CN111491654A - 用于改善植物的保护、生长和生产力的生物活性多肽 - Google Patents

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Abstract

提供了当以农业制剂形式施用于植物时有用的生物活性引发性多肽。还提供了使用含有所述生物活性引发性多肽的制剂的方法，所述生物活性引发性多肽被外源性地施用于植物或植物细胞膜的表面，或内源性地施用于植物或植物细胞的内部。当施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中时，所述生物活性引发性多肽提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构。

Description

用于改善植物的保护、生长和生产力的生物活性多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年7月20日提交的美国临时申请第62/534,710号的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
提供了可以以农业制剂形式递送的生物活性引发性多肽。可以将所述多肽施用于农作物以实现农学上期望的结果，如植物中的表型(例如，表现出对害虫、病原(diseaseagent)和非生物胁迫的保护性的表型)增强、植物的生长、生产力和产量提高。
背景技术
实现期望的农学表型(如提高的产量、疾病预防、抗病性和改善的非生物胁迫耐受性)的常规方法主要利用了选择性育种、嫁接、转基因和农用化学方法。
参与植物防御反应的生物活性引发性多肽
植物具有免疫系统，所述免疫系统检测可能引起疾病的微生物并保护植物免受所述微生物侵害。植物中的抗微生物肽(AMP)通常是抵御病原体入侵的第一道防线，并且参与启动可以向植物赋予先天性免疫力的防御反应。许多AMP通常对各种传染原具有活性。其通常被分类为抗菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生虫。
给定植物物种对可接触植物表面并在其上定居的某些病原生物的抗性基于高度专业化的识别系统，所述识别系统仅用于某些微生物(例如，特定的细菌或真菌菌株)产生的分子。植物通过使用模式识别受体(PRR)识别与其相关的病原体相关分子模式(PAMP)来感知潜在的微生物入侵者。
鞭毛蛋白/鞭毛蛋白相关型多肽
已经主要报道了鞭毛蛋白和源自那些鞭毛蛋白的鞭毛蛋白相关型多肽在植物的先天性免疫反应中具有功能性作用。这些多肽源自真细菌鞭毛蛋白的高度保守的结构域。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要组成部分。形成细菌鞭毛的细丝的鞭毛蛋白亚基可以在细胞中充当有效的激发子，从而在各种植物物种中引发防御相关反应。
“鞭毛蛋白”是球状蛋白，其自身排列成空心圆柱体，从而在细菌鞭毛中形成细丝。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要取代基，并且存在于鞭毛细菌中。植物可以通过识别保守的表位(如定位在全长鞭毛蛋白编码序列N端的22个氨基酸的伸展(Flg22))来感知、抵抗感染并建立针对细菌微生物的防御信号传导。Flg22多肽的激发子活性归因于鞭毛蛋白N端内的这个保守结构域(Felix等人，1999年)。植物可以通过植物细胞表面处的模式识别受体(PRR)来感知细菌鞭毛蛋白，所述模式鉴定受体被称为鞭毛蛋白敏感性受体，其是一种定位在质膜上的富含亮氨酸的重复受体激酶，并且可从植物细胞表面处获得。在植物中，最典型的PRR是鞭毛蛋白感知2(FLS2)，其在单子叶植物和双子叶植物中均高度保守。
在拟南芥(Arabidopsis)中，对Flg22的先天性免疫反应涉及宿主识别蛋白复合物，所述复合物含有FLS2—富含亮氨酸的重复(LRR)受体激酶(Gómez-Gómez L.和BollerT.,“FLS2：一种参与感知拟南芥属中的细菌激发子鞭毛蛋白的LRR受体样激酶(FLS2:AnLRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitorflagellin in Arabidopsis)”《分子细胞(Molecular Cell)》5:1003-1011,2000)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，FLS2是决定鞭毛蛋白感知的PRR，并且对一个或多个鞭毛蛋白相关型多肽的结合具有特异性。例如，Flg22与外部植物FLS2膜结合受体的结合会触发参与先天性免疫反应的信号传导级联，所述先天性免疫反应诱导植物建立高度特异性的信号传导相关级联，所述高度特异性的信号传导相关级联参与激活模式触发的免疫(Chinchilla等人,“拟南芥属受体激酶FLS2结合Flg22并决定鞭毛蛋白感知的特异性(TheArabidopsis receptor kinase FLS2 binds Flg22 and determines the specificityof flagellin perception)”《植物细胞(Plant Cell)18:465-476,2006》)。因此，Flg22与拟南芥属FLS2膜结合受体的结合引发了激活的第一步，在所述第一步中，结合引发了植物防御反应的激活级联。Flg22-FLS2相互作用还可以导致活性氧(ROS)的产生，这有助于氧化迸发的诱导、细胞培养基碱化、病原体反应基因的下游诱导以及与防御相关的反应，从而赋予植物疾病抵抗力(Felix G.等人,“植物对细菌鞭毛蛋白的最保守结构域具有敏感的感知系统(Plants have a sensitive perception system for the most conserved domainof bacterial flagellin)”《植物学杂志(The Plant Journal)》18:265-276,1999；Gómez-Gómez L.和Boller T.,“FLS2：一种参与感知拟南芥属中的细菌激发子鞭毛蛋白的LRR受体样激酶”《分子细胞》5:1003-1011,2000；Meindi等人,“根据地址-信息概念，细菌激发子鞭毛蛋白激活其在番茄细胞中的受体(The bacterial elicitor flagellin activates itsreceptor in tomato cells according to the address-message concept)”《植物细胞》12:1783-1794,2000)。在番茄中，使用完整细胞和微粒体膜制剂均观察到Flg22与FLS受体的高亲和力结合。在这项研究中，Flg22与质膜表面处的一个或多个FLS2受体的结合在生理条件下是不可逆的，这反映了Flg22激发子的吸收过程以及其被导入到番茄细胞中(Meindi等人,“根据地址-信息概念，细菌激发子鞭毛蛋白激活其在番茄细胞中的受体”《植物细胞》12:1783-1794,2000)。FLS2对Flg22的识别会触发局部和全身性植物免疫反应。Flg22结合的激活的FLS2受体复合物通过内吞作用而被内化到植物细胞中，并在整个植物中系统地移动(Jelenska等人,“鞭毛蛋白肽flg22通过其受体FLS2实现了拟南芥属中的长途运输(Flagellin peptide flg22 gains access to long-distance trafficking inArabidopsis via its receptor,FLS2)”《实验植物学杂志(Journal of ExperimentalBotany)68:1769-1783,2017)，这可能有助于全身性Flg22免疫反应。
涉及Flg22的鞭毛蛋白受体感知介导在不同的植物类群中是高度保守的(Taki等人,“对水稻中flg22受体OsFLS2介导的鞭毛蛋白感知的分析(Analysis of flagellinperception mediated by flg22 receptor OsFLS2 in rice)”《分子植物与微生物相互作用(Molecular Plant Microbe Interactions)》21:1635-1642,2008)。包括来自鞭毛蛋白保守结构域的15-22个或28个氨基酸的亚微摩尔浓度的合成多肽充当引发多种植物物种的防御反应的激发子。
已经使用转基因植物的产生来确认与鞭毛蛋白特异性PRR结合的鞭毛蛋白特异性PAMP。FLS2在拟南芥属植物中的异位表达显示出鞭毛蛋白反应与FLS2表达水平之间存在直接相关性，这表明FLS2参与鞭毛蛋白的识别(细菌存在的信号)并导致植物防御反应的激活(Gómez-Gómez L.和Boller T.,“FLS2：一种参与感知拟南芥属中的细菌激发子鞭毛蛋白的LRR受体样激酶(FLS2:An LRR receptor-like kinase involved in the perception ofthe bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis)”《分子细胞(Molecular Cell)》5:1003-1011,2000)。表达鞭毛蛋白结合受体的转基因植物已显示出对某些病原体的功效。鞭毛蛋白与FLS2的结合参与启动在鞭毛蛋白受体FLS2下游起作用的特异性MAP激酶转录因子的表达。缺少FLS2受体的变异植物(fls2)对Flg22不敏感(Gómez-Gómez L.和Boller T.,“FLS2：一种参与感知拟南芥属中的细菌激发子鞭毛蛋白的LRR受体样激酶(FLS2:An LRRreceptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitorflagellin in Arabidopsis)”《分子细胞(Molecular Cell)》5:1003-1011,2000)，并且破坏了Flg22与FLS2受体的结合。当用病原细菌进行处理时，变异植物(fls2)还表现出对感染和疾病的敏感性增强(Zipfel等人,“通过鞭毛蛋白感知的拟南芥属中的细菌抗病性(Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception)”《自然(Nature)》428:764-767,2004)。
传统上，提高抗病性的方法已经利用了这些和其它此类发现，并采取了转基因方法。用鞭毛蛋白感知性(FLS)受体蛋白(WO2016007606A2，其通过引用整体并入本文)或参与FLS下游信号传导的转录因子(WO2002072782A2，其通过引用整体并入本文)转化的转基因植物和种子已产生赋予某些病原微生物抗病性的植物。在另一个实例中，与不表达FLS3受体的非转基因植物相比，表达鞭毛蛋白感知性(FLS3)受体的转基因植物还显示出对疾病的增强的抗性(WO2016007606A2，其通过引用整体并入本文)。
植物防御素/硫蛋白
植物防御素也被表征为抗微生物肽(AMP)。植物防御素含有几个保守的半胱氨酸残基，这些残基形成二硫键并有助于其结构稳定性。防御素是植物中表征最丰富的富含半胱氨酸的AMP之一。防御素家族的成员具有四个折叠成球状结构的二硫键。这种高度保守的结构在保护植物免受微生物病原生物的侵害方面赋予了高度专业化的作用(Nawrot等人,“植物抗微生物肽(Plant antimicrobial peptide)”《叶线形微生物学(FoliaMicrobiology)》59:181-196,2014)。
硫蛋白是被分类为防御素家族的富含半胱氨酸的植物AMP，并且通常包括45-48个氨基酸残基，其中这些氨基酸中的6-8个氨基酸是在高等植物中形成3-4个二硫键的半胱氨酸。已经发现单子叶植物和双子叶植物中均存在硫蛋白，并且可以通过感染各种微生物来诱导硫蛋白的表达(Tam等人,“来自植物的抗微生物肽(Antimicrobial peptides fromplants)”《药物学(Pharmaceuticals)》8:711-757,2015)。已经发现硫蛋白的特定氨基酸(如高度保守的Lys1和Tyr13)对于这些AMP的功能性毒性至关重要。
超敏蛋白和超敏蛋白样(HpaG样)
与鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽类似，超敏蛋白包括一组细菌来源的激发子，所述激发子源自较大的前体蛋白。当渗透到植物细胞的细胞间间隙或质外体中时，超敏蛋白对于引起超敏反应(HR)至关重要(Kim等人,“对黄单胞菌属超敏蛋白HpaG的突变分析确定了在非宿主植物中引起超敏反应的关键功能区域(Mutational analysis ofXanthomonas harpin HpaG identifies a key functional region that elicits thehypersensitive response in nonhost plants)”《细菌学杂志(Journal ofBacteriology)》186:6239-6247,2004)。将一个或多个遥远的超敏蛋白样(HpaG样)生物活性引发性多肽施用到植物上提供了另一种途径来保护植物免受疾病和昆虫的胁迫。超敏蛋白利用III型分泌系统，所述分泌系统使蛋白质能够跨构成植物质细胞膜的脂质双层转运。超敏蛋白与质细胞膜表面的结合可以触发先天性免疫反应，其类似于由病原体相关分子模式(PAMP)触发的且已知可激活PAMP触发型免疫的免疫反应(Engelhardt等人,“丁香假单胞菌菜豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.phaseolicola)辅助蛋白HrpZ1在离子传导孔形成和植物免疫激活中的独立作用(Separable roles of the Pseudomonas syringaepv.phaseolicola accessory protein HrpZ1 in ion-conducting pore formation andactivation of plant immunity)”《植物学杂志》57:706-717,2009)。对超敏蛋白样HpaG来源的多肽的突变分析表明，原始133个氨基酸的超敏蛋白激发子前体蛋白的Leu-39和Leu50之间的12个氨基酸残基对引起烟草中的超敏反应(HR)和随后的先天性免疫反应至关重要(Kim等人,“对黄单胞菌属超敏蛋白HpaG的突变分析确定了在非宿主植物中引起超敏反应的关键功能区域”《细菌学杂志》186:6239-6247,2004)。这表明超敏蛋白的特定氨基酸区域(类似于其它AMP)负责引发反应。超敏蛋白(如HpaG样)不仅可以用于增强对植物病原体的抗性，而且还可以用于增强对昆虫的抗性(Choi等人,“超敏蛋白，由革兰氏阴性植物病原性细菌分泌的多功能蛋白质(Harpins,multifunctional proteins secreted by gram-negative plant pathogenic bacteria)”《分子植物与微生物相互作用》26:1115-1122,2013)。超敏蛋白已被用于诱导植物的抗病性，并保护植物免受如蚜虫等以昆虫韧皮部为食的昆虫的定居和进食的侵害(Zhang等人,“拟南芥属中超敏蛋白诱导的韧皮部蛋白质基因At.PP2A1的表达和转基因过度表达会抑制青桃蚜(桃蚜属)的韧皮部进食(Harpin-inducedexpression and transgenic overexpression of phloem protein gene At.PP2A1 inArabidopsis repress phloem feeding of the green peach aphid Myzus persicae)”《BMC植物生物学(BMC Plant Biology)》11:1-11,2011)。
延伸因子Tu(EF-Tu)
延伸因子Tu是在细菌中发现的丰富蛋白质，并且充当病原体相关分子模式(PAMP)来启动信号传导级联，所述信号传导级联参与植物抗病性和植物对微生物病原生物的先天性免疫力。有趣的是，一些EF-Tu多肽也被发现存在于植物中。已知来自大肠杆菌的EF-Tu N端的前18个氨基酸残基(被称为elf18)是植物中PAMP触发的免疫反应的有效诱导子(Zipfel等人,“受体EFR对细菌性PAMP EF-Tu的感知限制了土壤杆菌介导的转化(Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR restrictsAgrobacterium-mediated transformation)”《细胞(Cell)》125:749-760,2006)。植物细胞表面局部受体EF-Tu受体(EFR)感知源自大肠杆菌EF-Tu的多肽(Zipfel等人，2006年)。与Flg肽—FLS2受体复合物的作用模式相比，EF-Tu的结合和EFR的激活遵循相似的作用模式(Mbengue等人,“由模式识别受体激酶介导的免疫需要依赖网格蛋白的内吞作用(Clathrin-dependent endocytosis is required for immunity mediated by patternrecognition receptor kinases)”《美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci U.S.A.)》113:11034-9,2016)。
改变生长的生物活性引发性多肽
植物磺肽素(PSKα)
植物磺肽素(PSK)属于一组硫酸化的植物多肽，其由在高等植物中普遍存在且高度保守的前体基因进行编码(Sauter M.,“植物磺肽素肽信号传导(Phytosulfokinepeptide signaling)”《实验生物学杂志(Journal of Experimental Biology)》66:1-9,2015)。PSK基因由小型基因家族进行编码，所述小型基因家族既存在于单子叶植物中也存在于双子叶植物中，并且对一个或多个可以以五肽或C端截短的四肽形式活跃的PSK多肽进行编码(Lorbiecke R、Sauter M,“对PSK肽生长因子前体同源物的比较分析(Comparativeanalysis of PSK peptide growth factor precursor homologs)”《植物科学(PlantScience)》163:348-357,2002)。
通过保守的信号多肽将植物磺肽素蛋白靶向植物中的分泌途径(Lorbiecke R、Sauter M,“对PSK肽生长因子前体同源物的比较分析”《植物科学》163:348-357,2002)。植物磺肽素前体蛋白的加工涉及在植物分泌途径内通过酪蛋白磺基转移酶的进行磺酰化，特别是反式高尔基体(trans-Golgi)，然后在质外体中进行分泌和蛋白水解切割，以产生PSK(Sauter M.,“植物磺肽素肽信号传导”《实验生物学杂志》66:1-9,2015)。从较大的前体多肽中加工出PSK之后，所述多肽会经历酪氨酸硫酸化作用(Ryan等人,“多肽激素(Polypeptide hormones)”《植物细胞补充剂(The Plant Cell Supplement)》,S251-S264,2002)。然后，富含亮氨酸的重复序列家族的膜结合受体激酶在细胞表面处感知分泌的多肽(Sauter M.,“植物磺肽素肽信号传导”《实验生物学杂志》66:1-9,2015)，然后PSK可以结合到专门的PSK受体(例如，来自拟南芥属的PSK1)，所述受体具有定位在植物的质膜表面上的富含亮氨酸的重复区域。在源自水稻和玉米的细胞悬浮培养物的质膜组分中检测到PSK的特异性结合，并且已证明与受体的结合可引发并刺激细胞增殖(Matsubayashi等人,“植物磺肽素-α，一种通过特定的高亲和力和低亲和力结合位点刺激水稻细胞的增殖的硫酸化的五肽(Phytosulfokine-α,a sulfated pentapeptide,stimulates the proliferation ofrice cells by means of specific high-and low-affinity binding sites)”《美国国家科学院院报(Proceedings National Academy of Science USA)》94:13357-13362,1997)。
植物磺肽素(PSK)用作具有生物刺激活性的硫酸化的生长因子，并参与控制根和茎顶端分生组织的发育、生长调节和生殖过程。也有报道称PSK可以启动细胞增殖，使静止的组织分化，并参与管状分子的形成、刺激和分化(Matsubayashi等人,“内源性硫酸化的五肽植物磺肽素-α刺激分离的百日菊属中叶细胞的管状分子分化(The endogenoussulfated pentapeptide phytosulfokine-αstimulates tracheary elementdifferentiation of isolated mesophyll cells of zinnia,)”《植物生理学(PlantPhysiology)》120:1043-1048,1999)。还报道了PSK信号传导参与调节拟南芥属幼苗中发生的根和下胚轴延伸(Kutschmar等人,“PSK-α促进拟南芥属中的根生长(PSK-αpromotesroot growth in Arabidopsis)”《新植物学家(New Phytologist)》181:820-831,2009)。
根毛促进性多肽(RHPP)
根毛促进性多肽(RHPP)是源自Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂(KTI)蛋白的12个氨基酸片段，从使用来自圆形芽孢杆菌的碱性蛋白酶HA12进行降解的豆粕中检测到所述片段(Matsumiya Y.和Kubo M.“大豆与营养(Soybean and Nutrition)第11章：大豆肽：大豆中的新型植物生长促进肽(Soybean Peptide:Novel plant growth promoting peptidefrom soybean)”《农业与生物科学(Agricultural and Biological Sciences)》,ShenyH.E.(编者),第215-230页,2011)。当施用于大豆根部时，已显示出RHPP通过促进芸苔属(Brassica)中的细胞分裂和根毛分化而在根部积累并促进根部生长。
发明内容
提供了一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的多肽。所述多肽包括：
(a)鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、1-225、227-375、526、528、530、532、534、536、538、540、541、751和752中的任何一个；或
(b)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571-579和753中的任何一个；或
(c)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:580-586中的任何一个；或
(d)逆反型(retro inverso)Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450、527、531、533、535、537和539中的任何一个；或
(e)逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:451-525中的任何一个；或
(f)逆反型Flg15多肽，并且所述逆反型Flg15多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:529；或
(g)超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587、589、591、593、594和595中的任何一个；或
(h)逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:588、590、592、596和597中的任何一个；或
(i)根毛促进性多肽(RHPP)，并且所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID No:600、603和604中的任何一个；或
(j)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQID No:602；或
(k)逆反型根毛促进性多肽(RI RHPP)，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQID NO:601、605和606中的任何一个；或
(l)延伸因子Tu(EF-Tu)多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:607-623中的任何一个；或
(m)逆反型延伸因子Tu(RI EF-Tu)多肽，并且所述RI EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:624-640中的任何一个；或
(n)包括SEQ ID NO:750的融合多肽；或
(o)植物磺肽素(PSK)多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；或
(p)逆反型植物磺肽素(RI PSK)多肽，并且所述RI PSK多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:599；或
(q)硫蛋白或硫蛋白样多肽，并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:650-749中的任何一个，并且
任选地，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列。
提供了一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的组合物。所述组合物包括：如上所述的多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂；或所述多肽的任何组合。
还提供了一种用本文所述的多肽或组合物进行包被的种子。
还提供了一种表达或过度表达多肽的重组微生物。所述多肽包括上述组合物的多肽。
提供了用于提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的方法。所述方法可以包括将本文所述的多肽或组合物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构。
可替代地，所述方法可以包括将本文所述的多肽或组合物施用于植物生长培养基，从而提高将在所述植物生长培养基中生长的植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高先天性免疫反应和/或改变将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位的植物结构。
另一方法包括将本文所述的重组微生物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构。所述重组微生物表达所述多肽，并且与相同条件下相同种类的野生型微生物中的多肽的表达水平相比，所述多肽的表达提高。
产生多肽的方法包括通过发酵产生包括本文所述的任何多肽和肠激酶(EK)切割位点的融合蛋白，所述肠激酶切割位点增强了所述多肽的活性和稳定性。
本发明的特征在所附权利要求书和下文标题为“实施例”的部分中提供的实施例列表中进一步定义。其它目的和特征将在下文中部分地显而易见并且在下文中部分地指出。
附图说明
图1示出了呈原生L构型形式(SEQ ID NO:226)和相应的逆反或D构型形式(SEQ IDNO:375)的Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽。
图2展示了与未经处理的对照的产量相比，在12个地点中用Bt.4Q7Flg22(SEQ IDNO:226)进行叶面施用的玉米的可收获总产量(图A)和在10个地点中用逆反(RI)版本的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:375)生物活性引发性多肽进行叶面施用的玉米的可收获总产量(图B)，所述可收获总产量以Bu/Ac表示。
图3展示了与未经处理的对照的产量相比，在6个地点中用Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:226)进行叶面施用的玉米的可收获总产量，所述可收获总产量以Bu/Ac表示。
图4展示了与未经处理的对照的产量相比，在11个地点中用Bt.4Q7Flg22(SEQ IDNO:226)进行叶面施用的大豆的可收获总产量(图A)和用逆反型(RI)Bt.4Q7Flg22(SEQ IDNO:375)进行叶面施用的大豆的可收获总产量(图B)，所述可收获总产量以Bu/Ac表示。
图5展示了与未经处理的对照的产量相比，在12个地点中用Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)进行叶面施用的玉米的可收获总产量(图A)和用逆反型Ec.Flg22(SEQ ID NO:527)生物活性引发性多肽进行叶面施用的玉米的可收获总产量(图B)，所述可收获总产量以Bu/Ac表示。
图6涉及使用Bt.4Q7Flg22与不同浓度的作为添加剂的纤维二糖在玉米(图A)或大豆(图B)中进行的活性氧(ROS)活性测定。
图7涉及使用不同浓度的Bt.4Q7Flg22进行的活性氧(ROS)活性测定，以鉴定所述测定的峰值活性和时间。
图8涉及使用硫蛋白的施用递送，从而以速率依赖性方式影响(减少)土壤杆菌(Agrobacterium)菌株GV3101的生长。
图9涉及用硫蛋白标记或未标记的Bt4Q7 Flg22多肽的施用递送，从而减少HLB感染的柑橘树中黄龙病菌(Liberibacter spp)的生长。数据代表取自经处理的受感染树木的叶片样品中的柑橘黄龙病菌(C.Liberibacter)的定量性PCR结果(Ct值)。
图10涉及向注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的树木中的柑橘进行施用递送，从而减少受HLB感染的柑橘树中黄龙病菌(Liberibacter spp)的生长。数据代表取自经处理的受感染树木的叶片样品中的柑橘黄龙病菌(C.Liberibacter)的定量性PCR结果(Ct值)。
图11涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高每枝的座果率的“瓦伦西亚”橙树。
图12涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高果实生长(以厘米计)的“瓦伦西亚”橙树。
图13涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高座果率(由估计的每枝果实体积表示)的“瓦伦西亚”橙树。
图14涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高每枝的座果率的“红宝石”葡萄柚树。
图15涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高果实生长(以厘米计)的“红宝石”葡萄柚树。
图16涉及注射了1X或10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以提高座果率(由估计的每枝果实体积表示)的“红宝石”葡萄柚树。
定义
当在本文中使用冠词“一个(a/an/one)”和“所述(the/said)”时，除非另外说明，否则它们的意思是“至少一个”或“一个或多个”。
术语“包括(comprising)”、“包含(including)”和“具有(having)”旨在是包括性的且意指可以存在除所列举元件之外的附加元件。
如本文所使用的，“非生物胁迫”定义为可对植物产生负面影响的环境条件。非生物胁迫可以包含：温度(高或低)胁迫、辐射(可见光或紫外线)胁迫、干旱胁迫、寒冷胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、营养缺乏或高金属胁迫或导致水分亏缺、洪水或缺氧的水分胁迫。其它非生物胁迫因素包含脱水、损伤、臭氧以及高湿度或低湿度。
“生物活性引发”是指本文所述的多肽改善植物或植物部位的作用。生物活性引发可以提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构。
如本文所使用的，“生物活性引发性多肽”可以与术语“(一个或多个)引发剂”互换使用，并且如针对以下类别的多肽进行描述：鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽、超敏蛋白和超敏蛋白样多肽(HpaG样)、硫蛋白、延伸因子Tu(EF-Tu)及其多肽、植物磺肽素α(PSKα)、kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)和根毛促进性多肽(RHPP)，以及其任何逆反型多肽。
如本文所使用的，“着色剂”充当用于产品品牌推广和应用的视觉产品标识符。着色剂可以包含但不限于染料和颜料、无机颜料、有机颜料、聚合物着色剂以及可在各种高度浓缩的色调中获得的经配制的颜料涂料分散体。
如本文所使用的，“内源性地”施用是指施用于植物表面内部。小型生物活性引发性多肽特别适合于植物内的信号传导和交流。植物表面内是指任何植物膜或植物细胞内部的表面。内部可以用来指植物细胞的细胞外或细胞内，并且包括木质部、韧皮部、管胞等。内源性可以指系统地或通过植物的运动，如指代植物中细胞间的运动。内源性施用可以包含使用重组内生细菌或真菌递送生物活性引发性多肽，其中内生微生物被外部递送至植物，并通过天然机制内部移动至植物。
如本文所使用的，“外源性地”施用是指施用于植物表面外部。植物表面可以是任何外部植物表面，例如质膜、角质层、毛状体、叶、根毛、种皮等。
如本文所使用的，“相关型”或“样”多肽是指源自所列举的多肽或在结构上类似于所列举的多肽，但是具有不同于所列举的多肽的氨基酸序列和/或来源的多肽。例如，来自白菜型油菜(Brassica rapa)的硫蛋白样蛋白质(SEQ ID NO:694)的序列与来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的硫蛋白(SEQ ID NO:693)的序列不同，但二者在结构和功能上相似。
如本文所使用的，“叶面处理剂”是指施用于植物或植物部位的地上部分或叶子的组合物，并且可能具有叶、茎、花、枝或任何气生植物部位(例如，接穗)。
如本文所述，“注射”可以与疫苗接种或免疫接种互换使用，并提供了将生物活性引发性多肽内源性地递送至植物或植物部位的过程。
“接种”是指将产生引发性多肽的细菌或活性微生物递送至植物或植物部位。接种也可以指递送引发性多肽，使其通过植物或植物部位中或所述植物或植物部位上的气孔或任何开口被动进入。“植物”是指单子叶植物、双子叶植物或裸子植物，但不限于所述单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。如本文所使用的，术语“植物”包含整株植物、植物器官、整株植物或植物器官的后代、胚芽、体细胞胚胎、胚状结构、原球茎、类原球茎以及植物细胞的悬浮液。植物器官包括芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包含胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，韧皮部组织、维管组织、地面组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)。可以在本文所述的方法中使用的植物类别通常与高级植物的类别一样广泛，具体地说，被子植物单子叶植物(单子叶植物类)和双子叶植物(双子叶植物类)和裸子植物。其包含多种倍性水平的植物，包含非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体、纯合子和半合子。本文所述的植物可以是单子叶农作物，如高粱、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、小米和黑小麦。本文所述的植物也可以是双子叶农作物，如苹果、梨、桃、李子、橙子、柠檬、青柠、葡萄柚、猕猴桃、石榴、橄榄、花生、烟草、番茄等。而且，这些植物可以是园艺植物，如玫瑰、金盏花、樱草花、山茱萸、三色堇、天竺葵等。
植物“生物刺激素”是施用于植物或植物部位以增强营养效率、非生物胁迫耐受性和/或任何一个或多个其它植物质量性状的任何物质或微生物。
如本文所使用的，“植物细胞”是指任何植物细胞，并且可以包括植物表面或植物质膜内部的细胞，例如表皮细胞、毛状体细胞、木质部细胞、韧皮部细胞、筛管分子或伴随细胞。
如本文所述，“植物部位”是指植物细胞、叶、茎、花、花器官、果实、花粉、蔬菜、块茎、球茎、鳞茎、假鳞茎、荚果、根、根茎(rhizome)、根块、根茎(root stock)、接穗或种子。
如本文所述，“多肽”是指任何蛋白质、肽或多肽。
如本文所使用的，“引发”或“肽引发”是指用于改善植物性能的技术。具体地，引发是将生物活性引发性多肽外源性地或内源性地施用于植物、植物部位、植物细胞或植物的细胞间隙的过程，其导致的结果为植物带来益处，如增强生长、生产力、非生物胁迫耐受性、病虫害耐受性或预防性。
如本文所使用的，“逆反型”多肽是指使用非天然存在的D-氨基酸以与天然存在的L-氨基酸相反的顺序重新配置和构建的来自正常全L链的天然来源多肽的多肽链。全D-氨基酸形式和含有全L-形式的亲本链是蛋白质结构的拓扑镜像。
如本文所使用的，“种子处理剂”是指用于处理或包被种子的物质或组合物。样品种子处理剂包含提供给种子以抑制、控制或排斥植物病原体、昆虫或其它侵害种子、幼苗或植物的害虫的生物体、化学成分、接种剂、除草安全剂、微量营养素、植物生长调节剂、种子包衣剂等的施剂，或任何有用的促进植物生长和健康的药剂。
“协同”作用是指两个或更多个生物活性引发性多肽、物质、化合物或其它药剂的相互作用或协作之间产生的作用，所述相互作用或协作产生大于单独作用之和的组合作用。
“协同有效浓度”是指产生的作用大于单个作用之和的两个或更多个生物活性引发性多肽、物质、化合物或其它试剂的一个或多个浓度。
具体实施方式
对充当“引发剂”从而向农业提供益处的生物活性多肽的需求越来越大。在农业实践中使用生物活性“引发性”多肽为整体农作物管理实践提供了范式转变，例如，用于管理疾病、非生物胁迫和产量计划。生物活性(天然存在的、重组的或合成的)引发性多肽以农业制剂的形式递送。描述了组合物和使用生物活性引发性多肽的方法以提供施用于农作物的多层处理方案，从而实现农学上期望的结果。这种期望的结果包含植物中的表型(如表现出对害虫、病原和非生物胁迫的保护性的表型)增强以及植物的生长、生产力和产量提高。更具体地，可以使用各种处理方案将生物活性引发性多肽或所述生物活性引发性多肽的制剂外源性地和/或内源性地施用于植物或植物部位，并且已经发现所述多肽或所述制剂可以提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构。
选择具体类别的合成来源或天然存在的生物活性引发性多肽以发挥其独特的作用模式，所述具体类别包含鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽(包含芽孢杆菌属中保守的鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽)、硫蛋白、超敏蛋白样多肽(HpaG样)、延伸因子Tu(EF-Tu)、植物磺肽素(PSKα)和根毛促进性多肽(RHPP)，并且所述生物活性引发性多肽可以单独使用或与其它多肽组合使用，以适应上述特定的农业需求。生物活性引发性多肽可以代替市售的农用化学品、生物刺激素、补充生物活性物质和/或农药化合物使用或与所述市售的农用化学品、生物刺激素、补充生物活性物质和/或农药化合物一起使用。
还提供了以协同有效量施用的生物活性引发性多肽的组合，从而提供对害虫、病原体的控制，并另外提供增强植物生长和促进植物健康的益处。
I.多肽
提供了源自细菌或植物的天然存在的、重组的或化学合成形式的生物活性引发性多肽。提供了呈正常L氨基酸形式和非天然逆反D氨基酸形式的生物活性引发性多肽。另外，提供了含有非天然修饰的生物活性引发性多肽，所述非天然修饰包含N端和C端修饰、环化、含有β-氨基和D-氨基酸以及其它增强多肽稳定性或性能的化学修饰。例如，最初从针对细菌菌株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)4Q7组合的专有基因组中分离并鉴定鞭毛蛋白和Flg相关型多肽，所述Flg相关型多肽的长度为22个氨基酸并且源自鞭毛蛋白的完整编码区。提供了标准(L)形式和逆反(D)形式的这些Flg22来源的多肽。这些形式的多肽被描述为Bt.4Q7Flg22和逆反型(RI)Bt.4Q7Flg22。其它细菌来源的生物活性引发性多肽是Ec.Flg22(大肠杆菌)、HpaG样(黄单胞菌)，而植物来源的多肽包含硫蛋白(柑橘属和其它植物物种)、PSKα(拟南芥属和其它植物)、EF-Tu(既是细菌来源也是植物来源)和RHPP(大豆)。
生物活性引发性多肽可以包含全长蛋白，并以源自细菌或植物的天然存在的、合成的或重组的形式提供。例如，鞭毛蛋白、EF-Tu、KTI和HpaG均可被递送至植物。
还可以将生物活性引发性多肽作为融合伴侣递送至其它蛋白质序列(包含蛋白酶切割位点、结合蛋白和靶向蛋白)，从而特异性递送至植物或植物部位。
还提供了可以天然合成或化学合成的特征信息(signature)序列、信号锚分选序列和分泌序列以及靶向序列，如韧皮部靶向序列，所述韧皮部靶向序列使用重组微生物与一个或多个生物活性引发性多肽一起产生，并且用作本文所述的生物活性引发性多肽的融合或辅助多肽。
本文还描述了非天然存在的多肽。更具体地，提供了一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的多肽。所述多肽包括：
(a)鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、1-225、227-375、526、528、530、532、534、536、538、540和541中的任何一个；或
(b)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571-579中的任何一个；或
(c)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:580-586中的任何一个；或
(d)逆反型(retro inverso)Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450、527、531、533、535、537和539中的任何一个；或
(e)逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:451-525中的任何一个；或
(f)逆反型Flg15多肽，并且所述逆反型Flg15多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:529；或
(g)超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587、589、591、593、594和595中的任何一个；或
(h)逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:588、590、592、596和597中的任何一个；或
(i)根毛促进性多肽(RHPP)，并且所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID No:600、603和604中的任何一个；或
(j)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQID No:602；或
(k)逆反型根毛促进性多肽(RI RHPP)，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQID NO:601、605和606中的任何一个；或
(l)延伸因子Tu(EF-Tu)多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:607-623中的任何一个；或
(m)逆反型延伸因子Tu(RI EF-Tu)多肽，并且所述RI EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:624-640中的任何一个；或
(n)包括SEQ ID NO:750的融合多肽；或
(o)植物磺肽素(PSK)多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；或
(p)逆反型植物磺肽素(RI PSK)多肽，并且所述RI PSK多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:599；或
(q)硫蛋白或硫蛋白样多肽，并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:650-749中的任何一个，并且
任选地，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列。
鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽
多肽可以包含鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以源自芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)细菌或其任何组合。
本文所述的生物活性引发性多肽的主要类别之一是一个或多个鞭毛蛋白引发性多肽和一个或多个鞭毛蛋白相关型引发性多肽。使用本文所述的方法从各种芽孢杆菌和非芽孢杆菌细菌中鉴定了保守的全长和部分长度的氨基酸鞭毛蛋白编码序列。
鞭毛蛋白是形成来自鞭毛细菌物种的鞭毛细丝的主要部分的结构蛋白，其可以在所述蛋白的N端和C端区域显示保守性，但可以在中央或中间部分变化(Felix G.等人,“植物对细菌鞭毛蛋白的最保守结构域具有敏感的感知系统”《植物学杂志》18:265-276,1999)。形成鞭毛蛋白的内核的所述鞭毛蛋白的N和C端保守区可能在以下中起作用：蛋白质聚合成细丝；蛋白质的运动性和转运；以及肽片段表面附着到植物的植物细胞膜/细胞表面受体。
提供了全部或部分鞭毛蛋白(表1-2)和源自那些芽孢杆菌和非芽孢杆菌鞭毛蛋白的鞭毛蛋白相关型多肽(表3和5)。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1-768中的任何一个或其任何组合。
鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽是由鞭毛蛋白编码多肽(如Flg22的前体蛋白)产生的。更具体地，提供了多肽或源自所述多肽的切割片段以实现可用于引发或处理植物的生物活性引发性Flg多肽。可以通过在Flg22附近引入蛋白水解切割位点以便于处理来自较大多肽的活性生物肽，从而完成从较大前体上切割Flg22片段。
鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽可以源自全长鞭毛蛋白(或Flg相关型多肽的前体蛋白，所述Flg相关型多肽来自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属或其它非相关属细菌)。例如，将来自鞭毛蛋白相关型多肽(如Flg22和FlgII-28(芽孢杆菌属)以及Flg15和Flg22(大肠杆菌))的经PCR纯化的DNA克隆到重组载体中，进行扩增以得到足够量的纯化的DNA，然后使用本领域普通技术人员已知并使用的常规方法进行测序。可以对鞭毛蛋白编码序列或鞭毛蛋白部分序列(表1)、N或C端鞭毛蛋白多肽(表2)以及Flg相关型多肽中的任何一个(表3-5)使用相同的方法。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以源自真细菌的任何成员，所述真细菌含有由植物识别的保守的22个氨基酸区域。优选的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以源自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属细菌或其任何组合。另外的优选鞭毛蛋白和Flg22序列可以从γ-变形杆菌中获得，所述γ-变形杆菌含有>68％同一性的保守的22个氨基酸序列。
来自芽孢杆菌的保守的鞭毛蛋白序列
鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽对应于芽孢杆菌和其它真细菌鞭毛蛋白的N端保守结构域，并以合成的、重组的或天然存在的形式提供。鞭毛蛋白生物活性引发性多肽Flg22、Flg15和FlgII-28(表3)已被鉴定，并在多种农作物和蔬菜中充当有效的激发子，以便在协同刺激和促进植物的生长反应的同时预防和治疗一种或多种特定疾病的扩散。
本文所述的鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽可以单独使用或与本文所述的其它生物活性引发性多肽组合使用，并且包含来自芽孢杆菌的保守的全部和部分鞭毛蛋白(表1)、鞭毛蛋白多肽的保守的N和C端区域(表2)、芽孢杆菌来源的Flg22和FlgII-28来源的生物活性引发性多肽(表3)以及作为源自芽孢杆菌Flg22和FlgII-28的镜像的逆反序列(表4)。表1和3中序列的下划线部分分别代表已鉴定的信号锚分选序列或分泌序列以及信号锚定序列。还描述了其它非芽孢杆菌来源的多肽和蛋白质，它们是功能性等同物，并且可以类似的方式使用(表5)。
表1.来自芽孢杆菌的保守的鞭毛蛋白序列
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鞭毛蛋白的N和C端保守区
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以包括截短的N端多肽，并且所述截短的N端多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、109、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、752或其任何组合。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以包括截短的C端多肽，并且所述截短的C端多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225或其任何组合。
从来自芽孢杆菌属和其它真细菌的各种菌株的全长鞭毛蛋白序列中鉴定出N端和C端保守区(表2)。使用BLAST多重比对软件鉴定保守的N和C端结构域，并基于针对芽孢杆菌和其它真细菌数据库的单个命中检索分配功能性注释。编码序列N端区域的起始位点为粗体蛋氨酸(M)。以氨基酸序列N端(左列)和C端(右列)形式提供保守结构域。
表2.鞭毛蛋白的N和C端保守区
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鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226-300中的任何一个或其任何组合。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个或其任何组合。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:301。
从苏云金芽孢杆菌(Bt.)菌株4Q7的专有“内部”文库中鉴定出Bt4Q7Flg22的鞭毛蛋白来源的多肽序列(SEQ ID NO:226)。使用来自大肠杆菌的全长鞭毛蛋白的保守引物来筛选Bt.4Q7菌株文库并鉴定功能性鞭毛蛋白相关型生物活性引发性Flg22多肽。
表3.从芽孢杆菌属中鉴定出的鞭毛蛋白多肽Flg22和FlgII-28
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逆反型鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽
可用于引发的一个或多个生物活性Flg多肽可以以非天然异构体形式或逆反(RI)形式产生。
逆反型Flg多肽可以对一个或多个FLS受体蛋白表现出增强的结合亲和力。植物鞭毛蛋白受体(例如FLS2)可以识别逆反型Flg多肽片段，如定位在鞭毛蛋白N端保守结构域内的Flg22或FlgII-28。这些Flg多肽的逆反形式以生物学活性形式提供，其可以识别植物细胞膜表面上的Flg相关蛋白或FLS受体蛋白并与所述Flg相关蛋白或FLS受体蛋白相互作用。
逆反型Flg多肽可以对植物膜表面处的蛋白水解降解具有提高的活性和稳定性。例如，芽孢杆菌Flg22或FlgII-28多肽的逆反形式可以提高一个或多个Flg多肽的活性和稳定性，并提高针对植物表面或根表面的蛋白水解降解的保护性。当在田间或在土壤上或土壤中施用时，逆反形式也表现出增强的稳定性。
逆反型多肽是亲本多肽的原生结构的拓扑镜像。通过逆转多肽序列并使用逆向全D或逆向对映体肽来产生所述多肽序列的逆反合成形式。一个或多个全D链氨基酸Flg多肽采用其相关L肽或L链氨基的三维结构的“镜像”。
这通过产生源自表3中的芽孢杆菌或其它真细菌的亲本Flg多肽中的任何一个的逆反改变得到了进一步实现。表4中提供了被设计成Flg22(RI Flg22：SEQ ID NO:376-450)和FlgII-28(RI-FlgII-28：SEQ ID NO:451-525)的逆反型多肽。表5中提供的Ec.Flg22(SEQID NO:526)和EcFlg15(SEQ ID NO:529)的逆反形式也是由大肠杆菌来源的序列产生的。
多肽可以包含逆反型Flg22多肽。
多肽可以包括逆反型FlgII-28多肽。
包括表3中的芽孢杆菌或其它真细菌Flg22或FlgII-28多肽的鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽中的任何一个均可以以其逆反形式(参考表4)使用。
本文所提及的Flg生物活性引发性多肽的逆反形式可以以三种形式中的任一种提供，其中氨基酸手性的倒置含有正常全D(反向)、全L(逆向)和/或逆向全D(逆反)或这些形式的组合，以便在植物中获得期望的表型。
通过逆反工程化合成了表3中的芽孢杆菌来源的L-Flg22和L-FlgII-28多肽以及表5中的大肠杆菌原生L-Flg22和L-Flg15多肽，从而形成逆反型D-Flg22多肽(SEQ ID NO:376-450)、D-FlgII-28(SEQ ID NO:451-525)和大肠杆菌D-Flg22多肽(SEQ ID NO:527、529)。
通过逆转多肽主链的方向实现了Bt.4Q7 Flg22(SEQ ID NO:376)的氨基酸手性的倒置(全-L到全-D)，所述倒置以小的线性多肽片段形式提供，并且被称为逆反修饰，如下所述。
(DADIADLDGDADADDDDDSDADSDNDIDRDKDGDSDSDLDRDD)
逆反型全D链氨基酸Flg22多肽采用与其相关的原生L-Bt.4Q7Flg 22多肽的三维结构的“镜像”，并且所述全L链具有与所述全D Bt.4Q7Flg22多肽等同的镜像。全L-氨基酸残基被其D-对映异构体替换，从而产生含有酰胺键的全D-肽或全D-异构体-肽。Bt.4Q7Flg22多肽链的原生L-氨基酸链形式反转产生逆反型合成全D确认，所述确认是通过将所有L-氨基酸残基替换为其相应的D-对映异构体而制备的。
图1提供了天然(全L)Bt.4Q7 Flg22及其逆反或镜像化(从而形成全D Bt.4Q7Flg22对映异构体多肽)的图解表示。对应于Bt.4Q7 Flg22(SEQ ID NO:226)的逆反型Flg多肽被描述为SEQ ID NO:376。
在短多肽(如Flg22、Flg15和FlgII-28)的情况下，在从L到D转换状态的构象变化中侧链位置的镜像化也导致所述侧链的对称变换的镜像化。
已经发现逆向全D类似物具有生物学活性(Guptasarma,“肽主链方向的逆转可能导致蛋白质结构的镜像化(Reversal of peptide backbone direction may result inmirroring of protein structure)”,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》310:205-210,1992)。一个或多个逆反型D-Flg多肽可以在其延伸的构象中呈现类似于对应的原生L-Flg多肽序列的侧链拓扑结构，从而模拟原生L-亲本分子的生物学活性，同时完全抗蛋白水解降解，并因此提高所述多肽接触植物或周围环境时的稳定性。
表4或表5中描述了逆反型Flg生物活性引发性多肽。选择表4中提供的逆反型Flg相关型生物活性引发性多肽是因为这些多肽具有增强的活性和稳定性以及在不同条件和环境下存活的能力。基于所述多肽的D对映异构体的性质，其对蛋白水解降解具有更强的抵抗力，并且可以在恶劣的环境条件下存活和存在。
表4.来自芽孢杆菌的Flg22和FlgII-28的逆反型鞭毛蛋白多肽
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来自各种生物的Flg序列
表5.来自其它生物的鞭毛蛋白相关型Flg22和Flg15多肽
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协助将鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽导入植物的序列
特征信息序列、信号锚分选序列和分泌序列可以单独使用，或者与本文所述的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽中的任何一个组合使用。这些辅助序列对于将鞭毛蛋白多肽有效递送至植物细胞膜表面是有用的。其它辅助序列也可以辅助Flg多肽片段跨质膜的转运。将鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽递送至植物(或植物部位)的质膜表面可以有助于下游的信号传导过程，并导致对植物或植物部位的有益结果，如增强的植物健康和生产力。
多肽可以进一步包括辅助多肽。
辅助多肽可以包括特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列可以包括表6中所列的SEQ ID NO:542-548中的任何一个或其任何组合。例如，特征信息多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:542。
辅助多肽可以包括信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列可以包括表7中列出的SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合。例如，信号锚分选多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:549。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以由微生物重组产生。例如，所述微生物可以包括芽孢杆菌、假单胞菌、类芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌或赖氨酸芽孢杆菌。
辅助多肽可以包括分泌多肽，并且所述分泌多肽的氨基酸序列可以包括SEQ IDNO:563-570中的任何一个或其任何组合。例如，分泌多肽的氨基酸序列可以包括SEQ IDNO:563。
这三种类型的辅助序列在表6(N端特征信息序列)、表7(信号锚分选序列)和表8(分泌序列)中进一步描述。
还提供了具有保守的特征信息序列(表6；SEQ ID NO:542-548)、信号锚分选序列(表7；SEQ ID NO:549-562)和分泌序列(表8；SEQ ID NO:563-570)的“辅助”序列，所述辅助序列与本文所述的任何鞭毛蛋白相关型多肽组合。特别有用的是，特征信息、信号锚分选和分泌辅助序列与原生L-Flg多肽(表3.SEQ ID NO:226-375)或任何逆反型Flg22多肽(表4.SEQ ID NO:376-525)组合，从而将Flg多肽有效递送至细胞外植物膜表面，如植物或植物部位的表面。
N端特征信息序列
芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、类芽孢杆菌或解硫胺素芽孢杆菌细菌(属)和其它真细菌属内的保守的氨基酸“特征信息”序列可以将鞭毛蛋白多肽靶向一个或多个合适的Flg相关型受体蛋白(如在植物细胞膜表面上具有暴露的结合位点的FLS受体)，并且可以用于增强Flg多肽-受体的结合从而导致一个或多个Flg相关型受体的激活潜力提高。表6中鉴定的鞭毛蛋白特征信息序列可以将用于结合的Flg多肽靶向并稳定地递送至一个或多个FLS受体或FLS样受体，因此增加了膜受体与Flg多肽之间的接触和结合。
保守的N端特征信息序列(SEQ ID NO:542-548)可以与本文所述的任何鞭毛蛋白相关型多肽组合使用。特别有用的是，特征信息序列与表5中提供的原生L-Flg多肽(L-Flg22 SEQ ID NO:226-300；L-FlgII-28SEQ ID NO:301-375)或任何逆反型D-Flg多肽(D-Flg22 SEQ ID NO:376-450；FlgII-28SEQ ID NO:451-525)或任何其它Flg相关型序列(SEQID NO:526-541)组合使用以将Flg相关型多肽有效递送至植物膜表面。
特征信息序列协助Flg22和FlgII-28生物活性引发性多肽序列与一个或多个合适的Flg相关型受体结合，从而激活一个或多个受体使其具有功能活性。
表6.鞭毛蛋白相关型N端特征信息序列
Figure BDA0002417772590000911
N端信号锚分选序列
芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属和解硫胺素芽孢杆属和其它真细菌属内保守的氨基酸“信号锚分选”序列可以将鞭毛蛋白相关型多肽锚定并定位在植物细胞膜表面上并协助其与一个或多个合适的Flg相关型受体高亲和力地结合，从而提高结合的一个或多个受体的激活潜力。
保守的信号锚序列(SEQ ID NO:549-562；表7)定位在预先切割的鞭毛蛋白序列或全长编码鞭毛蛋白序列或部分编码鞭毛蛋白序列的下游，例如，如本文所述(SEQ ID NO:1-75；表1)。
本文所述的信号锚分选结构域可以用于膜附着。所述信号锚分选结构域可以用于辅助Flg相关型多肽的定位以及其与表面膜受体的结合，并且在氨基酸水平上与被内体(囊泡)转运到分泌途径或注定要靶向所述分泌途径的蛋白具有一定的功能相似性。本文所述的可用于将Flg生物活性引发性多肽锚定至植物细胞膜的此类信号锚分选序列还用于增强生物活性引发性Flg多肽到植物细胞的膜整合。
表7中描述的此类序列可以进一步在功能上被注释为导入受体信号锚序列，其可以用于改善Flg相关型多肽对植物的靶向或递送以及有效的膜锚定，并且有助于将所述多肽膜整合到植物细胞的细胞质中。
将信号锚序列(SEQ ID NO:549-562；表7)与本文所述的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽中的任何一个进行组合，有助于将这些鞭毛蛋白相关型多肽附着或导入到植物。
此类信号锚分选序列可以与Flg相关型多肽组合使用，并且可用于靶向、有效的膜锚定、膜整合和高尔基体到溶酶体/血管的运输。信号锚分选序列用于将Flg多肽稳定地递送至植物膜表面，并将其整体整合到植物中。
本文所述的此类序列含有被称为赋予植物系统内吞功能的双亮氨酸氨基酸(Pond等人1995,“酸性残基在基于双亮氨酸基序的内吞途径靶向中的作用(A role for acidicresidues in di-leucine motif-based targeting to the endocytic pathway)”,《生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)》270:19989-19997,1995)。
如上所述的此类信号锚分选序列也可以用于将系统性信号有效地传递至感染部位并刺激植物细胞中的植物先天性免疫力。
表7.鞭毛蛋白相关型信号锚分选序列
SEQ ID NO: 信号锚序列
SEQ ID NO:549 LLGTADKKIKIQ
SEQ ID NO:550 LLKSTQEIKIQ
SEQ ID NO:551 LLNEDSEVKIQ
SEQ ID NO:552 LGVAANNTQ
SEQ ID NO:553 LLRMRDLANQ
SEQ ID NO:554 LQRMRDVAVQ
SEQ ID NO:555 LLRMRDISNQ
SEQ ID NO:556 LLRMRDIANQ
SEQ ID NO:557 LQKQIDYIAGNTQ
SEQ ID NO:558 LLIRLPLD
SEQ ID NO:559 QRMRELAVQ
SEQ ID NO:560 TRMRDIAVQ
SEQ ID NO:561 TRMRDIAVQ
SEQ ID NO:562 QRMRELVVQ
C端分泌序列
定位在一个或多个鞭毛蛋白的C端的保守序列被进一步描述为分泌序列(SEQ IDNO:563-570；表8)。
在芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、类芽孢杆菌细菌(属)和其它真细菌属衍生的鞭毛蛋白的C端鉴定到保守序列，并且所述保守序列包括6个氨基酸，例如LGATLN、LGSMIN或LGAMIN。使用BLAST针对细菌数据库在功能上将这些序列注释为与分泌多肽具有最高同源性的基序。发现鉴定出的6个氨基酸的保守多肽与大肠杆菌中III型分泌系统中发现的保守多肽最相似。据引证，III型输出系统参与多肽跨植物细胞膜的转运。鞭毛蛋白的细丝集合取决于待分泌的鞭毛蛋白的可用性，并且可能需要辅助分泌过程的伴侣蛋白。
本文所述的这些分泌多肽可以与本文所述的任何鞭毛蛋白相关型多肽组合使用，以将这些多肽/肽递送至宿主植物的细胞质中，从而向植物提供有益结果。
表8.C端鞭毛蛋白相关型分泌序列
Figure BDA0002417772590000941
本文提供的特征信息序列(SEQ ID NO:542-548；表6)、信号锚分选序列(SEQ IDNO:549-562；表7)和分泌序列(SEQ ID NO:563-570；表8)可以与鞭毛蛋白多肽或鞭毛蛋白相关型多肽中的任何一个一起使用，以促进生长并向植物或植物部位提供健康和保护性益处。
Flg多肽序列功能的修饰
表3、4或5中提供的L或D Flg相关型序列中的任何一个序列可以被类似地修饰为融合到如表6-8中所述的辅助序列中的任何一个辅助序列。举例来说，这些辅助序列中的任何一个辅助序列的融合将对被鉴定为SEQ ID NO:226的Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽序列产生修饰。
对Flg相关型多肽进行突变以提高对活性氧的反应性或多肽稳定性
多肽可以包括突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以源自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或解硫胺素芽孢杆菌属细菌。也可以相同的方式使用来自其它真细菌类别(包含肠杆菌科)的其它多肽。所关注的其它属包含假单胞菌属、埃希氏杆菌属(Escherichia)、黄单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)等。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-768中的任何一个。例如，鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574和752中的任何一个或其任何组合。
天然存在或非天然的任何生物活性引发性多肽可以通过化学修饰被进一步修饰，以提高多肽的性能和稳定性。此类生物活性引发性多肽包含鞭毛蛋白多肽、逆反型多肽、超敏蛋白来源的多肽、超敏蛋白样多肽、EF-Tu多肽、硫蛋白多肽、RHPP多肽和PSK多肽。可以被化学修饰的特定序列包含SEQ ID NO:226-592、594-601、603-749和751-766。
这些生物活性引发性多肽也可以与其它部分缀合，所述其它部分包含植物结合结构域和多肽、植物部位结合结构域和多肽以及其它载体，如油、塑料、珠子、陶瓷、土壤、肥料、颗粒和大多数结构性材料。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以在其N端或C端被化学修饰。N端和C末端的常见修饰包含：乙酰化、脂质加成、尿素加成、焦谷氨酰加成、氨基甲酸酯加成、磺酰胺加成、烷基酰胺加成、生物素化、磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、甲基化、生物素化、酸加成、酰胺加成、酯加成、醛加成、酰肼加成、异羟肟酸加成、氯甲基酮加成或纯化标签的加成。这些标签可以提高多肽的活性、提高稳定性、提高多肽的蛋白酶抑制剂能力、直接阻断蛋白酶、允许追踪并协助与植物组织的结合。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以通过交联或环化进行修饰。交联可以使多肽彼此结合或与第二表面或部分结合，从而协助多肽的递送或稳定性。可以进行环化，例如以提高多肽的活性以及防止蛋白酶与多肽相互作用。
