스클레로티오룸의 치료에 유용한 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 226, 540, 571, 751, 및 752 중 임의의 하나를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.
슈도모나스 잎 반점병
슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애(PSA)는 키위 생산 구역 전체에 걸쳐 녹색- (악티니디애 델리시오사(Actinidiae deliciosa)) 및 황색-과육 식물(악티니디애 치네시스(Actinidiae chinesis)) 키위 식물 둘 다의 박테리아 궤양병을 유발하는 파괴적인 식물 병원체이며, 뉴질랜드, 중국 및 이탈리아에서 심각한 수확 손실을 초래합니다. 뉴질랜드에서만, 2025년까지 가장 치명적인 비오바(biovar) PSA-V에 대한 누적 매출 손실은 7억 400만 뉴질랜드 달러(NZD)에 도달할 것으로 예상된다(Agribusiness and Economics Research Institute of Lincoln University "The Costs of Psa-V to the New Zealand Kiwifruit Industry and the Wider Community"; May 2012). PSA-V는 키위 식물의 외면과 내면을 식민지화하여 목질부와 체관부 조직을 통해서 확산될 수 있다. 키위에서 PSA-V의 질병 증상은 박테리아 잎 반점, 몸통의 박테리아 궤양병, 붉은 삼출물, 꽃 썩음, 잔가지 변색, 궁극적으로 키위 덩굴의 백화를 포함한다. PSA-V에 대한 표준 방제 방법은 현재 병원체의 구리-내성 형태의 선택 및 질병 방제 손실을 초래할 것으로 예상되는 키위 덩굴에 금속 구리의 엽면 시비를 빈번하게 사용한다. 새로운 방제 방법이 시급히 필요하다.
특히 키위에서 슈도마나스 시린가세(Pseudomanas syringase)의 처리에 유용한 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 펩타이드는 서열번호 226, 540, 752, 및/또는 571을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다.
아시아 감귤 녹화(감귤그린병)병
명세서에 기재된 방법은 질병 퇴치 및 식물의 전체 생산성을 증가시키는 이득을 추가로 제공하기 위한 상이한 접근법을 포함한다. 이 접근법은 식물의 질병과 싸우기 위해서 티오닌을 포함하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 외인성 또는 내인성 적용을 제공하는 것에 관한 것이다.
티오닌 및 티오닌-유사 폴리펩타이드(표 19) 및 이의 조성물은 감귤그린병(HLB)병이라고도 지칭되는 아시아 감귤 녹화의 예방, 처리 및 방제에 유용하다. HLB병은 광범위하게 분포되어 있으며, 상업 감귤 과수원이 있는 모든 카운티의 대부분의 상업 및 주거 지역에서 발견된다.
티오닌 폴리펩타이드(서열번호 650 내지 749)를 사용하여 HLB병의 확산을 예방하고 이를 예방하기 위한 방법이 본 명세서에 기재된다.
아시아 감귤 녹화병은 아시안 시트러스 프실라(Asian citrus psyllid), 다이아포리나 시트리(Diaphorina citri) 또는 2-반점 시트러스 프실라, 트리오자 에리트레아(Trioza erytreae) 델게르시오(Del Guercio)에 의해서 전파되는데, 이것은 나무진디과에의 수액을 빠는 노린재류 벌레(들)를 특징으로 하며, 그것은 매우 깊숙히 체관부 서식하는 박테리아인, 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 의해서 유발되는 병인 감귤 녹화병과 연관되어 있다(Halbert, S.E. and Manjunath, K.L, "Asian citrus psyllids Sternorrhyncha: Psyllidae and greening disease of citrus: A literature review and assessment of risk in Florida," Florida Entomologist 87: 330-353, 2004). 아시아 감귤 녹화병 또는 감귤그린병(Huanglongbing disease)은 나무가 감염되면 감귤 나무에 치명적이라고 간주된다.
잎에서 질병의 초기 증상은 잎맥 황변 및 얼룩덜룩한 반점으로 지칭되는 비대칭 위황병이며, 이는 질병의 가장 진단적 증상이다. 감염된 나무는 생육이 저해되고, 나뭇잎에 얼룩 모틀링(mottling)이 보이는 잎이 나온다. 황변의 초기 증상은 단일 슈트 또는 가지에 나타날 수 있고, 질병이 진행되면 황변이 전체 나무에 퍼질 수 있다. 고착된 나무는 나뭇 가지가 죽고 열매가 떨어질 수 있다. 과일은 보통 수가 작고, 작거나, 변형되거나, 편향되고, 적절하게 착색되지 않고, 끝이 녹색으로 남아 있고, 자른 과일의 꽃자루 아래(줄기)에 노란색 얼룩이 보인다.
아시아 감귤 녹화 질병은 또한 감귤 뿌리가 선별되어 자손 품종에 이식 될 때 이식편 전달될 수 있다.
감귤 녹화병의 관리는 어렵다는 것이 입증되어있기 때문에, 현재 HLB를 방제하는 방법은 1) 접목에 사용되는 무병 묘목 및 뿌리줄기의 구현, 2) 2) 살충제 및 전신 살곤충제를 사용한 프실라 벡터의 방제, 3) 생물학적 제어제, 예컨대, 항생제의 사용, 4) 이로운 곤충, 예컨대, 프실라를 공격하는 기생벌의 사용, 및 5) 감귤 녹화 유발 박테리아(칸디다투스 리베리박터 종)에 대해서 증가된 저항성을 갖는 새로운 감귤 생식질의 육종을 사용한 멀티-티어 통합 질병(multi-tiered integrated disease) 및 해충 관리 접근법을 취하였다. 질병의 확산을 막기 위해 문화 및 규제 조치를 사용하는 것도 통합 관리 접근법의 일부이다. 감귤 녹화 관리와 관련된 다수의 양상은 금전적 감귤 생산 손실과 관련하여 비용이 많이 든다.
티오닌 폴리펩타이드 또는 티오닌 폴리펩타이드의 혼합물의 맥간 적용은 칸디다투스 리베리박터가 존재할 수 있는 체관부(예를 들어, 체관부 수액, 체관부 반세포 및 체관부 체관 요소를 포함하는 체관부 세포) 내로 직접 전달될 수 있다.
티오닌은 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있는데, 여기서 이것은 체관부 표적화 서열(들)(표 18)에 융합될 수 있고, 이어서 박테리아가 감귤 식물에서 존재할 수 있는 동일한 인접부에 고유하게 전달될 수 있다.
체관부 표적화 티오닌 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 박테리아인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스를 직접 표적화함으로써 아시아 감귤 녹화병 또는 감귤그린병(HLB)의 확산을 예방, 감소 또는 제거하기 위해서 감귤 식물을 처리하기에 유용하다.
이들 체관부 표적화된 티오닌은 관목 또는 나무의 체관부의 주입에 의해 전달될 수 있다. 또한 분무, 세척 또는 담금액 또는 식물 주변의 토양 또는 영역에 대한 관주로서 전달할 수 있다.
체관부 표적화 서열(표 18; 서열번호 641 내지 649) 중 임의의 것이 티오닌 및 티오닌-유사 폴리펩타이드(표 19; 서열번호 650 내지 749)와 조합하여 사용될 수 있다.
HLB, 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스를 유발하는 박테리아는 단리 및 배양이 얼벼다. HLB병의 처리에 유용한지를 결정하기 위해서 체관부 표적화 서열을 갖는 개별 티오닌 및 티오닌을 시험하기 위해서, 아그로박테리움 투메파시엔스를 모델 유기체로서 사용하여 과수원 설정에서 티오닌 또는 티오닌 조합물을 사용하기 전에 아그로박테리움 의 역가 또는 성장을 감소시키는 효과를 시험할 수 있다.
티오닌 및/또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(표 19)를 사용한 본 명세서에 제공된 "펩타이드 프라이밍" 방법은 플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(표 1 내지 표 5)의 조합물로 사용될 수 있다. 티오닌- 및 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합물을 사용하여, 감귤 관목 또는 나무에 대한 임의의 감염-관련된 증상의 발병 또는 출현 이전에 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 함유하는 조성물을 적용함으로써 감귤 식물을 예방적으로 사전처리할 수 있다. 사전처리는 감귤 녹화를 유발하는 질병 병원체(칸디다투스 리베리박터 종)에 대한 저항성을 증가시킨다.
플라젤린 연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 조합하여 제공된 티오닌은 질병 예방 및 관리에 대한 보다 포괄적인 접근법을 제공한다. 티오닌 및 플라젤린 연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 질병 및 질병 확산을 예방하기 위해서 2개의 별개의 작용 모드를 사용한다.
티오닌-플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 조합물은 또한 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLB를 위해서 처방된 질병 방제를 위한 임의의 다른 통합 관리 접근법과 함께 사용될 수 있다: (1) 접목에 사용되는 무병 묘목 및 뿌리줄기의 사용, (2) 살충제 및 전신 살곤충제를 사용한 프실라 벡터의 방제의 사용, (3) 생물학적 제어제, 예컨대, 항생제의 사용, (4) 아시아 감귤 녹화병의 원인이 되는 박테리아에 대한 증가된 저항성을 갖는 감귤 생식질의 육종, (5) 질병을 확산시킬 수 있는 기생 식물(예를 들어, 실새삼)의 방제 또는 (6) 이들의 임의의 조합.
체관부 표적화 폴리펩타이드(서열번호 641)의 합성 버전이 체관부 체관 및 반세포에 대한 항-미생물 폴리펩타이드의 표적에 특히 유용하고, 식물의 다양한 박테리아 질병, 예컨대, 박테리아 잎 줄무늬병, 아시아 감귤 녹화 또는 감귤그린병 및 감귤 궤양병을 치료하는데 유용할 수 있다.
또한, 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 특히 살박테리아제와 조합하여 사용되는 경우 아시아 감귤 녹화의 치료에 유용하다. 예를 들어, 서열번호 226, 571 및 752 중 임의의 하나를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 살박테리아제는 옥시테트라사이클린을 포함한다.
감귤 궤양병
"펩타이드 프라이밍" 방법은 감귤 궤양병의 임의의 가시적인 증상 이전에 감귤 식물을 예방적으로 처리하기 위해서 또는 질병 증상의 발병이 명백해지면 치료제로서 표 19 티오닌 및 표 1 내지 표 5(플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드)에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 티오닌 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드와 함께 사용하기 위해서 개발되었다.
감귤 궤양병은 주로 열대 및 아열대 기후에서 발생하며 아시아, 아프리카, 태평양 및 인도양 제도, 남아메리카, 오스트레일리아, 아르헨티나, 우루과이, 파라과이, 브라질에 및 미국에서 보고된 감염 확산을 포함하여 30개국 이상에서 발생하는 것으로 보고되어 있다. 감귤 궤양병은 나뭇잎, 열매 및 어린 줄기를 감염시키는 박테리아인 산토모나스 악소노포디스 pv. 시트리(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 또는 pv. 오란티폴리(pv. aurantifolii)(산토모나스 시트리 아종 시트리로도 지칭됨)에 의해서 유발되는 질병이다. 감귤 관목/나부의 잎, 및 열매에 대한 감귤 궤양병 감염의 증상은 잎-반점, 잎 병변, 탈엽, 줄기 마름병(die back), 열매의 변형, 열매 껍질 결점, 조숙 낙과 및 잎 및 열매 상의 궤양병을 초래할 수 있다. 감귤 궤양병의 진단 증상은 잎 병변을 둘러싸는 특징적인 황색 후광 및 감귤 식물의 잎에 있는 괴사 조직 주변에서 발달하는 수-침윤 가장자리를 포함한다. 감귤 궤양병 병원체는 감염된 열매, 식물 및 장비의 이송을 통해서 확산될 수 있다. 바람과 비에 의해서도 분산이 촉진될 수 있다. 오버헤드 관주법 시스템이 또한 감귤 궤양병 유발 병원체의 이동을 용이하게 할 수 있다. 감염된 줄기는 다른 감슐 식물로의 전염을 위해서 줄기 병변에 감귤 궤양병 유발 박테리아(산토모나스 악소노포디스 pv. 시트리)를 보유할 수 있다. 곤충, 예컨대, 아시아 잎나방벌레(필론크시스티스 시트렐라(Phyllocnistis citrella))가 또한 질병을 퍼뜨린다.
일반적으로, 감귤 궤양병에 민감한 감귤 식물은 오렌지, 스위트 오렌지, 자몽, 포멜로(pummelo), 만다린 탄제린, 레몬, 라임, 스윙글 에시드 라임(swingle acid lime), 팔레스틴 스위트 라임, 탄제린, 탄젤로, 소어 오렌지(sour orange), 러프 레몬, 시트론, 칼라만시, 삼출엽 오렌지 및 금귤을 포함한다. 감귤 궤양병을 방제하기 위한 예방, 위생, 배제, 검역 및 근절 프로그램에 매년 전 세계적으로 수백만 달러가 사용된다(Gottwald T.R. "Citrus Canker," The American Phytopathological Society, The Plant Health Instructor 2000/updated in 2005)). 질병 치료에는 항생제 또는 소독제 적용, 구리계 살박테리아제 분무 및 아시아 잎나방 벌레 방제를 위한 살충제 적용이 포함된다.
티오닌 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 조합물은, 분무, 접종, 주입, 담금액, 침윤, 세척, 침지를 포함할 수 있는 적용 방법을 사용하여 감귤 식물 또는 감귤 식물 부분(예를 들어, 뿌리줄기, 접순, 잎, 뿌리, 줄기, 열매 및 나뭇잎)에 그리고/또는 고랑 내 처리제로서의 주변 토양에 적용될 수 있다.
티오닌 및/또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용하여 임의의 가시적인 증상 발생 이전에 감귤 식물 또는 감귤 식물 부분(예를 들어, 뿌리 줄기, 접순, 잎, 뿌리, 줄기, 열매 및 나뭇잎)을 사전 처리하기 위한 방법이 제공된다. 이것은 또한 감귤 궤양병 병원체에 대한 저항성의 증가를 제공하여 질병 증상의 감소를 초래하는데 유용하다.
추가로, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 예컨대, 플라젤린 및 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 사용하는 방법은 감귤 궤양병 증상의 초기 발병 시에 또는 질병의 증상이 명백해진 경우 감귤 식물 또는 감귤 식물 부분(예를 들어, 뿌리 줄기, 접순, 잎, 뿌리, 줄기, 열매 및 나뭇잎)을 치료하는데 유용하다.
감귤 식물을 처리하여 감귤 궤양병의 확산을 예방, 감소 또는 제거하기 위한 Flg 폴리펩타이드의 적용은, 관목 또는 나무의 체관 내의 주입, 분무, 세척, 담금액으로서의 첨가 또는 식물 주변의 토양 또는 토양 영역에 대한 관주로서 전달될 수 있거나 고랑 내로 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 티오닌 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(표 17)는 단독으로 또는 플라젤린-연관된 Flg 폴리펩타이드(표 1 내지 표 5) 중 임의의 것과 조합하여 엽면 처리 또는 분무로서 또는 주입으로서 적용될 수 있고, 감귤 궤양병을 유발하는 박테리아(산토모나스 악소노포디스 pv. 시트리)의 확산에서 식별된 곤충, 예컨대, 아시아 잎나방벌레(필론크시스티스 시트렐라)로부터의 감귤 식물의 침략의 예방에 유용하다.
감귤 식물
개선된 식물 건강, 질병 내성 또는 질병 치료제 적용을 제공하여 아시아 감귤 녹화(HLB) 또는 감귤 궤양병을 치료 또는 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것은 임의의 감귤 식물 및 관목/나무에 사용하기에 적합하다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 티오닌 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 티오닌 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 임의의 감귤 관목 및/또는 나무 및 임의의 작물학적으로 중요한 감귤 잡종 또는 감귤 비-잡종 식물에 적용될 수 있고, 감염의 발병을 예방하기 위해서 감귤을 예방적으로 처리하거나 감염이 일어난 후 치료를 제공하기 위해서 사용된다.
본 명세서에 기재된 방법의 사용을 위한 감귤 식물 종은 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 스위트 오렌지(시트러스 시넨시스, 시트러스 맥시마×시트러스 레티쿨라타), 베가모트 오렌지(시트러스 버가미아, 시트러스 라메타×시트러스 오란티엄), 소어 오렌지 또는 세비야(Seville) 오렌지(시트러스 오란티엄, 시트러스 맥시마×시트러스 레티쿨라타), 블러드 오렌지(시트러스 시넨시스), 오가넬로 또는 치론자(Chironja)(시트러스 파라디시×시트러스 시넨시스), 만다린 오렌지(시트러스 레티쿨레이트), 삼출엽 오렌지(시트러스 트라이폴리에이타), 타치바나 오렌지(시트러스 타치바나), 클레멘틴(시트러스 클레민티나), 체리 오렌지(시트러스 크노쿠니), 레몬(시트러스 리몬, 시트러스 맥시마×시트러스 메디카), 인디아 야생 오렌지(시트러스 인디카), 임페리얼 레몬(시트러스 리몬, 시트러스 메디카×시트러스 파라디시), 라임(시트러스 라티폴리, 시트러스 오란티폴리아), 메이어 레몬(시트러스 메이에리); 시트러스 Х메이에리와 시트러스 맥시마, 시트러스 메디카, 시트러스 파라디시 및/또는 시트러스 시넨시스의 잡종), 러프 레몬(시트러스 잠브히리), 볼카머(Volkamer) 레몬(시트러스 볼카머이아나), 폰데로사(Ponderosa) 레몬(시트러스 리몬 x 시트러스 메디카) 카피어(Kaffir) 라임(시트러스 하이드릭스 또는 마우리티우스 파레다), 스위트 레몬, 스위트 라임 또는 모잠비(시트러스 라메타), 페르시안 라임 또는 타히티 라임(시트러스 라티폴리아), 팔레스틴 스위트 라임(시트러스 라임티오이데스), 윈제드(Winged) 라임(시트러스 롱기스피나), 오스트랄리언 핑거 라임(시트러스 오스트랄라시카), 오스트랄리언 라운드 라임(시트러스 오스트랄리스), 오스트랄리언 데저트 또는 아웃백 라임(시트러스 글라우카), 마운트 화이트 라임(시트러스 가라와이애), 카카두 라임 또는 햄프티 두 라임(시트러스 그라실리스), 러셀 리버 라임(시트러스 이노도라),뉴 기니아 와일드 라임(시트러스 와버기아나(Citrus warburgiana)), 브라운 리버 핑거 라임(시트러스 윈터시(Citrus wintersii)), 만다린 라임(시트러스 리모니아; (시트러스 레티쿨라타×시트러스 맥시마×시트러스 메디카), 카라바우 라임(시트러스 페니베시쿨라타), 블러드 라임(시트러스 오스트랄라시카 x 시트러스 리모니아) 라임베리(트리파시아 브라시, 트리파시아 그란디폴리아, 트리파시아 트리폴리아), 자몽(시트러스 파라디시; 시트러스 맥시마×시트러스 Х시넨시스), 탄자린(Tangarine)(시트러스 탄제리나), 탄젤로(Tangelo)(시트러스 탄젤로; 시트러스 레티쿨라타×시트러스 맥시마 또는 시트러스 파라디시), 미네올라 탄젤로(시트러스 레티쿨라타×시트러스 파라디시), 오가넬로(시트러스 파라디시×시트러스 시넨시스), 탄골(시트러스 노빌리스; 시트러스 레티쿨라타×시트러스 시넨시스), 퍼멜로 또는 포멜로(시트러스 맥시마), 시트론(시트러스 메디카), 마운틴 시트론(시트러스 할리미), 금귤(시트러스 자포니카오 포투넬라 종), 금귤 잡종(칼라몬딘, 포투넬라 자포니카; 시트란케쿼트, 시트러스 이창겐시스; 라임쿼트, 시트로포투넬라 플로리다나; 오렌지쿼트, 사추마 만다린 x 시트러스 자포니카오 포투넬라 종 간의 잡종; 프로시메쿼트(Procimequat), 포투넬라 히르드지에; 선쿼트, 시트러스 메이에리와 시트러스 자포니카오 포투넬라 종 간의 잡종; 유주쿼트(Yuzuquat), 시트러스 이창겐시스와 포투넬라 마가리타 간의 잡종), 파레다(Papeda)(시트러스 할리미(Citrus halimii), 시트러스 인디카(Citrus indica), 시트러스 마크롭테라, 시트러스 미크란타), 이창 파레다(시트러스 이창겐시스), 셀레베스 파레다(시트러스 셀레비카), 카시 파레다(시트러스 라티페스), 멜라네시안 파레다(시트러스 마크롭테라), 이창 레몬(시트러스 이창겐시스×시트러스 맥시마), 유주(Yuzu)(시트러스 이창겐시스×시트러스 레티쿨라타), 캄산(Cam s
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nh)(시트러스 레티쿨라타 x 시트러스 맥시마), 카보수(Kabosu)(시트러스 스패로카파(Citrus sphaerocarpa)), 수다치(시트러스 수다치), 알레모(Alemow)(시트러스 마크롭필라(Citrus macrophylla)), 비아송(Biasong)(시트러스 미크란타), 사무야오(Samuyao)(시트러스 미크란타), 칼피(시트러스 웨버리), 미칸(Mikan)(시트러스 운쉬우), 휴가나추(Hyuganatsu)(시트러스 타무라나), 마니샤니에간(Manyshanyegan)(시트러스 망샤넨시스), 러쉬(Lush)(시트러스 크레나티폴리아), 아마나추(Amanatsu) 또는 나추미칸(Natsumikan)(시트러스 나추다이다이), 키노우(시트러스 노빌리스×시트러스 델리시오사), 키요미(Kiyomi)(시트러스 시넨시스×시트러스 운쉬우), 오로블란코(Oroblanco)(시트러스 맥시마×시트러스 파라디시), 어글리(Ugli)(시트러스 레티쿨라타×시트러스 맥시마 및/또는 시트러스×파라디시), 칼라몬딘(시트러스 레티쿨라타×시트러스 자포니카), 치노토(시트러스 미르티폴리아, 시트러스 오란티엄 또는 시트러스 퍼밀라), 클레오파트라 만다린(시트러스 레쉬니), 다이다이(Daidai)(시트러스 오란티엄 또는 시트러스 다이다이), 라라하(시트러스 오란티엄), 사추마(시트러스 운쉬우), 나르트지에(시트러스 레티쿨라타×시트러스 노빌리스), 랑퍼(Rangpur)(시트러스 리모니아; 또는 시트러스 시넨시스 x 시트러스 맥시마×시트러스 레티쿨라타와의 잡종), 드제룩 리마우(Djeruk Limau)(시트러스 암블리카파), 이요칸(Iyokan), 아나도미칸(anadomikan)(시트러스 이요), 오디추쿠티(Odichukuthi)(시트러스 오디추쿠티), 오우곤칸(Ougonkan)(시트러스 플라비컬푸스), 폼피아(몬스트루오사)(시트러스 몬스트루오사), 타이완 탄제린(시트러스 데프레사), 쇼난 골드(시트러스 플라비컬푸스 또는 시트러스 운쉬우), 선키(Sunki)(시트러스 선키), 망샨이엔(Mangshanyen)(시트러스 망샤넨시스, 시트러스 노빌리스), 클리메니아(클리메니아 플라티포다, 클리메니아 폴리안드라), 자바라(Jabara)(시트러스 자바라), 만도라(Mandora)(만도라 시프러스(Mandora cyprus)), 멜로골드(시트러스 그란디스 x 시트러스 파라디시/시트러스 맥시마/시트러스 그란디스), 샨기우안(Shangjuan)(시트러스 이창겐시스 x 시트러스 맥시마), 난펭미주(Nanfengmiju)(시트러스 레티쿨라타) 및 쉬콰사이(Sh
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kw
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sa
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)(시트러스 데프레사(Citrus depressa)).
티오닌 및/또는 플라젤린-연관된 프라이밍 폴리펩타이드는, 의학 또는 화장품/건강 및 미용 목적을 위해서 사용되는 임의의 감귤 식물, 관목/나무, 예컨대, 베가모트 오렌지(시트러스 버가미아), 소어 또는 비터 오렌지(시트러스 오란티엄), 스위트 오렌지(시트러스 마크롭필라), 키(Key) 라임(시트러스 오란티폴리아), 자몽(시트러스 파라디시), 시트론(시트러스 메디카), 만다린 오렌지(시트러스 레티쿨레이트), 레몬(시트러스 리몬, 또는 시트러스 메디카×시트러스 맥시마와의 잡종, 시트러스 리모니아, 시트러스 메디카×시트러스 맥시마×시트러스 메디카), 스위트 라임(시트러스 라메타), 카피어 라임,(시트러스 하이드릭스 또는 마우리티우스 파레다), 레몬 잡종 또는 루미나(시트러스 메디카 x 시트러스 리몬), (시트러스 메디카×시트러스 맥시마×시트러스 메디카), 오마니(Omani) 라임(시트러스 오란티폴리아, 시트러스 메디카×시트러스 미크란타), 잠볼라(Jambola)(시트러스 그란디스), 카카두 라임 또는 햄프티 두 라임(시트러스 그라실리스), 포멜로(시트러스 레트쿨라타), 탄골(시트러스 노빌리스) 및 소어 라임 또는 님부카(Nimbuka)(시트러스 아시다)에 적용될 수 있다.
열매 생산을 위한 예시적인 중요한 감귤 잡종은 스위트 오렌지(시트러스 시넨시스), 광귤(시트러스 오란티엄), 자몽(시트러스 파라디시), 레몬(시트러스 리몬), 페르시안 라임(시트러스 라티폴리아(Citrus latifolia)), 키 라임(시트러스 오란티폴리아(Citrus aurantiifolia)), 탄제린(시트러스 탄제린) 및 랑퍼(시트러스 리모니아)이다.
추가로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, 조성물 방법 중 임의의 것이 뿌리줄기 및/또는 접순 생식질로서 사용되는 임의의 감귤 식물, 관목/나무에 적용될 수 있다. 이러한 방법은 접순 품종의 가치를 향상시키기 위해서 감귤의 접목에 일반적으로 사용되는 뿌리줄기에 특히 유용한데, 이것은 가뭄, 서리, 질병 또는 토양 유기체(예를 들어, 선충)에 대한 내성을 포함할 수 있다. 유용한 뿌리줄기를 제공하는 이러한 감귤 식물은 소어 또는 비터 오렌지(시트러스 오란티엄), 스위트 오렌지(시트러스 마크롭필라), 삼출엽 오렌지(폰시러스 트라이폴리에이타), 러프 레몬(시트러스 잠브히리), 볼카머 레몬(시트러스 볼카머이아나), 알레모(시트러스 마크롭필라), 클레오파트라 만다린(시트러스 레쉬니), 시트루멜로(시트론시루스 종과의 잡종), 자몽(시트러스 파라디시), 랑퓨어 라임(시트러스 리모니아), 팔레스틴 스위트 라임 (시트러스 라임티오이데스) 및 트로이어 시트랑(Troyer Citrange)(시트러스 시넨시스×폰시러스 트라이폴리에이타 또는 시트러스 시넨시스×시트러스 트라이폴리에이타) 및 시트랑(시트러스 시넨시스×폰시러스 트라이폴리에이타 또는 C. 시넨시스×C. 트라이폴리에이타)을 포함한다.
감귤 녹화를 치료 또는 감소시키기 위한 레트로-인버소 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 용도
레트로-인버소 대응물과 쌍을 이루는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 조합물은 아시아 감귤 녹화 또는 감귤그린병을 초래하는 감귤에 대한 녹화 효과를 치료 및 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
감귤에서 HLB의 초기 증상은 개별 가지 또는 나무 캐노피의 한 부분에서의 잎의 황변이다. HLB로부터 황변하는 잎은 잎의 한쪽 면에 녹색 패치가 있고 다른 쪽면에 황색 패치가 있는 얼룩이 있는 황변 또는 모틀링의 비대칭 패턴을 나타낼 것이다. HLB병이 진행함에 따라서 열매 크기는 더 작아지고, 과육은 써진다. 열매는 부분적으로 녹색으로 유지될 수 있고, 조숙하여 낙과하는 경향이 있다.
Flg 폴리펩타이드와 이의 레트로-인버소(RI) 형태의 처리 조합물은 감귤 열매 녹화에 대한 효과를 최소화하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 처리 조합물은 HLB-감염된 나무에 적용될 수 있다. 레트로-인버소 형태는 식물 표면에서 FLS-연관된 수용체(들)에 대한 결합에 대해서 Flg 폴리펩타이드의 네이티브 형태와 경쟁하고, 따라서 HLB병과 연관된 녹화의 증상 형성을 저해/지연시킬 것이다. 네이티브 Flg22 및 RI Flg22 조합물은 급성 증상 발달, 예컨대, 잎 황변 및 감귤 열매 녹화를 예방하면서 미세하게 조정되는 면역을 도와서 질병-유발 박테리아, 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스를 감소시키고, 심지어는 제거한다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해서 제공된다.
실시예 1: 옥수수에 대한 Bt. 4Q7Flg22 및 레트로-인버소 Bt. 4Q7Flg22 및 Ec. Flg22 및 Ec. RI Flg22의 적용
옥수수(BECK'S 5828 YH, 6175YE) 수확률에 대한 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 레트로-인버소 Bt.4Q7Flg22(서열번호 376), 뿐만 아니라 Ec. Flg22 (서열번호 526) 및 Ec. RI Flg22(서열번호 527) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 효과를 미국 중서부에서 10곳의 별개의 지역에서 결정하였다(도 2 및 도 3).
옥수수 식재를 위한 관행 또는 보존 경운 방법을 위해서 각각의 지역에서 파종상(field seed bed)을 제조하였다. 비료를 종래의 경작법에 의해서 권고된 바와 같이 적용하고, 미국 중서부 지역 간에 일관성을 유지하였다. 제초제를 잡초 방제를 위해 적용하였고, 필요 시 경작(cultivation)을 보충하였다. 모든 지역에 4-이랑 플롯(row polt)의 17.5피트(5.3미터) 길이를 심었다. 정상적인 뿌리 발달을 보장하기 위해서 옥수수 종자를 1.5 내지 2인치(3.8 내지 5.1㎝) 깊이로, 30인치(76.2㎝) 이랑의 이랑 너비로 1에이커당 28,000 내지 36,000개의 식물로 심었고, 종자 간격은 대략 1.6 내지 1.8개의 종자였다. 각각의 잡종을 경작지 변동성을 설명하기 위해 각 지역에서 최소한 3개의 별개의 플롯(반복)으로 성장시켰다.
네이티브 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226) 및 이의 레트로-인버소 폴리펩타이드(서열번호 376)를 고체상 펩타이드 합성을 통해서 화학적으로 합성하고 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/헥타르, Ha) 사용률로 제형화하였다. 10갤론의 물/Ac(37.85L/Ha)의 담체율로 희석한 후 분무 탱크의 최종 농도는 25nM이었다. 네이티브 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 1년 및 2년 경작지 시험 동안 적용하여 다년간 성장 계절에 걸친 효과를 측정하였다. 레트로-인버소 폴리펩타이드를 첫해 경작지 시험 동안 적용하여 네이티브 Bt.4Q7Flg22와 비교하였다. V5-V8 발달기 동안 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)의 사용률로 엽면 분무 적용으로서 적용하였다. 각각의 폴리펩타이드를 0.5%의 비이온성 계면활성제와 함께 적용 하였다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 효과를 에이커당 부셀(Bu/Ac) 단위의 수확률로 절대 변화로서 측정하였다. 추가로, 또한, 승률(win rate)을 계산하였다: 하나의 처리가 다른 처리보다 수확률 이익이 있는 시험 지역의 백분율(이 경우, 미처리 대조군 식물과 비교한 바와 같음).
도 2, 패널 A는 첫해 경작지 시험 동안, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)의 엽면 분무 적용이 미처리 대조군 옥수수 식물과 비교할 때 10개 지역에 걸쳐서11.60Bu/Ac(728.1㎏/Ha)의 평균 수확률 증가 및 90%의 승리율을 초래하였음을 나타낸다. 도 2, 패널 B 는 레트로 인버소 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 376)의 엽면 분무 적용이 미처리 대조군 옥수수 식물과 비교할 때 미국 중서부에서 10개 지역에 걸쳐서 +11.90Bu/Ac(746.9㎏/Ha)의 평균 수확률 증가 및 70%의 승리율을 초래하였음을 나타낸다. 두 도면에서, 위치(1 내지 12)를 x-축에 보고하고, 절대 수확률 변화Bu/Ac를 각각의 지역에서 막대 그래프 위 또는 아래에 y-축에 보고한다. 옥수수에 전달된 Ec. Flg22 폴리펩타이드는 10개의 장소에 걸쳐서 80% 승리율로 8.2Bu/Ac(514.7㎏/Ha) 이익을 산출하였다. Ec. RI Flg22의 레트로 인버소 버전은 마찬가지로 산출하지 않았는데, 이것은 10곳의 장소에 걸쳐서 50% 승리율로 1.9bu/c를 제공하였다.
두 번째 해 경작지 시험을 미국 중서부(IL, IN, IA)에서 10 내지 11개 지역에서 넓은 에이커의 경작지 시험을 사용하여 수행하였고, Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226)의 엽면 분무 적용을 V8 옥수수 식물(Dekalb 5064)에게 제공하였다. Bt.4Q7Flg22의 엽면 분무 적용을 0.33에이커당 유체 온스(Fl.oz/Ac)의 사용률로 적용하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비는, 11개 지역에 걸쳐서 대조군보다 +4.8Bu/Ac의 평균 수확률 증가를 초래하였고, 승리율은 83%였다. 지역 1 내지 6은 x-축에 보고하고, 절대 수확률 변화 Bu/Ac를 각각의 지역에서 막대 그래프 위 또는 아래에 y-축에 보고한다.
도 2(패널 A)에 도시된 옥수수 잡종(베크 5828 YH)에 적용된 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226)를 사용한 엽면 처리를 사용한 첫해 경작지 시험은 미처리 대조군 식물보다 +11Bu/Ac(690.4㎏/Ha)의 수확률 증가를 초래하였다. 도 3에 도시된 V8 옥수수 식물(Dekalb 5064)에 적용된 두 번째 해 경작지 시험은 미처리 대조군 식물의 수확률과 비교할 때 거의 +5Bu/Ac(313.8㎏/Ha) 증가를 초래하였다. 두 옥수수 잡종에 대한 조합 평균은 지역에 따라서 +8.0Bu/Ac(50.2㎏/Ha)의 2-년 평균 수확률 증가를 초래하였고, 다해 성장 시기에 대해서 86%의 승리율을 나타내었다.
3회 옥수수에 V5-V8 적용으로서 시험되고, 비이온성 계면활성제와 함께 적용된 Bt.4Q7 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용하여 제3 연구를 수행하였다. 최종 사용률은 0.33Fl.oz/Ac, 4Fl.oz/Ac, 8Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha, 292.3㎖/Ha, 584.6㎖/Ha)였는데, 이는 각각 25nM, 300nM, 600nM의 대략적인 최종 농도를 초래하였다. 10 내지 11곳의 장소에서 각각의 연구를 수행하였다. 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)의 V5-V8에서의 연구 결과는 5.75Bu/Ac 또는 360.9㎏/Ha의 이익, 4Fl.oz/Ac a 3.77Bu/Ac 또는 236.6㎏/Ha의 이익, 및 8Fl.oz/Ac 또는 5.05Bu/Ac 또는 317㎏/Ha였다.
실시예 2: 살진균제와 함께 Bt .4Q7Flg22의 V8 옥수수에 대한 적용
상업적으로 입수 가능한 살진균제, STRATEGO YLD와 함께, 또는 이것 없이 Bt.4Q7Flg22의 엽면 처리를 수행하여 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 살진균제의 조합물로부터 상승작용적 효과가 초래되었는지를 결정하였다.Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 단독 또는 STRATEGO YLD와 조합된 엽면 분무 적용을 V8 발달기에 옥수수 식물(잡종 Dekalb 5064)에서 평가하였다.
반복 시험을 사용하여 미국 중서부(IA, IL, IN) 전체의 6 내지 8개 지역에서 반복 시험을 수행하였다. 옥수수 식물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 개별 경작자의 생산 관행을 사용하여 플롯을 유지시키고, 각각의 플롯을 3 내지 4회 반복하였다. 사용되는 경우, STRATEGO YLD 살진균제(프로티오코나졸과 트라이플록시스트로빈의 조합물)를 권고된 표지 비율(4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha))로 각각의 지역에 적용하였다. 엽면 처리 적용은 하기 처리로 이루어졌다: (a) 미처리 대조군, (b) STRATEGO YLD 살진균제 단독, 및 (c) 살진균제와 함께 제공되는 유리 펩타이드 형태로 전달되는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) (d) 살진균제 없이 제공되는 유리 펩타이드 형태로 전달되는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226). Bt.4Q7Flg22를 0.33 또는 4.0에이커당 유체 온스(Fl.oz/Ac) 또는 (24.1 또는 292.3 ㎖/Ha)의 사용률로 적용하였다.
에이커당 부셀(Bu/Ac) 의 옥수수 수확률을 각각의 위치에서 반복 시험에 대한 평균 수확률로서 모든 지역에서 보고하였다. STRATEGOYLD 살진균제로의 엽면 시비가 제공된 옥수수 식물에 대한 Bu/Ac에서의 수확률 변화를 6개의 지역에 대해서 대조군 옥수수 식물에 대한 평균 수확률에 정규화시켰다(표 22).
0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)로 제공된 Bt.4Q7Flg22로의 엽면 처리는, 미처리 대조군 옥수수 식물에 비해서 수확률 이득을 제공하였고, 6개의 지역에 걸쳐서 +4.84Bu/Ac(303.8㎏/Ha) 증가가 관찰되었다. STRATEGO YLD의 살진균제 적용 만을 사용한 엽면 처리가 또한 대조군 식물보다 +4.88Bu/Ac(306.3㎏/Ha)의 옥수수 수확률 이득을 제공하였다. 4.0Fl.oz/Ac의 STRATEGO YLD 살진균제와 조합하여 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)의 유리 펩타이드, Bt.4Q7Flg22를 적용하는 것은 상승작용적 효과를 나타내었는데, 이는 미처리 대조군 식물보다 평균 +10.72Bu/Ac(672.9㎏/Ha)를 초래하였다. 따라서, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드와 살진균제 처리 조합물은 폴리펩타이드의 경우 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha) 사용률 및 살진균제의 경우 4.0Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha) 사용률에서 상승작용적 효과를 초래하였다.
Figure pct00081
Ec. Flg22와 STRATEGO의 조합물을 관찰하는 제2 연구를 또한 상기와 동일한 방식의 반복 시험으로서 8곳의 장소에서 또한 수행하였다. 4Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha)의 Ec. Flg22를 STRATEGO YLD의 상부 상에 1.3(Bu/Ac)(81.6㎏/Ha)로 첨가하였고, 8곳의 장소에 걸쳐서 63% 승리 백분율을 나타내었다. 이는, Flg22 폴리펩타이드 둘 다가 상업적인 살진균제, STRATEGO YLD에 이득을 부가할 수 있었음을 입증한다.
실시예 3: R2 대두에 대한 Bt .4Q7 Flg22, 레트로-인버소 Bt. 4Q7Flg22, Ec. Flg22, 레트로 인버소 Ec. Flg22 또는 RHPP의 적용 - 수확률 증가
바실루스 투린기엔시스 균주 4Q7로부터의 Bt.4Q7 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226; 도 4, 패널 A), 레트로-인버소(RI) Bt.4Q7Flg22(서열번호 376; 도 4, 패널 B) 및 글리신 맥스로부터 유래된 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP, 서열번호 600)를 사용한 엽면 시비를 대두 식물(상업적인 잡종 베크 294 NR)에 R2 발달기에 0.33Fl.oz/Ac 또는 24.1㎖/Ha(Flg22 폴리펩타이드) 또는 4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha(RHPP)의 사용률을 사용하여 적용하였다. 대두 종자를 성장시키는 데 실시예 1에서 사용된 경작 방법을 따랐다. 대두 종자(상업적인 잡종 베크 294 NR) 를 1.5 내지 2인치(3.8 내지 5.1㎝) 깊이로 심어서 정상적인 뿌리 발달을 보장하였다. 대두 종자를 30인치(76.2㎝) 이랑의 이랑 너비, 피트(0.3미터)당 대략 7 내지 8개 종자의 종자 간격으로 에이커당 대략 평균 150,000개 식물로 심었다.
10월에 수확된 11곳의 별개의 미국 중서부 지역에서 성장된 대두에 대해서 에이커당 부셀(Bu/Ac) 단위의 수확률 결과를 기록한다(도 4). 대조군 대두 식물에 정규화된 수확률(Bu/Ac) 변화로서 지역 모두에 대한 평균으로서 대두 수확률(Bu/Ac)을 또한 보고한다. Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 RI Bt.4Q7Flg22(서열번호 376)를 사용한 엽면 시비 이후의 대두 수확률을 미처리 대두 식물의 수확률과 비교하였고, 도 4에 플로팅하였다. 지역 1 내지 11을 x-축 상에 기록한다. 미처리 대조군 대두 식물과 비교하는 경우 절대 수확률 변화(Bu/Ac)를 각각의 지역에서 막대 그래프 위 또는 아래에 y-축 상에 보고한다. 모든 11곳의 지역에 걸친 평균 수확률을 기록하고, 흑색 막대로 강조하였다. Bt4Q7Flg22 및 RI Bt.4Q7Flg22 엽면 처리된 식물에 대한 대두 수확률은 11곳의 상이한 지역에서 유사한 경향을 나타내었다. RI Bt.4Q7Flg22를 사용한 대두 상의 분무 적용은 11곳의 지역에 걸쳐서 대두 미처리 대조군 식물과 비교할 때 2종의 대두 잡종에 대해서 0.90Bu/Ac(60.5㎏/Ha)의 평균 수확률 증가를 초래하였다. 대두에서 자연(올 L) Bt.4Q7Flg22에 대한 수확률 결과는 지역에 따라서 비교할 때 중립적(-0.1Bu/Ac 또는 -6.7㎏/Ha))이었다. 11곳의 개별 미국 중서부 지역에 걸쳐서 나타낸 수확률 데이터는 대조군 또는 미처리 대두 식물과 비교할 때 RI Bt.4Q7Flg22 및 Bt.4Q7Flg22 분무 적용 처리 둘 다에 대해서 64%의 승리율을 초래하였다. 동일한 연구에서 4Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha)의 RHPP 폴리펩타이드의 첨가는 대조군에 비해서 1.2Bu/Ac(80.7㎏/Ha)만큼 수확률을 증가시켰다.
10갤론/Ac(93.5L/Ha)의 물 및 NIS 계면활성제의 담체 비율과 함께 대두 상의 R2 엽면 처리제로서 Ec. Flg22 및 Ec. RI Flg22 폴리펩타이드를 시험하기 위해서 제2 연구를 수행하였다. 100nM의 농도를 각각의 처리를 위해서 탱크에서 획득하였다. Ec. Flg22의 적용은 11곳의 장소에 대해서 82% 승리율의 승리율과 함께 0.9Bu/Ac(60.5㎏/Ha) 증가로 이어졌고, Ec. RI Flg22는 10곳의 장소에 걸쳐서 80% 승리율과 함께 0.6Bu/Ac(40.3㎏/Ha) 증가로 이어졌다. 또한 종자 처리제로서 RHPP 폴리펩타이드를 포함시켰고, 이것은 11곳의 장소에 걸쳐서 73% 승리율로 1.2Bu/Ac(80.7㎏/Ha)를 가졌다.
엽면 비료를 단독으로 또는 RHPP(8fl oz/Ac(584.6㎖/Ha))와 함께 첨가하여 동일한 11곳의 장소에서 제3 연구를 수행하였다. 엽면 비료의 상부 상의 RHPP의 첨가는 11곳의 장소에 걸쳐서 1Bu/Ac(67.2㎏/Ha) 이익을 제공하였다.
실시예 4: 대두에 대한 Flg22 폴리펩타이드의 엽면 분무 적용.
0.5% NIS 계면활성제를 함유한 10갤론/Ac(93.5 L/Ha)의 물과 함께 Bt.4Q7Flg22, Ec.Flg22, 및 RHPP(4.0 및 8.0Fl.oz/Ac(292.3 및 584.6㎖/Ha))를 사용한 엽면 처리를 11곳의 장소에 걸쳐서 R2 시기의 대두 품종에 대해서 시험하였다. 더 많은 용량인 8Fl.oz/Ac(584.6㎖/Ha)에서, Ec. Flg22 폴리펩타이드는 0.74Bu/Ac(49.8㎏/Ha) 이익을 제공하였고, Bt.4Q7 Flg22는 0.88Bu/Ac(59.2㎏/Ha) 이익을 제공하였다. RHPP의 경우 더 적은 용량인 4Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha)는 0.31Bu/Ac(20.9㎏/Ha) 수확률 이익을 제공하였다.
실시예 5: 수확률을 증가시키기 위한 에쉐리키아 콜라이 플라젤린 폴리펩타이드의 적용 - 옥수수
이어서, 에쉐리키아 콜라이로부터 유래된 플라젤린 폴리펩타이드의 옥수수 수확률에 대한 효과를 시험하였다. 옥수수 식물(Beck's 5828 YH)에게 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)의 사용률로 적용되는, V5-V8 발달기에 에쉐리키아 콜라이로부터의 Ec. Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 526) 및 레트로-인버소 RI Ec.Flg22(서열번호 527)를 함유하는 제형을 초기 분무 적용으로 제공하였다. 10월에 수확된 12곳의 별개의 지역에서 재배된 옥수수에 대해서 에이커당 부셀(Bu/Ac) 단위의 수확률 결과를 결정하였다.
도 5는 미처리 대조군 식물에 대해서 정규화된 이러한 12곳의 지역에 걸친 수확률을 도시하는데, 이는 대조군과 비교한 Bu/Ac의 증가 또는 감소로서 나타낸다.일리노이에서 12곳의 개별 지역에 대해서 나타난 수확률 데이터는 50%의 승리율을 초래하였다. Ec.Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 엽면 분무 적용으로 제공된 옥수수 식물(도 5, 패널 A)은 12곳의 지역에 걸쳐서 미처리 식물에 비해서 +8.2Bu/Ac(514.7㎏/Ha)의 평균 수확률 증가를 초래하였다. 레트로 인버소 RI Ec.Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 엽면 분무 적용이 제공된 옥수수 식물(도 5, 패널 B)은 12곳의 지역에 걸쳐서 미처리 대조군 옥수수 식물과 비교할 때 +1.9Bu/Ac 119.3㎏/Ha)의 평균 수확률 증가를 초래하였다. 따라서, Ec.Flg22(서열번호 526) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 함유하는 엽면 분무의 적용은 V5-V8 발달기에 적용되는 경우 옥수수 식물에게 이로운 성장 반응 및 수확률 이득을 제공하였다.
실시예 6: 식물 키를 증가시키기 위한 V2-V3 대두에 대한 에쉐리키아 콜라이 플라젤린 폴리펩타이드의 엽면 시비
Ec.Flg22(서열번호 526) 및 레트로 인버소 RI Ec.Flg22(서열번호 527)의 엽면 시비를 대두(베크 297NR)에 적용하였다. 환경적으로 제어된 성장 공간에서 식물을 재배하였다. 팀버라인(Timberline) 상부 토양을 함유하는 39.7cm3 포트에 2.54㎝의 깊이로 포트당 2개의 종자로 종자를 직접 심었다. 식재 후, 50㎖의 실온수를 각각의 포트에 첨가하여 발아를 가능하게 하였다. 포트를 대략 300μ㏖m-2s-1(광자(light photon))를 제공하는 인공 조명 성장 공간에서 13/11 광/일 주기 동안 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위에서 유지시켰다. 식물에게 동일한 살수 및 비료 요법을 제공하였다.
Ec.Flg22의 네이티브 형태 및 레트로 인버소 형태 둘 다를 사용한 엽면 처리를 3주령의 대두 식물에 V2 내지 V3 발달기에 0.33Fl.oz/Ac(24.1㎖/Ha)의 사용률을 사용하여 적용하였다. 3주에 전달되는 엽면 시비 직전에 식물 키(㎝)를 측정하고, 이어서 식물이 5주령이 되었을 때 2주 후에 다시 측정하였다. 2회의 시험울 시험당 18개의 식물을 사용하여 수행하였다.
표 23에 기재된 바와 같이, V2 내지 V3 발달기의 대두에 대한 Ec.Flg22 폴리펩타이드의 엽면 시비는 대조군(물 단독 처리) 식물에 비해서, 식물 키를 증가시켰다(표 23). Ec.Flg22(서열번호 526) 및 레트로-인버소 Ec.Flg22(서열번호 527) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비는 대조군 미처리 대두 식물에 정규화(100%로 정규화)되는 경우 식물 키에서 +13% 및 +16% 증가를 초래하였다.
Figure pct00082
실시예 7: 옥수수에서 Flg22 및 레트로 인버소 Flg22의 적용 - 식물 키
옥수수(베크 잡종 5828 YH) 식물을 실시예 6에 기재된 바와 같은 환경 제어된 성장 공간에서 재배하였다. 식물을 출현 3주 후에 측정하고, 이어서 바실루스 투린기엔시스(Bt.4Q7Flg22, 서열번호 226 및 376) 및 에쉐리키아 콜라이(Ec.Flg22, 서열번호 526-527)로부터의 Flg22 폴리펩타이드의 자연(L) 형태 및 레트로-인버소(D) 형태의 엽면 시비로 처리하였다. 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드르 1μM의 농도로 유리 폴리펩타이드로서 적용하였다. 대조군 식물을 물 단독으로 처리하였다. 추가의 2주 성장 후에, 식물 키를 측정하였다(5주에).
2주와 5주 간격 시간 지점 사이의 식물 키 변화(△ 키 ㎝)를 측정하고, 수처리 대조군 식물의 성장에 정규화하였다. 시험당 9개의 식물을 사용하여 3회의 시험을 수행하였고, 이는 처리당 총 27회의 측정과 동일하였다(표 24). 3주 측정 시간 지점에서 EcFlg22, Bt.4Q7Flg22 또는 수처리 대조군 식물 사이에서 측정된 식물 키에는 차기가 없었다. 3주에서 5주까지의 식물 키의 최고 변화는 Ec.Flg22 엽면 시비가 제공된 옥수수 식물(△ = 17.60㎝)에 대해서 보고되었다. 이러한 식물은 또한 5주 측정 마크에서 대조군 식물에 비해서 +8.3%의 키 증가를 달성하였다. 2종의 레트로 인버소 폴리펩타이드(RI Ec.Flg22 및 RI Bt.4Q7Flg2) 및 자연 Bt.4Q7Flg22는, 대조군 처리와 비교할 때 대략 +2% 내지 +4%로 보고되는 증가로 식물 키를 유사하게 증가시켰다.
