KR20120104177A - 암을 치료하기 위한 톨 유사 수용체 및 효능제의 용도 - Google Patents

암을 치료하기 위한 톨 유사 수용체 및 효능제의 용도 Download PDF

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파나셀라 랩스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 플라젤린과 같은 톨 유사 수용체 효능제를 제공하고, 톨 유사 수용체 5(TLR-5)와 같은 톨 유사 수용체를 제공하여 암과 감염성 질병들을 치료하는 방법들과 약제에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 암 세포와 NF-κB 아포프토시스 경로를 통해 병원체에 의해 감염된 세포들을 정밀하게 죽이는 선천성(시스 효과) 및 적응성(트랜스 효과) 면역 반응에 관련된 세포들을 모으는 시스(cis) 및 인 트랜스(in trans) 효과를 가져오게 한다.

Description

암을 치료하기 위한 톨 유사 수용체 및 효능제의 용도{Use of toll-like receptor and agonist for treating cancer}
본 발명은 암과 감염성 질병을 치료하기 위한 방법들에 관한 것이다.
톨 유사 수용체(toll-like receptor)는 박테리아와 바이러스 병원체중 가장 일반적인 패턴들을 인식하기 위한 것이다. 그것의 활성화는 선천성 및 적응성 면역 반응의 보강을 가져오게 된다. 항원체의 위치에 대한 면역 시스템의 수용체 세포들은 유효한 면역 반응의 주요한 단계이다. 그 이유는 면역화는 다른 형태의 보조약(adjuvants)을 포함하고 있기 때문이다. 대부분의 종양들은 종양-특이성 항원들을 발현하고 있지만, 그 종양들은 면역 인식을 회피하는 수 많은 메카니즘을 이용하고 있다.
최근에는, 생쥐의 실험 모델에서, 리간드와 효능제에 의한 TLR5의 활성화와 박테리아 플라젤린이 기능성 TLR5를 발현하는 종양들에 대해서 항종양 효과를 유발시키는 결과를 초래했다는 것이 입증되었다. 이것은 암 면역 치료법을 위한 TLR5 효능제를 고려해 보기 위한 일반적인 기회를 제공하고 있다. 이러한 생각을 실행하기 위해서는 두 가지 주요한 장애가 존재한다. 먼저, 기능성 TLR5를 발현시키는 종양의 매우 드문 발생률로 인해, 작은 규모의 종양들에 대해서만 이러한 방법의 적용을 제한하게 된다. 두 번째로는, TLR5 효능제의 체계적인 투여에 의해, 기능성 수용체가 반응을 비중심적이고 종양-특이성이 되지 않도록 만드는 모든 세포의 TLR5 신호 처리의 활성화가 초래된다. 그러므로, 감염된 세포 또는 종양에 대해서만 선천적인 면역 반응을 유도하도록 하기 위해, 시스템에 대해 영향을 최소한으로 하면서 감염되거나 또는 종양 세포들내의 TLR 수용체 신호처리의 오토크라인(autocrine) 활성화 메카니즘 또는 방법에 대한 기술이 필요하게 되었다.
본 발명은 제 1의 핵산과 제 2의 핵산으로 구성된 벡터에 관한 것으로서, 상기 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체를 인코드하며, 상기 제 2의 핵산은 톨 유사 수용체 효능제(agonist)를 인코드 한다. 상기 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체의 분비 형태를 위해 인코드 한다. 상기 제 2의 핵산은 플라젤린의 분비 형태가 된다. 톨 유사 수용체는 플라젤린이 될 수 있다. 벡터는 포유류 발현 벡터이다. 상기 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스(lentivirus) 또는 리포솜으로부터 발현된다. 플라젤린의 분비 형태는 CBLB502S가 된다. 톨 유사 수용체는 TLR-5이다.
본 발명은 약제가 필요한 포유류에 대해 약제를 투여하여 포유류내의 암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 제 1의 핵산과 제 2의 핵산으로 구성된 벡터를 포함하며, 상기 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체를 인코드하며, 상기 제 2의 핵산은 톨 유사 수용체 효능제(agonist)를 인코드 한다. 상기 암은 종양이 된다. 상기 종양은, 전립선, 가슴, 결장, 식도, 위, 폐, 췌장, 신장, 갑상선, 난소, 목구멍 또는 경부(cervix)로 구성되는 그룹으로부터 시작된다. 상기 종양은 육종(sarcomas), 멜레노마(melenomas), 백혈병과 림프종으로 구성되는 그룹으로부터 시작된다. 상기 약제는 포유류의 상기 종양에서 인 트랜스(in trans) 형태로 또는 외부에서 투여된다. 상기 약제는 포유류의 상기 종양의 내부로 직접 투여된다. 상기 약제는 면역 촉진제와 함께 투여된다. 상기 면역 촉진제는 성장 호르몬, 프로락틴과 비타민 D로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 상기 성장 호르몬은 소마토트로핀(somatotrophin)이 된다. 상기 약제는 사이토킨(cytokin)과 함께 투여된다. 상기 사이토킨은 줄기 세포 인자가 된다.
본 발명은 또한 약제가 필요한 포유류에 대해 약제를 투여하여 포유류내의 감염(infection)을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 제 1의 핵산과 제 2의 핵산으로 구성된 벡터를 포함하며, 상기 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체를 인코드하며, 상기 제 2의 핵산은 톨 유사 수용체 효능제(agonist)를 인코드 한다. 암은 종양이 될 수 있다. 상기 감염은 바이러스, 박테리움, 원충 기생충과 균류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 생물체에 의해 발생된다.
본 발명은 플라젤린과 같은 톨 유사 수용체 효능제를 제공하고, 톨 유사 수용체 5(TLR-5)와 같은 톨 유사 수용체를 제공하여 암과 감염성 질병들을 치료하는 방법들과 약제에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 암 세포와 NF-κB 아포프토시스 경로를 통해 병원체에 의해 감염된 세포들을 정밀하게 죽이는 선천성(시스 효과) 및 적응성(트랜스 효과) 면역 반응에 관련된 세포들을 모으는 시스(cis) 및 인 트랜스(in trans) 효과를 가져오게 한다.
도 1a-도 1c는, TLR5, CBLB502S와 그들의 조합(TLR5+CBLB502S)을 발현하는 아데노바이러스 벡터들의 개략적인 지도를 도시한 도면이다.
도 2는, 생쥐가 CBLB502S 또는 PBS로 3일 동안 치료되는 경우에, (TLR5가 없는)제어 벡터 또는 TLR5를 발현하는 벡터로 형질 변경된 종양 세포들에 있어서 수 많은 날 동안에 생쥐내의 종양 부피의 비율 결과를 도시한 도면이다.