可以对表4和5中所述的任何一个或多个氨基酸序列进行序列修饰或突变，并用自然界中已知的20种标准氨基酸序列中的任何一种氨基酸序列进行替换或用非标准或非规范性氨基酸序列进行替换，如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸等。例如，可以对如SEQ ID NO:571所示的内部序列、对如SEQ ID NO:572或SEQ ID NO:753所示的C端或如SEQ ID NO:573所示的N端进行修饰或突变，从而产生增强ROS激活作用并提高植物或植物部位中的功能性的Flg多肽。经修饰的多肽也可以在N端或C端被截短，如SEQ ID NO:752所示(N端截短)，以进一步提高植物或植物部位中的功能性。表9A总结了提供经修饰的ROS活性的鉴定出的鞭毛蛋白多肽。
表9A.提供经修饰的ROS活性的从芽孢杆菌或其它细菌中鉴定出的具有突变的鞭毛蛋白多肽Flg22
Figure BDA0002417772590000961
Figure BDA0002417772590000971
Figure BDA0002417772590000981
Figure BDA0002417772590000991
Flg22的核心活性结构域
表9A中序列的下划线部分表示Flg22的核心活性结构域。所述核心结构域包括例如具有多达1个、2个或3个氨基酸取代(由SEQ ID NO:755-765表示)的SEQ ID NO:754，其可以促进农作物和观赏植物的生长、疾病减轻和/或预防。为了易于参考，所述核心结构域表示为具有SEQ ID NO:766的共有序列。包括SEQ ID NO:754-765的各种原生和突变型Flg22多肽与下表9B中的共有序列一起描述。因此，多肽可以进一步包括核心序列。核心序列可以包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个。
多肽还可以包括任何包括SEQ ID NO:1-753或767到768中的任何一个的多肽，其中所述多肽进一步包括核心序列，所述核心序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个。在具有不同功能的多肽或全长蛋白中包含核心序列可以提高所述多肽的生物活性引发性活性。
表9B具有变体的Flg22核心序列。
Figure BDA0002417772590001001
Figure BDA0002417772590001011
超敏蛋白或超敏蛋白样多肽
多肽可以包含超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:587-592和594-597(表10和11)，
超敏蛋白或超敏蛋白样多肽可以源自黄单胞菌物种或多种细菌属，包含芝麻素泛菌属(Pantoea sesami)、赫罗纳欧文氏菌属(Erwinia gerudensis)、芝麻素泛菌属或赫罗纳欧文氏菌。
另外的超敏蛋白样生物活性引发性多肽可以源自包括SEQ ID NO:593的来自柑橘黄单胞菌的全长HpaG样蛋白质。
当外源性地或内源性地施用于植物或植物部位时，采用原生L-超敏蛋白样序列(SEQ ID NO:587)或逆反型D-超敏蛋白样序列(SEQ ID NO:588)生物活性引发性多肽形式(如表10或11所示)的HpaG样多肽的施用有利于提高植物的生长和免疫反应。当施用于在非生物胁迫条件下生长或暴露于非生物胁迫条件下的植物时，逆反型HpaG样(例如SEQ IDNO:588)生物活性引发性多肽特别有利于增强所述HpaG样多肽的活性和稳定性。逆反型HpaG样形式可用于增强在这种环境下生长的植物中的生长和保护反应。
表10.超敏蛋白样(HpaG样)
Figure BDA0002417772590001031
表11.来自各种细菌属的HpaG样同源物
Figure BDA0002417772590001041
植物磺肽素(PSKα)多肽
多肽可以包括PSK多肽。
PSK多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:598-599。
植物磺肽素α(PSKα)最初来自拟南芥，并且是磺化的生物活性引发性多肽。表11中示出了一个或多个PSKα生物活性引发性多肽。
PSKα被提供为合成多肽或天然多肽，所述合成多肽或天然多肽在重组微生物中进行表达、纯化，并用于施用于植物或植物部位的农业制剂中。
表12.植物磺肽素α(PSKα)—以天然和逆反型氨基酸序列形式提供的磺化的生物活性引发性多肽
Figure BDA0002417772590001051
根毛促进性多肽(RHPP)
多肽可以包括RHPP。
RHPP的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:600-601和603-606。例如，RHPP的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:600。
还提供了包括RHPP的多肽和包括鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的多肽的组合。鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个。在一些情况下，多肽包括：包括SEQ ID NO:600的RHPP和包括SEQ ID NO:226的鞭毛蛋白。
多肽可以包括PSK多肽、RHPP、超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其组合。
另外的RHPP生物活性引发性多肽可以源自包括SEQ ID NO:602的来自大豆的全长Kunitz型胰蛋白酶抑制剂蛋白。可以通过C端酰胺化、N端乙酰化或其它修饰对RHPP多肽进行修饰。可以通过添加Kunitz型胰蛋白酶抑制剂和/或大豆粉的粗蛋白酶消化来获得RHPP生物活性引发性多肽。
最初源自大豆(Glycine max)的RHPP可以被提供为例如叶面施用，以在玉米、大豆和其它蔬菜中产生有益的表型。
表13.RHPP正向和逆反序列的氨基酸序列
Figure BDA0002417772590001061
表14.来自大豆属的RHPP的同源物
Figure BDA0002417772590001062
多肽可以包含逆反型(RI)RHPP。
逆反型RHPP可以包括SEQ ID NO:601、605或606。
可以通过C端酰胺化或N端乙酰化对逆反型(RI)RHPP进行修饰。
表15.来自大豆属的RHPP的同源物的逆反型氨基酸序列
Figure BDA0002417772590001071
延伸因子Tu(EF-Tu)多肽
多肽可以包括EF-Tu多肽。
源自延伸因子Tu(EF-Tu的)的肽可以单独使用或与本文所述的其它生物活性引发性多肽组合使用(如与Flg22多肽组合)以提供抵御病原生物的多个模式，所述病原生物通常为细菌或其它真菌微生物，但也包含其它传染原(如病毒)。
表16提供了源自选自植物和细菌的各种EF-Tu生物活性引发性多肽的优选的N端多肽。EF-Tu来源的多肽的长度可以为18到26个氨基酸或小于26个氨基酸。表17进一步提供了源自植物和细菌的EF-Tu多肽的逆反(全-D)版本。
EF-Tu多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:607-640中的任何一个。
EF-Tu多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:616或617。
可以通过N端乙酰化对EF-Tu多肽进行修饰。例如，EF-Tu多肽可以通过N端乙酰化进行修饰，并且包括任何SEQ ID NO:607、608、610、611、613、614、616、617、619或622中的任何一个。
表16.源自植物、细菌和藻类物种中存在的延伸因子(EF-Tu)的经N端乙酰化的多肽和中央多肽
Figure BDA0002417772590001081
Figure BDA0002417772590001091
Figure BDA0002417772590001101
表17.源自细菌和藻类物种中存在的延伸因子(EF-Tu)的逆反型多肽
Figure BDA0002417772590001102
Figure BDA0002417772590001111
Figure BDA0002417772590001121
硫蛋白和靶向硫蛋白的多肽
多肽可以包括硫蛋白或硫蛋白样多肽。
硫蛋白或硫蛋白样多肽可以与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞。
韧皮部靶向序列的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:641。
更具体地，可用于将AMP多肽(如硫蛋白或Flg多肽)靶向血管组织(木质部和韧皮部)的靶向序列对于治疗定居在参与流体和营养素(例如，水溶性营养素、糖、氨基酸、激素等)运输的受限组织上的疾病非常有用。如木质部等血管组织运输并储存水和水溶性营养素，而韧皮部细胞则运输植物中的糖、蛋白质、氨基酸、激素和其它有机分子。
表18提供了可用于靶向本文所述的硫蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽的优选的血管/韧皮部靶向多肽。
表18.韧皮部靶向多肽
Figure BDA0002417772590001141
合成版本的韧皮部靶向多肽(SEQ ID NO:641)在将抗微生物多肽靶向韧皮部筛管和伴随细胞方面特别有用。
还提供了抗微生物硫蛋白多肽(表19)，并将其与表18中提供的韧皮部靶向序列一起使用，以便将硫蛋白序列靶向柑橘和其它植物的韧皮部组织中。
硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:650-749中的任何一个，如SEQ ID NO:651。
表19.硫蛋白和硫蛋白样序列
Figure BDA0002417772590001151
Figure BDA0002417772590001161
Figure BDA0002417772590001171
Figure BDA0002417772590001181
Figure BDA0002417772590001191
Figure BDA0002417772590001201
Figure BDA0002417772590001211
Figure BDA0002417772590001221
Figure BDA0002417772590001231
Figure BDA0002417772590001241
Figure BDA0002417772590001251
Figure BDA0002417772590001261
Figure BDA0002417772590001271
Figure BDA0002417772590001281
Figure BDA0002417772590001291
多肽可以包括融合蛋白。
表20(SEQ ID NO:750)描述了用于进行翻译性融合的序列，所述翻译性融合使用对合成的韧皮部靶向多肽(SEQ ID NO:641)和合成的硫蛋白多肽(SEQ ID NO:650)进行编码的核苷酸序列。大写(非粗体)字体序列标识韧皮部靶向序列，大写加粗字体标识对靶向韧皮部的生物活性引发性多肽进行编码的所述两个肽序列(表20)的融合。
表20.韧皮部靶向序列与硫蛋白来源的多肽的翻译性融合
Figure BDA0002417772590001301
另外的修饰
另外，多肽可以与D-氨基酸、β2-氨基酸、β3-氨基酸、同型氨基酸、γ氨基酸、类肽、N-甲基氨基酸和其它非天然氨基酸模拟物和衍生物一起进行化学合成。
可以通过天然过程(如翻译后加工)或通过本领域众所周知的化学修饰技术对多肽进行修饰。修饰可以发生在多肽的任何地方，包含多肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。相同类型的修饰可以相同或不同程度地存在于多肽的几个位点上。同样，多肽可以含有许多类型的修饰。
肽可以是分支的(例如由于泛素化)并且其可以是环状的，具有或不具有分支。环状多肽、支链多肽和支链环状多肽可以由翻译后的天然过程产生或可以通过合成方法制备。
修饰包含乙酰化、酸加成、酰化、ADP-核糖基化、醛加成、烷基酰胺加成、酰胺化、胺化、生物素化、氨基甲酸酯加成、氯甲基酮加成、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、酯加成、共价交联的形成、半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、酰肼加成、异羟肟酸加成、羟基化、碘化、脂质加成、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、棕榈酰化、纯化标签的加成、焦谷氨酰加成、外消旋化、硒酰化、磺酰胺加成、硫酸化、RNA转移介导的氨基酸向蛋白质的加成，如精氨酸化、泛素化和尿素加成。(参见例如，Creighton等人(1993)《蛋白质—结构和分子特性(Proteins–Structure and MolecularProperties)》,第二版,T.E.Creighton,W.H.弗雷曼出版公司(W.H.Freeman andCompany),纽约；编辑者：Johnson(1983)《蛋白质的翻译后共价修饰(PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins)》,学术出版社(Academic Press),纽约；Seifter等人(1990)《酶学方法(Meth.Enzymol.)》,182:626-646；Rattan等人(1992)《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,663:48–62；等)。
使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可以产生变体以改善或改变本文所描述的多肽的特征。此类变体包含根据本领域众所周知的一般规则选择的缺失、插入、倒置、重复、复制、延伸和取代(例如，保守取代)，从而对活性几乎没有影响。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少75％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
多肽可以包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有生物活性引发性活性。
II.生物活性引发性多肽的制备
提供了用于使用本领域普通技术人员熟知且通常使用的方法对生物活性引发性多肽(例如，鞭毛蛋白)和生物活性引发性多肽(例如，Bt.4Q7Flg22)进行克隆、基因修饰和表达的方法和途径。本文所述的方法可以与本文所述的生物活性引发性多肽中的任何一个一起使用，因此包含鞭毛蛋白、鞭毛蛋白相关型多肽、硫蛋白、超敏蛋白样(HpaG样)、EF-Tu、PSKα或RHPP中的任何一个和/或其任何组合。
可以以游离多肽的形式提供生物活性引发性多肽，将其固定在颗粒表面上或浸渍在基质上或基质中。几种表达系统可用于产生游离多肽。
鞭毛蛋白来源的全编码多肽、部分编码多肽(鞭毛蛋白多肽)和鞭毛蛋白相关型多肽可以在芽孢杆菌菌株(例如，苏云金芽孢杆菌菌株BT013A)、蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中过度表达。使用适当的表达载体对鞭毛蛋白和鞭毛蛋白来源的多肽进行克隆，从而允许大量生产多肽。
例如，为了便于克隆对本文所述的一个或多个生物活性引发性多肽进行编码的靶核苷酸，通过在相容的BamHI限制性内切核酸酶位点处将上述pBC质粒主链与大肠杆菌pUC57克隆载体融合来构建大肠杆菌相容的穿梭载体pSUPER。所得的pSUPER载体带有双重选择标志物(大肠杆菌中的氨苄青霉素选择和芽孢杆菌属中的四环素选择)。通过用特异性引物对靶核苷酸进行PCR扩增来执行克隆，所述特异性引物被合成为与pSUPER插入位点重叠15bp。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)将编码特定基因的多肽融合到pSUPER载体上。使用pBC合适的主链反向引物和正向引物对经序列验证的pSUPER构建体进行扩增。将所得PCR产物自连接以产生用于转化B30供体芽孢杆菌属菌株的pBC质粒。通过Sanger测序证实了最终构建体是完全内在的。
通过使用可以将枯草芽孢杆菌和/或苏云金芽孢杆菌菌株用作指定的异源表达菌株的自由表达系统，大量生产本文所述的生物活性引发性多肽/肽以用于田间和种植者。命名为pFEe4B的基本表达质粒由大肠杆菌部分(＝e)和芽孢杆菌部分(＝pFE)组成。e部分源自pUC19，并且可以在大肠杆菌中对载体进行选择和扩增以用于克隆目的。其包括赋予抗β-内酰胺抗生素(如氨苄青霉素和其它青霉素衍生物)抗性的β-内酰胺酶基因(bla)，以及允许载体繁殖的大肠杆菌复制起点。pFE部分提供了芽孢杆菌属的选择和质粒扩增，并驱动所关注的异源多肽/肽的表达。因此，其含有赋予抗四环素抗性的基因(tetL)，以及负责在芽孢杆菌属中扩增质粒的复制蛋白(repU)的基因，两者均源自原生蜡样芽孢杆菌质粒pBC16。pFEe4B的表达盒含有分泌信号(amyQ)、克隆位点和终止子(rspD)，前者导致经表达的蛋白质/肽从宿主菌株细胞分泌到周围培养基中，而后者阻止转录超过所关注的开放阅读框架。pFEe4B中的表达由经修饰的自诱导型启动子驱动，一旦培养物达到足够的光密度，所述启动子就会启动表达。在pFEe4b表达系统中，表达受枯草芽孢杆菌的IPTG诱导型启动子序列控制。所述启动子由与大肠杆菌lac阻遏物(lacI)组合的经修饰的组成型启动子和核糖体结合位点组成。因此，来自pFEe4B编码的多肽/肽的表达取决于合适的诱导剂(如异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))的存在。然而，可用于表达本文所述的多肽的其它pFe系统不依赖于此类诱导系统来进行表达。pFEe4质粒进一步在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)青霉素酶启动子的控制下携带大肠杆菌lacI基因，从而在没有任何诱导剂的情况下防止本文所述的多肽/肽的表达。
其它市售的表达载体，例如，任何源自枯草芽孢杆菌的表达载体，也可以是有用的。由于以下期望的标准，选择了其它表达载体来生产重组的生物活性引发性多肽：重组微生物是非致病性的并且通常被认为是安全的(GRAS)生物，其密码子使用没有明显偏倚，并且能够将细胞外蛋白质直接分泌到培养基中，从而提供一个或多个细胞游离版本的生物活性引发性多肽。
本领域中常见的其它表达系统可用于以类似方式表达生物活性引发性多肽。
可以通过使用一个或多个用于亲和纯化的蛋白质标签或使用释放一个或多个未标记的多肽的柱蛋白酶切割方法来产生本文所述的生物活性引发性多肽并对其进行纯化。使用这种途径制备游离版本的生物活性引发性多肽的方法是本领域普通技术人员通常已知且理解的。
蛋白质标签通常包括掺入经翻译的多肽中的相对较小的氨基酸序列，其基本上为所关注的生物活性引发性多肽提供分子链。蛋白质标签通常用于辅助重组多肽的表达和纯化。选择聚组氨酸(His)标签是为了如上所述对生物活性引发性多肽进行亲和纯化。His标签可以融合至多肽的N端或C端。His标签经常与其它标签组合使用以进行双重标记。生物活性引发性多肽的标签可用于对所述多肽进行亲和纯化。还可以使用特异性蛋白酶和柱特异性蛋白酶切割方法来释放纯化后的未标记的生物活性引发性多肽或所关注的全长前体蛋白，从而将标签从生物活性引发性多肽上切下。这些方法也是本领域普通技术人员常见且众所周知的。可以利用的其它标签是本领域已知的，并且包含FLAG标签、抗体表位、链霉亲和素/生物素以及其它纯化工具。另一个有用的标签是谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。
可以在质粒内提供蛋白质标签以产生多肽。理想地，质粒与对所关注的多肽进行编码的序列一起包括用于促进分泌的分泌信号(例如，amyE或amyQ分泌信号和用于增强多肽稳定性的蛋白质标签(例如，谷胱甘肽S转移酶)，从而增强生产和稳定性。在优选的情况下，使用包括共有切割序列的连接子序列将蛋白质标签(例如，GST)与多肽连接。这可以允许添加靶向激酶，所述靶向激酶可以切割标签并释放纯化且分离的多肽。合适的共有切割序列可以包括肠激酶切割序列(SEQ ID NO:772)，可以通过例如简单应用牛肠激酶来切割所述肠激酶切割序列。
因此，提供了一种用于产生多肽的方法，所述方法包括通过发酵产生包括本文所述的任何多肽和肠激酶(EK)切割位点的融合蛋白，所述EK切割位点用于增强所述多肽的活性和稳定性。由质粒编码的融合蛋白可以进一步包括蛋白质标签(例如，聚组氨酸(His)标签、FLAG标签、抗体表位、链霉亲和素/生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)或其任何组合)，其中肠激酶切割位点包括连接多肽和蛋白质标签的连接区。融合蛋白还可以包括分泌信号。分泌信号可以包括amyE或amyQ分泌信号(例如，SEQ ID NO:769)，或者其可以包括如上所述的SEQ ID NO:563-570中的任何一个。与缺乏肠激酶(EK)切割位点的多肽相比，包括肠激酶(EK)切割位点的多肽可以更稳定并且通过发酵产生更高的产量。当需要时，可以将肠激酶(例如，牛肠激酶)施用于融合蛋白以激活(例如，分离)所关注的多肽。可以现场施用肠激酶，以使生物活性引发性多肽在施用前具有最大的稳定性。
可以使用市售的肽合成技术以合成形式提供生物活性引发性多肽，从而产生高纯度多肽。生物活性引发性多肽的合成生产利用本领域普通技术人员众所周知的一般固相肽合成方法。化学合成方法包含：从氨基酸前体逐步组装肽，其中通过氨基酸之间的偶联反应进行肽延伸，然后除去可逆的保护基。固相肽合成用于添加共价连接步骤，所述步骤将新生的肽链连接至不溶的聚合物载体，从而使锚定的肽可以扩展一系列循环。驱动这些延伸反应完成，然后通过过滤和洗涤步骤从固体载体中除去合成后的多肽。完成合成和纯化后，执行MS和HPLC分析。
可以以合成形式提供本文针对鞭毛蛋白相关型多肽(表1-5)、超敏蛋白样(HpaG样)多肽(表10和11)、植物磺肽素(PSKα)多肽(表12)、RHPP(表13-15)、延伸因子Tu(EF-Tu多肽)(表16和17)、硫蛋白和硫蛋白样多肽(表19)所描述的生物活性引发性多肽中的任何一种。
另外，此类方法可用于制备和使用保守的辅助序列，优选地将所述辅助序列命名为特征信息序列(SEQ ID NO:542-548)、信号锚分选序列(SEQ ID NO:549-562)和分泌序列(SEQ ID NO:563-570)。
也可以合成或化学地制造逆反。通过将所有L-氨基酸残基替换为其D-对映体从而产生反向或逆向的全D-异构体Flg多肽来制备在全D确认中产生的合成多肽。固相合成用于制备一个或多个逆反版本的Flg多肽。在合成并纯化一个或多个逆反型多肽后，使用质谱法测定一个或多个Flg多肽的氨基酸组成。然后使用HPLC分析测定所述一个或多个逆反型多肽的纯度水平大于或等于95％。使用HPLC保留时间、相对分子质量和氨基酸组成值(IC50μM)对所述一个或多个逆反版本的Flg多肽进行进一步表征。使用重组DNA技术进行逆反生产通常涉及使用非核糖体蛋白合成机制。
测试通过固相合成制备的逆反合成型Flg生物活性引发性多肽结合FLS2或替代性FLS受体(例如，也在植物中发现的FLS3)的能力。竞争性ELISA实验用于确认逆反型Flg相关型多肽与植物FLS受体的结合亲和力。
表达生物活性引发性多肽的重组细菌
还提供了一种表达或过度表达多肽的重组微生物。所述多肽包括上述组合物的多肽。例如，所述多肽可以包括：(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(j)的KTI多肽；或(l)的EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(o)的PSK多肽；或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽。
所述多肽可以被所述微生物过度表达。
重组微生物可以包括能够以有效方式制备重组的生物活性引发性多肽或其前体的微生物。优选的微生物将来自芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属的细菌、青霉菌属(Penicillium)的真菌、球囊霉属(Glomus)的细菌、假单胞菌属的细菌、节杆菌属(Arthrobacter)的细菌、副球菌属(Paracoccus)的细菌、根瘤菌属(Rhizobium)的细菌、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的细菌、固氮螺菌属(Azosprillium)的细菌、肠杆菌属(Enterobacter)的细菌、埃希氏杆菌属的细菌或其任何组合。
重组微生物可以包括芽孢杆菌属的细菌、类芽孢杆菌属的细菌或其任何组合。
例如，微生物可以包括蕈状芽孢杆菌属(Bacillus mycoides)、假蕈状芽孢杆菌属(Bacillus pseudomycoides)、蜡样芽孢杆菌属、苏云金芽孢杆菌属、巨大芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌属、坚强芽孢杆菌属(Bacillus firmus)、阿氏芽胞杆菌属、解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌属、环状芽孢杆菌属(Bacilluscirculans)、弯曲芽孢杆菌属(Bacillus flexus)、尼氏芽孢杆菌属(Bacillusnealsonii)、短小芽孢杆菌属(Bacillus pumulis)、类芽孢杆菌属细菌或其组合。
本领域普通技术人员通常使用方法和途径来确定和验证细菌的属和种。一种通用方法使用通用引物(ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT)和(GGGTTGCGCTCGTTG/AC)提供从细菌中分离的染色体DNA，并对16s rRNA区域进行PCR扩增。然后对PCR扩增子进行纯化和测序，以正确鉴定适当的细菌菌株，例如芽孢杆菌属中的特定菌株。
本领域技术人员通常已知用于制备染色体DNA、使用质粒转化对多肽进行编码的基因的DNA、在宿主细菌(例如，芽孢杆菌菌株)中产生多肽的样品方案。
提供的芽孢杆菌菌株可以产生本文所述的任何生物活性引发性多肽或其组合。例如，所述菌株可以包括：
(a)阿氏芽孢杆菌CAP53(NRRL编号：B-50819)、
(b)阿氏芽孢杆菌CAP56(NRRL编号：B-50817)、
(c)弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL编号：B-50816)、
(d)孔德拉蒂瓦埃富球菌(aracoccus kondratievae)NC35(NRRL编号：B-50820)、
(e)蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL编号：B-50921)、
(f)阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)CAP12(NRRL编号：B-50822)、
(g)尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL编号：B-50821)、
(h)蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL编号：B-50918)、
(i)枯草芽孢杆菌EE148(NRRL编号：B-50927)、
(j)粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)EE107(NRRL编号：B-50920)、
(k)蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL编号：B-50916)、
(l)蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL编号：B-50922)、
(m)蜡样芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL编号：B-50917)、
(n)马赛类芽孢杆菌(Paenibacillus massiliensis)BT23(NRRL编号：B-50923)、
(o)蜡样芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL编号：B-50928)、
(p)枯草芽孢杆菌EE218(NRRL编号：B-50926)、
(q)巨大芽孢杆菌EE281(NRRL编号：B-50925)、
(r)蜡样芽孢杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；
(s)假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)、
(t)蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)、
(u)短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)、
(v)苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、
(w)蕈状芽孢杆菌EE116(NRRL编号：B-50919)、
(x)蜡样芽孢杆菌家族成员EE417(NRRL编号：B-50974)、
(y)枯草芽孢杆菌EE442(NRRL编号：B-50975)、
(z)枯草芽孢杆菌EE443(NRRL编号：B-50976)、
(aa)蜡样芽孢杆菌家族成员EE444(NRRL编号：B-50977)、
(bb)枯草芽孢杆菌EE405(NRRL编号：B-50978)、
(cc)蜡样芽孢杆菌家族成员EE439(NRRL编号：B-50979)、
(dd)巨大芽孢杆菌EE385(NRRL编号：B-50980)、
(ee)蜡样芽孢杆菌家族成员EE387(NRRL编号：B-50981)、
(ff)环状芽孢杆菌EE388(NRRL编号：B-50982)、
(gg)苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL编号：B-50983)、
(hh)蜡样芽孢杆菌家族成员EE377(NRRL编号：B-67119)、
(ii)蕈状芽孢杆菌EE363(NRRL编号：B-67121)、
(jj)假蕈状芽孢杆菌EE366(NRRL编号：B-67120)；
(kk)苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL编号：B-50924)；
或其任何组合。这些菌株中的每一种菌株均已保藏在美国农业部(USDA)农业研究服务中心(ARS)中(地址是美国伊利诺斯州61604皮奥里亚市北大学街1815号)，并通过括号中提供的NRRL保藏号进行标识。菌株(a)-(d)、(f)和(g)于2013年3月11日保藏。菌株(e)、(h)-(q)、(w)和(kk)于2014年3月10日保藏。菌株(x)-(ff)于2014年9月10日保藏。菌株(gg)于2014年9月17日保藏。菌株(r)-(v)、(hh)、(ii)和(jj)于2015年8月19日保藏。苏云金芽孢杆菌BT013A也被称为苏云金芽孢杆菌4Q7。
国际公开第WO/2017/161091号中发现的实施例中描述了这些菌株的分离和表征，所述国际公开通过引用整体并入本文。为了易于鉴定生物，国际公开第WO/2017/161091 A1号还在序列表和表17中提供了这些菌株中的每一种菌株的部分16S核糖体RNA序列。
可以使用任何重组微生物对本文针对鞭毛蛋白相关型多肽(表1-5)、超敏蛋白或超敏蛋白样(HpaG样)多肽(表10或11)、植物磺肽素(PSKα)多肽(表12)、RHPP(表13-15)、EF-Tu多肽(表16-17)和硫蛋白或硫蛋白样多肽(表19)所描述的生物活性引发性多肽进行过度表达。
重组微生物可以包括本文所述的任何重组微生物中的两种或更多种的混合物。
重组微生物可以是灭活的。灭活导致无法繁殖的微生物。微生物的灭活可能是有利的，例如因为其允许将微生物递送至植物或植物生长培养基，同时减少或消除活性微生物可能对植物或环境产生的任何有害作用。可以通过任何物理或化学方式使重组微生物灭活，例如通过热处理、γ辐照、x射线辐照、UV-A辐照、UV-B辐照或用溶剂(如戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿或苯酚或其任何组合)处理。
III.组合物
提供了一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的组合物。所述组合物包括：本文所述的多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂；或本文所述的多肽的任何组合。
组合物可以基本上由本文所述的生物活性引发性多肽或多肽组成。
组合物可以包括大多数生物活性引发性多肽，而组合物的其余部分是农药或载剂。更具体地，组合物可以包括按所述组合物的总重量计，约0.00001％到约95％的多肽、约0.1wt.％到约80wt.％的农用化学品和约5wt.％到约50wt.％的载剂。可替代地，组合物可以包括按所述组合物的总重量计，约0.01wt.％到约5wt.％的多肽、约0.2wt.％到约70wt.％的农用化学品和约10wt.％到约30wt.％的载剂，或者组合物可以包括按所述组合物的总重量计，约0.05wt.％到约1wt.％的多肽、约30wt.％到约60wt.％的农用化学品和约40wt.％到约69wt.％的载剂。可替代地，组合物可以包括任何可检测量的多肽，以及按所述组合物的总重量计，约0.1wt.％到约80wt.％的农用化学品和约5wt.％到约50wt.％的载剂。
组合物可以包含与所述多肽本质上相关的农用化学品或载剂。
农用化学品可以与多肽组合非天然存在。
农用化学品可以包含但不限于防腐剂、缓冲剂、湿润剂、表面活性剂、包衣剂、单糖、多糖、研磨剂、农药、杀虫剂、除草剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀螨剂、肥料、生物刺激素、着色剂、保湿剂、渗透保护剂、抗生素、氨基酸、生物防治剂或其组合。
当组合物包含氨基酸时，所述氨基酸可以与包括多肽的氨基酸分开提供。例如，可以使用分离的氨基酸。合适的氨基酸包含任何天然或非天然的氨基酸。例如，组合物可以包括半胱氨酸。
农用化学品可以包括酸，如由本文所述的任何多肽的化学合成形成的酸。例如，如果例如通过发酵合成多肽，则可能存在盐酸、乙酸或三氟乙酸。
当农用化学品是酸时，其可以占组合物总重量的约0.001wt.％到约30wt.％、约0.01wt.％到约20wt.％或约0.1wt.％到约5wt.％。
除非另外说明，否则每种农用化学品可以占组合物总重量的约0.1wt.％到约60wt.％、约0.5wt.％到约50wt.％或约10wt.％到约30wt.％。
当组合物包含防腐剂时，所述防腐剂可以包括基于二氯酚和苄醇半缩甲醛(购自ICI的PROXEL或购自索尔化工(Thor Chemie)的ACTICIDE RS和购自陶氏化学(DowChemical)的KATHON MK)以及如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮等异噻唑啉酮衍生物(购自索尔化工的ACTICIDES)的防腐剂。作为另外的实例，合适的防腐剂包含MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、BIT(1,2-苯并噻唑啉-3-酮，其可以作为氢氧化钠和二丙二醇的溶液从Avecia公司以商品名PROXEL GXL获得)、5-氯-2-(4-氯苄基)-3(2H)-异噻唑酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-盐酸盐、4,5-二氯-2-环己基-4-异噻唑啉-3-酮、4,5-二氯-2-辛基-2H-异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-氯化钙络合物、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮、苄醇半缩甲醛或其任何组合。
当组合物包含缓冲剂时，所述缓冲剂可以包括钾、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、硫酸盐、MOPS或HEPES。缓冲剂可以使组合物中的多肽稳定。
当组合物包含湿润剂时，所述湿润剂可以包括有机硅、聚氧乙氧基化物、聚山梨醇酯、聚乙二醇及其衍生物、乙氧基化物、农作物油和多糖。
当组合物包含表面活性剂时，所述表面活性剂可以包括重质石油、重质石油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化的脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯单丁醚、烷基胺乙酸盐、烷基芳基磺酸盐、多元醇、烷基磷酸盐、醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、烷氧基化的多元醇、烷基聚乙氧基醚、烷基聚氧乙烯甘油、乙氧基化的大豆油衍生物、基于有机硅酮的表面活性剂或其任何组合。表面活性剂可以包含在多种组合物中，包含用于叶面用途的组合物。
当组合物包含包衣剂时，所述包衣剂可以包括增粘剂、聚合物、灌浆剂(fillingagent)或填冲剂(bulking agent)。
增粘剂可以包含但不限于羧甲基纤维素和呈粉末、颗粒或乳胶形式的天然和合成的聚合物(如阿拉伯树胶、甲壳质、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯盐)，以及天然磷脂(如脑磷脂和卵磷脂)和合成磷脂。增粘剂包含优选由天然或合成的粘合剂聚合物组成的增粘剂，所述粘合剂聚合物对被包被的种子没有植物毒性作用。可以单独或组合使用的其它增粘剂包含，例如，聚酯、聚醚酯、聚酸酐、聚酯氨基甲酸酯、聚酯酰胺；聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇和甲基纤维素；聚乙烯醇共聚物；聚乙烯吡咯烷酮；多糖(包含淀粉、改性淀粉和淀粉衍生物、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐、壳聚糖)和纤维素、纤维素酯、纤维素醚和纤维素醚酯(包含乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素)；脂肪；油；蛋白质，包含酪蛋白、明胶和玉米醇溶蛋白；阿拉伯树胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸盐，具体地说，木质素磺酸钙；聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸盐；聚氧化乙烯；聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚乙烯胺、聚乙酰胺；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁二烯，或其任何组合。增粘剂可用于多种组合物中，包含用于种子处理剂的组合物。
当组合物包含研磨剂时，所述研磨剂可以包括滑石、石墨或两者的组合。
保湿剂是有助于保持水分的吸湿性物质。当组合物包含保湿剂时，所述保湿剂可以包括：甘油、丙三醇、甘油衍生物(例如单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、三乙酸盐、丙二醇、己二醇或丁二醇)、三乙二醇、三聚丙烯乙二醇、甘油基三乙酸盐、蔗糖、塔格糖、糖醇或糖多元醇(例如甘油、山梨醇、木糖醇、甘露醇或甘露醇)、聚合多元醇(例如聚葡萄糖、胶原蛋白、芦荟或芦荟凝胶)或α羟基酸(例如乳酸、蜂蜜、糖蜜、皂树皮、六偏磷酸钠、氯化锂或尿素)。合成的保湿剂还可以包括：丁二醇和银耳提取物。
当组合物包含农药时，所述农药可以包括杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀螨剂或其任何组合。
当组合物包含杀虫剂时，所述杀虫剂可以包括噻虫胺(clothianidin)、吡虫啉(imidacloprid)、有机磷酸盐、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、杀螨剂(acaricide)、邻苯二甲酸酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、经卤代芳香族取代的尿素、烃酯、生物基杀虫剂或其任何组合。例如，所述杀虫剂可以包括噻虫胺或吡虫啉。
农用化学品可以包括除草剂。除草剂可以包括2,4-D、2,4-DB、刈草胺(acetochlor)、三氟羧草醚(acifluorfen)、甲草胺(alachlor)、莠灭净(ametryn)、莠去津(atrazine)、氯氨基吡啶酸(aminopyralid)、氟草氨(benefin)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、苄嘧磺隆甲基(bensulfuron methyl)、地散磷(bensulide)、噻草平(bentazon)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、除草定(bromacil)、溴苯腈(bromoxynil)、苏达灭(butylate)、唑草酮(carfentrazone)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、2-氯苯氧基乙酸、氯磺隆(chlorsulfuron)、氯嘧磺隆乙基(chlorimuron ethyl)、烯草酮(clethodim)、异噁草酮(clomazone)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯酯磺草胺(cloransulam)、CMPP-P-DMA、草灭特(cycloate)、DCPA、甜菜安(desmedipham)、麦草畏(dicamba)、敌草腈(dichlobenil)、氯甲草(diclofop)、2,4-二氯苯酚、二氯苯氧基乙酸、二氯丙酸(dichlorprop)、精二氯丙酸(dichlorprop-P)、唑嘧磺胺(diclosulam)、二氟吡隆(diflufenzopyr)、二甲吩草胺(dimethenamid)、2,4-二氯苯氧基乙酸的二甲胺盐、敌草快(diquat)、敌草隆(diuron)、DSMA、草藻灭(endothall)、EPTC、丁氟消草(ethalfluralin)、乙呋草磺(ethofumesate)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆(flucarbazone)、氟噻草胺(flufenacet)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、伏草隆(fluometuron)、氟草烟(fluroxypyr)、氟草烟1-甲基庚基酯(fluorxypyr 1-methyleptylester)、氟磺胺草醚(fomesafen)、氟磺胺草醚钠盐(fomesafen sodium salt)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、草丁膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-ammonium)、草甘膦(glyphosate)、吡氯磺隆(halosulfuron)、吡氯磺隆-甲基(halosulfuron-methyl)、六嗪酮(hexazinone)、2-羟基苯氧基乙酸、4-氢氧苯氧基乙酸、咪草酯(imazamethabenz)、咪草啶酸(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、异噁酰草胺(isoxaben)、异噁氟草酮(isoxaflutole)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、灭草烟(mazapyr)、MCPA、MCPB、2甲4氯丙酸(mecoprop)、精2甲4氯丙酸(mecoprop-P)、甲基磺草酮(mesotrione)、异丙甲草胺(metolachlor-s)、嗪草酮(metribuzin)、甲磺隆(metsulfuron)、甲磺隆-甲基(metsulfuron-methyl)、草达灭(molinate)、MSMA、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、达草灭(norflurazon)、黄草消(oryzalin)、噁草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、百草枯(paraquat)、壬酸(pelargonic acid)、胺硝草(pendimethalin)、甜菜宁(phenmedipham)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氨氟乐灵(prodiamine)、扑草净(prometryn)、拿草特(pronamide)、敌稗(propanil)、氟丙磺隆(prosulfuron)、杀草敏(pyrazon)、嘧硫草醚(pyrithiobac)、罗克杀草砜(pyroxasulfone)、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹禾灵(quizalofop)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定(sethoxydim)、环草隆(siduron)、西玛津(simazine)、磺胺草唑(sulfentrazone)、嘧磺隆(sulfometuron)、乙磺磺隆(sulfosulfuron)、丁唑隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、噻草啶(thiazopyr)、噻磺隆(thifensulfuron)、噻磺隆-甲基(thifensulfuron-methyl)、禾草丹(thiobencarb)、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏(triallate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、苯磺隆-甲基(tribernuron-methyl)、绿草定(triclopyr)、氟乐灵(trifluralin)、氟胺磺隆(triflusulfuron)或其任何组合。
当组合物包含杀线虫剂时，所述杀线虫剂可以包括坚强芽孢杆菌、氟吡菌酰胺(fluopyram)、抗生素杀线虫剂(如阿维菌素)；氨基甲酸酯类杀线虫剂，如乙酰虫腈(acetoprole)、蚀几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、氯化苦(chloropicrin)、杀线噻唑(benclothiaz)、苯菌灵(benomyl)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burholderia cepacia)、卡巴呋喃(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)和cleothocard；棉隆(dazomet)、DBCP、DCIP、棉铃威(alanycarb)、涕灭威(aldicarb)、砜灭威(aldoxycarb)、草氨酰(oxamyl)、除线特(diamidafos)、克线磷(fenamiphos)、伐线丹(fosthietan)、磷胺(phosphamidon)、硫线磷(cadusafos)、毒死蜱(chlorpyrifos)、除线磷(diclofenthion)、乐果(dimethoate)、灭克磷(ethoprophos)、丰索磷(fensulfothion)、噻唑磷(fostiazate)、伸展素(harpins)、速杀硫磷(heterophos)、新烟碱类(imicyafos)、isamidofos、氯唑磷(isazofos)、灭多虫(methomyl)、甲基灭蚜磷(mecarphon)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、拟斯扎瓦巴氏杆菌(Pasteuria nishizawae)(包含其孢子)、甲拌磷(phorate)、磷虫威(phosphocarb)、特丁磷(terbufos)、虫线磷(thionazin)、三唑磷(triazophos)、tioxazafen、棉隆(dazomet)、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烯、糠醛(furfural)、碘甲烷(iodomethane)、威百亩(metam)、溴甲烷、异硫氰酸甲酯、二甲苯酚或其任何组合。例如，所述杀线虫剂可以包括坚强芽孢杆菌菌株i-2580、拟斯扎瓦巴氏杆菌(包含其孢子)或氟吡菌酰胺。
当组合物包含杀菌剂时，所述杀菌剂可以包括链霉素、青霉素、四环素、土霉素、春日霉素、氨苄青霉素、恶喹酸、金霉素、氧化铜或其任何组合。例如，所述杀菌剂可以包括土霉素。
生物防治剂被广义地定义为可以代替合成农药或肥料使用的微生物。当组合物包含生物防治剂时，所述生物防治剂可以包括苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌分离物J、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)、铁杉下色杆菌(Chromobacterium subtsugae)、代尔夫特食酸菌(Delftiaacidovorans)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)K61、拜赖青霉菌(Penicilliumbilaii)、产生脂肽的枯草芽孢杆菌菌株、产生脂肽的解淀粉芽孢杆菌菌株、坚强芽孢杆菌菌株或短小芽孢杆菌菌株。
农用化学品可以包含杀真菌剂。所述杀真菌剂可以包括烯丙菊酯(aldimorph)、氨丙膦酸(ampropylfos)、氨丙膦酸钾(ampropylfos potassium)、胺扑灭(andoprim)、敌菌灵(anilazine)、阿扎康唑(azaconazole)、腈嘧菌酯(azoxystrobin)、苯霜灵(benalaxyl)、麦锈灵(benodanil)、苯菌灵(benomyl)、苄烯酸(benzamacril)、苄烯酸异丁酯(benzamacryl-isobutyl)、苯并烯氟菌唑(benzovindflupyr)、双丙氨膦(bialaphos)、乐杀螨(binapacryl)、联苯类化合物(biphenyl)、联苯三唑醇(bitertanol)、灭瘟素(blasticidin-S)、啶酰菌胺(boscalid)、糠菌唑(bromuconazole)、乙嘧酚磺酸酯(bupirimate)、丁硫啶(buthiobate)、石硫合剂(calcium polysulfide)、卡巴西霉素(capsimycin)、敌菌丹(captafol)、克菌丹(captan)、多菌灵(carbendazim)、香芹酮(carvon)、灭螨猛(quinomethionate)、灭瘟唑(chlobenthiazone)、苯咪唑菌(chlorfenazole)、地茂散(chloroneb)、氯化苦(chloropicrin)、百菌清(chlorothalonil)、乙菌利(chlozolinate)、clozylacon、硫杂灵(cufraneb)、霜脲氰(cymoxanil)、环菌唑(cyproconazole)、嘧菌环胺(cyprodinil)、酯菌胺(cyprofuram)、咪菌威(debacarb)、双氯酚(dichlorophen)、苄氯三唑醇(diclobutrazole)、苯氟磺胺(dichlofluanid)、哒菌酮(diclomezine)、氯硝胺(dicloran)、乙霉威(diethofencarb)、甲菌定(dimethirimol)、烯酰吗啉(dimethomorph)、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇(diniconazole)、精烯唑醇(diniconazole-M)、二硝巴豆酸酯(dinocap)、二苯基胺(diphenylamine)、吡菌硫(dipyrithione)、灭菌磷(ditalimfos)、二氰蒽醌(dithianon)、十二环吗啉(dodemorph)、多果定(dodine)、敌菌酮(drazoxolon)、敌瘟磷(edifenphos)、氟环唑(epoxiconazole)、乙嘧酚(ethirimol)、土菌灵(etridiazole)、噁唑菌酮(famoxadone)、咪菌腈(fenapanil)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)、腈苯唑(fenbuconazole)、甲呋酰胺(fenfuram)、种衣酯(fenitropan)、拌种咯(fenpiclonil)、苯锈啶(fenpropidin)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、三苯基乙酸锡(fentin acetate)、三苯基氢氧化锡(fentinhydroxide)、福美铁(ferbam)、嘧菌腙(ferimzone)、氟啶胺(fluazinam)、咯菌腈(fludioxonil)、氟酰菌胺(flumetover)、氟氯菌核利(fluoroimide)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟喹唑(fluquinconazole)、调嘧醇(flurprimidol)、氟硅唑(flusilazole)、磺菌胺(flusulfamide)、氟酰胺(flutolanil)、粉唑醇(flutriafol)、灭菌丹(folpet)、三乙膦酸铝(fosetyl-aluminium)、三乙膦酸钠(fosetyl-sodium)、四氯苯酞(fthalide)、麦穗宁(fuberidazole)、呋霜灵(furalaxyl)、呋吡菌胺(furametpyr)、灭菌胺(furcarbanil)、呋菌唑(furconazole)、顺式呋菌唑(furconazole-cis)、拌种胺(furmecyclox)、双胍辛(guazatine)、六氯苯(hexachlorobenzene)、己唑醇(hexaconazole)、噁霉灵(hymexazole)、抑霉唑(imazalil)、亚胺唑(imibenconazole)、双胍辛胺(iminoctadine)、双胍辛胺对十二烷基苯磺酸盐(iminoctadine albesilate)、三乙酸双胍辛胺(iminoctadine triacetate)、iodocarb、异稻瘟净(iprobenfos)(IBP)、异菌脲(iprodione)、人间霉素(irumamycin)、稻瘟灵(isoprothiolane)、氯苯咪菌酮(isovaledione)、春雷霉素(kasugamycin)、甲氧胺菌灵(kresoxim-methyl)、铜制剂(如：氢氧化铜(copper hydroxide)、环烷酸铜(copper naphthenate)、王铜(copperoxychloride)、硫酸铜(copper sulphate)、氧化铜(copper oxide)、喹啉铜(oxine-copper)和波尔多混合剂(Bordeaux mixture)、代森锰铜(mancopper)、代森锰锌(mancozeb)、代森锰(maneb)、嘧菌腙(meferimzone)、嘧菌胺(mepanipyrim)、灭锈胺(mepronil)、叶菌唑(metconazole)、甲霜灵(metalzxyl)、磺菌威(methasulfocarb)、呋菌胺(methfuroxam)、代森联(metiram)、苯吡洛菌(metomeclam)、噻菌胺(metsulfovax)、米多霉素(mildiomycin)、腈菌唑(myclobutanil)、甲菌利(myclozolin)、二甲基二硫代氨基甲酸镍(nickel dimethyldithiocarbamate)、酞菌异丙酯(nitrothal-isopropyl)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)、呋酰胺(ofurace)、噁霜灵(oxadixyl)、奥克斯莫卡宾(oxamocarb)、恶喹酸(oxolinic acid)、氧化萎锈灵(oxycarboxim)、oxyfenthiin、多效唑(paclobutrazole)、稻瘟酯(pefurazoate)、戊菌唑(penconazole)、戊菌隆(pencycuron)、氯瘟磷(phosdiphen)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、纳他霉素(pimaricin)、粉病灵(piperalin)、多抗霉素(polyoxin)、多氧霉素(polyoxorim)、烯丙苯噻唑(probenazole)、咪鲜胺(prochloraz)、腐霉利(procymidone)、霜霉威(propamocarb)、丙醇菌素钠(propanosine-sodium)、丙环唑(propiconazole)、丙森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、吡菌磷(pyrazophos)、啶斑肟(pyrifenox)、嘧霉胺(pyrimethanil)、咯喹酮(pyroquilon)、氯吡呋醚(pyroxyfur)、喹唑菌酮(quinconazole)、五氯硝基苯(quintozene)(PCNB)、嗜球果伞素(strobilurin)、硫磺(sulphur)和硫磺制剂、戊唑醇(tebuconazole)、叶枯酞(tecloftalam)、四氯硝基苯(tecnazene)、tetcyclasis、四氟醚唑(tetraconazole)、噻菌灵(thiabendazole)、噻菌腈(thicyofen)、噻氟菌胺(thifluzamide)、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、硫氰苯甲酰胺(tioxymid)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、甲苯氟磺胺(tolylfluanid)、三唑酮(triadimefon)、三唑醇(triadimenol)、叶锈特(triazbutil)、三唑(triazole)、咪唑嗪(triazoxide)、水杨菌胺(trichlamide)、三环唑(tricyclazole)、绿草定(triclopyr)、十三吗啉(tridemorph)、肟菌酯(trifloxystrobin)、氟菌唑(triflumizole)、嗪氨灵(triforine)、烯效唑(uniconazole)、井冈霉素A(validamycin A)、乙烯菌核利(vinclozolin)、烯霜苄唑(viniconazole)、灭杀威(zarilamid)、代森锌(zineb)、福美锌(ziram)以及Dagger G、OK-8705、OK-8801、a-(1,1-二甲基乙基)-(3-(2-苯氧基乙基)-1H-1,2,4-三唑-1-乙基醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-氟-3-丙基-1H--1,2,4-三唑e-1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-a-甲基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(5-甲基-1,3-二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]-间苯]-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、(5RS,6RS)-6-羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-辛酮、(E)-a-(甲氧基亚氨基)-N-甲基-2-苯氧基-苯基乙酰胺、{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-丙基}氨基甲酸1-异丙基酯、1-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲基)-肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2-丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)-磺酰基]-4-甲基-苯、1-[[2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯苯基)-3-苯基环氧乙烷基]-甲基]-1H-1,2,4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)-3-吡咯烷基、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟甲基-1,3-噻唑-甲酰胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷甲酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫氰酸酯、2,6-二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-磺酰基]-5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-0-甲基-(3-D-甘露糖基)-a-D-吡喃葡萄糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]吡啶亚氨基-5-腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)-戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚满-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(异硫氰酸根合甲基)乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基)-1-氧代-1H-茚-2-腈、3-[2-(4-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基-四唑并[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸酯、9H-氧杂蒽-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-甲酸酰肼、双-(1-甲基乙基)-3-甲基-4-[(3-甲基苯甲酰基)-氧基]-2,5-噻吩二甲酸酯、顺式1-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,6-二甲基吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸甲酯、碳酸氢钾硼酸盐、甲烷四硫醇钠盐、1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚基-1-基)-1H-咪唑-5-甲酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)甲基N-(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸酯、N-(2,3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基对苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基-环丙烷甲酰胺、N-[[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,5-双(2-丙氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲酰胺基酰胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸-钠盐、[2-(二丙基氨基)-2-氧代乙基]-乙基硫代氨基磷酸0,0-二乙酯、苯基丙基硫代氨基磷酸0-甲酯S-苯酯、1,2,3-苯并噻二唑-7-硫代碳酸S-甲酯和螺代[2H]-1-苯并吡喃-2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-酮、N-(三氯甲基)硫基-4-环己烷-1,2-二苯甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,3-苯并二恶唑-4-基)-l-H-吡咯-3-碳腈或其任何组合。
当多肽与市售的杀真菌剂一起配制或施用时，组合物可以提供额外的保护层以增强疾病预防或防止疾病在植物中传播。多肽与杀真菌剂的组合可以保护植物免受原发性或继发性真菌感染，如果植物由于暴露于非生物胁迫或疾病而受损或弱化，则可能发生原发性或继发性真菌感染。
嗜球果伞素类杀真菌剂可以包括嗜球果伞素A、嗜球果伞素B、嗜球果伞素C、嗜球果伞素D、嗜球果伞素E、嗜球果伞素F、嗜球果伞素G、嗜球果伞素H、腈嘧菌酯、肟菌酯、甲氧胺菌灵、氟嘧菌酯、啶氧菌酯或其任何组合。
嗜球果伞素类杀真菌剂可以包括非天然存在的嗜球果伞素杀真菌剂，如腈嘧菌酯、肟菌酯、甲氧胺菌灵、氟嘧菌酯或其任何组合。例如，嗜球果伞素类杀真菌剂可以包括肟菌酯、氟嘧菌酯或啶氧菌酯。嗜球果伞素类杀真菌剂用于控制多种真菌疾病，包含水霉病、霜霉病、白粉病、叶斑病和枯萎真菌、果实腐烂和锈病。它们可用于处理多种作物，包含谷类作物、大田作物、水果、坚果、蔬菜、草坪植物和观赏植物。
三唑类杀真菌剂可以包括丙硫菌唑(prothioconazole)、咪唑(imidazole)、imidazil、咪鲜胺(prochloraz)、丙环唑(propiconazole)、氟菌唑(triflumizole)、烯唑醇(diniconazole)、氟硅唑(flusilazole)、戊菌唑(penconazole)、己唑醇(hexaconazole)、环唑醇(cyproconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、戊唑醇(tebuconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、四氟醚唑(tetraconazole)、腈苯唑(fenbuconazole)、氟环唑(epoxiconazole)、叶菌唑(metconazole)、氟喹唑(fluquinconazole)、灭菌唑(triticonazole)或其任何组合。
生物活性引发性多肽可以与嗜球果伞素类杀真菌剂和三唑类杀真菌剂组合递送，尤其是氟嘧菌酯或肟菌酯与丙硫菌唑组合。
另外，杀真菌剂可以包括腈嘧菌酯、萎锈灵(carboxin)、苯醚甲环唑、咯菌腈、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)、种菌唑(ipconazole)、精甲霜灵(mefenoxam)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、硫硅菌胺(silthiofam)、氟唑环菌胺(sedaxane)、福美双(thiram)、灭菌唑或其任何组合。
除本文所述的叶面施用型杀真菌剂外，生物活性引发性多肽还可以与杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀菌剂和杀螨剂或作为生物活性剂的任何农用化学品一起以组合形式提供。
农用化学品可以包含肥料。肥料可以包括硫酸铵、硝酸铵、硫硝酸铵、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、轻烧镁、钙质石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云质石灰石、熟石灰、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸镁钾、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石、氧化镁、尿素、尿素甲醛、尿素硝酸铵、含硫尿素、高聚物包膜尿素、异丁烯二脲、K2SO4–Mg2SO4、钾盐镁矾(kainite)、钾盐、硫酸镁石(kieserite)、泻盐、元素硫、泥灰、牡蛎碎贝壳、鱼粉、油饼、鱼粪、血粉、磷矿石、过磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪肥、蝙蝠粪肥、泥炭藓、堆肥、绿石沙、棉籽粕、羽毛粉、蟹粉、鱼乳化剂、腐殖酸或其任何组合。
肥料可以包括液体肥料或干肥料。
农用化学品可以包括微量营养素肥料材料、所述微量营养素肥料材料包括硼酸、硼酸盐、硼熔块、硫酸铜、铜熔块、螯合铜、十水四硼酸钠、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁粉、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰粉、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、锌碳酸盐、锌熔块、磷酸锌、螯合锌或其任何组合。
农用化学品可以包括杀虫剂，所述杀虫剂包括有机磷酸盐、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、杀螨剂、邻苯二甲酸酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、经卤代芳香族取代的尿素、烃酯、生物基杀虫剂或其任何组合。