Figure pct00083
실시예 8: 스트레스 하에서 성장을 촉진시키기 위한 레트로 인버소 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 옥수수
비생물학적 스트레스는 상당한 작물 손실을 야기하며 작물 생산 및 수확량의 주요 감소를 초래할 수 있다. 플라젤린 조성물 및 플라젤린-연관된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드는 하나 이상의 비생물학적 스트레스에 대한 식물의 내성을 증가시키기 위해서 화학적 프라이밍제로 사용될 수 있다. Ec.Flg22 및 Bt.4Q7Flg22 및 이들 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 둘 다의 레트로 인버소(RI) 형태를 사용한 엽면 처리를 수행하여 이러한 엽면 적용된 폴리펩타이드가 고온 및 가뭄 스트레스에 대해서 보호 이익을 제공할 수 있는지를 결정하였다.
옥수수(베크 잡종 5828 YH) 종자를, 16시간 낮/8시간 밤의 광 사이클을 따르는 차이를 제외하고는, 실시예 6에 기재된 바와 같이 심고, 재배하였다. 온도는 75% 습도로 21℃/낮에서 15℃/밤으로 순환되었다. 낮 사이클은 여전히 식물 성장에 적절한 광인 균일한 대략 300μ㏖m-2s-1을 제공하였다. 식물을 출현 3주 후에 측정하고, 이어서 1μM 농도의 Ec.Flg22(서열번호 526 내지 527) 또는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226 및 376)의 자연 형태 또는 레트로-인버소(RI) 형태의 엽면 시비로 처리하였다. 대조군 식물을 물 단독으로 처리하였다. 분무 처리 적용 1주 후, 식물을 2개의 군으로 나누었는데, 하나의 군은 기재된 바와 같은 동일한 표준 성장 환경에 유지시켰고, 나머지 군은 고온 및 물 부족 스트레스를 제공하는 환경으로 옮겼다. 고온 스트레스 환경에서, 하루당 18시간 동안 5일의 기간 동안 열 맵을 사용하여 온도를 21℃에서 27℃로 증가시켰다. 식물을 고온 스트레스 기간 동안 물을 주지않고 내버려 두어 물 부족 스트레스를 추가로 자극하였다. 식물 키(㎝)의 변화를 2주 후 5주에 측정하고, 대조군 (물) 식물의 키의 백분율로서 보고하였다. 측정치를 두 시험의 조합된 평균으로서 기록하는데, 시험당 9개의 반복 식물을 사용한다(표 25).
표 25에 나타낸 바와 같이, 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 두 자연 형태 모두(Ec.Flg22 및 Bt.4Q7Flg22)는, 비-스트레스 조건 하에서 적용되는 경우, 대조군 식물 키에 의해서 측정되는 바와 같이 식물 성장을 증가시켰다. 두 처리제는 이의 각각의 대조군의 키 103% 및 108%에 도달한 식물을 초래하였다. 그러나, 일반 환경 및 고온/물 스트레스 환경 둘 다 에서 재배되는 경우 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Ec.Flg22 및 Bt.4Q7Flg22 둘 다)로 처리된 옥수수 식물만 대조군 식물에 비해서 향상된 식물 성장을 나타내었다. Ec. Flg22 레트로 인버소로 처리된 식물은 두 조건 다에서 이의 대조군 키의 103%에 도달하였다. Bt.4Q7Flg22로 처리된 식물은 비스트레스 조건 및 스트레스 조건 각각에서 이의 상대 대조군 키의 102% 및 거의 108%에 도달하였다.
따라서, 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(RI-Ec.Flg22 및 RI-Bt.4Q7Flg22)로 처리된 옥수수 식물은 대조군 식물보다 증가된 식물 키 백분율에 의해서 나타나는 바와 같이 증가된 성장을 나타내었다. 이러한 결과는, 레트로-인버소 형태가 보다 안정적인 형태이고, 더 가혹한 환경 또는 비생물학적 스트레스에 놓이는 상황에서 단백질분해 파괴 없이 생존할 수 있음을 시사한다. 따라서, 이것은 비생물학적 스트레스 환경에 적용되는 식물에게 보호 이점을 제공할 수 있다.
Figure pct00084
실시예 9: V2-V3 옥수수에 대한 엽면 Flg22 폴리펩타이드의 적용 후 고온 및 물 부족 스트레스
별개의 실험에서, 실시예 8에 기재된 바와 같이 재배한 옥수수 식물을 계면활성제와 함께 Bt.4Q7Flg22로 처리하고, 그 후 열 및 물 부족 스트레스에 노출시켰다. 18개의 옥수수 식물의 3회 반복 시험을 V2-V3 발달기까지 환경적으로 제어된 성장 공간에서 성장시켰다. 각각의 식물을 Bt.4Q7Flg22(1μM의 최종 농도)를 함유하거나 또는 함유하지 않는 0.1% 계면활성제를 함유하는 엽면 분무제로 처리하였다. 분무 처리 적용 1주 후, 식물을 고온 스트레스 및 물 부족 스트레스를 제공하는 환경으로 옮겼다. 가열 매트를 사용하여 고온 스트레스 적용하여 환경에서의 온도를 21℃에서 27℃로 증가시켰다. 고온 스트레스 기간 동안, 식물을 물을 주지 않고 내버려 두었다. 옥수수 식물을 1주 동안 모의실험된 비생물학적 스트레스 환경에서 유지시키고, 이어서 식물 키(㎝)를 다시 측정하였다(표 26).
표 26에 나타낸 바와 같이, 3개의 시험 중 2개에서, 엽면 분무로서 적용된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 적용(시험 1 및 3)이, 계면활성제 단독으로 처리된 대조군 식물과 비교할 때 옥수수 식물에서 유의하게 증가된 성장(㎝ 단위로 측정된 키)을 초래하였다. Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로의 엽면 처리는 대조군(계면활성제 단독 처리) 식물과 비교할 때 시험 1에서 거의 13%의 식물 키 증가를 초래하였고, 시험 3에서 33% 초과의 증가를 초래하였다.
Figure pct00085
실시예 10: Flg22 폴리펩타이드를 사용한 종자 처리 - 옥수수 및 콩
2개의 개별 잡종(잡종 베크 5828 AM 및 4606 P2)으로부터의 옥수수 종자를 각각의 종자의 표면에 처리되는 0.25μM 또는 1.0μM의 최종 슬러리 농도(표 27)로 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로 처리하였다. 살진균제, 살곤충제, 유익 박테리아, 착색제 및 종자 마무리제(EverGol Energy (0.031mg ai/종자), PONCHO/VOTiVO(0.6mg ai/종자), Peridium 1006(5fl oz/cwt 또는 147.9㎖/cwt) 및 Pro-Ized Red 착색제(일반)(0.5fl oz/cwt)를 함유하는 슬러리 중에 적절한 농도로 희석된 40μM 폴리펩타이드 스톡을 사용하여 종자 적용을 제공하였다. Wintersteiger HEGE II(윈터스타이거사, 독일 오스트리아 소재)를 사용하여 종자 처리제를 적용하였다.
종자를 미국 중서부(IA, IL, IN)의 12곳의 지역에 심었다. 16개의 무작위화된 복제 블록을, 0.25μM 및 1.0μM의 슬러리 농도로 적용되는 Bt.4Q7Flg22로 이루어진 Flg22 폴리펩타이드 처리제 각각에 대해서 수확하였다.
표 27은, 옥수수 종자 단위당 0.035 또는 0.14Fl.oz(2.6 또는 10.2㎖/Ha)의 폴리펩타이드 용액의 비율의 40μM의 폴리펩타이드 용액과 동등한 비율로 적용되는 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 종자 처리를 나타내는데, 이는 미처리 대조군 종자(종자 처리하지 않음)과 비교할 때 낮은 비율의 경우 평균 +2.1Bu/Ac(131.8㎏/Ha) 증가 및 높은 비율의 적용의 경우 +5.3Bu/Ac 증가로 향상된 수확률을 초래하였다.
Figure pct00086
옥수수에서 수확률을 촉진시키는 Ec.Flg22, Ec.RI Flg22, Bt.4Q7Flg22 및 Bt.4Q7RI Flg22의 능력을 시험하기 위해서 제2 시험을 설정하였다. 12곳의 지역에서의 반복 시험을 상기와 같이 설정하였다. Bt.4Q7 Flg22는 50% 승리율로 2.8부셀 또는 71.1㎏을 제공하였고, Bt.4Q7 RI Flg22 폴리펩타이드는 0.5Bu/Ac를 제공하였다. Ec. Flg22 폴리펩타이드는 70% 승리율로 2.8Bu/Ac(175.8㎏/Ha) 이익을 제공하였고, Ec. RI Flg22는 이득을 제공하지 않았다.
대두에 대한 종자 처리제로서 Bt.4Q7 Flg22, RI Bt.4Q7Flg22, Ec.RI Flg22 및 RHPP의 대두 종자 처리 이득을 관찰하기 위해서 제3 연구를 설정하였다. 12곳의 지역 연구에 걸쳐서, RHPP 폴리펩타이드는 64% 승리율로 0.4Bu/Ac(26.9㎏/Ha)를 제공하였고, Bt.4Q7 Flg22 폴리펩타이드는 64%로 1.3Bu/Ac(87.4㎏/Ha)를 제공하였고, Bt.4Q7 RI Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는 55%로 0.3Bu/Ac(20.2㎏/Ha)를 제공하였고, Ec. RI Flg22는 73% 승리율로 1.8Bu/Ac(121.1㎏/Ha)를 제공하였다.
실시예 11: 토마토에 대한 플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 수확률 증가
Bt.4Q7 Flg22(서열번호 226) 및 Ec. Flg22(서열번호 526)의 엽면 시비 처리제를 개화기 전에 외인성 분무로서 적용하였고, 이것은 토마토에서 수확률을 증가시키는데 사용되었다.
작은 스케일의 플롯을 설계하여 토마토에 대한 상업적인 재배 조건을 모의실험하였다. 토마토의 2종의 잡종, JetSetter(시험 1) 및 Better Big Boy(시험 2)를 온실에서 이식을 시작하였고, 42 내지 56일 후에 성장 필드판(raised field bed)에 식재하였다. 토양 표면 3인치(7.6㎝) 아래의 토양 온도가 60°F(15.5℃)에 도달한 후 토마토를 이식하였다. 토마토를 검은 플라스틱 멀치(mulch)로 피복된 성장층에서 재배하였다. 점적 관주법을 사용하여 식물을 재배하였고, 성장 시기 전체에서 경작자 가이드라인에 따라서 비료를 적용하여 최적의 식물 성장 및 수확률을 보장하였다. 일반적으로 단일 이랑에 에이커당 2,600 내지 5,800개의 식물을 심는 상업적인 경작자에 의해서 사용되는 경작 밀도를 모의실험하도록 작은 성장층 플롯을 설계하였는데, 5- 내지 6.5-ft(1.5 내지 2㎝) 중심 상에서 이랑 내의 식물 사이는 18 내지 30인치(46 내지 76㎝)였다.
각각 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha) 및 20Fl.oz/Ac(1461.5㎖/Ha)의 낮은 사용률 및 높은 사용률의 Bt.4Q7 Flg22 및 Ec. Flg22의 엽면 처리제를 초기 개화기(제1 개화)에 2종의 잡종 상에 적용하였다. 7월에 미주리 대학교(미국 미주리주 컬럼비아 소재)에서 반복 시험을 수행하였다. 대조군 식물을 동일한 부피(사용률)의 물로 처리하였다. 토마토에서 수확률에 대한 엽면 처리제의 효과를 결정하고, 수 대조군 처리에 정규화된 바와 같이 보고하였다. 평균 대조군 수확률에 대한 수확률의 평균 백분율 변화를 표 28에 보고한다.
Bt.4Q7Flg22 및 Ec.Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 둘 다의 엽면 시비는 낮은 사용률 및 높은 사용률 둘 다에서 각각의 잡종에 대해서 토마토 열매 수확률을 증가시켰다. 두 잡종에 대한 결과를 평균내는 경우, Bt.4Q7 Flg22에 대한 높은 적용 사용률은 각각 대조군 식물에 비해서 토마토 수확률을 +25% 및 +17% 증가시켰다. 유사하게, Ec. Flg22 처리제에 대한 낮은 적용 사용률 및 높은 적용 사용률은 두 잡종에 대한 대조군 식물에 비해서 +43% 및 +46%의 토마토 수확률 증가를 초래하였다.
Figure pct00087
실시예 12: Bt .4Q7 Flg22의 제형을 사용한 토마토 식물의 엽면 처리
또 다른 실험에서, 이전 실시예에 기재된 바와 같이 경작된 토마토 식물(잡종: Better Boy)을 제1 개화기에 Bt.4Q7 Flg22의 제형으로 처리하였다. 사용된 제형은 0.01%(v/v) 비이온성 계면활성제가 적용된 레트로 인버소 D RI Bt.4Q7 Flg22로 이루어졌다.제형을 플로리다에서 수행된 2회 복제 겨울 토마토 시험에서 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)의 적용 사용률을 사용하여 토마토 나뭇잎에 적용하였다. 수확 시에, 식물당 열매의 수, 열매당 중량(그램) 및 총 수확률(lb/Ac)로서 수확률을 측정하였다. 표 29는 미처리 대조군(물 단독) 식물에 대한 백분율 비교 또는 변화로서의 수확률을 보고한다.
1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)로 적용된 Bt.4Q7 Flg22 제형을 사용한 엽면 처리는 미처리(물 단독) 대조군 식물에 비해서 Better Boy 토마토의 수확률을 평균 21% 증가시켰다. Better Boy 토마토에 대한 이러한 증가는 식물당 열매의 수의 증가 및 열매 중량의 증가 둘 다에 상응하였다(표 29).
Figure pct00088
실시예 13: 페퍼에 대한 플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 수확률 증가
Bt.4Q7 Flg22(서열번호 226) 및 Ec.Flg22(서열번호 526)의 엽면 처리제를 제1 개화기에 외인성 분모로서 적용하여 두 페퍼 품종에서 수확률을 증가시키는데 사용하였다.
Bt.4Q7 Flg22 및 Ec.Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 엽면 처리제를 페퍼에 대한 상업적인 재배 조건을 자극하도록 설계된 작은 스케일의 플롯을 사용하여 적용하였다(캅시컴). 2개의 품종의 페퍼: Red Knight(RK) 및 Hungarian Hot Wax(HHW)를 5.8 내지 6.6의 pH 및 양호한 수분 보유 특성을 갖는 검은 플라스틱 멀치로 덮인 성장층에서 6주령의 이식물로부터 성장시켰다. 점적 관주법을 사용하여 식물을 재배하였고, 성장 시기 전체에서 경작자 가이드라인에 따라서 비료를 적용하여 최적의 식물 성장 및 수확률을 보장하였다. 일반적으로 플라스틱 멀치층 상에 14 내지 18인치(35.6 내지 46㎝) 이격된 이중 이랑 내에 에이커당 대략 10,000 내지 14,000개의 식물을 심는 상업적인 경작자에 의해서 사용되는 경작 밀도를 모의실험하도록 작은 성장층 플롯을 설계하였는데, 이랑 내의 식물 사이는 16 내지 24인치(40.6 내지 61㎝)이고, 층은 이의 중심으로부터 5.0 내지 6.5피트(40.6 내지 70㎝) 이격되어 있다. 단일 줄의 페퍼를 각각의 층 상에 심을 수 있다(에이커당 5,000 내지 6,500개의 식물 또는 헥타르당 12,355 내지 16,062개의 식물).
Bt.4Q7 Flg22 및 Ec.Flg22를 함유하는 조성물을 사용한 엽면 시비를 제1 개화기에 1Fl.oz/Ac(낮은 비율) 또는 73.1㎖/Ha 및 20Fl.oz/Ac(높은 비율) 또는 1461.5㎖/Ha의 적용 사용률로 두 페퍼 식물 상에 적용하였고, 대조군(물이 동일한 사용률로 적용됨)과 비교하였다. 페퍼 수확률에 대한 엽면 시비의 효과를 수확 접근법당 1회를 사용한 2개의 별개의 수확에 대해서 결정하고, 대조군 식물의 수확률에 정규화하였다. 대조군 식물에 대한 수확률에 대한, 각각의 처리에 대한 수확률의 평균 백분율 변화를 파운드/에이커 (lb/Ac)로서 표 29에 보고한다.
Bt.4Q7 Flg22 or Ec.Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 사용한 페퍼의 엽면 처리는 RK 및 HHW 페퍼 품종 둘 다에 대해서 낮은 적용 사용률 및 높은 적용 사용률 둘 모두에서 페퍼 수확률(lb/Ac)의 전체 평균 증가를 초래하였다. RK 품종 및 HHW 품종에 대한 수확률 조합된 평균은 대조군 페퍼 식물과 비교하여 Bt.4Q7 Flg22 엽면 처리된 페퍼에 경우 +53% 더 높았고(낮은 비율: 1Fl.oz/Ac 또는 73.1㎖/Ha), Bt.4Q7 Flg22 엽면 처리된 페퍼의 경우 +25% 더 높았다(높은 비율: 20Fl.oz/Ac). 대안적으로, RK 품종 및 HHW 품종에 대한 수확률 조합된 평균 증가는 대조군 페퍼 식물과 비교하여 Bt.4Q7 Flg22 엽면 처리된 페퍼에 경우 +30% 더 높았고(낮은 비율: 1Fl.oz/Ac), Ec. Flg22 엽면 처리된 페퍼의 경우 +47% 더 높았다(높은 비율: 20Fl.oz/Ac 또는 1461.5 ㎖/Ha).
두 페퍼 품종이 엽면 처리에 반응하는 방법 및 두 페퍼 품종 모두에 제공된 생성된 수확률 이익에서 차이가 있었다(표 30). 실질적인 수확률 증가는 RK 품종의 페퍼 및 대조군 또는 미처리 식물에 비해서 HHW 품종에서 인지되었고, 수확률 증가는 Bt.4Q7Flg22의 경우 대조군 또는 미처리 페퍼 식물보다 +77%(저: 1Fl.oz/Ac 또는 73.1㎖/Ha) 및 +42%(고: 20Fl.oz/Ac 또는 1461.5㎖/Ha) 증가되었다. 추가로, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 낮은 사용률(1Fl.oz/Ac) 및 Ec. Flg22 폴리펩타이드의 높은 사용률(20 Fl oz/Ac)이 HHW 품종의 수확률 증가에 가장 효과적이었다(둘 모두는 대조군 식물에 비해서 +72% 증가를 산출하였음).
Figure pct00089
실시예 14: 스쿼시에 대한 플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 수확률 증가
Bt.4Q7Flg22의 엽면 처리를 앰버서더 스쿼시(Ambassador squash) 상에 제1 개화기에 2개의 별개의 제형(제형 1 = F1 및 제형 2 = F2)을 사용하여 외인적으로 적용하였다. 제형 1(F1)은 0.01%(v/v) 비이온성 계면활성제가 적용된 네이티브 L Bt.4Q7 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로 이루어진다. 제형 2(F2)는 0.01%(wv) 비이온성 계면활성제가 적용된 D RI Bt.4Q7 Flg22로 이루어진다.두 형 F1 및 F2 모두를 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)의 적용 사용률을 사용하여 스쿼시 나뭇잎에 적용하였다. 엽면 Bt.4Q7Flg22 F1로 처리된 식물과 F2 분무 적용으로 처리된 식물에서 수확률 비교를 수행하여 대조군(물) 또는 미처리 스쿼시 식물과 비교하였다. 스쿼시 식물을 하기와 같이 사양토에서 경작하였다. 2.5㎝ 구멍을 2.5ft로 절단하였다. (0.76m) 폭의 플라스틱 피복된 마운드, 마운드당 2개의 이랑, 각각의 이랑 내에서 1.5ft(0.46m) 이격된 구멍. 이랑은 마운드 내에서 엇갈려 있었다. 마운드는 4ft(1.2m) 이격되어 있었다. 3개의 스쿼시 종자를 각각의 구멍에 심고, 식재 14일 이후에 구멍당 단일 식물로 솎았다. 점적 관주법 튜빙을 각각의 마운드 중심에 놓고, 필요한 경우 식물에 물을 주었다.
스쿼시 식물을 개화시까지 성장층에서 종자로부터 재배하고, 2개의 반복 시험 또는 2개의 별개의 수확을 사용하여 동일한 플로리다(FL) 지역에서 입면 처리하였다. 엽면 Bt.4Q7Flg22 적용된 F1 및 F2 처리된 식물에 대한 수확률을 식물당 스쿼시의 수, 스쿼시당 중량(그램) 및 총 스쿼시 수확률(lb/Ac)로서 보고하고, 미처리 대조군 식물과 비교하여 백분율 변화로서 나타내었다(표 31).
두 제형 F1 및 F2를 사용한 Bt.4Q7Flg22의 엽면 처리는, 미처리 대조군 식물과 비교할 때 개화기전에 스쿼시(앰버서더) 상에 적용되는 경우 수확률 증가 이익을 초래하였다. 식물당 스쿼시의 수, 스쿼시당 중량 및 수확률(lb/Ac)의 전체 평균 백분율 변화 모두는 대조군 또는 미처리 식물과 비교할 때 Bt.4Q7Flg22 F1 및 F2 처리된 식물에서 증가되었다. Bt.4Q7Flg22 F1 제형 및 F2 제형 둘 다로 처리된 스쿼시 식물은 식물당 스쿼시의 수, 스쿼시당 중량 및 수확률(lb/Ac)의 전체 평균 백분율 변화에서 유사한 증가 경향을 지녔지만, F1 엽면 시비가 제공된 스쿼시 식물은 F2 제형이 제공된 식물에 비해서 식물당 스쿼시의 수 및 총 수확률에서 증가를 나타내었다.
Figure pct00090
실시예 15. 옥수수 및 대두에서 반응성 산소 종(ROS) 생산에 대한 Flg 폴리펩타이드의 스크리닝
식물 세포 표면에서 FLS 수용체에 대한 Flg22 폴리펩타이드의 결합 및 숙주 유기체를 보다 양호하게 매칭하기 위해서 코돈 사용을 수행하여 Bt.4Q7Flg22에서 돌연변이를 생성시켰다. 옥수수 및 대두에 대한 바람직한 아미노산 시그니처를 갖도록 설계되고, ROS 활성도 검정에서 네이티브 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)와 동일하거나 더 양호한 성능을 수행하도록 설계된 네이키브 Bt.4Q7Flg22의 3종의 변이체를 생성하기 위해 확률론적 접근법을 사용하였다. 이들 변이체는 내부 분절(서열번호 571), 또는 C-말단(서열번호 572) 또는 N 말단(서열번호 573)에 대한 돌연변이를 보유하였고, 각각 Bt.4Q7Flg22-Syn01, Bt.4Q7Flg22-Syn02 및 Bt.4Q7Flg22-Syn03으로 지정하였다. 이어서, Bt.4Q7Flg22-Syn01 및 Bt.4Q7Flg22-Syn03을 다양한 농도에서 이의 네이티브 형태와 관련하여 측정하였다.
옥수수(잡종 5828 YX) 및 대두(잡종 297 R4) 잎으로부터의 새로운 식물 조직을 균일한 샘플로 절단하고, 96웰의 백색의 저 발광 플레이트 내에서 멸균수 150㎕ 상에 부유시켰다. 플레이트를 16-시간 낮/8-시간 밤 사이클을 갖는 성장 광 하에서 22℃의 일관된 온도에 두었다.
옥수수 샘플의 경우, 깨끗한 면도날을 사용하여 V1 내지 V4기의 옥수수 식물을 토양 라인 위의 식물로부터 잘라내었다. 자엽 및 엽초를 제거하였다. 1-mm 슬라이스를 식물의 기저부에서 줄기를 통해 잘라내어 첫 번째 잎 마디 아래 약 1.3㎝까지 절단하였다. 각 옥수수 섹션을 96-웰 플레이트의 개별 웰에 두었다.
대두 샘플의 경우, 완전히 팽창된 삼출엽 잎을 V1-V3기의 식물로부터 제거하였다. 잎 디스크(12.6mm2)을 4mm 직경의 깨끗하고 날카롭게 깎은 코르크 구멍 뚫기를 사용하여 잎 날개로부터 절단 하였다. 깨끗한 면도날을 사용하여 디스크를 절반으로 절단하고, 각 디스크 절반을 96-웰 플레이트의 개별 웰에 넣었다.
네이티브 Flg22 폴리펩타이드(서열번호 226) 또는 기재된 돌연변이(서열번호 571 또는 573) 스톡을 함유하는 Flg22 폴리펩타이드를 멸균 탈이온수 또는 0.1% Tween-20을 함유하는 100mM 인산나트륨(pH 7.8 내지 8.0) 완충제 중에서 제조하였다. 18 내지 24시간 이후에, 물을 96-웰 플레이트의 각 웰에서 제거하였다. 식물 조직 샘플을 Flg22 폴리펩타이드 스톡(250피코몰(pM) 내지 10마이크로몰(μM)의 농도 범위), 34㎍/㎖ 루미놀, 및 20㎍/㎖의 호스래디쉬 퍼옥시다제의 1:100 희석물을 함유하는 100㎕의 분출 용액으로 처리하였다. 식물 조직에 의한 Flg22 폴리펩타이드의 인식은 면역 신호전달의 활성화 및 아포플라스트 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 초래하였다. ROS(H2O2)의 존재 하에서, 호스래디쉬 퍼옥시다제는 루미놀의 산화 및 가시광의 생성을 촉진시켰다. 40분의 시간 기간에 걸쳐서 0.5초 적분; 2.6분 간격을 사용하여 GLOMAX 96 마이크로플레이트 광도계(프로메가사(Promega Corporation))로 상대 광 단위(RLU)를 보고하였다.
데이터 분석을 위해서, 생성된 총 RLU를 전체 40분 시간 경과에 걸쳐서 각각의 샘플에 대해 계산하였다. 사 분위수 범위를 초과하는 중요한 이상점(outlier)을 분석에서 제외시켰다. 각각의 조건(n=6 내지 16)에서의 총 RLU를 25nM에서 Bt.4Q7Flg22에 대한 평균 RLU로 정규하고, Bt.4Q7Flg22 대조군의 백분율(%)로서 보고하였다(표 32).
합성 돌연변이생성된 Bt.4Q7Flg22-Syn01 버전은 다양한 농도(0.25 내지 100nM)에서 ROS 활성이 증가한 반면, Bt.4Q7Flg22-Syn03은 보다 다양하였고, Flg22 또는 Bt.4Q7Flg22의 네이티브 버전과 비교할 때 0.25nM, 1nM, 10nM, 25nM 및 100nM 농도에서 ROS 활성이 증가된 것으로 나타났다. 5nM을 사용한 합성 버전의 Bt.4Q7Flg22-Syn01 처리는 네이티브 버전 또는 Bt.4Q7Flg22에 비해 ROS 활성이 가장 크게 변화하였다. Bt.4Q7Flg22-Syn03에 대한 ROS 활성은 첨가된 농도 범위에 걸쳐 보다 다양한 반응을 나타냈다.
Figure pct00091
실시예 16: 옥수수 및 대두에 대해서 기능적으로 활성인 Flg 폴리펩타이드를 식별하기 위한 ROS 스크리닝 분석
실시예 15의 예비 연구의 결과에 기초하여, 옥수수 및 대두에서 광범위한 Flg22 폴리펩타이드의 ROS 활성도을 스크리닝하기 위해서 하기 농도를 선택하였다: 옥수수에서 5nM(잡종 5828 YX) 및 대두에서 100nM(잡종 297 R4). 이어서, ROS 활성 검정을 사용하여 옥수수 및 대두의 개별 처리 용도를 위한 최고의 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 후보를 식별하고, 옥수수 및 대두 모두에 대해 활성인 후보를 식별하였다.
옥수수 및 대두 잎 조직을 식물로부터 수확하고, 표 33에 열거된 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 실시예 15에 이미 기재된 바와 같이 ROS 검정을 수행하였다. 생성된 총 RLU를 전체 40분 시간 경과에 걸쳐서 각각의 샘플에 대해 계산하였다. 사 분위수 범위를 초과하는 중요한 이상점(outlier)을 분석에서 제외시켰다. 옥수수(잡종 5828 YX) 및 대두(잡종 297 R4)에서의 ROS 활성도의 비교는 25nM Bt.4Q7Flg22 처리 농도에서의 평균 RLU 값과 비교할 때 상대 광 단위(RLU)의 백분율(%)로 보고하였다(표 33).
표 33은 각각의 조건(STDEV)에 대한 표준 편차와 함께 네이티브 Bt.4Q7Flg22와 비교하여 다양한 돌연변이체 Flg22 폴리펩타이드에 대한 상대 활성을 요약한다.
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
표 33의 결과에 기초하여, 옥수수 및 대두에서의 ROS 활성도에 대한 Flg22 폴리펩타이드에 대한 상이한 돌연변이의 효과에 기초하여 다수의 예측을 수행할 수 있다. 표 34는 다양한 표적화된 돌연변이에 대해 관찰되거나 예측된 ROS 활성도를 설명한다. 간단히 말하면, 제1 아미노산(D1N, D1Q 또는 D1T)에서의 대체는 옥수수에서 Flg22 수용체의 강한 인식 및/또는 활성화를 초래할 것이다. 내부 분절 K7Y, K7F 및 A16P에서의 돌연변이는 대두에서도 비슷한 긍정적인 결과를 가질 것이다. 시험된 폴리펩타이드 중에서, Bt.4Q7Flg22-Syn01(S13K) 및 Bt.4Q7Flg22-Syn03(D1Q)은 옥수수 및 대두에서 가장 강력한 ROS-유도 활성을 가졌다.
Figure pct00095
실시예 17: 옥수수 및 대두에 대한 Flg 폴리펩타이드의 조합을 식별하기위한 ROS 활성도 검정
옥수수 및 대두 잎 조직을 식물로부터 수확하고, 실시예 15에 이미 기재된 바와 같이 ROS 검정을 수행하였다. 단독 또는 조합된 상이한 Flg22 변이체의 상대적인 ROS 활성도를 평가하여, 함께 적용되는 경우 옥수수와 콩 모두에 가장 높은 ROS 활성도 반응을 제공한 Flg22 폴리펩타이드의 바람직한 조합물을 식별하였다. 결과를 표 35에 요약한다.
Figure pct00096
Figure pct00097
실시예 18: 셀로비오스 첨가제를 사용한 ROS 활성도 검정 - 옥수수 및 대두
셀로비오스는 이당류 글루코스이고, 셀룰로스 중합체에 대한 빌딩 블록이다. 화학적으로, 그것은 β(1-4) 결합으로 연결된 2개의 β-글루코스 분자로 이루어진 환원당인 글루코스-베타-1-4-글루코스이다. 셀로비오스는 셀룰로스 또는 리케닌의 분해에 의해 얻어지며, 가수분해시 글루코스를 생성한다. Bt.4Q7Flg22를 사용한 처리를 셀로비오스의 존재 또는 부재 하에서 ROS 활성도 검정으로 비교하여 셀로비오스가 Flg22 폴리펩타이드를 함유하는 반응에서 ROS 생산성을 증가시키기 위한 도출인자로 작용할 수 있는지를 결정하였다. 옥수수(도 6, 패널 A) 및 대두(도 6, 패널 B) 잎 검정과 함께 ROS 검정을 사용하여 수행된 특정 처리는 하기와 같았다: 25nM의 Bt.4Q7Flg22; 25nM의 Bt.4Q7Flg22+ 100μM의 셀로비오스; 25nM의 Bt.4Q7Flg22 + 1mM의 셀로비오스; 100mM 인산나트륨 완충제 대조군; 및 셀로비오스 단독(100μM).
실시예 15에 이미 기재된 바와 같이 옥수수 및 대두 잎 조직을 식물로부터 수확하였다. 멸균 탈이온수 또는 0.1% Tween-20을 함유하는 100mM 인산나트륨(pH 7.8-8.0) 완충제 중에서 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 스톡을 제조하였다. 18 내지 24시간 이후에, 물을 96-웰 플레이트의 각 웰에서 제거하였다. 샘플을 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226, 25nM), 셀로비오스(100μM 또는 1mM), 34㎍/㎖ 루미놀 및 20㎍/㎖ 호스래디쉬 퍼옥시다제를 함유하는 100㎕ 용액으로 처리하였다. 식물 조직에 의한 Flg22 폴리펩타이드의 인식은 면역 신호전달의 활성화 및 아포플라스트 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 초래하였다. ROS (H2O2)의 존재 하에서, 호스래디쉬 퍼옥시다제는 루미놀의 산화 및 가시광의 생성을 촉진시켰다. 40분의 시간 기간에 걸쳐서 0.5초 적분; 2.6분 간격을 사용하여 GLOMAX 96 마이크로플레이트 광도계(프로메가사)로 상대 광 단위(RLU)를 보고하였다.
데이터 분석을 위해, 처리당 평균 RLU(n=6 내지 16개 샘플, 평균의 +/- 표준 오차)를 시간 경과에 따라 그래프로 나타내었다(도 6). 사 분위수 범위를 초과하는 중요한 이상점(outlier)을 분석에서 제외시켰다.
각각의 처리를 위한 실험에 걸친 평균 RLU를 도 6, 패널 A(옥수수) 및 패널 B(대두)에 그래프로 나타낸다. Flg22 폴리펩타이드(백색 원)만을 함유하는 처리에서 두 식물 조직에서 ROS 생성이 관찰되었지만, 1mM의 셀로비오스의 첨가는 두 식물 조직(검은색 원)에서 현저한 ROS 활성을 초래하였다. 더 낮은 농도(100uM)의 셀로비오스의 첨가는 Bt.4Q7Flg22 단독과 비교할 때 ROS 활성도를 변경시키지 않았고(도 6, 패널 A의 흰색 원과 회색 원의 비교), 대두에서 임의의 ROS 생성을 초래하지 않았다(도 6의 회색 원, 패널 B). 특히, 25nM의 Bt.4Q7Flg22와 1mM의 셀로비오스의 조합물은 옥수수 잎(대략 75,000 RLU에서 ROS 피크)과 비교할 때 대두에서 더 많은 ROS 생산(약 25,000 RLU에서 ROS 피크)을 초래 하였다.
실시예 20: 수확률을 증가시키기 위한 파이토설포카인(PSKα)의 적용 - 옥수수 및 대두
옥수수 및 대두 수확률에 대한, 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 설폰화된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드인 파이토설포카인 알파(PSKα)의 효과를 시험하였다. 옥수수 및 대두를 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이 경작지에서 배양하였다. 아라비돕시스 탈리아나 PSKα(서열번호 598)를 계면활성제를 사용하여 엽면 분무로 1μM의 최종 농도로 적용하고, 옥수수(잡종 5140RR) 및 대두(잡종 375 NR)의 지상부 식물 부분에 균일한 적용을 사용하여 제공하였다. At.PSKα 제형은 옥수수에서 V5-V8 발달기에 그리고 대두에서 V1-V4 발달기에 적용되었다. At.PSKα로 처리된 옥수수 및 대두 식물을 미처리 대조군 식물(물)과 비교 하였다. 처리된 식물을 대조군과 비교하기 위해서 4개의 복제 블록에서 하나의 지역에서 무작위화하였다. 수확률을 에이커당 부셀(Bu/Ac)로 보고하였다.
표 36은 At.PSKα의 엽면 적용이 옥수수 및 대두 수확률 시험 둘 다에서 수확률 증가를 초래한 방법을 도시한다. 옥수수 및 대두는 옥수수에서 V5-V8 발달기에 그리고 대두에서 V1-V4 발달기에 적용되는 At.PSKα를 함유하는 입면 제형으로 경작지에서 긍정적인 수확률 증가를 가졌다. 평균적으로 옥수수는 경작지에서 전체 수확률이 +3Bu/Ac(188.3㎏/Ha) 증가하였고, 대두는 수확률이 +0.8Bu/Ac(53.8㎏/Ha) 증가하였다.
Figure pct00098
실시예 21: 수확량을 증가시키기 위한 파이토설포카인 알파(PSKα)의 엽면 시비 - 대두
At.PSKα를 활발하게 성장하는 대두 식물에 엽면 시비로서 적용하여 고온 및 가뭄 스트레스가 있는 환경에서 수확량 이익을 제공하는 방법이 제공된다.
대두 식물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 성장시켰다. At.PSKα 폴리펩타이드(서열번호 598)를 V1-V4기의 식물에 엽면 분무로서 적용하였다. 이어서, At.PSKα의 엽면 시비로 처리된 대두 식물 및 물 및 계면활성제 단독으로 처리된 대조군 식물을 비-스트레스 환경 및 스트레스 환경(고온 및 물 부족)을 생성시키는 실시예 7 내지 실시예 9에 기재된 조건에서 재배하였다. 표 37은 V1-V4 성장기에 엽면 분무로서 At.PSKα로 처리된 대두 식물에 대해서 보고된 키 증가 또는 백분율 변화를 기재한다. At.PSKα 적용은 미처리 대조군 대두 식물과 비교할 때 에이커당 부셀(Bu/Ac)로 보고하는 경우 비-스트레스 환경에서 +3.5%의 키 증가를 초래하였고, 스트레스 환경에서 +4.3%의 키 증가를 초래하였다.
Figure pct00099
실시예 22: 식물 구조를 변경시키기 위한 RHPP의 적용 - 옥수수
대두(글리신 맥스)로부터 본래 유래된 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP, 서열번호 600)를 옥수수에서 이로운 표현형을 제공하기 위해서 엽면 시비로서 제공한다.
네이티브 및 레트로 인버소 RHPP(서열번호 600 내지 601)를 V5-V8기에 옥수수 식물에 적용할 것이다. 레트로 인버소 RHPP는 적용 이전에 C-말단 아마이드화로 변형될 수 있다. 이러한 방식의 RHPP를 사용한 처리는 곧은 잎 배향 및 보다 똑바로 선 잎을 갖는 구별되는 잎 구조 표현형을 초래한다고 예상된다. 잎 각도의 증가는 이러한 면적에서 농업에서 사용하기에 효과적인 이익을 갖는다. 이는 특히 경작지 환경에서 수확률을 극대화하는데 사용되는 더 높은 경작 밀도와 관련이 있다. 메이즈(옥수수)에서 RHPP 폴리펩타이드의 엽면 비시는 잎 각도를 변화 시키는데 유용하여 더 작은 잎 각도에 기여하는데, 이는 곧은 잎 배향을 초래한다. 이러한 표현형은 잎 면적 지수를 증가시키고, 옥수수 그늘 증후군을 감소시키고, 광합성 효율을 개선시키는 데 유리할 수 있다. 또한, 캐노피 발달 및 총 광 투과율을 최대화시키기 위해서 엽면 제형으로 RHPP를 제공하는 것이 등숙기(grain filling stage)의 시작 이전에 식물의 영양 성장을 증가시키는 열쇠이다.
실시예 23: 뿌리 바이오매스 및 수확량 파라미터를 증가시키기 위한 RHPP의 적용 - 대두
대두 뿌리의 효과적인 근류형성은 종자 또는 에이커 단위당 더 높은 수확량 및 더 높은 품질의 종자 생산, 단백질 및 오일을 초래한다. 이는 질소 고정 증가로 인한 것일 수 있는데, 그 이유는 뿌리혹 형성이 질소 고정을 증가시키기 때문이다. 근모 촉진 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, RHPP(서열번호 600)가 뿌리 바이오매스 및 근류형성을 조절함으로써, 질소 고정을 개선시키는지를 결정하기 위해서, 대두 식물(잡종 Morsoy 38X52 및 베크 잡종 297R4)을 R1-R2 발달기에 RHPP(300nM)의 엽면 시비로 처리하였다.
증가된 식물 바이오매스 및 근류형성
RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 600, 본래 글리신 맥스로부터 유래됨)를 4주령 잡종 대두(Morsoy 품종)에 0.1%(v/v) 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACETM)와 함께 분무병을 사용하여 엽면 시비로 적용하고, 대략 1.25㎖/식물로 전달하였다. 처리군당 시험당 총 8개의 식물을 사용하여 실험을 수행하였다. 포트를 대략 300μ㏖ m-2s-1의 광수준을 제공하는 인공 조명 성장 공간에서 16/8 광/일 주기 동안 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위에서 유지시켰다. 뿌리혹 계수치의 성장 파라미터, 뿌리 바이오매스 및 식물당 총 바이오매스를 엽면 시비 15일 후에 측정하였고, 대조군으로서 ALLIGARE SURFACE 계면활성제(0.1% v/v)로 이루어진 엽면 처리와 ALLIGARE SURFACE 계면활성제(0.1% v/v)를 함유하는 RHPP 폴리펩타이드(300nM)를 비교하였다. 기재된 바와 같은 평균 성장 파라미터를 계면활성제 단독 처리가 제공된 대조군 식물에 정규화하였다(표 38).
RHPP의 엽면 시비로 처리된 각각의 식물의 뿌리에 대한 근류형성 계수치를 0.1%(v/v) 계면활성제 단독으로 처리된 대조군 식물에 대한 뿌리혹의 수와 비교하였다. RHPP 처리는 대조군(계면활성제) 처리에 비해서 각각의 대두 식물의 뿌리에 대해서 대략 2배의 뿌리혹의 수를 초래하였다. RHPP 폴리펩타이드의 엽면 시비가 제공된 대두 식물은 또한 뿌리 바이오매스 및 총 전체 식물 바이오매스의 증가를 나타내었는데, 이는 대조군에 정규화되는 경우 뿌리 바이오매스에서 20% 초과의 증가 및 총 바이오매스에서 8%의 증가를 초래하였다.
Figure pct00100
식물 성장 증가
RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 600)를 또한 R1기의 잡종 대두(베크 297R4)에 0.1%(v/v) 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACE)와 함께, 대략 1.2㎖/식물을 전달하는 분무병을 사용하여 엽면 처리로서 적용하였다. 이 실험을 사용하여 식물 성장에 대한 RHPP의 효과를 조사하였고, 처리군당 총 18개의 식물을 사용하여 수행하였다. 포트를 대략 300μ㏖ m-2s-1의 광수준을 제공하는 인공 조명 성장 공간에서 18/6 광/일 주기 동안 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위에서 유지시켰다. R1기의 대두 식물을 어느 것으로도 처리하지 않거나(미처리 대조군), 0.1%(v/v)의 농도로 적용되는 ALLIGARE SURFACE 계면활성제 또는 ALLIGARE SURFACE 계면활성제(0.1%v/v)와 조합하여 적용되는 RHPP 폴리펩타이드(300nM)로 처리하였다. 각각의 식물에 대한 키를 분무 시기에 보고하고, 엽면 시비 16일 후에 다시 보고하고, 엽면 처리 사이에 평균 성장 파라미터를 비교하였다(표 39).
RHPP 폴리펩타이 (300nM + 0.1% ALLIGARE SURFACE)의 엽면 시비가 제공된 대두 식물은 계면활성제 단독 및 미처리 대조군이 제공된 식물과 비교할 때 증가된 식물 성장(키) 및 식물 키의 증가된 변화를 가졌다(표 39).
Figure pct00101
실시예 24: 비료와 조합된 RHPP의 적용 - 대두
Gm.RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 600)를 액체 엽면 비료인 N-RAGE MAX (21-1-3 N-P-K)와 함께 엽면 시비로서, 2개의 대두 품종(AG3536 및 AG3832)에 적용하였다. RHPP의 엽면 시비를 1Fl.oz/Ac 또는 73.1㎖/Ha(300nM 농도)로 대두에 대한 권고된 사용률의 비료(1 내지 2gal/Ac(9.4 내지 18.8L/Ha), 또는 질소 2.16lbs/gal(0.29㎏/L)에 등등하게; 포스페이트 P2O5 0.10lbs/gal 및 가용성 포타쉬(K2O 0.31lbs/gal 또는 0.4㎏/L)와 함께 적용하였다. 조합물 RHPP의 엽면 시비, 비료 처리를 미국 중서부(IA, IL, IN)에 걸쳐서 5곳의 지역에서 두 대두 품종(AG3536 및 AG3832)에 R2 발달기(권고된 기 R1 내지 R6)에 제공하였다. Gm.RHPP와 N-RAGE MAX의 엽면 시비는, 품종 1(AG3536)의 경우, 대조군 처리에 비해서 1.9Bu/Ac(127.8㎏/Ha)의 수확률 이익을 제공하였고, 평균적으로 비료 단독 처리가 제공된 식물과 비교할 때 1.4Bu/Ac(94.2㎏/Ha)의 수확률 이익을 제공하였다(표 40).
Figure pct00102
실시예 25: 토마토에 대한 RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 수확률 증가
Gm.RHPP(서열번호 600)의 엽면 시비 처리를 개화기 전에 외인성 분무로서 적용하였고, 이것은 토마토에서 수확률을 증가시키는 데 사용되었다. 2개의 토마토 잡종(JetSetter 및 Better Big Boy)을 실시예 12에 기재된 바와 같이 작은 스케일의 플롯으로 심었다. Gm.RHPP의 엽면 처리를 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha) 및 20Fl.oz/Ac(1461.5㎖/Ha)의 적용 사용률로 2개의 잡종, JetSetter(시험 1) 및 Better Big Boy(시험 2)에 초기 개화(제1 개화)기에 적용하였다. 미국 중서부(미주리주)에서 7월에 반복 시험을 수행하였다. 토마토 식물에 대한 Gm.RHPP의 엽면 처리를 대조군(물이 동일한 사용률로 적용됨)과 비교하였다. 토마토에서 수확률에 대한 엽면 처리제의 효과를 결정하고, 수 대조군 처리에 정규화된 바와 같이 보고하였고, 표 41에 평균 대조군 수확률에 대해서 수확률의 평균 백분율 변화로서 보고하였다.
대조군 식물에 대한 백분율 변화로서 표현된 평균 수확률을 두 시험에 대해서 별도로 그리고 두 토마토 잡종에 대한 평균으로서 보고하였다. Gm.RHPP를 사용한 엽면 시비는, 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)의 시용률로 적용되는 경우 두 시험 각각에 대해서 토마토 열매의 증가를 초래하였다. Gm.RHPP의 적용은 두 잡종에 대해서 토마토 수확률에서 대조군 식물에 비해서 +52%의 평균 증가를 초래하였고, 개별 평균 증가는 대조군 식물과 비교할 때 Jetsetter 잡종의 경우는 +93%였고, Better Big Boy의 경우는 +10%였다.
Figure pct00103
실시예 26: 페퍼에 대한 RHPP의 적용 - 수확률 증가
Gm.RHPP(서열번호 600)의 엽면 처리를 외인성 분무로서 제1 개화기에서 적용하였고 두 페퍼 잡종에서 수확률을 증가시켰다. Gm.RHPP의 엽면 처리를 실시예 13에 기재된 바와 같이 페퍼(캅시컴)에 대한 상업적인 재배 조건을 자극하도록 설계된 작은 스케일의 플롯을 사용하여 적용하였다. Gm.RHPP 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드로의 엽면 시비를 제1 개화기에, 두 페퍼 품종, Red Knight(RK) 및 Hungarian Hot Wax(HHW)에 적용하였다. 엽면 Gm.RHPP 처리제를 1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)의 적용 사용률을 사용하여 RK 및 HHW 페퍼 식물 상에 적용하였고, 대조군(물이 동일한 사용률로 적용됨)과 비교하였다. 페퍼 수확률에 대한 엽면 시비의 효과를 수확 접근법당 1회를 사용한 2개의 별개의 수확에 대해서 결정하고, 대조군 식물의 수확률에 정규화하였다. 대조군 식물에 대한 수확률에 대한, 수확률의 평균 백분율 변화를 수확된 페퍼 총 중량당 백분율 변화(lb/Ac)로서 표 42에 보고한다. RK 및 HHW 페퍼 잡종에 대한 2회 반복 수확(시험)에 대해서 그리고 두 품종 모두에 대해서 조합된 평균으로서 수확률의 평균 백분율 변화를 보고한다.
Figure pct00104
1Fl.oz/Ac(73.1㎖/Ha)의 사용률로 적용되는 Gm.RHPP가 제공된 RK 및 HHW 페퍼에 대한 백분율 평균 수확률은 대조군 식물과 비교할 때 RK 페퍼에 대해서 87% 그리고 HHW 페퍼에 대해서 46%가 증가되었다. 두 페퍼 잡종에 대한 조합된 평균은 미처리(물) 대조군 페퍼 식물에 비해서 엽면 Gm.RHPP 처리된 페퍼에서 수확률의 백분율 변화에 대해서 평균 67% 증가로서 보고되었다(표 42).
실시예 27: 옥수수에 대한 하핀-유사 및 At.PSKα 폴리펩타이드의 적용
하핀은, 모두 외인적으로, 예를 들어, 엽면 분무로서 식물 표면에 적용되거나, 또는 아포플라스트에 의해서(식물 세포막의 외부 공간) 또는 내인적(식물 세포/식물 세포막 내부)으로 제공되는 경우 기능성 이득을 제공할 수 있다. 합성 하핀 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드인 HpaG-유사(산토모나스 종, 서열번호 587)를 V2 -V3 발달기에 외인적으로 옥수수 식물의 표면에 적용하였다. 추가로, 옥수수 성장에 대한, 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 설폰화된 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드인 파이토설포카인 알파(PSKα)의 외인성 적용의 효과를 시험하였다.
옥수수(베크 잡종 5828 YH) 식물을 환경 제어된 성장 공간에서 재배하였다. 팀버라인(Timberline) 상부 토양을 함유하는 39.7cm3 포트에 2.54㎝의 깊이로 포트당 2개의 종자로 옥수수 종자를 직접 심었다. 식재 후, 50㎖의 실온수를 각각의 포트에 첨가하여 발아를 가능하게 하였다. 포트를 대략 300μ㏖ m-2s-1(광자(light photon))를 제공하는 인공 조명 성장 공간에서 16/8 광/일 주기 동안 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위에서 유지시켰다. 식물에게 동일한 살수 및 비료 요법을 제공하였다.