도 3은, 아데노바이러스 공통 유전형의 생쥐 CT26 결장 악성 종양내에 주입되는 경우에 CBLB502S와 톨 유사 수용체를 공동 발현하는 벡터를 포함하고 있으며, 아데노바이러스 벡터 구조의 인-시스와 인- 트랜스를 연구한, 아데노바이러스 주입에 의한 종양 성장의 억제를 도시한 도면이다.
도 4는, 박테리아 플라젤린의 영역 구조를 도시한 도면이다. F41의 Ca 중추(backbone) 추적, 소수성 코어 분포와 구조 정보. 영역 D1, D2a, D2b와 D3를 정의하는 4개의 분명한 소수성 코어들. 모든 소수성 측쇄 원자들은 Ca 중추에 의해 표시된다. 측쇄 원자들은 칼라로 코드화 된다:Ala, 노랑; Leu Ile 또는 Val, 오렌지; Phe와 Tyr, 자주(탄소 원자)와 적색(탄소 원자). 플라젤린의 아미노산 서열내의 여러 가지 구조적인 특징들의 c, 배치와 영역. 상부에서 하부로 도시됨; F41 프래그먼트는 청색; 3개의 b-폴리움(folium)은 갈색으로 폴드(fold); 황색의 a-헬릭스(helix)를 가지는 2차 구조 분포, 녹색의 b-구조와 자주색의 b-턴(turn); 50번째 나머지(residue) 마다 청색으로 표시된 틱 마크(tic mark); 영역들 D0, D1, D2와 D3; 시안(cyan)의 프로토 요소(proto-element)내의 축 서브 유닛 접촉 영역; 보라색의 가변 영역과 적색으로 표시된 우수하게 보존된 아미노산 서열;다른 슈퍼코일(supercoil)들의 요소들을 생성하는 F41내의 포인트 변종(point mutations). 하부의 글자들은 변종 요소들의 형태학을 나타낸다; L(D107E, R124A, R124S, G426A), L-type 스트레이트(straight); R(A449V), R-type 스트레이트;C(D313Y, A414V, A427V, N433D), 컬리33(curly 33).
도 5는 살모넬라 플라젤린 영역들, 그것의 프래그먼트들과 TLR5와의 상호 작용의 개략도를 도시한 도면이다. 검은 막대들은 A, B, C, A'와 B'를 포함하는 프래그먼트를 구성하기 위해 사용되는 플라젤린 유전 인자의 영역들을 나타내고 있다.
도 6은 플라젤린 유도체를 도시한 도면이다. 선택된 플라젤린 유도체들(우측에 기재됨)의 영역 구조와 개략적인 경계들(아미노산 좌표들). 살모넬라 더블린(dublin)의 FliC 플라젤린이 505 아미노산(aa)에 의해 인코드된다.
도 7은 다음과 같은 플라젤린 변종의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 도면이다.: AA'(SEQ ID NO:7-9), AB'(SEQ ID NO:9-10), BA'(SEQ ID NO:11-12), BB'(SEQ ID NO:13-14), CA'(SEQ ID NO:15-16), CB'(SEQ ID NO:17-18), A(SEQ ID NO:19-20), B(SEQ ID NO:21-22), C(SEQ ID NO:23-24), GST-A'(SEQ ID NO:25-26), GST-B'(SEQ ID NO:27-28), AA'nl-170(SEQ ID NO:29-30), AA'nl-163(SEQ ID NO:33-34), AA'n54-170(SEQ ID NO:31-32), AA'n54-163(SEQ ID NO:35-36), AB'nl-170(SEQ ID NO:37-38), AB'nl-163(SEQ ID NO:39-40), AA'nl-129(SEQ ID NO:41-42), AA'n54-129(SEQ ID NO:43-44), AB'nl-129(SEQ ID NO:45-46), AB'n54-129(SEQ ID NO:47-48), AA'nl-100(SEQ ID NO:49-50), AB'nl-100(SEQ ID NO:51-52), AA'nl-70(SEQ ID NO:53-54)와 AB'nl-70(SEQ ID NO:55-56). pRSETb 리더 서열은 이탤릭체로 도시되어 있다(리더는 FliC의 아미노산이 되는 Met를 포함한다.). N-터미널 일정 영역은 밑줄로 표시되어 있다. 아미노산 링커 서열은 굵은 글씨로 표시되어 있다. C 터미널 일정 영역은 밑줄로 표시되어 있다. GST가 존재한다면, 하이라이트로 표시된다.
도 8은 21개의 박테리아로부터 보존 아미노산(도 8a)의 아미노산 서열들과 카르복시 터미너스(terminus)(도 8b)의 비교 결과를 도시한 도면이다.
TLR5 활성화에 중요한 13개의 보존 아미노산들은 음영으로 표시되어 있다. 아미노산 서열은 TrEMBL(첫 글자=Q) 또는 스위스-프롯(Prot)(첫 글자=P)로부터의 접속 번호에 의해 식별된다.
도 9는 인체의 톨 유사 수용체 5 단백질에 대한 핵산과 아미노산 서열을 도시한 도면이다.
본 발명자들은 플라젤린과 같은, 톨 유사 수용체 효능제와 함께, 톨 유사 수용체 5(TLR-5)와 같은 톨 유사 수용체의 공급에 의해, NF-κB 아포프토시스 경로를 통해 병원체에 의해 감염된 세포들과 암세포만을 지정하여 죽이는 선천성(시스 효과 : cis effect) 및 적응성(트랜스 효과 : trans effect) 면역 반응내에 포함된 세포들을 보충하는 시스 및 트랜스 효과가 발생된다는 놀라운 사실을 발견하게 되었다. 이론에 구애받지 않으면서, 본 발명에서 실현되는 아이디어는 (i) TLR의 발현을 실현하는 구조에 의해 종양을 변형시킴으로써 종양내에 이미 존재하는 TLR 발현에 의해 영향을 받는 TLR-중재에 의한 면역 방법을 해결하는 것과, (ii) TLR 효능제의 로컬 풀(local pool)을 생성하여 종양에 대한 면역 응답을 지시하는 것이다. 예를 들면, TLR을 포함하는 약제 조성물은 발현을 유도하고 TLR을 활성화시키면, 내장 벽을 통해 대량의 박테리아 침투 상황을 가정하는 경우에, 호스트 면역 시스템에 대해 종양 세포들을 노출시키게 된다.