当组合物包含生物刺激素时，所述生物刺激素可以包括海藻提取物、引发剂、多糖、单糖、蛋白质提取物、大豆提取物、腐殖酸、植物激素、植物生长调节剂或其任何组合。
可以使用多种着色剂，所述着色剂包含被分类为亚硝基、硝基、偶氮(包含单偶氮、双偶氮和聚偶氮)、二苯基甲烷、三芳基甲烷、氧杂蒽、甲烷、吖啶，噻唑、噻嗪、茚满胺、吲哚酚、嗪、恶嗪、蒽醌、酞菁或其任何组合的有机发色团。
组合物可以进一步包括载剂。
组合物的载剂可以包含但不限于水、泥炭、小麦、麸皮、蛭石(vermiculite)、粘土、经巴氏灭菌的土壤、碳酸钙、碳酸氢钙、白云石、石膏、膨润土、粘土、磷酸岩、磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石粉、藻酸盐、活性炭或其组合。
组合物可以呈水溶液、浆体或分散体、乳液、固体(如粉末或颗粒)的形式或任何其它期望的形式，以便将组合物施用于植物或植物部位。
可以以组合物形式提供生物活性引发性多肽，如鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽、硫蛋白(防御素家族)、超敏蛋白样HpaG、EF-Tu或促进或改变生长的其它生物活性引发性多肽(如PSKα和RHPP)，所述组合物可以被外源性地和/或内源性地施用于植物或植物部位，并提供所述植物或植物部位的增强的植物生长、生产力和改善的健康状况，如下文更详细地描述。
可以单独添加或以组合的组合物形式添加生物活性引发性多肽，所述组合物可用作向植物和/或植物部位提供益处的施剂。
通过组合，可以将多肽作为同一重组载体上的基因融合体以纯化的多肽形式进行配制和递送，或使用不同的重组载体进行配制和递送。
还可以产生生物活性引发性多肽并将其作为来自融合蛋白中的多种活性物的多肽递送至植物或植物部位。其实例包含递送由每个多肽之间的蛋白酶切割位点串联产生的多个鞭毛蛋白相关型多肽，这在本领域普通技术人员的能力范围内。此类融合蛋白可以包含本文所述的生物活性引物发性多肽(包含来自不同类别的生物活性引发性多肽)的任何组合，如鞭毛蛋白相关型多肽与RHPP的组合。生物活性引发性多肽也可以用作植物结合结构域的蛋白融合体，其可以将多肽引导至植物体内最需要多肽来对其活性产生益处的不同位置。
另外，可以将多肽添加到以合成化合物的形式提供的制剂中。
本文所述的鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽可以单独提供或以含有至少两个到多个生物活性引发性多肽的组合形式提供，从而提供在期望的宿主反应和种植系统的广泛范围内满足植物特定需求的组合物。
当组合物包含Flg生物活性引发性多肽的逆反形式(例如，RI Bt.4Q7 Flg 22(SEQID NO:376))时，所述多肽表现出增强的稳定性并且随时间推移发生较少降解，从而在植物细胞膜表面提供了更多活性，这增强了所述多肽与受体结合并被植物吸收的能力。这种Flg相关型生物活性引发型多肽的逆反形式被用于增强农业应用型制剂的稳定性，其中一个或多个Flg多肽显示出增强的抗蛋白水解切割的保护作用，这有助于组合物的总体上更大的活性和保存期限。
当多肽包含RHPP多肽时，组合物可以进一步包括鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。RHPP多肽可以包括SEQ ID NO:600。鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1-525、532、534、536、538、540、571-586和751-752中的任何一个或其任何组合。鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以包括SEQ ID NO:226、571和752中的任何一个。在一些情况下，RHPP多肽可以包括SEQ ID NO:600，并且鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可以包括SEQ ID NO:226。
多肽可以与辅助多肽组合配制。可以将特征信息多肽(SEQ ID NO:542-548)、信号锚分选多肽(SEQ ID NO:549-562)和分泌多肽(SEQ ID NO:563-570)与所述生物活性引发性多肽组合，从而将多肽/肽(表1-5)靶向植物细胞膜表面以改善Flg相关型受体的结合和激活。这意味着多肽的有效递送和与植物的结合提供了促进生长的益处，以及增强了对植物或植物部位的保护。
例如，本文所述的超敏蛋白或HpaG样生物活性引发性多肽可以与表6-8所述的辅助多肽(特征信息多肽(SEQ ID NO:542-548)、信号锚分选多肽(SEQ ID NO:549-562)和/或分泌多肽(SEQ ID NO:563-570))组合使用。这些与HpaG样生物活性引发性多肽组合使用的辅助多肽可用于将所述超敏蛋白样生物活性引发性多肽靶向并递送至植物细胞膜表面，从而增强与植物细胞膜的接触并提供有利于使超敏蛋白样(HpaG样)有效接触并进入植物或植物细胞环境(质外体)中的导管。
EF-Tu多肽中的一个或多个多肽可以任选地与鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽组合。一个或多个EF-Tu多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:616和/或617。鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:1-525、532、534、536、538、540、571-586和751-753中的任何一个或其任何组合。例如，鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:571。作为另一个实例，组合物可以包括包含SEQ ID NO:616和617的EF-Tu多肽，以及包含SEQ ID NO:226、571、572或其组合的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。作为另一个实例，可以将具有SEQ ID NO:616和/或617的EF-Tu多肽与具有SEQ IDNO:226的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽组合。可替代地，组合物可以仅包括一个或多个EF-Tu多肽(例如，包括SEQ ID NO:616和/或617)。可以通过N端乙酰化对EF-Tu多肽(例如，SEQ ID No:616和617)进行进一步修饰。
另外，可以将EF-Tu多肽或EF-Tu多肽和鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽与超敏蛋白或超敏蛋白样多肽组合。例如，超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列可以包括SEQID NO:587。
组合物可以包括以下组合中的任何一种：(a)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571、295、300、293和580；或295、300、293和580；或571、295、293和580；或571、300、293和580；或571、293和580；或571、295、293；或(b)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及纤维二糖、纤维素、甲壳素、壳聚糖或其任何组合；或(c)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:591；或(d)所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587，以及所述PSK多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；或(e)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752或571或其任何组合，以及所述EF-Tu多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617；或(f)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、752或571或其任何组合；或(g)所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或(h)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、226、752或571或其任何组合，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或(i)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600。
IV.应用
本文所述的农业组合物和方法可以用于任何物种的植物和/或其种子。所述组合物和方法通常用于农学上重要的种子。
种子可以是能够生长转基因植物的转基因种子，所述转基因种子掺入了转基因事件，所述转基因事件赋予例如对特定除草剂或除草剂组合的耐受性、增强抗病性、增强对昆虫、干旱、胁迫的耐受性和/或提高产量。
种子可以包括繁殖性状，包含例如抗病育种性状。
在一些情况下，种子包含至少一个转基因性状和至少一个繁殖性状。
生物活性引发性多肽组合物和用于施用所述多肽的方法可用于处理任何合适的种子类型，包含但不限于中耕作物和蔬菜。例如，一个或多个植物或植物部位或一个或多个植物的种子可以包括蕉麻(马尼拉麻)(Musa textilis)、饲料用苜蓿(Medicago sativa)、育种用苜蓿(Medicago sativa)、巴旦杏(Prunus dulcis)、茴芹种子(Pimpinellaanisum)、野苹果(Malus sylvestris)、杏(Prunus armeniaca)、槟榔(areca/betel nut)(Areca catechu)、秘鲁胡萝卜(Arracacia xanthorrhiza)、竹芋(Maranta arundinacea)、朝鲜蓟(Cynara scolymus)、芦笋(Asparagus officinalis)、鳄梨(Persea americana)、珍珠粟(bajra/pearl millet)(Pennisetum americanum)、班巴拉花生(Vignasubterranea)、香蕉(Musa paradisiaca)、大麦(Hordeum vulgare)、粮食用干燥可食用大豆(Phaseolus vulgaris)、未成熟时收割的大豆(菜豆属和豇豆属(Phaseolus and Vignaspp.))、饲料甜菜(beet/mangel)(Beta vulgaris)、红甜菜(Beta vulgaris)、糖甜菜(Betavulgaris)、饲料用糖甜菜(Beta vulgaris)、育种用糖甜菜(Beta vulgaris)、佛手柑(Citrus bergamia)、槟榔(Areca catechu)、黑胡椒(Piper nigrum)、黑荆(Acaciamearnsii)、不同品种的黑莓(蔷薇科悬钩子属(Rubus spp.))、蓝莓(越橘属(Vacciniumspp.))、巴西坚果(Bertholletia excelsa)、面包树(Artocarpus altilis)、干燥的蚕豆(Vicia faba)、未成熟时收割的蚕豆(Vicia faba)、西兰花(Brassica oleraceavar.botrytis)、高粱(Sorghum bicolor)、扫帚高粱(Sorghum bicolor)、抱子甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、红色和白色皱叶甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、大白菜(Brassica chinensis)、饲料用卷心菜(油菜属(Brassica spp.))、可可树(cacao/cocoa)(Theobroma cacao)、甜瓜(Cucumis melo)、葛缕子(Carum carvi)、小荳蔻(Elettaria cardamomum)、刺菜蓟(Cynara cardunculus)、长豆角(Ceratonia siliqua)、可食用胡萝卜(Daucus carota spp.sativa)、饲料用胡萝卜(Daucus carota sativa)、腰果(Anacardium occidentale)、木薯(cassava/manioc)(Manihot esculenta)、蓖麻(Ricinus communis)、花椰菜(Brassica oleraceavar.botrytis)、根芹菜(Apium graveolens var.rapaceum)、西芹(Apium graveolens)、佛手瓜(Sechium edule)、所有品种的樱桃(李属(Prunus spp.))、栗子(Castanea sativa)、鹰嘴豆(chickpea/gram pea)(Cicer arietinum)、菊苣(Cichorium intybus)、绿色菊苣(Cichorium intybus)、干辣椒(所有品种)(辣椒属(Capsicum spp.)(青椒(annuum)))、青辣椒(所有品种)(辣椒属(青椒))、锡兰肉桂(Cinnamomum verum)、香橼(Citrus medica)、香茅(Cymbopogon citrates；Cymbopogon nardus)、柑橘(Citrus reticulata)、丁香(Eugenia aromatica；Syzygium aromaticum)、饲料用丁香(所有品种)(Trifolium spp.)、育种用丁香(所有品种)(Trifolium spp.)、可可树(cacao/cocoa)(Theobroma cacao)、椰子树(Cocos nucifera)、芋头(Colocasia esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、所有品种的可乐果(Cola acuminata)、甘蓝型油菜(colza/rapeseed)(Brassica napus)、谷物玉米(corn/maize)(Zea mays)、青贮饲料玉米(corn/maize)(Zea mays)、蔬菜玉米(corn/maize)(Zea mays)、沙拉玉米(莴苣缬草(Valerianella locusta))、所有品种的棉花(Gossypium spp.)、所有品种的棉花籽(Gossypium spp.)、谷物豇豆(Vignaunguiculata)、收割时未成熟的豇豆(Vigna unguiculata)、蔓越莓(Vaccinium spp.)、水芹(Lepidium sativum)、黄瓜(Cucumis sativus)、所有品种的黑加仑(Ribes spp.)、番荔枝(Annona reticulate)、芋头(Colocasia esculenta)、枣椰树(Phoenix dactylifera)、鼓槌树(Moringa oleifera)、高粱(durra/sorghum)(Sorghum bicolour)、硬质小麦(Triticum durum)、花生(Vigna subterranea)、芋(edo/eddoe)(Xanthosoma spp.；Colocasia spp.)、茄子(Solanum melongena)、莴苣(Cichorium endivia)、茴香(Foeniculum vulgare)、胡芦巴(Trigonella foenum-graecum)、无花果(Ficus carica)、榛果(filbert/hazelnut)(Corylus avellana)、菲奎叶纤维(Furcraea macrophylla)、纤维亚麻(Linum usitatissimum)、油籽亚麻(亚麻籽)(Linum usitatissimum)、formio(新西兰亚麻)(Phormium tenax)、干大蒜(Allium sativum)、青蒜(Allium sativum)、天竺葵(Pelargonium spp.；Geranium spp.)、姜(Zingiber officinale)、所有品种的醋栗(Ribesspp.)、葫芦(Lagenaria spp；Cucurbita spp.)、鹰嘴豆(gram pea/chickpea)(Cicerarietinum)、葡萄(Vitis vinifera)、葡萄柚(Citrus paradisi)、葡萄干用葡萄(Vitisvinifera)、餐桌用葡萄(Vitis vinifera)、酿酒用葡萄(Vitis vinifera)、利坚草(Lygeumspartum)、果园草(Dactylis glomerata)、苏丹草(Sorghum bicolor var.sudanense)、花生(groundnut/eanut)(Arachis hypogaea)、番石榴(Psidium guajava)、高粱(guineacorn/orghum)(Sorghum bicolor)、榛果(hazelnut/filbert)(Croylus avellana)、大麻纤维(Cannabis sativa spp.indica)、马尼拉麻(蕉麻)(Musa textilis)、柽麻(Crotalariajuncea)、大麻籽(大麻)(Cannabis sativa)、灰叶剑麻(Agave fourcroydes)、指甲花(Lawsonia inermis)、蛇麻(Humulus lupulus)、蚕豆(Vicia faba)、辣根(Armoraciarusticana)、杂交玉米(Zea mays)、靛蓝(Indigofera tinctoria)、茉莉(Jasminum spp.)、洋姜(Helianthus tuberosus)、高粱(jowar/sorghum)(Sorghum bicolor)、黄麻(Corchorus spp.)、羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)、木棉(Ceibapentandra)、洋麻(Hibiscus cannabinus)、球茎甘蓝(Brassica oleraceavar.gongylodes)、薰衣草(Lavandula spp.)、韭菜(Allium ampeloprasum；lliumporrum)、柠檬(Citrus limon)、柠檬草(Cymbopogon citratus)、扁豆(Lens culinaris)、所有品种的胡枝子(Lespedeza spp.)、莴苣(Lactuca sativa var.capitata)、酸青柠(Citrus aurantifolia)、甜青柠(Citrus limetta)、亚麻籽(油籽亚麻)(Linumusitatissimum)、甘草(Glycyrrhiza glabra)、荔枝(Litchi chinensis)、枇杷(Eriobotrya japonica)、所有品种的羽扇豆(Lupinus spp.)、澳洲胡桃(Macadamia/Queensland nut)(Macadamia spp.ternifolia)、肉豆蔻(Myristica fragrans)、龙舌兰(Agave atrovirens)、玉米(maize/corn)(Zea mays)、青贮饲料用玉米(Zea mays)、玉米(鸟类)(Zea mays)、普通玉米(Zea mays)、柑橘(Citrus reticulata)、饲料甜菜(mangel/fodder beet)(Beta vulgaris)、芒果(Mangifera indica)、木薯(manioc/cassava)(Manihot esculenta)、混合粮(maslin/mixed cereals)(小麦属(Triticum spp.)和黑麦属(Secale cereale)的混合物)、欧楂(Mespilus germanica)、除西瓜以外的甜瓜(Cucumismelo)、糜糠(Sorghum bicolor)、印度珍珠粟(Pennisetum americanum)、芦苇粟(Pennisetum americanum)、指形粟(Eleusine coracana)、黄粟(Setaria italica)、日本粟(Echinochloa esculenta)、珍珠粟(珍珠粟、芦苇粟)(Pennisetum americanum)、黄米(Panicum miliaceum)、所有品种的薄荷(Mentha spp.)、所有品种的水果桑椹(Morusspp.)、桑蚕(Morus alba)、蘑菇(Agaricus spp.；Pleurotus spp.；Volvariella)、芥末(Brassica nigra；Sinapis alba)、油桃(Prunus persica var.nectarina)、新西兰亚麻(formio)(Phormium tenax)、黑芝麻(Guizotia abyssinica)、肉豆蔻(Myristicafragrans)、饲料燕麦(Avena spp.)、油棕榈树(Elaeis guineensis)、秋葵(Abelmoschusesculentus)、橄榄(Olea europaea)、洋葱种子(Allium cepa)、干洋葱(Allium cepa)、绿洋葱(Allium cepa)、鸦片(Papaver somniferum)、甜橙(Citrus sinensis)、苦橙(Citrusaurantium)、观赏植物(各种)、扇叶树头榈(Borassus flabellifer)、棕榈仁油(Elaeisguineensis)、棕榈油(Elaeis guineensis)、西谷椰子(Metroxylon sagu)、木瓜(papaya/pawpaw)(Carica papaya)、欧防风(Pastinaca sativa)、粮食用干燥可食用豌豆(Pisumsativum)、未成熟时收割的豌豆(Pisum sativum)、桃(Prunus persica)、花生(peanut/groundnut)(Arachis hypogaea)、梨(Pyrus communis)、山核桃(Carya illinoensis)、黑胡椒(Piper nigrum)、干辣椒(Capsicum spp.)、柿(Diospyros kaki；Diospyrosvirginiana)、木豆(Cajanus cajan)、菠萝(Ananas comosus)、开心果(Pistacia vera)、车前草(Musa sapientum)、李子(Prunus domestica)、石榴(Punica granatum)、柚子(Citrusgrandis)、罂粟籽(Papaver somniferum)、马铃薯(Solamum tuberosum)、棕榈仁油(Elaeisguineensis)、甜马铃薯(Ipomoea batatas)、梅干(Prunus domestica)、可食用南瓜(Cucurbita spp.)、饲料用南瓜(Cucurbita spp.)、除虫菊(Chrysanthemumcinerariaefolium)、白坚木(Aspidosperma spp.)、澳洲胡桃(Macadamiaspp.ternifolia)、柑橘(Cydonia oblonga)、金鸡纳树(Cinchona spp.)、藜麦(Chenopodium quinoa)、苎麻(Boehmeria nivea)、菜籽(rapeseed/colza)(Brassicanapus)、所有品种的树莓(Rubus spp.)、红甜菜(Beta vulgaris)、红顶草(Agrostisspp.)、苎麻(Boehmeria nivea)、大黄(Rheum spp.)、水稻(Oryza sativa；Oryzaglaberrima)、玫瑰(Rose spp.)、橡胶树(Hevea brasiliensis)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)(Brassica napus var.napobrassica)、黑麦(Secale cereale)、黑麦草种子(Loliumspp.)、红花(Carthamus tinctorius)、红豆草(Onobrychis viciifolia)、婆罗门参(Tragopogon porrifolius)、人参果(Achras sapota)、柑橘(mandarin/tangerine)(Citrus reticulata)、鸦葱(black salsify)(Scorzonera hispanica)、芝麻(Sesamumindicum)、乳木果(shea butter/nut)(Vitellaria paradoxa)、剑麻(Agave sisalana)、高粱(Sorghum bicolor)、扫帚高粱(Sorghum bicolor)、硬秆高粱(Sorghum bicolor)、玉米高粱(Sorghum bicolor)、高粱(jowar)(Sorghum bicolor)、甜高粱(Sorghum bicolor)、大豆(Glycine max)、大豆草(Glycine max)、斯卑尔脱小麦(Triticum spelta)、菠菜(Spinacia oleracea)、南瓜(Cucurbita spp.)、草莓(Fragaria spp.)、糖甜菜(Betavulgaris)、饲料用糖甜菜(Beta vulgaris)、育种用糖甜菜(Beta vulgaris)、饲料用甘蔗(Saccharum officinarum)、糖或酒精用甘蔗(Saccharum officinarum)、茅草甘蔗(Saccharum officinarum)、饲料用向日葵(Helianthus annuus)、油籽向日葵(Helianthusannuus)、柽麻(Crotalaria juncea)、瑞典甘蓝(Brassica napus var.napobrassica)、饲料用瑞典甘蓝(Brassica napus var.napobrassica)、甜玉米(Zea mays)、甜青柠(Citruslimetta)、甜辣椒(Capsicum annuum)、甜马铃薯(Lopmoea batatas)、甜高粱(Sorghumbicolor)、柑橘(Citrus reticulata)、箭叶黄体竽(Xanthosoma sagittifolium)、木薯(tapioca/cassava)(Manihot esculenta)、芋头(Colocasia esculenta)、茶树(Camelliasinensis)、苔麸(Eragrostis abyssinica)、梯牧草(Phleum pratense)、烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、三叶草(Lotus spp.)、饲料用黑小麦(小麦和黑麦杂合物)、油桐(Aleurites spp.；Fordii)、可食用萝卜(Brassica rapa)、饲料用萝卜(Brassica rapa)、地桃花(刚果黄麻)(Urena lobata)、香草(Vanilla planifolia)、粮食用野豌豆(Vicia sativa)、胡桃(Juglans spp.，尤其是Juglans regia)、西瓜(Citrulluslanatus)、小麦(Triticum aestivum)、山药(Dioscorea spp.)或马黛茶(Ilexparaguariensis)。
本文公开的组合物和方法也可以应用于草皮草、观赏草、花卉、观赏植物、树木和灌木。
包括生物活性引发性多肽的组合物还适用于苗圃、草坪和花园、花卉栽培或切花工业，并提供增强植物生产力、保护健康、活力和寿命的益处。例如，它们可以应用于多年生植物、一年生植物、强制性鳞茎或假鳞茎、草药、地被植物、树木、灌木、观赏植物(例如，兰花等)、热带植物和苗木。
包括生物活性引发性多肽的组合物适合于处理植物、植物部位和一个或多个植物繁殖材料，例如任何植物或植物部位，如种子、根、茎、花器官、根茎(root stock)、接穗、鳞茎、假鳞茎、根茎(rhizome)、块茎等。
生物活性引发性多肽可以用作种子处理剂，以治疗多种害虫、疾病、营养缺乏症，同时增强植物的生长和生产力。
种子包衣或拌料组合物可以是例如施用有常规添加剂的液体载剂组合物、浆液组合物或粉末组合物，所述常规添加剂被提供来使种子处理剂具有粘性，从而粘附并包被种子。用于种子组合物的合适的添加剂包括：滑石、石墨、树胶、稳定剂聚合物、包衣剂聚合物、整理剂聚合物、用于种子流动和可种植性的光滑剂、美容剂和纤维素材料(如羧甲基纤维素等)。生物活性引发性多肽种子处理剂可以进一步包括着色剂和其它此类添加剂。
生物活性引发性多肽可以以种子处理剂的形式单独施用，也可以与其它添加剂(如杀真菌剂、杀虫剂、孕育剂、植物生长调节剂、促进植物生长的微生物、肥料和肥料增强剂、种子营养素、生物防治剂、除草剂解毒剂和幼苗疾病处理剂)以及其它常规的种子处理剂组合施用。
可以以合适的载剂(如水)或对种子或环境无害的粉末形式将本文所述的种子处理剂组合物施用于种子。然后以常规方式种植种子。
优选的种子处理剂(如Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226或SEQ ID NO:571)、Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)和Gm.RHPP(SEQ ID NO:600))可用于增强幼苗发育、减少发芽时间、增加发芽种子的数量以及提高幼苗的生存能力。另外，种子处理剂组合物增强针对微生物基疾病的种子保护，已知所述微生物基疾病与种子或种子周围的土壤接触并在早期幼苗形成期间传播。
种子处理剂组合物可以包括本文所述的多肽和杀真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、生物防治剂、生物刺激素、微生物或其任何组合。
种子处理剂组合物可以包括本文所述的多肽和噻虫胺、坚强芽孢杆菌、甲霜灵或其任何组合。
种子处理剂组合物可以包括本文所述的多肽、噻虫胺和氟吡菌酰胺。
种子处理剂可以包括本文所述的多肽、甲霜灵和氟吡菌酰胺。
可以将生物活性引发性多肽以溶液形式直接施用于种子，或与其它市售添加剂组合施用于种子。可以将含有水溶性多肽的溶液以种子浆液或种子浸泡液的形式喷洒或以其它方式施用于种子。含有可溶性生物活性引发性多肽的固体或干燥材料也可用于在幼苗早期形成过程中促进有效的幼苗发芽、生长和保护。
生物活性引发性多肽可以与增溶性载剂(如水、缓冲液(例如，柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液)和其它处理剂(即，醇、其它溶剂))或任何增溶剂一起配制。另外，在组合物中可以使用少量的干燥剂增强剂，如低级醇等。也可以少量(0.5％v/v或更少)添加表面活性剂、乳化剂和防腐剂，以增强种子包衣产品的稳定性。
可以使用任何市售种子处理机器来施用含有生物活性引发性多肽的种子处理剂，或者也可以使用任何一种或多种可接受的非商业化方法(如使用注射器或任何其它种子处理装置)来施用所述种子处理剂。可以使用温特斯泰格HEGE11(温特斯泰格公司(Wintersteiger AG)，奥地利，德国)执行使用生物活性引发性多肽进行的常规种子处理剂包被程序，并将其施用于主要农作物(即玉米、大豆、小麦、水稻和各种蔬菜)的种子。这种种子处理机器的能力可以容纳大量不同的种子类型、大小和数量的种子(20–3000克)。种子被装入种子处理机的钵中。钵的选择取决于所需的处理种子量和钵的大小：大的14.5升钵(每次包被500-3000克种子)；中等的7升钵(每次包被80-800克种子)；和小的1升钵(每次包被20-100克种子)。也可以使用其它较大的种子处理系统。
通过利用离心包被装置施加离心力，种子朝着可旋转钵的径向周边分布。定位在钵底部的旋转盘将种子处理剂均匀地分布在种子上。在这一点上，开始旋转周期，使种子围绕钵中心旋转一圈，以均匀地包被种子。在种子均匀分布在撒播机周围之后，开始种子处理剂包被过程。当圆盘在可旋转的钵内旋转时，可以将种子处理剂样品材料(如粉末状、半液体、液体或浆状)应用到可旋转的圆盘上，所述可旋转的钵用于均匀地分配种子处理剂，从而提供均匀的种皮并包被种子表面。
可以在种子包被期间提供使用压缩空气(2-6巴)进行输送的恒定气流，从而有助于均匀地包被碗中的种子。包被种子的时间长短取决于种子的量、种子处理剂的粘度和处理中使用的种子的类型。种子处理剂计算器用于调整大多数主要作物和商业作物以及所施用的种子处理剂类型的所有体积。
可以使用多种方法包被种子，所述方法包含但不限于将含有生物活性引发性多肽的水溶液倾倒或泵送、雾化或喷洒在种子上或种子上方，使用或不使用传送带系统将所述水溶液喷洒或施用于种子层上。合适的混合装置包含滚筒、混合槽或转鼓、或其它流体施用装置(包含用于在包被时容纳种子的槽或转鼓)。
在种子已经被处理和干燥之后，将种子分配到一个或多个更大的存储容器中。将种子风干或用连续的气流吹过种子进行干燥。然后将种子转移到单独的容器或袋子中，以进行运输、转移或存储。
可以进一步提供生物活性引发性多肽，将其以施用于植物或植物部位周围的区域的叶面喷剂或种子处理剂的形式递送至植物表面或植物质膜。
一个或多个生物活性引发性多肽制剂也可以以种子处理剂施用的形式提供，或在基质上提供，如固定或浸渍在颗粒或颗粒体(如在播散处理中使用的颗粒体)上。
可以使用外源性施用(如喷剂、土壤处理剂、犁沟、种子处理剂、浸洗或洗涤)或以内源性施用(如注射、接种、灌溉、渗透等)的形式将本文所述的生物活性引发性多肽施用于植物或植物部位。
可以将多肽直接施用于植物或施用于植物或植物部位周围的区域。
也可以在基质材料上提供多肽，然后将其提供给植物或植物部位。
还可以提供含有鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽的组合物，通过各种递送方法(例如，注射、接种或渗透(例如，渗透到叶子上的气孔中))将其直接递送到植物、植物组织或植物细胞中。还可以按以下方式提供这些多肽：多肽可以在植物中全身性移动并影响植物中的信号传导级联，所述信号传导级联随后对植物或植物部位产生有益的和生产性的结果。
表4或表5中所述的逆反型Flg生物活性引发性多肽可以单独使用，或与本文所述的任何其它鞭毛蛋白、鞭毛蛋白相关型或其它生物活性引发性多肽序列组合使用。这种RI鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽的组合可用作植物保护剂以及植物生长促进剂。
特征信息辅助多肽(SEQ ID NO:542-548；表6)、信号锚分选辅助多肽(SEQ ID NO:549-562，表7)和分泌辅助多肽(SEQ ID NO:563-570；表8)可以与本文所述的鞭毛蛋白编码(表1)、芽孢杆菌来源的鞭毛蛋白的N和/或C端保守序列(表2)、鞭毛蛋白相关型多肽：Flg22和FlgII-28(表3)、Flg22和FlgII-28的逆反形式(表4)或任何其它Flg(表5)中的任何一个组合使用。
例如，Flg相关型生物活性引发性多肽中的任何一个或其组合可以以单独制剂的形式提供，并同时、依次以单独制剂的形式施用，或者以含有表6-8中所述的辅助序列的一个或多个融合蛋白的形式提供，并直接或单独施用于植物或植物部位。
当外源性地将超敏蛋白样多肽或RHPP多肽(例如以叶面喷剂的形式)施用于植物表面时，或外生地(施用到植物细胞膜外部的空间中)或内源性地(植物细胞/植物细胞膜内部)提供超敏蛋白样多肽或RHPP多肽时，所述多肽可以提供功能性益处。当用作种子处理剂时，RHPP多肽也可以提供功能性益处。
超敏蛋白样、HpaG样多肽的叶面施用或犁沟施用可用于增强植物的生长、增加生物量以及绿色或叶绿素的产生。
可以提供一个或多个PSKα生物活性引发性多肽，将其以施用于植物、植物部位或植物细胞周围的区域的叶面喷剂或种子处理剂的形式递送至植物表面/植物质膜。
还可以提供含有PSKα生物活性引发性多肽的组合物，通过各种递送方法(例如，注射、接种或渗透(例如，直接或先后添加到细胞培养物中))将其递送到植物、植物组织或植物细胞中。
V.使用方法
提供了用于提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的方法。所述方法可以包括将本文所述的多肽或组合物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构。
可替代地，所述方法可以包括将本文所述的多肽或组合物施用于植物生长培养基，从而提高将在所述植物生长培养基中生长的植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高先天性免疫反应和/或改变将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位的植物结构。
另一方法包括将本文所述的重组微生物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构。所述重组微生物表达所述多肽，并且与相同条件下相同种类的野生型微生物中的多肽的表达水平相比，所述多肽的表达提高。
还提供了使用生物活性引发性多肽的方法来增加田间、果园、种植床、苗圃、林地、农场、草坪、花园、花园中心或耕地的整体植物生产力。使用生物活性引发性多肽的施剂和方法还可用于提高多种作物(单子叶植物和双子叶植物)(例如玉米、小麦、大米、甘蔗、大豆、高粱、马铃薯和各种蔬菜)中的植物生长、健康和生产力。
还通过直接施用多肽提供了“生物活性多肽引发性”方法，所述多肽可以被外源性地施用于植物细胞表面或内源性地施用于植物和/或植物细胞的内部。提供多肽以将其递送至植物表面或质细胞膜或递送至植物、植物组织或细胞的内部，并且所述多肽可用于调节导致增强的生长表型(如整体生物量、营养生长、种子灌浆、种子大小和种子数量的增加，其有助于增加农作物的总产量)的发育过程。
施用以农业制剂形式提供的逆反型Flg多肽可以导致植物免受疾病和非生物胁迫的保护增强，同时协同地增强生长、生产力和产量，同时在更长的时间内保持增加的植物健康和增强的植物性能。
Flg相关型多肽的原生L(表3)或逆反D(表4)形式的选择可以取决于环境、植物/作物或植物/作物与环境的组合。另外，生长季节期间的处理剂施用(例如，叶面喷剂施用)的时机都是相关的考虑因素。逆反型Flg生物活性引发性多肽对细胞表面膜具有增强的结合亲和力。由于这些特征，RI形式的Flg生物活性引发性多肽可用于改善植物或植物部位中的非生物胁迫耐受性。
另外，逆反形式的RI Ec.Flg22和RI Bt.4Q7Flg22可用于在干旱和高温胁迫条件下刺激气孔的闭合，并在所述条件下提高产量。当环境条件不利时，使用在环境胁迫期间施用于植物的与Flg相关型生物活性引发性多肽控制气孔关闭可以帮助调节水分损失并稳定植物中的膨化压力。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个；逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个；或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个；逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个；或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括FlgII-28多肽和/或EF-Tu多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226、571或752中的任何一个，所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫力。在所述方法中，所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-766中的任何一个或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫或线虫的侵害。这些是对活性氧表现出增加的活性的具有突变序列的多肽。例如，所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574、751和752中的任何一个或其任何组合。
所述疾病可以包括亚洲柑橘绿化、黄龙病(HLB)、亚洲大豆锈病、核盘菌茎腐病(或白霉病)、假单胞菌叶斑或尾孢属叶枯萎病。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括Flg22多肽和FlgII-28多肽，所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合而所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合。所述多肽或所述组合物可以进一步包括逆反型Flg22多肽、逆反型FlgII-28多肽或其组合，所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合而所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括RHPP多肽和/或RI RHPP多肽，从而增加所述植物或植物部位的产量、生长和/或生产力和/或改变植物结构。
当所述方法包含包括RHPP多肽和/或RI RHPP多肽的多肽或组合物时，所述生长可以包括根生长、根长度、根系生物量、结瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合。当所述多肽或组合物包括RHPP多肽时，所述RHPP多肽的氨基酸序列可以包括SEQ ID NO:600。
当所述方法包含包括RHPP多肽和/或RI RHPP多肽的多肽或组合物时，所述植物可以包括大豆，所述生长可以包括总体根长度、根系生物量、结瘤、每株植物的根瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合，并且所述生产力可以包括总荚果的数量或每个节点的荚果的数量。
植物结构可以包括对所述植物或植物部位产生的有益结果。例如，有益的结果可以包含植物田地的种植密度能力提高。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括超敏蛋白样多肽或RHPP多肽，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括PSK多肽，从而在易于受热和干旱的环境中提高所述植物或所述植物部位的产量。
可以仅在花形成之前或在开花前阶段施用所述多肽、所述组合物或所述重组微生物。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括PSK多肽、RHPP、超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其组合，从而增加所述植物或所述植物部位的生长。
所述生长可以包括根和花的顶端分生组织、花器官的产生、果实的发育、果实的产生、花器官的数量、花器官的大小或其组合。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括PSK多肽和超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，从而在易于对植物生长产生胁迫和无胁迫条件的环境中提高所述植物或所述植物部位的生长和生产力。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括硫蛋白或硫蛋白样多肽。
硫蛋白或硫蛋白样多肽可以与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞。
在所述方法中，保护所述植物或所述植物部位免受疾病的侵害可以包括在所述植物或植物部位之上或在所述植物或植物部位之中发生的预防性治疗、治疗、预防和疾病进展减慢。
所述疾病可以包括亚洲柑橘病(HLB)、柑橘溃疡病、尾孢属叶枯萎病或细菌引起的疾病。
所述细菌引起的疾病包括细菌性叶枯萎病、细菌性叶条斑病、细菌性茎腐烂、细菌性叶斑病、细菌性叶焦枯病、细菌性顶部腐烂、细菌性条纹病、巧克力斑病、戈斯氏细菌性萎蔫病和枯萎病、荷花斑病、紫色叶鞘、种子腐烂、幼苗枯萎病、斯图尔特病(细菌性萎蔫病)、玉米矮化病、热萎病、皮尔斯病、柑橘杂色萎黄病、柑橘溃疡病、丁香假单胞菌血清变型或其组合。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以进一步包括鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-525和571-573中的任何一个或其任何组合。
在所述方法中，可以将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物外源性地施用于植物、植物部位或植物生长培养基。
在所述方法中，可以将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物内源性地施用于植物或植物部位。
所述植物部位可以包含植物细胞、叶、枝、茎、花、叶子、花器官、果实、花粉、蔬菜、块茎、根茎(rhizome)、球茎、鳞茎、假鳞茎、荚果、根、根块、根茎(root stock)、接穗或种子。
在所述方法中，可以将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于所述植物的表面、所述植物的叶子或所述植物的种子的表面。
在所述方法中，可以将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于种子的表面，并从所述种子生长出所述植物或所述植物部位。
在所述方法中，可以将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物以叶面施用形式施用；
所述植物可以是水果植物或蔬菜植物，并且所述方法提高了水果或蔬菜的产量。
在生长季节期间两次或多次施用生物活性引发性多肽的方法中，第一次施用可以发生在V2发育阶段期间或之前，随后的施用可以发生在植物开花之前。例如，可以在VE发育阶段期间/之前、在V1发育阶段期间或之前、在V2发育阶段期间或之前、在V3发育阶段期间或之前、在V4发育阶段期间或之前、在V5发育阶段期间或之前、在V6发育阶段期间或之前、在V7发育阶段期间或之前、在V8发育阶段期间或之前、在V9发育阶段期间或之前、在V10发育阶段期间或之前、在V11发育阶段期间或之前、在V12发育阶段期间或之前、在V13发育阶段期间或之前、在V14发育阶段期间或之前、在V15发育阶段期间或之前、在VT发育阶段期间或之前、在R1发育阶段期间或之前、在R2发育阶段期间或之前、在R3发育阶段期间或之前、在R4发育阶段期间或之前、在R5发育阶段期间或之前、在R6发育阶段期间或之前、在R7发育阶段期间或之前或在R8发育阶段期间或之前以种子处理剂的形式进行第一次施用。举例来说，第一次施用可以发生在发芽阶段期间或之前、幼苗阶段期间或之前、分叶阶段期间或之前、茎伸长阶段期间或之前、孕穗阶段期间或之前或抽穗阶段期间或之前。例如，如果使用Feekes量表来识别谷物作物的生长阶段，则第一次施用可以发生在阶段1期间或之前、阶段2期间或之前、阶段3期间或之前、阶段4期间或之前、阶段5期间或之前、阶段6期间或之前、阶段7期间或之前、阶段8期间或之前、阶段9期间或之前、阶段10期间或之前、阶段10.1期间或之前、阶段10.2期间或之前、阶段10.3期间或之前、阶段10.4期间或之前或阶段10.5期间或之前。
非生物胁迫
非生物胁迫导致农作物大量损失，并可能导致农作物产量和单产潜力的重大减少。本文所述的生物活性引发性多肽和组合物可以用作化学引发剂，从而增加植物对一种或多种非生物胁迫的耐受性。因此，鞭毛蛋白多肽、源自芽孢杆菌属的Flg22或FlgII-28的鞭毛蛋白相关型多肽、源自大肠杆菌和其它生物的Flg15和Flg22(表5)以及源自大豆的RHPP多肽(表13至15)可用于增加植物、植物群、植物田地和/或植物部位对非生物胁迫的耐受性。本文所述的多肽和组合物赋予植物或植物部位非生物胁迫耐受性。被赋予植物或植物部位的非生物胁迫耐受性所针对的非生物胁迫包含但不限于：温度胁迫、辐射胁迫、干旱胁迫、寒冷胁迫、盐胁迫、渗透胁迫、营养缺乏或高金属胁迫和由于水分亏缺、洪水或缺氧而引起的水分胁迫。将使用本文所述的生物活性引发性多肽和组合物的化学引发剂施用于植物或植物部位，从而提供了一种通用的方法来保护植物或植物部位免受单个、多个或组合的非生物胁迫。
当以地上叶面施用的形式施用于植物、植物部位、植物根、植物种子、植物生长培养基或植物周围的区域或植物种子周围的区域时，本文所述的多肽和组合物可以有效保护植物免受非生物胁迫的侵害。例如，对于树木而言，可以在树木的不同生长时期进行一次或多次施用，所述不同生长时期包含：冲洗前、冲洗中或冲洗后的时期；座果前、座果中或座果后的时期；或果实收获之前或之后的时期。
本文描述的方法以化学方式引发植物以保护植物免受一种或多种非生物胁迫的侵害，使得植物已经准备并启动了防御机制，所述防御机制可以被更快地激活并增加对一种非生物胁迫或同时发生(或在生长季节的不同时间发生)的多种胁迫的耐受性。
可以在过热胁迫、水分胁迫和干旱胁迫期间以叶面喷剂施用的形式(或使用其它施用方法，例如根浸)外部施用本文所述的逆反形式的Flg22多肽，并且所述多肽用于保护植物免受干旱、高温胁迫和/或其它非生物胁迫的侵害，这些胁迫可能会影响气孔孔径和振荡，而气孔孔径和振荡通常伴随着植物蒸腾作用的丧失而发生。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合；逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个或其任何组合；逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
在所述方法中，所述多肽或所述组合物可以包括：RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600、603、604或其任何组合；Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:602；逆反型RHPP多肽，并且所述RIRHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:601、605、606或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
所述非生物胁迫可以包括高温胁迫、温度胁迫、辐射胁迫、干旱胁迫、寒冷胁迫、盐胁迫、营养缺乏胁迫、高金属胁迫、水分胁迫、渗透胁迫或其任何组合。
平衡免疫反应与植物生长和发育
尽管免疫反应可以保护植物免受病原体的侵害，但是过度的免疫反应可能对植物的生长产生负面影响。因此，平衡植物中增强的免疫力或疾病预防和保护与增加的生长促进性反应是优化植物健康的期望组合。
本文所述的可用于增强免疫反应的生物活性引发性多肽可以与对植物生长和生产力产生积极影响的多肽组合。当将多肽组合物施用于植物或植物部位时，针对其不同的作用/调节模式进行特异性选择。然而，某些生物活性引发性多肽(Flgs、HpGa样、PSKα、硫蛋白)被受体样蛋白所感知，随后发生启动所述多肽进入植物并在植物中转运从而导致功能性结果的过程，而另一些生物活性引发性多肽(例如，RHPP)则通过主动吸收被带入植物中。例如，PSKα和Flg相关型多肽(如Flg22、Flg25和FlgII-28)被定位在质膜表面的富含亮氨酸的受体激酶所感知，并涉及复杂的信号传导通路，所述信号传导通路参与病原体触发的反应，从而导致免疫力、抗病性或疾病预防(Kutschmar等人“PSKα促进拟南芥属中的根生长”《新植物学家》181:820-831,2009))。
本文所述的生物活性引发性多肽(如Flg22 HpaG样多肽和硫蛋白)可以充当引发剂并表现出抗微生物活性(例如，抗农药活性；细菌、真菌或病毒活性)。提供了多肽的特定组合，例如，鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽与超敏蛋白相关型生物活性引发性多肽的组合可用于预防和保护植物免受致病性疾病的侵害，并且当与其它多肽(例如，可提高植物、植物部位和/或植物田地的生长和生产力的PSKα和RHPP)一起施用时，所述组合具有双重用途。
可以将本文所述的生物活性引发性多肽的组合以叶面喷剂、犁沟处理剂、种子处理剂、淋洗或洗涤的形式外源性地或内源性地施用于植物，从而刺激植物的免疫反应和生长特性，二者共同导致产量性能的提高。所述组合还可以为植物的不同部位(例如，叶、根、块茎、球茎、根茎、鳞茎、假鳞茎、花、荚果、果实和生长分生组织)提供保护和生长益处。
PSKα生物活性引发性多肽与HpaG样生物活性引发性多肽的组合叶面施用或顺序施用可用于增强标准(无胁迫或最佳生长)环境下的植物或暴露于非生物胁迫(例如、高温和缺水胁迫)的植物的生长。
当在最佳(无胁迫)环境和胁迫环境下对植物进行施用时，使用黄单胞菌属HpaG样生物活性引发性多肽和At.PSKα生物活性引发性多肽的叶面施用处理剂具有不同的作用模式。在叶面施用中，这两类生物活性引发性多肽可以桉顺序提供或组合使用，并且可以在具有或不具有一种或多种非生物胁迫的环境中改善植物的生长。
黄单胞菌属HpGa样在无胁迫环境中为玉米提供植物生长益处，在所述无胁迫环境中，温度、水、养分和其它环境参数有利于最佳的植物生长。另一方面，以叶面喷剂形式施用的At.PSKα在具有高温和干旱胁迫或缺水胁迫的环境条件下为植物生长提供益处。因此，当在叶面施用中组合使用时，二者可以跨越无胁迫和胁迫环境，并为在各种环境条件下生长的玉米植物的生长提供附加的益处。
在具有或不具有非生物胁迫的环境中生长的大豆植物中也观察到At.PSKα对植物生产力和生长的增加。与接受水和表面活性剂而没有生物活性引发性多肽的对照大豆植物相比，用含有生物活性引发性多肽At.PSKα的制剂进行叶面施用的且在高温和干旱胁迫条件下生长的大豆植物具有更高的产量。
当黄单胞菌属HpaG样和At.PSKα以叶面喷剂的形式一起施用时，它们可用于为正常环境和受胁迫环境下的植物生产提供协同效应。当以喷剂施用形式施用时，At.PSKα在玉米中表现出增加的整体生长，而黄单胞菌属HpaG样多肽导致相反的趋势。因此，将两种生物活性引物多肽一起施用可以起到平衡“高温胁迫”环境中植物生长的作用，使得与对照植物相比，植物生长的变化大于单独施用的生物活性引发性多肽的作用的总和。
这两类生物活性引发多肽的协同相互作用增强了在高温胁迫环境下的植物生长(例如，随着植物生物量增加而具有更高的生长速率)。
可以将本文所述的生物活性引发性多肽中的任何一个以组合形式或单独地施用于植物一次或多次，从而增强植物的生长和生产力。可以进行多次施用来促进整个生长季节的产量效益，其中针对环境条件量身定制施用，例如，如果在生长季节期间预计会有炎热干燥的天气，则额外喷洒在非生物胁迫下促进生长的生物活性引发性多肽可以减轻对植物的负面影响。
叶面施用磺肽素α(PSKα)以提高产量
提供了一种用于将At.PSKα以叶面施用的形式施用于活跃生长的大豆植物以在高温和干旱胁迫的环境中提供产量优势的方法。例如，一种使用本文所述的施用方法在V1-V4阶段将含有生物活性引发性At.PSKα多肽的组合物以叶面喷剂的形式提供给大豆的手段。经过叶面施用At.PSKα处理的大豆植物可以在田间环境中在产生无胁迫和胁迫(热量和水分亏缺)环境的条件下生长。在各种环境条件(包含非生物胁迫)下生长的植物中，用At.PSKα进行处理可以导致生长和产量效益。
可以将表12-14中提供的RHPP生物活性引发性多肽中的任何一个多肽以叶面处理剂、犁沟处理剂、种子处理剂或以根浸施用的形式施用于植物表面。
RHPP的叶面施用导致植物结构的改变。
提供了一种方法，在所述方法中，将RHPP多肽以叶面施用的形式施用于植物，并且所述多肽导致独特的叶片结构(玉米)和增强的根系(大豆)。使用RHPP进行叶面处理可以增加叶片角度和根系生物量，对两种主要农作物(玉米和大豆)的农业用途具有显著的优势。
施用RHPP以改变植物结构
将生物活性引发性多肽RHPP以叶面施用的形式施用于V5-V8玉米可产生具有垂直的叶片朝向和更多垂直叶片的独特叶片结构表型。这与在田间环境中用于使产量最大化的更高种植密度特别相关。RHPP多肽在玉米(玉米)中的叶面施用可用于改变叶片角度，以产生较小的叶片角度，从而导致垂直的叶片朝向。这种表型对于增加叶片面积指数、减少玉米阴影综合征和提高光合作用效率可能是有益的。另外，以叶面制剂形式提供RHPP从而使冠层发育和总透光率最大化，这对于在谷物灌浆阶段开始之前增加植物的营养生长至关重要。
玉米植物表现出叶片卷曲或叶片结构变化至更垂直的叶片朝向，以节约用水并增强植物对干旱和高温的耐受性。施用一个或多个RHPP生物活性引发性多肽组合物后，玉米叶片表型的垂直变化是有用的，并提供了用于形成叶片结构并增强对干旱和高温的耐受性的替代性非育种方法。
玉米植物中垂直的小叶朝向表型的作用是降低叶片温度、整株植物的蒸腾作用和改善水的利用效率，并为植物冠层提供结构上的改变，这可以实现更高密度的种植从而大大提高产量。
将生物活性引发性多肽RHPP施用于大豆也可以提供益处。例如，将RHPP叶面施用于开花期大豆可以增加结荚率。结荚是大豆发育的一个阶段，其发生在R4的中间到R5的中间，并且直接影响产量。初始结荚的标志是在主茎上四个最高节点之一处出现3/4英寸的荚果。然后，前进到全果阶段，在此阶段中，荚果迅速生长并且种子开始发育。结荚率的增加通过产量的增加来量化(即植物上每个节点的荚果数或每株植物的荚果总数)。
RHPP增加根系生物量和产量
与未经处理的植物相比，经一个或多个叶面施用的RHPP(SEQ ID NO:600)生物活性引发性多肽处理的大豆植物表现出增加的荚果填充和更完整的荚果填充，这可能是固氮作用增加的结果。
根系结构，特别是快速利用深层土壤的根系统可以优化氮捕获和水分吸收，这在干燥和贫氮的土壤中尤其重要。当以叶面处理剂施形式用于大豆植物时，本文所述的一个或多个RHPP多肽的根表型可用于获取水和矿物质(氮)，特别是在缺乏氮的土壤中。当与多种土壤类型的大豆栽培实践一起使用时，通过增强根系结构来提高养分吸收效率是提高植物生产力的关键因素。
叶面施用在大豆VE-V5或V2-V3发育阶段的早期营养阶段提供的RHPP产生了增强的根系生物量，从而导致了对深层土壤(深根)的快速利用，以及更大的根系生物量总体增加。例如，可以在V2至V3发育阶段将根毛促进性生物活性引发性多肽(如RHPP(SEQ ID NO:600))以叶面处理剂的形式施用于大豆植物，从而导致根系生物量的总体增加。除根系生物量外，其它显著增强还包括更长的侧根产生、根分支增加、根毛增加以及根吸收表面积增加。
在关键的发育阶段(VE-V8或V2-V8)或期望快速增加根系产量的环境(如干燥或营养不良的土壤类型)中，RHPP可以用作叶面处理剂。特别是土壤类型可能会影响根的发育和扩张。例如，如果植物很难在粘土中生长，则可能会影响根的形成和根的增殖。根质量的增加不仅可以有益地影响植物的出苗，而且可以促进植物生根。另外，根瘤的形成和数量很重要，因为存在于根瘤中的细菌从空气中吸收氮，从而使大豆将其转化为生长和产生种子所需的氮。
当使用这些处理剂施用方法中的任一种方法进行施用时，RHPP多肽(表13-15)可用于增加大豆根系的根瘤形成和根瘤产生，所述处理剂施用方法可直接施用于土壤、以土壤浸液、犁沟处理剂或以叶面施用的形式施用于地上植物部位。
根瘤的增加可以导致抑制根瘤的固氮菌(如豆科根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)或日本慢生根瘤菌(japonicum))的固氮作用增强。VE后不久可见根瘤形成，并且所述根瘤形成可以增加固氮作用。大豆根系的有效结瘤导致更高的产量和更高品质的种子生产、每种子或每英亩蛋白质和油。大豆植物在V1-V2的发育阶段已经完全形成了第一片三叶，据估计所述阶段是固氮的高峰时间。
Gm.RHPP生物活性引发性多肽与各种肥料处理剂的组合施用可以提高产量，并且特别推荐用于贫氮土壤中的作物管理应用。
细菌性疾病
使用本文所述的生物活性引发性多肽(如鞭毛蛋白相关型多肽或硫蛋白样多肽)的方法可用于预防、治疗和控制玉米中的细菌性疾病，并且在治疗由vasicola黄单胞菌甘蔗致病变种(也被称为野油菜黄单胞菌甘蔗致病变种)引起的玉米细菌性叶条斑病方面特别有用。
调查表明细菌性叶条斑病已经扩散并且可能广泛分布于整个美国玉米带(西印第安纳州、伊利诺伊州、爱荷华州、密苏里州、内布拉斯加州东部和堪萨斯州东部)。在作物轮作实践中将玉米种植在玉米上时，疾病传播最为普遍。细菌性叶条斑病可能导致马齿种玉米(田间)谷种、爆米花和甜玉米受到感染。玉米的症状包含从窄到棕黄色的条纹和叶脉之间的棕黄色条纹。病灶通常在较低或较老的植物叶片上生长，并最初扩散至植物上较高或较新的叶片。病灶周围也可能出现黄色变色。
玉米的细菌性叶条斑病可能在先前感染的宿主残骸中得以幸存。在被感染的叶片组织表面发现的细菌渗出液可以充当继发性接种物。细菌通过风、飞溅雨水进行传播，并可能通过灌溉水进行传播。病原体通过天然的开口(如气孔)穿透玉米叶片，这可能导致整个叶片出现带状病灶。叶片组织的定植显然受到主叶脉的限制。
因为疾病是由细菌病原体引起的，所以目前使用的杀菌剂难以控制疾病。例如，大多数杀菌剂充当接触产物且不是内吸性的，因此这些杀菌剂无法通过其它机制被吸收或摄取到植物中。由于杀菌剂可能会被雨水或风冲刷走，所述可能需要重复使用杀菌处理剂，因此在某些玉米作物中使用这些杀菌剂是不经济或不切实际的。
迄今为止，当前的疾病管理实践推荐轮作实践(如玉米、大豆、然后再回到玉米)，以及实施卫生实践(如在田间使用期间的清洁设备以减缓疾病进程)。
叶面施用Flg多肽(表4-5)和硫蛋白多肽(表19)或两类多肽的组合提供了用于治疾病的替代性方法。将这些以喷剂形式提供的生物活性引发性多肽叶面施用于无症状或有症状植物的叶片表面提供了一种预防、治疗和控制玉米中的细菌性叶条斑病的手段。
可替代地，鞭毛蛋白生物活性引发性多肽和硫蛋白生物活性引发性多肽或其组合可用于预防、治疗和控制感染玉米的其它细菌性疾病(表21)。
表21.玉米中的细菌引起的疾病
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大豆尾孢属叶枯萎病
尾孢菌是引起大豆尾孢属叶枯萎病的真菌病原体。尾孢属叶枯萎病(也被称为紫种子斑病)感染大豆的叶和种子。大豆种子的尾孢菌感染削弱种子外观和质量。尾孢属叶枯萎病的致病生物体是大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)，其在豆渣和种皮中过冬。当真菌孢子从被感染的残渣、杂草或其它被感染的大豆植物扩散到大豆植物时，发生疾病的传播。温暖而潮湿的天气加速了疾病传播和症状的发展。症状通常在开花期后开始发展，并且表现为大豆叶片上棕红色至紫红色斑点的圆形病灶，所述斑点可以合并从而形成病灶。症状在树冠上部可见，通常在最上面的三个或四个三叶中。随着作物成熟，被感染的大豆植物表现出症状恶化，并且在荚果填充期间可能出现受影响的叶子过早脱叶。尾孢菌症状的发展还可能表现为茎、叶柄和荚果上的病灶。种子通过与荚果连接而受到感染。尾孢菌感染的种子显示出紫色变色，这可以表现为斑点或疹斑覆盖整个种皮。
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽(表4-5)的叶面施用提供了用于治疗疾病的替代性方法。将这些以喷剂形式提供的生物活性引发性多肽叶面施用于无症状或有症状植物的叶片表面提供了一种预防、治疗和控制大豆中的尾孢属叶枯萎病的手段。叶面施用源自苏云金芽孢杆菌的Flg22(特别是高施用量(例如4.0Fl.oz/Ac))可以提供一种管理早期症状发展的手段，并提供在受到尾孢菌影响的田间地点生长的更健康且更具活力的大豆植物。
可用于治疗或减轻尾孢菌症状的生物活性引发性多肽的具体组合包含：氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、751或752的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽；或氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、751和572中的任何一个的鞭毛蛋白相关型多肽与氨基酸序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽的组合。
例如，用于治疗或减轻植物或植物部位上的尾孢菌症状的生物活性引发性多肽的有用组合是：单独的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226的鞭毛蛋白多肽；或所述鞭毛蛋白多肽与氨基酸序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽的组合。另外的处理剂可以进一步包括与这些生物活性引发性多肽组合的杀真菌剂。
亚洲大豆锈病
亚洲大豆锈病是由大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)引起的真菌疾病。亚洲大豆锈病的病因和症状与尾孢菌相似，并且可用于治疗亚洲大豆锈病的生物活性引发性多肽组合也相似。具体地，可用于治疗或减轻亚洲大豆锈病症状的生物活性引发性多肽的组合包含：氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、751或752的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽；或氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、751和572中的任何一个的鞭毛蛋白相关型多肽与氨基酸序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽的组合。
例如，用于治疗或减少植物或植物部位上的亚洲大豆锈病症状的生物活性引发性多肽的有用组合是：单独的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226的鞭毛蛋白多肽；或所述鞭毛蛋白多肽与氨基酸序列包括SEQ ID NO:600的RHPP多肽的组合。另外的处理剂可以进一步包括与这些生物活性引发性多肽组合的杀真菌剂。
荷花斑病
荷花斑病是由丁香假单胞菌海葵致病变种(Pseudomanas syringaepv.actinidae)引起的细菌性疾病。本文描述了用于使用鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽来限制丁香假单胞菌的生长并因此预防或治疗植物或植物部位中的荷花斑病的方法。可用于治疗丁香假单胞菌的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包含氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、751和572中的任何一个或其任何组合的任何多肽。
核盘菌茎腐病(白霉病)
核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种植物致病真菌，其引起被称为白霉病的疾病。其也被称为棉状腐病、水软腐病、茎腐病、脱落病、冠腐病和花枯萎病。白腐病的诊断症状包含被称为菌核的黑色静止结构和受感染植物上菌丝体的白色模糊生长。菌核继而产生子实体，所述子实体在囊中产生孢子。核盘菌可以影响草本植物、多肉植物(尤其是水果和蔬菜)或木质观赏植物上的幼体组织。其还会影响豆科植物或马铃薯等块茎植物。白霉病可以在任何生长阶段影响宿主，包含幼苗、成熟植物和收获的产品。通常在含水量高且与土壤紧邻的组织上发现白霉病。未经处理的土壤线茎上的浅色至深棕色病灶被白色蓬松的菌丝体生长所覆盖。这会影响木质部，导致萎黄、萎蔫、叶片掉落和死亡。白霉病也可能出现在田间果实或贮藏的果实上，其特征是白色真菌菌丝体覆盖果实并随后腐烂。可用于治疗核盘菌的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包含氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、571、751和752中的任何一个的任何多肽。
假单胞菌叶斑病
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(PSA)是一种破坏性植物病原体，其在猕猴桃的整个产区引起绿色果肉猕猴桃(美味猕猴桃)和黄色果肉猕猴桃(中华猕猴桃)的细菌性溃疡病，因此在新西兰、中国和意大利造成严重的收成损失。仅在新西兰，预计到2025年，最具破坏力的生物变种PSA-V的累积收入损失将接近7.4亿新西兰元(纽元)(林肯大学农业经济综合研究所“Psa-V对新西兰猕猴桃产业和更广泛社区造成的损失(The Costs of Psa-V tothe New Zealand Kiwifruit Industry and the Wider Community)”；2012年5月)。PSA-V定居在猕猴桃植物的内表面和外表面，并且可以通过木质部和韧皮部组织传播。猕猴桃PSA-V的疾病症状包含细菌性叶斑、树干细菌性溃疡、红色渗出液、花腐烂、树枝变色已经最终使猕猴桃藤枯。PSA-V的标准控制方法目前采取在猕猴桃藤上频繁地叶面喷施金属铜，这预计会导致选择抗铜形式的病原体并失去疾病控制能力。迫切需要新颖的控制方法。
可用于治疗丁香假单胞菌(特别是在猕猴桃中)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型肽包含氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、752和/或571的任何多肽。
亚洲柑橘绿化(黄龙)病
本文描述的方法结合了不同的方法来对抗疾病，并且另外提供了增加植物的整体生产力的益处。所述方法具体涉及外源性地或内源性地施用生物活性引发性多肽(包含硫蛋白)以对抗植物中的疾病。
硫蛋白和硫蛋白样多肽(表19)及其组合物可用于预防、治疗和控制亚洲柑橘绿化(也被称为黄龙病(HLB))疾病，其是一种对柑橘具有毁灭性的疾病。HLB疾病分布广泛，并且在所有拥有商业柑橘园的县的大多数商业和居民点中都曾发现过。