출현 3주 후에 식물 키(㎝)를 측정하였다. 이어서, 합성 23 아미노산 폴리펩타이드로서 제공된, HpaG-유사(서열번호 587)에 대한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 및 At.PSKα(서열번호 598)를, HpaG-유사의 경우 1μM의 최종 농도로 PSKα 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 경우 100mM의 최종 농도로 엽면 분무로서 옥수수 식물에 적용하였다. 대조군 식물을 계면활성제(0.01% v/v) 단독으로 처리하였다. 분무 처리 적용 1주일 후, 식물을 2개의 군으로 나누었는데, 하나의 군은 상기에 기재된 바와 같은 동일한 표준 성장 환경에 유지시켰고, 나머지 군은 고온 및 물 부족 스트레스를 제공하는 환경으로 옮겼다. 고온 및 물 부족 처리의 경우, 성장 공간 환경(온도 및 살수/비료 사이클 제외)을 표준 성장 환경과 유사하게 유지시켰다. 가열 매트를 사용하여 고온 스트레스 적용하여 환경에서의 온도를 21℃에서 27℃로 증가시켰다. 고온 스트레스 기간 동안, 식물을 물을 주지 않고 내버려 두어 물 부족 스트레스를 모의실험하였다. 식물 키(㎝)의 변화를 5주에 측정하고, 대조군 (물) 식물의 키의 백분율에 정규화하거나, 백분율로서 보고하였다. 측정치를 시험당 9개의 반복 식물을 사용하여 두 시험의 조합된 평균으로서 기록하고(표 43), 측정치 100%에 표준화된, 물과 계면활성제(0.01% v/v)가 제공된 대조군 옥수수 식물에 대한 성장 백분율로서 나타낸다(표 43).
Figure pct00105
HpaG-유사 폴리펩타이드를 사용한 엽면 시비는, 대조군 식물과 비교할 때 정상 환경에서 개선된 성장 표현형을 나타내었지만, 스트레스 환경에서는 그렇지 않았지만, PSKα의 엽면 시비는 고온 및 물 부족 스트레스의 조건 하에서 재배되는 경우 개선된 성장 표현형을 나타내었지만, 비-스트레스 환경에서는 그렇지 않았다.
개별세트의 반복 시험에서, 성장율의 유사한 변화가 HpaG-유사(서열번호 587) 및 PSKα(서열번호 598)의 엽면 시비로부터 초래되었다. 표 44는, 엽면 처리로서 적용되고, 최적 환경(비-스트레스) 및 스트레스 환경에서 재배된 대조군(물과 0.01% v/v 계면활성제) 식물과 비교된 식물 키의 변화에 의해서 측정된, X. 종 HpaG-유사 폴리펩타이드(1μM 최종 농도) 및 At.PSKα(100nM 최종 농도)가 제공된 옥수수에 대한 식물 성장의 백분율 변화를 나타낸다. 이는, PSKα와 HpaG-유사 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 조합된 엽면 시비 또는 순차적인 적용은 표준(비-스트레스 또는 최적 성장) 환경 하에서 식물 성장의 성장 또는 비생물학적 스트레스(예를 들어, 열 및 물 결핍 스트레스)에 노출된 식물의 성장을 향상시키는데 유용할 수 있음을 시사한다.
Figure pct00106
실시예: 28 Bt. 4Q7Flg22 또는 Ec. Flg22와 RHPP의 조합물
생물활성 프라이밍 폴리펩타이드, Bt.4Q7Flg22 및 Ec.Flg22를 RHPP와 조합하여 대두에서 수확률 이득에 대해서 평가하였다. Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 또는 Ec.Flg22(서열번호 526)와 RHPP(서열번호 600)의 조합물을 미국 중서부(IA, IL 및 IA) 전체에서 7곳의 지역에서 두 품종의 대두(AG2836, 품종 1; AG3536, 품종 2)에 엽면 적용하였다.
Bt.4Q7 Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226; FIG 4, 패널 A) 및 Ec.Flg22(서열번호 526; FIG 4, 패널 B) 및 RHPP(서열번호 600)를 사용한 엽면 시비를 대두 식물(상업적인 잡종 베크 294 NR)에 R2 발달기에 0.33, 4.0, 8.0, 및 16.0Fl.oz/Ac 또는 (24.1㎖/Ha, 292.3㎖/Ha, 584.6㎖/Ha, 1169.2㎖/Ha)의 다양한 사용률을 사용하여 개별적으로 적용하였다. 에이커당 부셀(Bu/Ac) 단위의 평균 수확률(9월에 수확됨)을 7곳의 개별 지역에서 재배된 대두에 대해서 보고하고, 두 대두 품종에 대해서 개별적으로 그리고 조합된 평균 수확률로서 보고하였다(표 45). 두 품종에 대한 대조군 대두 식물에 정규화된 수확률(Bu/Ac) 변화로서 대두 수확률(Bu/Ac)을 또한 보고한다.
Figure pct00107
대두 품종 AG3536(품종 2)은 미국 중서부의 모든 7곳의 지역에서 수확률 Bu/Ac에 대해서 AG3536(품종 1)을 지속적으로 능가하였다. Bt.4Q7Flg22, Ec.Flg22 및 RHPP로의 엽면 시비를 3개의 상이한 사용률(0.33, 4.0 및 8.0Fl.oz/Ac) 또는 (24.1㎖/Ha, 292.3㎖/Ha, 584.6㎖/Ha)로 개별적으로 적용하였고, 모두 미처리 대조군 식물보다 수확률 이익을 초래하였다. 4.0Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha) 사용률을 사용하여 엽면으로 적용된 RHPP는 개별적으로 적용된 다른 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드와 비교할 때 대조군 식물보다 +1.26Bu/Ac(84.7㎏/Ha)의 최고의 수확률 증가를 초래하였다. 그러나, Bt.4Q7Flg22와 RHPP의 조합물은 추가적인 수확률 이익을 제공하여, 미처리 대두 대조군 식물에 비해서 +2.61Bu/Ac(175.5㎏/Ha)를 초래하였다. RHPP와 조합된 Bt.4Q7Flg22의 엽면 시비로 처리된 대두 식물로부터 인지된 이러한 수확률 증가는 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드를 조합함으로써 달성된 상승작용적 효과를 설명하는데, 여기서 조합물의 수확률 증가는 별개로 적용된 두 폴리펩타이드의 합보다 컸다.
실시예 29: HLB병의 치료에 있어서의 티오닌의 효과를 시험하기 위한 아그로박테리움 투메파시엔스의 용도
아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101를 루리아 브로쓰 배지(Luria broth medium: LB) 내에 접종시키고, 20시간 동안 성장시켰다. 먼저, 배양물의 광학 밀도(OD)를 분광광도계를 사용하여 600nm의 파장에서 측정하고, 낮은 시작 밀도로 정규화하였다. 배양물을 동일하게 나누고, 감귤 나무를 치료하는데 사용되는 혼합물을 나타내는 티오닌의 유사한 부분으로 처리하였다. 사용된 Cs.티오닌(서열번호 651), As.티오닌(서열번호 652) 및 Mt.티오닌(서열번호 653)은 10.0%, 2.0%, 0.40%, 0.08% 및 0.02%였고, 나무당 처리제로서 사용된 티오닌 혼합물 각각의 여과액의 총 부피 20㎖과 매칭하도록 제조하였다. 각각의 티오닌 혼합물을 또한 여과액, 최소 배지(LB) 또는 테트라사이클린(Tet) 항생제(배양물당 10㎍/㎖) 만을 함유하는 대조군 혼합물과 비교하였다. 각각의 막대는 3회 반복물의 조합된 OD 측정치를 나타낸다. 티오닌 및 항생제 혼합물의 인큐베이션 후, 광학(OD 600)를 다시 측정하여 아그로박테리움 배양물의 성장이 감소 또는 저해되었는지를 결정하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, Cs.티오닌, As.티오닌 및 Mt.티오닌 처리는 모두 용량 의존적인 반응을 나타내었고, 여과액, 최소 배지 (LB) 또는 항생제(Tet) 대조군에 비해서 아그로박테리움 배양물의 성장을 감소시켰다.
실시예 30: 티오닌의 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 감염의 치료
칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 감염을 치료하는 티오닌의 용도를 플로리다 중부(오키 초비 카운티)에 위치한 과수원의 감귤 나무에서 시험할 것이다. 총 26그루의 나무의 처리는, 티오닌을 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스가 서식하는 체관부에 표적화하기 위해서 체관부 국지화 서열(서열번호 611)의 존재 또는 부재 하에서 티오닌(서열번호 620; 621 및 622)의 제형 혼합물을 사용할 것이다. 발렌시아 오렌지(시트러스 시넨시스) 나무의 티오닌과 이들의 혼합물의 제형으로의 접종은 저압 주입 장치인 BRANDT ENTREE를 사용하여 수행할 것이다. 음성 대조군으로서의 물 및 양성 대조군으로서의 테트라사이클린을 비롯한 총 4개의 티오닌 처리제를 5년생 나무에 적용할 것이다. 감귤 나무를 대조군(미처리), 티오닌 처리, 양성 대조군 항생제(옥시테트라사이클린) 처리된 나무 플롯을 위한 처리 블록으로 무작위할 것이다. 체관부 표적화 서열에 융합된 티오닌은 pBC 벡터로서 발현될 것이고, 티오닌 함유 여과액을 발현된 세포로부터 수집될 것이다. 티오닌: Cs.티오닌(서열번호 651), As.티오닌(서열번호 652) 및 Ms.티오닌(서열번호 653)의 혼합물을 함유하는 총 20㎖의 부피를 20㎖의 총 부피의 여과액으로서 제공할 것이다. 티오닌 처리된 감귤 나무를 미처리(대조군) 나무 및 2그램/나무의 농도로 적용된, 항셍제인 옥시테트라사이클린의 개별 양성 대조군이 제공된 나무와 비교할 것이다. 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스로의 나무의 감염 수준을 qPCR 검출 및 16S rRNA 유전자 특이적 프라이머 및 중첩된 프라이머를 사용하는 증폭에 의해서 확인하여 HLB병을 확인할 것이다[서열 5'≫ 3':TCGAGCGCGTATGCAATACG로서의 (정방향) HLB; (역방향) HLBr GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG; 플루오레세인 리포터 염료로 표지된 HLBpc(프로브) AGACGGFTGAGTAACGCG].
식물을 3월에 처리할 것이고, 잎 샘플을 1개월 후 4월에 수집할 것이다. 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 평균 박테리아 계수치를 잎 얼룩 모틀링 또는 잎과 줄기의 황변 징후에 대한 시각적 증상 순위 점수와 함께 평가할 것이다.
열매 크기, 형상 및 열매 발달 또는 성숙 수준을 나무당 20개의 대표적인 열매에 대해 수집할 것이다. 세로 길이(주 직경, ㎝) 및 폭(부 직경, ㎝, 열매가 대칭이 아닌 경우 가장 큰 폭과 가장 작은 폭의 평균). 열매 형상을 폭 대 길이의 비로 측정할 것이다. 총 열매 중량을 총 과일 수(20)로 나누어 평균 열매 중량(그램)을 제공할 것이다. 총 열매 중량을 ㎏/나무 단위로 수집 및 표시할 것이다.
착즙된(짜낸) 자몽 및 오렌지 열매로부터 얻어진 주스의 산 보정된 oBrix(oBrixc) 값을 oBrixc 실험실 분석 방법에 대한 USDA 최소 표준에 따라 나무당 수득할 것이다. 백분율 산(%, w/v)을 또한 측정할 것이다. 주스를 재구성하기 위한 굴절계 상의 oBrix 판독 값은 산 기여 및 온도 효과에서 차감된 원하는 산 보정된 oBrix의 값과 동일하다. 재구성된 주스의 총 적정 산도(% 산)를 재구성된 oBrix 및 Brix/산 비율을 기반으로 계산하고, 산 보정 및 온도 보정 계수를 사용하여 조정할 것이다(JBT FoodTech Laboratory Manual, "Procedures for Analysis of Citrus Products, Sixth Edition).
박테리아 세포 계수치는, 실시간 형광 PCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 기술을 사용하여 살아있는 박테리아만을 검출하고 죽은 세포로부터의 네이키드 DNA 또는 DNA를 포함하는 배경 DNA를 차감함으로써 계산될 것이다(Davis and Brlansky, "Quantification of live Candidatus Liberibacter asiasticus" populations using real-time PCR and propidium monoazide", Plant Disease 97: 1158-1167, 2013). 칸디다투스 리베리박터 아시아스티쿠스(Candidatus Liberibacter asiasticus)(CLas) 세포에 특이적인 집락 계수치를 티오닌 처리, 미처리(대조) 및 양성 대조군(항생제) 처리된 나무로부터 수집된 잎에서 측정할 것이다. 살아있는 박테리아 역가에 대한 계산은 qPCR에 의해 수득된 DNA 수확률로부터 획득할 것이고, 표적 카피 수를 총 박테리아 수와 상관시키고 조직 그램당 살아있는 세포의 로그 스케일로 표현되는 회귀 방정식에 피팅할 것이다. 처리 나무 및 미처리 나무로부터의 역가의 비교는, 붉은 자몽 및 발렌시아 오렌지 나무 둘 다에 대해서 질병 중증도 또는 질병 증상, 예컨대, 잎 상의 일반적인 얼룩 모틀링, 변형되거나 편향된 열매 및 녹색 열매의 정도와 일치할 것이다.
실시예 31: 감귤 녹화를 치료 또는 감소시키기 위한 레트로-인버소 Flg 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 용도
레트로-인버소 대응물과 쌍을 이루는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 조합물은 아시아 감귤 녹화 또는 감귤그린병(HLB)을 초래하는 감귤에 대한 녹화 효과를 치료 및 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
감귤에서 HLB의 초기 증상은 개별 가지 또는 나무 캐노피의 한 부분에서의 잎의 황변이다. HLB로부터 황변하는 잎은 잎의 한쪽 면에 녹색 패치가 있고 다른 쪽면에 황색 패치가 있는 얼룩이 있는 황변 또는 모틀링의 비대칭 패턴을 나타낼 것이다. HLB병이 진행함에 따라서 열매 크기는 더 작아지고, 과육은 써진다. 열매는 부분적으로 녹색으로 유지될 수 있고, 조숙하여 낙과하는 경향이 있다.
Flg22의 레트로-인버소 형태는 식물 표면에서 FLS-연관된 수용체(들)에 대한 결합에 대해서 Flg22의 네이티브 형태와 경쟁하고, 따라서 HLB 질병과 연관된 녹화의 증상 형성을 저해/지연시킬 것이다. 네이티브 Flg22 및 RI 조합물을 사용하는 것은 미세하게 조정되는 면역을 도와서 질병-유발 박테리아, 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스를 감소시키고, 심지어는 제거하여, 급성 증상 발달, 예컨대, 잎 황변 및 감귤 열매 녹화를 예방한다.
Flg 폴리펩타이드와 이의 레트로-인버소(RI) 형태의 처리 조합물을 사용하여 감귤 열매 녹화에 대한 HLB 감염의 효과를 최소화할 것이다. HLB병의 증상이 있거나 없는 34개의 상업적인 자몽, 시트러스 파라다이스 맥패드. 및 6개의 스위트 오렌지, 시트러스 시넨시스(L.)를 BRANDT enTREE라고 부리는 저압 주입 장치를 사용하여 하기 표 46에 기재된 플라젤린 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 조합물을 사용하여 처리하여 나무 내부에 Flg 폴리펩타이드를 분포시킬 것이다.
Figure pct00108
이들 처리된 자몽 및 스위트 오렌지 나무로부터의 잎 조직 샘플을 실시예 15에 기재된 바와 같이 ROS 검정을 사용하여 분석할 것이다. 플로리다 중부에서 3월부터 8월까지 과수원에서 샘플링을 수행할 것이다. 감귤 과수원의 샘플은 주를 대표하는 것으로 간주될 것이다. 샘플링된 과수원의 최소 면적은 2헥타르(2 내지 24Ha 범위 및 평균 5.2Ha)이다. 선택된 과수원 감귤 나무를 각각의 무작위화된 플롯에 중첩된 미처리 대조군 나무와 함께 무작위로 선택할 것이다. 자몽 및 오렌지 나무의 잎 조직은 대략 동일한 나이의 나무로부터 수집할 것이다. 잎을 나무의 유사한 위치에서 그리고 새로 자란 플러시가 있는 나무로부터만 샘플링할 것이다. 샘플링을 위해 선택된 과수원에서, 유사한 문화적 실시를 유지할 것이고, 제초제를 사용한 급수 관주법 및 잡초 관리를 포함할 것이다. 그러나, 선택된 과수원은 ROS 검정을 위해서 잎을 샘플링하기 최소 30일 동안에는 어떠한 살충제 적용도 제공되지 않을 것이다. HLB병의 증상을 나타내는 10그루의 자몽 나무의 2회 반복 시험을 과수원당 무작위로 샘플링하고, 어떠한 증상도 나타내지 않은 14그루의 자몽 나무(미감염 대조군)와 비교할 것이다. 유사한 잎 샘플링을 스위트 오렌지에서 수행할 것이다(4개의 미감염 샘플을 2개의 미감염 대조군과 비교). 과수원 전체를 대표할 나무를 선택할 것이다. 대조군 및 감염된 HLB 감귤 잎 샘플의 처리로부터 관찰된 ROS 활성도의 임의의 차이의 통계학적 유의성을 결정하기 위해서 중첩 분산 분석(ANOVA)을 수행할 것이다.
실시예 32: Flg22 폴리펩타이드의 엽면 시비는 대두의 세르코스포라 잎 마름병 질병을 감소시킨다
Bt.4Q7Flg22(H1)를 발현하는 바실루스 투린기엔시스 및 바실루스 슈도마이코이데스로부터 유래된 Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드(서열번호 226)의 엽면 시비를 대두 식물(상업적인 잡종 베크 294 NR)에, 경작지에 이미 세르코스포라 감염이 있다고 공지된 3곳의 별개의 미국 중서부 지역에서 재배된 V3 발달기에 적용하였다.
세르코스포라 잎 마름병 순위 스케일(영향을 받은 잎 면적의 백분율)을 사용하여 모든 경작지 실험에서 질병 중증도를 순위매겼다. 식물병 정량화에 대한 ASSESS 영상 분석에 기초한 시각적 키(key)를 사용하여 영향을 받는 잎 면적의 백분율을 계산하였다(Chagas Ferreira da Silva, LSU Master's Theses, 2014). 최고 삼출엽 잎에 대해서 백분율로서의 증상 순위매김을 수행하였다.
결과를 표 47에 기재한다. 시각적으로, Bt.4Q7Flg22 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드 및 Bt.4Q7Flg22(H1)를 발현하는 바실루스 슈도마이코이데스의 엽면 처리가 제공된 대두 식물은 미처리 대조군 식물과 비교할 때 활력이 증가되었다. 대조군 식물은 Bt.4Q7Flg22 처리(0.33Fl.oz/Ac 또는 24.1㎖/Ha)를 사용할 때 20% 그리고 Bt.4Q7Flg22 처리 (4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha)를 사용할 때 대략 5%와 비교할 때 4주 관찰 시점에 초기 증상 발달의 증가, 30%를 나타냈다. Bt.4Q7Flg22(H1) 처리제를 발현하는 바실루스 슈도마이코이데스가 제공된 대두 식물은 또한 미처리 대조군 식물보다 세르코스포라 감염의 결과로서 더 낮은 초기 증상 발달, 4주에 20%(0.33Fl.oz/Ac 또는 24.1㎖/Ha) 및 10%(4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha)를 나타내었다. 적용 8주 후, 미처리 대조군 식물은 식물의 상부 나뭇잎(상부 3 내지 4개의 삼출엽 잎)의 50%의 시각적인 증상 손상을 나타내었다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드(0.33 Fl.oz/Ac 또는 24.1㎖/Ha)의 엽면 처리가 제공된 식물의 증상 순위는 엽면 처리 후 8주에 미처리 대조군 식물과 대등하였다. 그러나, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드(4.0Fl.oz/Ac) 및 Bt.4Q7Flg22(H1)를 발현하는 바실루스 슈도마이코이데스(0.33Fl.oz/Ac 또는 24.1㎖/Ha) 및 4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha)의 엽면 처리가 제공된 대두 식물은 명백한 증상 및 손상이 현저히 적었다. 전체적으로, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드(4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha)의 처리는, 마름병 및 자색 착색 증상뿐만 아니라 탈엽을 나타낸 미처리 식물과 비교할 때 세르코스포라 감염으로부터의 초기 증상 발달의 예방에 효과적이었다. 따라서, 더 높은 적용 사용률(예를 들어, 4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha))로 적용된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 엽면 시비는 초기 증상 발달을 관리하는 수단을 제공할 수 있으며, 세르코스포라의 영향을 받은 경작지 위치에서 재배된 대두 식물에 더 건강하고, 활력있는 콩 식물을 제공할 수 있다.
Figure pct00109
실시예 33: 옥수수에 대한 적용 - 향상된 정규화된 차이 식생 지수(Enhanced Normalized Difference Vegetation Index: ENDVI) 분석
향상된 정규화된 차이 식생 지수(ENDVI)는 살아있는 광합성-활성 녹색 식생의 지표이며, 원격 감지 기술을 사용한 장소 시험에서 치료 효과를 비교하는데 사용되었다. ENDVI 지수에서, -1.0 내지 0.1 범위의 값은 광합성이 감소된 건강하지 않은 식물을 나타내며, 1에 가까은 값은 무성한 녹색, 높은 광합성 능력 및 증가된 바이오 매스를 나타낸다. 건강한 식물은 400 내지 700nm의 스펙트럼 파장 범위의 가시광을 강력하게 흡수하고, 700 내지 1100nm의 근적외선 파장을 반사한다. ENDVI 측정은 식물 바이오매스 또는 녹색, 식물 캐노피에 의한 광의 흡수, 광합성 능력(예를 들어, 잎 면적 지수, 바이오매스 및 엽록소 농도)와 같은 특정 식물 특성에 상응할 수 있다. NDVI 영상은 영상를 캡처하고, 캡처 동안 다양한 파장의 광을 필터링하도록 특별히 생성된 드론(DJI MATRICE 100)에 부착된 BGNIR 카메라(Zenmuse X3)를 사용하여 수집하였다. 카메라는 센서를 사용하여 전자기 스펙트럼의 가시 및 근적외선 밴드를 캡처한다. 다량의 초목 또는 바이오매스가 있는 건강한 식물은 녹색(G) 및 근적외선(NIR) 광을 반사하면서 청색(B) 및 적색 광을 모두 흡수한다. 건강이 좋지 않거나 지상 바이오 매스가 적은 식물은 가시성이 높고, 더 적은 NIR 광을 반사한다. ENDVI는 NIR 및 G 둘 다를 반사 채널로 사용하고, B를 흡수 채널로 사용한다. 하기 ENDVI 식은 반사 채널을 위해서 NIR 및 녹색 채널을 함께 추가한다. 청색 채널에 2를 곱하면 NIR 및 G 채널이 함께 추가된다. ENDVI 식은 NIR, G 및 B 채널에 대해 하기 계산을 사용하여 비율 값을 단일 출력으로 제공한다.
Figure pct00110
EVERGOL 살진균제(7.18% 프로피코나졸, 3.59% 펜플루펜 및 5.74% 메탈락실과 조합됨) 및 PONCHO/VOTiVO 500(40.3%의 클로티아니딘 살곤충제와 51.6%의 바실루스 피르무스 I-1582, 미생물 작용제의 혼합물)를 포함하는 종자 처리제로 처리된 옥수수 종자(DEKALB 잡종 DKC 58-89)를 미국 중서부(IL)에 심었다. Bt.4Q7Flg22 및 Bt.4Q7Flg22의 합성 버전(표 48에 기재된 바와 같은 Syn01Flg22)을 함유하는 다양한 엽면 처리를 V5-V7 발달기에 옥수수 식물에 적용하였다. 각각의 엽면 처리 3주 후 그리고 옥수수 캐노피가 완전히 닫힌 후 시험 플롯 위 드론 높이 50m에 의해서 BGNIR 영상을 수집하였다. 드론 디스플레이 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 개별 BGNIR 영상을 처리하여 시험 플롯의 단일 정사 영상을 생성하고, 이것을 피지 이미징 소프트웨어로 추가 분석하였다. 정사 영상 내에서, 경작지에서 개별 엽면 처리를 식별하기 위한 플롯 영역 및 각 처리당 복제를 각 경작지 시험에서 GPS 좌표를 사용하여 명확하게 확립하였다. 영상화를 위해 식별된 처리 반복물은 크기가 일정 하였다. 각각의 잎 처리에 대해서, 각각의 복제된 플롯당 2개의 열로 영상화된 3개의 반복물을 수집하였다. 각각의 반복물 내에서, 광의 평균 강도를 0 내지 255의 스케일로 영상 채널[청색, 녹색 및 근적외선(적색으로 가시화됨)] 각각에 대해서 측정하였는데, 강도 0=0% 반사율(흑색 픽셀) 및 강도 255=100% 반사율(백색 픽셀)이었다. 이들 평균 B, G 및 NIR 광 강도를 사용하여 각각의 복제된 플롯에 대한 식물 건강(녹색)에 대한 ENDVI 알고리즘을 사용하여 ENDVI 값을 계산 하였다. 이어서, 표 49 및 50에 보고된 바와 같이 3 개의 플롯 복제에 대해 ENDVI 값을 평균화하였다. 처리 적용을 위한 ENDVI 값을 각 플롯의 대조근 처리와 비교하였다. 대조군 처리는 기본 종자 처리만으로 처리되고 엽면 처리가 제공되지 않은 종자로부터 자란 옥수수 식물로 이루어졌다. 잎 처리 조성물은 표 48에 명시된 바와 같은 적용 사용률을 사용하여 기재된 바와 같았다.
Figure pct00111
엽면 조성물은 330.7mM의 1,2-벤즈아이소티아졸린(BIT), 53.5mM의 5-클로로-2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온(CMIT) 및 26.1mM의 2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온(MIT)의 블렌드의 수성 분산물인 0.1%(v/v) Proxel BC 보존제를 함유하였다. 엽면 조성물을, 0.1%(v/v) ALLIGARE SURFACETM 비이온성 계면활성제를 함유한 20갤론/에이커 물의 담체 부피 중의 제시된 비율로 적용하였다.
표 49에 나타낸 바와 같이, 옥수수에 V5-V7 발달기에 적용되는 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg 22를 함유하는 조성물을 사용한 엽면 시비는, 엽면 처리가 제공되지 않은 식물(종자 처리 대조군)과 비교되거나 정규화되는 바와 같이 증가된 ENDVI 측정비 값을 초래하였다. 완충 제형 중의 엽면 처리제로서 제공된 Bt.4Q7Flg22 조성물(조성물 2, 3, 4 및 5; 인산나트륨 pH 5.6 내지 5.7)은, 4Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha로 적용되는 비완충 조성물(조성물 1)로 제공되는 Bt.4Q7Flg22가 제공된 식물에 비해서 더 높은 ENDVI 비 값을 갖는 식물을 초래하였다. 그러나, Bt.4Q7Flg22 처리된 식물(조성물 1 내지 5)의 ENDVI 비 값은 미처리 대조군 식물에 비해서 모두 증가되었다. 8Fl.oz/Ac 또는 584.6㎖/Ha 사용률로 제공되는 인산염 완충 제형 중의 셀로비오스와 조합된 Bt4Q7Flg22 폴리펩타이드로 이루어진 조성물 4의 엽면 처리 적용이 제공된 옥수수 식물은, 대조군(종자 처리 단독) 식물에 비해서 평균 ENDVI 비 값에서 +9% 증가를 초래하였다. 각각의 적용 사용률(4 및 48Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha 및 3,507.6㎖/Ha)에서 조성만 상이한 조성물 1 및 5의 엽면 시비가 제공된 식물은 대조군 식물과 비교할 때 유사한 ENDVI 비 값(+3% 및 +4%)을 갖는 식물을 초래하였다. 중요하게는, 48Fl.oz/Ac 또는 3,507.6㎖/Ha의 더 높은 비율이 검출 가능한 식물독성을 초래하지 않았으며, 이는 대조군(종자 처리 만)과 비교하여 감소된 ENDVI 값으로 관찰되었다. Bt.4Q7Flg22(Syn01Flg22) 조성물 6, 7, 8의 합성 유래 변이체 버전을 또한 V5-V7 옥수수 식물에 대한 엽면 분무로서 제공하였다. 인산염 완충 제형(조성물 6 및 조성물 7) 중에 제공된 Syn01Flg22 폴리펩타이드를 적용 사용률에 따라서 비교하였다. 더 높은 적용 사용률(4Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha)을 사용하여 옥수수 식물에 제공된 Syn01Flg22 폴리펩타이드(조성물 6)는, ENDVI 비율 값을 감소시키거나, 또는 조성물 6과 7 처리 사이의 8% 변화인 0.4Fl.oz/Ac 또는 29.23㎖/Ha의 적용 사용률을 사용하여 식물에 적용된 Syn01Flg22 폴리펩타이드(조성물 7)와 비교할 때 더 낮은 ENDVI 백분율 증가를 가졌다. Syn01Flg22(조성물 8)는 셀로비오스가 첨가되었는데, 조성물 7과 유사한 0.4Fl.oz/Ac 또는 29.23㎖/Ha의 적용 사용률로 제공되었다. Syn01Flg22(조성물 7)의 엽면 시비를 셀로비오스(320mM)(조성물 8)와 조합된 Syn01Flg22와 비교하였다. Syn01Flg22 조성물 7 및 조성물 8은 ENDVI 측정비에서 유사한 증가를 가졌는데, 이는 대조군 식물과 비교할 때 10% 증가 또는 헥타르(Ha)당 더 높은 4Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖의 사용률로 제공되는 Syn01Flg22(조성물 6)가 제공된 식물과 비교할 때 +8% 증가를 초래한다.
Figure pct00112
옥수수 종자(DEKALB 잡종 DKC 52-61)를 또한 Bt.4Q7Flg22 조성물 3과 조합하여 Roundup POWERMAX(활성 성분 글리코포세이트, 칼륨염의 형태로 48.7%)으로 처리하였다. 권고된 사용률을 사용하여 24Fl oz/Ac의 시편 표지에 Roundup POWERMAX를 적용하였다. Bt.4Q7Flg22(조성물 3)을 4.0Fl.oz/Ac 또는 292.3㎖/Ha의 비율로 적용하였다. 결과를 표 50에 나타낸다.
Figure pct00113
표 50에 나타낸 바와 같이, V5-V7 발달기의 옥수수에 Bt.4Q7Flg22(조성물 3)와 조합된 엽면 제초제로서 적용된 Roundup POWERMAX는, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 없이 적용된 Roundup POWERMAX로의 처리와 비교할 때 증가된 ENDVI 측정비, +8%의 증가를 초래하였다.
실시예 34: V4-V7 옥수수에 대한 생물활성 프라이밍 폴리펩타이드의 적용 - 수확률 증가
EVERGOL 살진균제(7.18% 프로피코나졸, 3.59% 펜플루펜, 및 5.74% 메탈락실)와 PONCHO/VOTiVO 500(클로티아니딘 살곤충제와 미생물 작용제, 바실루스 피르무스 I-1582의 혼합물)을 포함하는 종자 처리제로 코팅된 옥수수 종자(DEKALB 잡종: DKC 52-61, DKC 58-89 및 DKC 65-81)를 심어서 넓은 에이커의 옥수수 시험을 수행하였다. 옥수수 경작지 시험은 미국 중서부(IN, IL 및 IA)의 8곳의 지역에서 수행되었다. 옥수수 식재를 위한 관행 또는 보존 경운 방법을 위해서 각각의 지역에서 파종상을 제조하였다. 비료를 종래의 경작법에 의해서 권고된 바와 같이 적용하고, 미국 중서부 지역 간에 일관성을 유지하였다. 제초제를 잡초 방제를 위해 적용하였고, 필요 시 경작(cultivation)을 보충하였다. 모든 지역에 4-이랑 플롯의 5.3 미터를 심었다. 옥수수 종자를 3.8 내지 5.1㎝ 깊이로 심어서 정상적인 뿌리 발달을 보장하였다. 옥수수를 에이커당 대략 평균 42,000개의 식물 또는 헥타르당 103,782개의 식물로 심었는데, 매 30㎝마다 1.6 내지 1.8개의 종자로 이격된 종자를 갖는 평균 이량 너비는 0.8미터였다.
대략 V5 발달기의 옥수수 식물에게 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 폴리펩타이드 및 Bt.4Q7Flg22의 합성 버전(이것은 Syn01Fflg22(서열번호 571) 폴리펩타이드로 기재됨)을 포함하는 엽면 조성물을 사용하여 엽면 시비를 제공하였다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 및 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 포함하는 엽면 조성물을 미국 중서부(IN, IL 및 IA)의 8곳의 지역에 식재된 3종의 옥수수 잡종(DEKALB 잡종: 잡종 1: DKC 52-61; 잡종 2: DKC 58-89; 잡종 3: DKC 65-81)에 적용하였다. 옥수수 식물에게 표 51에 기재된 바와 같은 농도 및 적용 사용률을 사용하여 엽면 처리를 제공하였다. 옥수수 수확률(Bu/Ac)을 수집하고, 지역(잡종 1의 경우 8개 지역, 잡종 2의 경우 7개 지역 및 잡종 3의 경우 6개 지역)에 걸쳐서 평균 수확률(Bu/Ac)로 그리고 계면활성제 단독으로 처리된 기본 종자 처리(ST) 대조군과 비교한 Bu/Ac 단위의 평균 변화로서 표 51에 보고하였다.
Figure pct00114
대략 V5 발달기의 옥수수 식물에 Bt.4Q7Flg22 및 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 합성 버전 Syn01Flg22를 포함하는 엽면 조성물을 사용하여 엽면 시비를 제공하였다. Bt.4Q7Flg22 및 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 합성 버전을 또한 β-(1→4)결합에 의해서 연결된 2개의 β-글루코스 분자로 이루어진 환원당인 셀로비오스(320mM)와 조합하고, 유도인자 처리로서 제공하여 Flg22 폴리펩타이드의 효과를 향상시켰다. 셀로비오스와 조합하여 옥수수 식물에 제공된 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22 둘 다는 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22 엽면 적용된 폴리펩타이드보다 향상된 수확률 증가를 초래하였다. +2.55Bu/Ac 또는 160㎏/Ha의 양의 수확률 증가는, 단독으로 제공된 Bt. 4Q7Flg22 엽면 처리에 대한 +1.14 BuAc 또는 71.6㎏/Ha 수확률 증가와 비교할 때 셀로비오스로의 Bt.4Q7Flg22 엽면 처리가 제공된 옥수수 식물을 초래하였다. 동일한 적용 사용률로 제공된 Syn01Flg22 엽면 처리에 대해서 +1.48 BuAc 또는 92.9㎏/Ha 수확률 증가와 비교할 때, 셀로비오스와 조합하여 제공된 Syn01Flg22(0.2Fl.oz/Ac 또는 14.6㎖/Ha) 엽면 처리를 제공받은 옥수수 식물에서 초래된 +1.59Bu/Ac 또는 99.8㎏/Ha의 양의 수확률 증가가 또한 존재였다. 반면에, 4.0Fl.oz 사용률 또는 292.3㎖/Ha를 사용하여 V5 발달기의 옥수수 식물에 엽면 처리제로서 제공된 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22는 두 종의 Flg22 폴리펩타이드와 셀로비오스의 조합물과 비교할 때 약간 더 낮은 수확률 증가 +1.14Bu/Ac(71.6㎏/Ha) 및 +0.90Bu/Ac(56.5㎏/Ha)를 제공하였다.
실시예 35: 합성-유래된 Flg22(Syn01Flg22)과 살진균제의 조합물
추가 연구에서, 광범위 살진균제, STRATEGO YLD(10.8% 프로티오코나졸 및 32.3% 티오플로옥시스트로빈)과 함께 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 및 Bt.4Q7Flg22로부터의 합성 유래된 폴리펩타이드(Syn01Flg22)의 조성물을 포함하는 엽면 시비를 사용하여 넓은 에이커의 수확률 시험을 수행하였다. STRATEGO YLD는 옥수수에 대한 초기 시기 엽면 시비로서 사용하기에 적합한 상업적으로 입수 가능한 살진균제이고, 4.0에이커당 유체 온스(Fl.oz/Ac)(292.3㎖/헥타르)의 사용률로 시편 표지 상의 권고에 따라서 엽면 분무로서 적용하였다 대략 V5 발달기의 옥수수 식물에 STRATEGO YLD 살진균제와 조합된, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 및 Syn0Flg22, Syn01Flg22 폴리펩타이드의 합성 버전를 포함하는 엽면 조성물을 사용하여 엽면 시비를 제공하였다. 엽면 처리를 아이오와의 2곳의 지역에 식재된 2개의 옥수수 잡종(DEKALB 잡종: 잡종 1: DKC 52-61; 잡종 2: DKC 58-89)에 적용하였다. 옥수수 수확률(Bu/Ac)을 수집하고, 두 잡종에 대해서 2개 지역에서 평균 수확률(Bu/Ac)로서 그리고 기본 종자 처리제(ST) 및 STRATEGOYLD 살진균제를 갖는 엽면 시비만 제공된 종자로부터 재배된 옥수수 식물과 비교하여 Bu/Ac 단위의 평균 변화로서 보고하였다(표 52).
Figure pct00115
살균제, 상기 표 5에 명시된 바와 같은 농도 및 적용 사용률로 STRATEGO YLD와 조합하여 제공된 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22 폴리펩타이드를 사용한 V5 옥수수 식물에 대한 엽면 시비는 +5 초과의 결과를 초래하였다. Syn01Flg22 폴리펩타이드 엽면 처리는, STRATEGO YLD 살진균제만을 사용한 엽면 처리가 제공된 식물과 비교할 때 +5.50Bu/Ac(345.2㎏/Ha)의 평균 수확률을 초래한 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 처리가 제공된 옥수수 식물보다 약간 더 높은 +5.84Bu/Ac(366.6㎏/Ha)의 옥수수 수확률을 초래하였다.
실시예 36: 옥수수에서 수확률을 증가시키기 위한 Flg22 폴리펩타이드를 사용한 종자 처리
다른 연구에서, 다양한 Flg22 폴리펩타이드와 조합하여 제공된 ®EVERGOL 살진균제(7.18% 프로피코나졸, 3.59% 펜플루펜 및 5.74% 메탈락실과 조합됨) 및 PONCHO/VOTiVO 500(40.3%의 클로티아니딘 살곤충제와 51.6%의 바실루스 피르무스 I-1582, 미생물 작용제의 혼합물)로 이루어진 기본 종자 처리제를 사용하여 넓은 아크의 수확률 시험을 수행하였다. 종자 처리제를 3개의 옥수수 잡종(베크 4919V2, 5140HR 및 5828YX)에 적용하고, 미국 중서부(IN, IL 및 IA)의 8개의 지역에 심었다. Flg22 폴리펩타이드의 종자 처리 조성물을 표 53에 기재된 바와 같이 바실루스 투린기네시스(Bacillus thuringinesis)로부터의 기본 종자 처리제 Bt.4Q7Flg22(조성물 10) 및 패니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei)로부터의 Pa.Flg22(조성물 11)를 함유하는 총 슬러리 부피 중의 옥수수 또는 콩 종자 단위당 Fl.oz로서 적용하였다. 조성물 10 및 11에 대한 슬러리 중의 폴리펩타이드의 최종 농도는 1uM이었다.
Figure pct00116
옥수수 수확률(Bu/Ac)을 수집하고, 모든 3개의 잡종에 대해서 평균낸 8개 지역에 걸친 수확률(Bu/Ac)로서 보고하였다. Bu/Ac 단위의 평균 변화를, 기본 종자 처리제(ST)만 제공된 종자로부터 재배된 옥수수 식물과 비교하여 표 54에 기록한다.
Figure pct00117
Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Pa.Flg22(서열번호 293) 폴리펩타이드를 사용한 옥수수 종자의 처리는 3개의 옥수수 잡종 및 8곳의 미국 중서부 지역에 대한 평균으로서 나타낸 바와 같이 수확률을 증가시켰다. 종자 처리제로서 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는 대조군 식물과 비교할 때 훨씬 더 높은 수확률 이익 또는 +4.73Bu/Ac(296.9㎏/Ha)를 초래하였다. 종자 처리제로서 적용된 Pa.Flg22는 또한 기본 종자 처리제만 제공된 종자로부터 재배된 옥수수 식물에 배해서 +3.57Bu/Ac(224㎏/Ha)의 수확률 이익을 초래하였다. 따라서, 상이한 종의 박테리아(바실루스 및 패니바실루스)로부터 획득된 Flg22 폴리펩타이드는 모두 옥수수 종자에 대한 종자 처리제로서 적용되는 경우 실질적인 수확률 증가를 초래하였다.
실시예 37: 옥수수에서 수확률을 증가시키기 위한 Flg22 폴리펩타이드와 셀로비오스의 적용
PONCHO/VOTiVO 500(클로티아니딘 살곤충제와 미생물 작용제, 바실루스 피르무스 I-1582의 혼합물)와 조합된 EVERGOL 살진균제(7.18% 프로피코나졸, 3.59% 펜플루펜, 및 5.74% 메탈락실과 조합됨)를 포함하는 종자 처리제를 함유하는 옥수수 종자(DEKALB 잡종: DKC 52-61, DKC 58-89 및 DKC 65-81)를 심어서 넓은 에이커의 옥수수 시험을 수행하였다. 대략 V5 발달기의 옥수수 식물에 Bt.4Q7Flg22 및 합성 Syn01Flg22 폴리펩타이드를 포함하는 엽면 조성물을 포함하는 농업 조성물을 사용한 엽면 시비를 셀로비오스(320mM)와 함께 또는 이것 없이 제공하였다. 미국 중서부(IL)의 2개 지역에 식재된 2개의 옥수수 잡종(DEKALB 잡종: 잡종 1: DKC 58-89; 잡종 2: DKC 65-81)에 옥수수의 엽면 처리를 적용하였는데, 그것은 옥수수의 수분 발달기 동안, 엽면 시비 후 가뭄-유사 조건을 겪었다. 옥수수 식물에게 비이온성 계면활성제(0.1%v/v 분무 탱크 부피의 최종 농도로 적용된 ALLIGARE SURFACETM)와 함께 표 48에 기재된 바와 같은 농도 및 적용 사용률을 사용한 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22 엽면 처리를 제공하였다. 옥수수 수확률(Bu/Ac)을 수집하고, 2개의 잡종에 대해서 2개의 지역의 평균 수확률(Bu/Ac)로서 그리고 기본 종자 처리제(ST) 및 비이온성 계면활성제(0.1% v/v 분무 탱크 부피의 최종 농도로 적용된 ALLIGARE SURFACETM)만 제공된 옥수수 식물로부터의 수확률과 비교한 Bu/Ac 단위의 평균 변화로서 보고하였다(표 55).
Figure pct00118
Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Syn01Flg22의 합성 버전(서열번호 571)의 엽면 처리 적용은, Flg 폴리펩타이드에 대한 2차 안정화제 및 식물 막 표면으로의 전달을 위한 비히클로서 사용되는 이당류인 셀로비오스와의 엽면 처리 적용과 조합되는 경우 옥수수 식물에서 실질적인 수확률 증가를 초래하였다. 4.0Fl.oz/Ac 적용 사용률(Flg22)을 사용하여 적용되는 조합물 엽면 분무로서 셀로비오스(320mM)가 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드(16.7μM)는, 4.0Fl.oz/Ac의 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 단독에 비해서 대조군 식물보다 2배 초과의 수확률 이득인 +8.22Bu/Ac 증가 또는 대략 516㎏/ha를 초래하였다. 셀로비오스 없이 적용된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는, 계면활성제 대조군으로부터 재배된 대조군 식물에 비해서 +3.70Bu/Ac 또는 232㎏/Ha 증가를 초래하였다. 0.2Fl.oz/Ac의 적용 사용률을 사용하여 Syn01Flg22 및 셀로비오스(320nM)와 조합하여 제공된 Syn01Flg22(16.7μM)의 조합물로 처리된 옥수수 식물에서 유사하게 증가된 수확률이 초래되었는데, 각각의 증가는 계면활성제 대조군 식물로부터 수득된 수확률과 비교하여 9.60(602.6㎏/Ha) 및 +15.48(971.6㎏/Ha)의 증가이다. 추가로, Bt.4Q7Flg22(16.7μM) 폴리펩타이드를 0.2, 2.0 및 24.0Fl.oz/Ac(14.6㎖/Ha, 146.2㎖/Ha 및 1753.8㎖/Ha)의 3개의 상이한 적용 사용률을 사용하여 V5-V7 발달기의 옥수수 식물에서 엽면 분무 적용으로서 제공하였다. 최고 사용률을 사용하여 전달된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는 실질적으로 더 높은 수확률 이익을 초래하였고, 이는 대조군 식물로부터 얻은 수확률에 비해서 거의 +27Bu/Ac(1694.6㎏/Ha) 수확률 증가이다. 전체적으로, Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22의 합성 버전은 중요한 식물 발달기(즉, 수분) 동안 가뭄-유사 성장 조건으로부터의 보호를 제공하였고, 옆면 시비로서 사용된 Bt.4Q7Flg22, Syn01Flg22 및 셀로비오스의 모든 조합물에 대해서 수확률 증가를 초래하였다.
또 다른 연구에서, Flg22 폴리펩타이드 및 Flg22 폴리펩타이드와 셀로비오스의 조합물을 사용한 종자 처리는 4개의 반복 시험에 대한 평균으로서 보고된 경작지 시험에서 전체 수확률 증가를 초래하였다(표 56). 종자 처리제를 미국 중서부(콜롬비아)의 1개 지역에서 재배된 옥수수 잡종(베크 5828YX)에 적용하였다. Flg22의 종자 처리 조성물을 기본 종자 처리제를 함유하는 총 슬러리 부피 중의 0.14Fl.oz/옥수수 종자 단위로서 표 56에 기재된 바와 같이 적용하였다. 슬러리 중의 Flg22 폴리펩타이드의 최종 농도를 시드당 1uM에 표준화하였다. Flg22 폴리펩타이드와의 조합물 처리제로 적용된 셀로비오스의 동일한 최종 농도는 종자당 1.0mM이었다. Bu/Ac 단위의 평균 수확률 및 미처리 대조군(칼럼 1) 및 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)(칼럼 2)과 비교한 Bu/Ac 단위의 평균 증가를 하기 표 56에 기재된 바와 같이 Flg22 폴리펩타이드 조합물 처리제가 제공된 종자로부터 재배된 옥수수에 대해서 보고한다.
Figure pct00119
Figure pct00120
실시예 38: V4-V6 대두에 대한 Flg22와 셀로비오스 첨가제의 적용은 수확률을 증가시켰음 - 넓은 에이커 수확률 시험
비코팅 대두 종자를 심어서 넓은 에이커 대두 시험을 수행하였다. 대두 종자르 1.5 내지 2인치 깊이(대략 5㎝)로 심어서 정상적인 뿌리 발달을 보장하였다. 대두를 에이커당 평균 150,500개의 식물, 30인치 이랑(0.8미터)의 이량 너비 및 피트(30㎝)당 7 내지 8개의 종자의 종자 간격으로 12.5'(3.8 미터) 플롯으로 심었다.
농업적 유효량의 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226), Syn01Flg22(서열번호 571) 및 애뉴리니바실루스 써모애로필루스(Aneurinbacillus thermoaerophilus)로부터의 Flg22, At.Flg22-B4(서열번호 300)를 포함하는 농업 조성물 대두에 적용하였다. Flg22 폴리펩타이드 처리제를 표 57에 명시된 바와 같은 적용 사용률(Fl.oz/Ac 또는 ㎖/Ha)로 5곳의 미국 중서부 지역(참여 장소: IA 및 IL)에서 재배된 대두에 엽면 분무로서 적용하였다. Bt.4Q7Flg22(서열번호 226); Syn01Flg22(서열번호 571) 및 At.Flg22-B4(서열번호 300)를 함유하는 엽면 처리제를 대략 V4-V6 발달기에 처리제의 확산 및 흡수를 용이하게 하기 위한 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACETM을 0.1% v/v 분무 탱크 부피의 최종 농도로 적용함)와 함께 대두 식물에게 제공하였다. Flg22 조성물이 제공된 식물에 대해서 대두 수확률을 3종의 대두 품종(Asgrow: AG2733, AG3536 및 AG4034)에 대해서 수집하였다. 대두 수확률을 또한 비이온성 계면활성제(0.1% v/v 분무 탱크 부피의 최종 농도로 적용된 ALLIGARE SURFACETM) 단독 처리만 제공된 대조군 대두 식물에 대해서 수확률 Bu/Ac의 변화로서 보고하였다(표 57).
Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22 폴리펩타이드의 엽면 시비를 또한 첨가제로서 셀로비오스와 조합하였고, 수확률 증가에 대한, 셀로비오스 첨가제와 조합된 Flg22 폴리펩타이드의 효과를 조사하였다. 셀로비오스는 이당류 글루코스이고, 셀룰로스 중합체에 대한 빌딩 블록이다. 화학적으로, 그것은 β(1-4) 결합으로 연결된 2개의 β-글루코스 분자로 이루어진 환원당인 글루코스-베타-1-4-글루코스이다. 셀로비오스는 셀룰로스 또는 리케닌의 분해에 의해 얻어지며, 가수분해시 글루코스를 생성한다. Bt.4Q7Flg22와 조합된 셀로비오스 첨가제는 대두에서 반응성 산소 종(ROS) 활성도의 증가를 초래하였다. 셀로비오스 첨가제를 함유하거나 함유하지 않는 Flg22 조성물이 제공된 식물에 대해서 대두 수확률을 3종의 대두 품종(Asgrow: AG2733, AG3536 및 AG4034)에 대해서 수집하고, 지역에 걸쳐서 모든 3종의 품종 평균 수확률(Bu/Ac)로서 보고하였다. 대두 수확률을 또한 비이온성 계면활성제(0.1% v/v 분무 탱크 부피의 최종 농도로 적용된 ALLIGARE SURFACETM) 단독 처리만 제공된 대조군 대두 식물에 대해서 수확률 Bu/Ac의 변화로서 보고하였다(표 57).