TLR5와 같은 TLR과 플라젤린과 같은 TLR 효능제를 제공하여, 선천성 및 적응성 면역 시스템을 활성화시키고, 상호 작용하게 하도록 하기 위해, 본 방법은, 육종(sarcomas), 멜레노마(melenomas), 백혈병과 림프종 뿐만 아니라, 전립선, 가슴, 결장, 식도, 위, 폐, 췌장, 신장, 갑상선, 난소, 목구멍 또는 경부암(cervix cancer)으로부터 발생하는 종양들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법의 응용 분야는 암 치료에 제한되지 않으며, 바이러스, 박테리아, 원충 기생충 또는 균류로부터 발생되는 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것이다.
TLR과 TLR 효능제를 제공하는 변종들은, LR 수용체와 감염된 동일한 포유류 세포내의 TLR 활성화를 초래하는 플라젤린의 분비 형태를 공동 발현하는 벡터들을 포함한다. 본 방법은 또한 세포내에 트랜스 형태로 투여되는 TLR 효능제와 포유류내의 TLR 수용체를 발현하는 벡터 구조들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 벡터는 포유류 세포에 의한 효과적인 합성과 분비를 실현하기 위해 플라젤린의 수정을 요구할 수 있다.
1. 정의
여기에서 사용되는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용되는 것이며 제한되는 것은 아니다. 본 명세서와 첨부된 청구항들에서 사용되는, 단수의 형태인, “한개”, “하나”, 그리고, “그것”은 문맥상에서 달리 명확하게 지시하지 않는 이상, 복수의 대상물들을 가리킨다.
여기에 기재된 수치 범위의 설명을 위해서, 동일한 정밀도를 가지는 각각의 중간수(intervening number)는 명확하게 고려되었다. 예를 들면, 6-9의 범위에 대해서는, 6과 9외에도, 7과 8이 고려되며, 6.0-7.0의 범위에 대해서는 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9와 7.0이 고려된다.
“공급(administer)"은 약품의 단일 투여 또는 복수 투여 또는 약품을 나타낸다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드와 연관지어 생각해보는 경우에,“아나로그(analog)"는 한 개 이상의 비표준 아미노산 또는 종래의 아미노산으로부터 유도되는 다른 구조성 변형체를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
“항체”는 Fab, F(ab‘)2, Fd를 포함하는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 프래그먼트 또는 그들의 유도체의 항체 및 단일 연쇄 항체, 2중 항체(diabodies), 이중 특이성 항체(bispecific antibodies), 이중 기능성 항체와 그들의 유도체를 의미한다. 항체는 단일 세포 항체, 복수 세포 항체, 친화 순수 항체, 또는 소망하는 에피토프(epitope) 또는 유도된 서열에 대해서 충분한 결합 특이성을 나타내는 혼합물이 된다. 항체는 또한 화학적 항체가 될 수 있다. 항체는 한 개 이상의 화학물질, 기존의 펩타이드, 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety)가 될 수 있다. 항체는 화학적 모이어트와 함께 한 쌍을 이루게 된다.
“유도체”는 일차 구조(아미노산과 아미노산 아나로그)가 아닌 펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 유도체는 글리코실화(glycosylated)에 의해 달라지며, 포스트 유전자 해독(post-translational) 수정의 한 형태가 된다. 예를 들면, 펩타이드, 또는 폴리펩타이드는 이종 구조(heterologus) 시스템에서의 발현에 의해 글리코실화를 나타낼 수 있다. 최소한 한 개의 생물학적인 활동이 유지되면, 이러한 펩타이드, 또는 폴리펩타이드는 본 발명에 따르는 유도체가 된다. 다른 유도체들은 공유가 형태로 수정된 N- 또는 C-말단(terminus)를 가지는 융합 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드, PEG화 된 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 지질(lipid) 모이어티와 연관된 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 알킬화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 아미노산 측쇄 기능 그룹을 통해 다른 펩타이드, 폴리펩타이드 및 화학산출물에 링크되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 및 종래의 기술에서 알려진 추가적인 수정 형태들이 될 수 있다.
“프래그먼트”는 기준 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 한 부분을 의미한다.
“동족체(homologue)”는 공통적인 진화성 원종(ancestor)을 공유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.
“리더 서열(leader sequence)”은 관심 대상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 링크되어 해독되는 어느 펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산이 될 수 있다. 이 때에, 세포막으로부터의 세포외 분비를 위해 상기 관심 대상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 진핵 세포의 소포체와 Golgi 복합체를 통해 적절하게 라우트된다.
리더 서열은 atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc를 포함하는 DNA 서열이 될 수 있다.
“리포솜(liposome)"은 동일한 물질에 의해 세포막으로 만들어진 작은 버블(소포)을 의미한다. 리포솜은 약제로 채워져 있으며 암과 다른 질병들을 위한 약제를 운반하기 위해 사용된다. 리포솜은 벡터로 채워져 있다. 리포솜은 헤드 그룹과 테일(tail) 그룹을 가지는 분자들, 즉 인지질(phospholipid)로 형성되어 있다. 리포솜의 해드 그룹은 친수성이 있으며, 기다란 탄화수소 연쇄로 구성되는 테일은 물에 대해서는 반발하게 된다. 테일은 물에 의해 반발되어 물로부터 멀어진 곳에서 표면을 형성하게 된다. 플라즈마 막내의 지질은 주로, 포스파티딜에타놀아민과 포스파티딜콜린과 같은 인지질이 될 수 있다. 리포솜은 (달걀 포스파티딜에타놀아민과 같은) 혼합된 지질 연쇄를 가지는 자연적으로 유도되는 인지질, 또는 DOPE(다이오레오일 포스파티딜에타놀아민)와 같은 순수한 표면활성제로 구성될 수 있다.
“펩타이드” 또는 “폴리펩타이드”는 아미노산의 링크 서열을 의미하며, 자연 형태, 합성 형태 또는 수정 형태 또는 자연 형태 및 합성 형태의 결합을 의미한다.
“실제적으로 동일하다는 것”은 제 1과 제 2의 아미노산 서열이 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000과 1100 아미노산의 영역에 걸쳐서 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 되는 것이다.
“치료됨”, “치료” 또는 “치료하는 것”은 일시적 또는 영구적인 기준에 근거하여 질환 또는 질병의 증상, 의학적 징후, 또는 기본적인 병리학적 증상의 경감, 억압, 제압, 제거, 방지 또는 지연시키는 것을 의미한다. 질환 또는 질병을 방지하는 것은 질병의 발생 초기 이전에 본 발명의 약제를 대상물에 투여하는 것을 포함한다. 질환 또는 질병을 억제하는 것(suppressing)은 질환 또는 질병의 진통 유발 후에, 그러나 의학적인 징후가 발생되기 이전에 본 발명의 약제를 대상물에 투여하는 것을 포함한다.