本文描述了用于使用硫蛋白多肽(SEQ ID NO:650-749)来预防HLB疾病的传播并在HLB疾病的治疗中使用的方法。
亚洲柑橘绿化病由亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)或两个斑点的柑橘木虱(Trioza erytreae Del Guercio)传播，二者均被表征为吸汁的木虱科半翅目虫并且与柑橘绿化的传播有关，柑橘绿化是由高度挑剔的以韧皮部为食的细菌-亚洲柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)所引起的疾病(Halbert,S.E.和Manjunath,K.L,“亚洲柑橘木虱胸喙类：木虱和柑橘的绿化病：文献综述和佛罗里达风险评估(Asiancitrus psyllids Sternorrhyncha:Psyllidae and greening disease of citrus:Aliterature review and assessment of risk in Florida)”佛罗里达昆虫学家87:330-353,2004)。一旦柑橘树被感染，亚洲柑橘绿化或黄龙病被认为对柑橘树是致命的。
这种疾病在叶子上的早期症状是叶脉发黄和不对称的萎黄(被称为斑点斑驳)，这是所述疾病的最具诊断性的症状。被感染的树木发育迟缓，叶片稀疏，并且叶面上出现斑点斑点。泛黄的早期症状可能出现在单个枝条或树枝上，并且随着疾病的发展，泛黄会扩散到整棵树上。受灾的树木可能显示出树枝枯萎和果实掉落。果实通常数量很少、较小、变形或不平衡，并且不能正确着色，其在末尾保持绿色而在切下的果实上的花梗(茎)正下方显示黄色斑点。
当选择柑橘砧木并将其嫁接到接穗品种上时，亚洲柑橘绿化病还可能被嫁接传播。
柑橘绿化病的管理已被证明是困难的，因此当前控制HLB的方法采用了多层次的病虫害综合管理方法，所述方法使用；1)实施用于嫁接的无病苗木和砧木；2)使用杀虫剂和全身性杀虫剂控制木虱载体，3)使用生物防治剂，如抗生素；4)使用有益的昆虫，如攻击木虱的寄生蜂；以及5)培育新的柑橘种质，其对引起柑橘绿化的细菌(韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter spp.))具有增强的抵抗力。使用文化和管理措施来预防疾病的传播也是综合管理方法的一部分。柑橘绿化的管理涉及的许多方面在金钱上和在柑橘生产中的损失方面都是昂贵的。
脉间施用硫蛋白多肽或硫蛋白多肽混合物可以将其直接递送到韧皮部杆菌可能居住的韧皮部(例如，包含韧皮部汁液的韧皮部细胞、韧皮部伴随细胞和韧皮部筛管分子)中。
可以使用表达系统产生硫蛋白，在所述表达系统中，硫蛋白可以与一个或多个韧皮部靶向序列(表18)融合，然后将硫蛋白独特地递送至细菌可能在柑橘植物中居住的位置附近。
靶向韧皮部的硫蛋白生物活性引发性多肽可用于治疗柑橘植物，从而通过直接靶向细菌(亚洲柑橘黄龙病菌)来预防、减少或消除亚洲柑橘绿化病或黄龙病(HLB)的传播。
这些靶向韧皮部的硫蛋白可以通过注入灌木或树木的韧皮部中来进行递送。另外，可以通过喷洒、洗涤或向植物周围的土壤或区域中添加浸渍或浸液来递送所述硫蛋白。
韧皮部靶向序列(表18；SEQ ID NO:641-649)中的任何一个序列均可以与硫蛋白和硫蛋白样多肽(表19；SEQ ID NO:650-749)组合使用。
难以分离和培养导致HLB的细菌(亚洲柑橘黄龙病菌)。为了测试单独的硫蛋白和具有韧皮部靶向序列的蛋白以确定二者是否可用于治疗HLB疾病，可以将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)用作模型生物，从而在果园中使用硫蛋白或硫蛋白组合之前，先测试降低土壤杆菌的细胞滴度或生长的有效性。
本文提供的具有硫蛋白和/或硫蛋白样多肽(表19)的“肽引发性”方法也可以与鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽(表1-5)组合使用。可以使用硫蛋白和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽的组合，通过在柑橘灌木或树木上的任何与感染相关的症状发作或出现之前施用生物活性引发性多肽或含有所述多肽的组合物来预防性地对柑橘植物进行预处理。这种预处理增加了对引起柑橘绿化的疾病病原体(韧皮部杆菌属)的抵抗力。
与鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽组合提供的硫蛋白为疾病的预防和管理提供了更全面的方法。硫蛋白和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽使用两种不同的作用模式来预防疾病和疾病的传播。
硫蛋白-鞭毛蛋白生物活性引发性多肽组合也可以与针对HLB规定的任何其它疾病控制综合管理方法一起使用，所述其它疾病控制综合管理方法包含但不限于：(1)使用无病苗木和/或砧木进行嫁接；(2)使用杀虫剂和/或全身性杀虫剂控制引起疾病的木虱；(3)使用生物防治剂，如注射抗生素或寄生虫来控制木虱；(4)培育新品种的柑橘种质，其对引起亚洲柑橘绿化病的细菌具有增强的抵抗力；(5)控制可能传播疾病的寄生植物(例如，菟丝子)；或(6)其任何组合。
合成版本的韧皮部靶向多肽(SEQ ID NO:641)在将抗微生物多肽靶向韧皮部筛管和伴随细胞方面特别有用，并且可用于治疗植物的各种细菌性疾病，如细菌叶条斑纹、亚洲柑橘绿化或黄龙病和柑橘溃疡病。
另外，鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽可用于治疗亚洲柑橘绿化，尤其是当与杀菌剂组合使用时。例如，可以使用氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571和752中的任何一个的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。优选地，杀菌剂包括土霉素。
柑橘溃疡病
开发了“肽引发性”方法，所述方法用于与表19(硫蛋白)和表1-5(鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽)中所描述的生物活性引发性硫蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽一起使用，以在柑橘溃疡病的任何可见症状出现之前对柑橘植物进行预防性处理，或者一旦疾病症状发作就进行治疗。
柑橘溃疡病主要发生在热带和亚热带气候中，据报道柑橘溃疡病发生在三十多个国家，包含亚洲、非洲、太平洋和印度洋群岛、南美洲、澳大利亚、阿根廷、乌拉圭、巴拉圭、巴西和美国。柑橘溃疡病是由感染叶子、果实和幼茎的细菌-地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)或莱檬致病变种(pv.aurantifolii)(也被称为柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri))所引起的疾病。柑橘灌木/树木的叶子和果实上的柑橘溃疡病感染症状可能导致叶片斑点、叶片损伤、脱叶、死皮、果实变形、果皮有斑点、过早落果以及在叶子和果实上形成溃疡。柑橘溃疡病的诊断症状包含围绕叶片病灶的特征性黄色光晕和在柑橘植物叶子上的坏死组织周围形成的浸水边缘。柑橘溃疡病的病原体可以通过受感染的果实、植物和设备的运输而传播。风和雨也可能促进分散。架空灌溉系统也可能促进引起柑橘溃疡病的病原体的移动。受感染的茎可能在茎干病灶中藏有引起柑橘溃疡病的细菌(地毯草黄单胞菌柑橘致病变种)，从而导致所述细菌被传播给其它柑橘植物。如亚洲斑潜蝇(潜叶蛾)等昆虫也传播这种疾病。
通常，易患柑橘溃疡病的柑橘植物包含橘子、甜橙、葡萄柚、柚子、柑橘、柠檬、青柠、施文格(swingle)酸青柠、巴勒斯坦(palestine)甜青柠、柑橘、橘柚、酸橙、粗皮柠檬、香橼、加利蒙地亚橘、三叶柑橘和金橘。在全球范围内，每年花费数百万美元用于预防、卫生、排斥、检疫和根除计划，以控制柑橘溃疡病(Gottwald T.R.“柑橘溃疡病(Citrus Canker)”美国植物病理学会,《植物健康指南(Health Instructor)》2000/2005年更新)。这种疾病的治疗方法包含施用抗生素或消毒剂、使用铜基杀菌喷剂以及使用杀虫剂来控制亚洲斑潜蝇。
可以使用包括以下的施用方法将包括硫蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽的生物活性引发性多肽组合施用于柑橘植物或柑橘植物部位(例如，砧木、接穗、叶片、根、茎、果实和叶子)：喷洒、接种、注射、浸泡、浸润、洗涤、浸入和/或以犁沟处理剂形式提供给周围的土壤。
提供了在出现任何明显的症状之前使用包括硫蛋白和/或鞭毛蛋白相关型多肽的生物活性引发性多肽对柑橘植物或柑橘植物部位(例如，根茎、接穗、叶片、根、茎、果实和叶子)进行预处理的方法。所述方法还可用于增加对柑橘溃疡病病原体的抗性，从而减轻疾病症状。
另外，一旦出现柑橘溃疡病的症状或当所述疾病的症状变得明显时，使用如鞭毛蛋白和鞭毛蛋白相关型多肽等生物活性引发性多肽的方法可用于处理柑橘植物或柑橘植物部位(例如，根茎、接穗、叶片、根、茎、果实和叶子)。
可以通过注入灌木或树木的韧皮部中、喷洒、洗涤、向植物周围的土壤或土壤区域中添加浸渍或浸液来递送施用Flg多肽或以犁沟形式提供所述多肽，从而治疗柑橘植物以预防、减少或消除柑橘溃疡病的扩散。
本文所述的硫蛋白生物活性引发性多肽(表17)可以以叶面处理剂或喷剂的形式或注射剂的形式单独施用，或与鞭毛蛋白相关型Flg多肽(表1-5)中的任何一个组合施用，并且可用于防止柑橘植物受到昆虫的侵扰，如在造成柑橘溃疡病的细菌(地毯草黄单胞菌柑橘致病变种)的传播中已经发现的亚洲斑潜蝇(潜叶蛾)。
柑橘植物
本文所述的用于改善植物健康、抗病性或疾病处理剂应用从而治疗或预防亚洲柑橘绿化病(HLB)或柑桔溃疡病的方法中的任何一种方法均适用于任何柑橘植物和灌木/树木。
可以将本文所述的硫蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽或包括所述硫蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的组合物施用于任何柑橘灌木和/或树木以及任何农学上重要的柑橘杂交植物或柑橘非杂交植物，并且所述多肽或所述组合物可用于对柑橘进行预防性治疗以预防感染的发作或在感染发生后提供治疗。
用于使用本文所述方法的柑橘植物物种包含但不限于：甜橙(Citrus sinensis、柚(Citrus maxima)×柑橘(Citrus reticulata))、香柠檬(Citrus bergamia、甜青柠(Citrus limetta)×酸橙(Citrus aurantium))、苦橙、酸橙(Sour Orange或SevilleOrange)(Citrus aurantium、柚×柑橘)、血橙(Citrus sinensis)、Orangelo或Chironja(葡萄柚(Citrus paradisi)×橙子(Citrus sinensis))、柑橘(Citrus reticulate)、三叶柑橘(Citrus trifoliata)、日本立花橘(Citrus tachibana)、克莱门氏小柑橘(Citrusclementina)、樱桃橙(Citrus kinokuni)、柠檬(Citrus limon、柚×香橼(Citrusmedica))、印度野生橘(Citrus indica)、皇家柠檬(Citrus limon、香橼×葡萄柚)、青柠(Citrus latifoli、Citrus aurantifolia)、野柠檬(Citrus meyeri)；野柠檬与柚、香橼、葡萄柚和/或橙子的杂交种)、粗皮柠檬(Citrus jambhiri)、沃尔卡姆柠檬(Citrusvolkameriana)、美国粗柠檬(柠檬x香橼)、泰国青柠(Citrus hystrix或Mauritiuspapeda)、甜柠檬、甜青柠或Mosambi(Citrus limetta)、波斯青柠或塔西堤青柠(Citruslatifolia)、巴勒斯坦甜青柠(Citrus limettioides)、有翼青柠(Citrus longispina)、澳洲手指青柠(Citrus australasica)、澳洲圆形青柠(Citrus australis)、澳洲沙漠或内陆青柠(Citrus glauca)、澳洲沙石青柠(Citrus garrawayae)、卡卡杜青柠或汉普蒂杜青柠(Citrus gracilis)、罗素河青柠(Citrus inodora)、新几内亚岛野生青柠(Citruswarburgiana)、布朗河手指青柠(Citrus wintersii)、橘青柠(Citrus limonia；(与柑橘×柚×香橼的杂交种)、卡拉宝青柠(Citrus pennivesiculata)、血青柠(澳洲指橙(Citrusaustralasica)×黎檬(Citrus limonia))、莓果青柠(Triphasia brassii、Triphasiagrandifolia、Triphasia trifolia)、葡萄柚(Citrus paradisi；柚×橙子)、橘子(Citrustangerina)、橘柚(Citrus tangelo；柑橘×柚或葡萄柚)、美人柑(柑橘×葡萄柚)、Orangelo(葡萄柚×橙子)、橘橙(Citrus nobilis；柑橘×橙子)、柚子(Pummelo或Pomelo)(Citrus maxima)、香橼(Citrus medica)、山区香橼(Citrus halimii)、金桔(Citrusjaponica或Fortunella species)、金桔的杂交种(加利蒙地亚橘，Fortunella japonica；金柑，Citrus ichangensis；莱檬，Citrofortunella floridana；桔子，温州蜜柑(Satsumamandarin)×圆金柑(Citrus japonica)或金柑属(Fortunella species)之间的杂交种；Procimequat，Fortunella hirdsiie；阳光橙，野柠檬和圆金柑或金柑属之间的杂交种；Yuzuquat，宜昌橙(Citrus ichangensis)和金桔(Fortunella margarita)之间的杂交种)、大翼橙(Citrus halimii、Citrus indica、Citrus macroptera、Citrus micrantha)、宜昌大翼橙(Citrus ichangensis)、西里伯岛大翼橙(Citrus celebica)、卡西大翼橙(Citruslatipes)、美拉尼西亚大翼橙(Citrus macroptera)、宜昌柠檬(宜昌橙×柚)、日本柚(宜昌橙×柑橘)、越南绿橙(柑橘×柚)、臭橙(Citrus sphaerocarpa)、德岛酸橘(Citrussudachi)、阿莱檬(Citrus macrophylla)、Biasong(小花橙(Citrus micrantha))、Samuyao(小花橙)、Kalpi(Citrus webberi)、温州蜜橘(Citrus unshiu)、日向夏(Citrustamurana)、Manyshanyegan(Citrus mangshanensis)、Lush(Citrus crenatifolia)、甘夏或日本夏橙(Citrus natsudaidai)、金诺橘(广西沙柑(Citrus nobilis)×纪州密柑(Citrus deliciosa)、Kiyomi(橙子×温州蜜柑(Citrus unshiu))、白金柚(柚×葡萄柚)、牙买加丑橘(柑橘×柚和/或葡萄柚)、加利蒙地亚橘(柑橘×圆金柑)、番石榴蜜柑(Citrusmyrtifolia、Citrus aurantium或Citrus pumila)、克利奥帕特拉柑橘(Citrus reshni)、代代花酸橙(Citrus aurantium或Citrus daidai)、Laraha(Citrus aurantium)、温州蜜柑(Citrus unshiu)、Naartjie(柑橘×橘橙)、Rangpur(黎檬；或与橙子×柚×柑橘的杂交种)、Djeruk Limau(Citrus amblycarpa)、伊予柑(Iyokan，anadomikan)(Citrus iyo)、Odichukuthi(Citrus odichukuthi)、Ougonkan(Citrus flaviculpus)、Pompia(Citrusmonstruosa)、台湾橘(Citrus depressa)、湘南黄金(Citrus flaviculpus或Citrusunshiu)、酸橘(Citrus sunki)、Mangshanyen(Citrus mangshanensis、Citrus nobilis)、多蕊橘(Clymenia platypoda、Clymenia polyandra)、贾巴拉柑橘(Citrus jabara)、曼陀罗(Mandora cyprus)、Melogold(沙田柚(Citrus grandis)×葡萄柚/柚/沙田柚)、Shangjuan(宜昌橙×柚)、南丰蜜桔(Citrus reticulata)和扁平橘(Citrus depressa)。
也可以将硫蛋白和/或鞭毛蛋白相关型引发性多肽施用于用于医疗或化妆品/保健和美容目的柑橘植物、灌木/树木，如香柠檬(Citrus bergamia)、酸橙或苦橙(Citrusaurantium)、甜橙(Citrus macrophylla)、青柠檬(Citrus aurantiifolia)、葡萄柚(Citrus paradisi)、香橼(Citrus medica)、柑橘(Citrus reticulate)、柠檬(Citruslimon，或与香橼×柚、黎檬、香橼×柚×香橼的杂交种)、甜青柠(Citrus limetta)、泰国青柠(Citrus hystrix或Mauritius papeda)、柠檬的杂交种或Lumia(香橼×柠檬)、(香橼×柚×香橼)、阿曼青柠(Citrus aurantiifolia，香橼×小花橙)、Jambola(Citrusgrandis)、卡卡杜青柠或汉普蒂杜青柠(Citrus gracilis)、柚子(Citrus retkulata)、橘橙(Citrus nobilis)和酸青柠或Nimbuka(Citrus acida)。
用于水果生产的示例性重要柑橘杂交种为：甜橙(Citrus sinensis)、苦橙(Citrus aurantium)、葡萄柚(Citrus paradisi)、柠檬(Citrus limon)、波斯青柠(Citruslatifolia)、青柠檬(Citrus aurantiifolia)、柑橘(Citrus tangerine)和Rangpur(Citrus limonia)。
此外，可以将本文所述的生物活性引发性多肽、组合物和方法中的任何一个施用于用作砧木和/或接穗种质的任何柑橘植物、灌木/树木。所述方法对于砧木特别有用，通常使用所述砧木进行柑橘接枝以提高接穗品种的优点，所述优点可以包含对干旱、霜冻、疾病或土壤生物(例如，线虫)的耐受性。提供有用砧木的此类柑橘植物包括含：酸橙或苦橙(Citrus aurantium)、甜橙(Citrus macrophylla)、三叶柑橘(Poncirus trifoliata)、粗皮柠檬(Citrus jambhiri)、沃尔卡姆柠檬(Citrus volkameriana)、阿莱檬(Citrusmacrophylla)、克利奥帕特拉柑橘(Citrus reshini)、枳柚(与香茅物种的杂交种)、葡萄柚(Citrus paradisi)、Rangpure青柠(Citrus limonia)、巴勒斯坦甜青柠(Citruslimettioides)和特洛亚枳橙(橙子×枸橘(Poncirus trifoliata)或橙子×三叶柑橘)和枳橙(橙子×枸橘或橙子×三叶柑橘)。
使用逆反型生物活性引发性多肽来治疗并减少柑橘绿化病
可以使用与逆反型对应物进行配对的鞭毛蛋白相关型多肽的组合来治疗并减少柑橘的绿化效应，所述绿化效应导致亚洲柑橘绿化病或黄龙病。
柑橘HLB的的早期症状是对单个枝干上的叶子变黄或树冠的一部分上的叶子变黄。由于HLB而变黄的叶子会显示出不对称的斑驳发黄或叶片成斑，表现为叶子的一边是绿色而另一边是黄色。随着HLB疾病的发展，果实大小变小，果汁变成苦涩。果实可能保持部分绿色，并且往往过早地脱落。
可以使用Flg多肽与其逆反(RI)形式的处理剂组合来使柑橘属果实绿化的效应最小化。可以将这种处理剂组合施用于感染HLB的树木。逆反形式的Flg多肽和原生形式的Flg多肽将竞相与植物表面的一个或多个FLS相关型受体结合，从而抑制/延迟与HLB疾病相关的症状形成。原生Flg22和RI Flg22的组合协助微调的免疫反应，以减少并甚至消除引起疾病的细菌(亚洲柑橘黄龙病菌)，同时防止急性症状(如叶片发黄和柑橘属果实绿化)的发展。
实例
提供了下列非限制性实例来进一步说明本发明。
实例1：将Bt.4Q7Flg22和逆反型Bt.4Q7Flg22以及Ec.Flg22和Ec.RI Flg22施用于玉米
在美国中西部10个独立的地点确定Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和逆反型Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:376)以及Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)和Ec.RI Flg22(SEQ ID:527)生物活性引发性多肽对玉米(贝克氏(BECK'S)5828YH、6175YE)产量的效果(图2和图3)。
使用玉米种植的常规或保护性耕作方法制备每个地点的田间苗床。按照常规耕作方式的建议施用化肥，并在美国中西部地点之间保持一致。施用除草剂施以控制杂草，并在必要时补充栽培。在所有地点种植四行地块，长度为17.5英尺(5.3米)。以1.5到2英寸(3.8到5.1厘米)的深度种植玉米种子，以确保根部正常发育，每亩28,000至36,000株植物，行宽为30英寸(76.2厘米)，种子间距为每英尺约1.6到1.8颗种子。考虑到田地易变性，每个地点均在至少三个独立的地块中生长每个杂合种(重复)。
通过固相肽合成技术化学合成原生Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQ IDNO:226)及其逆反型多肽(SEQ ID NO:376)，并以0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/公顷，Ha)的施用量进行调配。在以10加仑水/英亩(37.85L/Ha)的携带率进行稀释之后，喷罐中的最终浓度为25nM。在第一年和第二年田间试验期间施用原生Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽，从而测量跨越多年生长季节的效果。在第一年田间试验期间施用逆反型多肽以便与原生Bt.4Q7Flg22进行比较。在V5-V8发育阶段，以0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的施用量以叶面喷施剂形式施用生物活性引发性多肽。将每个多肽与0.5％的非离子表面活性剂一起施用。以产量的绝对变为单位化来衡量生物活性引发性多肽的效果，以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)。此外，赢率计算为：一种处理剂的产量优势超出其它处理剂的实验地点的百分比(在这种情况下，与未经处理的对照植物相比)。
图2A显示，在第一年的田间试验期间，与未经处理的对照玉米植物相比，叶面喷洒施用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)导致了10个地点的平均产量增加11.60Bu/Ac(728.1kg/Ha)并且赢率为90％。图2B显示，与未经处理的对照玉米植物相比，叶面喷洒施用逆反型Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:376)导致了美国中西部地区的10个地点的平均产量增加+11.90Bu/Ac(746.9kg/Ha)并且赢率为70％。在两个图中，x轴报告了地点(1-12)而y轴报告了产量(Bu/Ac)的绝对变化，并且所述产量绝对变化显示在每个地点的条形图的上方或下方。在10个地点中，递送至玉米的Ec.Flg22多肽产出了8.2bu/Ac(514.7kg/Ha)的优势，赢率为80％。逆反版本的Ec.RI Flg22产出得没有那么多，其在10个地点中产出了1.9bu/c的优势，赢率为50％。
采用大英亩田间试验在美国中西部(IL、IN、IA)的10-11个地点进行第二年田间试验，并且所述第二年田间试验采用叶面喷洒的形式将Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:226)提供给V8玉米植物(Dekalb 5064)。以0.33液体盎司/每英亩(Fl.oz/Ac)的施用量施用Bt.4Q7Flg22叶面喷施剂。如图3所示，与对照相比，使用Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽的叶面施用导致了11个地点的平均产量增加+4.8Bu/Ac，赢率为83％。x轴报告了地点1-6而y轴报告了产量(Bu/Ac)的绝对变化，并且所述产量绝对变化显示在每个地点的条形图的上方或下方。
图2(图A)所示的应用于玉米杂交种(贝克氏5828YH)的第一年田间试验使用含有Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:226)的叶面处理剂含，并且导致与未经处理的对照植物相比，产量的增加超过+11Bu/Ac(690.4kg/Ha)。图3所示的应用于V8玉米植物(Dekalb 5064)的第二年田间试验导致与未经处理的对照植物相比，产量增加了将近+5Bu/Ac(313.8kg/Ha)。两个玉米杂交种的合并平均值导致所有地点的2年平均产量增加为+8.0Bu/Ac(50.2kg/Ha)，赢率为86％(代表多年生长季节)。
使用Bt.4Q7 Flg22生物活性引发性多肽进行了第三项研究，所述多肽以3种比率施用于V5-V8玉米，并与非离子表面活性剂一起施用。最终施用量为0.33Fl.oz/Ac、4Fl.oz/Ac、8Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha、292.3mL/Ha、584.6mL/Ha)，这导致最终最终浓度分别约为25nM、300nM和600nM。每项研究均在10到11个地点之间进行。V5-V8期进行的研究的最终结果为：在0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的施用量下，优势为5.75Bu/Ac或360.9kg/Ha；在4Fl.oz/Ac的施用量下，优势为3.77bu/Ac或236.6kg/Ha；在8Fl.oz/Ac的施用量下，优势为5.05Bu/Ac或317kg/Ha。
实例2：将Bt.4Q7Flg22与杀真菌剂一起施用于V8玉米
用Bt.4Q7Flg22(单独或与市售杀真菌剂STRATEGO YLD一起)进行叶面处理，以确定Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽与杀真菌剂的组合是否产生协同作用。在V8发育阶段，将Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)单独或与STRATEGO YLD组合叶面喷施在玉米植物(杂交种Dekalb 5064)上进行评估。
使用重复试验在跨越美国中西部(IA、IL、IN)的6-8个地点进行重复试验。如实例1中所述，种植玉米植物。按照每个种植者的生产习惯维护地块，每个地块重复3-4次。使用时，在每个地点使用推荐的标签速率(4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)施用STRATEGO YLD杀真菌剂(丙硫菌唑与肟菌酯的组合)。叶面处理剂施剂由以下处理剂组成：(a)未经处理的对照、(b)单独的STRATEGO YLD杀真菌剂以及(c)带有杀真菌剂的以游离肽形式递送的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)或(c)不带有杀真菌剂的以游离肽形式递送的Bt.4Q7Flg22。以0.33或4.0液体盎司/英亩(Fl.oz/Ac)或(24.1或292.3mL/Ha)的施用量施用Bt.4Q7Flg22。
在所有地点报告了以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)为单位的玉米产量，作为在每个地点进行的重复试验的平均产量。将接受STRATEGOYLD杀真菌剂叶面施用的玉米植物的产量(Bu/Ac)的变化相对于6个地点的对照玉米植物的平均产量进行归一化(表22)。
与未经处理的对照玉米相比，用施用量为0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的Bt.4Q7Flg22进行叶面处理提供了产量效益，在6个地点观察到+4.84Bu/Ac(303.8kg/Ha)的增加。与对照植物相比，仅使用杀真菌剂STRATEGO YLD进行叶面处理也提供了+4.88Bu/Ac(306.3kg/Ha)的玉米产量效益。施用量为0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的游离肽Bt.4Q7Flg22与施用量为4.0Fl.oz/Ac的STRATEGO YLD杀菌剂的组合施用表现出了协同作用，从而导致与未经处理的对照植物相比，平均增加+10.72Bu/Ac(672.9kg/Ha)。因此，Bt.4Q7Flg22多肽与杀真菌剂处理剂的组合产生了协同作用，其中多肽的施用量为0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)而杀真菌剂的施用量为4.0Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha)。
表22：用与杀真菌剂一起施用的Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽对玉米进行叶面处理，从而增加玉米的产量
Figure BDA0002417772590001981
还以与上文相同的方式在8个地点进行了第二项研究作为重复试验，所述第二项研究研究Ec.Flg22与STRATEGO的组合。在8个地点中，施用量为4Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha)的Ec.Flg22在STRATEGO YLD的基础上增加了1.3(Bu/Ac)(81.6kg/Ha)，赢率为63％。这证明了与商业杀真菌剂STRATEGO YLD相比，两种Flg22多肽都能够增加效益。
实例3：将Bt.4Q7 Flg22、逆反型4Q7Flg22、Ec.Flg22、逆反型Ec.Flg22或RHPP施用于R2大豆-提高的产量，
在R2发育阶段，将使用,Bt.4Q7 Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:226；图4A)、来自苏云金芽孢杆菌菌株4Q7的逆反型(RI)Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:376；图4B)和源自大豆的根毛促进性多肽(RHPP，SEQ ID NO:600)的叶面喷剂以0.33Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha(Flg22多肽)或4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha(RHPP)的施用量分别施用于大豆植物(商业杂交种贝克氏294NR)。在大豆种子的生长中遵循实施例1中采用的栽培方法。以1.5到2英寸(3.8到5.1厘米)的深度种植大豆种子(商业杂交种贝克氏294NR)，以确保根部正常发育。如下种植大豆种子：平均每亩约150,000株植物，行宽为30英寸(76.2厘米)，种子间距为每英尺(0.3米)约7到8颗种子。
报告了十月份收获的生长于美国中西部11个不同地点的大豆的产量结果，以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)为单位(图4)。还报告了大豆产量(Bu/Ac)在所有地区的平均值，作为相对于对照大豆植物进行归一化的产量(Bu/Ac)变化。将叶面施用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和RI Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:376)后的大豆产量与未经处理的大豆植物的产量进行比较，并绘制在图4中。x轴报告了地点1-11。y轴报告了与未经处理的对照大豆植物相比的产量(Bu/Ac)的绝对变化，并且所述产量的绝对变化显示在每个地点的条形图的上方或下方。报告了所有11个地点的平均产量，并用黑条突出显示。经Bt4Q7Flg22和RI Bt.4Q7Flg22叶面处理的植物的大豆产量在11个不同地点显示出相似的趋势。与未经处理的对照植物相比，使用RI Bt.4Q7Flg22在大豆上进行喷洒施用导致11个地点的2个大豆杂交种平均增产0.90Bu/Ac(60.5kg/Ha)。当在各地进行比较时，大豆中的原生(全L)Bt.4Q7Flg22的产量结果呈中性(-0.1Bu/Ac或-6.7kg/Ha)。与对照大豆植物或未经处理的大豆植物相比，RIBt.4Q7Flg22和Bt.4Q7Flg22喷雾施用处理后的美国中西部11个单独地点的产量数据得出赢率为64％。与对照相比，在同一研究中添加施用量为4Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha)的RHPP多肽使产量提高了1.2Bu/Ac(80.7kg/Ha)。
进行了第二项研究以测试作为大豆上的R2叶面处理剂的Ec.Flg22和Ec.RI Flg22多肽，其携带率为10加仑/Ac(93.5L/Ha)水和NIS表面活性剂。对于每个处理剂，在槽中获得100nM的浓度。施用Ec.Flg22造成11个地点增产0.9Bu/Ac(60.5kg/Ha)且赢率为这82％，而施用Ec.RI Flg22造成10个地点增产0.6Bu/Ac(40.3kg/Ha)且赢率为这80％。还包含了作为种子处理剂的RHPP多肽，其在11个地点增产1.2bu/Ac(80.7kg/Ha)且赢率为73％。
在相同的11个地点进行的第三项研究是在8fl oz/Ac(584.6mL/Ha)的施用量单独添加叶面肥料或将叶面肥料与RHPP一起添加。在叶面肥料的基础上添加RHPP在这11个地点均产生了1Bu/AC(67.2kg/Ha)的优势。
实例4：将Flg22多肽叶面喷洒施用到大豆上。
在R2时期，在11个地点的带有10加仑/Ac(93.5L/Ha)水和0.5％NIS表面活性剂的大豆品种上，在4.0和8.0Fl.oz/Ac(292.3和584.6mL/Ha)的施用量下测试了含有Bt.4Q7Flg22、Ec.Flg22和RHPP的叶面处理剂。在8Fl.oz/Ac(584.6mL/Ha)的较高剂量下，Ec.Flg22多肽产生了0.74Bu/Ac(49.8kg/Ha)的优势，而Bt.4Q7 Flg22产生了0.88Bu/Ac(59.2kg/Ha)的优势。较低比率(4Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha))的RHPP产生了0.31Bu/Ac(20.9kg/Ha)的产量优势。
实例5：施用大肠杆菌鞭毛蛋白多肽以提高产量-玉米
然后测试了源自大肠杆菌的鞭毛蛋白多肽对玉米产量的影响。在V5-V8发育阶段，使用含有Ec.Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:526)和来自大肠杆菌的逆反型RIEc.Flg22(SEQ ID NO:527)的制剂以0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的施用量对玉米植物(贝克氏5828YH)进行首次喷洒施用。确定十月份收获的生长于12个不同地点的玉米的产量结果，以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)为单位。
图5描绘了相对于未经处理的对照植物归一化的这12个地点的产量，并且示出为与对照相比的增加或减少(以Bu/Ac为单位)。伊利诺伊州12个地点的产量数据得出了50％的赢率。与未经处理的植物相比，使用Ec.Flg22生物活性引发性多肽进行叶面喷洒处理的玉米植物(图5A)在12个地点的平均产量增加了+8.2Bu/Ac(514.7kg/Ha)。与未经处理的对照玉米植物相比，使用逆反型RI Ec.Flg22生物活性引发性多肽进行叶面喷洒处理的玉米植无(图5B)在12个地区的平均产量增加了+1.9Bu/Ac(119.3kg/Ha)。因此，当在发育的V5-V8阶段进行施用时，施用含有Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)生物活性引发性多肽的叶面喷剂为玉米植物提供了有益的生长反应和产量效益。
实例6：将大肠杆菌鞭毛蛋白多肽叶面施用于V2-V3大豆以增加植物高度
将Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)和逆反型RI Ec.Flg22(SEQ ID NO:527)的叶面施用于大豆(贝克氏297NR)。在环境受控的生长室中生长植物。将种子直接种植到39.7cm3的含有Timberline表层土壤的地块中，深度为2.54cm，每块地2颗种子。种植后，向每个地块中添加50mL室温水以使种子发芽。将这些地块保存在接受约300μmol m-2s-1(光子)的人造照明生长室中，保持13/11光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。植物接受相同的浇水和施肥方案。
使用0.33Fl.oz/Ac(24.1mL/Ha)的施用量，在V2至V3发育阶段将使用原生形式和逆反形式的Ec.Flg22的叶面处理剂施用于3周龄的大豆植物。刚好在第3周叶面施用之前测量植物高度(cm)，然后2周后在植物5周龄时再次进行测量。每个试验使用18个植物进行了两次重复试验。
如表23中所述，与对照(仅水处理)植物相比，在V2-V3发育阶段向大豆叶面施用Ec.Flg22多肽增加了植物的高度(表23)。当相对于未经处理的对照大豆植物进行标准化时(归一化为100％)，使用Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)和逆反型Ec.Flg22(SEQ ID NO:527)生物活性引发性多肽进行叶面施用导致了植物高度增加+13％和+16％。
表23.鞭毛蛋白多肽的叶面施用增加了大豆的植物高度
Figure BDA0002417772590002021
实例7：在玉米中施用Flg22和逆反型Flg22-植物高度
如实例6中所述，在环境受控的生长室中生长玉米(贝克氏(杂交种5828YH)植物。在出苗后三周测量植物，然后叶面施用天然(L)和逆反(D)形式的来自苏云金芽孢杆菌(Bt.4Q7Flg22，SEQ ID No:226和376)和大肠杆菌(Ec.Flg22，SEQ ID NO:526-527)的Flg22多肽，以进行处理。在1μM的浓度下以游离多肽的形式施用生物活性引发性多肽。仅用水处理对照植物。再生长2周后，测量植物高度(5周时)。
测量在2周和5周间隔时间点之间的植物高度的变化(Δ高度cm)，并将其相对于经水处理的对照植物的生长归一化。每个试验使用9株植物进行了三个重复试验，等于每个处理剂总共进行了27次测量(表24)。在3周的测量时间点处，在经EcFlg22、Bt.4Q7Flg22或水处理的对照植物之间测得的植物高度没有差异。报告了接受Ec.Flg22叶面施用的玉米植物从3周到5周的植物高度最大变化(Δ＝17.60cm)。与对照植物相比，在5周的测量标记处，这些植物的高度也增加了+8.3％。当与对照处理相比时，两个逆反型多肽(RI Ec.Flg22和RIBt.4Q7Flg2)和原生Bt.4Q7Flg22相似地增加了植物高度，报告的增加为约+2％到+4％。
表24.在玉米上叶面施用Ec.Flg22和Bt.Flg22多肽导致植物高度增加
Figure BDA0002417772590002022
Figure BDA0002417772590002031
实例8：施用逆反型Flg22生物活性引发性多肽以在胁迫下促进生长-玉米
非生物胁迫导致农作物大量损失，并可能导致农作物产量和单产潜力的重大减少。鞭毛蛋白组合物和鞭毛蛋白相关型生物活性引发性多肽可以用作化学引发剂，从而增加植物对一种或多种非生物胁迫的耐受性。进行了使用Ec.Flg22和Bt.4Q7Flg22以及这两种生物活性引发性多肽的逆发(RI)形式的叶面处理，以确定这些叶面施用的多肽是否可以提供抵抗高温和干旱胁迫的保护性优势。
按实例6中所述种植并生长玉米(贝克氏杂交种5828YH)种子，区别在于遵循白天16小时/夜间8小光照的周期。将温度从每天21℃循环到每天15℃，湿度为75％。光照循环仍为植物生长提供均匀的约300μmol m-2s-1的充足光照。在出苗后三周测量植物，然后以1μM的浓度叶面施用天然或逆反(RI)形式的Ec.Flg22(SEQ ID NO:526-527)或Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226和376)以进行处理。仅用水处理对照植物。喷洒处理一周后，将植物分为两组，将一组保持在与上文标准生长环境相同的环境中，而将另一组转移到提供高温和缺水胁迫的环境中。在高温胁迫环境中，使用加热垫将温度从21℃升高到27℃，每天进行18个小时，持续5天。在高温胁迫期间内不给植物浇水，以进一步模拟缺水胁迫。2周后，在第5周测量植物高度的变化(cm)，并将其报告为对照(水)植物的高度百分比。将测量结果报告为两次试验的合并平均值，每个试验有9个重复植物(表25)。
如表25所示，当在无胁迫条件下施用时，如通过对照植物高度所测量的，两种天然形式的生物活性引发性多肽(Ec.Flg22和Bt.4Q7Flg22)均增加了植物生长。两种处理剂导致植物的高度分别达到其对照的103％和108％。然而，当在正常和高温/水分胁迫环境中生长时，与对照植物相比，只有经逆反型Flg22多肽(逆反型Ec.Flg22和逆反型Bt.4Q7Flg22)处理的玉米植物显示出增强的植物生长。经Ec.Flg22逆反型处理的植物在两种情况下均达到其对照高度的103％。经Bt.4Q7Flg22处理的植物在无胁迫和胁迫条件下分别达到其对等的对照株高的102％和近108％。
因此，经逆反型Flg22多肽(RI-Ec.Flg22和RI-Bt.4Q7Flg22)处理的玉米植物表现出增加的生长，如通过与对照植物相比植物高度增加的百分比所表明的。这个结果表明逆反形式在形式上更加稳定，并且能够在更恶劣的环境或有利于非生物胁迫的情况下在没有蛋白水解作用的情况下存活。因此，逆反形式可以为遭受非生物胁迫环境的植物提供保护性优势。
表25.将Ec.Flg22和Bt.Flg22叶面施用于在无胁迫和胁迫环境中生长的玉米
Figure BDA0002417772590002041
实例9：在V2-V3玉米上施用叶面Flg22多肽后的高温和缺水胁迫
在单独的实验中，在暴露于高温和缺水胁迫之前，用Bt.4Q7Flg22以及表面活性剂处理如实例8中所述生长的玉米植物。在环境受控的生长室中生长每试验18株玉米植物重复的三个重复试验，直到发育到V2-V3阶段。用含有0.1％表面活性剂的叶面喷剂对每株植物进行处理，所述叶面喷剂具有或不具有Bt.4Q7Flg22(最终浓度为1μM)。进行喷洒处理一周后，将植物转移到提供高温胁迫和缺水胁迫的环境中。使用加热垫施加高温胁迫，将环境温度从21℃升高到27℃。在高温胁迫期间，不给植物浇水。玉米植物在模拟的非生物胁迫环境中停留一周，然后重新测量植物的高度(cm)(表26)。
如表26所示，在三个试验中的两个试验中，与仅用表面活性剂处理的对照植物相比，使用以叶面喷剂形式施用的Bt.4Q7Flg22多肽(试验1和3)导致玉米植物的生长显著增加(以厘米为单位测量高度)。与对照(仅使用表面活性剂处理的)植物相比，用Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽进行叶面处理导致试验1中的植物高度增加近13％，而试验3中的植物高度增加近33％。
表26.施用Bt.4Q7Flg22的玉米的植物高度变化
Figure BDA0002417772590002051
实例10：使用Flg22多肽的种子处理剂-玉米和大豆
用最终浆液浓度为0.25μM或1.0μM的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)生物活性引发性多肽处理两个单独的杂交种(杂交种贝克氏5828AM和4606P2)的玉米种子(表27)，将所述多肽施用于每颗种子的表面。使用在浆液中稀释至适当浓度的40μM多肽储备液提供种子喷剂，所述浆液含有杀真菌剂、杀虫剂、有益细菌、着色剂和种子整理剂(EverGol Energy(0.031mg ai/种子)、PONCHO/VOTiVO(0.6mg ai/种子)、Peridium 1006(5fl oz/cwt或147.9mL/cwt)和Pro-Ized红色着色剂(正常)(0.5fl oz/cwt))。使用温特斯泰格HEGE II(温特斯泰格公司，奥地利，德国)施用种子处理剂。
在美国中西部(IA、IL、IN)的12个地点种植种子。每Flg22多肽处理剂(由以0.25μM和1.0μM浆液浓度施用的Bt.4Q7Flg22组成)收获16个随机重复地块。
表27显示，与未经处理的对照种子(无种子处理剂)相比，以每单位玉米种子0.035或0.14Fl.oz(2.6或10.2mL/Ha)多肽溶液的施用量施用剂量等同于40μM多肽溶液的Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽来进行种子处理可以导致产量增加，低施用量下产量平均增加+2.1Bu/Ac(131.8kg/Ha)增加，高施用量下产量平均增加+5.3Bu/Ac。
表27.使用Flg22多肽对玉米进行种子处理
Figure BDA0002417772590002061
建立了第二项研究以测试Ec.Flg22、Ec.RI Flg22、Bt.4Q7Flg22和Bt.4Q7RIFlg22促进玉米产量的能力。如上所述建立了12个地点的重复试验。Bt.4Q7Flg22在50％的赢率下产生2.8蒲式耳或71.1公斤，Bt.4Q7 RI Flg22多肽产生0.5Bu/Ac。Ec.Flg22多肽在70％的赢率下产生2.8Bu/Ac(175.8kg/Ha)的优势，而Ec.RI Flg22不产生任何效益。
建立了第三项研究以研究Bt.4Q7 Flg22、RI Bt.4Q7Flg22、Ec.RI Flg22和RHPP作为大豆种子处理剂的益处。在12个地点的研究中，RHPP多肽在64％的赢率下产生0.4Bu/AC(26.9kg/Ha)，Bt.4Q7 Flg22多肽在64％的赢率下产生1.3Bu/Ac(87.4kg/Ha)，Bt.4Q7 RIBt.4Q7Flg22多肽在55％的赢率下产生0.3Bu/Ac(20.2kg/Ha)而Ec.RI Flg22在73％的赢率下产生1.8Bu/Ac(121.1kg/Ha)。
实例11：将鞭毛蛋白生物活性引发性多肽施用于番茄－产量增加
在开花前阶段将Bt.4Q7 Flg22(SEQ ID NO:226)和Ec.以外源喷剂的形式施用Flg22(SEQ ID NO:526)叶面施用处理剂，并将其用于增加番茄的产量。
设计小规模地块来模拟番茄的商业性生长条件。番茄的两个杂交种JetSetter(试验1)和Better Big Boy(试验2)最开始是大棚中的移栽植物，然后42到56天后在高架田地上种植。一旦土壤表面以下三英寸(7.6厘米)处的土壤温度达到60°F(15.5℃)，便开始移植番茄。在铺有黑色塑料覆盖物的高架床上生长西红柿。在整个生长季节中，使用滴灌法种植植物，并按照种植者的指导方针施肥，以确保最佳的植物生长和产量。设计小型的高架床地块来模拟商业种植者使用的种植密度，商业种植者通常在5至6.5英尺(1.5至2m)的中心上每英亩单行种植2,600至5,800株植物，行中植物之间的距离为18至30英寸(46至76厘米)。
在在早期开花(第一朵花)阶段，分别以低施用量(1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha))和高施用量(20Fl.oz/Ac(1461.5mL/Ha))施用Bt.4Q7 Flg22和Ec.Flg22叶面处理剂。7月在密苏里大学(哥伦比亚密苏里州)进行了重复试验。用等体积(施用量)的水处理对照植物。确定了叶面处理剂对番茄增产的影响，并将所述影响报告为相对于水对照处理归一化。表28报告了产量相对于平均对照产量的平均百分比变化。
在低施用量和高施用量下，Bt.4Q7Flg22和Ec.Flg22生物活性引发性多肽的叶面施用均提高了每株杂交种的番茄果实产量。当将两个杂交种的结果取平均值时，与对照植物相比，Bt.4Q7 Flg22的低使用量和高使用量分别增加了+25％和+17％的番茄产量。类似地，Ec.Flg22处理剂的低使用量和高使用量使两株杂交种的番茄产量平均比对照植物高+43％和+46％。
表28：用于提高不同番茄杂交种的产量的叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002081
实例12：用Bt.4Q7 Flg22制剂对番茄植物进行叶面处理
在另一个实验中，在开花初期用Bt.4Q7 Flg22制剂处理如前一实例所述栽培的番茄植物(杂交种：Better Boy)。所用制剂由与0.01％(v/v)非离子表面活性剂一起施用的逆反型D RI Bt.4Q7 Flg22组成。在佛罗里达州进行的两次冬季番茄试验中，使用1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)的施用量将所述制剂施用于番茄的叶面。在收获时，以每株植物上的果实数、每个果实的重量(克)和总产量(lbs/Ac)来衡量产量。表29报告了与未经处理(仅水)的对照植物相比，产量比较或变化的百分比。
与未经处理(仅水)的对照植物相比，使用以1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)施用的Bt.4Q7Flg22制剂的叶面处理使Better Boy番茄的产量平均提高了21％。Better Boy番茄的增加既对应于每株植物上的果实数量增加，又对应于果实重量的增加(表29)。
表29：用Flg22生物活性引发性多肽进行叶面处理以增加番茄的产量
Figure BDA0002417772590002091
实例13：将鞭毛蛋白生物活性引发性多肽施用于辣椒－产量增加
在第一开花阶段，以外源喷剂的形式施用Bt.4Q7 Flg22(SEQ ID NO:226)和Ec.Flg22(SEQ ID No:526)叶面处理剂，并将其用于增加两个辣椒品种的产量。
使用小规模地块施用Bt.4Q7 Flg22和Ec.Flg22生物活性引发性多肽叶面处理剂，所述小规模地块被设计成模拟辣椒(Capsicum)的商业生长条件。两个辣椒品种：红骑士(RK)和匈牙利热蜡(HHW)生长自铺有黑色塑料覆盖物的高架床中的6周龄移栽植物，所述高架床具有良好的保水特性，pH为5.8-6.6。在整个生长季节中，使用滴灌法种植植物，并按照种植者的指导方针施肥，以确保最佳的植物生长和产量。设计小型的高架床地块来模拟商业种植者使用的种植密度，商业种植者通常在塑料覆盖床上每英亩双行种植约10,000-14,000株植物，每行间隔14-18英寸(35.6到46厘米)，行中植物之间的距离为16-24英寸(40.6到61厘米)，床与其中心相距5.0-6.5英尺(40.6到70厘米)。每床也可以种植单行辣椒(每英亩种植5,000-6,500株植物，或每公顷12,355-16,062株植物)。
在第一花期以1Fl.oz/Ac(低比率)或73.1mL/Ha以及20Fl.oz/Ac(高比率)或1461.5mL/Ha的施用量用含有Bt.4Q7 Flg22和Ec.Flg22的组合物对两种辣椒进行叶面施用，并与对照(以相同的用量施用水)进行比较。使用一次过收获的方法确定了叶面施用对分别收获的辣椒产量的影响，并将所述影响相对于对照植物的产量归一化。表29中以磅/英亩(lbs/Ac)为单位报告了每个处理剂相对于对照植物产生的平均产量变化百分比。
使用Bt.4Q7 Flg22或Ec.Flg22生物活性引发性多肽对辣椒进行叶面处理导致RK和HHW辣椒品种的辣椒产量(lbs/Ac)的总体平均增加，无论采用低施用量还是高施用量。与对照辣椒植物相比，经Bt.4Q7 Flg22叶面处理的辣椒的RK和HHW品种的合并平均产量高出+53％(低比率：1Fl.oz/Ac或73.1mL/Ha)和+25％(高比率：20Fl.oz/Ac)。可替代地，与对照辣椒植物相比，经Ec.Flg22叶面处理的辣椒的RK和HHW品种的综合平均产量高出+30％(低速率：1Fl.oz/Ac)和+47％(高速率：20Fl.oz/Ac或1461.5mL/Ha)。
两个辣椒品种对叶面处理剂的反应以及提供给两个辣椒品种的结果产量优势有所不同(表30)。对于Bt.4Q7Flg22，与RK辣椒品种和对照或未经处理的植物相比，HHW品种的产量显著增加，与对照或未经处理的辣椒植物相比，产量增加了+77％(低：1Fl.oz/Ac或73.1mL/Ha)和+42％(高：20Fl.oz/Ac或1461.5mL/Ha)。此外，低施用量的Bt.4Q7Flg22多肽(1Fl.oz/Ac)和高施用量的Ec.Flg22(20Fl oz/Ac)多肽在增加HHW品种的产量方面最有效(均比对照植物增加+72％)。
表30：用于提高不同辣椒品种的产量的Flg22叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002111
实例14：将鞭毛蛋白生物活性引发性多肽施用于南瓜－产量增加
在第一开花阶段使用两种单独的制剂(制剂1＝F1和制剂2＝F2)将Bt.4Q7Flg22叶面处理剂施于Ambassador南瓜上。制剂1(F1)由与0.01％(v/v)非离子表面活性剂一起施用的原生Bt.4Q7 Flg22生物活性引发性多肽组成。制剂2(F2)由与0.01％(wv)非离子表面活性剂一起施用的D RI Bt.4Q7 Flg22组成。制剂F1和F2均以1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)的施用量施用于南瓜。将用Bt.4Q7Flg22 F1和F2叶面喷剂处理过的植物的产量与对照(水)或未经处理的南瓜植物的产量进行比较。如下在沙壤土上栽培南瓜植物。在2.5英尺(0.76m)宽的塑料覆盖的土丘上切出2.5厘米的孔，每土丘两行，每行内的孔距为1.5英尺(0.46m)。在土丘内，行与行交错。土丘之间相距4英尺(1.2m)。每孔种植三颗南瓜种子，种植后14天，稀疏成每孔一株植物。将滴灌管铺设在每个土丘的中央，并根据需要浇灌植物。
将南瓜植物从种子在高架床上生长直至开花，并使用两次重复试验或两次单独收获在同一佛罗里达(FL)地点对南瓜植物进行叶面处理。以每株植物上的南瓜数量、每颗南瓜的重量(克)和南瓜的总产量(lbs/Ac)报告了叶面施用Bt.4Q7Flg22的经F1和F2处理的植物的产量，并将其表示为相对于未经处理的对照植物的变化百分比(表31)。
与未经处理的对照植物相比，当在开花前阶段试验使用两种制剂F1和F2将Bt.4Q7Flg22叶面处理剂叶面施用于南瓜(Ambassador)上时，所述叶面处理剂导致增加的产量优势。与对照或未经处理的植物相比，经Bt.4Q7Flg22 F1和F2处理的植物的每株植物上的南瓜数量、每颗南瓜的重量以及产量(lbs/Ac)的总体平均变化百分比均增加。经Bt.4Q7Flg22 F1和F2制剂处理的南瓜植物在每株植物上的南瓜数量、每颗南瓜的重量以及产量(lbs/Ac)的总体平均百分比变化方面具有相似的增加趋势，但是与接受F2叶面施用的南瓜植物相比，接受F1叶面施用的南瓜植物的每株植物上的南瓜数量和南瓜总产量显示出更多增加。
表31：用Flg22多肽的组合物进行叶面处理以增加南瓜的产量
Figure BDA0002417772590002121
实例15.筛选用于玉米和大豆中的活性氧(ROS)产生的Flg多肽
使用密码子以在Bt.4Q7Flg22中产生突变，从而使其更好地匹配宿主生物，并使Flg22多肽与植物细胞表面的FLS受体结合。使用一种概率方法来生成原生Bt.4Q7Flg22的三个变体，这些变体被设计成具有玉米和大豆的优选氨基酸特征信息，并且在ROS中活性测定中表现出等同或优于原生Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的性能。这些变体具有内部区段(SEQ ID NO:571)或C端(SEQ ID NO:572)或N端(SEQ ID NO:573)突变，并且分别被命名为Bt.4Q7Flg22-Syn01、Bt.4Q7Flg22-Syn02和Bt.4Q7Flg22-Syn03。然后在各种浓度下测量Bt.4Q7Flg22-Syn01和Bt.4Q7Flg22-Syn03与其原生形式的关系。
将来自玉米(杂交种5828YX)和大豆(杂交种297R4)叶片的新鲜植物组织切成均匀的样品，并使其漂浮含150μL无菌水的96孔白色低发光板中。将板置于生长灯下，在22℃的恒定温度下，所述生长灯具有16小时光照/8小时黑暗的周期。
对于玉米样品，使用干净的剃刀刀片从土壤线以上的植物上切下V1至V4阶段玉米植物的气生组织。除去子叶和鞘。从植物根部直至第一个叶节点以下约1.3厘米的茎秆上切下1毫米切片。将每个玉米切片置于96孔板的单个孔中。
对于大豆样品，从V1-V3阶段的植物中除去完全展开的三叶。使用直径为4mm的干净且锋利的穿孔器从叶刃上切下叶盘(12.6mm2)。使用干净的剃刀刀片将圆盘切成两半，并将每半个圆盘放入96孔板的单个孔中。
在无菌去离子水或含0.1％Tween-20的100mM磷酸钠(pH 7.8-8.0)缓冲液中制备原生Flg22多肽(SEQ ID NO:226)或含有所述突变的Flg22多肽(SEQ ID NO:571或573)储备液。18-24小时后，从96孔板的每个孔中除去水。用100μL激发溶液处理植物组织样品，所述激发溶液含有1:100稀释的Flg22多肽储备液(浓度范围为250皮摩尔(pM)至10微摩尔(μM))、34μg/mL鲁米诺和20μg/mL辣根过氧化物酶。植物组织对Flg22多肽的识别导致免疫信号的激活和质外体活性氧(ROS)的产生。在存在ROS(H2O2)的情况下，辣根过氧化物酶催化鲁米诺的氧化和可见光的产生。使用GLOMAX 96微孔板发光计(Promega Corporation)使用0.5秒积分；间隔2.6分钟在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。
为了进行数据分析，在整个40分钟的时间过程中，针对每个样品计算所产生的总RLU。超出四分位数范围的明显异常值被排除在分析之外。将每种条件(n＝6-16)下的总RLU归一化为25nM时Bt.4Q7Flg22的平均RLU，并报告为Bt.4Q7Flg22对照的百分比(％)(表32)。
与原生版本的Flg22或Bt.4Q7Flg22相比，合成诱变的Bt.4Q7Flg22-Syn01版本在一定浓度范围(0.25-100nM)下具有增加的ROS活性，而Bt.4Q7Flg22-Syn03的变化范围更大，并在0.25nM、1nM、10nM、25nM和100nM浓度下显示出增加的ROS活性。与原生版本或Bt.4Q7Flg22相比，使用5nM的合成版本的Bt.4Q7Flg22-Syn01处理剂导致ROS活性变化最大。Bt.4Q7Flg22-Syn03的ROS活性在添加的浓度范围内显示出变化更大的反应。
表32.在宽范围的浓度下，Flg生成的合成突变体(Syn-01和Syn-03)在ROS测定中的活性比原生Bt.4Q7Flg22更高。
Figure BDA0002417772590002141
实例16：用于鉴定玉米和大豆的功能性活性Flg多肽的ROS筛选测定法
基于实例15中初步研究的结果，选择以下浓度以筛选玉米和大豆中多种Flg22多肽的ROS活性：玉米中为5nM(杂交种5828YX)，大豆中为100nM(杂交种297R4)。然后，使用ROS活性测定法来鉴定用于单独处理玉米和大豆的最佳Flg22生物活性引发性多肽候选物，并鉴定对玉米和大豆均具有活性的那些候选物。
从植物中收获玉米和大豆的叶组织，并且如先前实例15中所述对表33中列出的突变型多肽进行ROS测定。在整个40分钟的时间过程中，针对每个样品计算所产生的总RLU。超出四分位数范围的明显异常值被排除在分析之外。比较了玉米(5828YX)和大豆(297R4)的ROS活性，并以相对于25nM Bt.4Q7Flg22处理剂浓度下的平均光单位(RLU)值的相对RLU的百分比(％)进行报告(表33)。
表33总结了与原生Bt.4Q7Flg22相比，各种突变型Flg22多肽的相对活性以及每种条件下的标准差(STDEV)。
表33.玉米和大豆中的各种Flg22多肽的ROS活性比较
Figure BDA0002417772590002151
Figure BDA0002417772590002161
Figure BDA0002417772590002171
Figure BDA0002417772590002181
基于表33的结果，基于Flg22多肽的不同突变对玉米和大豆中ROS活性的影响，可以做出许多预测。表34描述了观察到或预测的各种靶向突变的ROS活性。简而言之，第一个氨基酸处的置换(D1N、D1Q或D1T)已经导致或可能导致玉米中Flg22受体的强识别和/或激活。内部部分的突变K7Y、K7F和A16P可能在大豆中产生相似的积极结果。在所测试的多肽中，Bt.4Q7Flg22-Syn01(S13K)和Bt.4Q7Flg22-Syn03(D1Q)在玉米和大豆中具有最强的ROS诱导活性。
表34.原生Bt.4Q7Flg22突变体版本的结果摘要
Figure BDA0002417772590002182
Figure BDA0002417772590002191
实例17：用于鉴定玉米和大豆的组合Flg多肽的ROS筛选测定法
从植物中收获玉米和大豆的叶组织，并且如先前实例15中所述进行ROS测定。评估单独或组合的不同Flg22变体的相对ROS活性以鉴定Flg22多肽的优选组合，当一起施用时，所述优选组合可为玉米和大豆提供最高的ROS活性反应。结果在表35中概括。
表35.Flg22组合在玉米和大豆中具有增加的ROS活性
Figure BDA0002417772590002192
Figure BDA0002417772590002201
实例18：纤维二糖添加剂的ROS活性测定-玉米和大豆
纤维二糖是葡萄糖二糖，并且是纤维素聚合物的基础。在化学上，纤维二糖是葡萄糖β-1-4-葡萄糖，是由两个通过β(1-4)键连接的β-葡萄糖分子组成的还原糖。通过纤维素或地衣素的分解获得纤维二糖，纤维二糖水解后产生葡萄糖。在ROS活性测定中比较了使用Bt.4Q7Flg22的处理以及使用和不使用纤维二糖的处理，以确定纤维二糖是否可以起到引发剂的作用，从而增加含Flg22多肽的反应中的ROS产生。使用ROS测定法，用玉米(图6A)和大豆(图6B)叶测定法进行的具体处理剂是：25nM的Bt.4Q7Flg22；25nM的Bt.4Q7Flg22+100μM的纤维二糖；25nM的Bt.4Q7Flg22+1mM的纤维二糖；100mM的磷酸钠缓冲液对照；和单独的纤维二糖(100μM)。
如先前实例15中所述，从植物中收获玉米和大豆的叶组织。在无菌去离子水或含有0.1％Tween-20的100mM磷酸钠(pH 7.8-8.0)缓冲液中制备Flg22生物活性引发性多肽储备液。18-24小时后，从96孔板的每个孔中除去水。用100μL溶液处理样品，所述溶液含有Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226、25nM)、纤维二糖(100μM或1mM)、34μg/mL鲁米诺和20μg/mL辣根过氧化物酶。植物组织对Flg22多肽的识别导致免疫信号的激活和质外体活性氧(ROS)的产生。在存在ROS(H2O2)的情况下，辣根过氧化物酶催化鲁米诺的氧化和可见光的产生。使用GLOMAX 96微孔板发光计(Promega Corporation)使用0.5秒积分；间隔2.6分钟在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。
为了进行数据分析，将每个处理剂的平均RLU(n＝6-16个样品，平均值的+/-标准误差)在时间过程上作图(图6)。超出四分位数范围的明显异常值被排除在分析之外。
将每种处理剂在整个实验中的平均RLU绘制在图6A(玉米)和图6B(大豆)中。尽管在仅含有Flg22多肽的处理剂下在两个植物组织中均观察到ROS产生(白色圆圈)，但是1mM纤维二糖的添加导致在两个植物组织中均具有显著的ROS活性(黑色圆圈)。与单独的Bt.4Q7Flg22相比，以较低浓度(100uM)添加纤维二糖不会改变ROS活性(比较图6A中的白色和灰色圆圈)，并且不会导致大豆中产生任何ROS(图6B中的灰色圆圈)。值得注意的是，与玉米叶片(ROS峰值约为75,000RLU)相比，25nM Bt.4Q7Flg22与1mM纤维二糖的组合导致大豆中产生更多的ROS(ROS峰值约为25,000RLU)。
实例20：施用植物磺肽素(PSKα)以提高产量–玉米和大豆
测试了植物磺肽素α(PSKα)(一种源自拟南芥的磺化的生物活性引发性多肽)对玉米和大豆产量的影响。如实例1和3中所述，在田间种植玉米和大豆。将拟南芥PSKα(SEQ IDNO:598)以1μM终浓度的叶面喷剂形式与表面活性剂一起施用，并均匀地施用于玉米(杂交种5140RR)和大豆(杂交种375NR)的地面植物部分。在玉米的V5-V8发育阶段和大豆的V1-V4发育阶段施用At.PSKα制剂。将经At.PSKα处理的玉米和大豆植物与未经处理的对照植物(水)进行比较。将处理过的植物在四个重复地块中的一个位置处随机分配，以与对照进行比较。产量以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)为单位。
表36描绘了在玉米和大豆产量试验中，叶面施用At.PSKα如何导致产量增加。通过在玉米的V5-V8发育阶段和大豆的V1-V4发育阶段施用含有At.PSKα的叶面制剂，玉米和大豆在田间均具有积极的增产效果。平均而言，玉米在田间的总产量增加了+3Bu/Ac(188.3kg/Ha)，而大豆的总产量增加了+0.8Bu/Ac(53.8kg/Ha)。
表36.在玉米和大豆上叶面施用At.PSKα导致产量增加(Bu/Ac)
Bu/Ac叶面玉米 Bu/Ac叶面大豆
3.0 0.8
实例21：叶面施用磺肽素α(PSKα)以提高产量-大豆
提供了一种方法，其中将At.PSKα以叶面施用的形式施用于活跃生长的大豆植物在具有高温和干旱胁迫的环境中提供了产量优势。
如实例6中所述，种植大豆植物。将At.PSKα多肽(SEQ ID NO:598)以叶面喷剂的形式施用于V1-V4阶段的植物。然后，在实例7-9中所述的条件下生长经At.PSKα叶面处理的大豆植物和仅用水和表面活性剂处理的对照植物，所述条件产生无胁迫和胁迫(热量和水分亏缺)环境。表37描绘了针对在V1-V4生长阶段用作为叶面喷剂的At.PSKα进行处理的大豆植物所报告的高度变化或增加百分比。与未经处理的对照大豆植物相比，At.PSKα的施用在无胁迫环境下导致高度增加+3.5％，在胁迫环境下导致高度增加+4.3％(以蒲式耳/英亩(Bu/Ac)为单位)。
表37.用At.PSKα叶面施用处理的并在无胁迫和胁迫环境下生成的大豆的产量增加
Figure BDA0002417772590002231
实例22：施用RHPP以改变植物结构-玉米
以叶面施用的形式提供最初源自大豆(Glycine max)的根毛促进性多肽(RHPP，SEQ ID NO:600)，以在玉米中产生有益的表型。
原生和逆反型RHPP(SEQ ID NO:600-601)将被施用于V5-V8阶段的玉米植物。可以在施用前，通过C端酰胺化对逆反型RHPP进行修饰。以这种方式用RHPP进行处理预计会产生具有垂直的叶片朝向和更多垂直叶片的独特叶片结构表型。叶片角度的增加对于在该地区的农业中使用具有显著的优势。这与在田间环境中用于使产量最大化的更高种植密度特别相关。RHPP多肽在玉米(玉米)中的叶面施用可用于改变叶片角度，以产生较小的叶片角度，从而导致垂直的叶片朝向。这种表型对于增加叶片面积指数、减少玉米阴影综合征和提高光合作用效率可能是有益的。另外，以叶面制剂形式提供RHPP从而使冠层发育和总透光率最大化，这对于在谷物灌浆阶段开始之前增加植物的营养生长至关重要。
实例23：施用RHPP以增加根系生物量和产量的参数-大豆
大豆根系的有效结瘤导致更高的产量和更高品质的种子生产、每种子或每英亩蛋白质和油。这可能是由于增加的固氮作用，因为根瘤形成增加了固氮作用。为了确定根毛促进性生物活性引发性多肽RHPP(SEQ ID NO:600)是否可以调节根系生物量和根瘤形成从而改善固氮作用，在R1-R2发育阶段对大豆植物(杂交种Morsoy 38X52和贝克氏杂交种297R4)进行了叶面施用RHPP处理(300nM)。
增加的植物生物量和结瘤
使用喷瓶将RHPP生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:600，最初源自大豆)以叶面处理剂的形式与0.1％(v/v)非离子表面活性剂(ALLIGARE SURFACETM)一起施用于4周龄的杂交大豆(Morsoy品种)，并向每株植物递送约1.25毫升。每个处理组每个试验总共使用8株植物进行实验。将这些地块保存在人造照明生长室中(所述生长室接受的光照水平约为300μmol m-2s-1)，保持16/8光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。在叶面施药后15天，测量每株植物的根瘤计数、根系生物量和总生物量的生长参数，并比较由ALLIGARESURFACE表面活性剂(0.1％v/v)(作为对照)和含有ALLIGARE SURFACE表面活性剂(0.1％v/v)的RHPP多肽(300nM)组成的叶面处理剂的这些参数。将所述平均生长参数相对于仅接受表面活性剂处理的对照植物进行归一化(表38)。
