CN111979285B - 一种珍珠肽螯合钙的制备方法 - Google Patents

一种珍珠肽螯合钙的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种珍珠肽螯合钙的制备方法，该方法将珍珠粉与丙酸水溶液混合，利用离心或透析的方法，得到珍珠蛋白沉淀；再冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末；将珍珠蛋白粉末溶解于水中，得到珍珠蛋白水溶液；再进行酶解反应，加热煮沸反应液，得到溶液II；溶液II过滤后，冻干，得到珍珠肽；将珍珠肽溶解于Tris‑HCl溶液中，向其中加入氯化钙溶液，进行螯合反应；离心，向上清液中加入无水乙醇，得到珍珠肽螯合钙。本发明采用丙酸对珍珠进行酸解，再用酶解法得到珍珠肽，然后将珍珠肽与钙离子螯合，得到珍珠肽螯合钙；该方法不仅所用试剂易得、操作简单、对设备要求不高、实际操作性强，且其中珍珠蛋白提取率以及珍珠肽螯合钙得率均较高。

Description

一种珍珠肽螯合钙的制备方法
技术领域
本发明涉及珍珠加工利用技术领域，尤其涉及一种珍珠肽螯合钙的制备方法。
背景技术
就人体内的无机元素而言，钙是其中含量最高的，含量约为700-1400g，约占人体体重的1.5-2.2％，其中99％的钙用于构成、支持和保护骨骼及牙齿，另1％分布在细胞内和细胞外液中。钙摄入充足可减少骨损失、预防骨质疏松和龋齿等，还可参与酶调节、凝血、调节细胞膜通透性、调节肌肉的正常活动等功能。人体内许多关键的过程如细胞增殖、激素调节及神经递质的释出等也与钙相关。钙摄入不足时，将会导致许多不良反应，严重时导致疾病产生。
人类最普遍的钙来源是离子钙，如碳酸钙、葡萄糖酸钙及乳酸钙等。然而，离子钙的不足是易在肠道中生成钙沉淀。也因此，日常饮食中的钙吸收率和生物利用度将会减弱许多。
为避免离子钙的副作用，肽钙螯合物逐渐兴起，被认为是代替离子钙的良好选择，螯合物中的肽可在钙离子的跨膜运输中作为载体，有能耗少、速度快、载体利用度高等优势。且肽的来源非常广泛，常见的有酪蛋白磷酸肽、大豆肽等，多种来源的肽可提供人体所必需的氨基酸，促进人体的氨基酸平衡，也无其他负面影响。其既少了溶解度低、利用率低等不足，也解决了有机酸钙的毒副作用及钙含量低的问题，作为钙补充剂来说显得更为理想；同时，它还具有性质稳定、抗病抗应激、生物利用率高等优点。
珍珠为珍珠贝科动物及蚌科动物等的外套膜受刺激后不断分泌珍珠质而形成的粒状体。除含有95％左右的碳酸钙和5％左右的有机质组成外，还含有30多种常量和微量元素；有机质包括氨基酸、牛磺酸、小分子活性肽、卟啉及金属卟啉、维生素B族及微量元素等，其临床应用非常广泛。
现代药理研究表明，珍珠能促进机体的新陈代谢，增加表皮细胞活力，延缓细胞衰老，抑制黑色素的生成，具有祛斑美白，解毒生肌等药理作用。目前，已有研究发现珍珠粉具有抗骨质疏松、促进修复骨损伤、可用于治疗口疮的能力，并在一定程度上可以起到抗氧化的作用。
目前，关于珍珠的加工利用方式多以磨粉纯化为主，珍珠内功能成分的提取纯化加工较少，即珍珠的深度加工形式较少。
发明内容
本发明提供了一种珍珠肽螯合钙的制备方法，该方法不仅所用试剂易得、操作简单、对设备要求不高、实际操作性强，且其中珍珠蛋白提取率以及珍珠肽螯合钙得率均较高，同时给珍珠深度加工提供了一种新思路，拓展了其应用范围。
具体技术方案如下：
一种珍珠肽螯合钙的制备方法，包括以下步骤：
(1)将珍珠粉与丙酸水溶液混合，在磁力搅拌作用下反应，得到溶液I；
(2)利用离心或透析的方法，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末；
(3)将珍珠蛋白粉末溶解于水中，得到珍珠蛋白水溶液；向珍珠蛋白水溶液中加入酶进行酶解反应，加热煮沸反应液，结束酶解反应，得到溶液II；溶液II过滤后，将得到的上清液冻干，得到珍珠肽；所述酶为β-丙内酯酶、碱性蛋白酶中的至少一种；
(4)将珍珠肽溶解于Tris-HCl溶液中，得到珍珠肽溶液；向珍珠肽溶液中加入氯化钙溶液，进行螯合反应；反应结束后，离心取上清液，向上清液中加入无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
珍珠中包含95％左右的碳酸钙，本发明为了提取珍珠蛋白，先用一定浓度的弱酸与碳酸钙反应，使珍珠蛋白游离出来，同时不影响其高级结构；此法中所用试剂易得，成本较低，实际操作性强；再采用酶解法得到珍珠肽，将其与钙离子螯合得到珍珠肽螯合钙。
作为优选，步骤(1)中，所述丙酸水溶液的浓度为2～3mol/L；所述丙酸与珍珠粉的体积质量比为10ml～20ml:1g。