“변종(variant)”은 아미노산의 삽입, 삭제, 또는 보존적인 치환(conservative substitution)에 의해 아미노산 서열이 다르게 되어 있으나, 최소한 한 가지 생물학적 활동을 보유하고 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. “생물학적 활동”의 대표적인 보기는 톨(toll) 수용체에 연결되어 특정 항체에 의해 결합되는 기능을 포함한다. 변종은 또한 최소한 한 개의 생물학적 활동을 보유하고 있는 아미노산 서열을 가지는 기준 단백질과 실제적으로 동일한 아미노산을 가지는 단백질을 의미한다. 아미노산의 보존적인 치환 즉, 아미노산을 비슷한 특성들(예를 들면, 친수성(hydrophilicity), 전하 이온들의 수준과 분포)을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것은, 일반적으로 사소한 변경을 포함하는 기술과 같이, 종래의 기술에서 인정된다. 이러한 사소한 변경들은 종래의 기술, 즉 Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)에서 알 수 있듯이 아미노산의 수치료법 지수(hydropathic index)에 의해 식별될 수 있다. 아미노산의 수치료법 지수는 소수성(hydrophobicity)과 전하에 근거하는 것이다. 유사한 수치료법 지수를 가지는 아미노산들이 치환될 수 있으며 여전히 단백질 기능을 가지고 있다는 것이 기존의 기술에서 알려져 있다. 한 특징에서는, 수치료법 지수 ±2를 가지는 아미노산들은 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능을 보유하고 있는 단백질을 발생시키는 치환성을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 아미노산의 친수성을 펩타이드와 같이 생각해 보면펩타이드의 가장 큰 로컬 평균 소수성을 측정할 수 있으며, 이것은 항원성(antigenecity)과 면역원성(immunogenecity)과의 비교할 수 있다고 보고된유용한 측정 자료이다. 여기에서 참조로 포함되어 있는, 미국 특허 제 4,554,101호에서는, 유사한 친수성 값을 가지는 아미노산의 치환은, 종래의 기술에서 알려진 바와 같이, 생물학적 활동, 예를 들면 면역원성을 보유한 펩타이드를 발생시킬 수 있다는 사실을 기재하고 있다. 치환은 서로 서로 ±2내에서 친수성을 가지는 아미노산에 의해 실행된다. 아미노산의 소수성과 친수성 값들은 그 아미노산의 특정한 측쇄(side chain)에 의해 영향을 받게 된다. 상기 관찰을 고려하면, 생물학적 기능과 양립할 수 있는 아미노산 치환은, 아미노산의 상대적인 유사성 그리고, 특히, 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성들에 의해 알려진 바와 같이, 아미노산의 측쇄에 의해 영향을 받는다고 알려져 있다.
“벡터”는 복제의 시초를 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 효모 또는 포유 동물의 인공 염색체가 될 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA 벡터가 될 수 있다. 벡터는 자가 복제하는 초과 염색체 벡터 또는 호스트 게놈과 통합하는 벡터가 될 수 있다.
2. 톨 유사 수용체( Toll - like receptor )
여기에서는 패턴 인식 수용체(PRR)의 형태가 되는 톨 유사 수용체(TLR)가 제공된다. TLR은 Gram-포지티브, Gram-네가티브 박테리아, 균류와 바이러스를 포함하는 병원체로부터 유도되는 보존성 분자 산출물(conserved molecular product)이나, 병원체-관련 분자 패턴(PAMPs)으로 총체적으로 언급되는, 호스트 분자와는 구별되는 분자들을 인식한다. TLR은 또한 총체적으로 손상-관련 분자 패턴(DAMPs)으로 언급되는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들을 인식할 수 있다. PAMP 또는 DAMP는 다음에 추가로 기술되는 TLR 효능제(agonist)가 된다. TLR은 신호를 전파하기 위해서 세포의 세포질내에서 어댑터(adapter) 분자들을 모으는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그(homolog) 또는 유도체가 될 수 있다. TLR은 인간 또는, 붉은털 원숭이, 쥐, 또는 생쥐와 같은 포유류 종류로부터 얻어질 수 있다. TLR은, 신호를 전파하기 위해서 세포의 세포질내에서 어댑터 분자들을 모으는 TLR과 최소한 30-99% 동일하게 된다.
TLR은 대부분의 포유류 종류에 존재한다고 추정되는 10-15개의 TLR중에서 어느 한 개가 될 수 있다. TLR은 인체와 생쥐내에서 모두 식별되는 13개의 TLR(단순하게 TLR1-TLR13)중에서 어느 한 개가 되거나, 또는 다른 포유 종류내에서 발견되는 동등한 형태가 될 수 있다. TLR은 인체내서 발견되는 11개의 멤버(TLR1-TLR11)중 어느 한 개가 될 수 있다.
TLR은 다른 형태의 면역 세포에 의해 발현되며, 세포질 또는 세포 표면상에서 발견될 수 있다. TLR은 암 세포상에서도 발현된다. TLR은 소화기내의 정상적인 상피 세포, 피부, 치조(alveolar) 및 기관지 상피 세포내의 케라틴 세포(keratinocytes)와 여성의 생식기관의 상피 세포에 의해 발현될 수 있다. 기관에 존재하는 이러한 세포들은 미생물의 공격에 대해 제 1의 방어선이 되며, TLR은 증식 및 아포프토시스(apoptosis)의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행하게 된다.
TLR-발현 암세포는 다음의 표로부터 선택될 수 있다.:
Figure pct00001
암 세포에서 발현된 TLR은 NF-κB 캐스케이드(cascade)를 상향 조절하고, 암 발생 및 암세포 증식에 기여하는 앤티-아포프토틱(anti-apoptotic) 단백질을 생성하게 된다.
TLR중 4개의 어댑터 분자들은 신호처리에 포함된다고 알려져 있다. 이러한 단백질들은 마이로이드(myeloid) 분화 인자 88(MyD88), Tirap(Mal이라고 함), Trif와 Tram으로 알려져 있다. 어댑터들은 신호를 증폭시키고, 최종적으로 염증을 일으키는 유전 인자의 유도 또는 억제에 이르게 하는 어느 단백질 키나제(IRAK1, IRAK4, TBK1과 IKKi)를 포함하는, 세포내에서 다른 분자들을 활성화시킨다. 병원체를 인식하는 동안에 TLR 신호 처리 경로는 MyD88에 의해 중개되는 세포 외부 및 세포 내부 경로와, 활성화 B세포(NF-κB)의 핵인자 카파-라이트-체인-증강인자(kappa-light-chain-enhancer)와 미토젠-관련 단백질 키나제(MAPK)를 통해 면역 반응을 유도하게 된다. 모든 경우에서, 수천의 유전 인자들은 TLR 신호 처리에 의해 활성화되며, 전체적으로, TLR은 가장 플라이어트로픽(pleiotropic)하고, 유전 인자 변조를 위한 조밀하게 조절된 게이트웨이중 한 개를 구성하게 된다.