将叶面施用RHPP处理的每株植物的结瘤计数与仅用0.1％(v/v)表面活性剂处理的对照植物的根瘤数量进行比较。与对照(表面活性剂)处理剂相比，RHPP处理剂导致每株大豆植物根部的根瘤数量大约为两倍。叶面施用RHPP多肽的大豆植物还表现出根系生物量和总植物整体生物量的增加，当相对于照进行归一化时，根系生物量增加20％以上，总生物量增加8％。
表38.叶面施用RHPP生物活性引发性多肽后，大豆(Morsoy变种)中植物生物量和结瘤的增加(n＝8个重复植物)
Figure BDA0002417772590002241
增加的植物生长
还使用喷瓶将RHPP生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:600)以叶面处理剂的形式与0.1％(v/v)非离子表面活性剂(ALLIGARE SURFACE)一起施用于R1阶段的杂交大豆(贝克氏297R4)，所述喷瓶向每株植物递送约1.2毫升。进行此实验以研究RHPP对植物生长的影响，并且每个处理组总共使用18株植物进行此实验。将这些地块保存在人造照明生长室中(所述生长室接受的光照水平约为300μmol m-2s-1)，保持18/6光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。对R1期大豆植物不进行任何处理(未经处理的对照)、向所述大豆植物施用浓度为0.1％(v/v)的ALLIGARE SURFACE表面活性剂或向所述大豆植物施用RHPP多肽(300nM)与ALLIGARE SURFACE表面活性剂(0.1％v/v)的组合。在喷洒时记录每株植物的高度，在叶面施用后第16天再次记录高度，并比较叶面处理剂的平均生长参数(表39)。
与单独接受表面活性剂的植物和未经处理的对照相比，接受RHPP多肽(300nM+0.1％ALLIGARE SURFACE)叶面施用的大豆植物具有增加的植物生长(植物高度)和增加的植物高度变化(表39)。
表39.叶面施用RHPP生物活性引发性多肽的大豆(贝克氏297R4)中植物生长的增加(n＝18个重复植物)
Figure BDA0002417772590002251
实例24：施用RHPP与肥料的组合-大豆
将Gm.RHPP生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:600)以叶面施用的形式与液态叶面肥料N-RAGE MAX(21-1-3N-P-K)一起施用于两个大豆品种(AG3536和AG3832)。RHPP的叶面施用量为1Fl.oz/Ac或73.1mL/Ha(300nM浓度)，推荐的大豆肥料施用量为1至2gal/Ac(9.4至18.8L/Ha)，或等于2.16lbs/gal(0.29kg/L)的氮；0.10lbs/gal的磷酸盐P2O5和可溶性钾盐(K2O 0.31lbs/gal或0.4kg/L)。在美国中西部(IA、IL、IN)的5个地点，在R2发育阶段(推荐R1至R6阶段)对两个大豆品种(AG3536和AG3832)进行叶面喷施RHPP组合肥料处理剂。对于品种1(AG3536)而言，与对照处理剂相比，将Gm.RHPP与N-RAGE MAX一起叶面施用可提供1.9Bu/Ac(127.8kg/Ha)的产量优势，而与单独接受肥料处理的植物相比，产量平均增加1.4Bu/Ac(94.2kg/Ha)(表40)。
表40.施用RHPP加肥料
Figure BDA0002417772590002261
实例25：将RHPP生物活性引发性多肽施用于番茄－产量增加
在开花前阶段，以外源喷剂的形式施用Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)叶面施用处理剂，并将其用于增加番茄的产量。如实例12中所述，将两个番茄杂交种(JetSetter和BetterBig Boy)种植在小规模地块中。在早期开花(第一朵花)阶段，将Gm.RHPP叶面处理剂以1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)和20Fl.oz/Ac(1461.5mL/Ha)的施用量施用于两个杂交种JetSetter(试验1)和Better Big Boy(试验2)。7月在美国中西部(密苏里州)进行了重复试验。将番茄上的Gm.RHPP叶面处理剂与对照(以相同的用量施用水)进行比较。确定了叶面处理剂对番茄增产的影响，并将其报告为相对于水对照处理进行归一化，并报告为相对于平均对照产量的平均产量变化百分比(表41)。
分别报告了两个试验的平均产量，所述平均产量表示为相对于对照植物的变化百分比，并且以两个番茄杂交种的平均值表示。当以1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)的使用量进行施用时，使用Gm.RHPP进行叶面施用导致两个试验的番茄果实均增加。与对照植物相比，Gm.RHPP的施用使两个杂交种的番茄产量平均增加+52％，其中与对照植物相比，Jetsetter杂交种平均增产+93％而Better Big Boy平均增产10％。
表41：用于提高不同番茄杂交种的产量的RHPP叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002271
实例26：将RHPP施用于辣椒—产量增加
在第一开花阶段，以外源喷剂的形式施用Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)叶面处理剂，从而增加两个辣椒品种的产量。如实例13中所述，使用小规模地块施用Gm.RHPP叶面处理剂，所述小规模地块被设计成模拟辣椒(Capsicum)的商业生长条件。在第一个花期，使用Gm.RHPP生物活性引发性多肽叶面施用于两个品种的胡椒，红骑士(RK)和匈牙利热蜡(HHW)。使用1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)的施用量将叶面Gm.RHPP处理剂施用到RK和HHW辣椒植物上，并与对照(以相同的用量施用水)进行比较。使用一次过收获的方法确定了叶面施用对分别收获的辣椒产量的影响，并将所述影响相对于对照植物的产量归一化。表42报告了相对于对照植物产量的平均产量变化百分比，将其报告为收获的辣椒的总重量(lbs/Ac)的变化百分比。报告了RK和HHW辣椒品种的两个重复收获(试验)的平均产量变化百分比，然后将其报告为两个品种的合并平均值。
表42：用于提高不同辣椒品种的产量的RHPP叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002281
与对照植物相比，接受以1Fl.oz/Ac(73.1mL/Ha)的使用量施用的Gm.RHPP的RK和HHW辣椒平均增产87％(RK)和46％(HHW)。两个辣椒品种的合并平均值报告为：与未经处理的(水)对照辣椒植物相比，经Gm.RHPP叶面处理的辣椒产量变化百分比平均增加67％(表42)。
实例27：将超敏蛋白样和At.PSKα多肽施用于玉米
当外源性地将超敏蛋白(例如以叶面喷剂的形式)施用于植物表面时，或外生地(植物细胞膜外部的空间)或内源性地(植物细胞/植物细胞膜内部)提供超敏蛋白时，所述超敏蛋白可以提供功能性益处。在V2-V3发育阶段，将合成的超敏蛋白生物活性引发性多肽HpaG样(黄单胞菌属，SEQ ID NO:587)外源性地施用于玉米植物的表面。此外，测试了植物磺肽素α(PSKα)(一种源自拟南芥的磺化的生物活性引发性多肽)的外源施用对玉米生长的影响。
在环境受控的生长室中生长玉米(贝克氏(杂交种5828YH)植物。将玉米种子直接种植到39.7cm3的含有Timberline表层土壤的地块中，深度为2.54cm，每块地2颗种子。种植后，向每个地块中添加50mL室温水以使种子发芽。将这些地块保存在接受约300μmol m-2s-1(光子)的人造照明生长室中，保持16/8光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。植物接受相同的浇水和施肥方案。
在出苗后3周测量植物高度(cm)。然后将以合成的23个氨基酸的多肽形式提供HpaG样生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:587)和At.PSKα生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:598)以叶面喷剂的形式施用于玉米植物，HpaG样的最终浓度为1μM而PSKα生物活性引发性多肽的最终浓度为100mM。仅用表面活性剂(0.01％v/v)处理对照植物。喷洒处理一周后，将植物分为两组，将一组保持在与所述标准生长环境相同的环境中，而将另一组转移到提供高温和缺水胁迫的环境中。对于热量和水分亏缺的处理，生长室环境(温度和浇水/肥料循环除外)保持与标准生长环境相似。使用加热垫施加高温胁迫，将环境温度从21℃升高到27℃。在高温胁迫期间，不给植物浇水，以模拟缺水胁迫。在第5周测量植物高度的变化(cm)，并报告为相对于对照(水)植物的高度进行归一化或归一化为对照植物的高度百分比。报告的测量值是两个试验的平均值，每个试验有9个重复植物(表43)，并表示为相对于接受水加表面活性剂(0.01％v/v)的对照玉米植物的生长百分比，标准化为100％(表43)。
表43.用X.spp.HpaG样和At.PSKα处理的玉米植物的植物高度变化
Figure BDA0002417772590002301
与对照植物相比，使用HpaG-like多肽的叶面施剂在正常环境中显示出改善的生长表型而在胁迫中不显示改善的生长表型，PSKα叶面施剂在高温和缺水胁迫的条件下显示出改善的生长表型而在无胁迫环境中不显示改善的生长表型。
在另一组独立的重复试验中，叶面施用HpaG-like(SEQ ID NO:587)和PSKα(SEQID NO:598)导致了相似的生长速率变化。表44示出了接受以叶面处理剂形式施用的X.spp.HpaG-like多肽(最终浓度为1μM)和At.PSKα(最终浓度为100nM)的玉米的植物生长变化百分比，通过相对于最佳(无胁迫)环境和胁迫环境中生长的对照植物(水加0.01％v/v表面活性剂)的植物高度变化测量所述植物生长变化百分比。这表明PSKα生物活性引发性多肽与HpaG样生物活性引发性多肽的组合叶面施用或顺序施用可用于增强标准(无胁迫或最佳生长)环境下的植物或暴露于非生物胁迫(例如、高温和缺水胁迫)的植物的生长。
表44.使用Xspp HpaG-like和At.PSKα多肽在无胁迫和胁迫条件下生长的玉米上进行叶面施用处理
Figure BDA0002417772590002311
实例：28Bt.4Q7Flg22或Ec.Flg22与RHPP的组合
将生物活性引发性多肽Bt.4Q7Flg22和Ec.Flg22与RHPP组合并使用，以在大豆中获得产量效益。在跨美国中西部(IA、IL和IA)的7个地点，将Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)或Ec.Flg22(SEQ ID NO:526)与RHPP(SEQ ID NO:600)的组合叶面施用于两个大豆品种(AG2836，品种1；AG3536，品种2)。
在R2发育阶段，将使用Bt.4Q7 Flg22生物活性引发性多肽(SEQ ID NO:226；图4A)和Ec.Flg22(SEQ ID NO:526；图4B)和RHPP(SEQ ID NO:600)的叶面施剂以不同施用量(0.33、4.0、8.0和16.0Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha、292.3mL/Ha、584.6mL/Ha、1169.2mL/Ha)单独施用于用大豆植物(商业杂交种贝克氏294NR)。报告了在7个不同地点种植的大豆的平均产量(9月收获)，以蒲式耳/每亩(Bu/Ac)，并且分别报告了这两个大豆品种的平均产量以及合并的平均产量(表45)。还将两个品种的大豆产量(Bu/Ac)报告为相对于对照大豆植物进行归一化的产量(Bu/Ac的变化。
表45.Flg多肽和RHPP多肽增加大豆的产量
Figure BDA0002417772590002312
Figure BDA0002417772590002321
在美国中西部的所有7个地点，大豆品种AG3536(品种2)的产量Bu/Ac始终优于AG3536(品种1)。与未经处理的对照植物相比，以三种不同的施用量(0.33、4.0和8.0Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha、292.3mL/Ha、584.6mL/Ha)单独施用Bt.4Q7Flg22、Ec.Flg22和RHPP叶面施剂均产生了产量优势。与其它单独施用的生物活性引发性多肽相比，以4.0Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha)的施用量叶面施用RHPP导致最大的产量增加，与对照植物相比为+1.26Bu/Ac(84.7kg/Ha)。然而，Bt.4Q7Flg22与RHPP的组合提供了额外的产量优势，从而导致与未经处理的大豆对照植物相比增加+2.61Bu/Ac(175.5kg/Ha)。从经Bt.4Q7Flg22与RHPP组合叶面施剂处理的大豆植物中观察到的这种产量增加说明了通过结合生物活性引发性多肽获得的协同效应，其中组合引起的产量增加大于单独施用的两种多肽引起的产量增加的总和。
实例29：使用根癌土壤杆菌测试硫蛋白在治疗HLB疾病中的有效性
将根癌土壤杆菌菌株GV3101接种到Luria肉汤培养基(LB)中，并生长20小时。最初，使用分光光度计在600nm的波长下测量培养物的光密度(OD)，并将其相对于低起始密度归一化。然后将培养物均分，并用相似比例的硫蛋白进行处理，这些硫蛋白代表用于处理柑橘树木的混合物。Cs.thionin(SEQ ID NO:651)、As.thionin(SEQ ID NO:652)和Mt.thionin(SEQ ID NO:653)的使用比率分别为10.0％、2.0％、0.40％、0.08％和0.02％，并将这些比率制备成与每种硫蛋白混合物滤液的20mL总体积相匹配，市售滤液用作每棵树的处理剂。还将每种硫蛋白混合物与仅含有以下成分的对照混合物进行了比较：滤液、基本培养基(LB)或四环素(Tet)抗生素(每种培养物10μg/mL)。每个条形代表3次重复的合并OD测量值。与硫蛋白和抗生素混合物一起温育后，再次测量光密度(OD 600)，以确定土壤杆菌培养物的生长是否被减少或抑制。
如图8所示，与滤液、基本培养基(LB)或抗生素(Tet)对照相比，Cs.thionin、As.thionin和Mt.thionin处理剂均显示出剂量依赖性反应并且土壤杆菌培养物的生长减少。
实例30：用硫蛋白治疗亚洲柑橘黄龙病菌感染
将在来自佛罗里达州中部(奥基乔比县)的一个果园的柑橘树中测试硫蛋白治疗亚洲柑橘黄龙病菌感染的用途。将使用硫蛋白(SEQ ID NO:620；621和622)的调配混合物(具有或不具有韧皮部定位序列(SEQ ID NO:611))对总共26棵树木进行处理，以将硫蛋白特异性地靶向亚洲柑橘黄龙病菌所在的韧皮部。将使用低压注射装置BRANDT ENTREE用这些硫蛋白及其混合物的制剂对瓦伦西亚橙(Citrus sinensis)树进行接种。将总共四种硫蛋白处理剂施用于5树龄的树木，所述处理剂包含水作为阴性对照和土霉素作为阳性对照。将柑橘树随机分为对照(未经处理的)树地块、经硫蛋白处理树地块和阳性对照经抗生素(土霉素)处理的树地块。与韧皮部靶向序列融合的硫蛋白将在pBC载体中表达，并从表达的细胞中收集含有硫蛋白的滤液。20mL总体积的含有硫蛋白：Cs.thionin(SEQ ID NO:651)、As.thionin(SEQ ID NO:652)和Ms.thionin(SEQ ID NO:653)的混合物将以20mL总体积的滤液形式提供。将经硫蛋白处理的柑橘树与未经处理的(对照)柑橘树以及接受单独的阳性对照抗生素(土霉素)的柑橘树进行比较，施用浓度为每棵树2克。将通过使用16S rRNA基因特异性引物和嵌套引物以检测HLB疾病的qPCR检测或扩增，来检测亚洲柑橘黄龙病菌对树的感染水平[序列5’＞＞3’：(正向)HLB为TCGAGCGCGTATGCAATACG；(反向)HLBrGCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG；荧光报告染料标记的HLBpc(探针)AGACGGFTGAGTAACGCG]。
将在3月份对植物进行处理，并在一个月后4月份收集叶片样本。将评估亚洲柑橘黄龙病菌的平均细菌计数，以及叶片斑点斑驳或叶和茎发黄迹象的视觉症状等级分数。
每棵树将收集20个代表性果实的果实大小、形状和果实发育或成熟度。纵向长度(大直径，厘米)和宽度(小直径，厘米，如果果实不对称，则取最大和最小宽度的平均值)。将通过宽度与长度之比来衡量果实形状。将获得总果实重量，并将其除以果实总数(20)，从而得出平均果实重量(克)。将收集总果实重量，并以千克/树表示。
将按照美国农业部关于oBrixc实验室分析方法的最低标准，从每棵树中获得从榨汁(榨制)葡萄柚和橙果中获得的果汁的酸校正oBrix(oBrixc)值。还将测量酸百分比(％，w/v)。折光仪上待重构果汁的oBrix读数等于期望的酸校正Brix值减去酸贡献和温度影响。重构果汁的总可滴定酸度(％酸)也将根据重构的oBrix和oBrix/酸比率进行计算，并使用酸校正和温度校正因子进行调整(《JBT FoodTech实验室手册(JBT FoodTech LaboratoryManual)》,“柑橘类产品的分析程序(Procedures for Analysis of Citrus Products)”,第六版)。
将使用实时荧光PCR、定量聚合酶链反应(qPCR)技术计算细菌细胞计数，以仅检测活细菌并从死细胞中扣除背景DNA(包含裸露的DNA或DNA)(Davis和Brlansky,“使用实时荧光定量PCR和单叠氮化丙锭对活的亚洲柑橘黄龙病菌种群进行定量(Quantification oflive Candidatus Liberibacter asiasticus populations using real-time PCR andpropidium monoazide)”,《植物病害(Plant Disease)》97:1158-1167,2013)。将在收集自经硫蛋白处理的树木、未经处理的(对照)树木和阳性对照(抗生素)处理的树木的叶子中测量亚洲柑橘黄龙病菌(CLas)细胞特有的菌落计数。将从通过qPCR获得的DNA产量中获得活细菌滴度的计算，并将其拟合到回归方程中，以将目标拷贝数与总细菌计数相关联，并以每克组织的活细胞对数刻度表示。对经处理的树木和未经处理的树木的滴度的比较将与疾病严重性程度或疾病症状(如红葡萄柚和巴伦西亚橙树的叶片经典斑点斑驳、果实变形或不平衡以及果实变绿等)的程度相匹配。
实例31：使用逆反型生物活性引发性多肽来治疗并减少柑橘绿化病
可以使用与逆反型对应物进行配对的鞭毛蛋白相关型多肽的组合来治疗并减少柑橘的绿化效应，所述绿化效应导致亚洲柑橘绿化病或黄龙病(HLB)。
柑橘HLB的的早期症状是对单个枝干上的叶子变黄或树冠的一部分上的叶子变黄。由于HLB而变黄的叶子会显示出不对称的斑驳发黄或叶片成斑，表现为叶子的一边是绿色而另一边是黄色。随着HLB疾病的发展，果实大小变小，果汁变成苦涩。果实可能保持部分绿色，并且往往过早地脱落。
逆反形式的Flg22和原生形式的Flg22可以竞相与植物表面的一个或多个FLS相关型受体结合，从而抑制/延迟与HLB疾病相关的症状形成。使用原生Flg22和RI的组合将协助微调的免疫反应，以减少并甚至消除引起疾病的细菌(亚洲柑橘黄龙病菌)，从而防止急性症状(如叶片发黄和柑橘属果实绿化)的发展。
将使用Flg多肽与其逆反(RI)形式的处理剂组合来使HLB感染对柑橘属果实绿化的效应最小化。将使用下表46中所述的鞭毛蛋白生物活性引发性多肽组合来处理34株商品葡萄柚(Citrus paradise Macfad.)和6株甜橙(Citrus sinensis(L.))树(不论是否具有HLB疾病症状)，使用被称为BRANDT enTREE的低压注射装置将Flg多肽分配到树的内部。
表46.原生Flg22和逆反型Flg22生物活性引发性多肽的组合
Figure BDA0002417772590002351
Figure BDA0002417772590002361
如实例15中所述，将使用ROS测定法分析来自这些经处理的葡萄柚和甜橙树的叶片组织样品。将从3月至8月在佛罗里达州中部的果园中进行采样。柑橘园的样品将被认为是该州的代表。采样的果园的最小面积为2公顷(范围为2-24Ha，平均为5.2Ha)。将随机选择选定的果园柑橘树，并在每个随机地块中嵌套未经处理的对照树。将从年龄大致相同的树木中收集葡萄柚和橙树的叶子组织。将在树木的相似位置对叶片进行采样，并且采样时，仅从生长迅速的树木中抽取叶片。在选定进行采样的果园中，将保持类似的栽培习惯，包含洪水灌溉和使用除草剂进行杂草管理。然而，在采样叶片用于ROS测定之前至少30天内，不会对选定的果园进行任何农药施用。每个果园将随机采样表现出HLB疾病症状的10棵葡萄柚树进行两次重复试验，并将其与没有任何症状的14棵葡萄柚树(未感染的对照)进行比较。将在甜橙中进行类似的叶片采样(四个感染样本与两个未感染的对照相比)。这些树将被选为整个果园的代表。将进行嵌套方差分析(ANOVA)，以确定从对照和感染的HLB柑橘叶片样品的处理中观察到的ROS活性的任何差异的统计显着性。
实例32：Flg22多肽的叶面施用减少了大豆尾孢属叶枯萎病
在V3发育阶段，将源自苏云金芽孢杆菌的Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽(SEQID NO:226)和表达Bt.4Q7Flg22(H1)的假蕈状芽孢杆菌叶面施剂施用于曾生长在美国中西部的3个不同地点的大豆植物(商业杂交种贝克氏294NR)，这些地点以前曾在田间感染过尾孢菌。
在所有田间实验中，使用尾孢属叶枯萎病等级量表(受影响的叶面积的百分比)来评定疾病的严重性。使用视觉键，基于ASSESS图像分析计算出受影响的叶面积的百分比，从而进行植物病害定量分析(Chagas Ferreira da Silva，LSU硕士论文，2014)。对最上面的三叶叶片的症状进行百分比排序。
结果描述于表47中。视觉上，与未经处理的对照植物相比，接受Bt.4Q7Flg22生物活性引发性多肽和表达Bt.4Q7Flg22(H1)的假蕈状芽孢杆菌叶面处理的大豆植物具有增加的活力。对照植物在4周观察时间点处显示出早期症状发展的增长，与Bt.4Q7Flg22处理剂(0.33Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha)的20％增长以及Bt.4Q7Flg22处理剂(4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)约5％增长相比，所述对照植物增长了30％。由于尾孢菌感染，与未经处理的对照植物相比，接受表达Bt.4Q7Flg22(H1)的假蕈状芽孢杆菌处理剂的大豆植物也显示出较少的早期症状发展，在4周时为20％(0.33Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha)和10％(4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)。在施用后的第8周，未经处理的对照植物在植物的上部叶片(前3-4个三叶叶片)上显示出50％的视觉症状损害。在叶面处理后的第8周，接受Bt.4Q7Flg22多肽叶面处理剂(0.33Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha)的植物的症状等级与未经处理的对照植物相当。然而，接受Bt.4Q7Flg22多肽(4.0Fl.oz/Ac)和表达Bt.4Q7Flg22(H1)的假蕈状芽孢杆菌(0.33Fl.oz/Ac或24.1mL/Ha和4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)叶面处理剂的大豆植物表现出明显更少的明显症状和损害。总体而言，与表现出枯萎和紫色着色症状以及脱叶的未经处理的植物相比，Bt.4Q7Flg22多肽处理剂(4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)可有效预防尾孢菌感染引起的早期症状发展。因此，以较高的施用量(例如4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)施用Bt.4Q7Flg22多肽叶面施剂可以提供一种管理早期症状发展的手段，并提供生长在曾受尾孢菌影响的田间地点的更健康、更具活力的大豆植物。
表47：用Bt.4Q7Flg22和表达Bt.4Q7Flg22的Bp.对大豆植物进行叶面处理导致大豆上尾孢菌的病害和症状发展减轻
Figure BDA0002417772590002381
实例33：施用于玉米—增强型归一化的差异植被指数(ENDVI)分析
增强型归一化的差异植被指数(ENDVI)是活的具有光合活性的绿色植被的指标，并且用于比较使用遥感技术进行的田间试验的治疗效果。在ENDVI指数中，介于-1.0到0.1之间的值表示光合作用降低的不健康植物，而接近1的值则表示茂密的绿色、高光合能力和增加的生物量。健康的植物会强烈吸收400-700nm光谱波长范围内的可见光，并反射700-1100nm的近红外光中的波长。ENDVI测量值可以对应于某些营养特性，如植物生物量或绿色度、植物冠层对光的吸收、光合能力(例如，叶面积指数、生物量和叶绿素浓度)。使用BGNIR相机(Zenmuse X3)收集ENDVI图像，所述相机连接到专门为捕获图像并在捕获过程中滤除不同波长的光而创建的无人机(DJI MATRICE 100)上。摄像机使用传感器捕获电磁光谱的可见和近红外波段。具有大量植被或生物量的健康植物反射绿色(G)和近红外(NIR)光，同时吸收蓝色(B)和红色光。健康程度较低或地上生物量较少的植物反射更多可见光和更少近红外光。ENDVI使用NIR和G作为反射通道，同时使用B作为吸收通道。下列ENDVI公式将NIR和绿色通道加在一起作为反射通道。将蓝色通道乘以2，以补偿相加在一起的NIR和G通道。ENDVI公式如下计算NIR、G和B通道，以提供比值作为单个输出。
Figure BDA0002417772590002391
在美国中西部(IL)种植用种子处理剂处理过的玉米种子(DEKALB杂交种DKC 58-89)，所述种子处理剂包括EVERGOL杀真菌剂(7.18％丙环唑、3.59％氟唑菌苯胺并与5.74％甲霜灵组合)和PONCHO/VOTiVO 500(40.3％噻虫胺杀虫剂与51.6％坚强芽孢杆菌I-1582(一种微生物制剂)的混合物)。在V5-V7发育阶段，将含有Bt.4Q7Flg22和Bt.4Q7Flg22的合成版本(如表48中所述的Syn01Flg22)的各种叶面处理剂施用于玉米植物。在每次叶面处理后三周以及玉米冠层完全闭合后，在试验地块上方50m处通过无人机飞行收集BGNIR图像。使用无人机显示图像分析软件对单幅BGNIR图像进行处理，以创建试验地块的单个正射影像图像，然后使用Fiji成像软件对其进行进一步分析。在正射影像图像中，在每个田间试验中都使用GPS坐标清楚地确定了用于鉴定田间的个别叶面处理以及每次处理的重复样的地块区域。所鉴定的用于成像的处理重复样大小一致。对于每次叶面处理，收集三个重复样，每个重复地块成像两行。在每个重复中，以0-255的范围测量了每个图像通道[蓝色、绿色和近红外(可视化为红色)]的平均光强度，其中强度0＝0％反射(黑色像素)而强度255＝100％反射(白色像素)。使用这些平均B、G和NIR光强度，使用ENDVI算法对每个重复地块的植物健康(绿度)进行ENDVI值计算。然后将三个地块重复样的ENDVI值取平均值，如表49和表50所示。将处理施用的ENDVI值与每个地块中的对照处理的ENDVI值进行比较。对照处理由从种子生长的玉米植物组成，所述种子仅用基础种子处理剂进行处理，而未接受任何叶面处理剂。使用表48中规定的施用量描述了叶处理剂组合物。
表48.用于玉米和大豆测试的叶面Flg22处理剂的组合物
Figure BDA0002417772590002392
Figure BDA0002417772590002401
Figure BDA0002417772590002411
叶面组合物含有0.1％(v/v)的PROXEL BC防腐剂、330.7mM 1,2-苯并噻唑啉酮(BIT)、53.5mM 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)和26.1mM 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)的混合物的水分散液。将叶面组合物以指定的比率(Fl.oz/Ac或mL/Ha)以20加仑/英亩水的载体体积与0.1％(v/v)Alligare SurfaceTM非离子表面活性剂一起施用。
如表49所示，与未接受叶面处理剂的植物(种子处理对照)相比或相对于所述对照进行归一化，在V5-V7发育阶段将含有Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg 22的组合物叶面施剂施用于玉米导致玉米的ENDVI测量比值增加。与接受以4Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha施用的非缓冲组合物(组合物1)形式的Bt.4Q7Flg22的植物相比，以缓冲制剂叶面处理剂形式提供的Bt.4Q7Flg22组合物(组合物2、3、4和5；磷酸钠pH 5.6-5.7)导致植物具有更高的ENDVI比值。然而，与未经处理的对照植物相比，Bt.4Q7Flg22处理后的植物(组合物1-5)的ENDVI比值均增加。与对照(仅种子处理剂)植物相比，接受组合物4叶面处理剂施用的玉米植物的平均ENDVI比值增加+9％，所述叶面处理剂由Bt4Q7Flg22多肽与磷酸盐缓冲液制剂形式的纤维二糖的组合(以8Fl.oz/Ac或584.6mL/Ha的施用量提供)组成。接受了组合物1和5叶面施肥的植物导致植物的ENDVI比值相似(与对照植物相比+3％和+4％)，这些植物仅在组合物的各自施用量上有所不同(4和48Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha和3,507.6mL/Ha)。重要的是，较高的施用量48Fl.oz/Ac或3,507.6mL/Ha导致不可检测的植物毒性，这可能通过与对照(仅种子处理剂)相比ENDVI值降低观察到。还将合成衍生变体版本的Bt.4Q7Flg22(Syn01Flg22)组合物6、7和8以叶面喷剂的形式提供给V5-V7玉米植物。根据施用量，比较以磷酸盐缓冲制剂形式提供的Syn01Flg22多肽(组合物6和组合物7)。与使用0.4Fl.oz/Ac或29.23mL/Ha的施用量施用于植物的Syn01Flg22多肽(组合物7)相比，使用较高施用量(4Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha)提供给玉米植物的Syn01Flg22多肽(组合物6)导致ENDVI比值降低或ENDVI增加的百分比降低，组合物6和7处理剂之间的变化为8％。Syn01Flg22(组合物8)添加了纤维二糖，并且类似于以0.4Fl.oz/Ac或29.23mL/Ha的施用量提供的组合物7。将Syn01Flg22(组合物7)叶面施剂与纤维二糖(320mM)组合的Syn01Flg22(组合物8)叶面施剂进行比较。Syn01Flg22组合物7和组合物8在ENDVI测量比率上具有相似的增加，从而导致与对照植物相比增加+10％，或者与接受了以较高施用量(4Fl.oz/Ac或292.3mL/公顷(Ha))提供的Syn01Flg22(组合物6)的植物相比增加+8％。
表49.提供用于玉米杂交种DKC 52-61上的叶面Flg22处理剂的ENDVI输出
Figure BDA0002417772590002421
Figure BDA0002417772590002431
*相对于种子处理剂归一化：EVERGOL和PONCHO/VOTiVO 500
还用Roundup POWERMAX(活性成分草甘膦，48.7％钾盐形式)与Rt.4Q7Flg22组合物3的组合对玉米种子(DEKALB杂交种DKC 52-61)进行处理。使用标本标签上的推荐用量(24Fl oz/Ac)施用Roundup POWERMAX。以4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha的比率施用Bt.4Q7Flg22(组合物3)。结果在表50中示出。
表50.玉米(杂交种DKC 52-61)上与除草剂组合的Flg22多肽叶面施剂的ENDVI
Figure BDA0002417772590002432
相对于RoundUp POWERMAX叶面处理剂归一化
如表50所示，在V5-V7发育阶段以叶面除草剂形式施用于玉米的RoundupPOWERMAX与Bt.4Q7Flg22(组合物3)的组合导致ENDVI的测量比率增加，与不使用Bt.4Q7Flg22多肽的情况下施用Roundup POWERMAX相比增加+8％。
实例34：将生物活性引发性多肽施用于V4-V7玉米－产量增加
用种子处理剂包被的玉米种子(DEKALB杂交种：DKC 52-61、DKC 58-89和DKC 65-81)种植大面积玉米试验，所述种子处理剂包括EVERGOL杀真菌剂(7.18％丙环唑、3.59％氟唑菌苯胺和5.74％甲霜灵)和PONCHO/VOTiVO 500(噻虫胺杀虫剂与微生物制剂(坚强芽孢杆菌I-1582)的混合物)。在美国中西部(IN、IL和IA)的8个地点进行了玉米田间试验。使用玉米种植的常规或保护性耕作方法制备每个地点的田间苗床。按照美国中西部地点之间一致的常规耕作方式的建议施用化肥。施用除草剂施以控制杂草，并在必要时补充栽培。在所有地点都种植了5.3米的四行地块。以3.8至5.1厘米的深度种植玉米种子，以确保正常的根系发育。玉米的种子面积为每英亩平均42,000株植物或每公顷103,782株植物，平均行宽为0.8米，每30厘米种子间距为1.6到1.8颗种子。
使用包括Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)多肽和被描述为Syn01Flg22的Bt.4Q7Flg22的合成版本(SEQ ID NO:571)多肽的叶面组合物对约处于V5发育阶段的玉米植物进行叶面施用。将包括Bt.4Q7Flg22多肽和Bt.4Q7Flg22多肽的合成版本的叶面组合物施用于3个玉米杂交种(DEKALB杂交种：杂交种1：DKC 52-61；杂交种2：DKC 58-89；杂交种3：DKC 65-81)，所述玉米杂交种种植于美国中西部(IN、IL和IA)的8个地点。玉米植物接受了表51中所述的浓度和施用量下的叶面施剂。表51中收集了玉米产量(Bu/Ac)，并将其报告为各个地点(8个地点为杂交种1、7个地点为杂交种2并且6个地点为杂交种3)的平均产量(Bu/Ac)，以及与仅使用表面活性剂进行处理的基础种子处理剂(ST)对照相比，Bu/Ac的平均变化。
表51.使用Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22合成突变体的叶面处理剂–提高玉米产量
Figure BDA0002417772590002441
Figure BDA0002417772590002451
使用包括Bt.4Q7Flg22和Bt.4Q7Flg22多肽的合成版本Syn01Flg22的叶面组合物对约处于V5发育阶段的玉米植物进行叶面施用。Bt.4Q7Flg22和Bt.4Q7Flg22多肽的合成版本还与320mM纤维二糖(由两个通过β-(1→4)键连接的β-葡萄糖分子组成还原糖)组合，并以激发子处理剂的形式提供，以增强Flg22多肽的作用。与Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22叶面施用的多肽相比，与纤维二糖组合提供给玉米植物的Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22两者都产生了增强的产量提高。接受Bt.4Q7Flg22叶面处理剂和纤维二糖的玉米植物产生+2.55Bu/Ac或160kg/Ha的正向产量增加，而单独提供叶面处理剂则产量增加+1.14Bu/Ac或71.6kg/Ha。与提供Syn01Flg22叶面处理剂(0.2Fl.oz/Ac或14.6mL/Ha)所产生的+1.48Bu/Ac或92.9kg/Ha产量增加相比，以相同施用量接受Syn01Flg22叶面处理剂与纤维二糖的组合的玉米植物也获得了+1.59Bu/Ac或99.8kg/Ha的正向产量增加。然而，与两种Flg22多肽与纤维二糖的组合相比，在V5发育阶段以4.0Fl.oz/Ac或292.3mL/Ha的施用量以叶面处理剂形式提供给玉米的Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22提供略低的产量增加，分别增产+1.14Bu/Ac(71.6kg/Ha)和+0.90Bu/Ac(56.5kg/Ha)。
实例35：合成衍生的Flg22(Syn01Flg22)与杀真菌剂的组合
在进一步的研究中，使用叶面施剂进行了大面积产量试验，所述叶面施剂包括与广谱杀真菌剂STRATEGO YLD(10.8％丙硫菌唑和32.3％肟菌酯)一起提供的Bt.4Q7Flg22多肽和来自Bt.4Q7Flg22的合成衍生多肽(Syn01Flg22)的组合物。STRATEGO YLD是一种市售杀真菌剂，其适用于玉米的早期季节叶面施用，按照标本标签上的建议以每英亩4.0液量盎司(Fl.oz/Ac)(292.3mL/公顷)的施用量将所述杀真菌剂以叶面喷剂的形式施用于玉米。使用包括与STRATEGO YLD杀真菌剂组合的Bt.4Q7Flg22多肽和Syn0Flg22(Syn01Flg22多肽的合成版本)的叶面组合物对约处于V5发育阶段的玉米植物进行叶面施用。将叶面处理剂施用于2个玉米杂交种(DEKALB杂交种：杂交种1：DKC52-61；杂交种2：DKC 58-89)，所述玉米杂交种种植于爱荷华州的2个地点。收集了玉米产量(Bu/Ac)，并将其报告为两个杂交种在2个地点的平均产量(Bu/Ac)，以及与接受基础种子处理剂(ST)和单独的STRATEGOYLD杀真菌剂叶面施剂的种子所生长出的玉米植物相比，Bu/Ac的平均变化(表52)。
表52.与杀真菌剂组合的Bt.4Q7Flg22合成突变体玉米产量叶面施剂
Figure BDA0002417772590002461
Figure BDA0002417772590002471
基本种子处理剂(ST)由EVERGOL杀真菌剂+PONCHO/VOTIVO 500组成。按样本标签上建议的浓度和施用量施用STRATEGO YLD杀真菌剂。
按上表5中所规定的浓度和施用量将Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22多肽与杀真菌剂STRATEGO YLD一起叶面施用于V5玉米导致了+5Bu/Ac以上的增产。Syn01Flg22多肽处理剂导致的玉米增产(与仅用STRATEGO YLD杀真菌剂进行叶面处理的植物相比增产+5.84Bu/Ac(366.6kg/Ha))略高于接受Bt.4Q7Flg22多肽处理剂的玉米植物的平均增产(+5.50Bu/Ac(345.2kg/Ha))。
实例36：用Flg22多肽进行种子处理以增加玉米的产量
在其它研究中，使用基础种子处理剂进行了大面积产量试验，所述基础种子处理剂由与各种Flg22多肽组合提供的EVERGOL杀真菌剂(7.18％丙环唑、3.59％氟唑菌苯胺并与5.74％甲霜灵组合)和PONCHO/VOTiVO 500(40.3％噻虫胺杀虫剂与51.6％坚强芽孢杆菌I-1582(一种微生物制剂)的混合物)组成。将种子处理剂施用于种植在美国中西部(IN、IL和IA)的8个地点的3个玉米杂交种(贝克氏4919V2、5140HR和5828YX)。按表53所示，以总浆料体积中每单位玉米或大豆种子Fl.oz施用Flg22多肽的种子处理剂组合物，所述总浆料体积含有来自苏云金芽孢杆菌的基础种子处理剂Bt.4Q7Flg22(组合物10)和来自蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)的Pa.Flg22(组合物11)。组合物10和11的浆液中多肽的最终浓度为1uM。
表53.用于玉米和大豆测试的Flg22种子处理剂的组合物
Figure BDA0002417772590002481
收集了玉米产量(Bu/Ac)，并将其报告为所有3个杂交种在8个地点的平均产量(Bu/Ac)。与仅接受基础种子处理剂(ST)的种子所生长出的玉米植物相比，得出Bu/Ac平均变化并报告在表54中。
表54.具有Flg22多肽的玉米种子处理剂可提高产量
Figure BDA0002417772590002482
用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Pa.Flg22(SEQ ID NO:293)多肽处理玉米种子提高了产量，如3个玉米杂交种和8个美国中西部地点的平均值所示。与对照植物相比，以种子处理剂形式提供的Bt.4Q7Flg22多肽产生了更大的产量优势或+4.73Bu/Ac(296.9kg/Ha)。与仅接受基础种子处理剂的种子所生长出的玉米植物相比，用作种子处理剂的Pa.Flg22也获得了+3.57Bu/Ac(224kg/Ha)的增产。因此，当用作玉米种子的种子处理剂时，从不同物种的细菌(芽孢杆菌和类芽孢杆菌)获得的Flg22多肽均导致产量的实质性增加。
实例37：将Flg22多肽与纤维二糖一起施用以提高玉米的产量
由含有种子处理剂的玉米种子(DEKALB杂交种：DKC 52-61、DKC 58-89和DKC 65-81)种植大面积玉米试验，所述种子处理剂包括EVERGOL杀真菌剂(7.18％丙环唑、3.59％氟唑菌苯胺并与5.74％甲霜灵组合)与PONCHO/VOTiVO 500(噻虫胺杀虫剂与微生物制剂(坚强芽孢杆菌1582)的混合物)的组合。使用包括Bt.4Q7Flg22和合成Syn01Flg22多肽的农业组合物(具有或不具有320mM纤维二糖)对约处于V5发育阶段的玉米植物进行叶面施用。在玉米发育的授粉阶段，将叶面处理剂施用于种植在美国中西部(IL)的两个地点的2个玉米杂交种(DEKALB杂交种：杂交种1：DKC 58-89；杂交种2：DKC 65-81)，所述玉米杂交种在叶面施肥后经历了类似干旱的情况。按表48中所述的浓度和施用量将Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22叶面处理剂与非离子表面活性剂(以喷罐容积的0.1％v/v最终浓度施用的Alligare SurfaceTM)一起施用于玉米植物。收集了玉米产量(Bu/Ac)，并将其报告为2个杂交种在2个地点的平均产量(Bu/Ac)，以及与仅接受基础种子处理剂(ST)和非离子表面活性剂(以喷罐容积的0.1％v/v最终浓度施用的Alligare SurfaceTM)的玉米植物的产量相比，Bu/Ac的平均变化(表55)。
表55.Flg22多肽与纤维二糖的组合-玉米
Figure BDA0002417772590002491
Figure BDA0002417772590002501
当与具有纤维二糖的叶面处理剂施剂组合时，Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和合成版本Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)的叶面处理剂施剂在玉米植物中产生了可观的增产，所述纤维二糖是用作Flg多肽的辅助稳定剂和递送至植物膜表面的媒剂的二糖。与单独的4.0Fl.oz/Ac Bt.4Q7Flg22多肽相比，与纤维二糖(320mM)一起以叶面喷剂的形式按4.0Fl.oz/Ac的施用量(Flg22)施用的Bt.4Q7Flg22多肽(16.7μM)导致产量增加一倍以上，与对照植物相比增加+8.22Bu/Ac或约516kg/ha。与从表面活性剂对照中生长的对照植物相比，在不存在纤维二糖的情况下施用Bt.4Q7Flg22多肽获得了+3.70Bu/Ac或232kg/Ha的增产。以0.2Fl.oz/Ac的施用量用Syn01Flg22以及Syn01Flg22(16.7μM)与纤维二糖(320nM)的组合处理过的玉米植物获得了类似的产量增加，与从表面活性剂对照植物获得的产量相比，分别增产了+9.60(602.6kg/Ha)和+15.48(971.6kg/Ha)。另外，在V5-V7发育阶段，以3种不同的施用量0.2、2.0和24.0Fl.oz/Ac(14.6mL/Ha、146.2mL/Ha和1753.8mL/Ha)将Bt.4Q7Flg22(16.7μM)多肽以叶面喷施剂的形式提供给玉米植物。使用最高施用量递送的Bt.4Q7Flg22多肽导致实质上更高的产量优势，与从对照植物获得的产量相比，几乎增产了+27Bu/Ac(1694.6kg/Ha)。总体而言，Bt.4Q7Flg22和合成版本的Syn01Flg22在植物发育的关键阶段(即授粉阶段)保护植物免受类似干旱的生长条件影响，从而导致用作叶面施剂的Bt.4Q7Flg22、Syn01Flg22和纤维二糖的所有组合均提高了产量。
在另一项研究中，使用Flg22多肽和Flg22多肽与纤维二糖的组合的种子处理剂导致田间试验的总产量增加，将其报告为四个重复试验的平均值(表56)。将种子处理剂施用于种植在美国中西部(哥伦比亚)的1个地点的玉米杂交种(贝克氏5828YX)。如表56所示，以含有基础种子处理的总浆料体积中每单位玉米种子0.14.Fl.oz施用Flg22的种子处理剂组合物。将浆料中的Flg22多肽的最终浓度标准化为每颗种子1uM。当与Flg22多肽一起以组合处理剂的形式施用时，纤维二糖的同一最终浓度为每颗种子1.0mM。如下表56所述，报告了接受Flg22多肽组合处理剂的种子所生长出的玉米的平均产量(Bu/Ac)，以及与未经处理的对照(第1列)和Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)(第2列)相比，Bu/Ac的平均增加。
表56.Flg22多肽和Flg22多肽变体与纤维二糖的种子处理剂组合-玉米
Figure BDA0002417772590002521
Figure BDA0002417772590002531
实例38：将Flg22和纤维二糖添加剂施用于V4-V6大豆增产–大面积产量试验
由未包衣的大豆种子种植大面积大豆试验。以1.5至2英寸(约5厘米)的深度种植大豆种子，以确保正常的根系发育。在12.5英寸(3.8米)的地块中种植大豆，平均每英亩种植150,500株植物，行宽为30英寸(0.8米)，每英尺(30厘米)的种子间距为7至8颗种子。
将农业组合物施用于大豆，所述农业组合物包括农业有效量的Bt.4Q7Flg22(SEQID NO:226)、Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)和来自嗜热解硫胺素芽孢杆菌(Aneurinbacillus thermoaerophilus)的Flg22—At.Flg22-B4(SEQ ID NO:300)的组合物。按表57中规定的施用量(Fl.oz/Ac或mL/Ha)将Flg22多肽处理剂以叶面喷剂的形式施用于种植在美国中西部五个地点(参与地点：IA和IL)的大豆。在大约V4-V6的发育阶段，大豆植物接受了含有Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)、Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)和At.Flg22-B4(SEQ ID NO:300)的叶面处理剂，以及用于促进处理剂的扩散和吸收的非离子表面活性剂(以喷罐容积的0.1％v/v最终浓度施用的Alligare SurfaceTM)。收集了接受Flg22组合物的植物的3个大豆品种(Asgrow：AG2733、AG3536和AG4034)的大豆产量。还报告了与接受非离子表面活性剂(以喷罐容积的0.1％(v/v)最终浓度施用的Alligare SurfaceTM)的对照大豆植物相比，大豆产量的产量变化(Bu/Ac)(表57)。
还将Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22多肽叶面施剂与作为添加剂的纤维二糖组合，并检验了Flg22多肽与纤维二糖添加剂的组合对产量增加的影响。纤维二糖是葡萄糖二糖，并且是纤维素聚合物的基础。在化学上，纤维二糖是葡萄糖β-1-4-葡萄糖，是由两个通过β(1-4)键连接的β-葡萄糖分子组成的还原糖。通过纤维素或地衣素的分解获得纤维二糖，纤维二糖水解后产生葡萄糖。纤维二糖添加剂与Bt.4Q7Flg22的组合导致大豆中的活性氧(ROS)活性增加。收集了接受带有或不带有纤维二糖添加剂的Flg22组合物的植物的3个大豆品种(Asgrow：AG2733、AG3536和AG4034)的大豆产量，并报告为所有3个品种在不同地点的平均产量(Bu/Ac)。还报告了与接受非离子表面活性剂(以喷罐容积的0.1％v/v最终浓度施用的Alligare SurfaceTM)的对照大豆植物相比，大豆产量的产量变化(Bu/Ac)(表57)。
表57.使用不同Flg22多肽进行叶面处理的大豆产量
Figure BDA0002417772590002551
Figure BDA0002417772590002561
与用仅含有表面活性剂的叶面施剂进行处理的对照植物相比，将各种Flg22多肽(Bt.4Q7Flg22；Syn01Flg22和At.Flg22-B4(组合物1-9)在V4-V6发育阶段叶面施用到大豆上，均产生了产量效益。与对照植物(仅表面活性剂)相比，按4.0Fl.oz/Ac施用含有Bt.4Q7Flg22(组合物3)的叶面处理剂获得了+2.51Bu/Ac(168.8kg/Ha)的增加。与仅使用表面活性剂的对照植物相比，使用4.0Fl.oz/Ac将Syn01Flg22(组合物6)多肽以叶面处理剂的形式施用于大豆植物导致产量增加了+1.76Bu/Ac(118.4kg/Ha)。与对照植物相比，将Syn01Flg22(组合物7)和带有纤维二糖(320nM)的Syn01Flg22(组合物8)以0.2Fl.oz/Ac的较低施用量施用于大豆植物导致添加纤维二糖添加剂可增产+1Bu/Ac，或产量整体增加+2.56Bu/Ac(172.2kg/Ha)。将At.Flg22-B4(组合物9)多肽施用于大豆(V4-V6)也获得了产量效益，与对照植物相比为+2.3Bu/Ac(154.7kg/Ha)，而与仅接受非离子表面活性剂处理的植物相比则超过3.5Bu/Ac(235.4kg/Ha)。
在又一项研究中，使用Flg22多肽和Flg22多肽与纤维二糖的组合的种子处理剂被用作大豆的种子处理剂并导致田间试验的总产量增加，将其报告为四个重复试验的平均值(表58)。将种子处理剂施用于种植在美国中西部(密苏里州哥伦比亚)的1个地点的1个大豆杂交种(品种)。表58所示，以含有基础种子处理剂的总浆料体积中每单位大豆种子0.14Fl.oz施用Flg22的种子处理剂组合物，并将其提供给大豆种子，所述基础种子处理剂由Poncho VOTiVO 600FS和Evergol Energy组成。每个种子处理剂的施用量保持恒定在0.14Fl.oz/Ac或4.14mL/unit。将浆料中的Flg22多肽的最终浓度标准化为每颗种子1uM。当与Flg22多肽一起以组合处理剂的形式施用时，纤维二糖的同一最终浓度为每颗种子1.0mM。在地点上进行随机分配，每个种子处理剂四个重复地块。表58中报告了平均产量(Bu/Ac)，以及与仅接受基础种子处理剂的对照植物相比，Bu/Ac的平均变化。当将Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)以种子处理剂的形式施用到大豆上时(以最终浓度为1.0μM的Flg22多肽进行递送)，观察到最显大幅度的产量增加，并且与接受基础种子处理剂的大豆的产量相比，平均产量增加分别为+5.11(343.7kg/Ha)和+9.92(667.1kg/Ha)。
表58.Flg22多肽和Flg22多肽变体与纤维二糖的种子处理剂组合-大豆
Figure BDA0002417772590002571
Figure BDA0002417772590002581
实例39：RHPP在V5玉米增产中的应用
由含有种子处理剂的玉米种子(DEKALB杂交种：DKC 52-61、DKC 58-89和DKC 65-81)种植大面积玉米试验，所述种子处理剂包括EVERGOL杀真菌剂(7.18％丙环唑、3.59％氟唑菌苯胺并与5.74％甲霜灵组合)与PONCHO/VOTiVO 500(噻虫胺杀虫剂与微生物制剂(坚强芽孢杆菌1582)的混合物)的组合。使用包括Gm.RHPP多肽(SEQ ID NO:600)的农业组合物对约处于V5发育阶段的玉米植物进行叶面施用。将配制的Gm.RHPP多肽(表59)以8.0Fl.oz/Ac(584.6mL/Ha)的施用量与0.1％v/v(喷罐)的非离子表面活性剂(Alligare SurfaceTM)一起施用于玉米杂交种。总的来说，在美国中西部(IL、IN、IA)的6个地点进行此试验，每个地点有1-2个杂交种，每个杂交种有3个重复地块。收集了玉米产量(Bu/Ac)，并将其报告为平均产量(Bu/Ac)。将Bu Ac的平均变化与从表面活性剂对照生长的植物的产量进行比较，并报告为6个地点的总平均产量(Bu/Ac)(总共11个重复地块)，以及与对照植物相比，Bu/Ac的总体变化。结果在表59中示出。
表59.使用RHPP进行叶面处理–增加玉米产量
Figure BDA0002417772590002591
与仅接受表面活性剂的植物相比，用Gm.RHPP多肽对植物进行叶面处理导致玉米的产量增加。与206Bu/Ac或对照植物相比，接受Gm.RHPP多肽叶面处理剂的玉米植物在每6个地点合并的平均产量略高于209Bu/Ac。与玉米对照植物的产量相比，经Gm.RHPP处理的植物的产量增加了3.52Bu/Ac或220.9kg/Ha(表59)。
实例40：RHPP多肽增加大豆中的荚果数
从种子中生长大豆(MorSoy品种)植物，在受控的环境生长室中每盆种植2颗种子，在大约300μmol-2s-1(光子)的条件下生长，保持13/11光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围，直至达到V4发育阶段。然后将植物置于由16/8光照/天的循环和21-26℃的温度组成的全天条件下，以促进早期开花并加速进入生殖(R)生长阶段。当大豆植物已达到R1发育阶段时，将含有最终浓度为300nM的Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)多肽的叶面施剂与0.10％(NIS90:10；Precision Laboratories,LLC)的非离子表面活性剂一起施用于大豆。向大豆植物提供了Gm.RHPP制剂和仅非离子表面活性剂的对照。每次处理将Gm.RHPP和非离子表面活性剂对照处理剂均施用于18株植物。每株植物大约在15厘米上方提供六次等距喷洒，以完全覆盖叶面。施用处理剂后，将R1大豆植物返回到控制环境生长室。十七天后，植物接受了又一次叶面处理剂施用，制剂含有Gm.RHPP多肽和非离子表面活性剂以及仅含非离子表面活性剂的处理剂。第一次施用叶面喷洒处理剂后第31天，在植物上计数长度超过1毫米的大豆荚。报告了每株豆荚的平均数量和总体平均值的标准差(表60)。根据接受Gm.RHPP的植物与非离子表面活性剂对照处理剂应用的荚果数之间的配对的T检验比较，计算出p值(显著性为p<0.05)。
表60.RHPP叶面处理后第31天大棚大豆的豆荚数
Figure BDA0002417772590002601
*p值<0.05具有统计学意义
与接受非离子表面活性剂对照处理剂的植物相比，在大豆植物的早期生殖阶段(R1)叶面施用Gm.RHPP多肽导致荚果计数大约增加一倍。
实例41：Flg22和RHPP多肽增加番茄和辣椒的产量
在开花前阶段，以外源喷剂的形式施用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Gm.RHPP(SEQ ID No:600)叶面施用处理剂，并将其用于增加番茄和墨西哥辣椒的产量。
设计小规模地块来模拟番茄的商业性生长条件。首先将番茄植物(罗马品种)在大棚中进行45天移栽生长，然后种植到2个高架田间行床上，每行之间有2英尺(0.6米)，平均每行床有30株植物。一旦土壤温度达到15.6℃，便将番茄移植到土壤表面以下三英寸处。在铺有黑色塑料覆盖物的高架床上生长西红柿。在整个生长季节使用滴灌法生长植物，并按照种植者的指导方针施用化肥(80lbs.或36.3kg)氮；100lbs.(45.4kg)磷酸盐和100lbs.(45.4kg)钾或钾)，以提供最佳的植物生长和产量。设计小型的高架床地块来模拟商业种植者使用的种植密度，商业种植者通常在1.5至2米的中心上每英亩单行种植2,600至5,800株植物，行中植物之间的距离为45.7至76.2厘米。[Orzolek等人,“农业替代方案：番茄生产(Agricultural Alternatives:Tomato Production)”大学公园：宾夕法尼亚州立大学(University Park:Penn State Extension)，2016]。
在早期开花(第一朵花)阶段，将使用Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP的叶面处理剂直接施用到番茄植物上。将施用量为4.0Fl.oz/Ac(292.3mL/公顷)的Bt.4Q7Flg22多肽叶面组合物和施用量为3.2Fl.oz/Ac(234mL/公顷)的Gm.RHPP多肽叶面组合物以每英亩10加仑水的形式与0.1％v/v非离子表面活性剂(AlligareTM Surface)一起施用于番茄植物。将经Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP处理的植物与未接受叶面处理剂施用的对照植物进行比较。一式六份地处理植物，每次处理三个重复。确定了叶面处理剂对番茄产量的影响，并将所述影响报告为相对于无喷剂对照处理归一化。表61中将每株番茄植物的平均果实重量报告为2次单独收获的合并平均值以及与无喷剂对照相比，果实重量的平均变化百分比。
表61.春季种植的番茄上的叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002621
用浓度为16.7μM且施用量为4.0Fl.oz/Ac(292.3mL/公顷)的Bt.4Q7Flg22多肽进行叶面处理导致单株植物的平均果实重量整体增加(以总克数计)，报告为与无喷剂对照相比，果实重量总克数增加+8.61％。提供浓度为100μM且施用量为3.2Fl.oz/Ac(234mL/公顷)的Gm.RHPP多肽也导致单株植物的平均果实重量(克)的整体产量增加，与无喷剂对照相比，果实重量几乎增加了2％。
在另一项研究中，在早期开花(第一朵花)阶段，将具有Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)多肽的叶面处理剂施用于墨西哥辣椒(Capsicum)。设计小规模地块来模拟墨西哥辣椒的商业性生长条件。在受控的生长室中生长辣椒，持续12周，然后将其外部移植到2个铺有黑色塑料覆盖物的高架床中，所述高架床具有良好的保水特性，且土壤的pH为5.8-6.6。墨西哥辣椒植物之间的间距为14-16英寸(38厘米)，植物之间的间距为16-24英寸(50厘米)，每行床包含约25株植物。在整个生长季节中，使用滴灌法种植植物，并按照种植者的指导方针施肥，以提供最佳的植物生长条件。设计高架床地块以模拟商业种植者使用的种植密度，商业种植者通常每英亩双行种植植物(每英亩约5,000-6,500株植物或每公顷12,355-16,062株植物)，每行间隔35.6–45.7厘米，床距中心间隔5.0-6.5英尺(1.52-1.98米)(Orzolek等人,“农业替代方案：辣椒生产(Agricultural Alternatives:Pepper Production.)”大学公园：宾夕法尼亚州立大学，2010)。
将Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP多肽叶面处理剂以每英亩10加仑水的喷雾体积与0.1％v/v非离子表面活性剂(AlligareTM Surface)一起施用到墨西哥辣椒上，其中Bt.Flg22的施用量为2.0Fl.oz/Ac(146.2mL/公顷)和4.0Fl.oz/Ac(292.3mL/公顷)，而Gm.RHPP多肽的施用量为3.2Fl.oz/Ac(234mL/公顷)。一式六份地处理植物，每次处理三个重复。试验中每株植物平均产量高于中值产量50％或低于中值产量50％的重复被排除在外。将施用Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP多肽叶面处理剂的墨西哥辣椒植物与每英亩喷洒10加仑水和0.1％v/v非离子表面活性剂(AlligareTM Surface)的植物进行了比较。
使用一次收获的方法，确定了两次单独收获中用作叶面喷施剂的Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP多肽对辣椒产量的影响。将辣椒的数量和每株植物的地上生物量相对于仅用表面活性剂处理的辣椒对照植物的产量和生物量进行归一化(表62)。
表62.春季种植的墨西哥辣椒上的叶面处理剂
Figure BDA0002417772590002641
在开花前阶段将Bt.4Q7Flg22多肽以叶面喷剂的形式施用于墨西哥辣椒导致每株植物的平均果实重量显著增加，与单独的表面活性剂对照植物相比，2Fl.oz/Ac(146.2mL/公顷)的施用量下增加了+49％，而4Fl.oz/Ac(292.3mL/Ha)的施用量下增加了+40％。也可以在开花前阶段以叶面喷剂的形式施用Gm.RHPP多肽处理剂，其也导致墨西哥辣椒中每株植物的平均果实重量增加，与从单独的表面活性剂对照植物中收获的辣椒相比，每株植物中辣椒的重量增加了27％。
实例42：施用于南瓜—产量增加
在第一开花阶段，将含有Bt.4Q7Flg22或Gm.RHPP多肽的叶面处理剂以叶面处理剂的形式外源性地施用于弯颈南瓜(Crookneck squash)。分别以2.0Fl.oz/Ac(146.2mL/公顷)或3.2Fl.oz/Ac(234mL/公顷)的施用量将Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP多肽叶面处理剂以每英亩10加仑水的喷雾体积与0.1％v/v非离子表面活性剂(AlligareTM 90)一起施用于南瓜植物。将经多肽处理的植物与仅表面活性剂的对照植物进行多次产量比较，每次处理三个重复。表63中将用Bt.4Q7Flg22或Gm.RHPP多肽处理剂叶面处理后的植物的产量报告为每重复两次收获后每株南瓜的平均重量(克)，并表示为与对照植物相比的变化百分比。试验中每株植物平均产量高于中值产量50％或低于中值产量50％的重复被排除在外。
如下在沙壤土上栽培南瓜植物。在铺有0.76米宽的塑料的土丘上切出2.5厘米的孔，每土丘两行，每行内的孔距为0.46米。在土丘内，行与行交错。土丘之间相距1.2米。每孔种植三颗南瓜种子，种植后14天，稀疏成每孔一株植物。将滴灌管铺设在每个土丘的中央，并根据需要浇灌植物。
表63.用Gm.RHPP多肽的组合物进行叶面处理以增加南瓜的产量
Figure BDA0002417772590002651
与仅表面活性剂的对照植物相比，在开花前阶段用Bt.4Q7Flg22或Gm.RHPP多肽对南瓜植物进行叶面处理均导致收获的南瓜果实的重量每株平均增加31.7克，或果实重量变化+4.4％(表63)。
实例43.Flg22多肽降低了羽衣甘蓝上白叶斑点的严重性
在中西部(密苏里州哥伦比亚)的一项重复的秋季羽衣甘蓝试验中，非常潮湿和温暖的生长条件导致羽衣甘蓝叶上出现白叶斑点，这通常是由芥生尾孢菌(Cercosporabrassicicola)引起的。受感染的羽衣甘蓝植物以前没有接受过任何用于预防真菌病的叶面处理剂。为了评估病害的严重性，建立了评分标准(1-5级)，其中1＝带有三个或更少白色真菌斑点的健康植物，2＝带有四个或更多斑点且部分叶子受到疾病影响的植物，3＝大多数叶子显示出症状且最多一片叶子因病脱落，4＝大多数叶子显示出症状且2-3片叶子因病脱落，5＝大多数叶子表现出症状且四片或更多叶子因病而脱落。一个人对试验区域内的所有植物进行评分，然后按表64中各处理剂之间的疾病评分均匀分配植物，每个处理剂对应6株植物的6个重复地块(总计＝每个处理剂36株植物)。为了测试用于改善羽衣甘蓝上的疾病症状的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)，按表64中所示的速率，以每英亩10加仑水的载剂体积将处理剂以叶面喷剂的形式与0.1％v/v非离子表面活性剂(AlligareTM Surface)一起施用。在叶面处理后三周，使用相同的病害严重性标准对植物评分。计算每株植物的病害评分变化，并确定每种处理剂的病害评分的平均变化。在评估病害严重程度后四天收获植物，并以植物重量(克)衡量产量。从数据集中排除权重低于试验的中值重量50％或高于所述中值重量50％的异常值。
表64.用于改善白叶斑点的叶面羽衣甘蓝处理剂。
Figure BDA0002417772590002671
与对照相比，用配制的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)对受感染的羽衣甘蓝植物进行叶面处理导致产量和病害症状改善(表64)。未经处理的对照的平均植物重量为14.6g，而接受叶面Bt.4Q7Flg22的植物的平均植物重量为15.1g，并且病害评分比对照的病害评分平均改善0.5个点。施用铜杀真菌剂将植物病害评分提高至与Bt.4Q7Flg22相同的程度，但与对照相比，产量却降低了21％(11.5g)。铜杀真菌剂与Bt.4Q7Flg22的组合处理剂使每株植物的产量提高至12.4g，但在试验中，仅施用Bt.4Q7Flg22获得的总体产量最高，对植物健康最有益。总之，在胁迫性生长条件下，可以使用Flg22多肽来减缓蔬菜中真菌感染的进程并提高产量。
实例44：用于确定Flg22多肽与种子处理剂的相容性的ROS筛选测定
检验了种子处理剂与玉米叶柄组织中质外体活性氧(ROS)的产生的相容性。检验了各种市售种子处理剂与Flg22多肽(Bt.4Q7Flg22；SEQ ID NO:226)的相容性，当单独用作玉米上的种子处理剂时，所述Flg22多肽增加了产量。如实例15中所述，使用来自玉米杂交种5828YX的玉米叶柄样品进行了ROS活性测定，不同的是，用SpectraMax L光度计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。将不同浓度的Bt.4Q7Flg22(0和1000μM)与三种商业种子处理剂组合，所述三种商业种子处理剂由PPST2030(枯草芽孢杆菌5x108 cfu/mL和短小芽孢杆菌5x108 cfu/mL细菌的组合)、ILEVO(48.4％氟吡菌酰胺)和PONCHO/VOTiVO(40.3％噻虫胺杀虫剂和微生物制剂(坚强芽孢杆菌I-1582)的混合物)组成，并测试了玉米叶柄中是否存在ROS反应。所描述的所有三种种子处理剂均按照每种种子处理剂的单个标本标签上所建议的每颗种子施用量进行施用。使用不同浓度的Bt.4Q7Flg22多肽生成标准曲线，并获得RLU和Flg22浓度之间的对数相关性，其中R2为0.90。RLU值是4个单独测量值(每个板上有4个处理剂孔)的平均值，括号中显示了总ROS(RLU)的增加(时间相对于本底增加)(表65)。
表65.使用ROS测定法的种子处理剂与Flg22多肽的相容性
Figure BDA0002417772590002691
当与表65中所述的每种种子处理剂组合时，通过RLU测量的ROS产生随着1μMBt.4Q7Flg22的添加而增加。与仅含有Bt.4Q7Flg22多肽或不含Bt.4Q7Flg22多肽的本底RLU水平相比，随着1μM Bt.4Q7Flg22的添加，以1:10稀释的种子处理剂的ROS产生(RLU值)也有所增加。与1μM Bt.4Q7Flg22组合的稀释的PONCHO/VOTiVO种子处理剂与本底相比增加了15倍以上，而与按照标本标签上的建议对每颗种子施用的非稀释PONCHO/VOTiVO处理剂相比，增加了2.2倍以上。因此，当Flg22多肽与标准种子处理碱以标签速率组合时，通过ROS测定可检测到Flg22多肽。当将此类Flg22多肽与特定种子处理剂组合时，可以考虑调整多肽浓度或种子处理剂浓度以确保植物中最佳的ROS反应。这些证明了在当今市场上存在其它种子处理剂包装的情况下，Flg22多肽在植物上的活性。
实例45：Flg22与FlgII-28肽组合以增加番茄中的ROS活性
在另一项研究中，对源自鞭毛蛋白不同区域的Flg22和FlgII-28多肽分别进行了测试，并组合测试了二者与番茄叶片中的反应的相容性。尽管Flg22和FlgII-28都是与微生物相关的分子模式(MAMP)，但它们可能分别被鞭毛蛋白感应2(FLS2)受体和鞭毛蛋白感应3(FLS3)受体识别(Hind等人,2016；《自然植物(Nature Plants)》2:16128)，并且相互作用可能因植物物种而异。使用番茄中的ROS活性测定将几种Flg22多肽(Bt.4Q7Flg22，SEQ IDNO:226；Bt.4Q7Flg22-Syn01，SEQ ID NO:571和Ec.Flg22，SEQ ID NO:526)与几种FlgII-28多肽(Ps.tomatoFlgII-28，SEQ ID NO:751；A.sp.FlgII-28，SEQ ID NO:375)进行比较。