作为优选，步骤(2)中，所述离心的条件为：6000～12000r/min，4℃下，离心5～10min，离心的次数为1～3次。
作为优选，步骤(2)中，所述透析选用截留分子量为1000～3000Da的透析袋，磁力搅拌的转速为1000～1500rpm，搅拌时长为20～30h。
作为优选，步骤(3)中，珍珠蛋白水溶液中珍珠蛋白的添加浓度为40～60g/L；β-丙内酯酶与珍珠蛋白的质量比为1:40～60。
作为优选，步骤(3)中，所述酶解的时间为4～8h；煮沸的时间为10～20min。
作为优选，步骤(4)中，所述Tris-HCl溶液的浓度为15～25mmol/L，pH为7.0～8.0；珍珠肽溶液中珍珠肽的浓度为15～25mg/mL。
作为优选，步骤(4)中，向珍珠肽溶液中加入氯化钙溶液后，珍珠肽与钙离子的质量摩尔比为1g:1～2mmol。
作为优选，步骤(4)中，所述螯合反应的温度为35～45℃，时间为1～2h。
作为优选，步骤(4)中，所述离心的条件为：6000～12000r/min，4℃下，离心5～10min；向上清液中加入2.5～3.5倍体积的无水乙醇。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用丙酸对珍珠进行酸解，再用酶解法得到珍珠肽，然后将珍珠肽与钙离子螯合，得到珍珠肽螯合钙；该方法不仅所用试剂易得、操作简单、对设备要求不高、实际操作性强，且其中珍珠蛋白提取率以及珍珠肽螯合钙得率均较高。
(2)本发明方法的珍珠蛋白提取率较高，凯氏定氮法测得其中粗蛋白提取率达到2.73％，实验稳定性较高，适合实际生产。
(3)本发明方法拓展了珍珠深度加工的思路与途径，为实际生产利用提供参考。
附图说明
图1为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的紫外可见吸收光谱。
图2为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的傅里叶红外光谱。
图3为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的圆二色谱。
图4为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的X射线衍射。
图5为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的差示扫描量热。
图6为实施例1中珍珠肽螯合钙与珍珠肽的扫描电镜图；
其中，A为珍珠肽，B为珍珠肽螯合钙。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释，本发明根据发明技术方案进行实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1
一种珍珠肽螯合钙的制备方法，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水将丙酸配成2mol/L的丙酸水溶液；将2g珍珠粉分别加入试管中，再缓慢加入30mL丙酸水溶液，磁力搅拌下反应24h，得到溶液I；
(2)将溶液I在8000r/min，4℃下离心5min，分离上清液，用蒸馏水复溶沉淀，再在8000r/min，4℃下离心5min，重复3次，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末产品，测量所得产品质量，计算得率；
(3)将珍珠蛋白粉末用蒸馏水配成50g/L的珍珠蛋白水溶液，向珍珠蛋白水溶液中加入β-丙内酯酶(BLP酶)，在酶/底物比为1/50(w/w)、pH为8.0、50℃的条件下酶解4h；再在100℃下加热10min，酶解反应结束，得到溶液II；将溶液II过滤后得到的上清液冷冻干燥，得到珍珠肽；
(4)将珍珠肽溶解于20mmol/L的Tris-HCl溶液(pH7.8)中，得到浓度为20mg/mL的珍珠肽溶液，向珍珠肽溶液中加入0.2mol/L的氯化钙溶液，40℃下螯合1h，肽与钙离子的比例(重量/毫摩尔)为1：1；反应结束后，在40℃，8000r/min条件下离心5min，取上清液，向上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
经过凯氏定氮测定，珍珠蛋白平均提取率为2.13±0.05g/100g珍珠粉，珍珠肽得率1.13±0.02g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为0.16±0.002g/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为48.75±1.20％。