Figure pct00121
다양한 Flg22 폴리펩타이드, Bt.4Q7Flg22; Syn01Flg22 및 At.Flg22-B4(조성물 1 내지 9) 모두의 엽면 처리는 V4-V6 발달기에 대두에 적용되는 경우, 계면활성제 단독의 엽면 시비가 처리된 대조군 대주 식물에 비해서 수확률 이득을 초래하였다. 4.0Fl.oz/Ac로 적용되는 Bt.4Q7Flg22(조성물 3)로의 엽면 처리는 대조군 식물(계면활성제 단독)에 비해서 +2.51Bu/Ac(168.8㎏/Ha) 증가를 초래하였다. 4.0Fl.oz/Ac를 사용하여 엽면 처리로서 대두 식물에 적용된 Syn01Flg22(조성물 6) 폴리펩타이드는 계면활성제 단독 대조군 식물에 비해서 +1.76Bu/Ac(118.4㎏/Ha)의 수확률 이득을 초래하였다. 0.2Fl.oz/Ac의 낮은 적용 사용률 사용하여 대두 식물에 적용되는 Syn01Flg22(조성물 7) 및 Syn01Flg22와 셀로비오스(320nM)(조성물 8)는 셀로비오스 첨가제가 첨가된 경우 +1Bu/Ac의 증가를 초래하였고, 전체적으로 대조군 식물에 비해서 +2.56Bu/Ac(172.2㎏/Ha) 수확률 증가를 초래하였다. 대두(V4-V6)에 적용되는 At.Flg22-B4(조성물 9) 폴리펩타이드는 대조군 식물과 비교할 때 +2.3Bu/Ac(154.7㎏/Ha)의 수확률 이득을 또한 초래하거나 또는 비이온성 계면활성제 처리만 제공된 식물과 비교할 때 3.5Bu/Ac(235.4㎏/Ha) 초과의 수확률 이득을 초래하였다.
추가의 또 다른 연구에서, Flg22 폴리펩타이드 및 Flg22 폴리펩타이드와 셀로비오스의 조합물을 사용한 종자 처리제를 대두에 종자 처리제로서 사용하였고, 4개의 반복 시험에 대한 평균으로서 보고된 경작지 시험에서 전체 수확률 증가를 초래하였다(표 58). 종자 처리제를 미국 중서부(미주리주 콜롬비아)의 1개 지역에서 재배된 1종의 대두 잡종(품종)에 적용하였다. Flg22의 종자 처리 조성물을 표 58에 기재된 바와 같이 총 슬러리 중의 대두 종자 단위당 0.14Fl.oz로서 적용하였고, Poncho VOTiVO 600 FS 및 Evergol Energy로 이루어진 기본 종자 처리제를 갖는 대두 종자에 제공하였다. 각각의 종자 처리당 적용 사용률을 0.14Fl.oz/Ac 또는 4.14㎖/단위로 일정하게 유지시켰다. 슬러리 중의 Flg22 폴리펩타이드의 최종 농도를 시드당 1uM에 표준화하였다. Flg22 폴리펩타이드와의 조합물 처리제로 적용된 셀로비오스의 동일한 최종 농도는 종자당 1.0mM이었다. 각각의 종자 처리당 4개의 반복 플롯을 지역에 걸쳐서 무작위화하였다. Bu/Ac 단위의 평균 수확률 및 기본 종자 처리제만 제공된 대조군 식물과 비교된 nBu/Ac 단위의 평균 변화를 표 58에 보고한다. 가장 상당한 수확률 증가는, 1.0μM의 Flg22 폴리펩타이드의 최종 농도로 전달된 대두 상의 종자 처리제로서 적용되는 경우 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Syn01Flg22(서열번호 571)에서 인지되었고, 기본 종자 처리제가 제공된 대두로부터의 수확률에 비해서 각각 +5.11(343.7㎏/Ha) 및 +9.92(667.1㎏/Ha)의 평균 수확률 증가를 초래하였다.
Figure pct00122
실시예 39: V5 옥수수에 대한 RHPP의 적용은 수확률을 증가시켰다
PONCHO/VOTiVO 500(클로티아니딘 살곤충제와 미생물 작용제, 바실루스 피르무스 I-1582의 혼합물)와 조합된 EVERGOL 살진균제(7.18% 프로피코나졸, 3.59% 펜플루펜, 및 5.74% 메탈락실과 조합됨)를 포함하는 종자 처리제를 함유하는 옥수수 종자(DEKALB 잡종: DKC 52-61, DKC 58-89 및 DKC 65-81)를 심어서 넓은 에이커의 옥수수 시험을 수행하였다. 대략 V5 발달기의 옥수수 식물에게 Gm.RHPP 폴리펩타이드(서열번호 600)을 포함하는 농업 조성물을 사용하여 엽면 시비를 제공하였다. 제형화된 Gm.RHPP 폴리펩타이드(표 59)를 (분무 탱크의) 0.1% v/v 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACETM)와 함께 8.0Fl.oz/Ac(584.6㎖/Ha)의 적용 사용률을 사용하여 옥수수 잡종에 적용하였다. 전체적으로, 시험을 미국 중서부(IL, IN, IA)의 6곳의 지역에서 수행하였고, 지역당 1 내지 2종의 잡종 및 잡종당 3회의 반복된 플롯을 사용하였다. 옥수수 수확률(Bu/Ac)을 수집하고, 평균 수확률(Bu/Ac)로서 보고하였다. Bu/Ac 단위의 평균 변화를 계면활성제 대조군으로부터 재배된 식물의 수확률과 비교하였고, 6개의 지역(총 11개의 반복 플롯)에 대해서 조합된 평균 수확률(Bu/Ac) 및 대조군 식물과 비교한 Bu/Ac 단위의 전체 변화로서 보고하였다. 결과를 표 59에 나타낸다.
Figure pct00123
Gm.RHPP 폴리펩타이드를 사용한 식물의 엽면 처리는 계면활성제 단독이 제공된 식물과 비교할 때 옥수수에서 증가된 수확률을 초래하였다. Gm.RHPP 폴리펩타이드 엽면 처리가 제공된 옥수수 식물에 대해서 조합된 6개의 지역당 평균 수확률은 206Bu/Ac과 비교할 때 또는 대조군 식물에 대해서 209Bu/Ac를 약간 초과하였다. Gm.RHPP 처리된 식물에 대한 수확률은 옥수수 대조군 식물로부터의 수확률과 비교할 때 3.52Bu/Ac 또는 220.9㎏/Ha 증가되었다(표 59).
실시예 40: RHPP 폴리펩타이드는 대두에서 깍지 수를 증가시킨다
대략 300μ㏖-2s-1(광자)의 조건 하에서 13/11 광/일 주기 동안 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위에서 V4 발달기까지 제어된 환경 성장 공간에서 포트당 식재된 2개의 종자를 갖는 종자로부터 대두(품종 MorSoy) 식물을 재배하였다. 이이서 식물을 16/8 광/일 주기 및 온도 21 내지 26℃로 이루어진 긴 낮 조건 하에 배치하여 조기 개화를 촉진하고, 생식(R) 성장기로의 진행 속도를 높였다. 대두 식물이 R1 발달기에 도달했을 때, 최종 농도 300nM 및 비이온성 계면활성제 0.10%(NIS90:10; 프리시젼 래보러토리즈사(Precision Laboratories, LLC))로 Gm.RHPP(서열번호 600) 폴리펩타이드를 함유하는 엽면 시비를 대두에 적용하였다. 대두 식물에는 Gm.RHPP 제형 및 비이온성 계면활성제 단독 대조군이 제공되었다. Gm.RHPP 및 비이온성 계면활성제 대조군 처리 둘 다는 처리당 18개의 식물에 적용되었다. 잎을 완전히 덮기 위해서 각각의 식물당 대략 15㎝ 위에 6개의 등거리 분무를 제공하였다. 처리제 적용 후, R1 대두 식물을 제어 환경 성장 공간으로 복귀시켰다. 17일 후, 식물에게 Gm.RHPP 폴리펩타이드 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 제형 및 비이온성 계면 활성제 단독 처리제로 또 다른 엽면 처리 적용을 제공하였다. 첫 번째 엽면 분무 처리 적용으로부터 31일 후에 길이가 1mm를 초과하는 대두 깍지를 식물에 대해서 계수하였다. 식물당 평균 깍지의 수 및 전체 평균으로부터의 표준 편차를 보고한다(표 60). Gm.RHPP가 제공된 식물로부터의 깍지 수와 비이온성 계면활성제 대조군 처리 적용 사이의 페어드 T- 검정 비교로부터 p 값(유의성의 경우 p <0.05)을 계산하였다.
Figure pct00124
대두 식물의 초기 생식기(R1)에서 Gm.RHPP 폴리펩타이드의 엽면 시비는 비이온성 계면활성제 대조군 처리가 제공된 식물과 비교하여 대략 2배의 깍지 수를 초래하였다.
실시예 41: Flg22 및 RHPP 폴리펩타이드는 토마토 및 페퍼에서 수확률을 증가시킨다
Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Gm.RHPP(서열번호 600)의 엽면 시비 처리제를 개화기 전에 외인성 분무로서 적용하였고, 이것은 토마토 및 할로피뇨 페퍼에서 수확률을 증가시키는데 사용되었다.
작은 스케일의 플롯을 설계하여 토마토에 대한 상업적인 재배 조건을 모의실험하였다. 토마토 식물, 품종 로마를 식재 전 45일 동안 온실에서 자란 이식에서 출발하여, 각 이식 사이가 2피트(0.6 미터)인 2 성장 필드 이랑층에 이랑층당 평균 30개의 식물을 심었다. 토양 온도가 15.6°C에 도달하면 토양 표면 아래 3인치에 토마토를 이식하였다. 토마토를 검은 플라스틱 멀치로 피복된 성장층에서 재배하였다. 점적 관주법을 사용하여 식물을 재배하였고, 성장 시기 전체에서 경작자 가이드라인에 따라서 비료(80lbs. 또는 36.3㎏) 질소; 100lbs.(45.4㎏) 인산염 및 100 lbs.(45.4㎏) 포타쉬 또는 칼륨)를 적용하여 최적의 식물 성장 및 수확률을 제공하였다. 일반적으로 단일 이랑에 에이커당 2,600 내지 5,800개의 식물을 심는 상업적인 경작자에 의해서 사용되는 경작 밀도를 모의실험하도록 작은 성장층 플롯을 설계하였는데, 1.5 내지 2㎝ 중심 상에서 이랑 내의 식물 사이는 45.7 내지 76.2㎝였다[Orzolek et al., "Agricultural Alternatives: Tomato Production." University Park: Penn State Extension, 2016].
Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP를 사용한 엽면 처리를 초기 개화(제1 개화)기에서 토마토 식물에 직접 적용하였다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 엽면 조성물을 4.0Fl.oz/Ac(292.3㎖/헥타르)의 적용 사용률을 사용하여 적용하였고, Gm.RHPP 폴리펩타이드 엽면 조성물을 3.2Fl.oz/Ac(234㎖/헥타르)의 적용 사용률을 사용하여 에이커당 물 10갤론 중에서 토마토 식물 상에 0.1% v/v 비이온성 계면활성제(AlligareTM Surface)와 함께 적용하였다. Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP 처리된 식물을 엽면 처리 적용을 받지 않은 대조군 식물과 비교하였다. 식물을 처리 당 3 회 반복하여 6개의 식물을 반복 처리하였다. 토마토로부터 얻은 수확률에 대한 엽면 처리제의 효과를 결정하고, 분무제가 없는 대조군 처리에 정규화된 바와 같이 보고하였다. 토마토 식물당 평균 열매 중량을 2회의 개별 수확물에 대한 조합된 평균으로서 보고하고, 비분무 대조군과 비교한 열매 중량의 평균 백분율 변화를 표 61에 보고한다.
Figure pct00125
16.7μM의 농도 및 4.0Fl.oz/Ac(292.3㎖/헥타르)의 적용 사용률로 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드로의 엽면 처리 적용은, 비분무 대조군과 비교할 때 총 그램으로서 보고된 바와 같은 식물당 평균 열매 중량의 전체 증가 및 열매 중량의 +8.61% 변화를 초래하였다. 100μM의 농도 및 3.2Fl.oz/Ac(234㎖/헥타르)의 적용 사용률로 제공된 Gm.RHPP 폴리펩타이드는 비분무 대조군과 비교할 때 식물당 열매 중량(그램)의 수확률 전체 증가 및 열매 중량의 거의 +2% 변화를 초래하였다.
또 다른 연구에서, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Gm.RHPP(서열번호 600) 폴리펩타이드로의 엽면 처리제를 초기 개화(제1 개화)기의 할라피뇨 페퍼(캅시컴) 식물에 적용하였다. 작은 스케일의 플롯을 설계하여 할라피뇨 페퍼에 대한 상업적인 재배 조건을 모의실험하였다. 페퍼를 제어된 성장 공간에서 12주 동안 재배하고, 이어서 5.8 내지 6.6의 pH의 토양이 있는 양호한 수분 보유 특성을 갖는 검은 플라스틱 멀치로 덮인 2 성장층 외부에 이식하였다. 할라피뇨 페퍼 식물을 14 내지 16인치(38㎝) 이격시켰고, 이랑층당 대략 25개의 식물을 갖는 식물 사이는 16 내지 24인치(50㎝)였다. 점적 관주법을 사용하여 식물을 재배하였고, 성장 시기 전체에서 경작자 가이드라인에 따라서 비료를 적용하여 식물 성장을 위한 최적의 조건을 제공하였다. 일반적으로 35.6 내지 45.7㎝ 이격된 이중 이랑에 에이커당 대략적인 식물(5,000 내지 6,500개의 식물 또는 헥타르당 12,355 내지 16,062개의 식물)을 심는 상업적인 경작자에 의해서 사용되는 경작 밀도를 모의실험하도록 작은 성장층 플롯을 설계하였는데, 그 층은 이의 중심으로부터 5.0 내지 6.5피트(1.52 내지 1.98미터) 이격되어 있었다(Orzolek et al., "Agricultural Alternatives: Pepper Production." University Park: Penn State Extension, 2010).
물 에이커당 10갤론의 물의 분무 부피 중에서 Bt.Flg22의 경우에는 2.0Fl.oz/Ac(146.2㎖/헥타르) 및 4.0Fl.oz/Ac(292.3㎖/헥타르)의 적용 사용률 및 Gm.RHPP 폴리펩타이드의 경우에는 3.2Fl.oz/Ac(234㎖/헥타르)의 적용 사용률을 사용하여 0.1% v/v 비이온성 계면활성제(AlligareTM Surface)와 함께 Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP 폴리펩타이드를 사용한 엽면 처리를 할라피뇨 페퍼 상에 적용하였다. 식물을 처리 당 3 회 반복하여 6개의 식물을 반복 처리하였다. 시험에 대해서 주위 수확률의 50% 이상 또는 50% 미만의 식물당 평균 수확률을 갖는 복제물은 이상점으로 제외시켰다. 할라피뇨 페퍼 식물에 적용된 Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP 폴리펩타이드 엽면 처리를 0.1% v/v 비이온성 계면활성제(AlligareTM Surface) 단독과 함께 에이커당 10갤론의 물이 분무된 식물과 비교하였다.
페퍼 수확률에 대한 엽면 분무 적용으로서 사용된 Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP 폴리펩타이드의 효과를 수확 접근법당 1회를 사용한 2개의 별개의 수확에 대해서 결정하였다. 식물당 페퍼의 수 및 지상부 바이오매스를 계면활성제 단독으로 처리된 페퍼 대조군 식물의 수확률 및 바이오 매스에 정규화하였다(표 62).
Figure pct00126
개화기 전에 엽면 분무 적용으로서 할라피뇨 페퍼에 적용된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는 계면활성제 단독 대조군 식물과 비교할 때 식물당 평균 열매 중량의 실질적인 증가, 2Fl.oz/Ac(146.2㎖/헥타르)의 경우 +49% 증가 및 4Fl.oz/Ac(292.3㎖/Ha)의 경우 +40% 증가를 초래하였다. 엽면 분무로서 또한 개화기전에 적용된 Gm.RHPP 폴리펩타이드 처리는 또한 식물당 할라피뇨 페퍼의 증가된 평균 열매 중량을 초래하였데, 계면활성제 단독 대조군 식물로부터 수확된 페퍼와 비교하여 식물 기준으로 측정되는 경우 페퍼의 중량은 +27% 증가하였다.
실시예 42: 스쿼시에 대한 적용 - 수확률 증가
Bt.4Q7Flg22 또는 Gm.RHPP 폴리펩타이드를 함유하는 엽면 처리제를 외인적으로 엽면 처리로서 제1 개화기의 크루크넥 스쿼시(Crookneck 스쿼시)에 적용하였다. Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP 폴리펩타이드를 함유한 엽면 처리제를 스쿼시 식물에 각각 물 에이커당 10갤론의 물의 분무 부피 중에서 2.0Fl.oz/Ac(146.2㎖/헥타르) 또는 3.2Fl.oz/Ac(234㎖/헥타르)의 적용 사용률을 사용하여 0.1% v/v 비이온성 계면활성제(AlligareTM 90)와 함께 적용하였다. 계면활성제 단독 대조군 식물과 비교하여 폴리펩타이드로 처리된 식물 사이의 수확률 비교를 처리당 3 회 반복하여 수행하였다. Bt.4Q7Flg22 또는 Gm.RHPP 폴리펩타이드 처리제가 제공된 엽면 처리된 식물에 대한 수확률을 반복물당 2개의 수확물에 대해서 식물당 스쿼시의 평균 중량(그램)으로서 표 63에 보고하고, 대조군 식물과 비교하여 백분율 변화로 나타내었다. 시험에 대해서 주위 수확률의 50% 이상 또는 50% 미만의 식물당 평균 수확률을 갖는 복제물은 이상점으로 제외시켰다.
스쿼시 식물을 하기와 같이 사양토에서 경작하였다. 0.76미터 폭의 플라스틱 피복된 마운드에 2.5㎝의 구멍을 절단하였는데, 마운드당 2개의 이랑이 있고, 구멍은 각각의 이랑 내에서 0.46m 이격되어 있다. 이랑은 마운드 내에서 엇갈려있었다. 마운드는 1.2미터 이격되어 있다. 3개의 스쿼시 종자를 각각의 구멍에 심고, 식재 14일 이후에 구멍당 단일 식물로 솎았다. 점적 관주법 튜빙을 각각의 마운드 중심에 놓고, 필요한 경우 식물에 물을 주었다.
Figure pct00127
개화기전 단계의 스쿼시 식물에 대한 Bt.4Q7Flg22 또는 Gm.RHPP 폴리펩타이드의 엽면 처리는 모두 수확된 스쿼시 열매의 식물당 평균 31.7그램 또는 계면활성제 단독 대조군 식물과 비교할 때 열매 중량의 +4.4% 변화(표 63)의 증가된 중량을 초래하였다.
실시예 43. Flg22 폴리펩타이드는 케일에서 흰 잎 반점병의 중증도를 감소시킨다
중서부(미주리주 콜럼비아)에서 반복된 가을 계절 케일 시험에서, 매우 습하고 따뜻한 성장 조건은 케일 잎에 흰 잎 반점이 생겼는데, 이는 일반적으로 세르코스포라 브라시콜라(Cercospora brassicicola)에 의해 발생한다. 감염된 케일 식물은 진균 질병 예방을 위한 사전 엽면 치료제가 제공되지 않았다. 질병의 중증도를 평가하기 위해, 점수 기준(1 내지 5 스케일)이 확립되었는데, 여기서 1은 3개 이하의 흰 진균 반점을 갖는 건강한 식물이고, 2는 4개 이상의 반점 및 나뭇잎의 일부가 질병에 영향을 받은 식물이고, 3은 나뭇잎의 대다수가 증상을 나타내고, 질병으로 인해 최대 하나의 잎이 떨어지고, 4는 나뭇잎의 대부분이 증상을 나타내고 2 내지 3개의 잎이 질병으로 인해 떨어지고, 5는 나뭇잎의 대부분이 질병으로 인해 증상이 나타나고 4개 이상의 잎이 떨어진다. 한 사람이 시험 구역 내의 모든 식물에 점수를 매긴 다음, 치료당 6개의 식물의 6개의 반복 블록(치료당 총 36개 식물)과 함께, 표 64의 처리 사이에 질병 점수에 의해 식물을 골고루 분포시켰다. 케일에서의 질병 증상의 개선에 대해서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)를 시험하기 위해서, 치료제를 0.1%v/v의 비이온성 계면활성제(AlligareTM Surface)와 함께 에이커 당 10갤런의 물의 담체 부피로 표 64에 제시된 비율로 엽면 분무로서 적용하였다. 엽면 처리 3주 후, 동일한 질병 중증도 기준을 사용하여 식물을 점수매겼다. 질병 점수의 변화를 각 식물에 대해 계산하였고, 질병 점수의 평균 변화를 치료마다 결정하였다. 질병 중증도를 평가 한 후 4일째에 식물을 수확하고, 수확률을 식물 중량(그램)으로 측정하였다. 시험에 대한 중위 중량의 50% 미만 또는 50% 초과인 외부 값은 데이터 세트에서 제외시켰다.
Figure pct00128
제형화된 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)로 감염된 케일 식물의 엽면 처리는 대조군에 비해 수확률 및 질병 증상의 개선을 초래하였다(표 64). 미처리 대조군은 평균 식물 중량이 14.6g인 반면, 잎 Bt. 4Q7Flg22가 제공된 식물은 평균 식물 중량이 15.1g이고, 질병 점수의 평균 개선이 대조군에 비해 0.5점이었다. 구리 살진균제의 적용은 Bt. 4Q7Flg22와 동일한 정도로 식물 질병 점수를 향상시켰지만, 대조군과 비교하여 수확률은 21%(11.5g) 감소하였다. 구리 살균제와 Bt.4Q7Flg22의 조합물 처리는 식물당 12.4g으로 수확률을 증가시켰지만, 전체 Bt.4Q7Flg22만으로도 시험에서 가장 높은 수확률 및 식물 건강상의 이득을 제공하였다. 결론적으로, Flg22 폴리펩타이드는 채소에서 진균 감염의 진행을 늦추고, 스트레스가 많은 재배 조건에서 수확률을 증가시키는데 사용될 수 있다.
실시예 44: Flg22 폴리펩타이드와 종자 처리제의 호환성을 결정하기 위한 ROS 스크리닝 검정
종자 처리제를 옥수수 잎자루 조직에서 아포플라스틱 반응성 산소 종(ROS)의 생성과의 호환성에 대해 조사하였다. 옥수수에 대한 종자 처리제로서 단독으로 적용될 때 수확률을 증가시키는 것으로 나타난 Flg22 폴리펩타이드(Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226)와의 호환성에 대해 다양한 사업적으로 입수 가능한 종자 처리제를 조사 하였다. ROS 활성도 검정은 상대 광 단위(RLU)를 SpectraMax L 발광 측정기(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 기록한 것을 제외하고는, 실시예 15에 기재된 옥수수 잡종 5828 YX로부터의 옥수수 잎자루 샘플을 사용하여 40분에 시간 기간에 걸쳐서 수행되었다. 다양한 농도의 Bt.4Q7Flg22(0 및 1000μM)를 PPST 2030(박테리아, 바실러스 섭틸리스 5x108cfu/㎖와 바실러스 푸밀리스 5x108cfu/㎖의 조합무), ILEVO(48.4% 플루오피람) 및 PONCHO/VOTiVO(40.3%의 클로티아니딘과 미생물 작용제, 바실루스 피르무스 I-1582의 혼합물)로 구성된 3가지 상업적인 종자 처리와 조합하고, 옥수수 잎자루에서 ROS 반응의 존재에 대해서 시험하였다. 기재된 3가지의 종자 처리제 모두는 각각의 종자 처리에 대한 개별 시편 표지에서 권장되는 종자당 적용 사용률을 사용하여 적용되었다. 다양한 농도의 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 0.90의 R2를 갖는 Flg22의 농도와 RLU 간의 로그 상관 관계가 생성되었다. RLU 값은 4개의 개별 측정치(각각의 플레이트에 대해서 4개의 처리 웰)의 평균이며, 전체 ROS(RLU)의 증가(배경에 대한 배수 증가)를 괄호 안에 표시한다(표 65).
Figure pct00129
RLU에 의해 측정된 ROS 생성은 표 65에 기재된 바와 같이 각각의 종자 처리제와 조합될 때 1μM Bt.4Q7Flg22의 첨가로 증가되었다. 1μM의 Bt.4Q7Flg22를 첨가한 종자 처리제의 1:10 희석에 의한 ROS 생성(RLU 값)은 또한 종자 처리 단독에 대한 배경 RLU 수준 또는 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드가 없는 수준과 비교할 때 증가되었다. 1μM의 Bt.4Q7Flg22와 조합된 희석된 PONCHO/VOTiVO 종자 처리는, 배경에 비해 15배 초과 또는 시편 표지 상의 권고에 따라서 종자당 적용되는 비희석된 PONCHO/VOTiVO 처리에 비해서 2.2배 증가하였다. 따라서, Flg22 폴리펩타이드는 표준 종자 처리 기재와 함께 표지 비율로 조합되는 경우 ROS 분석에 의해 검출될 수 있다. 이러한 Flg22 폴리펩타이드를 특정 종자 처리와 조합하는 경우, 폴리펩타이드 농도 또는 종자 처리 농도의 조정을 고려하여 식물에서 최적의 ROS 반응을 보장할 수 있다. 이것은, 현재 시판되는 다른 종자 처리 패키지의 존재 하에서 식물에 대한 Flg22 폴리펩타이드의 활성을 입증한다.
실시예 45: 토마토에서 ROS 활성도를 증가시키기 위한 Flg22와 FlgII-28 펩타이드의 조합물
별도의 연구에서, 플라젤린 단백질의 구별되는 영역으로부터 유래된 Flg22 및 FlgII-28 폴리펩타이드를 토마토 잎에서 반응의 호환성에 대해 별도로 그리고 조합하여 시험하였다. Flg22 및 FlgII-28은 둘 다 미생물-연관된 분자 패턴(MAMP)이지만, 각각 플라젤린-감지 2(FLS2) 및 플라젤린-감지 3(FLS3) 수용체에 의해 명확하게 인식 될 수 있고(Hind et al., 2016; Nature Plants 2:16128), 상호작용은 식물 종에 따라 다를 수 있다. 몇몇 Flg22 폴리펩타이드(Bt.4Q7Flg22, 서열번호 226; Bt.4Q7Flg22-Syn01, 서열번호 571 및 Ec.Flg22, 서열번호 526)를 토마토에서 ROS 활성도 검정을 사용하여 몇몇 FlgII-28 폴리펩타이드(Ps.토마토FlgII-28, 서열번호 751; A.sp.FlgII-28, 서열번호 375)와 비교하였다.
4mm 디스크를 생성하기 위해 코르크 보어를 사용하여 4주령 식물로부터 토마토 잎을 절개하였다. 면도날의 가장자리를 사용하여 각 디스크를 반으로 자른 다음, 각 디스크 반을 96-웰 플레이트에서 150㎕의 물에 부유시켜 밤새 방치하였다. 다음날, 폴리펩타이드 처리 직전에 각각의 웰로부터 물을 제거하였다. 표 66에 기재된 바와 같은 Flg 폴리펩타이드를 물에 첨가하여 각각의 처리 웰에 첨가하기 전에 루미놀 및 HRP 용액에서 5nM(표 67) 및 100nM(표 68)의 최종 농도가 되도록 하였다. 활성을 유지하기 위해, 다중 동결 및 해동을 피하기 위해 폴리펩타이드를 작은 분취액으로 저장하였다. 작업 농도를 얻기 위한 모든 희석은 초순도 물에서 수행되었다. 폴리펩타이드 용액을 단기 사용의 경우 -20℃, 장기 저장의 경우 -80℃에 저장하였다. RLU 값 및 상대 ROS 활성도(표 67, 표 68)를 4회 측정의 평균으로 보고한다. 상대 광 단위(RLU)를 SpectraMax L 발광 측정기(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 40분의 시간 기간에 걸쳐서 기록한 것을 제외하고는, 실시예 15에 이미 보고된 방법을 사용하여 ROS 활성도 검정을 수행하였다.
Figure pct00130
Figure pct00131
Figure pct00132
표 67 및 표 68의 결과로부터, 슈도모나스 시린개 pv.토마토 DC3000 또는 그램-양성 애뉴리니바실루스 sp. XH2(서열번호 375)로부터 유래 된 FlgII-28로 명명된 플라젤린의 제2 에피토프는, 5nM 및 100nM 농도 둘 다에서 토마토(서열번호 751)에서 면역 반응(예를 들어, ROS 생성)을 유발하기에 충분하다고 결정되었다. 5nM 농도에서, Ps.토마토 FlgII-28은 다른 Flg22 및 FlgII-28 폴리펩타이드와 비교하여 가장 높은 활성도를 갖고, 동일한 농도에서 Bt.4Q7Flg22에 비해 RLU가 거의 31배 증가한 반면, 5nM의 A.spp.FlgII28은 5nM의 Bt.4Q7Flg22에 대해서 동일하게 낮은 ROS 반응을 제공하였다. 그램-음성 에쉐리키아 콜라이로부터의 Flg22 폴리펩타이드(Ec. Flg22; 서열번호 526)는 또한 토마토 잎에 적용될 때 ROS 활성이 증가되었으며, Bt.4Q7Flg22 처리 단독에 비해 RLU 값이 12.9 X였다. Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 폴리펩타이드는 5nM 농도에서 토마토 잎에서 매우 낮은 ROS 반응을 촉발했지만, 100nM 농도에서 높은 반응을 제공하였다. 한편, Ps.토마토 FlgII-28은 시험된 두 농도에서 음성 대조군(물)과 비교하여 강한 ROS 반응을 제공하였다. 따라서, 토마토 잎은 Ps.토마토 FlgII-28 및 Ec.Flg22와 같은 그램-음성 박테리아 플라젤린으로부터 유래된 Flg 폴리펩타이드에 대한 증가된 민감성을 나타낸다. 또한, Syn01Flg22(서열번호 571)로 명명된 Bt.4Q7Flg22의 합성 변이체는 5nM 농도에서 시험될 때 Bt.4Q7Flg22 처리와 비교하여 활성도가 실질적으로 증가하였다(3.5 X).
표 68에 나타낸 바와 같이, 그램 양성(Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226) 및 그램 음성 Ps.토마토 FlgII-28(슈도모나스 시린개 pv. 토마토 DC3000; 서열번호 751)의 조합물은 조합된 엽면 시비로서 사용되어 치료 단독보다 ROS 생성을 증가시키고, 특정 병원성 유기체에 대한 식물 면역력을 향상시킬 수 있다.
실시예 46: 옥수수 및 대두에서 ROS 활성도를 증가시키기 위한 합성 Flg22Syn01 및 Flg-15Syn01 폴리펩타이드
7개의 N-말단 아미노산이 없는 Bt.4Q&Flg22로부터 유래된 Syn01Flg22의 절두된 버전을 생성시켜, 서열 nh2-RINSAKDDAAGLAIA-cooh를 갖는 15개 아미노산 폴리펩타이드를 초래하였다. Bt.4Q7Syn01Flg15(서열번호 752)로 명명된 이러한 폴리펩타이드는 그램 음성 프로테오박테리아 중에서 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드이지만, 그램-양성 단백질 서열에는 없다. 수용체 상호 작용에 필요한 코어 서열인 RINSAKDD는 단축된 폴리펩타이드에서 유지되기 때문에, 15-아미노산 변이체는 식물에서 ROS 생성을 촉발하는데 활성인 것으로 예측되었다. 이를 시험하기 위해, 옥수수(표 69) 및 대두(표 70) 둘 다에 의한 ROS 검정에서 Syn01Flg15를 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22와 비교하였다. 상대 광 단위(RLU)를 SpectraMax L 발광 측정기(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 40분의 시간 기간에 걸쳐서 기록한 것을 제외하고는, 실시예 15에 이미 보고된 방법을 사용하여 ROS 활성도 검정을 수행하였다.
Figure pct00133
옥수수를 사용한 ROS 활성도 검정(표 69)에서, Flg22-Syn01(서열번호 571)은, 10nM에서 0.2X의 감소된 ROS 반응을 갖는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)를 사용한 처리와 비교할 때 1.6X(100nM) 및 0.5X(10nM)의 상대적인 각각의 활성에 의해 나타나는 바와 같이 100nM 및 10nM 농도에서 옥수수 줄기 조직에서 가장 큰 ROS 반응을 가졌다. Syn01Flg22(서열번호 571) 또는 Syn01Flg15(서열번호 752)의 단축된 버전은 또한 10nM에서 0.4X인 더 높은 ROS 반응을 나타내었는데, 이는 동일한 농도에서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)의 상대 ROS 활성도의 2배였다.
Figure pct00134
마찬가지로, 대두를 사용한 ROS 활성도 검정(표 70)에서, Bt.4Q7Flg22-Syn01(서열번호 571)로서 기재된 Bt.4Q7Flg22의 합성 유래된 돌연변이체는 또한 10nM에서 0.04X의 상당히 감소된 ROS 반응을 갖는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)를 사용한 처리와 비교할 때 1.25X(100nM) 및 0.25X(10nM)의 상대적인 각각의 활성에 의해 나타나는 바와 같이 100nM 및 10nM 농도에서 콩 잎 조직에서 가장 큰 ROS 반응을 가졌다. Syn01Flg22 또는 Syn01Flg15의 단축된 버전은 또한 10nM에서 0.17X인 더 높은 ROS 반응을 나타내었는데, 이는 동일한 농도에서 Bt.4Q7Flg22의 상대 ROS 활성도의 4배였다.
전체적으로, Syn01Flg22는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)와 비교하여 옥수수 및 콩 조직 모두에서 시험된 두 농도에서 더 높은 ROS 활성도를 가졌다. 단축된 15-아미노산 폴리펩타이드 Syn01Flg15는 Bt.4Q7Flg22보다 2 내지 4X 더 활성이었고, 10nM에서 22-아미노산 Syn01Flg22보다 약간 덜 활성이었는데, 이는 식물 면역 반응을 유발하기 위한 주요 아미노산이 서열 내에 유지됨을 나타낸다.
실시예 47: Flg22 폴리펩타이드에 대한 ROS 활성도를 증가시키기 위한 화학적 변형
단백질분해에 대한 단백질 안정성을 증가시키고/시키거나 FLS2 수용체에 더 큰 가용성을 초래할 수 있는 더 긴 활성 기간을 촉진시키기 위해서 Flg22 폴리펩타이드에 화학적 변형이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드드 변형은 1) 불리한 조건 하에서 또는 프로테아제의 존재 하에서 폴리펩타이드를 안정화시키거나, 또는 2) 펩타이드에 추가적인 기능 또는 분자 특성을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 안정성 개선을 위한 변형은 폴리펩타이드 고리화 및 N-말단 및 C-말단에서의 변경을 포함한다. 헤드-대-테일 고리화(즉, N-말단 아미노와 C-말단 카복실 말단 사이의 아마이드 결합 형성)는 구조적 변화에 저항하는 단단한 폴리펩타이드 골격을 초래하며, 종종 펩타이드-수용체 결합을 안정화시키고 폴리펩타이드 말단을 엑소프로테아제로부터 보호한다. 대안적으로, 폴리펩타이드 말단의 변형은 중화(C-말단 아마이드화) 및 N-말단 분해 예방(N-말단 아세틸화)을 통해서 폴리펩타이드를 안정화시킬 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 분자의 접합을 통해 증가된 폴리펩타이드드 용해도 및 안정성이 또한 부여될 수 있다.
Flg22 폴리펩타이드를 안정화시키는데 사용되는 이러한 변형은 페길화, 고리화 및 아마이드화/아세틸화를 포함하며, 이들 모두는 표 71에 기재되어 있다. 폴리펩타이드를 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결함으로써 페길화를 사용한 폴리펩타이드의 안정화를 수행한다. 일단 폴리펩타이드에 연결되면, 각각의 PEG 소단위는 2 내지 3개의 물 분자와 밀접하게 회합되고, 이어서 이것은 폴리펩타이드의 용해도를 증가시키고, 전체 구조를 증가시켜서 단백질분해에 덜 민감하고 식물 표면에서 막 FLS2 수용체에 보다 접근하기 쉽게 하는 기능을 한다. Flg 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키기 위해 고리화가 또한 사용될 수 있다. 폴리펩타이드의 안정화는 또한 이들 변형이 네이티브 단백질과 더 근접한 모방을 생성하여 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 아마이드화를 통해 N-말단 아세틸화 및 C-말단을 사용하여 획득될 수 있다.
Figure pct00135
Syn05Flg22-Syn05(J36), Syn05Flg22-PEG(J37) 및 Syn05Flg22-Cyc를 비롯한 표 71에 기재된 바와 같은 전문화되고 변형된 폴리펩타이드는 미주리 대학교 몰레큘러 인터랙션즈 코어(University of Missouri Molecular Interactions Core)(미국 미주리주 콜럼비아 소재)에 의해 합성 및 건조 분말로 동결 건조되었고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 각각 정확한 MW 및 원하는 순도(>70%)인 것으로 결정되었다. Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Bt.4Q7Flg22 Mod-1(서열번호 226; J41)을 비롯한 표준 합성 폴리펩타이드를 Genscript(미국 뉴저지주 피케이타웨이 소재)로부터 입수하였다. 모든 동결 건조된 폴리펩타이드를 초순도 물에 10mM 농도로 재현탁시키고, 대두 및 옥수수 ROS 검정에서 실시예 15에 이미 기재된 바와 같이 초순도 물 중에 목적하는 농도로 연속 희석시켰다.
대두 샘플의 경우, 완전히 팽창된 삼출엽 잎을 V1 내지 V3기의 식물(품종 Morsoy)로부터 제거하였다. 잎 디스크(4mm)를 코르크 보어를 사용하여 제거한 후, 이미 기재된 ROS 검정을 수행하기 전에 밤새 150㎕의 물에 축을 따라 아래로 부유시켰다.
옥수수 샘플의 경우, V1 내지 V4기의 옥수수 식물(베크 잡종 5828 YX)을 상기에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이어서, 1mm로 절제된 잎 조각을 150uL의 물에 밤새 부유시켰다.
상대 광 단위(RLU)를 SpectraMax L 발광 측정기(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 40분에 걸쳐서 기록한 것을 제외하고는, 실시예 15에 이미 보고된 방법을 사용하여 ROS 활성도 검정을 수행하였다. 상대 광 단위(RLU)를 먼저 시험된 각 농도에 대해 동역학 시간 기간를 사용하여 시간에 따라 플로팅한 다음, 곡선 하 적분에 의해서 생성된 총 RLU 값을 계산하였다. 이어서, 평균 총 RLU(처리 당 n = 4개 샘플)를 대두(표 72 및 표 73) 및 옥수수(표 74)에 대한 각각의 폴리펩타이드에 대해서, 폴리펩타이드 농도에 대해 그래프로 나타내었다.
최적의 피트 로그 또는 선형 회귀(R> 0.80)가 각 처리에 대한 데이터에 적합하였다. 가장 적합한 회귀를사용하여, 15,000의 총 RLU(옥수수) 또는 50,000의 총 RLU(대두)의 총 RLU 생성에 도달하는 데 필요한 폴리펩타이드 농도를 각각의 폴리펩타이드에 대해서 계산하고, 각각의 데이터 세트 내에서 대조군 처리와 비교하여 활성도 %를 비교하였다(표 72 내지 74).
Figure pct00136
Bt.4Q7Flg22S Mod-1(서열번호 226)에 대해 50,000 RLU의 RLU 산출을 초래하기 위해 필요한 Flg22 폴리펩타이드 농도는, 수확률 이득을 생성하고, 대두 식물에 식물 보호 품질을 부여하는 것으로 나타난 현재 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)보다 낮았다. 이는 N-말단 아세틸화 및/또는 C-말단 아마이드화에 의한 Flg22의 변형이 FLS2 수용체에 대한 폴리펩타이드 결합을 방해하지 않고, 변형은 Bt.4Q7Flg22에 대한 Bt.4Q7Flg22S Mod-1의 활성의 +6% 증가에 의해서 나타난 바와 같이 Flg22의 보다 활성이고/이거나 안정적인 버전을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다(표 72).
미주리 대학교 몰레큘러 인터랙션즈 코어(미국 미주리주 소재)에서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 비병형된 폴리펩타이드와 비교하여 단일 아미노산 치환(A16P)을 갖는 신규 폴리펩타이드를 생성시켜, N-말단 페길화 Syn05Flg22-PEG(서열번호 578) 및 헤드-대-테일 고리화 Syn05Flg22-Cyc(서열번호 578)에 의해 추가로 변형될 수 있는 Syn05Flg22(서열번호 578) 폴리펩타이드를 생성하였다. 콩 ROS 검정을 수행하여 Flg22 폴리펩타이드에 대한 이들 2개의 추가 변형, 즉 N-말단 페길화 및 헤드-대-테일 고리화의 효과를 평가하고, 표 73에 결과를 나타내었다.
Figure pct00137
Syn05Flg22(서열번호 578)의 2가지 변형된 버전에 대한 폴리펩타이드의 상대적인 활성을 비교하기 위한 대두 ROS 분석에서, 페길화된 폴리펩타이드 Syn05Flg22-PEG(서열번호 578)는 총 50,000 RLU를 달성하기 위해서 실질적으로 적은 양의 폴리펩타이드를 필요로 하였는데, 이는 비-페길화된 버전 또는 Syn05Flg22(서열번호 578)과 비교할 때 +38%의 활성도 증가를 초래하였다. 펩타이드의 N-말단의 페길화는 폴리펩타이드의 친수성을 증가시키고 FLS2 수용체의 펩타이드-결합 포켓에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 그러나, Cy05Flg22-Cyc(서열번호 578)의 고리화된 버전은, 대두 ROS 검정에서 50,000 RLU의 총 RLU 생성에 도달하기 위해서 Syn05Flg22의 비고리화된 버전에 비해 ROS 활성도 검정에서 제공되는 더 많은 폴리펩타이드(+57.1nM 이상)가 필요하였다. 이는, Flg22 폴리펩타이드의 고리화(Syn05Bt.4Q7Flg22-Cyc)가 FLS2 수용체에 대한 변경된 결합을 갖는 보다 강성인 폴리펩타이드 골격을 초래할 수 있으며, 이에 따라 보다 고리화된 펩타이드가 동등한 ROS 반응에 도달할 필요가 있다. 그러나, 환경에서 고리화된 폴리펩타이드의 증가된 안정성은 약간의 활성 손실을 보상할 수 있다.
Figure pct00138
옥수수 ROS 분석에서, Syn05Flg22-PEG의 페길화된 버전은 총 15,000 RLU를 달성하기 위해서 실질적으로 더 적은 양(거의 5nM 더 적음)의 폴리펩타이드를 필요로 하였는데, 이는 비-페길화된 버전 또는 Syn05Flg22와 비교할 때 +30%의 활성도 증가를 초래하였다(표 74).
N-말단 아세틸화, N-말단 페길화, C-말단 아마이드화, 및/또는 헤드-대-테일 고리화에 의한 Flg22(Bt) 또는 Syn05Flg22(Bt) 폴리펩타이드의 변형은, 옥수수 및 콩 조직을 사용한 ROS 검정을 통해서 측정되는 바와 같이, 활성도를 보유한 펩타이드를 생성시킨다. 이러한 폴리펩타이드를 사용하여 농업적 사용(엽면 시비, 종자 처리, 고랑 내 적용, 이식에서의 적용 또는 트렁크 주입에 의해서)을 위한 추가로 안정화된 Syn05Flg22(서열번호 578) 유래된 폴리펩타이드 변이체를 전달할 수 있다. Syn05Flg22-Cyc의 고리화는 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있지만, 합성 폴리펩타이드의 막 FLS2 수용체에 대한 친화도에 영향을 미침으로써 ROS 활성을 손상시킨다.
실시예 48. Flg22 폴리펩타이드와의 아주반트 호환성
Flg22 폴리펩타이드를 사용한 제품 제형은 일반적으로 항미생물 증식억제 보존제, 예컨대, Proxel 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 유형의 아주반트와 조합으로 사용될 때 Flg22 반응성에 대한 용액에서의 효과를 결정하기 위해서 이러한 유형의 아주반트의 호환성을 ROS 활성 검정을 사용하여 시험하였다. 일반적으로 Proxel은 박테리아, 효모 및 진균의 부패로부터 제품을 보호하는 많은 농업 기반 제품을 보존하기위한 광범위한 살생물제이다. 일반적으로 계면활성제는 성능 향상을 위해 많은 농화학 제품이 식물에 침투하는 것을 개선하기 위해서 농업 제형에 일반적으로 사용된다. 이 연구에서, 5종의 상이한 Proxel 및 2종의 상이한 비이온성 계면활성제를 대두 잎에서 ROS 활성도 검정을 사용하여 ROS 반응을 생성시키는 효과를 위해서 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)와 조합된 제형으로 시험하였다. 상이한 Proxel 제형(론자사)을 하기 표 75에 기재한다. 이들 Proxel 제형을 제조사(론자사)에 의해 권고되는 다양한 표지 비율로 40μM Flg22 폴리펩타이드와 혼합하고, 이어서 100nM의 최종 폴리펩타이드 농도 및 표 75에 제시된 Proxel 농도로 ROS 검정으로 희석하였다. 시험된 비이온성 계면활성제를 개별 분포기 또는 제조사에 의해 권고되는 다양한 표지 비율로 ROS 검정에 제공하였다. ROS 검정을 수행한 후 획득된 평균 4개의 샘플 측정치 RLU 값을 SpectraMax L 발광 측정기(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 40분의 시간 기간에 걸쳐서 기록한 것을 제외하고는, 실시예 15에 이미 기재된 바와 같이 대두 잎 디스크를 사용하여 수집하였다. . 이러한 4개의 RLU 값의 평균을 표 76에 보고한다.
Figure pct00139
Figure pct00140
표 76에 기재된 바와 같은 모든 Proxel 보존제 처리제는, Proxel 보존제가 없는 Bt.4Q7Flg2 폴리펩타이드 대조군과 비교할 때(모의 처리보다 17.0X의 배수 증가) 높은 RLU 값(모의 처리보다 19.0 내지 28.3X의 배수 증가)에 의해서 나타나는 바와 같이 Flg22 폴리펩타이드 (Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226)와 함께 제형에서 사용되는 경우 호환성이었다.
Figure pct00141
표 77에 기재된 바와 같은 모든 계면활성제(비이온성) 처리는 에이커당 10갤론의 분무율로 물 중에 적용되는 조성물 1(Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226; 16.7μM)의 4.0Fl oz/Ac 사용률에 동등한 폴리펩타이드 농도인 52.2nM Flg22 폴리펩타이드(Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226)를 사용하여 제시된 농도로 혼합되는 경우 호환성이었다. 모의 처리된 대조군에 대한 ROS 생산의 배수 증가는, 계면활성제가 없는 Bt.4Q7Flg2 폴리펩타이드 대조군(대조군보다 6.8X)과, 0.25%v/v 또는 0.5%v/v의 처리 용액으로 적용된 비이온성 계면활성제 NIS90:10를 갖는 Bt.4Q7Flg2(5.8 내지 6.4X) 사이에서 대등하였거나, 또는 0.025%v/v 또는 0.1%v/v의 처리 용액이 적용된 Silwet-L77를 갖는 Bt.4Q7Flg2의 경우에는 약간 더 낮았다(2.8 내지 3.2X). 비이온성 유기규소 계면활성제인 Silwet-L77(헬레나사)은 수성 분무에 사용될 때 습윤 및 확산 특성이 향상된 공중합체로 제형화된다. NIS90:10(프리시젼 래보러토리즈)은 저발포성 비이온성 계 활성제로 분무 용액 커버리지 및 목표 잎 표면의 침투를 개선시킴으로써 작물 보호 및 성능을 향상시킨다. Bt.4Q7Flg22와 조합된 비이온성 계면활성제 둘 다는 표적 잎 조직에서 Flg22 폴리펩타이드에 반응하여 ROS 생성을 허용하였고(표 77), 따라서, 경작지에서 Flg22 폴리펩타이드 엽면 시비와 호환성이다.
실시예 49: 발효 방법을 사용한 Bt. 4Q7Flg22의 생산 및 감자, 렌틸콩 및 감귤 나무에서의 질병 예방 시험을 위한 엔테로카이나제 절단에 의한 활성화
폴리펩타이드를 안정화시키고, 대안적인 생산 방법, 즉, 박테리아 발효를 위한 활성도를 향상시키기 위한 확인으로 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)를 제공하였다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)에 융합된 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제로부터의 amyQ 분비 신호 및 기재된 바와 같은 엔테로카이나제 절단 태그 서열과 조합하였다: amyQ 분비 신호(바실루스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제) GST (쉬스토소마 자포니컴) _링커_엔테로카이나제 절단 부위_Bt.4Q7Flg22_정지 코돈(표 78).
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
표 78, 79 및 80의 서열을 암피실린 선택 마커 및 이.콜라이에서 복제될 수 있는 클로람페니콜(Cm) 또는 테트라사이클린(Tet) 선택 마커를 함유하는 표준 클로닝 벡터 내에서 클로닝하고, 이어서 생산 목적을 위해서 바실루스 섭틸리스 균주 K08(생산 균주 코드: H101=amyQ-GST-EK-BtFlg22, H114=amyQ-GST-EK-BtFlg22-Syn01, 및 H117=amyQ-티오닌-유사)로 옮겼다. 10㎍/㎖의 Cm 또는 Tet를 함유하는 멸균 2XYT 배지(16g Bacto tryptone, 10g 효모 추출물, 및 리터당 5g NaCl; pH 7.0으로 조정) 중에서 밤새 배양을 시작함으로써 발효 생산을 수행하였고, 이어서 다음 날 10㎍/㎖ Cm 또는 Tet를 함유하는 새로운 2XYT 배지 중에 희석시켰다. 50㎖(진탕 플라스크) 또는 3 L(유리 생물반응기 용기) 배지 부피를 사용하여 30°C의 일정한 온도로 생산을 수행하였다. 큰 규모 확대 부피는 5L 대 1000L+(최대 30,000L 부피 포함)를 포함할 수 있다. 박테리아 성장을, 배양물이 0.6 내지 1.0의 광학 밀도에 도달할 때까지 모니터링하고, 그 후 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1 내지 1.0mM의 최종 농도로 첨가하여 GST-Bt.4Q7Flg22 융합 단백질의 생산을 유도하였다. 유도된 생산은 배양 배지에서 추가 12 내지 24시간 동안 계속하여 성장 배지로 분비되는 융합 단백질을 생성하였다. 분비 시, the amyQ 분비 태그는 융합 단백질로부터 절단된다. 이어서 배양물을 5000 x g로 20분 동안 원심분리하고, 0.22μm 보틀-탑 필터를 통해서 여과시켜 박테리아 세포를 제거하였다. 이어서, 멸균 여과액을 수집하고, 스클레로티니아 질병 예방 시험에서 렌틸콩 및 감자 식물에 대한 엽면 처리제(실시예 50) 또는 HLB병 증상의 근절 및 예방을 위한 감귤라무의 트렁크 주입(실시예 51)로서 사용하였다.