使用穿孔器从4周龄的植物上切下西红柿叶片，以产生4毫米的圆盘。使用剃须刀刀片将每个圆盘切成两半，然后将圆盘的每一半漂浮在含150μL水的96孔板中，静置过夜。第二天，在进行多肽处理之前从每个孔中除去水。将表66中所述的Flg多肽添加到水中，使其在含鲁米诺和HRP的溶液中的最终浓度达到5nM(表67)和100nM(表68)，然后将其添加到每个处理剂孔中。为了保持活性，将多肽以小等分试样的形式储存，以避免多次冷冻和解冻。为获得工作浓度而进行的所有稀释均在超纯水中进行。将多肽溶液储存在-20℃下短期使用，或储存在-80℃下长期使用。将RLU值和相对ROS活性(表67、68)报告为4次测量的平均值。使用先前在实例15中报道的方法进行ROS活性测定，不同的是，用SpectraMax L发光计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。
表66.各种来源的Flg22和FlgII-28多肽
Figure BDA0002417772590002711
表67.番茄叶片组织中的Flg22和FlgII-28多肽的ROS活性比较
Figure BDA0002417772590002721
表68.来自革兰氏阴性丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000和革兰氏阳性解硫胺素芽孢杆菌属XH2的FlgII-28多肽触发番茄叶片组织中ROS的产生
Figure BDA0002417772590002731
根据表67和表68中的结果确定，鞭毛蛋白的第二个表位，即源自革兰氏阴性丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000或革兰氏阳性解硫胺素芽孢杆菌属XH2的FlgII-28(SEQ IDNO:375)在5nM和100nM浓度下足以触发番茄(SEQ ID NO:751)中的免疫反应(例如，ROS产生)。在5nM浓度下，与其它Flg22和FlgII-28多肽相比，Ps.tomato FlgII-28的活性最高并且导致RLU比相同浓度下的Bt.4Q7Flg22的RLU增加将近31倍，而5nM A.spp.FlgII28产生与5nM Bt.4Q7Flg22相同的低ROS反应。当施用于番茄叶片时，来自革兰氏阴性大肠杆菌的Flg22多肽(Ec.Flg22；SEQ ID NO:526)也导致ROS活性增加，与单独的Bt.4Q7Flg22处理剂相比，RLU值为12.9倍。在5nM浓度下，Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)多肽在番茄叶片中触发了非常低的ROS反应，但在100nM浓度下却提供了高反应。另一方面，在两种测试浓度下，与阴性对照(水)相比，Ps.tomato FlgII-28提供了强烈的ROS反应。因此，番茄叶片对源自革兰氏阴性细菌鞭毛蛋白的Flg多肽(如Ps.tomato FlgII-28和Ec.Flg22)显示出增加的敏感性。另外，当在5nM浓度下进行测试时，与Bt.4Q7Flg22处理剂相比，被称为Syn01Flg22(SEQID NO:571)的Bt.4Q7Flg22的合成变体具有显著增加的活性(3.5倍)。
如表68所示，可以将革兰氏阳性(Bt.4Q7Flg22；SEQ ID NO:226)与革兰氏阴性Ps.tomato FlgII-28(丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000；SEQ ID NO:751)的组合用作组合的叶面施剂，以增加ROS的产生，并增强植物对某些病原生物的免疫力。
实例46：用于增加玉米和大豆中的ROS活性的合成的Flg22Syn01和Flg-15Syn01多肽
生成了源自Bt.4Q&Flg22的缺少七个N端氨基酸的Syn01Flg22的截短版本，从而产生了具有序列nh2-RINSAKDDAAGLAIA-cooh的15个氨基酸的多肽。被称为Bt.4Q7Syn01Flg15(SEQ ID NO:752)的这种多肽是革兰氏阴性变形菌中天然存在的多肽，但在革兰氏阳性蛋白序列中不存在。受体相互作用所需的核心序列RINSAKDD保留在缩短的多肽中，因此，预计15个氨基酸的变体对触发植物中的ROS产生具有活性。为了测试这一点，在玉米(表69)和大豆(表70)的ROS测定中，将Syn01Flg15与Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22进行了比较。使用先前在实例15中报道的方法进行ROS活性测定，不同的是，用SpectraMax L发光计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。
表69.在玉米茎组织的ROS活性测定中，Flg22Syn01和Flg15Syn01变体比Bt.4Q7Flg22具有更高的活性。
Figure BDA0002417772590002751
*将相对ROS活性相对于Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的平均RLU值进行归一化。n.d.表示未测试的值，因此未确定相对值。
在玉米的ROS活性测定中(表69)，在100nM和10nM浓度下，与使用Bt.4Q7Flg22(SEQID NO:226)的处理剂相比，Flg22-Syn01(SEQ ID NO:571)在玉米茎组织中具有最大的ROS反应，如分别由相对活性1.6倍(100nM)和0.5倍(10nM)所指示的，而对照处理剂的ROS反应在10nM时衰减为0.2倍。Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)或Syn01Flg15(SEQ ID NO:752)的缩短版本在10nM下也表现出更大的ROS反应(0.4倍)，是相同浓度下Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的相对ROS活性的两倍。
表70.在大豆叶组织的ROS测定中，Flg22Syn01和Flg15Syn01变体比Bt.4Q7Flg22具有更高的活性
Figure BDA0002417772590002752
*将相对ROS活性相对于Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的平均RLU值进行归一化。n.d.表示未测试的值，因此未确定相对值。
类似地，在大豆的ROS活性测定中(表70)，在100nM和10nM浓度下，与使用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的处理剂相比，被描述为Bt.4Q7Flg22-Syn01(SEQ ID NO:571)的Bt.4Q7Flg22的合成衍生突变体在大豆叶组织中也具有最大的ROS反应，如分别由相对活性1.25X(100nM)和0.25X(10nM)所指示的，而对照处理剂的ROS反应在10nM时大大衰减为0.04X。Syn01Flg22或Syn01Flg15的缩短版本在10nM下也表现出更大的ROS反应(0.17X)，是相同浓度下Bt.4Q7Flg22的相对ROS活性的四倍。
总体而言，与Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)相比，Syn01Flg22在玉米和大豆组织中测试的两个浓度下均具有较高的ROS活性。在10nM下，缩短的15个氨基酸的多肽Syn01Flg15的活性是Bt.4Q7Flg22的2-4倍，而活性仅比22个氨基酸的Syn01Flg22略低，这表明引发植物免疫反应的关键氨基酸保留在序列中。
实例47：用于增加Flg22多肽的ROS活性的化学修饰
可以对Flg22多肽进行化学修饰以增加蛋白质抵抗蛋白水解的稳定性和/或促进更长的活性持续时间，这可以导致FLS2受体的更大可用性。通常，多肽修饰可用于1)在不利条件下或在蛋白酶存在的情况下稳定多肽，或2)为肽提供额外的功能或分子特性。用于改善稳定性的修饰包含多肽环化和N和C端的交替。从头到尾的环化(即在N端氨基与C端羧基末端之间形成酰胺键)会产生刚性的多肽主链，所述多肽主链抵抗构象变化，从而经常稳定肽-受体的结合并保护多肽末端免受外切蛋白酶的破坏。可替代地，多肽末端的修饰可以通过中和(C端酰胺化)和防止N端降解(N端乙酰化)来稳定多肽。也可以通过如聚乙二醇(PEG)等亲水分子的缀合来增加多肽的溶解度和稳定性。
用于稳定Flg22多肽的此类修饰包含聚乙二醇化、环化和酰胺化/乙酰化，所有这些修饰均在表71中进行描述。使用聚乙二醇化来稳定多肽是通过将多肽连接至聚乙二醇(PEG)来进行的。一旦与多肽连接，每个PEG亚基就会与2到3个水分子紧密结合，然后便可以增加多肽的溶解度，并增加其整体结构，从而使多肽不易受到蛋白水解降解的影响，并且更易于接近植物表面的膜FLS2受体。也可以使用环化来增加Flg多肽的稳定性。也可以使用N端乙酰化和C端酰胺化来获得多肽的稳定，其中这些修饰可以生成更接近原生蛋白质的模拟物，因此可以提高多肽的生物活性。
表71.经修饰的Flg22多肽
Figure BDA0002417772590002771
密苏里大学分子相互作用核心大学(哥伦比亚，美国密苏里州)合成了如表71所述的专门的经修饰的多肽，包含Syn05Flg22-Syn05(J36)、Syn05Flg22-PEG(J37)和Syn05Flg22-Cyc，将所述多肽冻干成干燥粉末，并分别通过液相色谱-质谱(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)确定其具有正确的分子量和所需的纯度(>70％)。从Genscript(皮斯卡塔韦，美国新泽西州)获得了包含Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Bt.4Q7Flg22 Mod-1(SEQID NO:226；J41)的标准合成多肽。将所有冻干的多肽重悬于超纯水中至10mM浓度，并依次在超纯水中稀释至所需浓度，以便在先前实例15所述的大豆和玉米ROS测定中进行测试。
对于大豆样品，从V1到V3阶段的植物(品种Morsoy)中除去完全展开的三叶。使用穿孔器取出叶子圆盘(4mm)，然后将其漂浮在150μL水(背面朝下)上过夜，然后进行上述ROS测定。
对于玉米样品，如前所述制备V1到V4阶段的玉米植物(贝克氏杂交种5828YX)的气生组织。然后将1-mm切下的叶子切片在150uL的水中漂浮过夜。
使用先前在实例15中报道的方法进行ROS活性测定，不同的是，用SpectraMax L发光计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。首先使用每种测试浓度的动力学时程随时间绘制相对光单位(RLU)，然后在曲线下积分以计算所产生的总RLU值。然后，将大豆(表72-73)和玉米(表74)的平均总RLU(n＝每处理剂4个样品)和每种多肽的多肽浓度对比作图。
最佳拟合对数或线性回归(R>0.80)适合每种处理剂的数据。使用最佳拟合回归，针对每种多肽计算达到总RLU产生(15,000总RLU(玉米)或50,000总RLU(大豆))所需的多肽浓度，并在每个数据集中将活性百分比与对照处理剂的活性百分比进行比较(表72-74)。
表72.在N和C端经修饰的Flg22-Bt多肽触发大豆中活性氧的产生
Figure BDA0002417772590002791
Bt.4Q7Flg22S Mod-1(SEQ ID NO:226)产生50,000RLU的RLU输出所需的Flg22多肽浓度小于目前的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)，所述Bt.4Q7Flg22被证明可以增加产量并赋予大豆植物植物保护性品质。这表明通过N端乙酰化和/或C端酰胺化修饰Flg22不会干扰多肽与FLS2受体的结合，并且修饰可用于产生更活跃和/或更稳定的Flg22版本，如与Bt.4Q7Flg22相比，Bt.4Q7Flg22S Mod-1的活性增加了+6％(表72)。
与未经修饰的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)多肽相比，在密苏里大学分子相互作用核心大学(哥伦比亚，密苏里州)生成了具有单个氨基酸取代(A16P)的新颖多肽，从而产生了Syn05Flg22(SEQ ID NO:578)多肽，其适于通过N端聚乙二醇化进行进一步修饰Syn05Flg22-PEG(SEQ ID NO:578)以及通过头尾环化进行进一步修饰Syn05Flg22-Cyc(SEQID NO:578)。进行大豆ROS测定以评估这两个另外的修饰(即对Flg22多肽进行N端聚乙二醇化和头尾环化)的效果，结果显示在表73中。
表73.经修饰的合成Flg22-Bt多肽触发大豆中活性氧的产生
Figure BDA0002417772590002801
在比较Syn05Flg22(SEQ ID NO:578)与多肽的两个经修饰版本的相对活性的大豆ROS测定中，与非聚乙二醇化版本或Syn05Flg22(SEQ ID NO:578)相比，聚乙二醇化的多肽Syn05Flg22-PEG(SEQ ID NO:578)获得总共50,000RLU所需的多肽量要少得多，从而导致活性增加+38％。肽的N端聚乙二醇化增加了多肽的亲水性，并可能增加对FLS2受体的肽结合凹槽(pocket)的亲和力。然而，在大豆ROS测定中，与非环化版本的Syn05Flg22相比，环化版本的Syn05Flg22-Cyc(SEQ ID NO:578)需要更多大豆ROS测定中提供的多肽(+57.1nM或更多)才能达到50,000RLU的总RLU产生。这表明Flg22多肽的环化(Syn05Bt.4Q7Flg22-Cyc)可能会导致更刚性的多肽主链，并与FLS2受体的结合发生改变，因此需要更多环化的肽才能达到等效的ROS反应。然而，环化多肽在环境中增加的稳定性可以弥补活性的轻微损失。
表74.经修饰的合成Flg22-Bt多肽触发玉米中活性氧的产生
Figure BDA0002417772590002802
在玉米ROS测定中，与非聚乙二醇化版本或Syn05Flg22相比，聚乙二醇化版本Syn05Flg22-PEG实现总共15,000RLU所需的多肽量要少得多(少近5nM)，从而导致活性增加+30％(表74)。
如通过用玉米和大豆组织的ROS测定所测量的，通过N端乙酰化、N端聚乙二醇化、C端酰胺化和/或头尾环化对Flg22(Bt)或Syn05Flg22(Bt)多肽进行修饰产生了保留活性的肽。可以使用这些多肽递送进一步稳定的Syn05Flg22(SEQ ID NO:578)来源的多肽变体，以用于农业用途(通过叶面施剂、种子处理剂、犁沟施剂、移植时施用或树干注射剂)。Syn05Flg22-Cyc的环化可用于增加多肽的稳定性，但损害ROS活性，这可能是通过影响合成多肽对膜FLS2受体的亲和力来实现的。
实例48.佐剂与Flg22多肽的相容性
使用Flg22多肽的产品制剂通常可以包含抗菌生物静态防腐剂，如Proxel和表面活性剂。因此，当与此类佐剂组合使用时，使用ROS活性测定法测试了这些类型的佐剂的相容性，以确定溶液中对Flg22反应性的影响。通常，Proxel是用于保存许多农产品的广谱杀生物剂，其保护农产品免受细菌、酵母和真菌的破坏。一般而言，表面活性剂也通常用于农业制剂中，以提高许多农用化学品对植物的渗透性，从而提高性能。在这项研究中，使用大豆叶片中的ROS活性测定，在与Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)组合的制剂中测试了五种不同的Proxel和两种不同的非离子表面活性剂产生ROS反应的有效性。下表75中描述了不同的Proxel制剂(Lonza)。按制造商(Lonza)推荐的标签率范围，将这些Proxel制剂与40μMFlg22多肽混合，然后稀释至ROS测定中100nM的最终多肽浓度和表75中列出的Proxel浓度。按照各个分销商或制造商推荐的标签率范围，在ROS测定中提供了经过测试的非离子表面活性剂。如之前实例15所述，使用大豆叶盘收集在进行ROS测定后获得的四个样品测量值的平均RLU值，不同的是，用SpectraMax L发光计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。.表76中报告了这些4个RLU值的平均值。
表75.在多肽制剂中用作佐剂的不同PROXEL添加剂
Figure BDA0002417772590002821
表76.使用由不同Proxel防腐剂配制的Flg22多肽的大豆叶片中ROS活性测定的RLU输出值
Figure BDA0002417772590002822
Figure BDA0002417772590002831
表76中所述的所有Proxel防腐处理剂在与Flg22多肽(Bt.4Q7Flg22；SEQ ID NO:226)一起以制剂形式使用时均相容，如通过与不含Proxel防腐剂的Bt.4Q7Flg2多肽对照(比模拟处理剂增加17.0倍)相比的高RLU值(比模拟处理剂增加19.0-28.3倍)所示。
表77.使用由不同非离子表面活性剂配制的Flg22多肽的大豆叶组织中ROS活性测定的RLU输出值
Figure BDA0002417772590002841
当以所示浓度与52.2nM Flg22多肽(Bt.4Q7Flg22；SEQ ID NO:226)混合时，表77中所述的所有表面活性剂(非离子)处理剂均相容，多肽浓度相当于组合物1(Bt.4Q7Flg22；SEQ ID NO:226；16.7μM)的施用量为4.0Fl oz/Ac，所述组合物以每英亩10加仑的喷洒速率以水的形式施用。与模拟处理的对照相比，不含表面活性剂的Bt.4Q7Flg2多肽对照(比对照高6.8倍)与含有非离子型表面活性剂NIS90:10(以处理剂溶液的0.25％v/v或0.5％v/v施用)的Bt.4Q7Flg2多肽的ROS产量倍数增加是相当的(5.8-6.4X)，或者对于含Silwet-L77(以处理剂溶液的0.025％v/v或0.1％v/v施用)的Bt.4Q7Flg2多肽，所述倍数增加略低(2.8-3.2X)。Silwet-L77(Helena)，一种非离子有机硅氧烷表面活性剂，被配制为共聚物，其在用于水性喷剂时具有增强的润湿和铺展特性。NIS90:10(Precision Laboratories)是一种低泡非离子型表面活性剂，其可以通过改善喷剂溶液的覆盖范围和目标叶片表面的渗透性来增强对作物的保护和性能。两种非离子表面活性剂与Bt.4Q7Flg22的组合均允许在目标叶片组织中响应Flg22多肽而产生ROS(表77)，并因此与本领域中的Flg22多肽叶面施剂相容。
实例49：使用发酵方法产生Bt.4Q7Flg22并通过肠激酶切割进行激活以用于马铃薯、扁豆和柑橘树的疾病预防试验
对于另一种生产方法(即细菌发酵)，提供Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)是为了稳定多肽并增强活性。将Bt.4Q7Flg22多肽与融合到谷胱甘肽S-转移酶(GST)的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶amyQ分泌信号以及肠激酶切割标签序列组合在一起，如下所述：amyQ分泌信号(解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶)GST(日本血吸虫)_连接子_肠激酶切割位点_Bt.4Q7Flg22_终止密码子(表78)。
表78.用序列克隆Bt.4Q7Flg22以增加多肽的稳定性和活性
Figure BDA0002417772590002861
*用于根据amy E分泌信号、GST和Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)序列进行克隆的DNA来自内部专有文库；生产菌株代码＝H101(抗氯霉素)
表79.用序列克隆Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)以增加多肽的稳定性和活表
Figure BDA0002417772590002871
*用于根据amy E分泌信号、GST和SynFlg22(SEQ ID NO:571)序列进行克隆的DNA来自内部专有文库。生产菌株代码＝H114(抗四环素)
表80.用序列克隆硫蛋白样蛋白以分泌到发酵生长培养基中
Figure BDA0002417772590002881
将表78、79和80中的序列克隆到含有氨苄青霉素选择标志物和可在大肠杆菌中复制的氯霉素(Cm)或四环素(Tet)选择标志物的标准克隆载体中，然后转移至用于生产目的的枯草芽孢杆菌菌株K08(生产菌株代码：H101＝amyQ-GST-EK-BtFlg22，H114＝amyQ-GST-EK-BtFlg22-Syn01，H117＝amyQ-Thionin-like)。如下进行发酵生产：在无菌的2XYT培养基(每升16g细菌用胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl；pH调节至7.0)中用10μg/mL Cm或Tet开始过夜培养，然后在第二天，将其稀释到含10μg/mL Cm或Tet的新鲜2XYT培养基中。使用50mL(摇瓶)或3L(玻璃生物反应器容器)的培养基体积在30℃的恒定温度下进行生产。扩大体积可以包含5L到1000L+(最多30,000L体积)。监测细菌的生长直至培养物的光密度达到0.6-1.0，然后将异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入至最终浓度为0.1-1.0mM，从而诱导产生GST-Bt.4Q7Flg22融合蛋白。在培养条件下，诱导的生产继续进行另外的12-24小时，以产生分泌到生长培养基中的融合蛋白。分泌后，从融合蛋白上切割出amyQ分泌标签。然后将培养物以5000x g离心20分钟，然后通过0.22μm瓶顶真空过滤器进行过滤，以除去细菌细胞。然后收集无菌滤液，将其用作菌核病防治试验中扁豆和马铃薯植物上的叶面处理剂(实施例50)，或用作柑橘树的树干注射剂以根除和预防HLB疾病症状(实施例51)。
发酵后，将两个版本的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)多肽产品用于马铃薯和扁豆的疾病预防试验，一个未经肠激酶处理(未激活的H101滤液)，而另一个通过肠激酶进行激活以切割与Flg22多肽融合的GST标签(EK激活的H101滤液)。为了激活Bt.4Q7Flg22，每1mLH101滤液添加32U(单位)的肠激酶(EK：肠激酶轻链；(New England BioLabs,Inc)，产品编号P8070)，在30℃下孵育2-3小时，从GST-EK切割位点处酶解释放Bt.4Q7Flg22，从而得到包括22个氨基酸的Bt.4Q7Flg22多肽的激活和释放产物。对于柑桔树注射试验，将H101滤液和H114滤液通过每毫升滤液添加0.8U的轻链肠激酶(新英格兰生物实验室公司，产品编号P8070)进行EK激活，并在30℃下孵育3小时，以酶促释放Flg22多肽。不需要激活处理即可释放在没有GST标签的情况下产生的硫蛋白样肽。
实例50：用Bt.4Q7Flg22多肽进行叶面预处理可保护扁豆和马铃薯植物免受核盘菌茎腐病(白霉病)的侵害
检验了Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)处理剂施用对扁豆和马铃薯植物抵抗核盘菌菌株MT07(白色霉菌)的疾病感染和进展的保护作用。在疾病评估研究中检验了三个不同版本的Bt.4Q7Flg22多肽。配制的pH 5.7的磷酸钠缓冲液形式的Bt.4Q7Flg22(100μM)，以及使用上述发酵方法生产(实施例49)的两个不同版本的Bt.4Q7Flg22，所述两个版本具有或不具有肠激酶(EK)激活的Flg22，并且被称为H101为滤液。
在扁豆和马铃薯植物的疾病保护测定中使用三个版本的多肽之前，使用先前在实例15中所述的方法使用玉米叶柄组织进行ROS活性测定，以确保Bt.4Q7Flg22 H101滤液(特别是具有EK的滤液)活跃。将不具有和具有肠激酶激活的H101 Bt.4Q7Flg22滤液(每毫升滤液EK＝8U)与用于产生一系列浓度比较的合成的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)进行比较，以预测使用发酵程序生成的H101滤液中的Flg22浓度。
表81.使用通过发酵产生的含有或不含有肠激酶激活的Flg22进行的玉米中的ROS活性测定
Figure BDA0002417772590002901
*RLU值报告为减去本底RLU水平后的4个独立测量值的平均值。
发酵产生的具有和不具有EK激活的Bt.4Q7Flg22的H101滤液均导致ROS活性(RLU值)高于对照(0nM Bt.4Q7Flg22)。与不具有任何Flg22多肽的对照处理剂相比，在ROS测定中提供给玉米茎的具有EK的H101 Bt.4Q7Flg22滤液(0.1％v/v)处理剂导致RLU值增加了3.0倍，并且ROS反应大于以25nM的浓度提供的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)；因此，未经稀释的EK激活滤液中的Bt.4Q7Flg22活性估计为≥25μM。发酵产生的Bt.4Q7Flg22处理剂的H101滤液在没有EK的情况下仍比阴性对照处理剂的ROS活性高(2.0X RLU)，但是与具有EK的Bt.4Q7Flg22的H101滤液相比，RLU值的增加幅度较低。一旦确定H101滤液在ROS测定中具有活性(表81)，就在马铃薯和扁豆的疾病防护研究中对其进行了评估。
在接种核盘菌真菌前48小时，将Bt.4Q7Flg22多肽的各种制剂以叶面预处理剂形式提供给扁豆和马铃薯植物，并以具有或不具有杀真菌剂(Endura，活性成分70％啶酰菌胺)的组合形式提供，所述杀真菌剂可有效治疗植物并保护植物免受核盘菌(白色菌)的感染。使用作物疾病模型(蒙大拿州立大学，推广服务作物保护(Extension Services CropProtection))测试了Bt.4Q7Flg22制剂，以检验每种叶面预处理剂对疾病的预防和保护以及症状发展的影响。使用连接到调节的空气压缩机上的气刷，将包含水对照的所有处理剂施用于扁豆和马铃薯植物，所述气刷的输出压力为50psi。预处理之后，使用放置在接触植物茎的菌丝体一侧的菌丝栓(覆盖有菌丝体的琼脂栓)将植物用核盘菌进行接种，并在湿度(100％)室中放置一段时间。
扁豆
在4'4'盆中，将扁豆(品种Pennel)植物生长在由1:1的泥炭藓和珍珠岩组成的无土培养基中，每盆一株植物，并在以下生长条件下于受控的生长室中持续24天：300-400μmol m-2s-1(光子)，保持13/11光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。如表35中所述，疾病研究包括：六种不同的叶面处理剂中每一种处理剂有五株扁豆植物，每种处理剂有6株重复植物，每种叶面处理剂总共有30株植物。在添加非离子型表面活性剂(ALLIGARESURFACE；Alligare，LLC)至最终浓度为0.1％(v/v)或烷基聚氧乙烯、乙二醇衍生物的浓度的情况下，施用用于预处理的所有叶面处理剂。以0.1％(v/v)或300μL产品比300mL水的施用量提供来自配制产品和发酵来源产品的每种Bt.4Q7Flg22处理剂，并将其以等量的喷剂形式提供给每株植物从而完全覆盖树叶，每次处理对所有30株植物施用8mL的每种处理剂。按照标品标签上的使用说明，以等效的施用量11Fl.oz/Ac(803.8mL/Ha)施用Endura杀真菌剂预处理剂。使用完全随机区组设计将处理剂随机化。预处理后约48小时，使用放置在接触植物茎的菌丝体一侧的菌丝栓(覆盖有菌丝体的琼脂栓)将植物用蒙大拿州本地分离的核盘菌进行接种。然后将扁豆植物放置在湿度(100％)室中，持续72小时。接种后第11天，对疾病症状进行评估和评分，并收集平均鲜重(每个重复的总重量-克)(表82)。使植物干燥大约3周，然后收集干重(每个重复的总重量-克)(表82)
收集五株植物的每个重复的疾病评分(疾病评分等级0-7)以及鲜量和干重(克)，然后取植物总数的平均值(n＝30)。以0-7的等级对疾病评分进行排序，0分等于没有疾病，10分表示所有植物均未能存活(表82)。
表82.感染核盘菌10天后扁豆的疾病评估
Figure BDA0002417772590002921
*p值<0.1意味着处理剂与水对照之间存在统计学上显著的差异。
将配制的Bt.4Q7Flg22叶面施剂与Endura杀真菌剂、与配制的Bt.4Q7Flg22组合的Endura杀真菌剂以及两种Bt.4Q7Flg22处理剂进行比较，所述两种处理剂与由发酵反应产生的具有和不具有EK激活的Flg22多肽一起提供，如先前表82中所述。将作物疾病模型中的所有叶面处理剂彼此进行比较，并与经水对照处理的植物进行比较，并在接种后11天评估疾病症状的出现。每株植物的疾病评分为0-7。还确定了每株植物的总鲜重和干重(克)。
在所有叶面处理剂中，Endura杀菌剂(用于核盘菌的市售处理剂)在扁豆上的疾病症状发展最少，疾病评分为0.50，而水处理剂(对照)的疾病评分为2.83。与接受水对照处理剂的植物相比，将配制的Bt.4Q7Flg22处理剂叶面施用于扁豆植物导致对核盘菌的抵抗力增强，疾病评分为1.33(p值＝0.0972)。与用水对照处理过的植物相比，Endura杀真菌剂处理剂导致生长减慢，而配制的Bt.4Q7Flg22处理剂导致症状早期发展期间持续旺盛的生长。与仅用Endura杀真菌剂(2.89g)或水对照(4.52g)处理过的植物相比，接受配制的Bt.4Q7Flg22预处理的扁豆植物每株平均鲜重为5.44克。与用水对照处理过的植物相比，Endura杀真菌剂与配制的Bt.4Q7Flg22多肽的组合处理剂进一步增加了对扁豆植物免受症状发展影响的保护作用，疾病评分为1.0(p值＝0.0524)。接受配制的Bt.4Q7Flg22多肽预处理的植物的植物重量(新鲜和干燥)大于单独接受水对照或Endura杀真菌剂的植物的新鲜或干燥重量。由发酵来源产品(非EK激活和EK激活)提供的Bt.4Q7Flg22多肽在疾病症状等级上等价，其疾病评分为2.17，该分数低于仅用水对照处理的植物的疾病评分。然而，与经水处理的植物相比，用EK激活版本的Bt.4Q7Flg22多肽处理的每株植物的鲜重具有6.11克的显著增加(p值＝0.0266)。与表82中的所有其它处理剂相比，EK激活版本的Bt.4Q7Flg22多肽的鲜重和干重也总体最高。这项研究的其它重要发现是，用配制的Bt.4Q7Flg22多肽对扁豆植物进行预处理可以保护扁豆免受杀真菌剂诱导的损害。接受Endura杀真菌剂的植物的平均鲜重为2.89g，而配制的Bt.4Q7Flg22处理剂的平均鲜重为5.44g(p值＝2.645x10-05)。如前所述，使用含有肠激酶(EK)的发酵产生的Bt.4Q7Flg22从GST-EK-Bt.4Q7Flg22上切割Bt.4Q7Flg22多肽。与经水处理的对照植物相比，提供给扁豆的这种Bt.4Q7Flg22滤液处理剂增加了Flg22多肽的活性，从而在感染期间导致植物生长显著增强(p值＝1.180x10-05)。与仅接受水对照处理的植物相比，未激活的EK或GST-EK-Bt.4Q7Flg22或未裂解的Bt.4Q7Flg22滤液并未增加植物的生长(p值＝0.9852)。
马铃薯
从眼芽突出的2厘米马铃薯切片中种下种薯(品种：Russet Burbank)，切面朝下(每盆1个切片)，并以约7-8厘米的深度种植在10x 10厘米的盆中由1:1的泥炭藓和珍珠岩组成的无土培养基中。以每盆一株的方式种植马铃薯，并在以下生长条件下于受控的生长室中持续19天：约300-400μmol m-2s-1(光子)，保持13/11光照/天的循环和21℃白天/15℃夜间的温度范围。种植后19天，用表36中所述的叶面处理剂对马铃薯进行预处理。如表83中所述，疾病研究包括：六种不同的叶面处理剂中每一种处理剂有五株马铃薯植物，每种处理剂有6株重复植物，每种叶面处理剂总共有30株植物。在添加非离子型表面活性剂(ALLIGARE SURFACE；Alligare，LLC)至最终浓度为0.1％(v/v)或烷基聚氧乙烯、乙二醇衍生物的浓度的情况下，叶面施用用于预处理的所有叶面处理剂。以0.1％(v/v)或300μL产品比300mL水的施用量提供来自配制产品和发酵来源产品的每种Bt.4Q7Flg22处理剂，并将其以等量的喷剂形式提供给每株植物从而完全覆盖树叶，每次处理对所有30株植物施用15mL的每种处理剂。按照标品标签上的使用说明，以等效的施用量11Fl.oz/Ac(803.8mL/Ha)施用Endura杀真菌剂预处理剂。使用完全随机区组设计将处理剂随机化。预处理后约48小时，使用放置在接触植物茎的菌丝体一侧的菌丝栓(覆盖有菌丝体的琼脂栓)将植物用核盘菌进行接种，并在湿度室(100％)中放置192小时。接种后第16天，对疾病症状进行评估和评分，并收集平均茎鲜重(总茎重-克)(表83)。使植物干燥12天，然后记录干重(总茎重-克)(表83)
48小时后，用放置在每株植物附近的土壤上的菌丝栓接种马铃薯植物，并将其置于潮湿的雾化室内。使用随机区组设计将处理剂随机化。疾病评分(评分等级0-6)。还从每株植物中收集茎的鲜重和干重(克)，然后取植物总数的平均值(n＝30)。在收获后约12天，将植物完全干燥后，取茎的干重。初次接种后16天评估疾病评分。以0-6的等级对疾病评分进行排序，0分等于没有疾病，6分表示所有植物均未能存活。
表83.感染核盘菌15天后马铃薯的疾病评估
Figure BDA0002417772590002951
*p值<0.1意味着处理剂与水对照之间存在统计学上显著的差异。
比较了使用配制的Bt.4Q7Flg22和源自发酵产物的Bt.4Q7Flg22多肽(H101滤液)的叶面预处理施剂在接受Endura杀真菌剂和水对照处理的马铃薯植物上的疾病症状发展。与接受水对照的植物(疾病评分＝2.83)相比，将配制的的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)叶面施剂以预处理剂形式提供给马铃薯植物所产生的疾病评分为1.83。与用水对照处理的植物相比，接受Endura杀真菌剂预处理的植物的疾病症状最少，疾病评分为0.50(p值＝0.0045)。配制的Bt.4Q7Flg22多肽预处理剂导致植物的平均疾病评分与以滤液(发酵产物)形式提供的肠激酶激活的Bt.4Q7Flg22(EK激活的H101)相似-均具有1.83的疾病评分。提供给植物的未激活的EK或GST-EK-Bt.4Q7Flg22或未裂解的Flg22滤液(未激活的H101)的评分为2.33，与用水对照处理的植物的疾病评分没有明显差异(p值＝0.4835)。然而，与所有处理剂相比，接受EK激活的Bt.4Q7Flg22滤液预处理的马铃薯植物平均单株鲜重和干重增加，与接受水对照预处理的植物相比，每株植物的茎鲜重增加约20g而茎干重增加近6g。与仅接受水对照施用的植物相比，接受了配制的Bt.4Q7Flg22多肽的植物的单株茎鲜重和茎干重均增加。
实例51：用Flg22和抗微生物多肽治疗亚洲柑橘黄龙病菌感染
通过树干注射处理将Bt.4Q7Flg22制剂施用于瓦伦西亚橙(Citrus sinensis)和红宝石葡萄柚(Citrus x paradisi)树。这项研究是在佛罗里达州中部(奥基乔比县)的一个商业果园里进行的。比较了使用Bt.4Q7Flg22多肽(SEQ ID NO:226)以1X低速(0.55微摩尔肽；韧皮部估计浓度为0.138μM)和10X高速(5.5微摩尔肽；韧皮部估计浓度为1.38μM)进行注射处理的树与未经处理的对照树。使用随机完整区组设计设置注射处理剂，每个处理剂有10棵葡萄柚树(4岁)。在2017年4月(第一次)进行注射，这是从叶片出现到叶片扩展置完整大小的生长阶段。使用低压注入设备BRANDTENTREE(BRANDT)对葡萄柚树进行注射。在注射时(第0天)、注射后第21天和注射后第56天，对来自每个葡萄柚树的叶子进行采样。每棵树总共选择了六片叶子样本，从而根据叶子的年龄、位置和视觉症状的存在来表示树上的叶子数量。将每个中脉与叶刃分开，并立即用新的无菌剃刀刀片切成小块。然后将每棵树的叶子样品放入单独的试管中，然后将其存储在-80℃的冰箱中，直至进行进一步处理。在Southern Gardens Citrus(佛罗里达州克莱维斯顿)对这些叶片进行DNA提取和实时聚合酶链反应或定量PCR(qPCR)分析。
可以使用特定引物通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)方法确定CLas细菌滴度在受HLB感染的柑橘树中的存在，从而确认疾病的存在(Li,W.B.,Hartung,J.S.And和Levy,L.2008“使用实时PCR对宿主植物中无法培养的‘韧皮部杆菌属’进行优化定量(Optimizedquantification of unculturable‘Candidatus Liberibacter spp.’In host plantsusing real-time PCR)”,《植物病害》92:854-861)。在Southern Gardens Citrus(佛罗里达州克莱维斯顿)，使用靶向亚洲柑橘黄龙病菌的16S DNA的HLB引物组进行这些叶子上的DNA提取和定量PCR(qPCR)分析[5'＞＞3'(正向)HLB为TCGAGCGCGTATGCAATACG(SEQ ID NO:773)；(反向)HLBr:GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG(SEQ ID NO:774)；HLBpc(探针)：AGACGGFTGAGTAACGCG(SEQ ID NO:775)，所述探针标记有嵌入型荧光报告染料]。进行了40个qPCR循环，并测量了与溶液中dsDNA量成比例的荧光信号。qPCR分析可检测柑橘组织中的CLas细菌。每种处理剂均从qPCR分析获得循环阈值(Ct)。Ct测量值等于产生相对阈值水平所需的PCR循环数。与分子生物学领域的惯例一样，据报道Ct值的变化表明经处理样品与未经处理样品或经处理样品中某个时间点与另一时间的CLas DNA的相对量。Ct值越高，治疗效果越好或越有效，这可以通过从树中减少/消除CLas细菌来表明。细菌载量减少的百分比可以计算为：
样品随时间减少的百分比＝(1-2[Ct(初始时间)-Ct(稍后时间)])*100％
或
经处理样品相对于对照样品减少的百分比＝(1-2[Ct(对照样品)-Ct(经处理样品)])*100％
葡萄柚试验的结果显示在图9中。图9报告了从T0时间点(注射日)、T21和T56时间点(注射后第21天和第56天)通过qPCR分析获得的Ct比较的平均值(每个处理剂n＝10棵树)以及与平均Ct值的标准误差(T0＝深灰色条；T21＝白色条；T56＝浅灰色条；平均Ct值标记为“x”)。对于每种处理剂，任何异常值均由定位在标准误差线外部的小圆圈表示。对于所有处理时间点，未经注射的对照树或葡萄柚树的Ct值均在25附近的Ct范围内。与来自对照树的叶子相比，从接受了1X和10X Bt.4Q7Flg22多肽制剂注射处理的葡萄柚树上采样的叶子导致Ct计数略高(图9)。Ct值越高，用于控制或减少CLas细菌传播引起的感染的治疗效果就越大。从T21采样中获取的叶子的平均Ct值大于从T56采样中获取的Ct值，但与未经注射的对照叶子或接受Bt.4Q7Flg22多肽制剂注射的树木的叶子相比，两者均显著增加(图9，平均Ct值标记为“x”)。
在另一项使用瓦伦西亚橙(Citrus sinensis)的研究中，也是在佛罗里达州中部(奥基乔比县)的商业果园里进行的。将使用Bt.4QFlg22(SEQ ID NO:226)制剂的注射处理剂与被称为硫蛋白的抗微生物多肽进行了比较。以硫蛋白多肽(SEQ ID NO:651、652和653)的混合物形式提供硫蛋白注射液，其特征为“未标记”或没有韧皮部定位序列。除了未标记的硫蛋白混合物之外，包括韧皮部定位序列的“标记的”硫蛋白多肽(SEQ ID NO:650)也用作比较注射处理剂。韧皮部靶向或“标记”版本用于将硫蛋白特异性地靶向CLas细菌所在并繁殖的韧皮部。使用随机完全区组设计将注射处理剂施用于橙树，其中未经处理的对照和Bt.4QFlg22处理剂的每次处理总共有8棵橙树(8岁)，而硫蛋白处理剂的每次处理总共有5棵橙树。在2017年4月(第一次)进行注射，这是从叶片出现到叶片扩展置完整大小的生长阶段。使用低压注入设备BRANDTENTREE(BRANDT)对橙树进行注射。将浓度为1X(0.138μM)和10X(1.37μM)的Bt.4Q7Flg22多肽、“未标记的”和“标记的”硫蛋白多肽与未接受注射处理的树(对照)进行了比较。在注射时(第0天)和T56(或注射后56天)，每种处理剂均对橙树的叶子进行采样。
每棵树总共选择了六片叶子样本，从而根据叶子的年龄、位置和视觉症状的存在来表示树上的叶子数量。将每个中脉与叶刃分开，并立即用新的无菌剃刀刀片切成小块。然后将每棵树的叶子样品放入单独的试管中，然后将其存储在-80℃的冰箱中，直至进行进一步处理。使用上述用于执行Ct分析的方法，在Southern Gardens Citrus(佛罗里达州克莱维斯顿)对这些叶片进行DNA提取和实时聚合酶链反应或定量PCR(qPCR)分析。
来自瓦伦西亚橙试验的结果显示在图10中(T0＝深灰色条；T56＝白色条)。对于处理时间点T0和T56，来自对照橙树的叶组织的Ct值在25-30附近的Ct范围内最低，这表明这些树中CLas细菌的滴度水平没有变化。与从注水对照中采样的T56叶片的平均Ct值相比，“未标记”和“标记”的硫蛋白处理剂在从“T56”采样中获取的叶片上均具有较高的平均Ct值(图10；平均Ct值标记为“x”)。对于每种处理剂，任何异常值均由定位在标准误差线外部的小圆圈表示。与接受非靶向或“未标记”的硫蛋白处理剂的树木的叶子相比，从接受韧皮部靶向硫蛋白“标记”处理剂的树木中采样的叶子在T56处具有更高的平均Ct值。从接受了1X和10X Bt.4Q7Flg22多肽制剂注射处理的橙树中采样的叶子从T0到T56的时间点产生的Ct计数明显更高，这表现为与T0相比，T56处的Ct平均增加(图10；平均Ct值标记为“x”)。与对照树木的叶子样品相比，注射了两种Bt.4Q7Flg22多肽制剂(1X和10X)的树木的叶子的Ct值也明显更高。Bt.4Q7Flg22是用于控制或降低受感染橙树中的CLas细菌滴度的有效处理剂(图9)。
以注射处理剂形式提供的最终浓度分别为1X(0.138μM)和10X(1.38μM)的Bt.4Q7Flg22多肽均有效降低了注射后8周采样的叶片组织中的CLas滴度水平。然而，更高浓度的Bt.4Q7Flg22多肽10X(1.38μM)更有效，其导致CLas滴度水平降低了37％(试验1)和43％(试验2)。
表84.Bt.4Q7Flg22对降低注射处理后8周柑橘(瓦伦西亚橙和红宝石葡萄柚)上的CLas细菌滴度水平的治疗有效性
Figure BDA0002417772590002991
Figure BDA0002417772590003001
先前的结果表明,Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)在整个疾病时期促进植物生长(实例50)。为了评估将Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)注入受HLB感染的瓦伦西亚橙和红宝石葡萄柚树所产生的潜在植物生长益处，于2018年5月在佛罗里达州中部(奥基乔比县)的商业小树林果园中测量了2017年4月注入Bt.4Q7Flg22的相同树木的当年生长情况，并评估了CLas细菌滴度。目测评估每棵树的当季生长区域，其树枝为绿色，而老的生长树枝则外观上更显木质，呈深绿棕色至棕色色调。每棵树选择三个具有新生枝的代表性树枝，并用柔性卷尺测量从绿色新生枝的起点(最老的节点)到最年轻的节点的尖端的距离(以英寸为单位)。收集了注入1X和10X Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的树木的数据以及未经处理的对照树木的数据，“瓦伦西亚”橙试验每次处理8棵树，而“红宝石”葡萄柚试验每次处理9-10棵树(每次处理n＝24-30次测量)。“红宝石”葡萄柚试验中仅丢失了原始试验(1XBt.4Q7Flg22处理剂组)中的一棵树，这大概是由于2017年9月的飓风强度损害。对于每个试验，计算新生枝的平均长度(英寸)，并将其相对于未经处理的对照进行归一化(表85)。
表85.Bt.4Q7Flg22树干注射剂可增加“瓦伦西亚”橙和“红宝石”葡萄柚中新树枝的生长
Figure BDA0002417772590003011
这些结果证明了与未经处理的植物相比，显示出降低的CLas细菌滴度(图9和图10)的Flg22组合物在增强甜橙和柚子树的生长方面的能力(表85)。随着整个季节生产更多的叶子来维持果实的生长，增强的树枝生长可以充当果实产量提高的指标。与未经处理的对照相比，2017年4月接受1X Bt.4Q7Flg22注射剂的橙树和葡萄柚树的新树枝的生长分别平均增加了6.1英寸(+85％)或2.8英寸(+35％)。Bt.4Q7Flg22的10倍注射剂量也有效地促进了生长，橙树和葡萄柚树中新树枝的生长分别增加了5.1英寸(70％)和+1.1英寸(+13％)。由于在2018年，10倍Bt.4Q7Flg22注射剂在增强生长方面的性能不如1倍注射剂，并且在2017年，细菌滴度的降低相似。所以1倍Bt.4Q7Flg22注射剂可在植物中提供足够的反应。重要的是，生长测量表明，以1倍或10倍的速率树干注射Flg22后未发生任何植物毒性。
由于这些植物没有100％清除引起疾病的细菌，因此这些结果也证明了，即使在存在引起HLB的细菌的情况下，注射了Bt.4Q7Flg22的植物也能够继续生长。假设具有抗生素抗性的CLas菌株预计会出现并成为控制HLB的另一个障碍，则Flg22注射剂代表了用于改善植物生长并降低细菌滴度的抗生素处理剂的理想替代品。在这个实例中，用标准的商业柑橘处理程序维护接受了Flg22注射剂的树木，这进一步证明了将Flg22柑橘注射剂添加到标准种植者实践中的能力。
实例52：单独施用或与抗微生物或植物健康促进性化合物组合施用的Flg22的叶面和树干注射增加了橙树中新芽的生长
在随后的2018年4月的试验中，通过树干注射处理或叶面喷洒在两个独立的试验地点施用Flg22制剂。将试验设计成：1)测试通过合成和发酵产生的Flg22多肽变体；2)比较先前用于2017年柑橘注射试验的Flg22变体Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)以及Syn01Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:571)，后者既可作为叶面处理剂又可作为种子处理剂来提高大田作物的产量；3)比较Flg22的施用方法，即树干注射与对树冠进行叶面喷洒；以及4)测试Flg22肽与土霉素注射剂、L-半胱氨酸和苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代甲酸-S-甲酯(也被称为BTH)之间的组合性处理剂，作为市售制剂ACTIGARD WG。L-半胱氨酸是一种必需的蛋白氨基酸；BTH是一种具有更高稳定性的水杨酸类似物，其在农业上用作植物免疫反应的激活剂，并且已被批准用于柑橘树的根部浸水或灌溉处理，以防止由地毯草黄单胞菌柑橘致病变种引起的柑橘溃疡病。
在2018年3月，在两个单独的地点对树木进行了处理。在佛罗里达州中部(奥基乔比县)的一个商业小树林果园里对三岁的Hamlin橙树(Citrus sinensis)进行了处理。在佛罗里达州威尔士湖(波克县)的拥有6年历史的Vernia橘树商业林中对施文格砧木(Swinglerootstock)进行了类似的试验。使用用于树干注射的低压注入设备BRANDT ENTREE(BRANDT)或可产生细雾以进行叶面喷洒的CO2加压背负式喷洒器来施用下表85中所列的处理剂。树干注射如实例51中所述。将Bt.4Q7Flg22的叶面组合物与非离子表面活性剂(Precision Labs NIS90:10；喷罐体积的0.1％v/v)一起稀释于水中，并以每棵树3升的喷撒率均匀地施用于树冠的冠层。在试验区域中，将接受叶面处理剂的树木的区块隔开，即处理块之间有间隙(跳过的树木)，以避免处理剂漂移到相邻的处理块中。在清晨或傍晚风力较弱(<5mph)时进行处理，条件是所有喷雾处理剂均在4小时内在叶片上干燥。将表86中所述的组合处理剂在同一BRANDT ENTREE瓶中进行共同注射(柑橘组合物7、柑橘组合物8)，或以土霉素注射剂的形式单独施用，然后在同一天施用Bt.4Q7Flg22-Syn01叶面处理剂(柑橘组合物11、柑橘组合物12)。对于所有处理剂，每次处理使用10棵树，分成两个重复的区块，每个区块中五棵树。在奥基乔比和波克县小树林中均施用柑橘组合物1-8，而仅在奥基乔比小树林中施用柑橘组合物9-12。
表86.经测试可改善HLB对橙树的影响的处理剂组合物
Figure BDA0002417772590003031
Figure BDA0002417772590003041
Figure BDA0002417772590003051
为了评估向受HLB感染的橙树注射或喷洒单独的Flg22多肽制剂或其与抗微生物或植物健康促进性化合物的组合所产生的潜在植物生长益处，于2018年5月在佛罗里达州奥基乔比县和佛罗里达州波克县的商业林中测量了2018年3月处理过的树木的新芽长度。在两个地点都对植物进行处理时(2018年3月)，树木的叶子呈深绿色，同时2018季的果实开始发育。在处理(2018年3月)和树木测量(2018年5月)之间的两个月时间间隔中，树木进入春季发芽期，具有可见为非常浅的绿色新生枝、柔韧的树枝和类似浅绿色的叶子。评估每棵树的新芽，并且每棵树选择三个具有新生枝的代表性树枝。用柔性卷尺测量从浅绿色新生枝的起点(最老的节点)到最年轻的节点的尖端的距离(以英寸为单位)。每次处理(包括未经处理的对照)收集了10棵树的数据，每次处理总共进行了30次测量。表86表示了每种处理剂在奥基乔比郡和波尔克郡两个树林地点的平均芽长度(英寸)，其生长相对于未经处理的对照进行归一化。
表87.以树干注射剂或叶面喷剂形式施用的Flg22变体增加了“Hamlin”和“Vernia”橙树中新树枝的生长
Figure BDA0002417772590003061
在树干注射或叶面喷洒Flg22变体两个月后对“Hamlin”和“Vernia”新芽进行的生长测量表明，与未经处理的对照相比，Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Syn01Flg22(SEQ IDNO:571)均有效促进了更大的生长。平均而言，未经处理的对照枝芽的长度为3.08英寸，而注入Bt.4Q7Flg22的树的枝芽长出25％(3.84英寸)，注入Syn01Flg22的树的枝芽长出146％(4.48英寸)。通过实例49中所述的发酵方法产生的Bt.4Q7Flg22和Syn01Flg22在以80mL/树的速率注入树干时也有效地增加了芽的生长。含有通过发酵菌株H101产生并用0.8U/mL肠激酶(新英格兰生物实验室公司；产品代码P8070)处理过的Bt.4Q7Flg22的柑橘组合物3是最有效的，与未处理的对照相比，芽平均长出169％(5.18英寸)。
还测试了Flg22变体叶面施剂促进受HLB感染的橙树生长的能力，所述叶面施剂在疾病胁迫下有效促进猕猴桃、大豆、扁豆和马铃薯生长。表88显示，分别由1X或4X剂量的Syn01Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:571)组成的柑橘组合物5和6也有效促进橙树中新芽的生长。1X和4X剂量的效果类似，其中1X叶面速率比对照长出119％，而4X速率比对照长出122％。这些结果表明，Flg22多肽叶面施剂可以用作柑橘树林的标准护理程序的一部分。
表88.注入Bt.4Q7Flg22-Syn01与植物健康促进性化合物的组合可增加‘Hamlin’和‘Vernia’橙树中新树枝的生长
Figure BDA0002417772590003071
接下来，在梅尔文地点和威尔士湖树林中研究了Syn01Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:571)与BTH(ACTIGARD WG)或L-半胱氨酸的组合。与未经处理的对照相比，表88中的两种组合处理剂均显示出更大的新芽长度，这表明Flg22多肽可以与氨基酸、植物激素或植物激素模拟物组合使用以改善柑橘树的健康。
表89.Bt.4Q7Flg22-Syn01叶面喷施剂与土霉素注射剂组合可增加3岁‘Hamlin’橙树中新树枝的生长
Figure BDA0002417772590003081
在另一个试验中，观察了Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)与土霉素处理剂的组合。在向树注射土霉素的同一天，还以1倍或10倍的速率向10棵树喷洒Syn01Flg22叶面喷剂。这些结果表明抗生素和多肽处理剂是相容的，并且由于双重处理剂，并未观察到任何植物毒性。可以设想一个标准程序，在所述程序中，种植者交替使用树木注射剂和叶面处理剂，以增强对HLB症状的控制并降低CLas滴度。
实例53：在大豆植物上使用Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP叶面施剂以预防由大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)引起的疾病的疾病保护
表90描述了在以下实例中测试的组合物和相应的施用量
表90.大豆上的Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP叶面施剂可保护植物免受大豆锈菌和大豆紫斑病菌侵害
Figure BDA0002417772590003091
Figure BDA0002417772590003101
*叶面组合物含有0.1％(v/v)的PROXEL BC防腐剂、330.7mM 1,2-苯并噻唑啉酮(BIT)、53.5mM 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)和26.1mM2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)的混合物的水分散液。以150L/Ha的载剂体积或16加仑/英亩的水的形式将叶面组合物按指定的速率(Fl.oz/Ac或mL/Ha)与0.5％(v/v)AUREO甲基化豆油表面活性剂(组合物13)一起或与0.33％(v/v)Agris Parrafinic矿物油(原料浓度为795g/L或79.5％(p/v))(组合物13-20)一起施用。
使用叶面施剂在巴拉圭的三个地点(亚提泰、奥利巴多和卡皮坦米兰达)进行了重复的田间试验，所述叶面施剂包括与广谱杀菌剂Fox(16.0％丙硫菌唑和13.7％肟菌酯)一起提供的Bt.4Q7Flg22多肽和RHPP多肽的组合物。FOX是南美的一种市售叶面杀真菌剂，其在预防和根治由大豆锈菌引起的亚洲大豆锈病和由大豆紫斑病菌引起的尾孢属叶枯萎病方面效果有限，应按照标本标签上的建议以每英亩5.48液体盎司(Fl.oz/Ac)(400mL/hectare)的施用量以叶面喷剂的形式进行施用。从R1发育阶段开始，大豆植物接受了表90中所述的组合物的两次叶面施用，两次喷施之间间隔13-14天。在三个地点将叶面处理剂施用于单一大豆品种(哪一个？三个地点都相同)，重复4个地块(3x 10米，30平方米；每次处理最少6行)。在大豆发育的R4-R5阶段(第二次叶面施用后4-15天)根据Godoy等人的指导(1997；《植物病害与保护(Journal of plant diseases and protection》104:336-345)对自然感染试验的疾病评估的感染严重性进行评分(受影响的叶子的0-100％)，针对大豆锈菌引起的亚洲大豆锈病和大豆紫斑病菌引起的尾孢属叶枯萎病，对每个地块内的10株植物进行评分。在大豆发育的R4-R5阶段还对植物毒性百分比(受影响的叶子的0-100％)进行了评分。在每个地点的所有四个重复中(总计＝12个重复，三个地点，每个地点四个重复)对感染的严重性和植物毒性取平均值。计算了每种处理剂在三个地点之间的标准偏差。在第二次叶面处理后第11天，亚提泰地点的未经处理的对照植物表现出99％的脱叶率，并在此时对所述植物脱叶程度进行评分(0-100％脱叶率)。表91中以百分比的形式提供了疾病的严重性、植物毒性和脱叶结果，括号中为标准偏差。
表91.在巴拉圭叶面施用杀真菌剂和多肽组合物后亚洲大豆锈病症状的发生率
Figure BDA0002417772590003111
Figure BDA0002417772590003121
Figure BDA0002417772590003131
Figure BDA0002417772590003141
表92.在巴拉圭叶面施用杀真菌剂和多肽组合物后尾孢属叶枯萎病症状的发生率
Figure BDA0002417772590003151
Figure BDA0002417772590003161
Figure BDA0002417772590003171
表93.在巴拉圭叶面施用杀真菌剂和多肽组合物后的植物毒性
Figure BDA0002417772590003172
Figure BDA0002417772590003181
Figure BDA0002417772590003191
与未经处理的对照相比，在大豆发育的繁殖期叶面施用Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP提供了增强的抗亚洲大豆锈病和尾孢属叶枯萎病的保护作用。与未经处理的对照相比，经150和300mL/Ha Bt.4Q7Flg22处理的植物的叶面施用显示出的亚洲大豆锈病叶面积损害减少了12.4-13.0％，而尾孢属叶面积损害减少了2.8-3.5％；并且，与未经处理的对照相比，经150和300mL/Ha Gm.RHPP处理的植物的叶面施用显示出的亚洲大豆锈病叶面积损害减少了10.5-11.3％，而尾孢属叶面积损害减少了3.3-4.5％。与单独的Fox杀真菌剂处理剂相比，包含Bt.4Q7Flg22或RHPP与FOX杀真菌剂的组合处理剂增强了抗亚洲大豆锈病和尾孢属的保护作用。在亚提泰地点，由于在施用Bt.4Q7Flg22或Gm.RHPP处理剂+/-FOX杀真菌剂时出现严重的疾病症状，因此在R7发育阶段观察到较少的脱叶。虽然未经处理的对照在此阶段的脱叶率为99％，但150或300mL/Ha下的Bt.4Q7Flg22处理剂将脱叶率分别降低至70％或60％，同时仍可见绿色叶子。150或300mL/Ha下的Gm.RHPP处理剂将脱叶率分别降至96％或70％。Bt.4Q7Flg22或Gm.RHPP处理剂与FOX杀真菌剂的组合处理剂将脱叶率降低至25％(可见绿叶)，而单独的Fox杀真菌剂将脱叶率降低至仅45％(无绿叶可见)。总体而言，多肽处理剂提供了比单独使用FOX杀真菌剂更好的保护作用，从而控制亚洲大豆锈病和尾孢属叶枯萎病。单独施用任何多肽均未观察到植物毒性，并且与单独使用FOX杀真菌剂相比，任何一种多肽与FOX杀真菌剂的组合均未显著增加或减少植物毒性(表93)。
实例54.猕猴桃上的Flg22-PSA叶面施剂可保护植物免受丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(PSA-V)的侵害
丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(PSA)是一种破坏性植物病原体，其在猕猴桃的整个产区引起绿色果肉猕猴桃(美味猕猴桃)和黄色果肉猕猴桃(中华猕猴桃)的细菌性溃疡病，因此在新西兰、中国和意大利造成严重的收成损失。仅在新西兰，预计到2025年，最具破坏力的生物变种PSA-V的累积收入损失将接近7.4亿新西兰元(纽元)(林肯大学农业经济综合研究所“Psa-V对新西兰猕猴桃产业和更广泛社区造成的损失(The Costs of Psa-V tothe New Zealand Kiwifruit Industry and the Wider Community)”；2012年5月)。PSA-V定居在猕猴桃植物的内表面和外表面，并且可以通过木质部和韧皮部组织传播。猕猴桃PSA-V的疾病症状包含细菌性叶斑、树干细菌性溃疡、红色渗出液、花腐烂、树枝变色已经最终使猕猴桃藤枯。PSA-V的标准控制方法目前采取在猕猴桃藤上频繁地叶面喷施金属铜，这预计会导致选择抗铜形式的病原体并失去疾病控制能力。迫切需要新颖的控制方法。
为了测试猕猴桃叶片对鞭毛蛋白的22个氨基酸片段的敏感性，从美味猕猴桃-“海沃德”猕猴桃叶柄上切下1mm的切片，并漂浮在含150μL水的96孔板中，每孔一个切片。通过将冻干的多肽重悬于去离子水中至浓度为10mM，制备表94中的Flg22多肽用于测定；然后在含0.1％Tween-20的100mM磷酸钠(pH 7.8-8.0)缓冲液中将多肽连续稀释至10μM。20小时后从猕猴桃叶柄样品中除去水，并用含100μL激发溶液的去离子水的代替，所述激发溶液含有100nM肽(从10μM储备液中稀释)、34μg/mL鲁米诺和20μg/mL辣根过氧化物酶。植物组织对Flg22多肽的识别导致免疫信号的激活和质外体活性氧(ROS)的产生。在存在ROS(H2O2)的情况下，辣根过氧化物酶催化鲁米诺的氧化和可见光的产生。用SpectraMax L发光计(0.5秒积分；2.0分钟间隔)在40分钟的时间过程中记录相对光单位(RLU)。在两个独立的实验中，用表94中的每种Flg22多肽处理了总共6个猕猴桃叶柄样品。计算了每种处理剂的平均总RLU和平均值的标准误(SEM)。使用两尾T检验确定处理剂之间90％置信水平(P<0.1)下的显著性。与100nM Bt.4Q7Flg22对照的总RLU相比，确定了每种多肽的相对ROS产生。
表94.猕猴桃叶柄对Flg22-PSA最敏感
Figure BDA0002417772590003211
*90％置信度水平下的显著差异
在两个独立的实验中，与源自苏云金芽孢杆菌菌株4Q7的Flg22(Bt.4Q7Flg22；SEQID NO:226)相比，“海沃德”猕猴桃的叶柄对源自丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的Flg22(Flg22-PSA；SEQ ID NO:540)最敏感。虽然与Bt.4Q7 Flg22(SEQ ID NO:226)相比，响应于合成的Syn01Flg22(SEQ ID NO:571)，猕猴桃叶柄中的ROS产生增加了，但差异并不明显。基于这些结果，按指定的100nM最终浓度(表94)配制了Flg22-PSA(SEQ ID NO:540)，用于新西兰的“海沃德”猕猴桃盆栽植物的疾病预防试验。
表95.施用于盆栽猕猴桃试验的处理剂
Figure BDA0002417772590003221
叶面组合物含有0.1％(v/v)的PROXEL BC防腐剂、330.7mM 1,2-苯并噻唑啉酮(BIT)、53.5mM 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)和26.1mM 2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)的混合物的水分散液。在含0.05％(v/v)Contact XcelTM非离子表面活性剂的水(g/L水或mL/L水中)中将叶面组合物稀释至指定浓度。用加压的背负式喷洒器将稀释后的产品以细小液滴的形式施用到每株植物的整个树冠上，直至完全覆盖。
为了评估Flg22-PSA(SEQ ID NO:540)控制丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(PSA-V)的功效，由HortEvaluation Ltd与NuFarm Limited合作在新西兰的丰盛湾地区进行了一项盆栽猕猴桃疾病试验。无PSA-V症状的美味猕猴桃-“海沃德”猕猴桃盆栽植物平均分布在6个处理组之间，每组12个盆栽植物。接种PSA-V的前一天，根据表96(处理组3、4)的施用量，用ChampION++TM(PSA-V防治的行业标准)或配制的Flg22-PSA处理新西兰蒂普基的一家苗圃中盆栽植物。24小时后，使用5L手持式加压喷洒器向除未感染对照外的所有植物喷洒1x108cfu/mL PSA-V接种物，直至完全覆盖。仅用水喷洒未感染的对照。然后将盆栽植物运送到普基希纳，并在具有顶棚喷雾的地方放置48小时，以模拟PSA-V感染的环境条件，其中将未感染的对照植物与受感染的植物分开。然后在48小时后，从雾化区域移出一部分植物并使其短暂干燥。经过最终的处理后，将所有植物都移到其最终的室外试验地点，即在普基希纳的随机地点。试验地点的日平均温度为20.75℃，在34天内的总降雨量为277mm。此外，通过滴灌对每株植物每天进行两次浇水，每次两小时。使环境条件有利于PSA-V疾病症状的发展。在整个试验过程中通过视觉监测植物的PSA-V疾病评估，由同一评估者记录接种后6天(6DAI)、16DAI、23DAI和29DAI的斑点覆盖的叶面积％。另外，在29DAI，以0-10的等级评估每株植物的处理剂植物毒性作用，其中0＝没有叶片植物毒性，而10＝非常严重的叶片植物毒性症状。表96报告了每种处理剂在6、16、23和29DAI的平均病害评分，以及29DAI的植物毒性评分(每个处理n＝12株植物)。计算每种处理剂相对于未经处理的对照的P值。
表96.Flg22-PSA叶面施剂可减轻猕猴桃植物的PSA-V疾病症状
Figure BDA0002417772590003231
与未经处理的对照相比，施用Flg22-PSA显著降低了6、16和23DAI时的PSA-V叶斑症状(P<0.1；90％置信区间)。在所有评估时间点，与单独的Flg22-PSA处理剂相比，Flg22-PSA预处理剂的组合进一步降低了叶斑的严重性，并将有效保护期延长至29DAI(与未经处理的对照相比，叶斑减少了14.3％；P＝0.002)。总之，Flg22-PSA既可以作为单独的处理剂使用，也可以与其它旨在限制病原体生长的处理剂组合使用。虽然目前用于治疗PSA的含铜处理剂-行业标准ChampION++TM会引起轻度的植物毒性(AVE评分＝1.6)，但处理剂3-4中并未观察到明显的植物毒性(表97)。Flg22-PSA可以用作其它植物毒性处理剂的替代品。
表97.FLG22-PSA叶面施剂不会引起猕猴桃植物的叶片植物毒性
Figure BDA0002417772590003241
实例55：源自延伸因子Tu的多肽
测试了来自蜡样芽孢杆菌延伸因子-TU(EF-Tu)蛋白的Elf18和Elf26多肽在玉米(杂交种5828YX)、大豆(品种Morsoy)和拟南芥中产生ROS反应的能力。多肽由GenscriptUSA(美国新泽西州皮斯卡塔韦)采用标准固相合成方法合成，并以冻干粉末形式提供，纯度大于或等于70％。将干燥的粉末重悬于超纯水中至10mM的浓度，然后在超纯水中依次稀释至表98中的ROS测定中所测试的浓度。
对于ROS测定，从4周龄的植物上切下拟南芥叶片，并使用穿孔器从叶片上取下4毫米圆盘。使用剃须刀刀片将每个圆盘切成两半，然后将圆盘的每一半漂浮在含150μL水的96孔板中(背面接触水)，静置过夜。第二天，在进行多肽处理之前从每个孔中除去水。将RLU值和相对ROS活性报告为4次测量的平均值。使用先前在实例15中报道的方法进行ROS活性测定。ROS活性结果报告在下表97中。
表98.来自蜡样芽孢杆菌的Elf18和Elf26多肽
Figure BDA0002417772590003251
表99.拟南芥叶片组织中的elf18和elf26多肽的ROS活性
Figure BDA0002417772590003252
先前在芸苔属植物分枝中鉴定了EF-Tu多肽的受体-EF-Tu受体(EFR)，其中拟南芥是模型植物。表99中的结果表明，当均以100nM的浓度进行测试时，来自蜡样芽孢杆菌的新鉴定的多肽EF-Tu(SEQ ID NO:616和SEQ ID NO:617)可用于引发与Bt.4Q7Flg22(SEQ IDNO:226)相似的ROS反应。与经模拟处理的对照相比，EF-Tu N端多肽产生的反应增加了3.2-2.5倍，而Bt.4Q7Flg22产生的反应比模拟对照增加了3.1倍。这些结果表明，在芸苔属作物中，蜡样芽孢杆菌N端的18和26个氨基酸片段可以与Bt.4Q7Flg22类似地使用，以增加植物的生物量、产量和疾病预防，所述芸苔属作物包含但不限于羽衣甘蓝、卷心菜、羽衣甘蓝叶(collard greens)、花椰菜、抱子甘蓝(Brussel sprouts)、皱叶甘蓝、球茎甘蓝和盖兰。
EF-Tu N端肽(SEQ ID NO:616和SEQ ID NO:617)和Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)的组合处理剂导致与单独的EF-Tu肽相似的ROS反应，这表明本领域中的肽处理剂的组合将不会干扰活性；然而，由于分别被EFR和FLS2受体识别的EF-Tu和Flg22肽的下游信号转导事件之间存在共同的机制，因此，交错施用的肽处理剂可能为植物提供最大的生长益处。
实例56：在大豆植物上使用Bt.4Q7Flg22和Gm.RHPP叶面施剂以预防由大豆锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)引起的疾病的疾病保护
先前发现在大豆发育的繁殖期叶面施用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)可以减少由大豆锈菌和大豆紫斑病菌感染引起的疾病症状(实例53)。在巴拉圭进行的重复试验中，植物感染了亚洲大豆锈病和尾孢属叶枯萎病，取这些植物的产量，发现与未经处理的对照植物相比，叶面施用Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)和Gm.RHPP(SEQ ID NO:600)可以提高产量。在未经处理的植物的平均产量为1266.3Kg/Ha的试验中，以150和300mL/Ha叶面施用Bt.4Q7Flg22使产量分别增加了+342.2kg/Ha和+427.2kg/Ha。300mL/Ha Bt.4Q7Flg22叶面施剂产生的产量增加(36.1％)与单独的FOX杀真菌剂相当(36.6％)，这表明Bt.4Q7Flg22作为抗真菌的叶面处理剂可有效减少疾病症状并提高产量。与单独的FOX杀真菌剂或Bt.4Q7Flg22叶面施剂相比，用FOX杀真菌剂和Bt.4Q7Flg22的组合施剂处理过的植物在所有三个试验地点的相对产量略高，这表明两种处理剂是相容的。在未经处理的对照相比，以150和300mL/Ha叶面施用Gm.RHPP进一步使产量分别增加了+294.2kg/Ha和506.8kg/Ha。当与FOX杀真菌剂组合使用时，Gm.RHPP在试验中提供了最大的抗疾病保护能力，证据是，Gm.RHPP的施用量为150mL/Ha和300mL/Ha时分别增产了+517.6kg/Ha和+539.9kg/Ha。叶面施用Gm.RHPP持续改善了植物健康状况并提高了产量，因此Gm.RHPP是促进生长和抵抗真菌病害的有效处理剂。