对比例1
本对比例除采用乙酸替代丙酸外，其余内容与实施例1完全相同。
经过凯氏定氮测定，珍珠蛋白平均提取率为1.07±0.02g/100g珍珠粉，珍珠肽得率0.75±0.01g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为100±1mg/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为63.41±1.2％。
对比例2
本对比例除采用盐酸替代丙酸外，其余内容与实施例1完全相同。
经过凯氏定氮测定，珍珠蛋白平均提取率为0.90±0.01g/100g珍珠粉，珍珠肽得率0.68±0.01g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为10±0.1mg/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为25±0.8％。
实施例2
一种珍珠肽螯合钙的制备方法，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水将丙酸配成2mol/L的丙酸水溶液；将2g珍珠粉分别加入试管中，再缓慢加入30mL丙酸水溶液，磁力搅拌下反应24h，得到溶液I；
(2)将溶液I在8000r/min，4℃下离心5min，分离上清液，用蒸馏水复溶沉淀，再在8000r/min，4℃下离心5min，重复3次，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末产品，测量所得产品质量，计算得率；
(3)将珍珠蛋白粉末用蒸馏水配成50g/L的珍珠蛋白水溶液，向珍珠蛋白水溶液中加入β-丙内酯酶(BLP酶)和碱性蛋白酶组成的复合酶(质量比为1：1)，在酶/底物比为1/50(w/w)、pH为8.0、50℃的条件下酶解4h；100℃下加热10min，酶解反应结束，得到溶液II；将溶液II过滤后得到的上清液冻干，得到珍珠肽；
(4)将珍珠肽溶解于20mmol/L的Tris-HCl溶液(pH7.8)中，得到浓度为20mg/mL的珍珠肽溶液，向珍珠肽溶液中加入0.2mol/L的氯化钙溶液，40℃下螯合1h，肽与钙离子的比例(重量/毫摩尔)为1：1；反应结束后，在40℃，8000r/min条件下离心5min，取上清液，向上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
经过凯氏定氮测定，珍珠肽得率1.28±0.06g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为180±1.1mg/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为39.86±1.0％。
实施例3
一种珍珠肽螯合钙的制备方法，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水将丙酸配成2mol/L的丙酸水溶液；将2g珍珠粉分别加入试管中，再缓慢加入30mL丙酸水溶液，磁力搅拌下反应24h，得到溶液I；
(2)将溶液I在8000r/min，4℃下离心5min，分离上清液，用蒸馏水复溶沉淀，再在8000r/min，4℃下离心5min，重复3次，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末产品，测量所得产品质量，计算得率；
(3)将珍珠蛋白粉末用蒸馏水配成50g/L的珍珠蛋白水溶液，向珍珠蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶，在酶/底物比为1/50(w/w)、pH为8.0、50℃的条件下酶解4h；100℃下加热10min，酶解反应结束，得到溶液II；将溶液II过滤后得到的上清液进行冻干，得到珍珠肽；
(4)将珍珠肽溶解于20mmol/L的Tris-HCl溶液(pH7.8)中，得到浓度为20mg/mL的珍珠肽溶液，向珍珠肽溶液中加入0.2mol/L的氯化钙溶液，40℃下螯合1h，肽与钙离子的比例(重量/毫摩尔)为1：1；反应结束后，在40℃，8000r/min条件下离心5min，取上清液，向上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
经过凯氏定氮测定，珍珠肽得率1.47±0.04g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为170±1.1mg/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为35.53±0.92％。