인터루킨-1 수용체와 TLR은 “인터루킨-1 수용체/톨 유사 수용체 슈퍼 패밀리”라고 알려진 수용체 슈퍼 패밀리를 형성하게 된다. 이러한 패밀리의 모든 멤버들은 공통적으로 소위 TIR(Toll-IL-1 수용체) 영역을 가지고 있다. TIR 영역에서 3개의 서브 그룹들이 존재할 수 있다. 서브 그룹 I TIR 영역을 가지는 단백질은 대식세포(macrophage), 단핵 세포(monocyte)와 나뭇가지 모양의 세포들에 의해 생성되는 인터루킨용 수용체들이며, 모두 세포 외부의 면역글로블린(Ig)을 가진다. 서브 그룹 II TIR 영역을 가지는 단백질은 전형적인 TLR이며, 미생물의 시점(origin)의 분자들에 대해 직접 또는 간접적으로 결합되어 있다. TIR 영역(III)을 포함하는 단백질의 제 3그룹은 단지 세포 기질로만 이루어지고 서브 그룹들 1과 2로부터의 신호 처리를 중재하는 어댑터 단백질들로 구성된다. TLR은 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 서브 그룹 I TIR 영역, 서브 그룹 II TIR 영역 또는 서브 그룹 III TIR 영역중 어느 하나를 보유하고 있는 유도체가 될 수 있다.
TLR은 다이머(dimer)로서 기능한다. 예를 들면, 대부분의 TLR은 호모다이머(homodimer)로서 기능하고 있는 것처럼 보이지만, TLR2는 TLR1 또는 TLR 6와 함께 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하며, 각 다이머는 서로 다른 리간드(ligand) 특이성을 가진다. TLR은 또한, MD-2를 요구하면서, TLR4가 LPS를 인식하는 경우에, 완전한 리간드 감지(sensitivity)를 위해 다른 공통-수용체에 의해 영향을 받게 된다. 그리고, CD14와 LPS 결합 단백질(LBP)은 LPS~MD-2의 표시를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
a. TLR1
TLR은 TLR1이 될 수 있으며, 이것은 그램-포지티브 박테리아에 대한 특이성을 가지는 PAMP를 인식한다. TLR1은 또한 CD281로 지정되었다.
b. TLR5
TLR은 톨 유사 수용체 5가 될 수 있다. TLR-5에 의해 인코드된 단백질은 병원체 인식과 선천성 면역성의 활성화에 있어서 기본적인 역할을 수행한다. TLR-5는 전엽 인자에 대해 발현되는 PAMP를 인지하며, 효과적인 면역성의 개발을 위해 필요한 사이토킨의 생성을 중재하게 된다. TLR-5는 박테리아 플라젤라(flagella)의 주요 구성 요소인, 박테리아 플라젤린(flagellin)과 독성 인자를 인지한다. TLR은 핵 인자 NF-κB를 가동시키고 종양 괴저(necrosis) 인자-알파 생성을 촉진하게 된다.
3. 톨 유사 수용체 효능제
여기에서는 TLR 효능제가 제공된다. TLR은 병원체로부터 유도되는 보존 분자 산출물 이 되는, PAMP가 될 수 있다. 병원체는 Gram-포지티브 박테리움, Gram--네가티브 박테리움, 균류 또는 바이러스가 될 수 있다. TLR 효능제는 손상되거나 또는 죽은 세포로부터 방출되는 내인성(endogenous) 분자들이 되는, 손상-관련 분자 패턴(DAMP) 리간드가 될 수 있다. SAMP 또는 PAMP는 TLR 신호를 통해 면역 응답을 개시하고 신호를 전달하기 위해 세포의 세포질내에서 어댑터 분자들을 모으게 된다. TLR 효능제는 다음의 표 2로부터 리간드가 되는, TLR 효능제가 된다.
Figure pct00002
TLR 효능제는 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 TLR을 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 PAMP 또는 DAMP의 유도체가 될 수 있다. TLR 효능제인, 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로그 또는 유도체는 TLR 효능제의 아미노산의 최소한 30-99% 동일하며 TLR-중재에 의한 활성화를 유도하게 된다.
TLR 효능제는 TLR-5와 같은 TLR을 목표로 한다. TLR 효능제는 TLR-5의 효능제가 될 수 있으며, TLR-5 활동을 촉진하게 된다. TLR 효능제는 앤티-TLR-5 항체 또는 다른 작은 분자가 된다. TLR 효능제는 플라젤린이 될 수 있다.
플라젤린은 한 개의 플라젤린 또는 플라젤린과 연관된 폴리펩타이드가 될 수 있다. 플라젤린은 여러 가지 Gram-포지티브 박테리아와 Gram-네가티브 박테리아 종류들을 포함하는 어느 소스로부터 얻어질 수 있다. 플라젤린은 미국 공개 특허 제 2003/000044429호에 기재된 플라젤린 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어느 Gram-포지티브 박테리아와 Gram-네가티브 박테리아 종류로부터 얻어지는 플라젤린 폴리펩타이드가 될 수 있다. 상기 미국 특허 공보는 여기에서 그 전체 본문이 참조로서 포함되어 있다. 예를 들면, 플라젤린은 미국 공개 특허 제 2003/0044429호의 도7에 도시된 박테리아 종류로부터 아미노산 서열을 가질 수 있다. 미국 공개 특허 제 2003/0044429호의 도 7에 기재된 플라젤린 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들은 NCBI Genbank 데이터베이스를 포함하는 소스에서 공개적으로 이용가능하다. 플라젤린은 또한 미국 공개 특허 제 2003/0044429호의 도 25에 도시된 BLAST내에 기재된 접속(Accession) 번호에 대응하는 플라젤린 폴리펩타이드 또는 그것의 변종이 될 수 있다. 플라젤린은 또한 여기에 그 전체 본문이 참조로서 포함되어 있는, 미국 출원 공개 번호 2009/0011982호에 기재된 플라젤린 폴리펩타이드가 될 수 있다. 플라젤린은 본 출원의 도 6과 도 7에 도시된 플라젤린 폴리펩타이드 중에서 어느 하나가 될 수 있다.
플라젤린은, TLR을 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는 플라젤린의 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 그 유도체가 될 수 있다. 플라젤린의 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 유도체는 TLR을 결합하고 TLR5-중재에 의한 활동을 유도하는 플라젤린의 아미노산과 최소한 30-99% 동일하다.