발효 후, 2가지 버전의 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 폴리펩타이드 생성물을 감자 및 렌틸콩 질병 예방 시험에 사용하였으며, 하나는 엔테로카이나제 처리가 없었고(H101 여과액, 비활성화) 및 다른 하나는 엔테로카이나제를 사용한 활성화로 Flg22 폴리펩타이드에 융합된 GST 태그를 제거하였다(H101 여과액, EK-활성화). Bt.4Q7Flg22를 활성화시키기 위해, 32U(단위)의 엔테로카이나제(EK: 엔테로카이나제 경쇄; 뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England BioLabs, Inc), 제품번호 P8070)를 1㎖의 H101 여과액당 첨가하고, GST-EK 절단 부위로부터의 Bt.4Q7Flg22의 효소적 방출을 위해서 30℃에서 2내지 3시간 동안 인큐베이션시켜 22개의 아미노산 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 포함하는 활성화 및 방출된 생성물을 초래하였다. 감귤 나무 주입 시험의 경우, 1㎖ 여과액당 0.8U 엔테로카이나제, 경쇄(뉴 잉글랜드 바이오랩스사, 제품 번호 P8070)를 첨가하고, Flg22 폴리펩타이드의 효소적 방출을 위해서 3시간 동안 30℃에서 인큐베이션시켜 H101 여과액 및 H114 여과액을 EK-활성화시켰다. GST 태그 없이 생산된 티오닌-유사펩타이드의 방출을 위해서는 활성화 처리가 필요하지 않았다.
실시예 50: Bt. 4Q7Flg22 폴리펩타이드로의 엽면 사전-처리는 스클레로티니아 줄기 썩음(흰곰팡이)병으로부터의 렌틸콩 및 감자 식물을 보호한다
Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)의 처리 적용을 스클레로티니아 스클레로토리엄(Sclerotinia sclerotorium) 균주 MT07(흰곰팡이)로의 질병 감염 및 진행에 대한 렌틸콩 및 감자 식물의 보호에 대해서 조사하였다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 3개의 상이한 버전을 질병 평가 연구로 조사하였다. 인산나트륨 완충제, pH 5.7 중의 제형화된 Bt.4Q7Flg22(100μM) 및 기재된 바와 같은 발효 방법(실시예 49)을 사용하여 생산되고, Flg22를 엔테로카이나제(EK)로 활성화시키거나 활성화시키지 않고 제공되고, H101 여과액으로 지칭된 Bt.4Q7Flg22의 2가지의 상이한 버전.
3가지 버전의 폴리펩타이드를 렌틸콩 및 감자 식물에서의 질병 보호 검정에 사용하기 전에, 실시예 15에 이미 기재된 방법을 사용하여 옥수수 잎자루 조직을 사용하여 ROS 활성도 검정을 수행하여 특히 EK를 사용하여 Bt.4Q7Flg22 H101 여과액이 활성화되었음을 보장하였다. 엔테로카이나제(EK = 8U/㎖ 여과액) 활성화를 사용하지 않거나 사용한 H101 Bt.4Q7Flg22 여과액을 합성 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)와 비교하였는데, 이것을 사용하여 일련의 농도 비교를 사용하여 발효 절차를 사용하여 생성된 H101 여과액 중의 Flg22 농도를 예측하였다.
Figure pct00145
EK 활성화로 또는 EK 활성화 없이 제공된 Bt.4Q7Flg22의 발효 생산된 H101 여과액은 모두 대조군(0nM Bt.4Q7Flg22)보다 더 높은 ROS 활성(RLU 값)을 초래하였다. ROS 검정에서 옥수수에 제공된 EK 처리된 H101 Bt.4Q7Flg22 여과액(0.1% v/v)은 임의의 Flg22 폴리펩타이드가 없는 대조군 처리와 비교할 때 RLU 값의 3.0X 증가를 초래하였고, ROS 반응은 25nM의 농도로 제공된 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)보다 더 높았고; 따라서, 비희석된 EK-활성화된 여과액에서 예측된 Bt.4Q7Flg22 활성도는 25μM 이상이었다. EK 없이 제공된 Bt.4Q7Flg22 처리제의 발효 생산된 H101 여과액은 음성 대조군 처리제에 비해서 ROS 활성도(2.0X RLU)를 여전히 가졌지만, EK 처리된 Bt.4Q7Flg22의 H101 여과액과 비교할 때 RLU 값 갑에서 더 낮은 증가가 인지되었다. H101 여과액이 ROS 검정에서 활성도를 갖는 것을 확인한 후(표 81), 그것을 감자 및 렌틸콩에서 질병 보호 연구로 평가하였다.
Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 다양한 제형을 렌틸콩 및 감자 식물에 엽면 사전-처리로서 식물에게 스클레로티니아 스클레로토리엄 진균을 접종하기 48시간 전에 제공하였는데, 이것은 스클레로티니아 진균(흰곰팡이)으로의 감염으로부터 식물을 처리 및 보호하는데 효과적인 살진균제(Endura, 활성 성분 70% 보스칼리드)와 조합하여 또는 살균제 없이 제공하였다. Bt.4Q7Flg22 제형을 작물-질병 모델(몬타나 주립 대학교, 익스텐션 서비스즈 크롭 프로텍션(Montana State University, Extension Services Crop Protection))을 사용하여 시험하여 질병에 대한 예방 및 보호 및 증상의 발달에 대한 엽면 사전-처리 각각의 효과를 조사하였다. 50psi로 브러시에 압력을 산출하도록 설정된 조절되는 공기 압축기에 연결된 에어 브러시를 사용하여 수 대조군을 비롯한 모든 처리를 렌틸콩 및 감자 식물에 적용하였다. 사전-처리 후, 균사체 측면이 식물 줄기에 닿도록 놓인 균사체 플러그(균사체로 덮인 한천 플러그)를 사용하여 스클레로티니아 스클레로토리엄을 식물에 접종하고, 정해진 시간 동안 가습(100%) 챔버에 두었다.
렌틸콩
렌틸콩(품종 Pennel) 식물을 포트당 하나의 식물이 있는 4'4' 포트 내에서 1:1 초탄 대 진주암의 혼합물로 이루어진 무토양 매질에서 성장 조건(300 내지 400μ㏖m-2s-1(광자), 13/11 광/일 주기 동안 및 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위) 하의 제어된 성장 챔버에서 24일 동안 재배하였다. 질병 연구는 6개의 상이한 엽면 처리 각각에 대해 5개의 렌틸콩 식물을 처리당 6개의 반복 식물로, 표 35에 기재된 바와 같이 엽면 처리당 총 30개의 식물을 포함하였다. 사전-처리를 위해서 사용된 엽면 처리 모두를 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACE; 알리게어사(Alligare, LLC))를 첨가하여 0.1%(v/v)의 최종 농도로 또는 알킬폴리옥시에틸렌, 글리콜 유도체의 농도로 적용하였다. 제형화 및 발효-유래된 생산으로부터의 Bt.4Q7Flg22 처리 각각은 0.1%(v/v)의 적용 사용률 또는 300㎕의 생성물 대 300㎖의 물로 제공되었고, 동등한 수의 분무로 각각의 식물에 제공하여 처리당 30개의 식물 모두에 대해 8㎖의 각각의 처리 적용을 사용하여, 나뭇잎을 완전히 덮었다. Endura 살진균제 사전-처리를 11Fl.oz/Ac(803.8㎖/Ha)의 동등한 적용 사용률로 그 다음 시편 표지 상의 적용 설명서에 따라서 적용하였다. 처리를 완전 무작위 블록 설계를 사용하여 무작위화하였다. 사전-처리 대략 48시간 후, 균사체 측면이 식물 줄기에 닿도록 놓인 균사체 플러그(균사체로 덮인 한천 플러그)를 사용하여 몬타나에서 국지적으로 단리된 스클레로티니아 스클레로토리엄 균주를 식물에 접종하였다. 이어서 렌틸콩 식물을 가습(100%) 챔버에 72시간 기간 동안 넣었다. 접종 11일 후 질병 증상을 평가하고, 점수 매기고, 평균 신선 중량(각각의 반복물의 총 중량 - 그램)을 수집하였다(표 82). 식물을 대략 3주 동안 건조시키고, 이어서 건조 중량을 수집하였다(반복물당 총 중량 - 그램)(표 82).
질병 점수(질병 점수 스케일 0 내지 7) 및 신선 중량 및 건조 중량(그램)을 5개 식물의 각각의 반복물에 대해서 수집하고, 식물의 총 수(n = 30)에 대해서 평균내었다. 질병 점수를 0 내지 7의 스케일로 순위매겼는데, 0의 점수는 질병이 없음과 동일하고, 10의 점수는 모든 식물이 생존하지 않은 순위였다(표 82).
Figure pct00146
제형화된 Bt.4Q7Flg22의 엽면 시비를 Endura 살진균제, Bt.4Q7Flg22와 조합된 Endura 살진균제, 및 표 82에 이미 기재된 바와 같이 EK 활성화된 발효 반응 및 EK 활성화되지 않은 발효 반응으로부터 생산된 Flg22 폴리펩타이드와 함께 제공된 2개의 Bt.4Q7Flg22 처리와 비교하였다. 작물-질병 모델에서 엽면 처리 모두를 서로 그리고 수 대조군 처리된 식물과 비교하였고, 접종 11일 후에 질병 증상의 외관에 대해서 평가하였다. 각각의 식물을 0 내지 7의 질병 점수에 배정하였다. 총 신선 중량 및 건조 중량(그램)을 또한 식물당 결정하였다.
스클레로티니아 스클레로티엄(Sclerotinia sclerotium)에 대해 상업적으로 입수 가능한 처리제인 Endura 살균제는 질병 점수 0.50로 모든 엽면 처리제에 비해서 렌틸콩에서 질병 증상이 가장 적게 발생하는 반면 수처리(대조군)는 2.83의 질병 순위 점수를 초래하였다. 렌틸콩 식물에 대한 제형화된 Bt.4Q7Flg22 처리제 엽면 시비는, 수 대조군 처리가 제공된 식물에 비해서 1.33의 질병 점수(p 값 = 0.0972)로 스클레로티니아에 대한 증가된 저항성을 초래하였다. 수 대조군으로 처리된 식물과 비교할 때 느린 성장을 초래한 Endura 살진균제 처리와 달리, 제형화된 Bt.4Q7Flg22 처리는 초기 증상 발달 동안 계속적인 활력적인 성장을 초래하였다. 제형화된 Bt.4Q7Flg22로의 사전-처리가 제공된 렌틸콩 식물은 Endura 살진균제 단독(2.89g) 또는 수 대조군(4.52g)으로 처리된 식물에 비해서 식물당 5.44그램의 평균 신선 중량을 가졌다. Endura 살진균제와 제형화된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 조합물 처리는, 수 대조군으로 처리된 식물에 비해서 1.0(p 값 = 0.0524)의 질병 점수로, 증상 발달로부터 렌틸콩 식물의 보호를 추가로 증가시켰다. 제형화된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드로의 사전-처리가 제공된 식물에 대한 식물 중량(신선 및 건조)은, 수 대조군 또는 Endura 살진균제 단독이 제공된 식물로부터의 신선 또는 건조 중량보다 더 컸다. 발효 유래된 생성물(비-EK 활성화 및 EK 활성화)로부터 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드는 2.17의 질병 점수의 순위로 질병 증상이 동등하였는데, 이것은 물 단독 대조군 적용으로 처리된 식물의 질병 점수보다 더 낮은 것이었다. 그러나, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 EK-활성화된 버전으로 처리된 식물당 신선 중량은 수 처리된 식물과 비교할 때 6.11그램(p 값 = 0.0266)의 유의하게 증가된 신선 중량을 가졌다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드의 EK-활성화 버전은 또한 표 82의 다른 처리 모두에 비해서 전체적으로 가장 높은 신선 중량 및 건조 중량을 가졌다. 본 연구의 다른 유의한 발견은, 렌틸콩 식물의 제형화된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 사전-처리가 살진균제-유도된 손상으로부터 렌틸콩을 보호하였다는 것이었다. Endura 살진균제가 제공된 식물의 평균 신선 중량은 2.89g인 반면, 제형화된 Bt.4Q7Flg22 처리는 5.44g(p 값 = 2.645x10-05)이었다. 엔테로카이나제(EK) 효소를 함유하는 발효 생산된 Bt.4Q7Flg22를 사용하여 이미 기재된 바와 같이 GST-EK-Bt.4Q7Flg22로부터 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 절단하였다. 렌틸콩에 제공된 이러한 Bt.4Q7Flg22 여과액 처리는 Flg22 폴리펩타이드의 활성도를 증가시켰고, 따라서 수 처리된 대조군 식물과 비교할 때 감염 기간 동안 유의하게 향상된 식물 성장을 초래하였다(p 값 = 1.180 x 10-05). 비활성화된 EK 또는 GST-EK-Bt.4Q7Flg22 또는 비-절단된 Bt.4Q7Flg22 여과액은 수 대조군 단독 처리가 제공된 식물에 비해서 식물 성장을 증가시키지 않았다(p 값 = 0.9852).
감자
종자 감자(품종: Russet Burbank)를 눈 싹이 돌출된 2㎝ 감자 절단부로부터 절단부가 아래로 향하게 심고(포트 당 1개의 섹션), 10x10㎝ 포트 내에서 1:1 초탄 대 진주암의 혼합물로 이루어진 무토양 매질에 대략 7 내지 8㎝ 깊이로 심었다. 감자를 포트당 하나의 식물로 대략 300 내지 400μ㏖m-2s-1(광자)가 제공되는 표준 조건 하에서 13/11 광/일 주기 동안 및 21℃ 낮/15℃ 밤 온도 범위 하의 제어된 성장 챔버에서 19일 동안 재배하였다. 식재 19일 후, 감자 식물을 표 36에 기재된 바와 같이 엽면 시비로 사전 처리하였다. 질병 연구는 6개의 상이한 엽면 처리 각각에 대해 5개의 감자 식물을 처리당 6개의 반복 식물로, 표 83에 기재된 바와 같이 엽면 처리당 총 30개의 식물을 포함하였다. 사전-처리를 위해서 사용된 엽면 처리 모두를 비이온성 계면활성제(ALLIGARE SURFACE; 알리게어사)를 첨가하여 0.1%(v/v)의 최종 농도로 또는 알킬폴리옥시에틸렌, 글리콜 유도체의 농도로 엽면 적용하였다. 제형화 및 발효-유래된 생산으로부터의 Bt.4Q7Flg22 처리 각각은 0.1%(v/v)의 적용 사용률 또는 300㎕의 생성물 대 300㎖의 물로 제공되었고, 동등한 수의 분무로 각각의 식물에 제공하여 처리당 30개의 식물 모두에 대해 15㎖의 각각의 처리 적용을 사용하여, 나뭇잎을 완전히 덮었다. Endura 살진균제 사전-처리를 11Fl.oz/Ac(803.8㎖/Ha)의 동등한 적용 사용률로 그 다음 시편 표지 상의 적용 설명서에 따라서 적용하였다. 처리를 완전 무작위 블록 설계를 사용하여 무작위화하였다. 사전-처리 대략 48시간 후, 균사체 측면이 식물 줄기에 닿도록 놓인 균사체 플러그(균사체로 덮인 한천 플러그)를 사용하여 스클레로티니아 스클레로토리엄을 식물에 접종하고, 192시간 시간 동안 가습 챔버(100%) 챔버에 두었다. 접종 16일 후 질병 증상을 평가하고, 점수 매기고, 평균 줄기 신선 중량(총 줄기 중량 - 그램)을 수집하였다(표 83). 식물을 12일 동안 건조시키고, 어어서 건조 중량을 보고하였다(총 줄기 중량 - 그램)(표 83).
48시간 후, 각각의 식물 근처의 토양에 위치된 균사체 플러그를 감자 식물에 접종하고, 가습 미스팅 챔버에 넣었다. 처리를 무작위 블록 설계를 사용하여 무작위화하였다. 질병 점수(점수 스케일 0 내지 6). 줄기 신선 중량 및 건조 중량(그램)을 또한 각각의 식물로부터 수집하고, 이어서 식물의 총 수(n = 30)에 대해서 평균내었다. 식물을 수확 대략 12일 후에 완전히 건조시킨 후 줄기 건조 중량을 취하였다. 초기 접종 16일 후에 질병 점수를 평가하였다. 질병 점수를 0 내지 6의 스케일로 순위매겼는데, 0의 점수는 질병이 없음과 동일하고, 6의 점수는 모든 식물이 생존하지 않은 순위였다.
Figure pct00147
제형화된 Bt.4Q7Flg22 및 발효 생성물(H101 여과액)로부터 유래된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드를 사용한 엽면 사전-처리 적용을 Endura 살진균제 및 수 대조군 처리가 제공된 감자 식물 상의 질병 증상과 비교하였다. 감자 식물에 대한 사전-처리로서 제공된 제형화된 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)의 엽면 시비는 수 대조군(질병 점수 = 2.83)이 제공된 식물과 비교할 때 1.83의 질병 점수를 초래하였다. Endura 살진균제로의 사전-처리가 제공된 식물은 수 대조군으로 처리된 식물에 비해서 0.50(p 값 = 0.0045)의 질병 점수로 가장 낮은 질병 증상을 가졌다. 제형화된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 사전-처리는, 여과액(발효 생성물)으로 제공된 엔테로카이나제 활성화된 Bt.4Q7Flg22(H101 EK-활성화)와 유사한 평균 질병 점수를 갖는 식물을 초래하였는데, 둘 모두 1.83의 질병 점수를 가졌다. 식물에 제공된 비-활성화된 EK 또는 GST-EK-Bt.4Q7Flg22 또는 비-절단된 Flg22 여과액(H101 비-활성화)은 2.33의 점수를 가졌고, 수 대조군으로 처리된 식물의 질병 점수와 상당히 상이하지는 않았다(p 값 = 0.4835). 그러나, EK-활성화된 Bt.4Q7Flg22 여과액을 사용한 사전-처리가 제공된 감자 식물은, 모든 처리에 대해서 식물당 증가된 평균 줄기 신선 중량 및 건조 중량을 초래하였는데, 수 대조군 사전-처리가 제공된 식물과 비교할 때 식물당 줄기 신선 중량은 대략 20g 증가하였고, 줄기 건조 중량은 거의 6g 증가하였다. 제형화된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드가 제공된 식물 모두는, 물 단독 대조군 적용이 제공된 식물과 비교할 때 식물 기준으로 측정되는 경우 증가된 줄기 신선 중량 및 건조 중량을 가졌다.
실시예 51: Flg22 및 항-미생물 폴리펩타이드를 사용한 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 감염의 치료
Bt.4Q7Flg22 제형을 트렁크 주입 처리에 의해서 두 발렌시아 오렌지(시트러스 시넨시스) 및 루비 레드 자몽(시트러스 x 파라디시) 나무에 적용하였다. 본 연구는 플로리다 중부(오키초비 카운티)에 위치한 상업적인 과수원에서 수행하였다. 1X 저 비율(0.55마이크로몰의 펩타이드; 체관부에서 0.138μM의 예측된 농도) 및 10X 고비율(5.5마이크로몰의 펩타이드; 체관부에서 1.38μM의 예측된 농도)을 사용하여 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드(서열번호 226)를 사용한 주입 처리를 미처리 대조군 나무와 비교하였다. 처리당 10그루의 자몽 나무(4년생)를 사용한 무작위화 완전 블록 설계를 사용하여 주입 처리를 설정하였다. 잎의 출현에서 잎이 완전 크기로 커질 때까지의 성장기에, 제1 플러시로 4월(2017년)에 주입을 제공하였다. 자몽 나무의 주입을 저압 주입 장치인 BRANDTENTREE(BRANDT)를 사용하여 수행하였다. 자몽 나무 각각으로부터의 잎을 주입시(0일), 주입 후 21일 및 56일에 샘플링하였다. 나무당 총 6개의 잎 샘플을 선택하여 잎 연령, 위치 및 가시적인 증상의 존재와 관련하여 나무 상의 잎의 집단을 나타내었다. 각각의 주맥을 잎새로부터 분리하고, 새로운 멸균 면도날을 사용하여 작은 조각으로 즉시 절단하였다. 이어서 각각의 나무로부터의 잎 샘플을 개별 튜브에 넣고, 그 다음 추가 가공시까지 -80℃의 동결기에 저장하였다. 이들 잎에 대한 DNA 추출 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 또는 정량적 PCR(qPCR) 분석은 서던 가든즈 시트러스(Southern Gardens Citrus)(미국 플로리다주 클루이스톤 소재)에서 수행하였다.
HLB 감염 감귤 나무에서 CLas 박테리아 역가의 존재는 질병의 존재를 확인하기 위해 특정 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 방법으로 결정될 수 있다(Li, W.B., Hartung, J.S. and Levy, L. 2008 "Optimized quantification of unculturable 'Candidatus Liberibacter spp.' In host plants using real-time PCR", Plant Disease 92: 854-861). 이들 잎에 대한 DNA 추출 및 정량적 PCR(qPCR) 분석은, C. 리버리박터 박테리아의 16S DNA를 표적으로 하도록 설정된 HLB 프라이머[5'≫ 3'(정방향): TCGAGCGCGTATGCAATACG(서열번호 773)로서의 HLB; (역방향) HLBr: GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG(서열번호 774); HLBpc(프로브): 개재 형광 리포터 염료로 표지된 AGACGGFTGAGTAACGCG(서열번호 775)]를 사용하여 서던 가든즈 시트러스(미국 플로리다주 클루이스톤 소재)에서 수행하였다. 40주기의 qPCR을 수행하고, 용액 중 dsDNA의 양에 비례하는 형광 신호를 측정하였다. qPCR 분석은 감귤 조직에서 CLas 박테리아의 검출을 허용한다. qPCR 분석으로부터의 주기 임계(Ct) 값은 각각의 처리마다 얻어졌다. Ct 측정치는 상대 임계값 수준을 생성하는데 필요한 PCR 주기의 수와 동일하다. 분자생물학 분야의 일반적인 관행에서와 같이, Ct 값의 변화는 처리된 샘플 대 미처리 샘플 또는 한 시점 대 또 다른 시간에 처리된 샘플에서 CLas DNA의 상대적인 양을 나타내는 것으로 보고되어 있다. Ct 값이 높을수록 처리 효과가 더 크거나 효과적인데, 이는 나무로부터 CLas 박테리아의 감소/제거에 의해 나타난다. 박테리아 로드의 백분율 감소를 하기와 같이 계산할 수 있다:
Figure pct00148
자몽 시험으로부터의 결과를 도 9에 나타낸다. T0 시점(주입일), T21 및 T56 시점(주입 후 21 및 56일)으로부터의 qPCR 분석으로부터 얻은 Ct 비교(n = 10 나무당 처리)로부터의 평균값을 평균 Ct 값으로부터의 표준 오차와 함께 도 9에 보고한다(T0 = 어두운 회색 막대; T21 = 흰색 막대; T56 = 밝은 회색 막대; "x"로 표시된 평균 Ct 값). 모든 이상점 값은 각 처리에 대한 표준 오차 막대 외부에 있는 작은 원으로 표시된다. 주입되지 않은 대조군 또는 자몽 나무는 모든 처리 시점에 대해 25에 가까운 Ct 범위에서 가장 낮은 Ct 값을 가졌다. 1X 및 10X Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 제형으로의 주입 처리가 제공된 자몽 나무로부터 샘플링된 잎은 대조군 나무의 잎에 비해 약간 더 높은 Ct 계수치를 초래하였다(도 9). Ct 값이 높을수록, CLas 박테리아의 감염 확산을 제어하거나 감소시키는 치료 효과가 더 크다. T21 샘플링으로부터 취한 잎에서의 평균 Ct 값은 T56 샘플링으로부터의 Ct 값보다 컸지만, 둘 모두는 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 제형으로의 주사가 제공된 나무로부터의 잎 또는 비주입된 대조군 잎에 비해 유의하게 증가하였다(도 9, 평균 Ct 값은 "x"로 표시됨).
발렌시아 오렌지(시트러스 시넨시스) 를 사용한 또 다른 연구를 플로리다 중부(오키초비 카운티)에 위치한 상업적인 과수원에서 수행하였다. Bt.4QFlg22(서열번호 226)의 제형을 사용한 주입 처리를 티오닌으로 공지된 항미생물 폴리펩타이드와 비교하였다. 티오 닌 주입은 "비태그화된" 것 또는 체관부 국지화 서열이 없는 것을 특징으로 하는 티오닌 폴리펩타이드(서열번호 651, 652 및 653)의 혼합물로서 제공되었다. 또한 비태그화된 티오닌 혼합물에 추가하여, 체관부 국지화 서열(서열번호 650)을 포함한 "태그화된" 티오닌 폴리펩타이드를 비교 주입 처리로 사용 하였다. 체관부 표적화 또는 "태그화된" 버전을 사용하여 CLas 박테리아가 존재하고 증식하는 체관부에 특이적으로 티오닌을 표적화시켰다. 미처리 대조군 및 Bt. 4QFlg22 처리에 대해서 처리당 총 8그루의 오렌지 나무(8년령) 및 티오닌 처리에 대해 총 5그루의 오렌지 나무를 갖는 무작위 완전 블록 설계를 사용하여 주입 처리를 오렌지 나무에 적용 하였다. 잎의 출현에서 잎이 완전 크기로 커질 때까지의 성장기에, 제1 플러시로 4월(2017년)에 주입을 제공하였다. 오렌지 나무의 주입을 저압 주입 장치인 BRANDTENTREE(BRANDT)를 사용하여 수행하였다. Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 1X(0.138μM) 및 10X(1.37μM) 농도에서, "비태그화된" 및 "태그화된" 티오닌 폴리펩타이드를 모두 주입 처리되지 않은 나무(대조군)과 비교하였다. 오렌지 나무로부터의 잎을 주입시(0일), T56 또는 주입 후 56일에 각각의 처리당 샘플링하였다.
나무당 총 6개의 잎 샘플을 선택하여 잎 연령, 위치 및 가시적인 증상의 존재와 관련하여 나무 상의 잎의 집단을 나타내었다. 각각의 주맥을 잎새로부터 분리하고, 새로운 멸균 면도날을 사용하여 작은 조각으로 즉시 절단하였다. 이어서 각각의 나무로부터의 잎 샘플을 개별 튜브에 넣고, 그 다음 추가 가공시까지 -80
Figure pct00149
의 동결기에 저장하였다. 이들 잎에 대한 DNA 추출 및 실시간 중합효소 연쇄 반응 또는 정량적 PCR(qPCR) 분석은 Ct 분석을 수행하는 것에 대해서 상기에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 서던 가든즈 시트러스(미국 플로리다주 클루이스톤 소재)에서 수행하였다.
발렌시아 오렌지 시험으로부터의 결과를 도 10에 나타낸다(T0 = 어두운 회색 막대; T56 = 백색 막대). 대조군 오렌지 나무로부터의 잎 조직은 처리 시점 T0 및 T56에 대해 25 내지 30 근처의 Ct 범위에서 가장 낮은 Ct 값을 가졌으며, 이는, 이들 나무에서 CLas 박테리아의 역가 수준이 변하지 않았음을 나타낸다. 티오닌 처리 둘 다, 즉 "비태그화된 것" 및 "태그화된 것"은 물 주입된 대조군으로부터 샘플링된 T56 잎으로부터의 평균 Ct 값과 비교할 때 T 56 샘플링으로부터 취한 잎에서 더 높은 평균 Ct 값을 가졌다(도 10; 평균 Ct 값은 "x"로 표시됨). 모든 이상점 값은 각 처리에 대한 표준 오차 막대 외부에 있는 작은 원으로 표시된다. 체관부 표적화 티오닌 "태그화된" 처리가 제공된 나무로부터 샘플링된 잎은 비표적화 또는 "비태그화된" 티오닌 처리가 제공된 나무로부터의 잎에 비해 T56에서 더 높은 평균 Ct 값을 가졌다. 1X 및 10X Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 제형의 주입 처리가 제공된 오렌지 나무로부터 샘플링된 잎은 T0에 비해 T56에서 Ct의 평균 증가에 의해 나타난 T0 내지 T56 시점에 상당히 높은 Ct 계수치를 초래하였다(도 10; 평균 Ct 값 "x"로 표시). Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 제형(1X 및 10X) 둘 다가 주입된 나무로부터의 잎은 또한 대조군 나무로부터의 잎 샘플에 비해 상당히 높은 Ct 값을 가졌다. Bt.4Q7Flg22는 감염된 오렌지 나무에서 CLas 박테리아의 역가 수준을 제어하거나 감소시키기 위한 효과적인 치료법이다(도 9).
1X(0.138μM) 및 10X(1.38μM)에서 최종 농도를 사용하여 주입 처리로 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이는 주입 8주 후에 샘플링된 잎 조직에서 CLas 역가 수준을 감소시키는데 효과적이었다. 그러나, Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 10X(1.38μM)의 높은 농도는 CLas 역가 수준에서 37% 감소(시험 1) 및 43% 감소(시험 2)를 초래하는 훨씬 더 효과적이었다.
Figure pct00150
이전 결과는, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 질병 기간 전체에서 식물 성장을 촉진시킴을 나타낸다(실시예 50). HLB-감염된 '발렌시아' 오렌지 및 '루비 레드' 자몽 나무에 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)를 주입하는 것에 대한 잠재적인 식물 성장 이득을 평가하기 위해서, 2017년 4월에 Bt.4Q7Flg22가 주입된 동일한 나무에 대해서 2018년 5월에 현재 연도 성장을 측정하고, 플로리다 중부(오키초비 카운티)에 위치한 상업적인 과수원에서 CLas 박테리아 역가를 평가하였다. 진녹갈색 대 갈색 색조로 외관상 더 나무같은 오래된 성장 가지와 비교할 때, 각각의 나무는 가지가 녹색을 띠는 현재 계절 성장 영역으로 시각적으로 평가되었다. 나무당 새로운 성장을 갖는 3개의 대표 가지를 선택하였고, 녹색 성장의 시작(가장 오래된 마디)에서 가장 어린 마디의 끝까지의 거리(인치)를 유연한 측정 테이프로 측정하였다. 1X 및 10X Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)가 주입된 나무 및 미처리 대조군 대조군에 대한 데이터를 수집하였고, '발렌시아' 오렌지 시험에 대해 치료당 8 개의 나무 및 '루비 레드' 그레이프푸룻 시험에 대해 치료당 9 내지 10개의 나무가 존재하였다(처리당 n=24 내지 30개 측정치). 2017년 9 월 허리케인 강도의 바람 피해로 인해 본래 시험(1X Bt.4Q7Flg22 처리군)에서 '루비 레드' 자몽 시험에서 단 하나의 나무만 손실되었다. 각각의 시험에 대해서, 평균 새로운 성장 길이(인치)를 계산하고, 미처리 대조군에 대해 정규화하였다(표 85).
Figure pct00151
이들 결과는 스위트 오렌지 나무 및 자몽 나무의 성장을 또한 향상시키는, 미처리 식물(도 9 및 도 10)에 비해 감소된 CLas 박테리아 역가를 나타내는, Flg22 조성물의 능력을 입증한다(표 85). 향상된 가지 성장은 열매 수확량 향상의 지표 역할을 하는데, 그 이유는 계절 내내 열매 성장을 유지하기 위해 더 많은 잎이 생산되기 때문이다. 미처리 대조군과 비교하여, 2017년 4월에 1X Bt.4Q7Flg22 주입이 제공된 오렌지 나무 및 자몽 나무는 각각 평균 6.1인치(+ 85%) 또는 2.8인치(+ 35%)의 새로운 가지 성장을 가졌다. Bt.4Q7Flg22의 10X 주입 용량은 또한 오렌지 나무 및 자몽 나무에서 각각 5.1 초과 인치(70%) 및 +1.1 초과 인치(+13%)의 새로운 가지 성장으로 성장 증가에 효과적이었다. 10X Bt.4Q7Flg22 주입은 2018년 성장을 향상시키기 위한 1X 주입보다 성능이 우수하지 않았기 때문에, 2017년에 박테리아 역가 감소가 유사하였다. 1X Bt.4Q7Flg22 주입은 식물에서 충분한 반응을 제공한다. 중요하게도, 성장 측정은 Flg22 트렁크 주입 후 1X 또는 10X 속도로 식물독성이 발생하지 않았다는 것을 나타냈다.
이들 식물이 질병-유발 박테리아를 100% 제거하지 않았기 때문에, 이 결과는 또한 HLB-유발 박테리아의 존재에도 불구하고, 계속 성장할 수 있는 Bt.4Q7Flg22가 주입된 식물의 능력을 입증한다. 항생제 저항성을 갖는 CLas 균주가 출현하여 HLB-대조군에 대한 추가 장애물이 될 것으로 예상되는 경우, Flg22 주입은 식물 성장을 개선시키고, 박테리아 역가를 감소시키기 위한 항생제 치료의 바람직한 대안을 나타낸다. 본 실시예에서 Flg22 주입이 제공된 나무는 표준 상업적인 감귤 처리 프로그램으로 유지되었고, 이는 표준 경작자 관행에 Flg22 감귤 주입을 부가하는 능력을 추가로 입증한다.
실시예 52: 단독 또는 항미생물 또는 식물-건강 촉진 화합물과 조합하여 적용되는 Flg22의 엽면 및 트렁크 주입은 오렌지 나무에서 새로운 슈트 성장을 증가시킨다
4월(2018년)의 후속 시험에서, Flg22 제형을 2 개의 독립적인 시험 부위에서 트렁크 주입 처리 또는 엽면 분무에 의해 적용하였다. 시험은 1) 합성 및 발효에 의해 생산된 Flg22 폴리펩타이드 변이체를 시험하도록, 2) 2017년에 감귤 주입 시험을 위해서 이전에 사용된 Flg22 변이체인 Bt. 4Q7Flg22(서열번호 226)의 효능 대 줄뿌림 작물에서 수확률을 증가시키기 위해 엽면 및 종자 처리 둘 모두로서 효과적인 Syn01Bt.4Q7Flg22(서열번호 571)의 효능을 비교하도록, 3) Flg22 적용 방법, 즉, 캐노피에 대한 트렁크 주입 대 엽면 분무를 비교하도록, 그리고 4) Flg22 펩타이드와 옥시테트라사이클린 주입, L-시스테인 및 벤조(1,2,3) 티아디아졸-7-카보티오산-S-메틸 에스터(BTH라고도 공지됨)(상업적으로 입수 가능한 제형 ACTIGARD WG로서) 간의 조합 시험을 시험하도록 설계되었다. L- 시스테인은 필수 단백질생성 아미노산이고; BTH는 식물 면역 반응의 활성화제로 농업적으로 사용되는 안정성이 증가된 살리실산 유사체이고, 산토모나스 악소노포디스 pv 시트리로 인해 유발되는 감귤 궤양병을 예방하기 위한 뿌리 관주 또는 관주법 처리로서 감귤 나무에 적용할 수 있도록 승인되었다.
2018년 3월에, 나무를 2곳의 별개의 장소에서 처리하였다. 3년생 햄린(Hamlin) 오렌지 나무(시트러스 시넨시스)를 플로리다 중부(오키초비 카운티)에 위치한 상업적인 과수원에서 처리하였다. 플로리다주 웨일즈 레이크(폴크 카운티)의 스윙클(Swingle) 뿌리줄기에 대해서 6년생 버니아(버니아) 오렌지 나무의 상업적인 과수원에서 비슷한 시험을 수행하였다. 트렁크 주입을 위한 저압 주입 장치인 BRANDT ENTREE(BRANDT) 또는 입면 분무용 미세 미스트 생성 CO2-가압 배낭 분무기를 사용하여 하기 표 85에 열거된 바와 같이 처리를 적용하였다. 트렁크 주입은 실시예 51에 기재된 바와 같았다. Bt.4Q7Flg22의 엽면 조성물을 비이온성 계면활성제(프리시젼 랩스 NIS90:10; 분무 탱크 부피의 0.1%v/v)를 함유한 물에 희석시키고, 나무의 캐노피에 나무당 3리터의 분무율로 균일하게 적용하였다. 이웃하는 처리 블록에서 처리 드리프트(drift)를 회피하기 위해서 처리 블록 사이에 갭(스킵 나무(skipped tree))을 두어 시험 면적에서 이격시켰다. 처리는 이른 아침 또는 늦은 저녁에 바람이 약한 기간(5mph 미만) 동안 적용하였고, 모든 분무 처리는 4시간 기간 내에 잎에서 건조되는 조건이었다. 표 86에 기재된 조합 처리를 동일한 BRANDT ENTREE 병(감귤 조성물 7, 감귤 조성물 8)에 공동 주입하거나, 또는 옥시테트라사이클린 주입으로서 별도로 적용하고, 이어서 같은 날에 Bt. 4Q7Flg22-Syn01 엽면 처리를 적용하였다(감귤 조성물 11, 감귤 조성물 12). 모든 처리에 대해서, 처리당 10그루의 나무를 사용하였고, 각각 5 개의 나무의 2개의 반복 블록으로 분리하였다. 감귤 조성물 1 내지 8은 오키초비 카운티 과수원 및 포크 카운티 과수원에서 모두 적용되는 반면, 감귤 조성물 9 내지 12는 오키초비 과수원 단독에 적용되었다.
Figure pct00152
Figure pct00153
상이한 제형의 Flg22 폴리펩타이드를 단독으로 또는 항미생물 또는 식물- 건강 촉진 화합물과 조합하여 HLB-감염된 오렌지 나무에 주입 또는 분무하는 것에 대한 잠재적인 식물 성장 이득을 평가하기 위해서, 2018년 3월 플로리다주 오키초비 카운티 및 플로리다주 폴크 카운티의 상업적인 과수원에서 처리된 나무에 대해서 2018년 5월에 새로운 플러시 길이를 측정하였다. 두 지역 모두에서 식물을 처리할 때(2018년 3월), 나무는 2018년 계절 열매가 발달하기 시작하여 짙은 녹색 잎을 나타냈다. 처리(2018년 3월)과 나무 측정 시기(2018년 5월) 사이의 2개월 간격에서, 나무는 연한 녹색 잎을 가진 매우 연한 녹색의 유연한 가지로 보이는 새로운 성장으로 봄의 플러시 기간에 들어갔다. 각각의 나무를 새로운 플러시에 대해서 평가하였고, 나무마다 새로운 성장을 갖는 3 개의 대표적인 가지를 선택하였다. 연한 녹색 성장의 시작(가장 오래된 마디)에서 가장 어린 마디의 끝까지의 거리(인치)를 유연한 측정 테이프로 측정하였다. 미처리 대조군을 포함하여 처리당 10개의 나무에 대한 데이터를 수집하여 처리당 총 30 회 측정하였다. 표 86에는 오키초비 카운티 및 포크 카운티의 2개 과수원 장소에 걸쳐 각 처리에 대한 평균 플러시 길이(인치)가 표시되어 있으며, 성장은 미처리 대조군에 대해서 정규화되어 있다.
Figure pct00154
Flg22 변이체의 트렁크 주입 또는 엽면 분무 적용 후 2개월 후에 취한 '햄린' 및 '버니아' 신규 슈트의 성장 측정은, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Syn01Flg22(서열 번호 571)이 미처리 대조군보다 더 큰 성장을 촉진 시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 평균적을, 미처리 대조군 슈트는 3.08인치 길이였고, Bt.4Q7Flg22 -주입 나무는 25% 더 긴 슈트(3.84 인치)를 가졌고, Syn01Flg22-주입 나무는 146% 더 긴 슈트(4.48인치)를 가졌다. 실시예 49에 기재된 발효 방법을 통해 생산된 Bt.4Q7Flg22 및 Syn01Flg22는 또한 트렁크에 80㎖/나무의 비율로 주입될 때 슈트 성장을 증가시키는 데 효과적이었다. 균주 H101의 발효에 의해 생산되고, 0.8U/㎖ 엔테로카이나제(뉴 잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs); 제품 코드 P8070)로 처리 된 Bt.4Q7Flg22를 함유하는 감귤 조성물 3이 가장 효과적이며, 슈트는 미처리 대조군보다 평균 169%(5.18인치) 더 긴 것으로 측정되었다.
질병 압력 하에서 키위, 대두, 렌틸콩 및 감자의 성장을 촉진시키는 데 효과적인 Flg22 변이체의 엽면 시비를 또한 HLB- 감염된 오렌지 나무의 성장을 촉진하는 능력에 대해 시험하였다. 표 88은, 각각 1X 또는 4X 용량의 Syn01Bt.4Q7Flg22(서열번호 571)로 구성된 감귤 조성물 5 및 6이 오렌지 나무에서 새로운 슈트 성장을 촉진시키는 데 효과적임을 나타낸다. 1X 및 4X 용량은 유사하게 효과적이었는데, 1X 엽면 비율은 대조군보다 119% 더 긴 슈트가 측정되었고, 4X 비율은 대조군보다 122% 더 긴 슈트가 측정되었다. 이러한 결과는, Flg22 폴리펩타이드의 엽면 시비가 감귤 과수원 나무의 표준 관리 프로그램의 일부로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
Figure pct00155
이어서, Syn01Bt.4Q7Flg22(서열번호 571)와 BTH(ACTIGARD WG) 또는 L- 시스테인의 조합물을 멜빈 지역 및 웨일즈 레이크 과수원 둘 다에서 조사하였다. 표 88의 두 조합물 처리는, 미처리 대조군과 비교하여 더 큰 새로운 플러시 길이를 나타내어, Flg22 폴리펩타이드가 감귤 나무 건강을 개선시키기 위해 아미노산, 식물 호르몬 또는 식물 호르몬-모방체와 조합하여 사용될 수 있음을 나타내었다.
Figure pct00156
별도의 시험에서, Syn01Flg22(서열번호 571) 및 옥시테트라사이클린 처리의 조합물을 관찰하였다. 나무에 옥시테트라사이클린을 주입한 당일에 10그루의 군에 Syn01Flg22의 엽면 시비를 또한 1X 비율 또는 10X 비율로 분무하였다. 이러한 결과는 항생제 및 폴리펩타이드 처리가 호환성이고, 이중 처리로 인한 어떠한 물리 독성도 관찰되지 않았음을 나타낸다. HLB 증상의 향상된 제어 및 CLas 역가 감소를 위해서 엽면 처리와 나무 주입을 교대로 진행할 수 있는 표준 프로그램이 구상될 수 있다.
실시예 53: 파콥소라 파치리치 및 세르코스포라 키쿤치에 의해서 유발되는 질병으로부터 보호하기 위해서 대두 식물 상에서 Bt. 4Q7Flg22 및 Gm. RHPP 엽면 시비를 사용한 질병 보호
표 90은 하기 실시예에서 시험된 상응하는 사용률 및 조성물을 기재한다.
Figure pct00157
반복된 경작지 시험은 파라과이(야티타이, 오블리가도 및 카피탄 미란다)의 3개 위치에 걸쳐 광범위 살진균제 Fox(16.0% 프로티오코나졸 및 13.7% 티오플록시스트로빈)과 함께 제공된 Bt.4Q7Flg22 폴리펩타이드 및 RHPP 폴리펩타이드의 조성물을 포함하는 엽면 시비를 사용하여 수행되었다. FOX는 5.48에이커당 유체 온스(Fl.oz/Ac)(400㎖/헥타르)의 사용률로 시편 표지 상의 권고에 따라서 엽면 분무로서 적용되는, 파콥소라 파치리치에 의해서 유발되는 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라 키쿤치에 의해서 유발되는 대두의 세르코스포라 잎 마름병의 예방 및 치료적 처리에 대한 제한된 효능을 갖는남아메리카에서 상업적으로 입수 가능한 엽면 살진균제이다. R1 발달기에서 시작하여, 대두 식물은 분무 적용 사이에 13 내지 14 일 간격으로 표 90에 기재된 조성물의 2회의 엽면 시비가 제공되었다. 엽면 처리를 모든 3개의 장소에 동일한 단일 콩 품종에 적용하였고, 4회 반복 플롯을 수행하였다(3x10미터, 30m2; 처리당 최소 6개의 이랑). 자연적으로 감염된 시험에 대한 질병 평가를 감염의 중증도(영향을 받은 나뭇잎 0 내지 100%)에 대해 점수를 매겼고, 콩의 R4 내지 R5 발달기(제2 엽면 시비 4 내지 15일 후)에 파콥소라 파치리치에 의해서 유발된 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라 키쿤치에 의해서 유발된 대두의 세르코스포라 잎 마름병 둘 다에 대한 각각의 플롯에서 문헌[Godoy et al (1997; Journal of plant diseases and protection 104:336-345)]으로부터의 가이드에 따라서 10개의 식물을 점수매겼다. 백분율 세포독성(영향을 받은 나뭇잎 0 내지 100%)을 R4 내지 R5 콩 발달기에 또한 점수매겼다. 감염 및 식물독성의 중증도를 장소당 4개의 반복물 모두에 대해서 평균내었다(총 = 12개의 반복물, 각각 4개의 복제물을 갖는 3 개의 장소). 3개의 장소 사이의 각 처리에 대한 표준 편차를 계산하였다. 야티타이(Yayatay) 장소의 미처리 대조군 식물은 제2 엽면 처리 적용 후 11일째에 99%의 탈엽을 나타내었으며, 이때 탈엽(0 내지 100% 탈엽)에 대해 점수를 매겼다. 질병 중증도, 식물독성 및 탈엽 결과를 괄호 안의 표준 편차와 함께 백분율로 표 91에 제공한다.
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Figure pct00163
Figure pct00164
대두 발달의 생식기 동안 Bt.4Q7Flg22 및 Gm.RHPP의 엽면 시비는 미처리 대조군과 비교할 때 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라 잎 마름병에 대한 보호를 증가시켰다. 150 및 300㎖/Ha의 Bt.4Q7Flg22-처리된 식물의 엽면 시비는 미처리 대조군에 비해서 12.4 내지 13.0%의 더 적은 아시아 대두 녹병 잎 면적 손상 및 2.8 내지 3.5% 더 적은 세르코스포라 잎 면적 손상을 나타내었고; 150 및 300㎖/Ha의 Gm.RHPP-처리된 식물의 엽면 시비는 미처리 대조군에 비해서 10.5 내지 11.3% 더 적은 아시아 대두 녹병 잎 면적 손상 및 3.3 내지 4.5% 더 적은 세르코스포라 잎 면적 손상을 나타내었다. Bt.4Q7Flg22 또는 RHPP와 FOX 살진균제의 조합물 처리는 Fox 살진균제 처리 단독에 비해서 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라에 대한 보호를 증가시켰다. 야이타이 장소에서, Bt.4Q7Flg22 또는 Gm.RHPP 처리 +/- FOX 살진균제에 대한 심각한 질병 증상으로 인해서 R7 발달기에서 더 적은 탈엽이 관찰되었다. 미처리 대조군은 이 기에서 99%의 탈엽된 반면, 150 또는 300㎖/Ha의 Bt.4Q7Flg22 처리는 녹색 잎이 여전히 보이면서 각각 잎이 70 또는 60%로 감소하였다. 150 또는 300㎖/Ha의 Gm.RHPP 처리는 탈엽 제거를 각각 96% 또는 70%로 감소시켰다. Bt.4Q7Flg22 또는 Gm.RHPP과 FOX 살진균제로의 조합물 처리는 탈엽을 25%로 감소시켰고, 녹색 잎이 보였으며, Fox 살진균제 단독은 탈엽을 단지 45%로 감소시켰고, 녹색 잎이 보이지 않았다. 종합적으로, 폴리펩타이드 처리는 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라 잎 마름병의 방제에 대해서 FOX 살진균제 단독보다 증가된 보호를 제공하였다. 임의의 폴리펩타이드 적용 단독에 대해서는 식물독성이 관찰되지 않았고, FOX 살진균제와 폴리펩타이드의 조합은 FOX 살균제 단독에 비해 식물독성을 유의하게 증가시키거나 감소시키지 않았다(표 93).
실시예 54. 키위에 대한 Flg22-PSA 엽면 시비는 슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애(PSA-V)로부터 식물을 보호한다
슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애(PSA)는 키위 생산 구역 전체에 걸쳐 녹색- (악티니디애 델리시오사) 및 황색-과육(악티니디애 치네시스) 키위 식물 둘 다의 박테리아 궤양병을 유발하는 파괴적인 식물 병원체이며, 뉴질랜드, 중국 및 이탈리아에서 심각한 수확 손실을 초래합니다. 뉴질랜드에서만, 2025년까지 가장 치명적인 비오바(biovar) PSA-V에 대한 누적 매출 손실은 7억 400만 뉴질랜드 달러(NZD)에 도달할 것으로 예상된다(Agribusiness and Economics Research Institute of Lincoln University "The Costs of Psa-V to the New Zealand Kiwifruit Industry and the Wider Community"; May 2012). PSA-V는 키위 식물의 외면과 내면을 식민지화하여 목질부와 체관부 조직을 통해서 확산될 수 있다. 키위에서 PSA-V의 질병 증상은 박테리아 잎 반점, 몸통의 박테리아 궤양병, 붉은 삼출물, 꽃 썩음, 잔가지 변색, 궁극적으로 키위 덩굴의 백화를 포함한다. PSA-V에 대한 표준 방제 방법은 현재 병원체의 구리-내성 형태의 선택 및 질병 방제 손실을 초래할 것으로 예상되는 키위 덩굴에 금속 구리의 엽면 시비를 빈번하게 사용한다. 새로운 방제 방법이 시급히 필요하다.
플라젤린의 22-아미노산 단편에 대한 키위 잎의 민감성을 시험하기 위해서, 1mm 슬라이스를 악티니디애 델리시오사 키위 '헤이워드(Hayward)' 잎 잎자루를 통해서 절단하고, 96-웰 플레이트에서 150㎕의 물에, 웰당 하나의 슬라이스를 부유시켰다. 동결건조된 폴리펩타이드를 10mM의 농도로 탈이온수에 재현 탁시킴으로써 표 94의 Flg22 폴리펩타이드를 검정을 위해서 제조하였고; 이어서, 펩타이드를 0.1% 트윈-20을 함유하는 100mM 인산나트륨(pH 7.8 내지 8.0) 완충제에 10μM로 연속 희석시켰다. 물을 20시간 후에 키위 잎 잎자루 샘플에서 제거하고, 탈이온수 중의 100nM 펩타이드(10μM 스톡으로부터 희석), 34㎍/㎖의 루미놀 및 20㎍/㎖의 호스래디쉬 퍼옥시다제를 함유하는 100㎕의 엘리시테이션 용액으로 교체하였다. 식물 조직에 의한 Flg22 폴리펩타이드의 인식은 면역 신호전달의 활성화 및 아포플라스트 반응성 산소 종(ROS)의 생성을 초래하였다. ROS (H2O2)의 존재 하에서, 호스래디쉬 퍼옥시다제는 루미놀의 산화 및 가시광의 생성을 촉진시켰다. 40분의 시간 기간에 걸쳐서 SpectraMax L 광도계(0.5초 적분; 2.0분 간격)로 상대 광 단위(RLU)를 보고하였다. 두 개의 독립적인 실험에서, 총 6개의 키위 잎 잎자루 샘플을 표 94에서 각각의 Flg22 폴리펩타이드로 처리하였다. 평균 총 RLU 및 평균의 표준 오차(SEM)를 각각의 처리에 대해 계산 하였다. 양측 T- 검정을 사용하여 치료 간 90% 신뢰 수준(P < 0.1)에서 유의성을 결정하였다. 100nM Bt.4Q7Flg22 대조군에 대한 총 RLU와 비교하여 각각의 폴리펩타이드에 대해서 상대적인 ROS 생성을 결정하였다.