表100.感染大豆锈菌和大豆紫斑病菌的重复田间试验的大豆产量，其中用Bt.4Q7Flg22或RHPP处理植物
Figure BDA0002417772590003271
Figure BDA0002417772590003281
Figure BDA0002417772590003291
Figure BDA0002417772590003301
实例57.用Flg22处理感染了亚洲柑橘黄龙病菌的柑橘树可增加座果率
实例51中总结的先前结果表明，Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)树干注射降低了黄龙病(HLB)的致病因子-亚洲柑橘黄龙病菌所感染的柑橘树中的病原体效价并促进了新的生长。为了评估结果的潜在增加并获得早期产量的估计，于2018年6月在佛罗里达州中部(奥基乔比县)的商业小树林果园中测量了2017年4月树干注入Bt.4Q7Flg22的受HLB感染的相同‘瓦伦西亚’橙树(将于2019年春季收获)和‘红宝石’葡萄柚树(即于2018年秋季收获)的座果率。如实例51中所述，在2017年4月向树木注入1X Bt.4Q7Flg22-低比率(0.55微摩尔肽；估计的韧皮部浓度为0.138μM)或10X Bt.4Q7Flg22-高比率(5.5微摩尔；估计的韧皮部浓度为1.38μM)。在2018年6月，使用用于预测柑橘树产量的既定方法，将注入Bt.4Q7Flg22的树木与树林同一区域内的未经处理的对照树木进行了比较(“预测佛罗里达柑橘产量：方法与发展(Forecasting Florida Citrus Production:Methodology&Development)”；1971；S.R.Williams；佛罗里达州作物和牲畜报告服务(Florida Crop and LivestockReporting Service))。为了量化座果率，在每棵树上随机选择了三个与眼睛水平面相同的四位树枝(每次处理n＝8棵“瓦伦西亚”橙树，每次处理n＝10棵“红宝石”葡萄柚树)。在树枝开始的交界处测量每个四位树枝的周长，并使用以下公式计算树枝的横截面积(CSA)(其中C＝周长，CSA＝横截面积，r＝半径)：
Figure BDA0002417772590003311
和CSA＝πr2
然后，计数位于所述交界处远端的四位树枝上的果实总数。为了归一化树枝大小，将每个四位树枝的座果率量化为树枝上的果实数量除以四位树枝的CSA：
Figure BDA0002417772590003312
图11(‘瓦伦西亚’橙)和图12(红葡萄柚)中用框线图报告了每个四位树枝CSA的果实计数，其中每种处理剂的中值标记为方框内的垂直线，平均值标记为“x”，上四分位数下四分位数标记为方框的末端，并且线延伸至每枝CSA观察到的最高和最低果实计数。对于每种处理剂，任何异常值均由定位在标准误差线外部的小圆圈表示。
为了进一步评估每棵树的坐果的大小和体积，将卡尺放置在每个果实上最宽点处，从而测量每棵树上至少10个随机选择的果实的果实直径(mm)。图13(‘瓦伦西亚’橙)和图14(红葡萄柚)中用框线图报告了每种处理剂的每棵树的平均果实直径(mm)。使用平均果实直径来估计每种处理剂的每枝总果实体积。对于这些估计，使用以下公式计算理论上呈球形的橙子的体积，以毫升量(mL)为单位，其中果实的半径(r)为每枝的平均直径(以mm为单位)除以2：
Figure BDA0002417772590003313
图15(‘瓦伦西亚’橙)和图16(红葡萄柚)中用框线图报告了每种处理剂的通过树枝CSA归一化的果实的估计体积。
在2018年6月收集测量结果，以评估佛罗里达州奥基乔比的‘瓦伦西亚’橙树和‘红宝石’葡萄柚树的座果率，当比较所有测得参数的平均值和中值时，所述测量结果显示，与未经处理的对照相比，于2017年4月接受1X低比率和10X高比率的Bt.4Q7Flg22(SEQ ID NO:226)树干注射的两个品种的树木的每枝果实数和果实大小均增加。座果率和果实大小的增加预示着产量的增加。这些结果提供的另外的证据表明，用Bt.4Q7Flg22对柑橘树进行树干注射可用于减少橙(图9)和葡萄柚(图10；表84)中韧皮部杆菌的细菌滴度，并刺激柑橘树新芽和果实的生长(表85；图11-16)。
鉴于以上内容，将看到实现了本发明的几个目的并且获得了其它有利的结果。
由于可以在不脱离本发明范围的情况下对上述多肽、重组生物、方法和种子进行各种改变，因此旨在将以上描述中包含的所有内容解释为说明性的，而不是限制性的。
实施例
为了进一步说明，以下阐述了本公开的其它非限制性实施例。
实施例1是一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的多肽，其中所述多肽包括：
(a)鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、1-225、227-375、526、528、530、532、534、536、538、540、541、751、752和754-766中的任何一个；或
(b)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571-579和753中的任何一个；或
(c)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:580-586中的任何一个；或
(d)逆反型(retro inverso)Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450、527、531、533、535、537和539中的任何一个；或
(e)逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:451-525或768中的任何一个；或
(f)逆反型Flg15多肽，并且所述逆反型Flg15多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:529或767；或
(g)超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587、589、591、593、594和595中的任何一个；或
(h)逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:588、590、592、596和597中的任何一个；或
(i)根毛促进性多肽(RHPP)，并且所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID No:600、603和604中的任何一个；或
(j)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQID No:602；或
(k)逆反型根毛促进性多肽(RI RHPP)，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQID NO:601、605和606中的任何一个；或
(l)延伸因子Tu(EF-Tu)多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:607-623中的任何一个；或
(m)逆反型延伸因子Tu(RI EF-Tu)多肽，并且所述RI EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:624-640中的任何一个；或
(n)包括SEQ ID NO:750的融合多肽；或
(o)植物磺肽素(PSK)多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；或
(p)逆反型植物磺肽素(RI PSK)多肽，并且所述RI PSK多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:599；或
(q)硫蛋白或硫蛋白样多肽，并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:650-749中的任何一个，并且
任选地，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列。
实施例2是根据实施例1所述的多肽，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列。
实施例3是根据实施例2所述的多肽，其中所述化学修饰包括乙酰化、酸加成、酰化、ADP-核糖基化、醛加成、烷基酰胺加成、酰胺化、胺化、生物素化、氨基甲酸酯加成、氯甲基酮加成、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、酯加成、共价交联的形成、半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、酰肼加成、异羟肟酸加成、羟基化、碘化、脂质加成、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、棕榈酰化、纯化标签的加成、焦谷氨酰加成、外消旋化、硒酰化、磺酰胺加成、硫酸化、RNA转移介导的氨基酸向蛋白质的加成、泛素化或尿素加成。
实施例4是根据实施例2所述的多肽，其中所述化学修饰包括N端修饰或C端修饰。
实施例5是根据实施例3所述的多肽，其中所述化学修饰包括乙酰化、酰胺化、交联或环化。
实施例6是根据实施例2所述的多肽，其中所述变体的氨基酸内的氨基酸取代包括β-氨基酸、D-氨基酸或非天然氨基酸的取代。
实施例7是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括：(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RIRHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(p)的RI PSK多肽。
实施例8是根据实施例7所述的多肽，其中(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571-573中的任何一个。
实施例9是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
实施例10是根据实施例9所述的多肽，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个。
实施例11是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
实施例12是根据实施例11所述的多肽，其中所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽来自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或解硫胺素芽孢杆菌属细菌。
实施例13是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型Flg22多肽。
实施例14是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型FlgII-28多肽。
实施例15是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型Flg15多肽。
实施例16是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
实施例17是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
实施例18是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述RHPP。
实施例19是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述RI RHPP。
实施例20是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述EF-Tu多肽。
实施例21是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型EF-Tu多肽。
实施例22是根据实施例1到21中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包括核心序列。
实施例23是根据实施例22所述的多肽，其中所述核心序列包括SEQ ID:754-766中的任何一个。
实施例24是根据实施例1所述的多肽，其中所述多肽包括所述融合多肽。
实施例25是根据实施例24所述的多肽，其中所述融合多肽包括辅助多肽。
实施例26是根据实施例25所述的多肽，其中所述辅助多肽包括特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542-548中的任何一个或其任何组合。
实施例27是根据实施例25所述的多肽，其中所述辅助多肽包括特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542。
实施例28是根据实施例25所述的多肽，其中所述辅助多肽包括信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合。
实施例29是根据实施例25所述的多肽，其中所述辅助多肽包括信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549。
实施例30是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述植物磺肽素多肽。
实施例31是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述逆反型植物磺肽素多肽。
实施例32是根据实施例1到6中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括所述硫蛋白或硫蛋白样多肽。
实施例33是根据实施例1到32中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包括核心序列，所述核心序列包括SEQ ID NO:754-768中的任何一个，并且其中包含所述核心序列提高了所述多肽的生物活性引发性活性。
实施例34是根据实施例1到33中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例35是根据实施例1到34中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例36是根据实施例1到35中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例37是根据实施例1到36中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少85％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例38是根据实施例1到37中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例39是根据实施例1到38中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例40是根据实施例1到39中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-768中的任何一个具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例41是根据实施例1到40中任一项所述的多肽，其中所述多肽可以包括与SEQID NO:1-766中的任何一个具有至少99％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
实施例42是根据实施例1到41中任一项所述的多肽，其中所述多肽从发酵产物中分离、浓缩和/或部分纯化。
实施例43是根据实施例42所述的多肽，其中所述多肽从发酵产物中分离、浓缩和/或通过过滤或色谱法部分纯化。
实施例44是根据实施例42或43所述的多肽，其中所述多肽从发酵产物中分离、浓缩，或从重组微生物中部分纯化。
实施例45是一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的组合物，所述组合物包括：
根据实施例1到44中任一项所述的多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂；或
根据实施例1到44中任一项所述的多肽的任何组合。
实施例46是根据实施例45所述的组合物，其中所述组合物包括(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂，所述农用化学品或载剂本质上与所述多肽不相关。
实施例47是根据实施例45所述的组合物，其中所述组合物包括：
(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RI RHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；(p)的RI PSK多肽或其任何组合；以及
(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合。
实施例48是根据实施例46或47所述的组合物，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合不含所述化学修饰；不是所述变体；不是所述融合蛋白的一部分；并且不含所述蛋白酶识别序列。
实施例49是根据实施例45所述的组合物，其中所述组合物包括：以下中的两个或更多个：(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RI RHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(p)的RI PSK多肽。
实施例50是根据实施例45所述的组合物，其中所述组合物包括：以下中的两个或更多个：(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽，其中：
(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽中的至少一个含有所述化学修饰；是所述变体；是所述融合蛋白的一部分；或含有所述蛋白酶识别序列；或
(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽中的至少两个本质上不相关；
实施例51是根据实施例45所述的组合物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽由微生物重组产生。
实施例52是根据实施例51所述的组合物，其中所述微生物包括来自芽孢杆菌属的细菌、来自假单胞菌属的细菌、来自类芽孢杆菌属的细菌、青霉菌属真菌、球囊霉属细菌、节杆菌属细菌、副球菌属细菌、根瘤菌属细菌、慢生根瘤菌属细菌、固氮螺菌属细菌、肠杆菌属细菌、埃希氏杆菌属细菌或其任何组合。
实施例53是一种表达或过度表达多肽的重组微生物，其中所述多肽包括根据实施例1到44中任一项所述的多肽或其任何组合。
实施例54是根据实施例53所述的重组微生物，其中所述多肽包括：(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(j)的KTI多肽；或(l)的EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(o)的PSK多肽；或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽。
实施例55是根据实施例53或54所述的重组微生物，其中所述多肽被所述微生物过度表达。
实施例56是根据实施例55所述的重组微生物，其中所述多肽被制成具有分泌信号。
实施例57是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
实施例58是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽在其N端或C端被化学修饰。
实施例59是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽通过交联或环化进行修饰。
实施例60是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽来自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属细菌或其任何组合。
实施例61是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1-75中的任何一个或其任何组合。
实施例62是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包括截短的N端多肽，并且所述截短的N端多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、109、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、752或其任何组合。
实施例63是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包括截短的C端多肽，并且所述截短的C端多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225或其任何组合。
实施例64是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-768中的任何一个或其任何组合。
实施例65是根据实施例64所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574和752中的任何一个或其任何组合。
实施例66是根据实施例64所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个。
实施例67是根据实施例66所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽被掺入非鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽或全长蛋白中，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的掺入导致所述非鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽或全长蛋白的生物活性引发性活性提高。
实施例68是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300中的任何一个或其任何组合。
实施例69是根据实施例57所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375和751中的任何一个或其任何组合。
实施例70是根据实施例69所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301。
实施例71是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述逆反型Flg22多肽。
实施例72是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述逆反型FlgII-28多肽。
实施例73是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述硫蛋白或硫蛋白样多肽。
实施例74是根据实施例73所述的组合物或重组微生物，其中所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:651。
实施例75是根据实施例74所述的组合物或重组微生物，其中所述硫蛋白或硫蛋白样多肽与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至所述植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞。
实施例76是根据实施例75所述的组合物或重组微生物，其中所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641。
实施例77是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述PSK多肽。
实施例78是根据实施例77所述的组合物或重组微生物，其中所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598。
实施例79是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述RHPP。
实施例80是根据实施例79所述的组合物或重组微生物，其中所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600。
实施例81是根据实施例80所述的组合物或重组微生物，其进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽。
实施例82是根据实施例81所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个。
实施例83是根据实施例82所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226。
实施例84是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述RI RHPP。
实施例85是根据实施例38到47中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
实施例86是根据实施例85所述的组合物或重组微生物，其中所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587。
实施例87是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其包括所述PSK多肽、所述RHPP、所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其任何组合。
实施例88是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述EF-Tu多肽。
实施例89是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽进一步包括分泌信号。
实施例90是根据实施例88或89所述的组合物或重组微生物，其中所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616。
实施例91是根据实施例90所述的组合物或重组微生物，其进一步包括氨基酸序列包括SEQ ID NO:617的EF-Tu多肽。
实施例92是根据实施例88到91中任一项所述的组合物或重组微生物，其进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1-525、526、530、532、534、536、538、540、541、571-586和751-766中的任何一个或其任何组合。
实施例93是根据实施例92所述的组合物或重组微生物，其进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:226、571或752或其任何组合。
实施例94是根据实施例92所述的组合物或重组微生物，其进一步包括所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
实施例95是根据实施例94所述的组合物或重组微生物，其中所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587。
实施例96是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其包括：
(a)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571、295、300、293和580；或295、300、293和580；或571、295、293和580；或571、300、293和580；或571、293和580；或571、295、293；或
(b)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及纤维二糖、甲壳素、壳聚糖或纤维素中的一个或多个；或
(c)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:591；或
(d)所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587，以及所述PSK多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:598；或
(e)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571或752或其任何组合，以及所述EF-Tu多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617；或
(f)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、571或752或其任何组合；或
(g)所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
(h)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、226、571或752或其任何组合，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
(i)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600。
实施例97是根据实施例45到56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述多肽包括所述融合多肽。
实施例98是根据实施例45-56中任一项所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽是具有多肽的融合蛋白。
实施例99是根据实施例45到98中任一项所述的组合物或重组微生物，其进一步包括辅助多肽。
实施例100是根据实施例99所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542-548中的任何一个或其任何组合。
实施例101是根据实施例99所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542。
实施例102是根据实施例99所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合。
实施例103是根据实施例102所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549。
实施例104是根据实施例99所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括分泌多肽，并且所述分泌多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:563-570或769中的任何一个或其任何组合。
实施例105是根据实施例104所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括分泌多肽，并且所述分泌多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:563或769。
实施例106是根据实施例99或104所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括肠激酶切割序列，并且所述肠激酶切割序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:772。
实施例107是根据实施例106所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括介于多肽和蛋白质标签之间的连接区。
实施例108是根据实施例107所述的组合物或重组微生物，其中所述蛋白质标签包括聚组氨酸(His)标签、FLAG标签、抗体表位、链霉亲和素/生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)或其任何组合。
实施例109是根据实施例45到52和57到108中任一项所述的组合物，其进一步包括与所述多肽本质上相关的农用化学品或载剂。
实施例110是根据实施例45到52和57到109中任一项所述的组合物，其中所述农用化学品包括抗生素、生物农药、防腐剂、缓冲剂、湿润剂、表面活性剂、包衣剂、单糖、多糖、研磨剂、农药、杀虫剂、除草剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀螨剂、肥料、生物刺激素、渗透保护剂、着色剂、保湿剂、氨基酸、生物防治剂或其组合。
实施例111是根据实施例110所述的组合物，其中所述防腐剂包括二氯苯、苄醇半缩甲醛、异噻唑啉酮衍生物、烷基异噻唑啉酮、苯并异噻唑啉酮、MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、BIT(1,2-苯并噻唑啉-3-酮)、5-氯-2-(4-氯苄基)-3(2H)-异噻唑酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-盐酸盐、4,5-二氯-2-环己基-4-异噻唑啉-3-酮、4,5-二氯-2-辛基-2H-异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮-氯化钙络合物、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮或其任何组合。
实施例112是根据实施例110或111所述的组合物，其中所述缓冲剂包括钾、磷酸、磷酸盐、柠檬酸、柠檬酸盐、硫酸盐、MOPS、HEPES或其任何组合。
实施例113是根据实施例110到112中任一项所述的组合物，其中所述湿润剂包括有机硅、聚氧乙氧基化物、聚山梨醇酯、聚乙二醇及其衍生物、乙氧基化物、农作物油、多糖或其任何组合。
实施例114是根据实施例110到113中任一项所述的组合物，其中所述表面活性剂包括重质石油、重质石油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化的脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙烯乙二醇、烷基胺乙酸盐、烷基芳基磺酸盐、多元醇、烷基磷酸盐、醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、烷氧基化的多元醇、烷基聚乙氧基醚、乙氧基化的大豆油衍生物、烷基聚氧乙烯甘油、醇乙氧基化物、聚氧乙烯聚氧丙烯单丁醚、有机硅衍生物或其任何组合。
实施例115是根据实施例110到114中任一项所述的组合物，其中所述包衣剂包括增粘剂、聚合物、灌浆剂(filling agent)、填冲剂(bulking agent)或其任何组合。
实施例116是根据实施例115所述的组合物，其中所述增粘剂包括羧甲基纤维素、天然聚合物、合成聚合物、阿拉伯树胶、甲壳质、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯盐、天然磷脂、脑磷脂、卵磷脂、合成磷脂、聚酯、聚醚酯、聚酸酐、聚酯氨基甲酸酯、聚酯酰胺；聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；甲基纤维素；聚乙烯醇共聚物；聚乙烯吡咯烷酮；多糖、淀粉、改性淀粉、淀粉衍生物、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐、壳聚糖、纤维素、纤维素酯、纤维素醚、纤维素醚酯、乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素；脂肪；油；蛋白质、酪蛋白、明胶、玉米醇溶蛋白；虫胶；偏二氯乙烯、偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸盐、木质素磺酸钙；聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸盐；聚氧化乙烯；聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚乙烯胺、聚乙酰胺；丙烯酰胺聚合物或共聚物；聚羟乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺；聚氯丁二烯，或其任何组合。
实施例117是根据实施例110到116中任一项所述的组合物，其中所述研磨剂包括滑石、石墨或其组合。
实施例118是根据实施例110到117中任一项所述的组合物，其中所述农药包括杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、杀菌剂、杀线虫剂、杀螨剂或其任何组合。
实施例119是根据实施例118所述的组合物，其中所述杀虫剂包括噻虫胺(clothianidin)、吡虫啉(imidacloprid)、有机磷酸盐、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、杀螨剂(acaricide)、邻苯二甲酸酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、经卤代芳香族取代的尿素、烃酯、生物基杀虫剂或其任何组合。
实施例120是根据实施例118所述的组合物，其中所述除草剂包括2,4-D、2,4-DB、刈草胺(acetochlor)、三氟羧草醚(acifluorfen)、甲草胺(alachlor)、莠灭净(ametryn)、莠去津(atrazine)、氯氨基吡啶酸(aminopyralid)、氟草氨(benefin)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、苄嘧磺隆甲基(bensulfuron methyl)、地散磷(bensulide)、噻草平(bentazon)、双嘧苯甲酸钠(bispyribac-sodium)、除草定(bromacil)、溴苯腈(bromoxynil)、苏达灭(butylate)、唑草酮(carfentrazone)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、2-氯苯氧基乙酸、氯磺隆(chlorsulfuron)、氯嘧磺隆乙基(chlorimuron ethyl)、烯草酮(clethodim)、异噁草酮(clomazone)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯酯磺草胺(cloransulam)、CMPP-P_DMA、草灭特(cycloate)、DCPA、甜菜安(desmedipham)、麦草畏(dicamba)、敌草腈(dichlobenil)、氯甲草(diclofop)、2,4-二氯苯酚、二氯苯氧基乙酸、二氯丙酸(dichlorprop)、精二氯丙酸(dichlorprop-P)、唑嘧磺胺(diclosulam)、二氟吡隆(diflufenzopyr)、二甲吩草胺(dimethenamid)、2,4-二氯苯氧基乙酸的二甲胺盐、敌草快(diquat)、敌草隆(diuron)、DSMA、草藻灭(endothall)、EPTC、丁氟消草(ethalfluralin)、乙呋草磺(ethofumesate)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆(flucarbazone)、氟噻草胺(flufenacet)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、伏草隆(fluometuron)、氟草烟(fluroxypyr)、氟草烟1-甲基庚基酯(fluorxypyr 1-methyleptylester)、氟磺胺草醚(fomesafen)、氟磺胺草醚钠盐(foresafen sodium salt)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、草丁膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-ammonium)、草甘膦(glyphosate)、吡氯磺隆(halosulfuron)、吡氯磺隆-甲基(halosulfuron-methyl)、六嗪酮(hexazinone)、2-羟基苯氧基乙酸、4-氢氧苯氧基乙酸、咪草酯(imazamethabenz)、咪草啶酸(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、异噁酰草胺(isoxaben)、异噁氟草酮(isoxaflutole)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、灭草烟(mazapyr)、MCPA、MCPB、2甲4氯丙酸(mecoprop)、精2甲4氯丙酸(mecoprop-P)、甲基磺草酮(mesotrione)、异丙甲草胺(metolachlor-s)、嗪草酮(metribuzin)、甲磺隆(metsulfuron)、甲磺隆-甲基(metsulfuron-methyl)、草达灭(molinate)、MSMA、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、达草灭(norflurazon)、黄草消(oryzalin)、噁草灵(oxadiazon)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、百草枯(paraquat)、壬酸(pelargonic acid)、胺硝草(pendimethalin)、甜菜宁(phenmedipham)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氨氟乐灵(prodiamine)、扑草净(prometryn)、拿草特(pronamide)、敌稗(propanil)、氟丙磺隆(prosulfuron)、杀草敏(pyrazon)、嘧硫草醚(pyrithiobac)、罗克杀草砜(pyroxasulfone)、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹禾灵(quizalofop)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定(sethoxydim)、环草隆(siduron)、西玛津(simazine)、磺胺草唑(sulfentrazone)、嘧磺隆(sulfometuron)、乙磺磺隆(sulfosulfuron)、丁唑隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、噻草啶(thiazopyr)、噻磺隆(thifensulfuron)、噻磺隆-甲基(thifensulfuron-methyl)、禾草丹(thiobencarb)、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏(triallate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、苯磺隆-甲基(tribernuron-methyl)、绿草定(triclopyr)、氟乐灵(trifluralin)、氟胺磺隆(triflusulfuron)或其任何组合。
实施例121是根据实施例118所述的组合物，其中所述杀线虫剂包括坚强芽孢杆菌、氟吡菌酰胺(fluopyram)、抗生素杀线虫剂、阿维菌素(abamectin)、氨基甲酸酯类杀线虫剂、乙酰虫腈(acetoprole)、蚀几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)、氯化苦(chloropicrin)、杀线噻唑(benclothiaz)、苯菌灵(benomyl)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burholderia cepacia)、卡巴呋喃(carbofuran)、丁硫克百威(carbosulfan)、cleothocard、棉隆(dazomet)、DBCP、DCIP、棉铃威(alanycarb)、涕灭威(aldicarb)、砜灭威(aldoxycarb)、草氨酰(oxamyl)、除线特(diamidafos)、克线磷(fenamiphos)、伐线丹(fosthietan)、磷胺(phosphamidon)、硫线磷(cadusafos)、毒死蜱(chlorpyrifos)、除线磷(diclofenthion)、乐果(dimethoate)、灭克磷(ethoprophos)、丰索磷(fensulfothion)、噻唑磷(fostiazate)、伸展素(harpins)、速杀硫磷(heterophos)、新烟碱类(imicyafos)、isamidofos、氯唑磷(isazofos)、灭多虫(methomyl)、甲基灭蚜磷(mecarphon)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、拟斯扎瓦巴氏杆菌(Pasteuria nishizawae)、甲拌磷(phorate)、磷虫威(phosphocarb)、特丁磷(terbufos)、虫线磷(thionazin)、tioxazafen、三唑磷(triazophos)、棉隆(dazomet)、1,2-二氯丙烷、1,3-二氯丙烯、糠醛(furfural)、碘甲烷(iodomethane)、威百亩(metam)、溴甲烷、异硫氰酸甲酯、二甲苯酚或其任何组合。
实施例122是根据实施例118所述的组合物，其中所述杀菌剂包括链霉素、青霉素、四环素、土霉素、氨苄青霉素、恶喹酸、春日霉素、金霉素、氧化铜或其任何组合。
实施例123是根据实施例122所述的组合物，其中所述杀菌剂包括土霉素。
实施例124是根据实施例118所述的组合物，其中所述生物防治剂包括苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌分离物J、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)、铁杉下色杆菌(Chromobacterium subtsugae)、代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、哥伦比亚链霉菌(Streptomyces colombiensis)、鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)K61、拜赖青霉菌(Penicillium bilaii)、产生脂肽的枯草芽孢杆菌菌株、产生脂肽的解淀粉芽孢杆菌菌株、坚强芽孢杆菌菌株或短小芽孢杆菌菌株。
实施例125是根据实施例110到124中任一项所述的组合物，其中所述肥料包括硫酸铵、硝酸铵、硫硝酸铵、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、轻烧镁、钙质石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云质石灰石、熟石灰、碳酸钙、磷酸氢二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸镁钾、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石、氧化镁、尿素、尿素甲醛、尿素硝酸铵、含硫尿素、高聚物包膜尿素、异丁烯二脲、K2SO4–Mg2SO4、钾盐镁矾(kainite)、钾盐、硫酸镁石(kieserite)、泻盐、元素硫、泥灰、牡蛎碎贝壳、鱼粉、油饼、鱼粪、血粉、磷矿石、过磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪肥、蝙蝠粪肥、泥炭藓、堆肥、绿石沙、棉籽粕、羽毛粉、蟹粉、鱼乳化剂、腐殖酸或其任何组合。
实施例126是根据实施例110到125中任一项所述的组合物，其中所述肥料包括硼酸、硼酸盐、硼熔块、硫酸铜、铜熔块、螯合铜、十水四硼酸钠、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁粉、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰粉、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、锌碳酸盐、锌熔块、磷酸锌、螯合锌或其任何组合。
实施例127是根据实施例110到126中任一项所述的组合物，其中所述生物刺激素包括海藻提取物、引发剂、多糖、单糖、蛋白质提取物、大豆提取物、腐殖酸、植物激素、植物生长调节剂或其任何组合。
实施例128是根据实施例110到126中任一项所述的组合物，其中所述氨基酸包括半胱氨酸。
实施例129是根据实施例57到128中任一项所述的组合物，其进一步包括杀真菌剂。
实施例130是根据实施例129所述的组合物，其中所述杀真菌剂包括嗜球果伞素类杀真菌剂或三唑类杀真菌剂。
实施例131是根据实施例130所述的组合物，其中所述嗜球果伞素类杀真菌剂包括嗜球果伞素A、嗜球果伞素B、嗜球果伞素C、嗜球果伞素D、嗜球果伞素E、嗜球果伞素F、嗜球果伞素G、嗜球果伞素H、腈嘧菌酯、肟菌酯、甲氧胺菌灵、氟嘧菌酯、啶氧菌酯或其任何组合。
实施例132是根据实施例131所述的组合物，其中所述嗜球果伞素类杀真菌剂包括腈嘧菌酯、肟菌酯、甲氧胺菌灵、氟嘧菌酯、啶氧菌酯、唑菌胺酯或其任何组合。
实施例133是根据实施例131所述的组合物，其中所述嗜球果伞素类杀真菌剂包括肟菌酯。
实施例134是根据实施例131所述的组合物，其中所述嗜球果伞素类杀真菌剂包括氟嘧菌酯。
实施例135是根据实施例130到134中任一项所述的组合物，其中所述三唑类杀真菌剂包括丙硫菌唑(prothioconazole)、咪唑(imidazole)、imidazil、咪鲜胺(prochloraz)、丙环唑(propiconazole)、氟菌唑(triflumizole)、烯唑醇(diniconazole)、氟硅唑(flusilazole)、戊菌唑(penconazole)、己唑醇(hexaconazole)、环唑醇(cyproconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、戊唑醇(tebuconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、四氟醚唑(tetraconazole)、腈苯唑(fenbuconazole)、氟环唑(epoxiconazole)、叶菌唑(metconazole)、氟喹唑(fluquinconazole)、灭菌唑(triticonazole)或其任何组合。
实施例136是根据实施例130到135中任一项所述的组合物，其中所述三唑类杀真菌剂包括丙硫菌唑。
实施例137是根据实施例45到52或57到136中任一项所述的组合物，其中所述保湿剂包括：甘油、丙三醇、甘油衍生物、三乙酸甘油酯、三乙酸盐、丙二醇、己二醇、丁二醇、三乙二醇、三聚丙烯乙二醇、甘油基三乙酸盐、蔗糖、塔格糖、糖醇、糖多元醇、山梨醇、木糖醇、甘露醇、甘露醇、聚合多元醇、聚葡萄糖、胶原蛋白、芦荟、芦荟凝胶、α羟基酸、蜂蜜、糖蜜、皂树皮、六偏磷酸钠、氯化锂、尿素、丁二醇或银耳提取物。
实施例138是根据实施例45到52或57到137中任一项所述的组合物，其中所述载剂包括水、泥炭、小麦、麸皮、蛭石(vermiculite)、粘土、经巴氏灭菌的土壤、碳酸钙、碳酸氢钙、白云石、石膏、膨润土、粘土、磷酸岩、磷化合物、二氧化钛、腐殖质、滑石粉、藻酸盐、活性炭或其组合。
实施例139是根据实施例45到52或57到138中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括按所述组合物的总重量计，约0.00001wt.％到约95％的一个或多个多肽、约0.01％到约80wt.％的农用化学品和约5wt％到约50wt％的载剂。
实施例140是根据实施例45到52或57到139中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括按所述组合物的总重量计，约0.01％到约5％的一个或多个多肽、约0.2％到约70wt.％的农用化学品和约10wt％到约30wt％的载剂。
实施例141是根据实施例45到52或57到139中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括按所述组合物的总重量计，约0.05％到约1％的一个或多个多肽、约30％到约60wt.％的农用化学品和约40wt％到约69wt％的载剂。
实施例142是根据实施例45到52或57到141中任一项所述的组合物，其中所述农用化学品包括盐酸、乙酸和/或三氟乙酸。
实施例143是根据实施例142所述的组合物，其中所述农用化学品包括盐酸、乙酸和/或三氟乙酸，并且按所述组合物的总重量计，占约0.001wt.％到约30％wt.％。
实施例144是根据实施例143所述的组合物，其中所述农用化学品包括盐酸、乙酸和/或三氟乙酸，并且按所述组合物的总重量计，占约0.01wt.％到约20％wt.％。
实施例145是根据实施例144所述的组合物，其中所述农用化学品包括盐酸、乙酸和/或三氟乙酸，并且按所述组合物的总重量计，占约0.1wt.％到约5wt.％。
实施例146是一种用根据实施例1到44中任一项所述的多肽或其任何组合、或根据实施例45到52和57到145中任一项所述的组合物或根据实施例53到108中任一项所述的重组微生物进行包被的种子。
实施例147是一种用于提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的方法，所述方法包括：
(a)将根据实施例1到45中任一项所述的多肽或根据实施例45到52和57到145中任一项所述组合物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构；或
(b)将根据实施例1到45中任一项所述的多肽或根据实施例45到52和57到145中任一项所述组合物施用于植物生长培养基，从而提高将在所述植物生长培养基中生长的植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高先天性免疫反应和/或改变将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位的植物结构；或
(c)将根据实施例53到56、102和105中任一项所述的重组微生物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构，其中所述重组微生物表达所述多肽，并且与相同条件下相同种类的野生型微生物中的多肽的表达水平相比，所述多肽的表达提高。
实施例148是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合；所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例149是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个或其任何组合；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例150是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例151是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600、603、604或其任何组合；Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:602；逆反型RHPP多肽，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:601、605、606或其任何组合；或其任何组合，从而减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例152是根据实施例147到151中任一项所述的方法，其中所述非生物胁迫包括高温胁迫、温度胁迫、辐射胁迫、干旱胁迫、寒冷胁迫、盐胁迫、营养缺乏胁迫、高金属胁迫、水分胁迫、渗透胁迫或其任何组合。
实施例153是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个；所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个；或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例154是根据实施例147或153所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:451-525中的任何一个；或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例155是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752或571中的任何一个，以及EF-Tu多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫发应。
实施例156是根据实施例147所述的方法，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-766中的任何一个或其任何组合，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫或线虫的侵害。
实施例157是根据实施例156所述的方法，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574、751和752中的任何一个或其任何组合。
实施例158是根据实施例147和150到157中任一项所述的方法，其中所述疾病包括亚洲柑橘绿化、黄龙病(HLB)、亚洲大豆锈病、核盘菌茎腐病(或白霉病)、假单胞菌叶斑或尾孢属叶枯萎病。
实施例159是根据实施例158所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合。
实施例160是根据实施例158所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合。
实施例161是根据实施例158所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括Flg22多肽和FlgII-28多肽，所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合而所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合。
实施例162是根据实施例161所述的方法，其中所述多肽或所述组合物进一步包括逆反型Flg22多肽、逆反型FlgII-28多肽或其组合，所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合而所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合。
实施例163是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括RHPP多肽和/或RI RHPP多肽，从而增加所述植物或植物部位的产量、生长和/或生产力和/或改变植物结构。
实施例164是根据实施例163所述的方法，其中所述RHPP多肽包括SEQ ID NO:600。
实施例165是根据实施例163或164所述的方法，其中所述生长包括根生长、根长度、根系生物量、结瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合。
实施例166是根据实施例163到165中任一项所述的方法，其中所述植物包括大豆，所述生长包括总体根长度、根系生物量、结瘤、每株植物的根瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合，并且生产力包括总荚果的数量或每个节点的荚果的数量。
实施例167是根据实施例163到166中任一项所述的方法，其中所述植物结构包括对所述植物或植物部位产生的有益结果。
实施例168是根据实施例167所述的方法，其中所述有益结果包括植物田地的种植密度能力提高。
实施例169是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括超敏蛋白样多肽或RHPP多肽，从而保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或增加所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应。
实施例170是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括PSK多肽，从而在易于受热和干旱的环境中提高所述植物或所述植物部位的产量。
实施例171是根据实施例170所述的方法，其中仅在花形成之前或在开花前阶段施用所述多肽、所述组合物或所述重组微生物。
实施例172是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括PSK多肽、RHPP、超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其组合，从而增加所述植物或所述植物部位的生长。
实施例173是根据实施例172所述的方法，其中所述生长包括根和花的顶端分生组织、花器官的产生、果实的发育、果实的产生、花器官的数量、花器官的大小或其组合。
实施例174是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括PSK多肽和超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，从而在易于对植物生长产生胁迫和无胁迫条件的环境中提高所述植物或所述植物部位的生长和生产力。
实施例175是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括硫蛋白或硫蛋白样多肽。
实施例176是根据实施例175所述的方法，其中所述硫蛋白或硫蛋白样多肽与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至所述植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞。
实施例177是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽包括Flg22多肽。
实施例178是根据实施例177所述的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO:526和527。
实施例179是根据实施例177所述的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO:226和227。
实施例180是根据实施例175或176所述的方法，所述疾病包括亚洲柑橘病(HLB)、柑橘溃疡病、尾孢属叶枯萎病或细菌引起的疾病。
实施例181是根据实施例180所述的方法，其中所述细菌引起的疾病包括细菌性叶枯萎病、细菌性茎腐烂、细菌性叶斑病、细菌性叶焦枯病、细菌性顶部腐烂、细菌性条纹病、巧克力斑病、戈斯氏细菌性萎蔫病和枯萎病、荷花斑病、紫色叶鞘、种子腐烂、幼苗枯萎病、斯图尔特病(细菌性萎蔫病)、玉米矮化病、热萎病、皮尔斯病、柑橘杂色萎黄病、柑橘溃疡病、丁香假单胞菌血清变型或其组合。
实施例182是根据实施例147所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-525和571-573中的任何一个或其任何组合。
实施例183是根据实施例147所述的方法，其中所述疾病包括亚洲大豆锈病、尾孢属或核盘菌茎腐病(或白霉病)，并且所述多肽或组合物包括：
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个；或
RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个，以及RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600。
实施例184是根据实施例183所述的方法，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226。
实施例185是根据实施例183或184所述的方法，其中所述组合物进一步包括杀真菌剂。
实施例186是根据实施例147所述的方法，其中所述疾病包括细菌性疾病，并且所述方法包括限制细菌的生长和/或预防疾病，并且其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、752和571中的任何一个或其任何组合。
实施例187是根据实施例186所述的方法，其中所述细菌包括丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
实施例188是根据实施例187所述的方法，其中所述植物包括猕猴桃植物。
实施例189是根据实施例147所述的方法，其中所述疾病包括亚洲柑橘绿化，并且所述组合物包括杀菌剂和所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571和752中的任何一个或其任何组合。
实施例190是根据实施例189所述的方法，其中所述杀菌剂包括土霉素。
实施例191是根据实施例147所述的方法，其中所述疾病包括核盘菌茎腐病(或白霉病)，并且所述组合物包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、571、751和752中的任何一个。
实施例192是根据实施例147到191中任一项所述的方法，其中保护所述植物或所述植物部位免受疾病的侵害包括在所述植物或植物部位之上或在所述植物或植物部位之中发生的预防性治疗、治疗、预防和疾病进展减慢。
实施例193是根据实施例147到192中任一项所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物外源性地施用于所述植物、所述植物部位或所述植物生长培养基。
实施例194是根据实施例147到193中任一项所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物内源性地施用于所述植物或植物部位。
实施例195是根据实施例147到194中任一项所述的方法，其中所述植物部位包括细胞、叶、枝、茎、花、叶子、花器官、果实、花粉、蔬菜、块茎、球茎、鳞茎、假鳞茎、荚果、根、根块、根茎、接穗或种子。
实施例196是根据实施例147到195中任一项所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于所述植物的表面、所述植物的叶子或所述植物的种子的表面。
实施例197是根据实施例196所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于种子的表面，并从所述种子生长出所述植物或所述植物部位。
实施例198是根据实施例147到197中任一项所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物以叶面施用的形式施用。
实施例199是根据实施例147到198中任一项所述的方法，其中所述植物是水果植物或蔬菜植物，并且所述方法提高了水果或蔬菜的产量。
实施例200是一种产生多肽的方法，所述方法包括通过发酵产生包括根据实施例1到44中任一项所述的多肽和肠激酶(EK)切割位点的融合蛋白，所述肠激酶切割位点增强所述多肽的活性和稳定性。
实施例201是根据实施例200所述的方法，其进一步包括将肠激酶施用于制备好的融合蛋白上，从而切割所述肠激酶切割位点并分离所述多肽。
实施例202是根据实施例200或201所述的方法，其中所述肠激酶切割位点包括SEQID NO:772。
实施例203是根据实施例200到202中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签。
实施例204是根据实施例203所述的方法，其中所述蛋白质标签包括谷胱甘肽S转移酶(GST)。
实施例205是根据实施例200到204中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白进一步包括分泌信号。