플라젤린은 (GenBank 접속 번호 M84972에 의해 인코드된) S.dublin의 대표적인 보기가 되는 살모넬라균으로부터 얻어질 수 있다. 플라젤린과 관련된 폴리펩타이드는 TLR을 결합하고 NF-κB 활동의 활성화와 같은, TLR-중재에 의한 활성화를 유도하는, M84972호의 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 유도체 또는 그들의 조합이 될 수 있다. 플라젤린의 프래그먼트, 변종, 아나로그, 호모로지(homology) 또는 유도체는 플라젤린의 영역 구조와 TLR5에 의해 인지되는 보존 구조에 근거하는 합리적인 설계에 의해 얻어진다.
플라젤린은 도 5에 도시된 13개의 보존 아미노산중 최소한 10, 11, 12 또는 13개를 포함한다(위치 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436과 452). 플라젤린은 M84972호의 아미노산 1 174와 418 505와 최소한 30-99%가 동일하다. 여기에 그 전체 본문이 참조로서 포함되어 있는, 미국 출원 공개 번호 2009/0011982호의 도 26은 M84972호와 비교할 때에, 기존의 TLR-5 촉진 활동을 가지는 플라젤린의 아미노- 및 카르복시-말단의 백분율을 기재하고 있다.
플라젤린은 박테리아 플라젤룸(flagellum)의 주요 성분이 될 수 있다. 플라젤린은 3개의 영역들로 구성될 수 있다(도 4). 영역 1(D1)과 영역 2(D2)는 비연속이며 아미노 말단(terminus)과 카르복시 말단내의 나머지(residue)가 헤어핀(hairpin) 구조의 형태에 의해 병렬 배치되어 있는 경우에 형성될 수 있다. D1과 D2영역들을 포함하는 아미노와 카르복시 단말은 최대한 보존되며, 반면에 중간의 고변위(hypervariable) 영역(D3)은 매우 가변적이다. Escherichia 콜리 힌지(coli hinge)(ND1-2/ECH/CD2)에 의해 분리되는 아미노 D1과 D2와 카르복실 D1과 D2를 포함하는 재결합 단백질에 대한 연구들은 D1과 D2가 ECH에 결합되는 경우에 생물학적 활동성이 된다는 것을 보여주고 있다. 이러한 공생체(chimera)는, 단지 힌지만이 아니라, 두 개의 내장 상피세포 라인내에서 IkBa 열화(degradation), NF-κB 활성화와 NO 및 IL-8 생성을 유도하게 된다. 비보존 D3 영역은 플라젤라(flagellar) 필라멘트의 표면에 있으며 주요 항원성 에피토프(epitope)를 포함한다. 플라젤린의 강력한 친염증 작용(proinflammatory activity)은 우수하게 보존된 N 및 C D1과 D2 영역들내에 남아 있다(도 4 참조).
플라젤린은 톨 유사 수용체5(TLR5)에 대한 결합에 의해 NF-κB 활동을 유도한다. TLR은 플라젤린에 대해 특정한 보존 구조를 인지한다. 보존 구조는 아미노산 성분내의 변화에 대해서 약간 허용적인 대규모의 찌꺼기들(residues)로 구성된다. 여기에서 그 내용이 참조로 포함되어 있는, Smith et al., Nat Immunol. 4: 1247-53(2003)은 TLR5에 의해 인지가능한 보존 구조의 일부가 되며 플라젤린내에 있는 13개의 보존 아미노산을 식별하였다. TLR5 활동을 위해 중요한 플라젤린내의 13개의 보존 아미노산들은 도 5에 도시되어 있다.
최소한 몇 개의 TLR5 촉진 활동을 보존하는 수 많은 플라젤린의 결손 돌연변이체(deletional mutants)가 만들어졌다. 플라젤린은 결손 돌연변이체와 같으며, 본 발명의 실시예에 기재된 결손 돌연변이체가 될 수 있다. 플라젤린은 Genbank 접속 번호 D13689 손실 아미노산 185-306 또는 444-492로부터, 또는 Genbank 접속 번호 M84973 손실 아미노산 179-415 또는 그 변종으로부터 번역되는 서열을 포함한다.
플라젤린은 트랜스포손(transposon) 삽입들을 포함하며, 가변 D3 영역에 대해 변화된다. D3 영역은 D1과 D2 영역들은, 그 전체 또는 부분적으로, 적절하게 접혀지도록 하는 힌지 또는 링커(linker) 폴리펩타이드로 치환될 수 있다. 그러므로, 그 변종은 TLR5 활동을 촉진하게 된다. 변종 힌지 요소들은 E. coli MuκB 단백질내에서 발견되며, SEQ ID NOS:3과 4 또는 그 변종내에서 설명되는 서열을 가진다.
상기와 같이 기재된 플라젤린은 리더 서열을 추가로 포함한다. 리더 서열을 추가로 포함하는 플라젤린은 CBLB502S가 될 수 있다.
4. 약제
본 발명은 또한 치료가능한 유효한 TLR과 TLR 효능제 양을 포함하는 약제에 관한 것이다. 약제는 TLR 효능제로부터 TLR을 분리하여 전달할 수 있다. 약제는 벡터가 될 수 있다. 벡터는 TLR을 인코딩하는 제 1핵산과 TLR 효능제를 포함하는 제 2핵산을 포함한다. 벡터는 포유류 세포를 형질 변환(transducing)할 수 있다. 벡터는 TLR 및/또는 강한 프로모터(promoter)를 이용하는 TLR 효능제의 바이-시스트로닉(bi-cistronic) 발현을 실행할 수 있다. 벡터는 강한 프로모터에 의해 제어되는, TLR을 인코딩하는 유전자만을 포함할 수 있다. 벡터는 바이러스 또는 리포솜과 관련되는 벡터 시스템에 의해 포유류 세포내에 전달될 수 있다. 바이러스 벡터 시스템은 아데노바이러스 또는 싸이토메갈로바이러스가 될 수 있다.
약제는 벡터를 저장하는 리포솜이 될 수 있다. 리포솜은 포유류 세포를 형질 변경할 수 있으며 발현을 위해 벡터를 전달할 수 있다.