Figure pct00165
두 개의 독립적인 실험에 걸쳐 키위 '헤이워드' 잎 잎자루는 바실루스 투린기엔시스 균주 4Q7(Bt.4Q7Flg22; 서열번호 226)로부터 유래된 Flg22에 비해서 슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애(Flg22-PSA; 서열번호 540)로부터 유래된 Flg22에 상당히 더 감응성이었다. ROS 생성은 Bt.4Q7 Flg22(서열번호 226)에 비해서 합성 Syn01Flg22(서열번호 571)에 반응하여 키위 잎 잎자루에서 증가되었기 때문에, 그 차이는 유의하지 않았다. 이러한 결과에 기초하여, 뉴질랜드에서 화분 키위 '헤이워드' 식물의 질병 예방 시험을 위해 Flg22-PSA(서열번호 540)를 100nM 최종 농도(표 94)로 나타낸 바와 같이 제형화하였다.
Figure pct00166
엽면 조성물은 330.7mM의 1,2-벤즈아이소티아졸린(BIT), 53.5mM의 5-클로로-2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온(CMIT) 및 26.1mM의 2-메틸-4-아이소티아졸린-3-온(MIT)의 블렌드의 수성 분산물인 0.1%(v/v) Proxel BC 보존제를 함유하였다. 엽면 조성물을 0.05%(v/v) Contact XcelTM 비이온성 계면활성제를 함유하는 물(g/L 물 또는 ㎖/L 물) 중에 제시된 농도로 희석시켰다. 완전히 덮을 때까지 각각의 식물의 전체 캐노피에 희석된 생성물을 가압 배낭 분무기를 사용하여 미세한 액적으로 적용하였다.
슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애(PSA-V)의 대조군에 대한 Flg22-PSA(서열번호 540)의 효능을 평가하기 위해서, 화분 키위 질병 시험을 뉴팜사(NuFarm Limited)와 공동으로 호트이밸류에이션사(HortEvaluation Ltd)에 의해서 뉴질랜드 베이 오프 플렌티 지역에서 수행하였다. PSA-V 무증상의 화분 키위 악티니디애 델리시오사 '헤이워드' 식물을 군당 12개의 화분 식물로, 6개의 처리군에 고르게 분포시켰다. PSA-V로 접종하기 하루 전에, 화분 식물을 뉴질랜드 테 푸카의 식물 묘표에서 PSA-V 대조군에 대한 산업 표준인 ChampION++TM 또는 표 96의 적용률에 따라서 제형화된 Flg22-PSA로 처리하였다(처리군 3, 4). 24시간 후, 비감염 대조군을 제외한 모든 식물을 완전히 덮을 때까지 잎의 바닥을 향해서 5L 핸드-헬드 가압 분무기를 사용하여 1x108cfu/㎖의 PSA-V 접종원을 분무하였다. 비감염 대조군에게 물 단독을 분무하였다. 화분 식물을 푸케히나(Pukehina)로 옮기고, 감염된 식물과 분리된 비감염된 대조군 식물과 함께, PSA-V 감염에 대한 환경 조건을 모방하기 위해서 48시간 동안 오버헤드 미스트가 있는 곳에 배치하였다. 48시간 후, 이어서 하위 세트의 식물을 미스트 면적으로부터 꺼내고, 약간 건조시켰다. 최종 처리 후, 모든 식물을 푸케히나에서 무작위화된 위치인 최종 실외 시험 장소로 이동시켰다. 시험 장소에서의 평균 일단위 온도는 20.75°C였고, 총 강수량은 34일에 걸쳐서 277mm였다. 추가로, 각각의 식물을 점적 관주법에 의해서 한 번에 2시간 동안 1일 2회 물을 주었다. 환경 조건은 PSA-V 질병 증상의 진행에 대해서 선호되었다. 식물을 PSA-V 질병 평가를 위한 시험 기간 전체에서 육안으로 모니터링하였고, 동일한 평가자가 접종 후 6일(6 DAI), 16 DAI, 23 DAI 및 29 DAI에 반점으로 덮인 잎 면적의 %를 기록하였다. 추가로, 각각의 식물을 29 DAI에 0 내지 10의 스케일로 처리제 식물독성에 대해서 평가하였는데, 여기서 0은 잎 식물독성 없음이고, 10은 매우 심각한 잎 식물독성 증상이다. 6, 16, 23 및 29 DAI의 평균 질병 점수 및 29 DAI의 식물독성 점수를 각각의 처리에 대해서 표 96에 보고한다(처리당 n=12 식물). P-값을 각각의 처리군 대 미처리 대조군에 대해서 계산하였다.
Figure pct00167
Flg22-PSA의 적용은 미처리 대조군과 비교하여 6, 16 및 23 DAI에서 PSA-V 잎 반점 증상(P <0.1; 90% 신뢰 구간)을 유의하게 감소시켰다. Flg22-PSA 사전-처리의 조합은 모든 평가 시점에서 Flg22-PSA 처리 단독과 비교하여 잎 반점의 중증도를 추가로 감소시켰고, 29 DAI까지 상당한 보호 기간을 연장시켰다(미처리 대조군과 비교하여 잎 반점이 14.3% 적음; P = 0.002). 결론적으로, Flg22-PSA는 단독 치료 및 병원체 성장 제한을 목적으로 하는 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있다. PSA를 치료하기 위해 현재 사용되는 구리 함유 처리제인 산업 표준 ChampION ++ TM은 경엽 식물독성을 유발하지만(AVE 점수 = 1.6), 처리제 3 내지 4에 대해서는 유의한 식물독성이 관찰되지 않았다(표 97). Flg22-PSA는 다른 식물독성 처리제에 대한 대안으로 사용될 수 있다.
Figure pct00168
실시예 55: 연장 인자 Tu로부터 유래된 폴리펩타이드
공통 바실루스 세레우스 연장 인자-TU(EF-Tu) 단백질로부터 유래된 Elf18 및 Elf26 폴리펩타이드를 옥수수(잡종 5828 YX), 콩(품종 Morsoy), 및 아라비돕시스 탈리아나에서 ROS 반응을 생성하는 능력에 대해 시험 하였다. 폴리펩타이드는 표준 고체상 합성 방법을 사용하여 미국 젠스크립트사(Genscript USA)(미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재)에 의해 합성되었고, 70% 이상의 순도를 갖는 동결 건조된 분말로서 제공되었다. 건조 분말을 초고순도 물 중에 10mM의 농도로 재현탁시킨 후, 초고순도 물 중에 표 98의 ROS 검정에서 시험된 농도까지 연속 희석시켰다.
ROS 검정을 위해서, 아라비돕시스 잎을 4주령 식물로부터 절제하고, 코르크 보어를 사용하여 4mm 디스크를 잎으로부터 제거하였다. 면도날의 가장자리를 사용하여 각 디스크를 반으로 자른 다음, 각 디스크 반을 150㎕의 물에 부유시키고 96-웰 플레이트 내에서 물과 배축면을 접촉시키면서 밤새 방치하였다. 다음날, 폴리펩타이드 처리 직전에 각각의 웰로부터 물을 제거하였다. RLU 값 및 상대 ROS 활성도를 4회 측정의 평균으로 보고하였다. ROS 활성도 검정을 실시예 15에 이미 보고된 바와 같은 방법을 사용하여 수행하였다. ROS 활성도 결과를 하기 표 97에 보고한다.
Figure pct00169
Figure pct00170
EF-Tu 폴리펩타이드, EF-Tu 수용체(EFR)에 대한 수용체는 이미 브라시카 클래드에서 식별되었고, 이 중 아라비돕시스 탈리아나가 모델 식물이다. 표 99의 결과는, 각각 100nM 농도에서 시험했을 때 바실루스 세레우스 EF-Tu(서열번호 616 및 서열번호 617)로부터 새로 식별된 폴리펩타이드가 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)와 유사한 크기의 ROS 반응을 유도하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 모의 처리된 대조군과 비교하여, EF-Tu N-말단 폴리펩타이드는 3.2 내지 2.5배 증가된 반응을 제공한 반면, Bt.4Q7Flg22는 모의 대조군에 비해 3.1배 증가하였다. 이러한 결과는 바실루스 세레우스의 N-말단으로부터의 18- 및 26-아미노산 단편이 케일, 양배추, 콜라드 그린, 콜리플라워, 미니양배추(Brussel sprouts), 사보이, 콜라비 및 가이 란(gai lan)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 브라시카 작물의 Bt.4Q7Flg22와 유사하게, 식물 바이오매스, 수확률 및 질병 예방을 증가시키기 위해서, 사용될 수 있음을 시사한다.
EF-Tu N-말단 펩타이드(서열번호 616 및 서열번호 617) 및 Bt. 4Q7Flg22(서열번호 226)의 조합 처리는 EF-Tu 펩타이드 단독에 대해 유사한 ROS 반응을 초래하였는데, 이는 경작지에서 펩타이드 처리의 조합은 활성의 간섭을 제공하지 않을 것임을 나타내지만; EFR 및 FLS2 수용체에 의해 각각 인식되는 EF-Tu 및 Flg22 펩타이드에 대한 하류 신호전달 사건 사이의 공유 메커니즘으로 인해, 펩타이드 처리의 시간차 적용(staggered application)이 식물에 가장 큰 성장 이득을 제공할 수 있다.
실시예 56: 파콥소라 파치리치 및 세르코스포라 키쿤치에 의해서 유발되는 질병으로부터 보호하기 위해서 대두 식물 상에서 Bt. 4Q7Flg22 및 Gm. RHPP 엽면 시비를 사용한 질병 보호
대두 발달의 생식기 동안 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Gm.RHPP(서열번호 600)의 엽면 시비는 파콥소라 파치리치 및세르코스포라 키쿤치 감염에 의해 유발되는 질병 증상을 감소시키는 것을 이미 발견하였다(실시예 53). 이 식물을 수확을 위해 취하였고, Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 및 Gm.RHPP(서열번호 600) 엽면 시비는 식물이 아시아 대두 녹병 및 세르코스포라 잎 마름병이 감염된 파라과이에서 반복 시험으로 미처리 대조 식물과 비교하여 수확량을 증가시키는 것을 발견하였다. 150 및 300㎖/Ha의 Bt.4Q7Flg22의 엽면 시비는, 미처리 식물에 대한 평균 수확률이 1266.3㎏/Ha인 시험에서, 수확률을 각각 +342.2㎏/Ha 및 +427.2㎏/Ha 증가시켰다. Bt.4Q7Flg22의 300㎖/Ha 엽면 시비에 대한 수확률 증가(36.1%)는 FOX 살진균제 단독(36.6%)과 대등하였는데, 이는 Bt.4Q7Flg22가 질병 증상 감소 및 수확률 증가 둘 모두에 대해서 항진균 엽면 처리제로서 효과적임을 입증한다. 3개의 시험 장소에 걸친 상대적인 수확률은, FOX 살진균제와 Bt.4Q7Flg22의 조합된 적용으로 치료된 식물의 경우, FOX 살진균제 또는 Bt.4Q7Flg22 엽면 시비 단독에 비해서 약간 증가되었는데, 이는 이러한 처리가 양립성임을 입증한다. 150 및 300㎖/Ha의 Gm.RHPP의 엽면 시비는 미처리 대조군에 비해서, 수확률을 각각 +294.2㎏/Ha 및 506.8㎏/Ha만큼 추가로 증가시켰다. FOX 살진균제와 조합하여 적용되는 경우, Gm.RHPP는 Gm.RHPP의 150㎖/Ha 및 300㎖/Ha의 적용률에 대해서 각각 +517.6㎏/Ha 및 +539.9㎏/Ha의 수확률 증가에 의해서 입증되는 바와 같이 시험에서 질병에 대한 최대 보호를 제공하였다. Gm.RHPP의 엽면 시비는 식물 건강을 일관되게 개선시키고, 수확률을 증가시켰기 때문에, Gm.RHPP는 성장 촉진 및 진균 질병 저항성에 대한 효과적인 처리제이다.
Figure pct00171
Figure pct00172
Figure pct00173
실시예 57. Flg22를 사용하여 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스로 감염된 감귤 나무를 처리하면 착과를 증가시킨다
실시예 51에 요약된 이전 결과는 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226) 트렁크 주입이 병원체 역가를 감소시키고, 감귤그린병 (HLB)의 원인 작용제인 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스로 감염된 감귤 나무에서 새로운 성장을 촉진한다는 것을 나타낸다. 열매맺음의 잠재적 증가를 평가하고, 수확률을 추정치를 조기에 얻기 위해서, 플로리다 중부(오키초비 카운티)에 위치한 상업적인 과수원에서 2017년 4월에 Bt.4Q7Flg22가 트렁크 주입된 동일한 HLB-감염된 '발렌시아' 오렌지(2019년 봄 수확 예정) 및 '루비 레드' 자몽 나무(2018년 가을 수확 예정)에 대해 2018년 6월 착과를 측정하였다. 실시예 51에 기재된 바와 같이, 2017년 4월에 1X Bt.4Q7Flg22-저비율(0.55마이크로몰 펩타이드; 0.138μM의 예측된 체관부 농도) 또는 10X Bt.4Q7Flg22-고비율(5.5마이크로몰 펩타이드; 1.38μM의 예측된 체관부 농도)를 나무에 주입하였다. 2018년 6월, Bt.4Q7Flg22-주입된 나무를 감귤 나무 수확률을 예측하는 기존의 방법을 사용하여 과수원의 동일한 면적 내에서 미처리 대조군 나무와 비교하였다("Forecasting Florida Citrus Production: Methodology & Development; 1971; by S. R. Williams for Florida Crop and Livestock Reporting Service). 착과를 정량하기 위해, 각 나무에서 눈높이에서 3개의 4차 가지를 무작위로 선택하였다(처리당 n = 8그루의 나무, '발렌시아' 오렌지, 처리당 n = 10그루의 나무, '루비 레드' 자몽). 각각의 4차 가지의 원주를 가지가 시작되는 연결부에서 측정하고, 이를 사용하여 하기 식을 사용하여 가지의 단면적(CSA)을 계산하였다(식중, C=원주, CSA=단면적, r=반경):
Figure pct00174
및
Figure pct00175
그 다음, 그 접합부에서 원위에 있는 4차 가지 상의 과일의 총 수를 세었다. 가지 크기를 정규화하기 위해서, 각각의 4차 가지에 대한 착과를, 가지 상의 열매의 수를 4차 가지의 CSA로 나눈 값으로 정량하였다.
Figure pct00176
4차 가지 CSA당 열매 수를 도 11('발렌시아' 오렌지) 및 도 12(레드 자몽)에 상자 수염 그림(box and whisker plot)으로 보고하는데, 여기서 각 처리에 대한 중위값이 상자 내의 수직선으로 표시되고, 평균 또는 평균값은 "x"로 표시되고, 위, 아래 사분위는 상자의 끝에 표시되며, 수염은 가지 CSA당 관찰된 최대 및 최저 열매 수까지 확장된다. 모든 이상점 값은 각 처리에 대한 표준 오차 막대 외부에 있는 작은 원으로 표시된다.
나무당 달린 열매의 크기 및 부피를 추가로 평가하기 위해서, 나무당 적어도 10개의 무작위로 선택된 열매의 열매 직경(㎜)을 각 열매의 가장 넓은 지점에 배치된 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 각각의 처리에 대한 나무당 평균 열매 직경(㎜)을 도 13('발렌시아' 오렌지) 및 도 14(레드 자몽)에 상자 수염 그림으로 보고한다. 평균 열매 직경을 사용하여 각각의 처리에 대한 가지당 총 과일 부피를 추정하였다. 이러한 추정치에 대해, 이론적으로 구형인 오렌지의 밀리리터(㎖) 단위의 부피는 하기 식을 사용하여 계산하였으며, 여기서 열매의 반경(r)은 가지당 평균 직경(㎜ 단위)을 2로 나눈 값이다.
Figure pct00177
각각의 처리에 대해서 가지 CSA에 의해서 정규화된 열매의 부피 추정치를 도 15('발렌시아' 오렌지) 및 도 16(레드 자몽)에 상자 수염 그림으로 보고한다.
플로리다주 오키쵸비의 '발렌시아' 오렌지 및 '루비 레드' 자몽 나무에서의 착과를 평가하기 위해서, 2018년 6월에 수집된 측정치는, 미처리 대조군에 대해서 측정된 모든 파라미터에 대해서 평균 및 중위값과 비교한 경우, 2017년 4월에 1X 저비율 및 10X 고비율의 Bt.4Q7Flg22(서열번호 226)의 트렁크 주입이 제공된 두 품종 모두의 나무에 대해서 가지당 열매 증가 및 열매 크기의 증가를 나타낸다. 증가된 착과 및 크기는 증가된 수확률을 나타낸다. 이러한 결과는, Bt.4Q7Flg22를 이용한 감귤 나무의 트렁크 주입이 오렌지(도 9) 및 자몽(도 10; 표 84)에서 C. 리버티박터 박테리아 역가를 감소시키고, 감귤 나무에서 새로운 슈트 및 과일 성장을 자극하는데 사용될 수 있다는 추가 증거를 제공한다(표 85, 도 11 내지 16).
상기를 고려하여, 본 발명의 몇몇 목적이 달성되고 다른 유리한 결과가 달성됨을 인지할 수 있을 것이다.
본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 상기 폴리펩타이드, 재조합 유기체, 방법 및 종자에서 다양한 변화가 이루어질 수 있기 때문에, 상기 설명에 포함된 모든 물질은 예시가 아닌 것으로 해석되도록 의도된다.
실시형태
추가 설명을 위해서, 본 개시내용의 추가적인 비제한적인 실시형태를 하기에 제시한다.
실시형태 1은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위한, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍용 폴리펩타이드로서,
(a) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 1 내지 225, 227 내지 375, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 541, 751, 752 및 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(b) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571 내지 579 및 753 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(c) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드(돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 580 내지 586 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(d) 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450, 527, 531, 533, 535, 537 및 539 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(e) 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 또는 768 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(f) 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 529 또는 767을 포함함); 또는
(g) 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587, 589, 591, 593, 594 및 595 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(h) 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드(레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 588, 590, 592, 596 및 597 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(i) 근모 촉진 폴리펩타이드(RHPP)(RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603 및 604 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(j) 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드(KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함함); 또는
(k) 레트로 인버소 근모 촉진 폴리펩타이드(RI RHPP)(RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605 및 606 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(l) 연장 인자 Tu(EF-Tu) 폴리펩타이드(EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 607 내지 623 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(m) 레트로 인버소 연장 인자 Tu(RI EF-Tu) 폴리펩타이드(RI EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 624 내지 640 중 임의의 하나를 포함함); 또는
(n) 서열번호 750을 포함하는 융합 폴리펩타이드; 또는
(o) 파이토설포카인(PSK) 폴리펩타이드(PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함함); 또는
(p) 레트로 인버소 파이토설포카인(RI PSK) 폴리펩타이드(RI PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 599를 포함함); 또는
(q) 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 650 내지 749 중 임의의 하나를 포함함), 그리고
선택적으로, 여기서 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, (j)의 KTI 폴리펩타이드, (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전, 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유한다.
실시형태 2는 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, (j)의 KTI 폴리펩타이드, (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전, 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유한다.
실시형태 3은 실시형태 2의 폴리펩타이드이되, 화학적 변형은 아세틸화, 산 첨가, 아실화, ADP-리보실화, 알데하이드 첨가, 알킬아마이드 첨가, 아마이드화, 아미노화, 바이오틴일화, 카바메이트 첨가, 클로로메틸 케톤 첨가, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 가교, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 에스터 첨가, 공유 가교부의 형성, 시스테인-시스테인 다이설파이드 결합의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 폼일화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드라자이드 첨가, 하이드록시아믹산 첨가, 하이드록실화, 아이오딘화, 지질 첨가, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질가수분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 팔미토일화, 정제 태그의 첨가, 파이로글루탐일 첨가, 라세미화, 셀레노일화, 설폰아마이드 첨가, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 트랜스퍼-RNA 매개된 첨가, 유비퀴틴화 또는 유레아 첨가를 포함한다.
실시형태 4는 실시형태 2의 폴리펩타이드이되, 화학적 변형은 N-말단 변형 또는 C-말단 변형을 포함한다.
실시형태 5는 실시형태 3의 폴리펩타이드이되, 화학적 변형은 아세틸화, 아마이드화, 가교 또는 고리화를 포함한다.
실시형태 6은 실시형태 2의 폴리펩타이드이되, 변이체의 아미노산 내의 아미노산 치환은 β-아미노산, D-아미노산 또는 비-자연 아미노산의 치환을 포함한다.
실시형태 7은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 상기 폴리펩타이드는 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 (i)의 RHPP; 또는 (k)의 RI RHPP; 또는 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 (n)의 융합 폴리펩타이드; 또는 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 8은 실시형태 7의 폴리펩타이드이되, (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 9는 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 10은 실시형태 9의 폴리펩타이드이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 11은 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 12는 실시형태 11의 폴리펩타이드이되, 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스 또는 애뉴리니바실루스 박테리아 속으로부터 유래된다.
실시형태 13은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 14는 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 15는 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 16은 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 17은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 18은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 RHPP를 포함한다.
실시형태 19는 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 RI RHPP를 포함한다.
실시형태 20은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 21은 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 22는 실시형태 1 내지 21 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 코어 서열을 추가로 포함한다.
실시형태 23는 실시형태 22의 폴리펩타이드이되, 코어 서열은 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 24는 실시형태 1의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 25는 실시형태 24의 폴리펩타이드이되, 융합 폴리펩타이드는 지원 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 26은 실시형태 25의 폴리펩타이드이되, 지원 폴리펩타이드는 시그니처 폴리펩타이드를 포함하고, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542 내지 548 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 27은 실시형태 25의 폴리펩타이드이되, 지원 폴리펩타이드는 시그니처 폴리펩타이드를 포함하고, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함한다.
실시형태 28은 실시형태 25의 폴리펩타이드이되, 지원 폴리펩타이드는 신호 앵커 분류 폴리펩타이드를 포함하고, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 29는 실시형태 25의 폴리펩타이드이되, 지원 폴리펩타이드는 신호 앵커 분류 폴리펩타이드를 포함하고, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549를 포함한다.
실시형태 30은 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 파이토설포카인 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 31은 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 32는 실시형태 1 내지 6 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 33은 실시형태 1 내지 32 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 754 내지 768 중 임의의 하나를 포함하는 코어 서열을 더 포함하되, 코어 서열의 포함은 폴리펩타이드의 생물활성 프라이밍 활성도를 증가시킨다.
실시형태 34는 실시형태 1 내지 33 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 35는 실시형태 1 내지 34 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 36은 실시형태 1 내지 35 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 37은 실시형태 1 내지 36 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 38은 실시형태 1 내지 37 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 39는 실시형태 1 내지 38 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 41은 실시형태 1 내지 40 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 766 중 임의의 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는다.
실시형태 42는 실시형태 1 내지 41 중 임의의 하나의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 발효 생성물로부터 단리, 농축되고/되거나 부분적으로 정제된다.
실시형태 43은 실시형태 42의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 발효 생성물로부터 단리, 농축되고/되거나 여과 또는 크로마토그래피에 의해서 부분적으로 정제된다.
실시형태 44는 실시형태 42 또는 43의 폴리펩타이드이되, 폴리펩타이드는 발효 생성물로부터 단리, 농축되거나 또는 재조합 미생물로부터 부분적으로 정제된다.
실시형태 45는 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위한, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍용 조성물이되,
실시형태 1 내지 44 중 어느 하나의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물 및 농화학물질 또는 담체; 또는
실시형태 1 내지 44 중 임의의 하나의 폴리펩타이드의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 46은 실시형태 45의 조성물이되, 조성물은 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, (j)의 KTI 폴리펩타이드, (o)의 PSK 폴리펩타이드, (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물, 및 농화학물질 또는 담체(상기 농화학물질 또는 담체는 자연에서 상기 폴리펩타이드와 회합되지 않음)를 포함한다.
실시형태 47은 실시형태 45의 조성물이되, 조성물은
상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 상기 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 상기 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 상기 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (k)의 RI RHPP; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 상기 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물; 및
상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 48은 실시형태 46 또는 47의 조성물이되, 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물은 화학적 변형을 함유하지 않고; 변이체가 아니고; 융합 단백질의 부분이 아니고; 프로테아제 인식 서열을 함유하지 않는다.
실시형태 49는 실시형태 45의 조성물이되, 조성물은 상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 상기 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 상기 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 상기 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (k)의 RI RHPP; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 상기 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드 중 적어도 2종을 포함한다.
실시형태 50은 실시형태 45의 조성물이되, 조성물은 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 2종 이상을 포함하되,
상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 적어도 1종은 화학적 변형을 함유하거나; 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유하거나; 또는
상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 적어도 2종은 자연에서 회합되지 않는다.
실시형태 51은 실시형태 45의 조성물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 미생물에 의해서 재조합 방식으로 생산된다.
실시형태 52는 실시형태 51의 조성물이되, 미생물은 바실루스 속의 박테리아, 슈도모나스 속의 박테리아, 패니바실루스 속의 박테리아 페니실리엄 속의 진균, 글로무스 속의 박테리아, 안트로박터 속의 박테리아, 파라코쿠스 속의 박테리아, 리조븀 속의 박테리아, 브래디리조븀 속의 박테리아, 아조스프릴리엄 속의 박테리아, 엔테로박터 속의 박테리아, 에쉐리키아 속의 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물이다.
실시형태 53은 폴리펩타이드를 발현하거나 과발현하는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 실시형태 1 내지 44항 중 어느 하나의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 54는 실시형태 53의 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 또는 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드; 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 55는 실시형태 53 또는 54의 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 미생물에 의해서 과별환된다.
실시형태 56은 실시형태 55의 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 분비 신호로 제조된다.
실시형태 57은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 58은 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 이의 N 또는 C 말단에서 화학적으로 변형된다.
실시형태 59는 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 가교 또는 고리화를 통해서 변형된다.
실시형태 60은 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스, 패니바실루스, 애뉴리니바실루스 박테리아 속 또는 이들의 임의의 조합물로부터 유래된다.
실시형태 61은 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 75 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 62는 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 N-말단 폴리펩타이드를 포함하고, 절두된 N-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106,108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182,184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 63은 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 C-말단 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 절두된 C-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 64는 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751 내지 768 중 임의의 하나 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 65는 실시형태 64의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571, 574 및 752 또는 이들의 임의의 조합물 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 66은 실시형태 64의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 67은 실시형태 66의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 비-플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 전장 단백질 내에 혼입되고, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 혼입은 비-플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 전장 단백질에서 증가된 생물활성 프라이밍 활성도를 초래한다.
실시형태 68은 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 69는 실시형태 57의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 및 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 70은 실시형태 69의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301을 포함한다.
실시형태 71은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 72는 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 73는 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 74는 실시형태 73의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 651을 포함한다.
실시형태 75는 실시형태 74의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성할 수 있는데, 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 76은 실시형태 75의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641을 포함한다.
실시형태 77은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 PSK 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 78은 실시형태 77의 조성물 또는 재조합 미생물이되, PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함한다.
실시형태 79는 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 RHPP를 포함한다.
실시형태 80은 실시형태 79의 조성물 또는 재조합 미생물이되, RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함한다.
실시형태 81은 실시형태 80의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함한다.
실시형태 82는 실시형태 81의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752 및 571 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 83은 실시형태 82의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함한다.
실시형태 84는 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 RI RHPP를 포함한다.
실시형태 85는 실시형태 38 내지 47 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 86은 실시형태 85의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함한다.
실시형태 87은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, PSK 폴리펩타이드, RHPP, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 88은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 89는 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 분비 신호를 추가로 포함한다.
실시형태 90은 실시형태 88 또는 89의 조성물 또는 재조합 미생물이되, EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616을 포함한다.
실시형태 91는 실시형태 90의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 서열번호 617을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 92는 실시형태 88 내지 91 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하며, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 525, 526, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 541, 571 내지 586, 및 751-766 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 93은 실시형태 92의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하며, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 또는 752 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 94는 실시형태 92의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
실시형태 95는 실시형태 94의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함한다.
실시형태 96은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되,
(a) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571, 295, 300, 293 및 580; 또는 295, 300, 293 및 580; 또는 571, 295, 293 및 580; 또는 571, 300, 293 및 580; 또는 571, 293 및 580; 또는 571, 295, 293을 포함하거나; 또는
(b) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 및 셀로비오스, 셀룰로스, 키틴 또는 키토산 중 1종 이상을 포함하거나; 또는
(c) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226를 포함하고, 그리고 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 591을 포함하거나; 또는
(d) 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함하고, 그리고 상기 PSK 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함하거나; 또는
(e) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 그리고 상기 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함하거나; 또는
(f) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 571 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
(g) 상기 RHPP 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하거나; 또는
(h) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 226, 571, 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 그리고 상기 RHPP 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하거나; 또는
(i) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하고, 그리고 상기 RHPP 폴리펩타이드 및 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
실시형태 97은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 98은 실시형태 45 내지 56 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 갖는 융합 단백질이다.
실시형태 99는 실시형태 45 내지 98 중 임의의 하나의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드를 더 포함한다.
실시형태 100은 실시형태 99의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 시그니처 폴리펩타이드를 포함하고, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542 내지 548 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 101은 실시형태 99의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 시그니처 폴리펩타이드를 포함하고, 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함한다.
실시형태 102는 실시형태 99의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 신호 앵커 분류 폴리펩타이드를 포함하고, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 103은 실시형태 102의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 신호 앵커 분류 폴리펩타이드를 포함하고, 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549를 포함한다.
실시형태 104는 실시형태 99의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 분비 폴리펩타이드를 포함하고, 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563 내지 570 또는 769 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 105은 실시형태 104의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 분비 폴리펩타이드를 포함하고, 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563 또는 769를 포함한다.
실시형태 106은 실시형태 99 또는 104의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 엔테로카이나제 절단 서열을 포함하고, 엔테로카이나제 절단 서열의 아미노산 서열은 서열번호 772를 포함한다.
실시형태 107은 실시형태 106의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 지원 폴리펩타이드는 폴리펩타이드와 단백질 태그 사이에 연결 영역을 포함한다.
실시형태 108은 실시형태 107의 조성물 또는 재조합 미생물이되, 단백질 태그는 폴리-히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 항체 에피토프, 스트렙타비딘/바이오틴, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 109는 실시형태 45 내지 52 및 57 내지 108의 조성물 중 임의의 하나이되, 자연에서 폴리펩타이드와 회합되는 농화학물질 또는 담체를 추가로 포함한다.
실시형태 110은 실시형태 45 내지 52 및 57 내지 109 중 임의의 하나의 조성물이되, 농화학물질은 항생제, 생물살충제, 보존제, 완충제, 습윤제, 계면활성제, 코팅제, 단당류, 다당류, 연마제, 살충제, 살곤충제, 제초제, 살선충제, 살박테리아제, 살진균제, 살진드기제, 비료, 생물자극제, 삼투억제제, 착색제, 보습제, 아미노산, 생물학적 제어제 또는 이들의 조합물을 포함한다,
실시형태 111은 실시형태 110의 조성물이되, 보존제는 다이클로로펜, 벤질알코올 헤미 폼알, 아이소티아졸리논 유도체, 알킬아이소티아졸리논, 벤즈아이소티아졸리논, MIT (2- 메틸-4-아이소티아졸린-3-온), BIT (1,2-벤즈아이소티아졸린-3-온), 5-클로로-2-(4-클로로벤질)-3(2H)-아이소티아졸론, 5-클로로- 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온, 5-클로로-2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온, 5-클로로- 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온-하이드로클로라이드, 4,5-다이클로로-2-사이클로헥실-4- 아이소티아졸린-3-온, 4,5-다이클로로-2-옥틸-2H-아이소티아졸-3-온, 2-메틸-2H- 아이소티아졸-3-온, 2-메틸-2H-아이소티아졸-3-온-염화칼슘 복합체, 2-옥틸-2H-아이소티아졸-3-온 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 112는 실시형태 110 또는 111의 조성물이되, 완충제는 포타슘, 인산, 포스페이트염, 스트르산, 시트레이트 염류, 설페이트 염류, MOPS, HEPES 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 113은 실시형태 110 내지 112 중 임의의 하나의 조성물이되, 습윤제는 유기실리콘, 폴리옥시에톡실레이트, 폴리솔베이트, 폴리에틸렌글리콜 또는 이들의 유도체, 에톡실레이트, 작물 오일, 다당류 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
시형태 114는 실시형태 110 내지 113 중 임의의 하나의 조성물이되, 계면활성제는 중질 석유 오일, 중질 석유 증류물, 폴리올 지방산 에스터, 폴리에톡실화 지방산 에스터, 아릴 알킬 폴리옥시에틸렌 글리콜, 알킬 아민 아세테이트, 알킬 아릴 설포네이트, 다가 알코올, 알킬 포스페이트, 알코올 에톡실레이트, 알킬페놀 에톡실레이트, 알콕실화 폴리올s, 알킬 폴리에톡시 에터, 에톡실화 대두 오일 유도체, 알킬폴리옥시에틸렌 글리세롤, 알코올 에톡실레이트, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 모노부틸 에터, 유기실리콘 유도체 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 115는 실시형태 110 내지 114 중 임의의 하나의 조성물이되, 코팅제는 증점제, 중합체, 충전제, 벌킹제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 116은 실시형태 115의 조성물이되, 증점제는 카복시메틸셀룰로스, 자연 중합체, 합성 중합체, 아라비아검, 키틴, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 아세테이트, 자연 인지질, 세팔린, 레시틴, 합성 인지질, 폴리에스터, 폴리에터 에스터, 폴리언하이드라이드, 폴리에스터 우레탄, 폴리에스터 아마이드; 폴리바이닐 아세테이트; 폴리바이닐 아세테이트 공중합체; 타일로스; 폴리바이닐 알코올 공중합체; 폴리바이닐피롤리돈; 다당류, 전분, 변형된 전분, 전분 유도체, 덱스트린, 말토덱스트린, 알지네이트, 키토산, 셀룰로스, 셀룰로스 에스터, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 에터 에스터, 에틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스; 지방; 오일; 단백질, 카제인, 젤라틴, 제인; 쉘락; 바이닐리덴 클로라이드, 바이닐리덴 클로라이드 공중합체; 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트; 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 아크릴 공중합체; 폴리바이닐아크릴레이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리부텐, 폴리아이소부텐, 폴리스타이렌, 폴리부타다이엔, 폴리에틸렌아민, 폴리에틸렌아마이드; 아크릴아마이드 중합체 또는 공중합체; 폴리하이드록시에틸 아크릴레이트, 메틸아크릴아마이드; 폴리클로로프렌 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 117은 실시형태 110 내지 116 중 임의의 하나의 조성물이되, 연마제는 탤크, 흑연 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 118은 실시형태 110 내지 117중 임의의 하나의 조성물이되, 살충제는 살곤충제, 제초제, 살진균제, 살박테리아제, 살선충제, 살진드기제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 119는 실시형태 118의 조성물이되, 살곤충제는 클로티아니딘, 이미다클로프리드, 유기포스페이트, 카바메이트, 피레트로이드, 살비제, 알킬 프탈레이트, 붕산, 붕산염, 플루오라이드, 황, 할로방향족 치환된 유레아, 탄화수소 에스터, 생물계 살곤충제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 120은 실시형태 118의 조성물이되, 제초제는 하기를 포함한다: 2,4-D, 2,4-DB, 아세토클로르, 아시플루오르펜, 알라클로르, 아메트린, 아트라진, 아미노피랄리드, 베네핀, 벤설퓨론, 벤설퓨론 메틸 벤설파이드, 벤타존, 비스피리박 소듐, 브로마실, 브로목시닐, 부틸레이트, 카르펜트라존, 클로리뮤론, 2-클로로페녹시 아세트산, 클로르설퓨론, 클로리뮤론 에틸, 클레토딤, 클로마존, 클로피랄리드, 클로란설람, CMPP-P-DMA, 사이클로에이트, DCPA, 데스메디팜, 디캄바, 다이클로베닐, 다이클로폽, 2,4-다이클로로페놀, 다이클로로페녹시아세트산, 다이클로프롭, 다이클로프롭-P, 다이클로설람, 다이플루펜조피르, 다이메텐아미드, 2,4-다이클로로페녹시아세트산의 다이메틸 아민염, 다이쿼트, 다이유론, DSMA, 엔도탈, EPTC, 에탈플루랄린, 에토퓨메세이트, 페녹사프롭, 플루지폽-P, 플루카바존, 플루페나세트, 플루메트설람, 플루미클락, 플루미옥사진, 플루오메투론, 플루록시피르, 플루오르자이피르 1-메틸엡틸에스터, 포메사펜, 포메사펜 나트륨염, 포람설퓨론, 글루포시네이트, 글루포시네이트-암모늄, 글리포세이트, 할로설퓨론, 할로설퓨론-메틸, 헥사지논, 2-하이드록시페녹시 아세트산, 4-하이드록시페녹시 아세트산, 이마자메타벤즈, 이마자목스, 이마자픽, 이마자퀸, 이마제타피르, 아이속사벤, 아이속사플루톨, 락토펜, 리누론, 마자피르, MCPA, MCPB, 메코프롭, 메코프롭-P, 메소트라이온, 메톨라클로르-s, 메트리부진, 메트설퓨론, 메트설퓨론-메틸, 몰리네이트, MSMA, 나프롭아마이드, 납탈람, 니코설퓨론, 노르플루라존, 오리잘린, 옥사디아존, 옥시플루오르펜, 파라쿼트, 펠라곤산, 펜다이메탈린, 펜메디팜, 피클로람, 프리미설퓨론, 프로다이아민, 프로메트린, 프론아마이드, 프로파닐, 프로설퓨론, 피라존, 피리티오박, 피록사설폰, 퀸클로락, 퀴잘로폽, 림설퓨론, 세톡시딤, 시두론, 시마진, 설펜트라존, 설포메투론, 설포설퓨론, 테부티우론, 터바실, 티아조피르, 티펜설퓨론, 티펜설퓨론-메틸, 티오벤카르브, 트랄콕시딤, 트라이랄레이트, 트라이아설퓨론, 트라이베뉴론, 트라이버뉴론-메틸, 트라이클로피르, 트라이플루랄린, 트라이플루설퓨론 또는 이들의 임의의 조합물.
실시형태 121은 실시형태 118의 조성물이되, 살선충제는 바실루스 피르무스, 플루오피람, 항생제 살선충제, 아바멕틴; 카바메이트 살선충제, 아세토프롤, 바실루스 키토노스포러스, 클로로피크린, 벤클로티아즈, 베노밀, 버홀데리아 세파시아, 카보푸란, 카보설판 및 클레오토카드; 다조메트, DBCP, DCIP, 알라니캅, 알디캅, 알독시캅, 옥사밀, 다이아미다포스, 페나미포스, 포스티에탄, 포스파마이돈, 카두사포스, 클로르피리포스, 다이클로펜티온, 다이메토에이트, 에토프로포스, 펜설포티온, 포스티아제이트, 하핀즈, 헤테로포스, 이미시아포스, 이사피도포스, 이사조포스, 메토밀, 메카폰, 마이로테큠 버루카리, 패실로마이세스 리라시누스, 파스테우리아 니쉬자왜, 포레이트, 포스포캅, 터부포스, 티오나진, 티옥사자펜, 트라이아조포스, 다조메트, 1,2-다이클로로프로판, 1,3-다이클로로프로펜, 퍼퍼랄, 아이오도메탄, 메탐, 메틸 브로마이드, 메틸 아이소티오사이아네이트, 자일렌올 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 122는 실시형태 118의 조성물이되, 살박테리아제는 스트렙토마이신, 페니실린, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 암피실린, 옥솔린산, 카수가마이신, 클로로테트라사이클린, 구리 옥사이드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 123은 실시형태 122의 조성물이되, 살박테리아제는 옥시테트라사이클린을 포함한다.
실시형태 124는 실시형태 118의 조성물이되, 생물학적 제어제는 바실루스 투린기엔시스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 마이코이데스 단리물 J, 바실루스 메틸로트로피쿠스, 바실루스 발리스모티스, 크로모박테리움 서브츠개, 델프티아 아시도보란스, 스트렙토마이세스 리디쿠스, 스트렙토마이세스 콜롬비엔시스, 스트렙토마이세스 갈부스 K61, 페니실리엄 빌라이, 당단백질-생산 바실루스 섭틸리스 균주, 당단백질-생산 바실루스 아밀로리퀴파시엔스 균주, 바실루스 피르무스 균주 또는 바실루스 푸밀러스 균주를 포함한다.
실시형태 125는 실시형태 110 내지 124 중 임의의 하나의 조성물이되, 비료는 암모늄 설페이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 설페이트 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 바이설페이트, 암모늄 폴리설파이드, 암모늄 티오설페이트, 수성 암모니아, 무수 암모니아, 암모늄 폴리포스페이트, 알루미늄 설페이트, 칼슘 나이트레이트, 칼슘 암모늄 나이트레이트, 칼슘 설페이트, 하소된 마그네사이트, 방해석질 석회암, 칼슘 옥사이드, 칼슘 나이트레이트, 백운석질 석회암, 소석회, 칼슘 카보네이트, 다이암모늄 포스페이트, 모노암모늄 포스페이트, 마그네슘 나이트레이트, 마그네슘 설페이트, 포타슘 나이트레이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 마그네슘 설페이트, 포타슘 설페이트, 소듐 나이트레이트, 마그네시아질 석회암, 마그네시아, 유레아, 유레아-폼알데하이드, 유레아 암모늄 나이트레이트, 황-코팅된 유레아, 중합체-코팅된 유레아, 아이소부틸리덴 다이유레아, K2SO4-Mg2SO4, 카이나이트, 실비나이트, 키젤석, 엡솜염, 황 원소, 이회암, 패분, 어분, 오일 케이크, 어비, 혈분, 인광석, 과인산염, 슬래그, 골분, 나무재, 거름, 박쥐 구아노, 초탄, 퇴비, 산사, 면실박, 우모분, 갑각류분, 어류 에멀션, 휴믹산 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 126은 실시형태 110 내지 125 중 임의의 하나의 조성물이되, 비료는 붕산, 붕산염, 붕소 프릿, 구리 설페이트, 구리 프릿, 구리 킬레이트, 소듐 테트라붕산염 10수화물, 철 설페이트, 철 옥사이드, 철 암모늄 설페이트, 철 프릿, 철 킬레이트, 망간 설페이트, 망간 옥사이드, 망간 킬레이트, 망간 클로라이드, 망간 프릿, 소듐 몰리브데이트, 몰리브덴산, 아연 설페이트, 아연 옥사이드, 아연 카보네이트, 아연 프릿, 아연 포스페이트, 아연 킬레이트 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 127은 실시형태 110 내지 126 중 임의의 하나의 조성물이되, 생물자극제는 해조류 추출물, 유도인자, 다당류, 단당류, 단백질 추출물, 대두 추출물, 휴믹산, 식물 호르몬, 식물 성장 조절제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 128은 실시형태 110 내지 126 중 임의의 하나의 조성물이되, 아미노산은 시스테인을 포함한다.
실시형태 129는 실시형태 57 내지 128 중 임의의 하나의 조성물이되, 살진균제를 추가로 포함한다.
실시형태 130은 실시형태 129의 조성물이되, 살진균제는 스트로빌루린 살진균제 또는 트라이아졸론 살진균제를 포함한다.
실시형태 131은 실시형태 130의 조성물이되, 스트로빌루린 살진균제는 스트로빌루린 A, 스트로빌루린 B, 스트로빌루린 C, 스트로빌루린 D, 스트로빌루린 E, 스트로빌루린 F, 스트로빌루린 G, 스트로빌루린 H, 아족시스트로빈, 트라이플록시스트로빈, 크레속심 메틸, 플루옥사스트로빈, 피콕시스트로빈 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 132는 실시형태 131의 조성물이되, 스트로빌루린 살진균제는 아족시스트로빈, 트라이플록시스트로빈, 크레속심 메틸, 플루옥사스트로빈, 피콕시스트로빈, 피라클로스트로빈 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 133은 실시형태의 조성물 131이되, 스트로빌루린 살진균제는 트라이플록시스트로빈을 포함한다.
실시형태 134는 실시형태의 조성물 131이되, 스트로빌루린 살진균제는 플루옥사스트로빈을 포함한다.
실시형태 135는 실시형태 130 내지 134 중 임의의 하나의 조성물이되, 트라이아졸론 살진균제는 프로티오코나졸, 이미다졸, 이미다질, 프로클로라즈, 프로피코나졸, 트라이플루미졸, 다이니코나졸, 플루실라졸, 펜코나졸, 헥사코나졸, 사이프로코나졸, 마이클로부타닐, 테부코나졸, 다이페노코나졸, 테트라코나졸, 펜부코나졸, 에폭시코나졸, 메트코나졸, 플루퀸코나졸, 트라이티코나졸 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 136은 실시형태 130 내지 135 중 임의의 하나의 조성물이되, 트라이아졸론 살진균제는 프로티오코나졸을 포함한다.
실시형태 137은 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 136 중 임의의 하나의 조성물이되, 보습제는 글리세롤, 글리세린, 글리세롤 유도체, 글리세롤 트라이아세테이트, 트라이아세틴, 프로필렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 트라이에틸렌 글리콜, 트라이폴리프로필렌 글리콜, 글리세릴 트라이아세테이트, 수크로스, 태가토스, 당 알코올, 당 폴리올솔비톨, 자일리톨, 만니톨, 만티톨, 중합체 폴리올, 폴리덱스트로스, 콜라겐, 알로에, 알로에 베라 겔 또는 알파 하이드록시산, 꿀, 당밀, 퀼라이아, 소듐 헥사메타포스페이트, 염화리튬, 유레아, 부틸렌 글리콜 또는 트레멜라 추출물을 포함한다.
실시형태 138은 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 137 중 임의의 하나의 조성물이되, 담체는 물, 토탄, 밀, 겨, 질석, 점토, 살균 토양, 칼슘 카보네이트, 칼슘 바이카보네이트, 백운석, 석고, 벤토나이트, 점토, 인광석, 인 화합물, 타이타늄 다이옥사이드, 부엽토, 탤크, 알지네이트, 활성 차콜 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 139는 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 138 중 임의의 하나의 조성물이되, 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.00001wt% 내지 약 95%의 폴리펩타이드(들), 약 0.01% 내지 약 80wt%의 농화학물질 및 약 5 내지 약 50wt%의 담체를 포함한다.
실시형태 140은 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 139 중 임의의 하나의 조성물이되, 상기 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.01% 내지 약 5%의 폴리펩타이드(들), 약 0.2% 내지 약 70wt%의 농화학물질 및 약 10 내지 약 30wt% 담체를 포함한다.
실시형태 141은 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 139 중 임의의 하나의 조성물이되, 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.05% 내지 약 1%의 폴리펩타이드(들), 약 30% 내지 약 60wt%의 농화학물질 및 약 40 내지 약 69wt% 담체를 포함한다.
실시형태 142는 실시형태 45 내지 52 또는 57 내지 141 중 임의의 하나의 조성물이되, 농화학물질은 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산을 포함한다.
실시형태 143은 실시형태 142의 조성물이되, 농화학물질은 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산을 포함하고, 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.001wt% 내지 약 30%wt%를 차지한다.
실시형태 144는 실시형태 143의 조성물이되, 농화학물질은 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산을 포함하고, 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.01wt% 내지 약 20%wt%를 차지한다.
실시형태 145는 실시형태 144의 조성물이되, 농화학물질은 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산을 포함하고, 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.1wt% 내지 약 5wt%를 차지한다.
실시형태 146은 실시형태 1 내지 44 중 임의의 하나의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물, 또는 실시형태 45 내지 52 및 57 내지 145 중 임의의 하나의 조성물 또는 실시형태 53 내지 108 중 임의의 하나의 재조합 미생물로 코팅된 종자이다.
실시형태 147은 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 방법이되,
(a) 실시형태 1 내지 45 중 임의의 하나의 펩타이드 또는 실시형태 45 내지 52 및 57 내지 145 중 임의의 하나의 조성물을 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질 또는 상기 식물 또는 상기 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 도포하여 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 구조를 변화시키는 단계; 또는
(b) 실시형태 1 내지 45 중 임의의 하나의 펩타이드 또는 실시형태 45 내지 52 및 57 내지 145 중 어느 한 항의 조성물을 식물 성장 매질에 도포하여 상기 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 보호하고/하거나 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 식물 구조를 변화시키는 단계; 또는
(c) 실시형태 53 내지 56, 102 및 105 중 어느 하나의 재조합 미생물을 식물, 식물 부분, 또는 식물 성장 매질 또는 상기 식물 또는 상기 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 도포하여 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함하되, 상기 재조합 미생물은 상기 폴리펩타이드를 발현하고, 상기 폴리펩타이드의 발현은 동일한 조건 하에서 동일한 부류의 야생형 미생물에서의 상기 폴리펩타이드의 상기 발현 수준과 비교할 때 증가된다.
실시형태 148은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 Flg22 폴리펩타이드(Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 149는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 FlgII-28 폴리펩타이드(FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 150은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 151은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서, RHPP 폴리펩타이드(RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603, 604 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드(KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함함); 레트로-인버소 RHPP 폴리펩타이드(RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605, 606 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 152는 실시형태 147 내지 151 중 임의의 하나이되, 비생물학적 스트레스는 고온 스트레스, 온도 스트레스, 방사선 스트레스, 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 염류 스트레스, 영양-결핍 스트레스, 고 금속 스트레스, 물 스트레스, 삼투성 스트레스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 153은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 Flg22 폴리펩타이드(Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함함); 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드(레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나를 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 154는 실시형태 147 또는 153의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 FlgII-28 폴리펩타이드(FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나를 포함함); 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드(레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525중 임의의 하나를 포함함); 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 155는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서, Flg22 폴리펩타이드(Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752 또는 571을 포함함) 및 EF-Tu 폴리펩타이드(EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함함)를 포함한다.