实施例4
一种珍珠肽螯合钙的制备方法，具体步骤如下：
(1)用蒸馏水将丙酸配成2mol/L的丙酸水溶液；将2g珍珠粉分别加入试管中，再缓慢加入30mL丙酸水溶液，磁力搅拌下反应24h，得到溶液I；
(2)用截留量为1000Da的透析袋对溶液I透析24h，分离上清液，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末产品，测量所得产品质量，计算得率；
(3)将珍珠蛋白粉末用蒸馏水配成50g/L的珍珠蛋白水溶液，向珍珠蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶，在酶/底物比为1/50(w/w)、pH为8.0、50℃的条件下酶解4h；100℃下加热10min，酶解反应结束，得到溶液II；将溶液II过滤后得到的上清液冻干，得到珍珠肽；
(4)将珍珠肽溶解于20mmol/L的Tris-HCl溶液(pH7.8)中，得到浓度为20mg/mL的珍珠肽溶液，向珍珠肽溶液中加入0.2mol/L的氯化钙溶液，40℃下螯合1h，肽与钙离子的比例(重量/毫摩尔)为1：1；反应结束后，在40℃，8000r/min条件下离心5min，取上清液，向上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
经过凯氏定氮测定珍珠蛋白平均提取率为1.62±0.03g/100g珍珠粉，珍珠肽得率0.86±0.01g/100g珍珠粉，珍珠肽螯合钙平均得率为120±0.65mg/100g珍珠粉。EDTA滴定法测得螯合物中平均钙含量为45.00±1.0％。

Claims (9)

1.一种珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将珍珠粉与丙酸水溶液混合，在磁力搅拌作用下反应，得到溶液I；
(2)利用离心或透析的方法，得到溶液I中的珍珠蛋白沉淀；再将珍珠蛋白沉淀冷冻干燥，得到珍珠蛋白粉末；
(3)将珍珠蛋白粉末溶解于水中，得到珍珠蛋白水溶液；向珍珠蛋白水溶液中加入酶进行酶解反应，加热煮沸反应液，结束酶解反应，得到溶液II；溶液II过滤后，将得到的上清液冻干，得到珍珠肽；所述酶为碱性蛋白酶；
(4)将珍珠肽溶解于Tris-HCl溶液中，得到珍珠肽溶液；向珍珠肽溶液中加入氯化钙溶液，进行螯合反应；反应结束后，离心取上清液，向上清液中加入无水乙醇，得到沉淀物，即为珍珠肽螯合钙。
2.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丙酸水溶液的浓度为2～3mol/L；所述丙酸与珍珠粉的体积质量比为10ml～20ml:1g。
3.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心的条件为：6000～12000r/min，4℃下，离心5～10min，离心的次数为1～3次。
4.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述透析选用截留分子量为1000～3000Da的透析袋，磁力搅拌的转速为1000～1500rpm，搅拌时长为20～30h。
5.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶解的时间为4～8h；煮沸的时间为10～20min。
6.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Tris-HCl溶液的浓度为15～25mmol/L，pH为7.0～8.0；珍珠肽溶液中珍珠肽的浓度为15～25mg/mL。
7.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，向珍珠肽溶液中加入氯化钙溶液后，珍珠肽与钙离子的质量摩尔比为1g:1～2mmol。
8.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述螯合反应的温度为35～45℃，时间为1～2h。
9.如权利要求1所述的珍珠肽螯合钙的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心的条件为：6000～12000r/min，4℃下，离心5～10min；向上清液中加入2.5～3.5倍体积的无水乙醇。
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