약제는 발현을 유도하고 TLR을 동시에 활성화시킴으로써, 내장벽을 통해 대량의 침투 상황과 같이 호스트 면역 시스템에 종양 또는 전염된 세포들을 노출시키는, 약품 조성물이 될 수 있다. 약제는 TLR 효능제와 결합하여 TLR을 발현시키는 약품 조성물이 될 수 있으며, 근육 내부에 대한 투여를 위해 용액 상태로 체계적으로 전달될 수 있다. 약제는, 아데노바이러스 또는 싸이토메갈로바이러스 벡터 시스템과 같은, 동일한 벡터로부터 발현되는, TLR 효능제와 결합하여 TLR을 발현하는 악품 조성물이 될 수 있다. 약제는 포유류 세포의 표면으로 기능성 효능제를 운반하는, 나노-입자의 형태로 발현되는 TLR 효능제와 결합하여 TLR을 발현하는 악품 조성물이 될 수 있다.
약제는, 종래의 기술에서 잘 알려진 방법들을 이용하여 생성되는, 상기 약품 조성물을 포함하는 약학적 제품이다. 약제는 또한 공동인자(coagent)를 포함한다.
벡터는 TLR5를 인코딩하는 제 1핵산과 플라젤린을 포함하는 제 2핵산으로 이루어진다. 벡터는 강한 프로모터를 이용하여 TLR5 및/또는 플라젤린을 발현할 수 있다. 발현 벡터는 TLR 또는 TLR5 및/또는 플라젤린을 인코딩하는 유전 인자의 리더 서열 클로운 업스트림(cloned upstream)을 추가로 포함한다. 발현 벡터는 pCD515에 근거하는 벡터 시스템이 될 수 있다. 발현 벡터는 도 1a에 기재된 바와 같이 pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502가 될 수 있다. 발현 벡터는 도 1c에 기재된 바와 같이 pCD515-CMV-Sseap-502가 될 수 있다.
약제는 TLR의 발현 및 활성화를 동시에 유도함으로써, 내장벽을 통해 대량의 침투 상황과 같이 호스트 면역 시스템에 종양 또는 전염된 세포들을 노출시키는, 약품 조성물이 될 수 있다. 약품 조성물은 벡터를 저장하는 바이어스 발현 시스템의 형태가 될 수 있다.
약품 조성물은,
근육 내부 투여를 위해 용액으로 체계적으로 전달되는 TLR 효능제와;
TLR과 같이 아데노바이러스 벡터로부터 발현되는 TLR 효능제;
또는 CBLB502로부터 전달되는, 플라젤린과 같이, 기능성 TLR 효능제를 표면상에 운반하는 나노-입자들의 형태로 발현되는 되어 있는 TLR 효능제와 결합하여 아데노바이러스 발현 기능성 인체 TLR5가 될 수 있다. 나노 입자는 박테리오파지 T7에 근거하거나 또는 생물학적인 활동을 보존하기 위해 완전하게 형성된다. 나노-조성물은 투여량에 의해 영향을 받는, NF-κB-응답성 리포터 활동을 위해 제공되며, 효과적인 면역 방법을 위한 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내재화(internalization)를 초래하게 된다.
a. 투여
여기에 기재된 방법을 이용하는 약제의 투여는, 구강 투여, 비경구 투여, 혀밑 투여, 경피 투여, 직장 투여, 점막 투여, 국소 부분 투여, 흡입, 구강 (buccal)투여, 또는 그들의 조합을 통해 이루어진다. 비경구 투여는 정맥 투여, 동맥 투여, 복막 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 수막공간 투여 밑 관절 투여를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 수의학 목적을 위해, 약제는 정상적인 수의학 관습에 다라 적절하게 허용가능한 조성물로서 투여될 수 있다. 수의사는 투여 요법과 특정한 동물에게 가장 적합한 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 약제는 환자, 고양이, 개, 큰 동물 또는 조류에 대해 투여될 수 있다.
약제는 다른 치료들과 함께 동시에 또는 체계적으로 투여될 수 있다. 여기에서 사용되는 용어“동시”또는 “동시에”는 약제와 다른 치료가 각각 48시간 내에 투입되는 것을 의미한다. 바람직하게는 24시간이며, 더욱 바람직한 시간은 12시간이며, 더욱 바람직한 것은 6시간이며, 가장 바람직한 시간은 3시간 이하이다. 여기에서 사용되는 용어“체계적으로”는 다른 치료와는 다른 시간에서, 그리고 반복 투여에 대한 어느 횟수 만큼 그 약제를 공급하는 것을 의미한다.
그 약제는 다음과 같은 시간을 포함하는, 또 다른 치료 이전의 어느 시점에서 투여될 수 있다. 즉, 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분과 1분.
그 약제는 그 약제의 제 2의 치료 이전에, 다음과 같은 시간을 포함하는 어느 시점에서 투여될 수 있다. 즉, 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분과 1분.
그 약제는 다른 치료 이후에, 다음과 같은 시간을 포함하는 어느 시점에서 투여될 수 있다. 즉, 약 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 36시간, 38시간, 40시간, 42시간, 44시간, 46시간, 48시간, 50시간, 52시간, 54시간, 56시간, 58시간, 60시간, 62시간, 64시간, 66시간, 68시간, 70시간, 72시간, 74시간, 76시간, 78시간, 80시간, 82시간, 84시간, 86시간, 88시간, 90시간, 92시간, 94시간, 96시간, 98시간, 100시간, 102시간, 104시간, 106시간, 108시간, 110시간, 112시간, 114시간, 116시간, 118시간과 120 시간. 그 약제는 그 약제의 제 2의 치료 이전에, 다음과 같은 시간을 포함하는 어느 시점에서 투여될 수 있다. 즉, 약 120시간, 118시간, 116시간, 114시간, 112시간, 110시간, 108시간, 106시간, 104시간, 102시간, 100시간, 98시간, 96시간, 94시간, 92시간, 90시간, 88시간, 86시간, 84시간, 82시간, 80시간, 78시간, 76시간, 74시간, 72시간, 70시간, 68시간, 66시간, 64시간, 62시간, 60시간, 58시간, 56시간, 54시간, 52시간, 50시간, 48시간, 46시간, 44시간, 42시간, 40시간, 38시간, 36시간, 34시간, 32시간, 30시간, 28시간, 26시간, 24시간, 20시간, 18시간, 16시간, 14시간, 12시간, 10시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 55분, 50분, 45분, 40분, 35분, 30분, 25분, 20분, 15분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분과 1분.
b. 조성물
본 방법은 약제의 투여 방법을 포함한다. 여기에서 제공되는 약제는 종래의 방법으로 제조되는 태블릿 또는 정제의 형태로 되어 있다. 예를 들면, 구강 투여를 위한 태블릿과 캡슐은 종래의 부형제(excipient)를 포함하고 있으며 이러한 부형제는 결합제, 필러, 윤활제, 붕괴제(정제 분해물질)와 습식제가 된다. 결합제는 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스, 녹말의 점액과 폴리비닐파이롤리돈을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 필러들(fillers)은 락토제, 설탕, 미정질의 셀룰로스, 옥수수 녹말, 칼슘 인과 소르비톨을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 윤활제는 마그네슘 스테아레이트산, 스테아릭산, 탈크, 폴리에틸렌 글리코과 규소를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 붕괴제는, 감자 녹말과 나트륨 녹말 클리콜레이트(glycollate)가 된다. 습식제는 나트륨 로릴 황산염이 된다. 태블릿은 기존의 방법들에 따라 코팅된다.