실시형태 156은 실시형태 147의 방법이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 질병, 곤충 또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하기 위해서, 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586, 및 751-766 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 157은 실시형태 156의 방법이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571 574, 751 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 158은 실시형태 147 및 150 내지 157 중 임의의 하나의 방법이되, 질병은 아시아 감귤 녹화, 감귤그린(HLB)병, 아시아 대두 녹병, 스클레로티니아 줄기 썩음병 (또는 흰곰팡이), 슈도모나스 잎 반점병, 또는 세르코스포라 잎 마름병을 포함한다.
실시형태 159는 실시형태 158의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 Flg22 폴리펩타이드를 포함하고, Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 160은 실시형태 158의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함하고, FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 161은 실시형태 158의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 Flg22 폴리펩타이드 및 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함하고, Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 조합물을 포함하고, FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 162은 실시형태 161의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드, 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 추가로 포함하고, 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 163은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분의 수확률, 성장 및/또는 생산성을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위해서 RHPP 폴리펩타이드 및/또는 RI RHPP 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 164는 실시형태 163의 방법이되, RHPP 폴리펩타이드는 서열번호 600을 포함한다.
실시형태 165는 실시형태 163 또는 164의 방법이되, 성장은 뿌리 성장, 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 166은 실시형태 163 내지 165 중 임의의 하나의 방법이되, 식물은 대두를 포함하고, 성장은 전체 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 식물당 뿌리혹, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 그리고 생산성은 총 깍지의 수 또는 마디당 깍지를 포함한다.
실시형태 167은 실시형태 163 내지 166 중 임의의 하나의 방법이되, 식물 구조는 식물 또는 식물 부분에 대한 이로운 결과를 포함한다.
실시형태 168은 실시형태 167의 방법이되, 이로운 결과는 식물의 경작지의 증가된 경작 밀도를 포함한다.
실시형태 169는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 식물 또는 식물 부분을 보호하고/하거나 식물 또는 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키기 위해서 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 RHPP 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 170은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 고온 및 가뭄 경향이 있는 환경에서 식물 또는 식물 부분의 수확률을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 171은 실시형태 170의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 꽃 형성 직전에 또는 개화기 이전에 적용된다.
실시형태 172는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 또는 식물 부분의 성장을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드, RHPP, 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 173은 실시형태 172의 방법이되, 성장은 뿌리 및 꽃 정단 분열조직, 꽃 기관 생산, 열매 발달, 열매 생산, 꽃 기관의 수, 꽃 기관, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 174은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 식물 성장을 위한 스트레스 및 비-스트레스 조건 둘 다의 경향이 있는 환경에서 식물 또는 식물 부분의 성장 및 생산을 증가시키기 위해서 PSK 폴리펩타이드 및 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 175는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 176은 실시형태 175의 방법이되, 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성할 수 있되, 상기 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 177은 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드는 Flg22 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 178은 실시형태 177의 방법이되, 폴리펩타이드는 서열번호 526 및 527을 포함한다.
실시형태 179는 실시형태 177의 방법이되, 폴리펩타이드는 서열번호 226 및 227을 포함한다.
실시형태 180은 실시형태 175 또는 176의 방법이되, 질병은 아시아 감귤병(HLB), 감귤 궤양병, 세르코스포라 잎 마름병 또는 박테리아 유발 질병을 포함한다.
실시형태 181은 실시형태 180의 방법이되, 박테리아 유발 질병은 박테리아 잎 마름병, 박테리아 줄기 썩음병, 박테리아 잎 반점병, 박테리아 잎 그을음병, 박테리아 상부 썩음병, 박테리아 줄무늬병, 갈색 무늬병, 고스 박테리아 시드름병 및 마름병, 홀커스 반점병, 자색 잎자루, 종자 썩음병, 묘목 마름병, 스테바르트병(박테리아 시드름병), 옥수수 생육저해병, 화상병, 피어스병, 감귤 얼룩 백화증, 감귤 궤양병, 슈도모나스 시린개 세로바스 또는 이들의 조합물을 포함한다.
실시형태 182는 실시형태 147의 방법이되, 폴리펩타이드 또는 조성물은 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드를 포함하되, 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 525 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 183은 실시형태 147의 방법이되, 질병은 아시아 대두 녹병, 세르코스포라 또는 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이)을 포함하되, 폴리펩타이드 또는 조성물은,
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752, 및 571 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드; 또는
플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752, 및 571 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기RHPP 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 184는 실시형태 183의 방법이되, 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함한다.
실시형태 185는 183 또는 184의 방법이되, 조성물은 살진균제를 추가로 포함한다.
실시형태 186은 실시형태 147의 방법이되, 질병은 박테리아 질병을 포함하되, 방법은 박테리아의 성장을 제한하고/하거나 질병을 예방하는 것을 포함하고, 플라젤린- 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 752 및 571 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 187는 실시형태 186의 방법이되, 박테리아는 슈도모나스 시린개 pv. 악티니디애를 포함한다.
실시형태 188은 실시형태 187의 방법이되, 식물은 키위 식물을 포함한다.
실시형태 189는 실시형태 147의 방법이되, 질병은 아시아 감귤 녹화를 포함하고, 조성물은 살박테리아제 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
실시형태 190은 189의 방법이되, 살박테리아제는 옥시테트라사이클린을 포함한다.
실시형태 191은 실시형태 147의 방법이되, 질병은 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이)을 포함하고, 조성물은 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 571, 751 및 752 중 임의의 하나를 포함한다.
실시형태 192는 실시형태 147 내지 191 중 임의의 하나의 방법이되, 질병으로부터의 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 보호는 식물 또는 식물 부분 상에서 또는 그 내에서의 예방적 처리, 처리, 예방 및 감소된 질병 진행을 포함한다.
실시형태 193은 실시형태 147 내지 192 중 임의의 하나의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물, 또는 재조합 미생물은 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질에 외인적으로 적용된다.
실시형태 194는 실시형태 147 내지 193 중 임의의 하나의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물, 또는 재조합 미생물은 식물 또는 식물 부분에 내인적으로 투여된다.
실시형태 195는 실시형태의 147 내지 194 중 임의의 하나의 방법이되, 식물 부분은 세포, 잎, 가지, 줄기, 꽃, 나뭇잎, 꽃 기관, 열매, 화분, 채소, 괴경, 구경, 구근, 위구경, 깍지, 뿌리, 분형근, 뿌리 줄기, 접순 또는 종자를 포함한다.
실시형태 196은 실시형태 147 내지 195중 임의의 하나의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 식물의 표면, 식물의 나뭇잎 또는 식물의 종자의 표면에 적용된다.
실시형태 197은 실시형태 196의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 종자의 표면에 적용되고, 식물 또는 식물 부분은 종자로부터 재배된다.
실시형태 198은 실시형태 147 내지 197중 임의의 하나의 방법이되, 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 엽면 시비로서 적용된다.
실시형태 199는 실시형태 147 내지 198 중 임의의 하나의 방법이되, 식물은 열매 식물 또는 채소 식물이고, 방법은 열매 또는 채소에 증가된 수확률을 제공한다.
실시형태 200은, 폴리펩타이드의 생산 방법이되, 실시형태 1 내지 44 중 어느 하나의 폴리펩타이드 및 엔테로카이나제(EK) 절단 부위를 포함하는 융합 단백질을 발효를 통해서 생산하는 단계를 포함하되, 엔테카이나제 절단 부위는 폴리펩타이드의 활성도 및 안정성을 향상시킨다.
실시형태 201은 실시형태 200의 방법이되, 엔테로카이나제를 제조된 융합 단백질에 적용하여 엔테로카이나제 절단 부위를 절단하고, 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다.
실시형태 202는 실시형태 200 또는 201의 방법이되, 엔테로카이나제 절단 부위는 서열번호 772를 포함한다.
실시형태 203은 실시형태 200 내지 202 중 임의의 하나의 방법이되, 융합 단백질은 단백질 태그를 추가로 포함한다.
실시형태 204는 실시형태 203의 방법이되, 단백질 태그는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)를 포함한다.
실시형태 205는 중 실시형태 200 내지 204임의의 하나의 방법이되, 융합 단백질은 분비 신호를 추가로 포함한다.
실시형태 206은 실시형태 205의 방법이되, 분비 신호는 서열번호 563 내지 570 또는 769 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
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SEQUENCE LISTING <110> Spogen Biotech Inc. <120> BIOACTIVE POLYPEPTIDES FOR IMPROVEMENTS IN PLANT PROTECTION, GROWTH AND PRODUCTIVITY <130> WO/2019/018768 <140> PCT/US2018/043092 <141> 2018-07-20 <150> US 62/534,710 <151> 2017-07-20 <160> 775 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 283 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 1 Met Arg Ile Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg Thr Gln Glu Tyr Met 1 5 10 15 Arg Gln Asn Gln Ala Lys Met Ser Asn Ala Met Asp Arg Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ala Thr Arg Met Lys Ala Arg Glu Gly Gly Leu Asn Val Ala Gly Arg 50 55 60 Asn Thr Gln Asp Gly Met Ser Leu Ile Arg Thr Ala Asp Ser Ala Leu 65 70 75 80 Asn Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Leu Ala Asn Gln 85 90 95 Ser Ala Asn Gly Thr Asn Thr Lys Gly Asn Gln Ala Ser Leu Gln Lys 100 105 110 Glu Phe Ala Gln Leu Thr Glu Gln Ile Asp Tyr Ile Ala Lys Asn Thr 115 120 125 Gln Phe Asn Asp Gln Gln Leu Leu Gly Thr Ala Asp Lys Lys Ile Lys 130 135 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Thr Pro 100 105 <210> 195 <211> 49 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 195 Met Ala Ala Ser Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala Asp Met Ala Lys Glu 1 5 10 15 Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Ser Glu Ala Gly Ile Ser 20 25 30 Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met Val Ser Lys Leu Leu 35 40 45 Gln <210> 196 <211> 102 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 196 Ala Val Trp Leu Ala Met Ser Arg Ile Arg Arg Arg Ile Leu Asp Thr 1 5 10 15 Asp Cys Lys Ala Glu Ser Ala Val Arg Ile Lys Glu Ile Pro Ser Asp 20 25 30 Val Leu Arg Ala Ala Thr Glu Arg Pro Leu Ser Cys Ala Arg Ile Arg 35 40 45 Val Ala Ile Ala Arg Pro Ala Ala Ser Ser Glu Ala Leu Leu Ile Arg 50 55 60 Leu Pro Leu Asp Lys Arg Ser Ile Ala Leu Leu Ile Leu Ala Trp Phe 65 70 75 80 Trp Arg Met Tyr Ser Cys Val Arg Met Leu Leu Met Phe Val Leu Ile 85 90 95 Leu Met Leu Arg Thr Pro 100 <210> 197 <211> 50 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 197 Ser Met Ala Ala Ser Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala Asp Met Ala Lys 1 5 10 15 Glu Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Ser Glu Ala Gly Ile 20 25 30 Ser Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met Val Ser Lys Leu 35 40 45 Leu Gln 50 <210> 198 <211> 128 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 198 Gly Phe Leu Asn Met Arg Ile Gly Thr Asn Phe Leu Ser Met Asn Ala 1 5 10 15 Arg Gln Ser Leu Tyr Glu Asn Glu Lys Arg Met Asn Val Ala Met Glu 20 25 30 His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro Ala 35 40 45 Asn Ile Ala Ile Val Thr Arg Met His Ala Arg Ala Asn Gly Met Arg 50 55 60 Val Ala Ile Arg Asn Asn Glu Asp Ala Ile Ser Met Leu Arg Thr Ala 65 70 75 80 Glu Ala Ala Leu Gln Thr Val Met Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Asp 85 90 95 Leu Ala Ile Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Asn Lys Asn Arg Asp 100 105 110 Ser Leu Asn Lys Glu Phe Gln Ser Leu Thr Glu Gln Ile Ser Tyr Ile 115 120 125 <210> 199 <211> 70 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 199 Leu Gly Ala Met Ile Asn Arg Leu His Phe Asn Ile Glu Asn Leu Asn 1 5 10 15 Ser Gln Ser Met Ala Leu Thr Asp Ala Ala Ser Arg Ile Glu Asp 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210 <211> 148 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 210 Met Ile Ile Ser His Asn Leu Thr Ala Leu Asn Thr Met Asn Lys Leu 1 5 10 15 Lys Gln Lys Asp Leu Ala Val Ser Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Leu Arg Ile Asn Gly Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Asn Gln Ala Ser Arg 50 55 60 Asn Ile Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Val Ala Asp Gly Ala Met 65 70 75 80 Gln Glu Ile His Ser Met Leu Gln Arg Met Asn Glu Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ala Ser Asn Gly Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Arg Leu Asn Ile Gln Ser 100 105 110 Glu Val Glu Gln Leu Ile Glu Glu Ile Asp Glu Ile Ala Gly Asn Thr 115 120 125 Gly Phe Asn Gly Ile Lys Leu Leu Asn Gly Asn Asn Glu Lys Thr Glu 130 135 140 Lys Thr Glu Lys 145 <210> 211 <211> 84 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 211 Ile Ser Ala Ala Ile Asp Lys Val Ser Ala Glu Arg Ala Arg Met Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Gln Asn Arg Leu Glu His Ser Arg Asn Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Ala Glu Asn Leu Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met 35 40 45 Ala Lys Glu Met Met Glu Leu Met Lys Asn Gln Ile Phe Thr Gln Ala 50 55 60 Gly Gln Ala Met Leu Leu Gln Thr Asn Thr Gln Pro Gln Ala Ile Leu 65 70 75 80 Gln Leu Leu Lys <210> 212 <211> 148 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 212 Met Arg Ile Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg Thr Gln Glu Tyr Met 1 5 10 15 Arg Gln Asn Gln Ala Lys Met Ser Asn Ala Met Asp Arg Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ala Thr Arg Met Arg Ala Arg Glu Ser Gly Leu Gly Val Ala Ala Asn 50 55 60 Asn Thr Gln Asp Gly Met Ser Leu Ile Arg Thr Ala Asp Ser Ala Met 65 70 75 80 Asn Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Leu Ala Asn Gln 85 90 95 Ser Ala Asn Gly Thr Asn Thr Lys Glu Asn Gln Asp Ala Leu Asp Lys 100 105 110 Glu Phe Gly Ala Leu Lys Glu Gln Ile Asp Tyr Ile Ser Lys Asn Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Asp Lys Lys Leu Leu Asn Gly Asp Asn Lys Ser Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Thr Leu 145 <210> 213 <211> 84 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 213 Ile Asp Ser Ala Leu Glu Thr Ile Ala Ser Asn Arg Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Ala Thr Leu Asn Arg Leu Asp Phe Asn Val Asn Asn Leu Lys Ser Gln 20 25 30 Ser Ser Ala Met Ala Ser Ala Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala Asp Met 35 40 45 Ala Lys Glu Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Asn Glu Ala 50 55 60 Gly Ile Ser Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met Val Ser 65 70 75 80 Lys Leu Leu Gln <210> 214 <211> 172 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 214 Met Gln Lys Ser Gln Tyr Lys Lys Met Gly Val Leu Lys Met Arg Ile 1 5 10 15 Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg Thr Gln Glu Tyr Met Arg Gln Asn 20 25 30 Gln Asp Lys Met Asn Val Ser Met Asn Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg 35 40 45 Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile Ala Thr Arg 50 55 60 Met Arg Ala Arg Gln Ser Gly Leu Glu Lys Ala Ser Gln Asn Thr Gln 65 70 75 80 Asp Gly Met Ser Leu Ile Arg Thr Ala Glu Ser Ala Met Asn Ser Val 85 90 95 Ser Asn Ile Leu Thr Arg Met Arg Asp Ile Ala Val Gln Ser Ser Asn 100 105 110 Gly Thr Asn 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Bacillus anthracis <400> 218 Met Arg Ile Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg Thr Gln Glu Tyr Met 1 5 10 15 Arg Gln Asn Gln Asp Lys Met Asn Val Ser Met Asn Arg Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ala Thr Arg Met Arg Ala Arg Gln Ser Gly Leu Glu Lys Ala Ser Gln 50 55 60 Asn Thr Gln Asp Gly Met Ser Leu Ile Arg Thr Ala Glu Ser Ala Met 65 70 75 80 Asn Ser Val Ser Asn Ile Leu Thr Arg Met Arg Asp Ile Ala Val Gln 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Thr Asn Thr Ala Glu Asn Gln Ser Ala Leu Gln Lys 100 105 110 Glu Phe Ala Glu Leu Gln Glu Gln Ile Asp Tyr Ile Ala Lys Asn Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Asp Lys Asn Leu Leu Ala Gly Thr Gly Ala Val Thr Ile 130 135 140 Gly Ser Thr Ser Ile Ser Gly Ala Glu Ile Ser Ile Glu Thr Leu 145 150 155 <210> 219 <211> 76 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 219 Ala Leu Asn Thr Val Ala Gly Asn Arg Ala Thr Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 10 15 Asn Arg Leu Asp Arg Asn Val Glu Asn Leu Asn Asn Gln Ala Thr Asn 20 25 30 Met Ala Ser Ala 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Arg Ala Thr Leu Gly 1 5 10 15 Ala Thr Leu Asn Arg Leu Asp Arg Asn Val Glu Asn Leu Asn Asn Gln 20 25 30 Ala Thr Asn Met Ala Ser Ala Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala Asp Met 35 40 45 Ala Lys Glu Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Asn Glu Ala 50 55 60 Gly Ile Ser Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met Val Ser 65 70 75 80 Lys Leu Leu Gln <210> 222 <211> 154 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 222 Met Arg Ile Asn His Asn Ile Thr Ala Leu Asn Thr Tyr Arg Gln Phe 1 5 10 15 Asn Asn Ala Asn Asn Ala Gln Ala Lys Ser Met Glu Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Gln Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Asp Gln Ala Ser Arg 50 55 60 Asn Ala Gln Asp Gly Val Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Asn Glu Thr His Asp Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Val Val Gln 85 90 95 Ala Gly Asn Gly Thr Asn Lys Thr Glu Asp Leu Asp Ala Ile Gln Asp 100 105 110 Glu Ile Gly Ser Leu Ile Glu Glu Ile Gly Gly Glu Ala Asp Ser Lys 115 120 125 Gly Ile Ser Asp Arg Ala Gln Phe Asn Gly Arg Asn Leu Leu Asp Gly 130 135 140 Ser Leu Asp Ile Thr Leu Gln Val Gly Ala 145 150 <210> 223 <211> 53 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 223 Ile Ile Asp Gly Ala Ile Asn Gln Val Ser Glu Gln Arg Ser Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ala Thr Gln Asn Arg Leu Asp His Thr Ile Asn Asn Leu Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Glu Asn Leu Thr Ala Ser Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp 35 40 45 Tyr Ala Leu Ala Ala 50 <210> 224 <211> 148 <212> PRT <213> Aneurinibacillus sp. <400> 224 Met Arg Ile Asn His Asn Leu Pro Ala Leu Asn Ala Tyr Arg Asn Leu 1 5 10 15 Ala Gln Asn Gln Ile Gly Thr Ser Lys Ile Leu Glu Arg Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Tyr Arg Ile Asn Arg Ala Ser Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Gln Gly Gln Arg 50 55 60 Asn Thr Met Asp Gly Val Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu 65 70 75 80 Gln Glu Ile His Glu Met Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Ala Val Gln 85 90 95 Ala Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Asp Lys Asp Lys Lys Ala Ile Glu Asp 100 105 110 Glu Ile Asn Gln Leu Thr Ala Gln Ile Asp Gln Ile Ala Lys Thr Thr 115 120 125 Glu Phe Asn Gly Ile Gln Leu Ile Gly Asp Ser Asp Ser Thr Ser Leu 130 135 140 Gln Asp Val Lys 145 <210> 225 <211> 85 <212> PRT <213> Aneurinibacillus sp. <400> 225 Phe Lys Ala Ala Ile Asp Gln Val Ser Arg Ile Arg Ser Tyr Phe Gly 1 5 10 15 Ala Ile Gln Asn Arg Leu Glu His Val Val Asn Asn Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Thr Glu Asn Leu Thr Gly Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Ala Asp Met 35 40 45 Ala Lys Glu Met Thr Glu Phe Thr Arg Phe Asn Ile Ile Asn Gln Ser 50 55 60 Ala Thr Ala Met Leu Ala Gln Ala Asn Gln Leu Pro Gln Gly Val Leu 65 70 75 80 Gln Leu Leu Lys Gly 85 <210> 226 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 226 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 227 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 227 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 228 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 228 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 229 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 229 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 230 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 230 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn Asn Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Ala Ile Val 20 <210> 231 <211> 23 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 231 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala Thr 20 <210> 232 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 232 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 233 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 233 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 234 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 234 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 235 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 235 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Val Ala Ile Val 20 <210> 236 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 236 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 237 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus bombysepticus <400> 237 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 238 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 238 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 239 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 239 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 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<211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 246 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 247 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 247 Glu His Phe Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Val Ala Ile Val 20 <210> 248 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 248 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 249 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 249 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Val Ile Val 20 <210> 250 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 250 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 251 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 251 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 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Asn Val Ala Ile Val 20 <210> 258 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 258 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 259 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 259 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 260 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 260 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Val Ile Val 20 <210> 261 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 261 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 262 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 262 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asn Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Val Ala Ile Val 20 <210> 263 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 263 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 264 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 264 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Ala Ile Val 20 <210> 265 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 265 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 266 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 266 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 267 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 267 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 268 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 268 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 269 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 269 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 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Ile Val 20 <210> 282 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 282 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 283 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 283 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 284 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 284 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn Asn Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Ala Ile Val 20 <210> 285 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 285 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 286 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 286 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 287 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 287 Glu His Leu Ala Thr Gly Lys Lys Leu Asn His Ala Ser Asp Asn Pro 1 5 10 15 Ala Asn Ile Ala Ile Val 20 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thuringiensis <400> 341 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Ile Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Gly Asp Asn Gln Lys Ala 20 25 <210> 342 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 342 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Ile Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Gly Asp Asn Gln Lys Ala 20 25 <210> 343 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 343 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Ile Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Asn Gly Asn Gln Ala Ala 20 25 <210> 344 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 344 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Ile Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Asp Lys Asn Gln Ala Ala 20 25 <210> 345 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 345 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Leu Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Asn Glu Asn Gln Ala Ala 20 25 <210> 346 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 346 Thr Val 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Lysinibacillus sp. <400> 367 Glu Thr His Ala Ile Val Gln Arg Met Arg Glu Leu Ala Val Gln Ala 1 5 10 15 Ala Thr Asp Thr Asn Thr Asp Asp Asp Arg Ala Lys 20 25 <210> 368 <211> 28 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 368 Glu Ile His Ser Met Leu Gln Arg Met Asn Glu Leu Ala Val Gln Ala 1 5 10 15 Ser Asn Gly Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Arg Leu Asn 20 25 <210> 369 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 369 Ser Val Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Leu Ala Asn Gln Ser 1 5 10 15 Ala Asn Gly Thr Asn Thr Lys Glu Asn Gln Asp Ala 20 25 <210> 370 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 370 Ser Val Ser Asn Ile Leu Thr Arg Met Arg Asp Ile Ala Val Gln Ser 1 5 10 15 Ser Asn Gly Thr Asn Thr Ala Glu Asn Gln Ser Ala 20 25 <210> 371 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 371 Ser Val Ser Asn Ile Leu Thr Arg Met Arg Asp Ile Ala Val Gln Ser 1 5 10 15 Ser Asn Gly Thr Asn Thr Ala Glu Asn Gln Ser Ala 20 25 <210> 372 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 372 Ser Val Ser 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Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 396 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 396 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 397 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 397 Val Ile Ala Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala His Asn Leu Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Ala Phe His Glu 20 <210> 398 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 398 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Arg Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 399 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 399 Val Ile Val Ile Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala His Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 400 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 400 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 401 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 401 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 402 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 402 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 403 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 403 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 404 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 404 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 405 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus weihenstephanensis <400> 405 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 406 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 406 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 407 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 407 Val Ile Ala Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala His Asn Leu Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 408 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 408 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 409 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 409 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 410 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 410 Val Ile Val Ile Asn Ala Pro Asn Asp Ala Ser His Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 411 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 411 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 412 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 412 Val Ile Ala Val Ala Asn Pro Asn Asn Ser Ala His Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 413 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 413 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 414 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 414 Val Ile Ala Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala His Asn Leu Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 415 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 415 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 416 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 416 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 417 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 417 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 418 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 418 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 419 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 419 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 420 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 420 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Ser Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 421 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 421 Val Ile Ala Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala Asn Asn Leu Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 422 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 422 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 423 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 423 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 424 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 424 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 425 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 425 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 426 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 426 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 427 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 427 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 428 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 428 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Asn Asn Ile Arg Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 429 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 429 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 430 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 430 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 431 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 431 Val Ile Ala Ile Asn Ala Pro Asn Asn Ser Ala His Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 432 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 432 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 433 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 433 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 434 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 434 Val Ile Ala Ile Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala Asn Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Gly Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 435 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 435 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 436 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 436 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Asn Asn Ile Arg Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 437 <211> 21 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 437 Val Ile Ala Asn Ala Pro Asn Asp Ser Ala His Asn Leu Lys Lys Gly 1 5 10 15 Thr Ala Leu His Glu 20 <210> 438 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 438 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Asn Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asp 20 <210> 439 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus aryabhattai <400> 439 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Ser Asn Ile Arg Gln 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Lys Glu 20 <210> 440 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus manliponensis <400> 440 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Ser Asn Ile Gln Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asn 20 <210> 441 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus sp. <400> 441 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Ala Ser Asn Ile Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Leu 20 <210> 442 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus sp. <400> 442 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Ala Ser Asn Ile Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Leu 20 <210> 443 <211> 22 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 443 Ser Ile Ala Gly Leu Ala Ala Asp Asp Ser Ala Gly Asn Ile Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Lys Gly 20 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<211> 22 <212> PRT <213> Aneurinibacillus sp. <400> 450 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ser Ala Arg Asn Ile Arg Tyr 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Glu 20 <210> 451 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 451 Ser Ala Gln Asn Gly Lys Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 452 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 452 Ser Ala Gln Asn Gly Lys Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 453 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 453 Ser Ala Gln Asn Gly Lys Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 454 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 454 Ser Ala Gln Asn Gly Lys Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 455 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 455 Ser His Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 456 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 456 Ala Ser Lys Asn Glu Asn Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 457 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 457 Ala Lys Gln Asn Asp Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 458 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 458 Ala Ala Lys Asn Glu Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 459 <211> 29 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 459 Leu Ala Val Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn 1 5 10 15 Ala Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 460 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 460 Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Val Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 461 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 461 Ala Gln Gln Asn Asp Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 462 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus bombysepticus <400> 462 Ala Ala Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Ser Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 463 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 463 Ala Ala Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Ser Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 464 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 464 Ala Ala Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Ser Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 465 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 465 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 466 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 466 Asn Leu Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln 1 5 10 15 Val Ala Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Thr 20 25 <210> 467 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 467 Asn Leu Ser Asp Arg Asn Lys Asn Leu Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln 1 5 10 15 Val Ala Val Asp Arg Met Arg Gln Leu Val Asn Thr 20 25 <210> 468 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 468 Ala Ser Lys Asn Ser Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 469 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 469 Ala Ala Lys Asn Glu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 470 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 470 Ala Lys Gln Asn Asp Ser Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg 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<211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 486 Ala Ser Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ser 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 487 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 487 Ser Asp Arg Asn Lys Ser Ser Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Val Asp Arg Met Arg Gln Leu Val Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 488 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 488 Ala Val Gln Lys Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala Ile 1 5 10 15 Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 489 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 489 Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Ser Asn Ala Ser Gln Ile Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Met Val Thr 20 25 <210> 490 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 490 Ala Lys Gln Asn Asp Ser Thr Asn Ile Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 491 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 491 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Phe Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 492 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 492 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Phe Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 493 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 493 Ala Ala Gln Asn Gly Asn Thr Asn Thr Phe Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 494 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 494 Ala Ala Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 495 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 495 Ala Ala Gln Asn Glu Asn Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 496 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 496 Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Val Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 497 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 497 Ala Ala Lys Asn Glu Asn Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 498 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 498 Ala Ala Gln Asn Asp Ser Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 499 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 499 Ala Ala Lys Asn Glu Asn Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 500 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 500 Ala Ala Lys Asn Glu Asn Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 501 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 501 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 502 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 502 Ala Ala Gln Asn Lys Ser Thr Asn Thr Glu Ser Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 503 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 503 Ala Ala Gln Asn Lys Ser Thr Asn Thr Glu Ser Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 504 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 504 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 505 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 505 Ala Ala Gln Asn Glu Ser Thr Asn Thr Gly Asn Ala Gln Asn Ala Leu 1 5 10 15 Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 506 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 506 Ser Asn Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Val Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 507 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 507 Ala Gly Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Asn Ala Ser Gln Asn Ala Leu 1 5 10 15 Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 508 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 508 Ala Ala Gln Asn Lys Asp Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 509 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 509 Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Val Asn Thr Val Thr 20 25 <210> 510 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 510 Ala Glu Ile Asp Thr Asp Lys Asn Thr Gly Asn Ala Thr Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 511 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 511 Ala Glu Ile Asp Thr Asp Lys Asn Thr Gly Asn Ala Thr Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 512 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 512 Ser Asp Arg Asn Lys Asn Ser Asn Thr Ser Asn Ala Ser Gln Ile Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Met Thr 20 25 <210> 513 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 513 Ala Lys Gln Asn Asp Gly Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 514 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus aryabhattai <400> 514 Ala Asp Leu Asp Glu Thr Lys Asn Thr Gly Asn Gly Ala Gln Val Val 1 5 10 15 Leu Glu Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp His Thr Glu 20 25 <210> 515 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus manliponensis <400> 515 Ser Glu Arg Asp Asn Gly Gln Asn Thr Gly Thr Ala Gln Thr Ala Leu 1 5 10 15 Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 516 <211> 28 <212> PRT <213> Lysinibacillus sp. <400> 516 Lys Ala Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Asp Thr Ala Ala Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Met Arg Gln Val Ile Ala His Thr Glu 20 25 <210> 517 <211> 28 <212> PRT <213> Lysinibacillus sp. <400> 517 Lys Ala Arg Asp Asp Asp Thr Asn Thr Asp Thr Ala Ala Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Met Arg Gln Val Ile Ala His Thr Glu 20 25 <210> 518 <211> 28 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 518 Asn Leu Arg Asp Ser Gly Ser Tyr Thr Gly Asn Ser Ala Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Glu Asn Met Arg Gln Leu Met Ser His Ile Glu 20 25 <210> 519 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 519 Ala Asp Gln Asn Glu Lys Thr Asn Thr Gly Asn Ala Ser Gln Asn Ala 1 5 10 15 Leu Asp Arg Met Arg Leu Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 520 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 520 Ala Ser Gln Asn Glu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ser Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Thr Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 521 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 521 Ala Ser Gln Asn Glu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ser Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Thr Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 522 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 522 Ala Ser Gln Asn Glu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ser Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Ile Asp Arg Met Arg Thr Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 523 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 523 Ala Ser Gln Asn Glu Ala Thr Asn Thr Gly Asn Ser Ser Gln Val Ile 1 5 10 15 Ala Asp Arg Met Arg Thr Leu Ile Asn Ser Val Ser 20 25 <210> 524 <211> 28 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 524 Ala Asp Leu Asp Glu Thr Lys Asn Thr Gly Asn Gly Ala Gln Val Val 1 5 10 15 Leu Glu Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp His Thr Glu 20 25 <210> 525 <211> 27 <212> PRT <213> Aneurinibacillus sp. <400> 525 Ala Lys Lys Asp Lys Ser Tyr Thr Gly Asn Ala Ala Gln Val Ala Leu 1 5 10 15 Glu Arg Met Arg Gln Leu Met Glu His Ile Glu 20 25 <210> 526 <211> 22 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 526 Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ala Ile Ala 20 <210> 527 <211> 22 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 527 Ala Ile Ala Gln Gly Ala Ala Asp Asp Lys Ala Ser Asn Ile Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Glu 20 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Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ala Ile Ser 20 <210> 535 <211> 22 <212> PRT <213> Erwinia amylovora <400> 535 Ser Ile Ala Gln Gly Ala Ala Asp Asp Lys Ala Ser Asn Ile Arg Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Gln 20 <210> 536 <211> 22 <212> PRT <213> Burkholderia phytofirmans <400> 536 Thr Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 537 <211> 22 <212> PRT <213> Burkholderia phytofirmans <400> 537 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Ala Ser Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Thr 20 <210> 538 <211> 22 <212> PRT <213> Burkholderia ubonensis <400> 538 Asn Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Thr Ala Ala Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 539 <211> 22 <212> PRT <213> Burkholderia ubonensis <400> 539 Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Ala Ala Thr Asn Ile Arg Lys 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Asn 20 <210> 540 <211> 22 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 540 Thr Arg Leu Ser Ser Gly Leu Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Gln Ile Ala 20 <210> 541 <211> 22 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 541 Ala Ile Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asp Lys Ala Ser Asn Ile Lys Leu 1 5 10 15 Gly Ser Ser Leu Arg Thr 20 <210> 542 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 542 Gly Phe Leu Asn 1 <210> 543 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 543 Trp Gly Phe Leu Ile 1 5 <210> 544 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 544 Met Gly Val Leu Asn 1 5 <210> 545 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 545 Gly Val Leu Asn 1 <210> 546 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 546 Trp Gly Phe Phe Tyr 1 5 <210> 547 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 547 Leu Val Pro Phe Ala Val Trp Leu Ala 1 5 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<213> Bacillus thuringiensis <400> 576 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Tyr Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 577 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 577 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Phe Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 578 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 578 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Pro 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 579 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 579 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Gln Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 580 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus spp. <400> 580 Glu Lys Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 581 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus spp. <400> 581 Glu Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Arg Ala Ser Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 582 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus spp. <400> 582 Leu Arg Ile Ser Ser Gly Tyr Arg Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Pro 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 583 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus fusiformis <400> 583 Leu Arg Ile Ser Thr Gly Tyr Arg Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Pro 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 584 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus macroides <400> 584 Glu Lys Leu Ser Ser Gly Phe Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 585 <211> 22 <212> PRT <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 585 Glu Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ser 20 <210> 586 <211> 22 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 586 Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ala Ile Ala 20 <210> 587 <211> 23 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 587 Asn Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Thr Gln Leu 1 5 10 15 Ile Met Ala Leu Leu Gln Gln 20 <210> 588 <211> 23 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 588 Gln Gln Leu Leu Ala Met Ile Leu Gln Thr Leu Leu Gln Asp Leu Gln 1 5 10 15 Lys Glu Ser Ile Gly Gln Asn 20 <210> 589 <211> 12 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 589 Leu Asp Gln Leu Leu Thr Gln Leu Ile Met Ala Leu 1 5 10 <210> 590 <211> 12 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 590 Leu Ala Met Ile Leu Gln Thr Leu Leu Gln Asp Leu 1 5 10 <210> 591 <211> 19 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 591 Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Thr Gln Leu Ile Met Ala Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gln <210> 592 <211> 19 <212> PRT <213> Xanthomonas species <400> 592 Gln Gln Leu Leu Ala Met Ile Leu Gln Thr Leu Leu Gln Asp Leu Gln 1 5 10 15 Lys Glu Ser <210> 593 <211> 143 <212> PRT <213> Xanthamonas citri <400> 593 Met Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Leu Gly Ala Asn Ser Ser Phe Phe 1 5 10 15 Gln Val Asp Pro Ser Gln Asn Thr Gln Ser Gly Ser Asn Gln Gly Asn 20 25 30 Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Thr Gln Leu Ile 35 40 45 Met Ala Leu Leu Gln Gln Ser Asn Asn Ala Glu Gln Gly Gln Gly Gln 50 55 60 Gly Gln Gly Gly Asp Ser Gly Gly Gln Gly Gly Asn Arg Gln Gln Ala 65 70 75 80 Gly Gln Ser Asn Gly Ser Pro Ser Gln Tyr Thr Gln Met Leu Met Asn 85 90 95 Ile Val Gly Asp Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Phe Gly Gly 100 105 110 Gly Phe Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Gly Leu Gly Thr Ser Leu Gly 115 120 125 Thr Ser Leu Gly Thr Ser Leu Ala Ser Asp Thr Gly Ser Met Gln 130 135 140 <210> 594 <211> 19 <212> PRT <213> Pantoea sesami <400> 594 Gln Leu Glu Gln Leu Met Thr Gln Leu Arg Ala Arg Leu Cys Arg Leu 1 5 10 15 Met Ala Met <210> 595 <211> 19 <212> PRT <213> Erwinia gerudensis <400> 595 Gln Leu Glu Gln Leu Met Thr Gln Leu Arg Ala Arg Leu Lys Arg Leu 1 5 10 15 Met Ala Met <210> 596 <211> 19 <212> PRT <213> Pantoea sesami <400> 596 Met Ala Met Leu Arg Cys Leu Arg Ala Arg Leu Gln Thr Met Leu Gln 1 5 10 15 Glu Leu Gln <210> 597 <211> 19 <212> PRT <213> Erwinia gerudensis <400> 597 Met Ala Met Leu Arg Lys Leu Arg Ala Arg Leu Gln Thr Met Leu Gln 1 5 10 15 Glu Leu Gln <210> 598 <211> 5 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = sulfonated tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = sulfonated tyrosine <400> 598 Xaa Ile Xaa Thr Gln 1 5 <210> 599 <211> 5 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = sulfonated tyrosine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = sulfonated tyrosine <400> 599 Gln Thr Xaa Ile Xaa 1 5 <210> 600 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 600 Gly Gly Ile Arg Ala Ala Pro Thr Gly Asn Glu Arg 1 5 10 <210> 601 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 601 Arg Glu Asn Gly Thr Pro Ala Ala Arg Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 602 <211> 217 <212> PRT <213> Glycine max <400> 602 Met Lys Ser Thr Ile Phe Phe Ala Leu Phe Leu Phe Cys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Thr Ser Tyr Leu Pro Ser Ala Ile Ala Asp Phe Val Leu Asp Asn Glu 20 25 30 Gly Asn Pro Leu Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ile Leu Ser Asp Ile 35 40 45 Thr Ala Phe Gly Gly Ile Arg Ala Ala Pro Thr Gly Asn Glu Arg Cys 50 55 60 Pro Leu Thr Val Val Gln Ser Arg Asn Glu Leu Asp Lys Gly Ile Glu 65 70 75 80 Thr Ile Ile Ser Ser Pro Tyr Arg Ile Arg Phe Ile Ala Glu Gly His 85 90 95 Pro Leu Ser Leu Lys Phe Asp Ser Phe Ala Val Ile Met Leu Cys Val 100 105 110 Gly Ile Pro Thr Glu Trp Ser Val Val Glu Asp Leu Pro Glu Gly Pro 115 120 125 Ala Val Lys Ile Gly Glu Asn Lys Asp Ala Met Asp Gly Trp Phe Arg 130 135 140 Leu Glu Arg Val Ser Asp Asp Glu Phe Asn Asn Tyr Lys Leu Val Phe 145 150 155 160 Cys Pro Gln Gln Ala Glu Asp Asp Lys Cys Gly Asp Ile Gly Ile Ser 165 170 175 Ile Asp His Asp Asp Gly Thr Arg Arg Leu Val Val Ser Lys Asn Lys 180 185 190 Pro Leu Val Val Gln Phe Gln Lys Leu Asp Lys Glu Ser Leu Ala Lys 195 200 205 Lys Asn His Gly Leu Ser Arg Ser Glu 210 215 <210> 603 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 603 Gly Gly Ile Arg Ala Thr Pro Thr Glu Asn Glu Arg 1 5 10 <210> 604 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 604 Gly Gly Ile Arg Val Ala Ala Thr Gly Lys Glu Arg 1 5 10 <210> 605 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 605 Arg Glu Asn Glu Thr Pro Thr Ala Arg Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 606 <211> 12 <212> PRT <213> Glycine max <400> 606 Arg Glu Lys Gly Thr Ala Ala Val Arg Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 607 <211> 18 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 607 Ala Arg Gly Lys Phe Glu Arg Lys Lys Pro His Val Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly <210> 608 <211> 26 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 608 Ala Arg Gly Lys Phe Glu Arg Lys Lys Pro His Val Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 609 <211> 50 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 609 Glu Lys Pro Asn Val Lys Arg Gly Glu Asn Lys Trp Val Asp Lys Ile 1 5 10 15 Tyr Glu Leu Met Asp Ser Val Asp Ser Tyr Ile Pro Ile Pro Thr Arg 20 25 30 Gln Thr Glu Leu Pro Phe Leu Leu Ala Val Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Thr Gly 50 <210> 610 <211> 18 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 610 Ala Arg Gln Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Ile Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly <210> 611 <211> 26 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 611 Ala Arg Gln Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Ile Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 612 <211> 50 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 612 Lys Asn Pro Lys Ile Thr Lys Gly Glu Asn Lys Trp Val Asp Lys Ile 1 5 10 15 Leu Asn Leu Met Asp Gln Val Asp Ser Tyr Ile Pro Thr Pro Thr Arg 20 25 30 Asp Thr Glu Lys Asp Phe Leu Met Ala Ile Glu Asp Val Leu Ser Ile 35 40 45 Thr Gly 50 <210> 613 <211> 18 <212> PRT <213> Acidovorax avenae <400> 613 Ala Lys Gly Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Val Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly <210> 614 <211> 26 <212> PRT <213> Acidovorax avenae <400> 614 Ala Lys Gly Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Val Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 615 <211> 50 <212> PRT <213> Acidovorax spp. <400> 615 Lys Leu Ala Leu Glu Gly Asp Lys Gly Pro Leu Gly Glu Gln Ala Ile 1 5 10 15 Asp Lys Leu Ala Glu Ala Leu Asp Thr Tyr Ile Pro Thr Pro Glu Arg 20 25 30 Ala Val Asp Gly Ala Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Ser Gly 50 <210> 616 <211> 18 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 616 Ala Lys Ala Lys Phe Glu Arg Ser Lys Pro His Val Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly <210> 617 <211> 26 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 617 Ala Lys Ala Lys Phe Glu Arg Ser Lys Pro His Val Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 618 <211> 50 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 618 Ser Ala Leu Lys Ala Leu Gln Gly Glu Ala Glu Trp Glu Glu Lys Ile 1 5 10 15 Ile Glu Leu Met Ala Glu Val Asp Ala Tyr Ile Pro Thr Pro Glu Arg 20 25 30 Glu Thr Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Ile Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Thr Gly 50 <210> 619 <211> 26 <212> PRT <213> Burkholderia spp. <400> 619 Ala Lys Gly Lys Phe Glu Arg Thr Lys Pro His Val Asn Val Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 620 <211> 50 <212> PRT <213> Burkholderia spp. <400> 620 Lys Leu Ala Leu Glu Gly Asp Thr Gly Glu Leu Gly Glu Val Ala Ile 1 5 10 15 Met Asn Leu Ala Asp Ala Leu Asp Thr Tyr Ile Pro Thr Pro Glu Arg 20 25 30 Ala Val Asp Gly Ala Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Ser Gly 50 <210> 621 <211> 50 <212> PRT <213> Xanthomonas campestris <400> 621 Arg Leu Ala Leu Asp Gly Asp Gln Ser Glu Ile Gly Val Pro Ala Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Val Asp Ala Leu Asp Thr Phe Ile Pro Glu Pro Thr Arg 20 25 30 Asp Val Asp Arg Pro Phe Leu Met Pro Val Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Ser Gly 50 <210> 622 <211> 26 <212> PRT <213> Pseudomonas spp. <400> 622 Ala Lys Glu Lys Phe Glu Arg Ser Lys Pro His Val Asn Val Gly Thr 1 5 10 15 Ile Gly His Val Asp His Gly Lys Thr Thr 20 25 <210> 623 <211> 50 <212> PRT <213> Pseudomonas spp. <400> 623 Met Ala Leu Glu Gly Lys