实施例206是根据实施例205所述的方法，其中所述分泌信号包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:563-570或769中的任何一个或其任何组合。
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Claims (50)

1.一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的多肽，其中所述多肽包括：
(a)鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、1-225、227-375、526、528、530、532、534、536、538、540、541、751、752和754-766中的任何一个；或
(b)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571-579和753中的任何一个；或
(c)突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:580-586中的任何一个；或
(d)逆反型(retro inverso)Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450、527、531、533、535、537和539中的任何一个；或
(e)逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:451-525或768中的任何一个；或
(f)逆反型Flg15多肽，并且所述逆反型Flg15多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:529或767；或
(g)超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587、589、591、593、594和595中的任何一个；或
(h)逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:588、590、592、596和597中的任何一个；或
(i)根毛促进性多肽(RHPP)，并且所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID No:600、603和604中的任何一个；或
(j)Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNo:602；或
(k)逆反型根毛促进性多肽(RI RHPP)，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQ IDNO:601、605和606中的任何一个；或
(l)延伸因子Tu(EF-Tu)多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:607-623中的任何一个；或
(m)逆反型延伸因子Tu(RI EF-Tu)多肽，并且所述RI EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:624-640中的任何一个；或
(n)包括SEQ ID NO:750的融合多肽；或
(o)植物磺肽素(PSK)多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；或
(p)逆反型植物磺肽素(RI PSK)多肽，并且所述RI PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:599；或
(q)硫蛋白或硫蛋白样多肽，并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:650-749中的任何一个，并且
任选地，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在所述氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；或是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列或进一步包括核心序列。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽和(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽：含有化学修饰；是在所述氨基酸内具有氨基酸插入、缺失、倒置、重复、复制、延伸或取代的变体；或是融合蛋白的一部分；或含有蛋白酶识别序列；或进一步包括核心序列。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中
所述化学修饰包括乙酰化、酸加成、酰化、ADP-核糖基化、醛加成、烷基酰胺加成、酰胺化、胺化、生物素化、氨基甲酸酯加成、氯甲基酮加成、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、酯加成、共价交联的形成、半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、酰肼加成、异羟肟酸加成、羟基化、碘化、脂质加成、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、棕榈酰化、纯化标签的加成、焦谷氨酰加成、外消旋化、硒酰化、磺酰胺加成、硫酸化、RNA转移介导的氨基酸向蛋白质的加成、泛素化、尿素加成或N端修饰或C端修饰；或
所述变体的所述氨基酸内的氨基酸取代包括β-氨基酸、D-氨基酸或非天然氨基酸的取代。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述化学修饰包括乙酰化、酰胺化、交联或环化。
5.根据权利要求2所述的多肽，其中：
所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个；或
所述突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽来自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或解硫胺素芽孢杆菌属细菌。
6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括：
(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RI RHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；(p)的RI PSK多肽；或
核心序列。
7.根据权利要求6所述的多肽，其中
(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包括SEQ ID NO:571-573中的任何一个；和/或
所述核心序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个；和/或
所述融合多肽包括辅助多肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述辅助多肽包括：
特征信息(signature)多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542-548中的任何一个或其任何组合；或
信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合；或
特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:
542；或
信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的多肽，其中所述多肽进一步包括核心序列，所述核心序列包括SEQ ID NO:754-766中的任何一个，并且其中包含所述核心序列提高了所述多肽的生物活性引发性活性。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO:1-768中的任何一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且所述多肽具有生物活性引发性活性。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的多肽，其中所述多肽从发酵产物中，或从重组微生物中，分离、浓缩、和/或，任选地通过过滤、色谱法，部分纯化。
12.一种用于引发植物或植物部位的生物活性从而提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的组合物，所述组合物包括：
根据权利要求1到11中任一项所述的多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂；或
根据权利要求1到12中任一项所述的多肽的任何组合。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包括：
(A)(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合，以及农用化学品或载剂，所述农用化学品或载剂本质上与所述多肽不相关；或
(B)(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；
或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RI RHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(p)的RI PSK多肽或其任何组合；以及(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合；或(C)以下中的两个或更多个：(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(d)的逆反型Flg22多肽；或(e)的逆反型FlgII-28多肽；或(f)的逆反型Flg15多肽；或(h)的逆反型超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；或(k)的RI RHPP；或(l)的EF-Tu多肽；或(m)的RI EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(p)的RI PSK多肽；或
(D)以下中的两个或更多个：(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽，其中：
(i)(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽中的至少一个含有所述化学修饰；是所述变体；是所述融合蛋白的一部分；或含有所述蛋白酶识别序列；或
(ii)(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽中的至少两个本质上不相关；或
(E)其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽由微生物重组产生。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包括：
(i)(A)的组合物或(B)的组合物，并且其中(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽、(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽、(j)的KTI多肽、(o)的PSK多肽、(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽或其任何组合不含所述化学修饰；不是所述变体；不是所述融合蛋白的一部分；并且不含所述蛋白酶识别序列；或
(ii)(E)的组合物，其中所述微生物包括来自芽孢杆菌属的细菌、来自假单胞菌属的细菌、来自类芽孢杆菌属的细菌、青霉菌属真菌、球囊霉属细菌、节杆菌属细菌、副球菌属细菌、根瘤菌属细菌、慢生根瘤菌属细菌、固氮螺菌属细菌、肠杆菌属细菌、埃希氏杆菌属细菌或其任何组合。
15.一种表达或过度表达多肽的重组微生物，其中所述多肽包括根据权利要求1到15中任一项所述的多肽或其任何组合。
16.根据权利要求15所述的重组微生物，其中
所述多肽包括：(a)的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(b)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(c)的突变型鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或(g)的超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或(i)的RHPP；
或(j)的KTI多肽；或(l)的EF-Tu多肽；或(n)的融合多肽；或(o)的PSK多肽；或(q)的硫蛋白或硫蛋白样多肽；和/或
所述多肽被所述微生物过度表达。
17.根据权利要求16所述的重组微生物，其中所述多肽被所述微生物过度表达并且被制成具有分泌信号。
18.根据权利要求12到17中任一项所述的组合物或重组微生物，其中
所述多肽包括：所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；所述逆反型Flg22多肽；所述逆反型FlgII-28多肽；所述硫蛋白或硫蛋白样多肽；所述硫蛋白或硫蛋白样多肽，其中所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:651；所述PSK多肽；所述PSK多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:598；所述RHPP；所述RHPP，并且所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；所述RI RHPP；所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587；所述EF-Tu多肽；或所述融合多肽；或
所述组合物或重组微生物包括所述PSK多肽、所述RHPP、所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其组合；或
所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽是具有多肽的融合蛋白；或
所述多肽进一步包括分泌信号。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述多肽包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且其中：
(i)鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽在其N端或C端被化学修饰；或
(ii)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽通过交联或环化进行修饰；或
(iii)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽来自芽孢杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、解硫胺素芽孢杆菌属细菌或其任何组合；或
(iv)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1-75中的任何一个或其任何组合；或
(v)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包括截短的N端多肽，并且所述截短的N端多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、109、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、752或其任何组合；或
(vi)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽包括截短的C端多肽，并且所述截短的C端多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225或其任何组合；或
(vii)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-768中的任何一个或其任何组合；或
(viii)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300中的任何一个或其任何组合；或
(ix)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375和751中的任何一个或其任何组合。
20.根据权利要求19所述的组合物或重组微生物，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括：
SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574和752中的任何一个或其任何组合；或
SEQ ID NO:754-766中的任何一个；或
SEQ ID NO:754-766中的任何一个，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽被掺入非鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽或全长蛋白中，其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的掺入导致所述非鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽或全长蛋白的生物活性引发性活性提高；或
SEQ ID NO:301。
21.根据权利要求18所述的组合物或重组微生物，其中：
(i)所述硫蛋白或硫蛋白样多肽与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至所述植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞；或
(ii)所述硫蛋白或硫蛋白样多肽，其中所述硫蛋白或硫蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:651并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至所述植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞；或
(iii)所述RHPP的氨基酸序列包含SEQ ID NO:600，并且所述组合物或重组微生物进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽；或
(iv)所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600，并且所述组合物或重组微生物进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个；
(v)所述RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600，并且所述组合物或重组微生物进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226；或
(vi)所述EF-Tu多肽的氨基酸序列括SEQ ID NO:616；或
(vii)所述多肽进一步包括所述分泌信号，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:616；或
(viii)所述多肽进一步包括所述分泌信号，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:616和617。
22.根据权利要求18或21所述的组合物或重组微生物，其中所述组合物或重组微生物包括所述EF-Tu多肽或所述EF-Tu多肽和所述分泌信号，并且进一步包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1-525、526、530、532、534、536、538、540、541、571-586和751-766中的任何一个或其任何组合。
23.根据权利要求22所述的组合物或重组微生物，其中
所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571或752中的任何一个或其组合；或
所述组合物或重组微生物进一步包括所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽；或
所述组合物或重组微生物进一步包括所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽包括SEQ ID NO:587。
24.根据权利要求12到17中任一项所述的组合物或重组微生物，其包括
(a)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:571、295、300、293和580；或295、300、293和580；或571、295、293和580；或571、300、293和580；或571、293和580；或571、295、293；或
(b)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及纤维二糖、纤维素、甲壳素或壳聚糖中的一个或多个；或
(c)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:591；或
(d)所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽，并且所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:587，以及所述PSK多肽，并且所述PSK多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:598；或
(e)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571或752或其任何组合，以及所述EF-Tu多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617；或
(f)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、571或752或其任何组合；或
(g)所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
(h)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、226、571或752或其任何组合，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
(i)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226，以及所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600。
25.根据权利要求12到24中任一项所述的组合物或重组微生物，其进一步包括辅助多肽。
26.根据权利要求25所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽包括：
特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542-548中的任何一个或其任何组合；或
特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542；或
信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合；或
信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549-562中的任何一个或其任何组合；或
分泌多肽，并且所述分泌多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:563-570或769中的任何一个或其任何组合；或特征信息多肽，并且所述特征信息多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:542；或
信号锚分选多肽，并且所述信号锚分选多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:549；或
分泌多肽，并且所述分泌多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:563或769。
27.根据权利要求26所述的组合物或重组微生物，其中所述辅助多肽进一步包括：
肠激酶切割序列，并且所述肠激酶切割序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:772；或
肠激酶切割序列，并且所述肠激酶切割序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:772，以及连接所述多肽和蛋白质标签的连接区；或肠激酶切割序列，并且所述肠激酶切割序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:772，以及连接所述多肽和蛋白质标签的连接区，其中所述蛋白质标签任选地包括聚组氨酸(His)标签、FLAG标签、抗体表位、链霉亲和素/生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)或其任何组合。
28.根据权利要求12到14和18到27中任一项所述的组合物，其进一步包括与所述多肽本质上相关的农用化学品或载剂。
29.根据权利要求12到14和18到28中任一项所述的组合物，其中所述农用化学品包括抗生素、生物农药、防腐剂、缓冲剂、湿润剂、表面活性剂、包衣剂、单糖、多糖、研磨剂、农药、杀虫剂、除草剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀螨剂、肥料、生物刺激素、渗透保护剂、着色剂、保湿剂、氨基酸、生物防治剂、盐酸、乙酸和/或三氟乙酸或其组合。
30.根据权利要求12到14和18到29中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：
按所述组合物的总重量计，约0.00001wt.％到约95wt.％的一个或多个多肽、约0.01％到约80wt.％的农用化学品和约5wt.％到约50wt.％的载剂；或
按所述组合物的总重量计，约0.01wt.％到约5wt.％的多肽、约0.2％到约70wt.％的农用化学品和约10wt.％到约30wt.％的载剂；或
按所述组合物的总重量计，约0.05wt.％到约1wt.％的多肽、约30wt.％到约60wt.％的农用化学品和约40wt.％到约69wt％的载剂。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述农用化学品包括：
盐酸、乙酸和/或三氟乙酸；或
按所述组合物的总重量计，约0.001wt.％到约30wt.％、约0.01wt.％到约20％wt.％、或0.1wt.％到约5wt.％的盐酸、乙酸和/或三氟乙酸。
32.一种用根据权利要求1到12中任一项所述的多肽或其任何组合、根据权利要求12到14和18到31中任一项所述的组合物或根据权利要求15到27中任一项所述的重组微生物进行包被的种子。
33.一种用于提高植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变植物结构的方法，所述方法包括：
(a)将根据权利要求1到11中任一项所述的多肽或根据权利要求12到14和18到31中任一项所述组合物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构；或
(b)将根据权利要求1到11中任一项所述的多肽或根据权利要求12到14和18到31中任一项所述组合物施用于植物生长培养基，从而提高将在所述植物生长培养基中生长的植物或植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高将在所述植物生长培养基中生长的所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变其植物结构；或
(c)将根据权利要求15到27中任一项所述的重组微生物施用于植物、植物部位或植物生长培养基或所述植物或所述植物部位周围区域的根际中，从而提高所述植物或所述植物部位的生长、产量、健康、寿命、生产力和/或活力和/或减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病、昆虫和/或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应和/或改变所述植物结构，其中所述重组微生物表达所述多肽，并且与相同条件下相同种类的野生型微生物中的多肽的表达水平相比，所述多肽的表达提高。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法包括：
(A)减少所述植物或所述植物部位中的非生物胁迫和/或保护所述植物或所述植物部位免受疾病的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应，并且所述多肽或所述组合物包括：
所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合；所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；或其任何组合；或
所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个或其任何组合；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或
所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个或其任何组合；或其任何组合；
所述RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600、603、604或其任何组合；所述Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KTI)多肽，并且所述KTI多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:602；所述逆反型RHPP多肽，并且所述RI RHPP的氨基酸序列包括SEQ ID NO:601、605、606或其任何组合；
或
(B)保护所述植物或植物部位免受疾病的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应，并且所述多肽或所述组合物包括：
(i)所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个；所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个；或其任何组合；或
(ii)所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个；或其任何组合；或
(iii)所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个；所述逆反型Flg22多肽，并且所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合；所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375中的任何一个；所述逆反型FlgII-28多肽，并且所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:451-525中的任何一个；或其任何组合；或
(iv)所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752或571，以及EF-Tu多肽，并且所述EF-Tu多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:616和617；或
(C)保护所述植物或植物部位免受疾病、昆虫或线虫的侵害，并且所述多肽或所述组合物包括：
(i)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、289、290、291、293、294、295、300、437、532、534、536、538、540、571-586和751-766中的任何一个；或(ii)所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、293、295、300、540、571、574、751和752中的任何一个或其任何组合；
或
(D)保护所述植物或植物部位免受疾病、昆虫或线虫的侵害和/或提高所述植物或所述植物部位的先天性免疫反应，并且所述多肽或所述组合物包括所述超敏蛋白样多肽和所述RHPP多肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中任选地：
(a)(A)的方法，并且当所述多肽或所述组合物减少非生物胁迫时，所述非生物胁迫包括高温胁迫、温度胁迫、辐射胁迫、干旱胁迫、寒冷胁迫、盐胁迫、营养缺乏胁迫、高金属胁迫、水分胁迫、渗透胁迫或其任何组合；或
(b)(B)的方法或(C)的方法，并且所述疾病包括亚洲柑橘绿化、黄龙病(HLB)、亚洲大豆锈病、核盘菌茎腐病(或白霉病)、假单胞菌叶斑或尾孢属叶枯萎病。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述方法包括：
(A)提高所述植物或植物部位的产量、生长和/或生产力和/或改变所述植物结构，并且所述多肽或所述组合物包括所述RHPP多肽和/或所述RI RHPP多肽；或
(B)在易于受热和干旱的环境中提高所述植物或所述植物部位的产量，并且所述多肽或所述组合物包括所述PSK多肽；或
(C)提高所述植物或植物部位的生长，并且所述多肽或所述组合物包括所述PSK多肽、所述RHPP、所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽或其组合；或
(D)在易于对植物生长产生胁迫和无胁迫条件的环境中提高所述植物或植物部位的生长和生产力，并且所述多肽或所述组合物包括所述PSK多肽和所述超敏蛋白或超敏蛋白样多肽。
37.根据权利要求36所述的方法，其中：
(a)(A)的方法，并且满足以下至少一项：
(i)(A)的RHPP多肽包括SEQ ID NO:600；和/或
(ii)在(A)中，所述植物的生长包括根生长、根长度、根系生物量、结瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合；和/或
(iii)在(A)中，所述植物包括大豆，所述生长包括总体根长度、根系生物量、结瘤、每株植物的根瘤、总生物量、地上生物量或其任何组合，并且所述生产力包括总荚果的数量或每个节点的荚果的数量；和/或
(iv)在(A)中，对植物结构的改变包括对所述植物或植物部位产生的有益结果和/或
(v)在(A)中，对植物结构的改变包括对所述植物产生的有益结果，所述有益结果包括植物田地的种植密度能力提高；
或
(b)(B)的方法，并且仅在花形成之前或在开花前阶段施用(B)的多肽、组合物或重组微生物；或
(c)(C)的方法，并且在(C)中，所述植物或植物部位的生长包括根和花的顶端分生组织、花器官的产生、果实的发育、果实的产生、花器官的数量、花器官的大小或其组合；和/或。
38.根据权利要求35所述的方法，其中(B)的方法或(C)的方法，并且所述疾病包括亚洲柑橘绿化、黄龙病(HLB)、亚洲大豆锈病、核盘菌茎腐病(或白霉病)、假单胞菌叶斑或尾孢属叶枯萎病，并且所述多肽或所述组合物包括：
所述Flg22多肽，并且所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合；或
所述FlgII-28多肽，并且所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合；或
所述Flg22多肽和所述FlgII-28多肽，所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合而所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合；
所述Flg22多肽和所述FlgII-28多肽，所述Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-300和571-573中的任何一个或其任何组合而所述FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQID NO:301-375或751中的任何一个或其任何组合，并且进一步包括所述逆反型Flg22多肽、所述逆反型FlgII-28多肽或其组合，所述逆反型Flg22多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:376-450中的任何一个或其任何组合而所述逆反型FlgII-28多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNO:451-525中的任何一个或其任何组合。
39.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病包括：
(i)亚洲大豆锈病、尾孢属叶枯萎病或核盘菌茎腐病(或白霉病)，并且所述多肽或所述组合物包括：
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个；或
RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；或
鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、752和571中的任何一个，以及RHPP多肽，并且所述RHPP多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:600；
或
(ii)亚洲柑橘绿化，并且所述组合物包括杀菌剂和所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、571和752中的任何一个或其任何组合；
或
(iii)核盘菌茎腐病(或白霉病)，并且所述组合物包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、571、751和752中的任何一个；
或
(iv)细菌性疾病，并且其中所述方法包括限制细菌的生长和/或预防疾病，并且其中所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226、540、752和571中的任何一个或其任何组合。
40.根据权利要求39所述的方法，其中：
(i)的方法，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226；并且所述组合物任选地包括杀真菌剂或
(iv)的方法，并且所述细菌包括丁香假单胞菌，并且所述植物任选地包括猕猴桃植物；或
(ii)的方法，并且所述杀菌剂包括土霉素。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述多肽或所述组合物包括：
所述硫蛋白或硫蛋白样多肽；或
所述硫蛋白或硫蛋白样多肽或Flg22多肽，并且所述硫蛋白或硫蛋白样多肽与韧皮部靶向序列融合从而形成融合的多肽，所述韧皮部靶向序列的氨基酸序列包括SEQ ID NO:641-649中的任何一个或其任何组合，以便将所述融合的多肽递送至所述植物或植物部位中的维管组织或细胞和/或韧皮部或与韧皮部相关的组织或细胞。
42.根据权利要求33所述的方法，其中：
所述多肽包括Flg22多肽；或
所述多肽包括Flg22多肽，并且所述Flg22多肽包括SEQ ID NO:526和527或SEQ ID NO:226或227；或
所述多肽包括所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽，并且所述鞭毛蛋白或鞭毛蛋白相关型多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:226-525和571-573中的任何一个或其任何组合。
43.根据权利要求41所述的方法，其中：
(A)所述疾病包括亚洲柑橘病(HLB)、柑橘溃疡病、尾孢属叶枯萎病或细菌引起的疾病；或
(B)所述疾病包括细菌引起的疾病，并且所述细菌引起的疾病包括细菌性叶枯萎病、细菌性茎腐烂、细菌性叶斑病、细菌性叶焦枯病、细菌性顶部腐烂、细菌性条纹病、巧克力斑病、戈斯氏细菌性萎蔫病和枯萎病、荷花斑病、紫色叶鞘、种子腐烂、幼苗枯萎病、斯图尔特病(细菌性萎蔫病)、玉米矮化病、热萎病、皮尔斯病、柑橘杂色萎黄病、柑橘溃疡病、丁香假单胞菌血清变型或其组合。
44.根据权利要求33到43中任一项所述的方法，其中保护所述植物或所述植物部位免受疾病的侵害包括在所述植物或植物部位之上或在所述植物或植物部位之中发生的预防性治疗、治疗、预防和疾病进展减慢。
45.根据权利要求33到44中任一项所述的方法，其中将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物外源性地施用于所述植物、所述植物部位或所述植物生长培养基，或内源性地施用于所述植物或植物部位。
46.根据权利要求33到45中任一项所述的方法，其中
所述植物部位包括细胞、叶、枝、茎、花、叶子、花器官、果实、花粉、蔬菜、块茎、球茎、鳞茎、假鳞茎、荚果、根、根块、根茎、接穗或种子；和/或
将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于所述植物的表面、所述植物的叶子或所述植物的种子的表面；和/或
将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物施用于所述植物的种子的表面，并从所述种子生长出所述植物或所述植物部位；和/或
将所述多肽、所述组合物或所述重组微生物以叶面施用形式施用；和/或
所述植物是水果植物或蔬菜植物，并且所述方法提高了水果或蔬菜的产量。
47.一种产生多肽的方法，所述方法包括通过发酵产生包括根据权利要求1到11中任一项所述的多肽和肠激酶(EK)切割位点的融合蛋白，所述肠激酶切割位点增强所述多肽的活性和稳定性。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法进一步包括将肠激酶施用于制备好的融合蛋白上，从而切割所述肠激酶切割位点并分离所述多肽。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述肠激酶切割位点包括SEQ ID NO:772。
50.根据权利要求47到49中任一项所述的方法，其中：
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签；或
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签，并且所述蛋白质标签包括谷胱甘肽S转移酶(GST)；或
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签和分泌信号；或
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签和分泌信号，并且所述蛋白质标签包括谷胱甘肽S转移酶(GST)；或
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签和分泌信号，并且所述分泌信号包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:563-570或769中的任何一个或其任何组合；或
所述融合蛋白进一步包括蛋白质标签和分泌信号，并且所述蛋白质标签包括谷胱甘肽S转移酶(GST)，并且所述分泌信号包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQ ID NO:563-570或769中的任何一个或其任何组合。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112362627A (zh) * 2020-11-12 2021-02-12 贵州师范学院 一种检测水中多果定的荧光探针及其制备方法和应用
CN112400882A (zh) * 2020-12-08 2021-02-26 山东省农业科学院生物技术研究中心 鞭毛蛋白和/或壳六糖在用于制备抑制植物光合作用的抑制剂中的应用
CN113139461A (zh) * 2021-04-23 2021-07-20 塔里木大学 一种农业种植用小麦叶片病虫害检测系统及其管理方法
CN113785830A (zh) * 2021-09-17 2021-12-14 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种番荔枝坐果剂
CN114651622A (zh) * 2022-02-21 2022-06-24 浙江大学 植物磺肽素在提高农作物果实风味和营养品质中的应用
CN114671933A (zh) * 2022-05-26 2022-06-28 西北农林科技大学深圳研究院 一种nac转录因子及其在猕猴桃抗病性调控中的应用
CN116267600A (zh) * 2022-12-02 2023-06-23 福建省中科生物股份有限公司 一种天门冬属植物的组培苗更新扶壮的培养基及其应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY37816A (es) * 2017-07-20 2019-02-28 Spogen Biotech Inc Polipéptidos bioactivos para mejorar la protección, crecimiento y productividad en plantas
US10968146B2 (en) * 2017-10-03 2021-04-06 Dlt Growers, Inc. Lawn substitute and methods therefor
BR112021014467A2 (pt) * 2019-01-23 2021-09-21 Spogen Biotech Inc. Composições para iniciação bioativa de uma planta, peptídeo isolado, método para aumentar crescimento, rendimento, saúde, longevidade, produtividade e/ou vigor de uma planta, método para aumentar teor de suco e semente
CN112940135A (zh) * 2019-12-11 2021-06-11 四川农业大学 融合蛋白、其氨基酸序列、编码核苷酸序列、制备方法和应用
CN111979285B (zh) * 2020-08-27 2021-12-17 浙江长生鸟健康科技股份有限公司 一种珍珠肽螯合钙的制备方法
KR102510287B1 (ko) * 2021-12-27 2023-03-15 국립낙동강생물자원관 식물의 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 리시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) TT41 균주 및 이를 포함하는 식물의 건조 스트레스 내성 증진용 미생물 제제
CN114267002B (zh) * 2022-03-02 2022-05-24 深圳市华付信息技术有限公司 卷烟厂制丝车间工况监测方法、装置、设备及存储介质
WO2023240208A1 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 Invaio Sciences, Inc. Controlling citrus greening in citrus plants using oxytetracycline
CN115029277B (zh) * 2022-06-24 2023-08-22 四川省烟草公司凉山州公司 一株耐酸抗青枯病的假蕈状芽孢杆菌

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150064219A1 (en) * 2010-02-05 2015-03-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods and compositions for cancer immunotherapy using flagellin-tumor associated antigen fusion protein expressing tumor cells
US20160073640A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-17 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and another biological control agent
US20160108096A1 (en) * 2014-09-17 2016-04-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
WO2016069623A1 (en) * 2014-10-27 2016-05-06 Academia Sinica Plant defense signaling peptides and applications thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5631007A (en) 1990-03-12 1997-05-20 Ciba-Geigy Corporation Anti-pathogenically effective compositions comprising lytic peptides and hydrolytic enzymes
GB9013017D0 (en) * 1990-06-11 1990-08-01 Mars Uk Ltd Compounds
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
AU2002254203A1 (en) 2001-03-12 2002-09-24 The General Hospital Corporation Master activators of pathogen responsive genes
US6927322B2 (en) * 2001-03-30 2005-08-09 Cornell Research Foundation, Inc. Cabbage proteinase inhibitor gene confers resistance against plant pests
WO2002085933A1 (en) 2001-04-20 2002-10-31 The Institute For Systems Biology Toll-like receptor 5 ligands and methods of use
US8703146B2 (en) 2001-04-20 2014-04-22 Institute For Systems Biology Toll-like receptor 5 ligands and methods of use
ES2395022T3 (es) 2003-09-19 2013-02-07 Epitopix, Llc Polipéptidos de Campylobacter y sus métodos de uso
US8580321B2 (en) 2003-12-02 2013-11-12 The Cleveland Clinic Foundation Method for reducing the effects of chemotherapy using flagellin related polypeptides
KR20050073865A (ko) 2004-01-12 2005-07-18 대한민국(전남대학교총장) 비브리오 패혈증균 편모 구성인자 플라젤린을유효성분으로 함유하는 백신 보조제
EP1740604A2 (en) 2004-04-27 2007-01-10 Intercell AG Td antigens
DE102004024184A1 (de) 2004-05-13 2006-01-26 Basf Plant Science Gmbh Neue Nukleinsäuresequenzen und deren Verwendung in Verfahren zum Erreichen einer Pathogenresistenz in Pflanzen
EP1838340B1 (en) 2004-12-22 2018-04-04 Cleveland Clinic Foundation Flagellin related polypeptides and uses thereof
US20070065902A1 (en) 2005-09-19 2007-03-22 Dicosimo Deana J Process for chromosomal expression of foreign genes in the fliC region of a methylotrophic microbial host cell
EP1991264B1 (en) 2006-03-07 2015-01-07 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
EP2045329A1 (en) 2006-07-21 2009-04-08 Yokohama City University Flagellin mutant vaccine
US8263078B2 (en) 2007-09-05 2012-09-11 Inotek Pharmaceuticals Corporation Antibodies against flagellin and uses thereof
WO2009073133A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Vaxinnate Corporation Compositions of toll-like receptor agonists and papillomavirus antigens and uses thereof
WO2009082440A2 (en) 2007-12-18 2009-07-02 Vaxinnate Corporation Compositions of toll-like receptor agonists and malaria antigens and methods of use
EP2235045B1 (en) 2008-01-08 2012-10-03 Csir Production of heterologous proteins or peptides
EP3115060A1 (en) 2008-04-18 2017-01-11 VaxInnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
JP2011519834A (ja) 2008-04-25 2011-07-14 インスティチュート フォー システムズ バイオロジー フラジェリンポリペプチドワクチン
WO2010014957A1 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Cleveland Biolabs, Inc. Methods for treating reperfusion injuries
CN102245775A (zh) 2008-11-03 2011-11-16 双刃基金会 增强植物对细菌病原体的抗性的方法
US20100239583A1 (en) 2009-03-04 2010-09-23 Inotek Pharmaceuticals Corporation Antibodies against flagellin and uses thereof
US9096659B2 (en) 2009-03-18 2015-08-04 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and use thereof to induce immune responses against Pseudomonas aeruginosa
CN103800906B (zh) 2009-03-25 2017-09-22 德克萨斯大学系统董事会 用于刺激哺乳动物对病原体的先天免疫抵抗力的组合物
US20120151636A1 (en) 2009-04-08 2012-06-14 The Regents Of The University Of California Peptides for Stimulating Plant Disease Resistance
IT1394774B1 (it) 2009-06-04 2012-07-13 Univ Roma Costrutti esprimenti recettori chimerici, e loro uso per l'attivazione controllata delle risposte di difesa a organismi patogeni in piante
KR20120104177A (ko) 2009-10-06 2012-09-20 파나셀라 랩스, 아이엔씨. 암을 치료하기 위한 톨 유사 수용체 및 효능제의 용도
EP2532363B1 (en) 2010-02-02 2015-12-02 Instituto Nacional De Investigación Y Tecnología Agraria Y Alimentaria Use of flagellins from the genus marinobacter as vaccination adjuvants
AU2011255621A1 (en) 2010-05-18 2012-12-20 The Uab Research Foundation Latent Human Immunodeficiency Virus reactivation
WO2012040164A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Emory University Tlr5 ligands, therapeutic methods, and compositions related thereto
EP2663367A4 (en) 2011-01-10 2014-08-06 Cleveland Biolabs Inc USE OF A TOLL-TYPE RECEPTOR AGONIST FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN103945863A (zh) 2011-08-01 2014-07-23 爱默蕾大学 包含配体的vlp及其相关方法
WO2013074794A1 (en) 2011-11-15 2013-05-23 The Uab Research Foundation Latent human immunodeficiency virus reactivation
WO2013144579A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Heriot-Watt University Use of flagellin as a vaccine
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
US9101144B2 (en) 2013-01-23 2015-08-11 Ut-Battelle, Llc. Plant growth promoting rhizobacterium
EP2970399B1 (en) 2013-03-13 2021-11-10 Emory University Protein particles comprising disulfide crosslinkers and uses related thereto
US9573980B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
WO2014168948A2 (en) 2013-04-09 2014-10-16 Vaxinnate Corporation Clostridium difficile compositions and methods of use
US20150216926A1 (en) 2013-06-26 2015-08-06 The Uab Research Foundation Methods of reactivating a latent human immunodeficiency virus
WO2015012243A1 (ja) 2013-07-22 2015-01-29 住友化学株式会社 植物病害防除組成物およびその用途
US20150191742A1 (en) 2014-01-07 2015-07-09 National Taiwan University Method for enhancing resistance to pathogens in plants based on over-expression of impaired oomycete susceptibility 1
US10557145B2 (en) 2014-07-08 2020-02-11 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Flagellin-sensing 3 (‘FLS3’) protein and methods of use
KR20170031251A (ko) * 2014-07-30 2017-03-20 클리브랜드 바이오랩스, 아이엔씨. 플라젤린 조성물 및 용도
WO2016039961A1 (en) * 2014-09-11 2016-03-17 Marrone Bio Innovations, Inc Chromobacterium subtsugae genome
US10448647B2 (en) * 2014-09-17 2019-10-22 Basf Corporation Compositions comprising recombinant bacillus cells and an insecticide
CA3017521A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Spogen Biotech Inc. Methods for promoting plant health using free enzymes and microorganisms that overexpress enzymes
WO2017176588A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Plant Health Care, Inc. Beneficial microbes for delivery of effector peptides or proteins and use thereof
UY37816A (es) 2017-07-20 2019-02-28 Spogen Biotech Inc Polipéptidos bioactivos para mejorar la protección, crecimiento y productividad en plantas

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150064219A1 (en) * 2010-02-05 2015-03-05 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods and compositions for cancer immunotherapy using flagellin-tumor associated antigen fusion protein expressing tumor cells
US20160073640A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-17 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising recombinant bacillus cells and another biological control agent
US20160108096A1 (en) * 2014-09-17 2016-04-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
WO2016069623A1 (en) * 2014-10-27 2016-05-06 Academia Sinica Plant defense signaling peptides and applications thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA VICTORIA GARCIA 等: "Salmonella enterica Flagellin Is Recognized via FLS2 and Activates PAMP-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana", MOLECULAR PLANT, vol. 7, no. 4, pages 3 *
杨红 等: "《生物化学》", 31 January 2016, 北京：中国医药科技出版社, pages: 11 - 12 *
胡思前 等: "《有机化学》", 31 December 2015, 武汉：华中师范大学出版社, pages: 443 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112362627A (zh) * 2020-11-12 2021-02-12 贵州师范学院 一种检测水中多果定的荧光探针及其制备方法和应用
CN112362627B (zh) * 2020-11-12 2023-06-06 贵州师范学院 一种检测水中多果定的荧光探针及其制备方法和应用
CN112400882A (zh) * 2020-12-08 2021-02-26 山东省农业科学院生物技术研究中心 鞭毛蛋白和/或壳六糖在用于制备抑制植物光合作用的抑制剂中的应用
CN113854300A (zh) * 2020-12-08 2021-12-31 山东省农业科学院生物技术研究中心 鞭毛蛋白和/或壳六糖在用于制备调节植物光合作用的调节剂中的应用
CN113139461A (zh) * 2021-04-23 2021-07-20 塔里木大学 一种农业种植用小麦叶片病虫害检测系统及其管理方法
CN113785830A (zh) * 2021-09-17 2021-12-14 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 一种番荔枝坐果剂
CN114651622A (zh) * 2022-02-21 2022-06-24 浙江大学 植物磺肽素在提高农作物果实风味和营养品质中的应用
CN114671933A (zh) * 2022-05-26 2022-06-28 西北农林科技大学深圳研究院 一种nac转录因子及其在猕猴桃抗病性调控中的应用
CN116267600A (zh) * 2022-12-02 2023-06-23 福建省中科生物股份有限公司 一种天门冬属植物的组培苗更新扶壮的培养基及其应用
CN116267600B (zh) * 2022-12-02 2024-02-27 福建省中科生物股份有限公司 一种天门冬属植物的组培苗更新扶壮的培养基及其应用

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