Asp Asp Asn Glu Met Gly Thr Thr Ala Val 1 5 10 15 Lys Lys Leu Val Glu Thr Leu Asp Ser Tyr Ile Pro Glu Pro Glu Arg 20 25 30 Ala Ile Asp Lys Pro Phe Leu Met Pro Ile Glu Asp Val Phe Ser Ile 35 40 45 Ser Gly 50 <210> 624 <211> 18 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 624 Gly Ile Thr Gly Ile Asn Val His Pro Lys Lys Arg Glu Phe Lys Gly 1 5 10 15 Arg Ala <210> 625 <211> 26 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 625 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Ile Asn Val His 1 5 10 15 Pro Lys Lys Arg Glu Phe Lys Gly Arg Ala 20 25 <210> 626 <211> 50 <212> PRT <213> Arabidopsis lyrata <400> 626 Gly Thr Ile Ser Phe Val Asp Glu Val Ala Leu Leu Phe Pro Leu Glu 1 5 10 15 Thr Gln Arg Thr Pro Ile Pro Ile Tyr Ser Asp Val Ser Asp Met Leu 20 25 30 Glu Tyr Ile Lys Asp Val Trp Lys Asn Glu Gly Arg Lys Val Asn Pro 35 40 45 Lys Glu 50 <210> 627 <211> 18 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 627 Gly Ile Thr Gly Ile Asn Ile His Pro Lys Thr Arg Glu Phe Lys Gln 1 5 10 15 Arg Ala <210> 628 <211> 26 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 628 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Ile Asn Ile His 1 5 10 15 Pro Lys Thr Arg Glu Phe Lys Gln Arg Ala 20 25 <210> 629 <211> 50 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 629 Gly Thr Ile Ser Leu Val Asp Glu Ile Ala Met Leu Phe Asp Lys Glu 1 5 10 15 Thr Asp Arg Thr Pro Thr Pro Ile Tyr Ser Asp Val Gln Asp Met Leu 20 25 30 Asn Leu Ile Lys Asp Val Trp Lys Asn Glu Gly Lys Thr Ile Lys Pro 35 40 45 Asn Lys 50 <210> 630 <211> 18 <212> PRT <213> Acidovorax avenae <400> 630 Gly Ile Thr Gly Val Asn Val His Pro Lys Thr Arg Glu Phe Lys Gly 1 5 10 15 Lys Ala <210> 631 <211> 26 <212> PRT <213> Acidovorax avenae <400> 631 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Val Asn Val His 1 5 10 15 Pro Lys Thr Arg Glu Phe Lys Gly Lys Ala 20 25 <210> 632 <211> 50 <212> PRT <213> Acidovorax spp. <400> 632 Gly Ser Ile Ser Phe Val Asp Glu Val Pro Met Leu Phe Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Ala Arg Glu Pro Thr Pro Ile Tyr Thr Asp Leu Ala Glu Ala Leu 20 25 30 Lys Asp Ile Ala Gln Glu Gly Leu Pro Gly Lys Asp Gly Glu Leu Ala 35 40 45 Leu Lys 50 <210> 633 <211> 18 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 633 Gly Ile Thr Gly Ile Asn Val His Pro Lys Ser Arg Glu Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Ala <210> 634 <211> 26 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 634 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Ile Asn Val His 1 5 10 15 Pro Lys Ser Arg Glu Phe Lys Ala Lys Ala 20 25 <210> 635 <211> 50 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 635 Gly Ile Thr Ser Phe Val Asp Glu Ile Pro Met Leu Phe Pro Lys Asp 1 5 10 15 Thr Glu Arg Glu Pro Thr Pro Ile Tyr Ala Asp Val Glu Ala Met Leu 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Glu Glu Trp Glu Ala Glu Gly Gln Leu Ala Lys Leu 35 40 45 Ala Ser 50 <210> 636 <211> 26 <212> PRT <213> Burkholderia spp. <400> 636 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Val Asn Val His 1 5 10 15 Pro Lys Thr Arg Glu Phe Lys Gly Lys Ala 20 25 <210> 637 <211> 50 <212> PRT <213> Burkholderia spp. <400> 637 Gly Ser Ile Ser Phe Val Asp Glu Val Pro Met Leu Phe Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Ala Arg Glu Pro Thr Pro Ile Tyr Thr Asp Leu Ala Asp Ala Leu 20 25 30 Asn Met Ile Ala Val Glu Gly Leu Glu Gly Thr Asp Gly Glu Leu Ala 35 40 45 Leu Lys 50 <210> 638 <211> 50 <212> PRT <213> Xanthomonas campestris <400> 638 Gly Ser Ile Ser Phe Val Asp Glu Val Pro Met Leu Phe Pro Arg Asp 1 5 10 15 Val Asp Arg Thr Pro Glu Pro Ile Phe Thr Asp Leu Ala Asp Val Leu 20 25 30 Lys Leu Ile Ala Pro Val Gly Ile Glu Ser Gln Asp Gly Asp Leu Ala 35 40 45 Leu Arg 50 <210> 639 <211> 26 <212> PRT <213> Pseudomonas spp. <400> 639 Thr Thr Lys Gly His Asp Val His Gly Ile Thr Gly Val Asn Val His 1 5 10 15 Pro Lys Ser Arg Glu Phe Lys Glu Lys Ala 20 25 <210> 640 <211> 50 <212> PRT <213> Pseudomonas spp. <400> 640 Gly Ser Ile Ser Phe Val Asp Glu Ile Pro Met Leu Phe Pro Lys Asp 1 5 10 15 Ile Ala Arg Glu Pro Glu Pro Ile Tyr Ser Asp Leu Thr Glu Val Leu 20 25 30 Lys Lys Val Ala Thr Thr Gly Met Glu Asn Asp Asp Lys Gly Glu Leu 35 40 45 Ala Met 50 <210> 641 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 641 Met Ser Thr Ala Thr Phe Val Asp Ile Ile Ile Ala Ile Leu Leu Pro 1 5 10 15 Pro Leu Gly Val Phe Leu Arg Phe Gly Cys Gly Val Glu Phe Trp Ile 20 25 30 Cys Leu Val Leu Thr Leu Leu Gly Tyr Ile Pro Gly Ile Ile Tyr Ala 35 40 45 Ile Tyr Val Leu Thr Lys 50 <210> 642 <211> 54 <212> PRT <213> Citrus clementina <400> 642 Met Gly Ser Glu Thr Phe Leu Glu Val Ile Leu Ala Ile Leu Leu Pro 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Phe Leu Arg Tyr Gly Cys Gly Val Glu Phe Trp Ile 20 25 30 Cys Leu Leu Leu Thr Val Leu Gly Tyr Ile Pro Gly Ile Ile Tyr Ala 35 40 45 Ile Tyr Val Leu Val Gly 50 <210> 643 <211> 54 <212> PRT <213> Citrus trifoliata <400> 643 Met Gly Thr Ala Thr Cys Val Asp Ile Ile Leu Ala Val Ile Leu Pro 1 5 10 15 Pro Leu Gly Val Phe Leu Lys Phe Gly Cys Lys Ala Glu Phe Trp Ile 20 25 30 Cys Leu Leu Leu Thr Ile Leu Gly Tyr Ile Pro Gly Ile Ile Tyr Ala 35 40 45 Val Tyr Val Ile Thr Lys 50 <210> 644 <211> 58 <212> PRT <213> Citrus sinensis <400> 644 Met Ala Asp Glu Gly Thr Ala Thr Cys Ile Asp Ile Ile Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ile Leu Pro Pro Leu Gly Val Phe Leu Lys Phe Gly Cys Lys Val Glu 20 25 30 Phe Trp Ile Cys Leu Leu Leu Thr Ile Phe Gly Tyr Ile Pro Gly Ile 35 40 45 Ile Tyr Ala Val Tyr Ala Ile 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ternatea <400> 673 Asn Leu Cys Glu Arg Ala Ser Leu Thr Trp Thr Gly Asn Cys Gly Asn 1 5 10 15 Thr Gly His Cys Asp Thr Gln Cys Arg Asn Trp Glu Ser Ala Lys His 20 25 30 Gly Ala Cys His Lys Arg Gly Asn Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe Asn 35 40 45 Cys <210> 674 <211> 80 <212> PRT <213> Dacus carota <400> 674 Met Ala Lys Lys Ser Ser Ser Phe Cys Leu Ser Ala Ile Phe Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Ala Asn Thr Gly Met Val Arg Glu Val Asp Gly Ala 20 25 30 Leu Cys Glu Lys Pro Ser Leu Thr Trp Ser Gly Asn Cys Arg Asn Thr 35 40 45 Gln His Cys Asp Lys Gln Cys Gln Ser Trp Glu Gly Ala Lys His Gly 50 55 60 Ala Cys His Lys Arg Gly Asn Trp Lys Cys Phe Cys Tyr His Ala Cys 65 70 75 80 <210> 675 <211> 92 <212> PRT <213> Bupleurum kaoi <400> 675 Met Ala Lys Lys Leu Asn Ala Val Thr Val Ser Ala Ile Phe Leu Val 1 5 10 15 Val Phe Leu Ile Ala Ser Tyr Ser Val Gly Ala Ala Lys Glu Ala Gly 20 25 30 Ala Glu Gly Glu Val Val Phe Pro Glu Gln Leu Cys Glu Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Thr Trp Ser Gly Asp Cys Lys Asn Thr Lys Asn 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Ala Ser Tyr Thr Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ser Ile Phe Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ser Thr Glu Val Met Met Val Glu Gly Arg Val Cys Gln Arg 20 25 30 Arg Ser Lys Thr Trp Thr Gly Phe Cys Gly Asn Thr Arg Gly Cys Asp 35 40 45 Ser Gln Cys Lys Arg Trp Glu Arg Ala Ser His Gly Ala Cys His Ala 50 55 60 Gln Phe Pro Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys 65 70 75 <210> 697 <211> 56 <212> PRT <213> Vitis vinifera <400> 697 Met Val Met Leu Glu Ala Lys Val Cys Gln Arg Pro Ser Lys Thr Trp 1 5 10 15 Ser Gly Phe Cys Gly Ser Ser Lys Asn Cys Asp Arg Gln Cys Lys Asn 20 25 30 Trp Glu Gly Ala Lys His Gly Ala Cys His Ala Lys Phe Pro Gly Val 35 40 45 Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys 50 55 <210> 698 <211> 88 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 698 Met Thr Lys Ser Phe Ile Leu Val Ala Leu Leu Cys Ile Cys Phe Ile 1 5 10 15 Leu Leu Ser Pro Thr Glu Met Arg Leu Thr Leu Asn Ala Cys Leu Lys 20 25 30 Leu Ala Glu Ala Lys Ile Cys Glu Lys Tyr Ser Gln Thr Trp Ser Gly 35 40 45 Arg Cys Thr Lys Thr Ser His Cys Asp Arg Gln Cys Ile 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<213> Cucumis melo <400> 701 Met Ala Lys Val Val Gly Asn Ser Ala Lys Met Ile Val Ala Phe Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ala Leu Thr Leu Ser Met Asn Glu Lys Gln Gly Val Val 20 25 30 Glu Ala Lys Val Cys Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Trp Cys 35 40 45 Gly Asp Thr Lys His Cys Asp Arg Gln Cys Lys Asn Trp Glu Gly Ala 50 55 60 Lys His Gly Ala Cys His Ala Gln Phe Pro Gly Arg Ala Cys Phe Cys 65 70 75 80 Tyr Phe Asn Cys <210> 702 <211> 82 <212> PRT <213> Erythranthe guttate <400> 702 Met Ala Ala Ser Leu Val Tyr Arg Leu Ser Ser Val Ile Leu Ile Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Phe Ile Met Leu Asn Asn Glu Val Met Val Val Glu Ser 20 25 30 Arg Leu Cys Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Thr Gly Phe Cys Gly Ser 35 40 45 Ser Asn Asn Cys Asn Asn Gln Cys Arg Asn Trp Glu Arg Ala Ser His 50 55 60 Gly Ala Cys His Ala Gln Phe Pro Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 65 70 75 80 Asn Cys <210> 703 <211> 76 <212> PRT <213> Sesamum indicum <400> 703 Met Ala Lys Phe Gln Val Ser Ser Thr Ile Phe Phe Ala Leu Phe Phe 1 5 10 15 Cys Phe Leu Leu Leu Ala Ser Asn Glu Ala Lys Ile Cys Gln Arg Met 20 25 30 Ser Lys Thr Trp Ser Gly Val Cys Leu Asn Ser Gly Asn Cys Asp Arg 35 40 45 Gln Cys Arg Asn Trp Glu Arg Ala Gln His Gly Ala Cys His Arg Arg 50 55 60 Gly Leu Gly Phe Ala Cys Leu Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 704 <211> 110 <212> PRT <213> Eclipta prostrata <400> 704 Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Phe Ala Phe Leu Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Gly Ser Val Lys Gly Glu Leu Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Ser Gln Thr Trp Ser Gly Thr Cys Arg Ile Thr Ser His Cys 35 40 45 Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His 50 55 60 Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Ser His Cys Ala 65 70 75 80 Lys Ala Glu Lys Leu Thr Gln Asp Lys Leu Lys Ala Gly His Leu Val 85 90 95 Asn Glu Lys Ser Glu Ala Asp Gln Lys Val Pro Val Thr Pro 100 105 110 <210> 705 <211> 105 <212> PRT <213> Cynara cardunculus <400> 705 Met Ala Lys Asn Thr Lys Val Ser Ala Phe Leu Phe Val Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Phe Leu Val Val His Ser Val Thr Ala Phe Ala Ile Arg Phe 20 25 30 Lys Cys Phe Asp Thr Asp Met Leu Leu Lys Val Ile Ala Asp Met Val 35 40 45 Val Gly Met Lys Gly Ile Glu Lys Val Cys Arg Arg Arg Ser Lys Thr 50 55 60 Trp Ser Gly Tyr Cys Gly Asp Ser Lys His Cys Asp Gln Gln Cys Arg 65 70 75 80 Glu Trp Glu Gly Ala Glu His Gly Ala Cys His His Glu Gly Leu Gly 85 90 95 Arg Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys 100 105 <210> 706 <211> 110 <212> PRT <213> Ambrosia artemisiifolia <400> 706 Met Ala Ala Gly Leu Leu Val Phe Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly Lys Leu Cys Glu Lys Pro Ser Val Thr Trp Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Val Lys Gln Thr Asp Lys Cys Asp Lys Arg Cys Ile Glu 35 40 45 Trp Glu Gly Ala Lys His Gly Ala Cys His Lys Arg Asp Ser Lys Ala 50 55 60 Ser Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Asp Pro Thr Lys Asn Pro Gly Pro 65 70 75 80 Pro Pro Gly Ala Pro Lys Gly Lys Ala Pro Ala Pro Ser Pro Pro Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Glu Arg 100 105 110 <210> 707 <211> 111 <212> PRT <213> Ambrosia artemisiifolia <400> 707 Met Ala Ala Gly Leu Leu Val Phe Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Gly Lys Leu Cys Glu Lys Pro Ser Leu Thr Trp Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Lys Val Lys Gln Thr Asp Lys Cys Asp Lys Arg Cys Ile Glu 35 40 45 Trp Glu Gly Ala Lys His Gly Ala Cys His Lys Arg Asp Ser Lys Ala 50 55 60 Thr Cys Phe Cys Tyr Phe Asp Cys Asp Pro Thr Lys Asn Pro Gly Pro 65 70 75 80 Pro Pro Gly Ala Pro Lys Gly Lys Ala Pro Ala Pro Ser Pro Pro Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Glu Gly Gly Glu Arg 100 105 110 <210> 708 <211> 79 <212> PRT <213> Jatropha curcas <400> 708 Met Ala Lys Leu His Ser Ser Ala Leu Cys Phe Leu Ile Ile Phe Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Val Ser Lys Glu Met Ala Val Thr Glu Ala Lys Leu Cys 20 25 30 Gln Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Phe Cys Gly Asp Pro Gly Lys 35 40 45 Cys Asn Arg Gln Cys Arg Asn Trp Glu Gly Ala Ser His Gly Ala Cys 50 55 60 His Ala Gln Phe Pro Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 709 <211> 79 <212> PRT <213> Nelumbo nucifera <400> 709 Met Ala Lys Ala Pro Lys Ser Val Ser Tyr Phe Ala Phe Phe Phe Ile 1 5 10 15 Leu Phe Leu Leu Ala Ser Ser Glu Ile Gln Lys Thr Lys Lys Leu Cys 20 25 30 Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Arg Cys Thr Lys Thr Gln Asn 35 40 45 Cys Asp Lys Gln Cys Lys Asp Trp Glu Tyr Ala Lys His Gly Ala Cys 50 55 60 His Gly Ser Trp Phe Asn Lys Lys Cys Tyr Cys Tyr Phe Asp Cys 65 70 75 <210> 710 <211> 82 <212> PRT <213> Pyrus x bretschneideri <400> 710 Met Ala Lys Leu Leu Ser Arg Leu Ser Ile Pro Leu Ile Val Phe Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ile Leu Leu Ala Ser Thr Glu Val Ala Met Val Glu Ala 20 25 30 Arg Ile Cys Gln Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Phe Cys Ala Asn 35 40 45 Thr Gly Asn Cys Asn Arg Gln Cys Thr Asn Trp Glu Gly Ala Leu His 50 55 60 Gly Ala Cys His Ala Gln Phe Pro Gly Val Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 65 70 75 80 Arg Cys <210> 711 <211> 83 <212> PRT <213> Ricinus communis <400> 711 Met Ala Lys Leu His Phe Pro Thr Leu Leu Cys Leu Phe Ile Phe Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu 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<400> 732 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Ala Pro Leu Phe Ala Val Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 733 <211> 80 <212> PRT <213> Eutrema salsugineum <400> 733 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Thr Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Val Phe Glu Gly Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 734 <211> 80 <212> PRT <213> Raphanus sativus <400> 734 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Ala Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 735 <211> 80 <212> PRT <213> Raphanus sativus <400> 735 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Val Ser Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Thr Ala Phe Glu Ala Pro Ala Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 736 <211> 76 <212> PRT <213> Raphanus sativus <400> 736 Met Asn Thr Lys Val Ile Leu Ala Leu Leu Phe Cys Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 Ala Ser Asn Glu Met Gln Val Gly Glu Ala Lys Val Cys Gln Arg Arg 20 25 30 Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn Thr Gly Asn Cys Ser Arg 35 40 45 Gln Cys Lys Gln Gln Glu Asp Ala Arg Phe Gly Ala Cys His Arg Ser 50 55 60 Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 737 <211> 80 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 737 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Ala Pro Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 738 <211> 76 <212> PRT <213> Solanum pennellii <400> 738 Met Asn Thr Lys Leu Ile Leu Ala Leu Met Phe Cys Phe Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ala Ser Asn Glu Met Gln Val Gly Glu Ala Lys Val Cys Gln Arg Arg 20 25 30 Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn Thr Gly Asn Cys Ser Arg 35 40 45 Gln Cys Lys Gln Gln Glu Asp Ala Arg Phe Gly Ala Cys His Arg Ser 50 55 60 Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 739 <211> 78 <212> PRT <213> Citrus clementina <400> 739 Met Ala Lys Phe Thr Thr Thr Phe Ala Leu Leu Phe Ala Phe Phe Ile 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Asp Val Pro Met Ala Glu Ala Lys Val Cys Gln 20 25 30 Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Leu Cys Leu Asn Thr Gly Asn Cys 35 40 45 Ser Arg Gln Cys Lys Gln Gln Glu Asp Ala Arg Phe Gly Ala Cys His 50 55 60 Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 740 <211> 80 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 740 Met Ala Lys Phe Thr Ser Ile Ile Val Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Gly Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala Arg Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 741 <211> 78 <212> PRT <213> Eutrema salsugineum <400> 741 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Thr Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Thr Phe Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Lys Leu Cys Glu 20 25 30 Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn Ala Cys 35 40 45 Lys Ser Gln Cys Gln Arg Leu Glu Gly Ala Arg His Gly Ser Cys Asn 50 55 60 Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 <210> 742 <211> 79 <212> PRT <213> Eutrema salsugineum <400> 742 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Thr Leu Leu Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Thr Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Lys Leu Cys 20 25 30 Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn Ala 35 40 45 Cys Lys Ser Gln Cys Gln Arg Leu Glu Gly Ala Arg His Gly Ser Cys 50 55 60 Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 <210> 743 <211> 80 <212> PRT <213> Heliophila coronopifolia <400> 743 Met Ala Lys Phe Ala Ser Ile Ile Ala Phe Phe Phe Ala Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Ile Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Arg Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 744 <211> 80 <212> PRT <213> Brassica oleracea <400> 744 Met Ala Lys Val Ala Ser Ile Val Ala Leu Leu Phe Pro Ala Leu Val 1 5 10 15 Ile Phe Ala Ala Phe Glu Ala Pro Thr Met Val Glu Ala Gln Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly Asn Asn Asn 35 40 45 Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser 50 55 60 Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys 65 70 75 80 <210> 745 <211> 76 <212> PRT <213> Cicer arietinum <400> 745 Met Ser Lys Phe Tyr Thr Val Phe Met Phe Leu Cys Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ile Ser Ser Trp Glu Val Glu Ala Lys Leu Cys Gln Arg Arg Ser 20 25 30 Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Ile Ile Thr Gly Asn Cys Lys Asn Gln 35 40 45 Cys Lys Asn Val Glu His Ala Thr Phe Gly Ala Cys His Arg Gln Gly 50 55 60 Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys His 65 70 75 <210> 746 <211> 82 <212> PRT <213> Citrus clementina <400> 746 Met Ala Lys Ser Val Ala Ser Ile Thr Thr Ala Phe Ala Leu Ile Phe 1 5 10 15 Ala Phe Phe Ile Leu Phe Ala Ser Phe Gly Val Pro Met Ala Glu Ala 20 25 30 Lys Val Cys Gln Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 35 40 45 Thr Gly Lys Cys Ser Arg Gln Cys Lys Gln Gln Glu Tyr Ala Arg Tyr 50 55 60 Gly Ala Cys Tyr Arg Gln Gly Ala Gly Tyr Ala Cys Tyr Cys Tyr Phe 65 70 75 80 Asn Cys <210> 747 <211> 82 <212> PRT <213> Citrus sinensis <400> 747 Met Ala Lys Ser Val Ala Ser Ile Thr Thr Ala Phe Ala Leu Ile Phe 1 5 10 15 Ala Phe Phe Ile Leu Phe Ala Ser Phe Glu Val Pro Met Ala Glu Ala 20 25 30 Lys Val Cys Gln Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 35 40 45 Thr Gly Lys Cys Ser Arg His Cys Lys Gln Gln Glu Asp Ala Arg Tyr 50 55 60 Gly Ala Cys Tyr Arg Gln Gly Thr Gly Tyr Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 65 70 75 80 Glu Cys <210> 748 <211> 78 <212> PRT <213> Citrus sinensis <400> 748 Met Ala Lys Phe Thr Thr Thr Phe Ala Leu Leu Phe Ala Phe Phe Ile 1 5 10 15 Leu Phe Ala Ala Phe Asp Val Pro Met Ala Glu Ala Lys Val Cys Gln 20 25 30 Leu Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Leu Cys Leu Asn Thr Gly Asn Cys 35 40 45 Ser Arg Gln Cys Lys Gln Gln Glu Asp Ala Arg Phe Gly Ala Cys His 50 55 60 Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 749 <211> 76 <212> PRT <213> Citrus sinensis <400> 749 Met Glu Arg Ser Val Arg Leu Phe Ser Thr Val Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Ser Glu Met Gly Leu Arg Ala Ala Glu Ala Arg Ile Cys 20 25 30 Glu Ser Gln Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Val Ser Lys Ser Asn 35 40 45 Cys Ala Ala Val Cys Gln Thr Glu Gly Phe His Gly Gly His Cys Arg 50 55 60 Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Lys Arg Cys 65 70 75 <210> 750 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 750 Met Ser Thr Ala Thr Phe Val Asp Ile Ile Ile Ala Ile Leu Leu Pro 1 5 10 15 Pro Leu Gly Val Phe Leu Arg Phe Gly Cys Gly Val Glu Phe Trp Ile 20 25 30 Cys Leu Val Leu Thr Leu Leu Gly Tyr Ile Pro Gly Ile Ile Tyr Ala 35 40 45 Ile Tyr Val Leu Thr Lys Arg Thr Cys Glu Ser Gln Ser His Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Pro Cys Ser Arg Asp Ser Asn Cys Ala Thr Val Cys Leu Thr 65 70 75 80 Glu Gly Phe Ser Gly Gly Asp Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys Arg 85 90 95 Cys Thr Arg Pro Cys Val Phe Asp Glu Lys 100 105 <210> 751 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 751 Glu Ser Thr Asn Ile Leu Gln Arg Met Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser 1 5 10 15 Arg Asn Asp Ser Asn Ser Ala Thr Asp Arg Glu Ala 20 25 <210> 752 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 752 Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile Ala 1 5 10 15 <210> 753 <211> 22 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 753 Asp Arg Leu Ser Ser Gly Lys Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Pro Ala 1 5 10 15 Ala Gly Leu Ala Ile Ala 20 <210> 754 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 754 Arg Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 755 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 755 Arg Ile Asn Asn Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 756 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus manliponensis <400> 756 Gln Ile Asn Ser Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 757 <211> 8 <212> PRT <213> Lysinibacillus sp. <400> 757 Arg Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp 1 5 <210> 758 <211> 8 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 758 Arg Ile Asn Gly Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 759 <211> 8 <212> PRT <213> Aneurinibacillus sp. <400> 759 Arg Ile Asn Arg Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 760 <211> 8 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 760 Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp 1 5 <210> 761 <211> 8 <212> PRT <213> Burkholderia ubonensis <400> 761 Arg Ile Asn Thr Ala Ala Asp Asp 1 5 <210> 762 <211> 8 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 762 Lys Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp 1 5 <210> 763 <211> 8 <212> PRT <213> Lysinibacillus spp. <400> 763 Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp 1 5 <210> 764 <211> 8 <212> PRT <213> Lysinibacillus spp. <400> 764 Lys Ile Asn Arg Ala Ser Asp Asp 1 5 <210> 765 <211> 8 <212> PRT <213> Lysinibacillus xylanilyticus <400> 765 Lys Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp 1 5 <210> 766 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Arg or Gln or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser or Asn or Gly or Arg or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser or Ala or Lys or Gly <400> 766 Xaa Ile Asn Xaa Ala Xaa Asp Asp 1 5 <210> 767 <211> 15 <212> PRT <213> Bacillus thuringiensis <400> 767 Ala Ile Ala Leu Gly Ala Ala Asp Asp Lys Ala Ser Asn Ile Arg 1 5 10 15 <210> 768 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas syringae <400> 768 Ala Glu Arg Asp Thr Ala Ser Asn Ser Asp Asn Arg Ser Gln Val Ala 1 5 10 15 Leu Glu Arg Met Arg Gln Leu Ile Asn Thr Ser Glu 20 25 <210> 769 <211> 31 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 769 Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met 1 5 10 15 Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala 20 25 30 <210> 770 <211> 218 <212> PRT <213> Schistosoma japonicum <400> 770 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys 210 215 <210> 771 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 771 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 772 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 772 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 773 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (primer) <400> 773 tcgagcgcgt atgcaatacg 20 <210> 774 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (primer) <400> 774 gcgttatccc gtagaaaaag gtag 24 <210> 775 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct (primer) <400> 775 Ala Gly Ala Cys Gly Gly Phe Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Cys Gly 1 5 10 15 Cys Gly

Claims (50)

  1. 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스(abiotic stress)를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위한, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍(bioactive priming)용 폴리펩타이드로서,
    (a) 플라젤린(flagellin) 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 1 내지 225, 227 내지 375, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 541, 751, 752 및 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    (b) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571 내지 579 및 753 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    (c) 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 580 내지 586 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    (d) 레트로 인버소(retro inverso) Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450, 527, 531, 533, 535, 537 및 539 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는
    (e) 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 또는 768 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는
    (f) 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 529 또는 767을 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는
    (g) 하핀(harpin) 또는 하핀-유사 폴리펩타이드이되, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587, 589, 591, 593, 594 및 595 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는
    (h) 레트로 인버소 하핀(retro inverso harpin) 또는 하핀-유사 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 588, 590, 592, 596 및 597 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는
    (i) 근모 촉진 폴리펩타이드(root hair promoting polypeptide: RHPP)이되, 상기 RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603 및 604 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 RHPP; 또는
    (j) 쿠니츠 트립신 저해제(Kunitz Trypsin Inhibitor: KTI) 폴리펩타이드이되, 상기 KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함하는, 상기 KTI 펩타이드; 또는
    (k) 레트로 인버소 근모 촉진 폴리펩타이드(retro inverso root hair promoting polypeptide: RI RHPP)이되, 상기 RI RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605 및 606 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 RI RHPP; 또는
    (l) 연장 인자 Tu(elongation factor Tu: EF-Tu) 폴리펩타이드이되, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 607 내지 623 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는
    (m) 레트로 인버소 연장 인자 Tu(retro inverso elongation factor Tu: RI EF-Tu) 폴리펩타이드이되, 상기 RI EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 624 내지 640 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는
    (n) 서열번호 750을 포함하는 융합 폴리펩타이드; 또는
    (o) 파이토설포카인(phytosulfokine: PSK) 폴리펩타이드이되, 상기 PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함하는 상기 PSK 폴리펩타이드; 또는
    (p) 레트로 인버소 파이토설포카인(retro inverso phytosulfokine: RI PSK) 폴리펩타이드이되, 상기 RI PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 599를 포함하는, 상기 RI PSK 폴리펩타이드; 또는
    (q) 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드이되, 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 650 내지 749 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함하고, 그리고
    선택적으로, 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전(inversion), 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 또는 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유하거나 또는 코어 서열을 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 및 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 화학적 변형을 함유하거나; 아미노산 내에 아미노산 삽입, 결실, 역전, 반복, 중복, 연장 또는 치환을 갖는 변이체이거나; 또는 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유하거나 또는 코어 서열을 더 포함하는, 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 아세틸화, 산 첨가, 아실화, ADP-리보실화, 알데하이드 첨가, 알킬아마이드 첨가, 아마이드화, 아미노화, 바이오틴일화, 카바메이트 첨가, 클로로메틸 케톤 첨가, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 가교, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 에스터 첨가, 공유 가교부의 형성, 시스테인-시스테인 다이설파이드 결합의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 폼일화, 감마-카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드라자이드 첨가, 하이드록시아믹산 첨가, 하이드록실화, 아이오딘화, 지질 첨가, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질가수분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 팔미토일화, 정제 태그의 첨가, 파이로글루탐일 첨가, 라세미화, 셀레노일화(selenoylation), 설폰아마이드 첨가, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 트랜스퍼-RNA 매개된 첨가, 유비퀴틴화, 유레아 첨가 또는 N-말단 변형 또는 C-말단 변형을 포함하거나; 또는
    상기 변이체의 상기 아미노산 내의 상기 아미노산 치환은 β-아미노산, D-아미노산 또는 비-자연 아미노산의 치환을 포함하는, 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 화학적 변형은 아세틸화, 아마이드화, 가교 또는 고리화를 포함하는, 폴리펩타이드.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드의 상기 아미노산 서열은 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함하거나; 또는
    상기 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 바실루스(Bacillus), 라이시니바실루스(Lysinibacillus), 패니바실루스(Paenibacillus) 또는 애뉴리니바실루스 속(Aneurinbacillus genus) 박테리아로부터 유래되는, 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
    상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 상기 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 상기 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 상기 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (k)의 RI RHPP; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 상기 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드; 또는
    코어 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드는 서열번호 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함하고/하거나
    상기 코어 서열은 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함하고/하거나;
    상기 융합 폴리펩타이드는 지원(assistance) 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 지원 폴리펩타이드는,
    시그니처(signature) 폴리펩타이드이되, 상기 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542 내지 548 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 시그니처 폴리펩타이드; 또는
    신호 앵커 분류(signal anchor sorting) 폴리펩타이드이되, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 신호 앵커 분류 펩타이드; 또는
    시그니처 폴리펩타이드이되, 상기 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함하는, 상기 시그니처 폴리펩타이드; 또는
    신호 앵커 분류 폴리펩타이드이되, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549를 포함하는, 상기 신호 앵커 분류 펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나를 포함하는 상기 코어 서열을 더 포함하되, 상기 코어 서열의 상기 포함은 상기 폴리펩타이드의 상기 생물활성 프라이밍 활성도를 증가시키는, 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 768 중 임의의 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 폴리펩타이드는 생물활성 프라이밍 활성도를 갖는, 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 발효 생성물로부터 단리, 농축되고/되거나 선택적으로, 여과, 크로마토그래피에 의해서 또는 재조합 미생물로부터 부분적으로 정제되는, 폴리펩타이드.
  12. 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키기 위한, 식물 또는 식물 부분의 생물활성 프라이밍용 조성물로서,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물 및 농화학물질 또는 담체; 또는
    제1항 내지 제12항 중 임의의 한 항의 폴리펩타이드의 임의의 조합물을 포함하는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은,
    (A) 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물, 및 농화학물질 또는 담체(상기 농화학물질 또는 담체는 자연에서 상기 폴리펩타이드와 회합되지 않음); 또는
    (B) 상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 상기 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 상기 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 상기 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (k)의 RI RHPP; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 또는 상기 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드; 또는 이들의 임의의 혼합물; 및 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물; 또는 (C) 상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (d)의 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 상기 (e)의 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 상기 (f)의 레트로 인버소 Flg15 폴리펩타이드; 또는 상기 (h)의 레트로 인버소 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (k)의 RI RHPP; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (m)의 RI EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 상기 (p)의 RI PSK 폴리펩타이드 중 적어도 2종; 또는
    (D) 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 2종 이상을 포함하되,
    (i) 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 적어도 1종은 화학적 변형을 함유하거나; 변이체이거나; 융합 단백질의 부분이거나; 또는 프로테아제 인식 서열을 함유하거나; 또는
    (ii) 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 중 적어도 2종은 자연에서 회합되지 않거나, 또는
    (E) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 미생물에 의해서 재조합 방식으로 생산되는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은,
    (i) 상기 (A)의 조성물 또는 상기 (B)의 조성물이되, 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드, 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드, 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드, 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물은 화학적 변형을 함유하지 않고; 변이체가 아니고; 융합 단백질의 부분이 아니고; 프로테아제 인식 서열을 함유하지 않는, 상기 (A)의 조성물 또는 상기 (B)의 조성물; 또는
    (ii) 상기 (E)의 조성물이되, 상기 미생물은 바실루스(Bacillus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 박테리아, 패니바실루스(Paenibacillus) 속의 박테리아, 페니실리엄(Penicillium) 속의 박테리아, 글로무스(Glomus) 속의 박테리아, 슈도모나스 속의 박테리아, 안트로박터(Arthrobacter) 속의 박테리아, 파라코쿠스(Paracoccus)속의 박테리아, 리조븀(Rhizobium) 속의 박테리아, 브래디리조븀(Bradyrhizobium) 속의 박테리아, 아조스프릴리엄(Azosprillium) 속의 박테리아, 엔테로박터(Enterobacter) 속의 박테리아, 에쉐리키아(Escherichia) 속의 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 (E)의 조성물
    을 포함하는, 조성물.
  15. 폴리펩타이드를 발현하거나 과발현하는 재조합 미생물로서,
    상기 폴리펩타이드는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 재조합 미생물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 상기 (a)의 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (b)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (c)의 돌연변이체 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 상기 (g)의 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는 상기 (i)의 RHPP; 또는 상기 (j)의 KTI 폴리펩타이드; 또는 상기 (l)의 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는상기 (n)의 융합 폴리펩타이드; 또는 상기 (o)의 PSK 폴리펩타이드; 또는 상기 (q)의 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드를 포함하고/하거나;
    상기 폴리펩타이드는 상기 미생물에 의해서 발현되는, 재조합 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 미생물에 의해서 과발현되고, 분비 신호로 제조되는, 재조합 미생물.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 상기 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드; 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드(상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 651을 포함함); 상기 PSK 폴리펩타이드; (상기 PSK 폴리펩타이드 및 상기 PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함함); 상기 RHPP; (상기 RHPP 및 상기 RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함함); 상기 RI RHPP; 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; (상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 및 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함함); 상기 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하거나; 또는
    상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 PSK 폴리펩타이드, 상기 RHPP, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함하거나; 또는
    상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드와의 융합 단백질이거나; 또는
    상기 폴리펩타이드는 분비 신호를 더 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되,
    (i) 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 이의 N 또는 C 말단에서 화학적으로 변형되거나; 또는
    (ii) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 가교 또는 고리화를 통해서 변형되거나; 또는
    (iii) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 바실루스, 라이시니바실루스(Lysinibacillus), 패니바실루스(Paenibacillus), 애뉴리니바실루스(Aneurinibacillus) 속 박테리아 또는 이들의 임의의 조합물로부터 유래되거나; 또는
    (iv) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 75 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
    (v) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 N-말단 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 절두된 N-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106,108, 109, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154,156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182,184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
    (vi) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 절두된 C-말단 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 절두된 C-말단 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
    (vii) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751 내지 768 중 임의의 하나 또는 이들의 조합물을 포함하거나; 또는
    (viii) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
    (ix) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 및 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 플라젤린 또는 플라젤린 연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은,
    서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571, 574 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물; 또는
    서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나; 또는
    서열번호 754 내지 766 중 임의의 하나(상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드는 비-플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 전장 단백질 내에 혼입되고, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 상기 혼입은 상기 비-플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드 또는 전장 단백질에서 증가된 생물활성 프라이밍 활성도를 초래함); 또는
    서열번호 301
    을 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  21. 제18항에 있어서,
    (i) 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성하되, 상기 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나;
    (ii) 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드이되, 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 651을 포함하고, 그리고 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성하되, 상기 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하거나; 또는
    (iii) 상기 RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하고, 그리고 상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하거나; 또는
    (iv) 상기 RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하고, 그리고 상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752 및 571 중 임의의 하나를 포함하거나; 또는
    (v) 상기 RHPP의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하고, 그리고 상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하거나; 또는
    (vi) 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616을 포함하거나; 또는
    (vii) 상기 폴리펩타이드는 분비 신호를 더 포함하고, 그리고 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616을 포함하거나; 또는
    (viii) 상기 폴리펩타이드는 분비 신호를 더 포함하고, 그리고 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  22. 제18항 또는 제21항에 있어서, 상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 EF-Tu 폴리펩타이드 또는 상기 EF-Tu 폴리펩타이드 및 상기 분비 신호를 포함하고, 그리고 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 더 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 525, 526, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 541, 571 내지 586 및 751 내지 766 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 또는 752 또는 이들의 조합물을 포함하거나; 또는
    상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 더 포함하거나; 또는
    상기 조성물 또는 재조합 미생물은 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 더 포함하고, 그리고 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드는 서열번호 587을 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  24. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 571, 295, 300, 293 및 580; 또는 295, 300, 293 및 580; 또는 571, 295, 293 및 580; 또는 571, 300, 293 및 580; 또는 571, 293 및 580; 또는 571, 295, 293을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    (b) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226인, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 셀로비오스, 셀룰로스, 키틴 또는 키토산 중 1종 이상; 또는
    (c) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드이되, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 591을 포함하는, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드; 또는
    (d) 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드이되, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 587을 포함하는, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 및 상기 PSK 폴리펩타이드이되, 상기 PSK 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 598을 포함하는 상기 PSK 폴리펩타이드; 또는
    (e) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 상기 EF-Tu 폴리펩타이드이되, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함하는, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드; 또는
    (f) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 571 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    (g) 상기 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드; 또는
    (h) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 226, 571, 또는 752 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 상기 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드; 또는
    (i) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 상기 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드
    를 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  25. 제12항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 지원 폴리펩타이드를 더 포함하는, 조합물 또는 재조합 미생물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 지원 폴리펩타이드는,
    시그니처(signature) 폴리펩타이드이되, 상기 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542 내지 548 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 시그니처 폴리펩타이드; 또는
    시그니처 폴리펩타이드이되, 상기 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함하는, 상기 시그니처 폴리펩타이드; 또는
    신호 앵커 분류(signal anchor sorting) 폴리펩타이드이되, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드; 또는
    신호 앵커 분류 폴리펩타이드이되, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549 내지 562 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 상기 신호 앵커 분류 펩타이드; 또는
    분비 폴리펩타이드이되, 상기 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563 내지 570 또는 769 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 분비 폴리펩타이드; 또는 시그니처 폴리펩타이드이되, 상기 시그니처 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 542를 포함하는, 상기 시그니처 폴리펩타이드; 또는
    신호 앵커 분류 폴리펩타이드이되, 상기 신호 앵커 분류 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 549를 포함하는, 상기 신호 앵커 분류 펩타이드; 또는
    분비 폴리펩타이드이되, 상기 분비 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 563 또는 769를 포함하는, 상기 분비 폴리펩타이드
    를 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 지원 폴리펩타이드는,
    엔테로카이나제 절단 서열이되, 상기 엔테로카이나제 절단 서열의 아미노산 서열은 서열번호 772를 포함하는, 상기 엔테로카이나제 절단 서열; 또는
    엔테로카이나제 절단 서열이되, 상기 엔테로카이나제 절단 서열의 아미노산 서열은 서열번호 772를 포함하는, 상기 엔테로카이나제 절단 서열, 및 상기 폴리펩타이드와 단백질 태그를 연결하는 연결 영역; 또는 엔테로카이나제 절단 서열이되, 상기 엔테로카이나제 절단 서열의 아미노산 서열은 서열번호 772인, 상기 엔테로카이나제 절단 서열, 및 상기 폴리펩타이드와 단백질 태그를 연결하는 연결 영역을 더 포함하되, 상기 단백질 태그는 폴리-히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, 항체 에피토프, 스트렙타비딘/바이오틴, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 또는 이들의 임의의 조합물을 선택적으로 포함하는, 조성물 또는 재조합 미생물.
  28. 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 자연에서 상기 폴리펩타이드와 회합되는 농화학물질 또는 담체를 더 포함하는, 조성물.
  29. 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농화학물질은 항생제, 생물살충제(biopesticide), 보존제, 완충제, 습윤제, 계면활성제, 코팅제, 단당류, 다당류, 연마제, 살충제, 살곤충제, 제초제, 살선충제, 살박테리아제, 살진균제, 살진드기제, 비료, 생물자극제, 삼투억제제, 착색제, 보습제, 아미노산, 생물학적 제어제, 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산 또는 이들의 조합물을 포함하는, 조성물.
  30. 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은,
    상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.00001wt% 내지 약 95wt%의 상기 폴리펩타이드(들), 약 0.01% 내지 약 80wt%의 상기 농화학물질 및 약 5wt% 내지 약 50wt%의 담체; 또는
    상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.01wt% 내지 약 5wt%의 상기 폴리펩타이드, 약 0.2% 내지 약 70wt%의 상기 농화학물질 및 약 10wt% 내지 약 30wt%의 담체; 또는
    상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.05wt% 내지 약 1wt%의 상기 폴리펩타이드, 약 30wt% 내지 약 60wt%의 상기 농화학물질 및 약 40wt% 내지 약 69wt%의 담체
    를 포함하는, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 농화학물질은,
    염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산; 또는
    상기 조성물의 총 중량을 기준으로, 약 0.001wt% 내지 약 30wt%, 약 0.01wt% 내지 약 20%wt% 또는 0.1wt% 내지 약 5wt%의 염산, 아세트산, 및/또는 트라이플루오로아세트산을 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 조합물, 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항의 재조합 미생물로 코팅된, 종자(seed).
  33. 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 식물 구조를 변화시키는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물을 식물, 식물 부분 또는 식물 성장 매질 또는 상기 식물 또는 상기 식물 부분 주변의 영역 내의 근권(rhizosphere)에 도포하여 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 구조를 변화시키는 단계; 또는
    (b) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제12항 내지 제14항 및 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 성장 매질에 도포하여 상기 식물 성장 매질에서 성장될 식물 또는 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 보호하고/하거나 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 성장 매질에서 성장될 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 식물 구조를 변화시키는 단계; 또는
    (c) 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 식물, 식물 부분, 또는 식물 성장 매질 또는 상기 식물 또는 상기 식물 부분 주변의 영역 내의 근권에 도포하여 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 성장, 수확률, 건강, 수명, 생산성, 및/또는 활력을 증가시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키거나 상기 식물 구조를 변화시키는 단계를 포함하되, 상기 재조합 미생물은 상기 폴리펩타이드를 발현하고, 상기 폴리펩타이드의 발현은 동일한 조건 하에서 동일한 부류의 야생형 미생물에서의 상기 폴리펩타이드의 상기 발현 수준에 비해서 증가되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법은,
    (A) 상기 식물 또는 상기 식물 부분에서 비생물학적 스트레스를 감소시키고/시키거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 상기 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드; 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 이들의 임의의 조합물; 또는
    FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드; 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는
    레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 이들의 임의의 조합물;
    RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600, 603, 604 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드; 쿠니츠 트립신 저해제(KTI) 폴리펩타이드이되, 상기 KTI 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 602를 포함하는, 상기 KTI 폴리펩타이드; 상기 레트로-인버소 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RI RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 601, 605, 606 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 RI RHPP 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계
    또는
    (B) 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 질병으로부터 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 상기 선천적인 면역 반응을 증가시키고/시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    (i) 상기 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 또는 이들의 임의의 조합물; 또는
    (ii) 상기 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는
    (iii) 상기 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드; 상기 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드; 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는 이들의 임의의 조합물; 또는
    (iv) 상기 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752 또는 571을 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드 및 EF-Tu 폴리펩타이드이되, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 616 및 617을 포함하는, 상기 EF-Tu 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계; 또는
    (C) 상기 식물 또는 상기 식물 부분을 질병, 곤충 또는 선충으로부터 보호하는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    (i) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 289, 290, 291, 293, 294, 295, 300, 437, 532, 534, 536, 538, 540, 571 내지 586 및 751 내지 766 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는 (ii) 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 293, 295, 300, 540, 571 574, 751 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계;
    또는
    (D) 상기 식물 또는 식물 부분을 질병, 곤충 및/또는 선충으로부터 보호하고/하거나 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 상기 선천적인 면역 반응을 개선시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은 상기 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 상기 RHPP 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계
    를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    (a) 상기 (A)의 방법이되, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은 비생물학적 스트레스를 감소시키고, 상기 비생물학적 스트레스는 고온 스트레스, 온도 스트레스, 방사선 스트레스, 건조 스트레스, 저온 스트레스, 염류 스트레스, 영양-결핍 스트레스, 고 금속 스트레스, 물 스트레스, 삼투성 스트레스 또는 이들의 임의의 조합물이거나; 또는
    (b) 상기 (B)의 방법 또는 상기 (C)의 방법이되, 상기 질병은 아시아 감귤 녹화(Asian citrus greening), 감귤그린(Huanglonging: HLB)병, 아시아 대두 녹병(Asian soybean rust), 스클레로티니아 줄기 썩음병(Sclerotinia stem rot)(또는 흰곰팡이(white mold)), 슈도모나스 잎 반점병(Pseudomonas leaf spot) 또는 세르코스포라 잎 마름병(Cercospora leaf blight)을 포함하는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 방법은,
    (A) 상기 식물 또는 식물 부분의 상기 수확률, 상기 성장 및/또는 상기 생산성을 증가시키고/시키거나 상기 식물 구조를 변화시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물은 상기 RHPP 폴리펩타이드 및/또는 상기 RI RHPP 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계; 또는
    (B) 고온 및 가뭄 경향이 있는 환경에서 상기 식물 또는 식물 부분의 상기 수확률을 증가시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물은 상기 PSK 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계; 또는
    (C) 상기 식물 또는 식물 부분의 상기 성장을 증가시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물은 상기 PSK 폴리펩타이드, 상기 RHPP, 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함하는, 상기 단계; 또는
    (D) 식물 성장을 위한 스트레스 및 비-스트레스 조건 둘 다의 경향이 있는 환경에서 상기 식물 또는 식물 부분의 상기 성장 및 생산성을 증가시키는 단계로서, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 조성물은 상기 PSK 폴리펩타이드 및 상기 하핀 또는 하핀-유사 폴리펩타이드를 포함하는, 상기 단계
    를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    (a) 상기 (A)의 방법으로서, 하기 중 적어도 하나이거나:
    (i) (A)의 상기 RHPP 폴리펩타이드는 서열번호 600을 포함함; 그리고/또는
    (ii) (A)에서의 상기 식물의 상기 성장은 뿌리 성장, 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함함; 그리고/또는
    (iii) (A)에서 상기 식물은 대두를 포함하되, 상기 성장은 전체 뿌리 길이, 뿌리 바이오매스, 근류형성, 식물당 뿌리혹, 총 바이오매스, 지상부 바이오매스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 그리고 상기 생산성은 총 깍지(pod)의 수 또는 마디당 깍지를 포함함; 그리고/또는
    (iv) (A)에서 상기 식물 구조에 대한 상기 변화는 상기 식물 또는 식물 부분에 대한 이로운 결과를 포함함; 그리고/또는
    (v) (A)에서 상기 식물 구조에 대한 상기 변화는 상기 식물의 경작지의 증가된 경작 밀도를 포함하는 상기 식물에 대한 이로운 결과를 포함함;
    또는
    (b) 상기 (B)의 방법으로서, (B)의 상기 폴리펩타이드, 조성물 또는 재조합 미생물은 꽃 형성 직전에 또는 개화기 이전에 적용되거나; 또는
    (c) 상기 (C)의 방법으로서, (C)에서 상기 식물 또는 식물 부분의 상기 성장은 뿌리 및 꽃 정단 분열조직, 꽃 기관 생산, 열매 발달, 열매 생산, 꽃 기관의 수, 꽃 기관, 또는 이들의 조합물인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 (B)의 방법 또는 상기 (C)의 방법으로서, 상기 질병은 아시아 감귤 녹화, 감귤그린(HLB)병, 아시아 대두 녹병, 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이), 슈도모나스 잎 반점병 또는 세르코스포라를 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    상기 Flg22 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226-300 및 571-573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드; 또는
    상기 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301-375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드; 또는
    상기 Flg22 폴리펩타이드 및 상기 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226-300 및 571-573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301-375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드 및 상기 FlgII-28 폴리펩타이드;
    상기 Flg22 폴리펩타이드 및 상기 FlgII-28 폴리펩타이드이되, 상기 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 300 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 상기 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 301 내지 375 또는 751 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 Flg22 폴리펩타이드 및 상기 FlgII-28 폴리펩타이드를 포함하고, 그리고 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드이드, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 더 포함하되, 상기 레트로 인버소 Flg22 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 376 내지 450 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 상기 레트로 인버소 FlgII-28 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 451 내지 525 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 질병은,
    (i) 아시아 대두 녹병, 세르코스포라 잎 마름병 또는 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이)로서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752, 및 571 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드; 또는
    RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드; 또는
    플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 752, 및 571 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드, 및 RHPP 폴리펩타이드이되, 상기 RHPP 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 600을 포함하는, 상기 RHPP 폴리펩타이드
    를 포함하는, 상기 아시아 대두 녹병, 세르코스포라 잎 마름병 또는 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이);
    또는
    (ii) 아시아 감귤 녹화로서, 상기 조성물은 살박테리아제 및 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 571 및 752 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 아시아 감귤 녹화;
    또는
    (iii) 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이)으로서, 상기 조성물은 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 571, 751 및 752 중 임의의 하나를 포함하는, 상기 스클레로티니아 줄기 썩음병(또는 흰곰팡이);
    또는
    (iv) 박테리아 질병으로서, 상기 방법은 상기 박테리아의 성장을 제한하고/하거나 상기 질병을 예방하는 것을 포함하고, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226, 540, 752 및 571 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 상기 박테리아 질병
    을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 (i)의 방법이되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-연관된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226을 포함하고; 그리고 상기 조성물은 살진균제를 선택적으로 포함하거나, 또는
    상기 (iv)의 방법이되, 상기 박테리아는 슈도마나스 시린개(Pseudomanas Syringae)를 포함하고, 상기 식물은 키위 식물을 선택적으로 포함하거나; 또는
    상기 (ii)의 방법이되, 상기 살박테리아제는 옥시테트라사이클린을 포함하는, 방법.
  41. 제33항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 조성물은,
    상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드; 또는
    상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드 또는 Flg22 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 티오닌 또는 티오닌-유사 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드를 식물 또는 식물 부분 내의 관다발 조직 또는 세포 및/또는 체관부 또는 체관부-연관된 조직 또는 세포에 전달하기 위해서, 체관부 표적화 서열에 융합되어 융합된 폴리펩타이드를 형성하되, 상기 체관부 표적화 서열의 아미노산 서열은 서열번호 641 내지 649 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
  42. 제33항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 Flg22 폴리펩타이드를 포함하거나; 또는
    상기 폴리펩타이드는 Flg22 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 Flg22 폴리펩타이드는 서열번호 526 및 527 또는 서열번호 226 또는 227을 포함하거나 또는
    상기 폴리펩타이드는 상기 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 플라젤린 또는 플라젤린-유사 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 226 내지 525 및 571 내지 573 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    (A) 상기 질병은 아시아 감귤병(HLB), 감귤 궤양병, 세르코스포라 잎 마름병 또는 박테리아 유발 질병을 포함하거나; 또는
    (B) 상기 질병은 박테리아 유발 질병을 포함하되, 상기 박테리아 유발 질병은 박테리아 잎 마름병(bacterial leaf blight), 박테리아 줄기 썩음병(bacterial stalk rot), 박테리아 잎 반점병(bacterial leaf spot), 박테리아 잎 그을음병(bacterial leaf scorch), 박테리아 상부 썩음병(bacterial top rot), 박테리아 줄무늬병(bacterial stripe), 갈색 무늬병(chocolate spot), 고스 박테리아 시드름 및 마름병(Goss's bacterial wilt and blight), 홀커스 반점병(Holcus spot), 자색 잎자루(purple leaf sheath), 종자 썩음병, 묘목 마름병, 스테바르트병(Stewart's disease)(박테리아 시드름병), 옥수수 생육저해병(corn stunt), 화상병(Fire Blight), 피어스병(Pierce's disease), 감귤 얼룩 백화증(citrus variegated chlorosis), 감귤 궤양병(citrus canker), 슈도모나스 시린개 세로바스(Pseudomonas syringae serovars)는 이들의 조합물을 포함하는, 방법.
  44. 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 질병으로부터의 상기 식물 또는 상기 식물 부분의 보호는 식물 또는 식물 부분 상에서 또는 그 내에서의 예방적 처리, 처리, 예방 및 감소된 질병 진행을 포함하는, 방법.
  45. 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드, 상기 조성물 또는 상기 재조합 미생물은 상기 식물, 상기 식물 부분 또는 상기 식물 성장 매질에 외인적으로 적용되거나 또는 상기 식물 또는 식물 부분에 내인적으로 적용되는, 방법.
  46. 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물 부분은 세포, 잎, 가지, 줄기, 꽃, 나뭇잎, 꽃 기관, 열매, 화분, 채소, 괴경(tuber), 구경(corm), 구근(bulb), 위구경(pseudobulb), 깍지, 뿌리, 분형근(root bal), 뿌리 줄기, 접순(scion) 또는 종자를 포함하고/하거나;
    상기 폴리펩타이드, 상기 조성물 또는 상기 재조합 미생물은 상기 식물의 표면, 상기 식물의 나뭇잎 또는 상기 식물의 종자의 표면에 적용되고/되거나;
    상기 폴리펩타이드, 상기 조성물 또는 상기 재조합 미생물은 상기 식물의 종자의 표면에 적용되고, 상기 식물 또는 상기 식물 부분은 상기 종자로부터 재배되고/되거나;
    상기 폴리펩타이드, 상기 조성물 또는 상기 재조합 미생물은 엽면 시비로서 적용되고/되거나;
    상기 식물은 열매 식물 또는 채소 식물이고, 상기 방법은 열매 또는 채소의 증가된 수확률을 제공하는, 방법.
  47. 폴리펩타이드의 생산 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 엔테로카이나제(enterokinase: EK) 절단 부위를 포함하는 융합 단백질을 발효를 통해서 생산하는 단계를 포함하되, 상기 엔테카이나제 절단 부위는 상기 폴리펩타이드의 활성도 및 안정성을 향상시키는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 방법은 엔테로카이나제를 상기 제조된 융합 단백질에 적용하여 상기 엔테로카이나제 절단 부위를 절단하고, 상기 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 더 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  49. 제47항 또는 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔테로카이나제 절단 부위는 서열번호 772를 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 단백질 태그를 더 포함하거나; 또는
    상기 융합 단백질은 단백질 태그를 더 포함하되, 상기 단백질 태그는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(glutathione S transferase: GST)를 더 포함하거나; 또는
    상기 융합 단백질은 단백질 태그 및 분비 신호를 더 포함하거나; 또는
    상기 융합 단백질은 단백질 태그 및 분비 신호를 더 포함하되, 상기 단백질 태그는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)를 더 포함하거나; 또는
    상기 융합 단백질은 단백질 태그 및 분비 신호를 더 포함하되, 상기 분비 신호는 서열번호 563 내지 570 또는 769 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    상기 융합 단백질은 단백질 태그 및 분비 신호를 더 포함하되, 상기 단백질 태그는 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)를 포함하고, 상기 분비 신호는 서열번호 563 내지 570 또는 769 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
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