여기에서 제공되는 약제는 또한 수용성 또는 지성 서스펜션, 용액, 에멀션, 시럽 그리고 일릭서(elixir)와 같은 액체 조성물이 된다. 약제는 사용 이전에 물 또는 다른 적합한 매체와 구성되기 위해 건성(dry) 산출물로서 제조될 수 있다. 이러한 액체 조합제(preparation)는 서스펜딩제, 에멀시파잉제(emulsifying agent), 비수용성 매체와 보존제와 같은 첨가제를 포함한다. 서스펜딩제는 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 글루코스/설탕 시럽, 젤라틴, 하이드록시에틸셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트산 젤, 및 수소로 처리된 식용 지방이 된다. 에멀시파잉제는 레시틴, 소르비탄 모노올레아산염, 및 아카시아가 된다. 비수용성 매체는 식용 오일, 아몬드 오일, 분말 코코넛 오일, 지방성 에스테르, 프로필렌 글리콜 및 에틸 알코올이 된다. 보존제는 메틸, 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 및 소르빅산이 된다.
여기에서 제공되는 약제는 코코아 버터 또는 글리세라이드와 같은 조약 베이스(suppositoty base)를 포함하는, 좌약으로서 제조된다. 여기에서 제공되는 약제는 흡입 투여식으로 제조되며, 용액, 서스펜션 또는 건식 분말로 투여되는 에멀션의 형태 또는 디클로로디플루오로메탄 또는 트라이클로로플루오로메탄과 같은, 추진제를 이용하는 아에로졸(aerosol)의 형태가 된다. 여기에서 제공되는 약제는 크림, 연고, 로션, 페이스트, 약을 넣은 플라스터, 패치 또는 막(membrane)과 같은 수용성 또는 비수용성 매체들을 포함하는 경피성 조성물로서 제조된다.
여기에서 제공되는 약제는 또한 투입, 종양내 투입 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제조되었다. 투입을 위한 조성물은 지용성 또는 수용성 매체내에서 서스펜션, 용액 또는 에멀션의 형태로 되며서스펜딩제, 안정제 및 분산제를 포함하나 이에 한정되지 않는 조성제를 포함한다. 약제는 또한 살균한 그리고 발열 물질이 없는 물을 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 매체와 재구성하기 위한 분말 형태로 제공된다.
여기에서 제공되는 약제는 또한 임플란테이션(implantation) 또는 근육내 주입에 의해 투여되는 데포우(depot) 조합제로 제조된다. 약제는 (예를 들면, 수용가능한 오일내의 에멀션과 같은) 적합한 중합체 또는 소수성 물질, 이온 교환 레진으로 조제되거나 또는 거의 용해되지 않는 유도체(예를 들면, 거의 용해되지 않는 소금)로서 조제된다.
C. 투여량
본 방법은 필요한 환자에게 치료가능한 유효한 양의 약제를 투여하는 단계를 포함한다. 치료시에 필효한 치료가능한 유효한 양은 치료되는 질병의 특성, TLR 활동을 활성화시키기 위해 요구되는 시간, 및 환자의 나이/조건에 따라 달라진다. 그러나, 일반적으로, 성인 환자를 위해 이용되는 투여량은 하루에 0.001 mg/kg에서 약 200 mg/kg의 범위에 있다. 그 투여량은 약 1 mg/kg에서 약 100 mg/kg의 범위에 있을 수도 있다. 종래에는, 소망하는 투여 방식이 단일한 투여로 실행되거나, 또는 적절한 구간을 두고 투여되는 다중 투여로 실행되었다. 예를 들면, 하루에 2, 3, 4 또는 그 이상의 서브-투여(sub-dose)가 실행되었다. 다중 투여는 희망하나 또는 필요에 의해 이루어질 수 있다.
투여량은 다음과 같이 될 수 있다. 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg,
1 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 225 mg/kg, 250 mg/kg, 275 mg/kg, 300 mg/kg, 325 mg/kg, 350 mg/kg, 375 mg/kg, 400 mg/kg, 425 mg/kg, 450 mg/kg, 475 mg/kg, 500 mg/kg, 525 mg/kg, 550 mg/kg, 575 mg/kg, 600 mg/kg, 625 mg/kg, 650 mg/kg, 675 mg/kg, 700 mg/kg, 725 mg/kg, 750 mg/kg, 775 mg/kg, 800 mg/kg, 825 mg/kg, 850 mg/kg, 875 mg/kg, 900 mg/kg, 925 mg/kg, 950 mg/kg, 975 mg/kg, 또는 1 mg/kg.
5. 암 치료방법
여기에서는 약제가 필요한 포유류에 대해 투여함으로써 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 종양 세포를 TLR 효능제-반응 상태로 변환시킴으로써 암에 대한 면역 치료에 대해, 대상이 되는 TLR의 종양내부를 자극시키게 된다. 그러므로, 면역 반응성을 그 종양에 대해 집중시키게 된다. 본 방법은 종양의 작은 혹을 치료하고, 환부의 전이(metastasis) 발전의 위험성을 줄이기 위해 외과적인 제거수술 이전에 주요 종양들을 치료하는데 이용된다. 본 방법은 종양 내부에 대한 주입을 포함한다. 본 방법은 종양의 작은 혹을 치료하고, 환부의 전이(metastasis) 발전의 위험성을 줄이기 위해 외과적인 제거수술 이전에 주요 종양내에 약제를 주입하는 단계를 포함한다. 본 방법은 아데노바이러스 종양내 주입을 위해 근접 가능한 어느 종양을 치료하는데 이용된다.
여러 종류의 암들이 본 발명에 따라 치료된다. 상기 암들은, 악성 종양, (가속화되며 전이성 방광암을 포함하는)방광, 가슴, (직장결장 암을 포함하는)결장, 신장, 간, (소규모의 그리고 소규모가 아닌 세포 폐암과 선암종(adenocarcinoma)을 포함하는)폐, 난소, 전립선, 고환, 요생식로, 림프계, 직장, 후두(larynx), (외분비의 췌장 악성 종양을 포함하는)췌장, 식도, 위, 담낭, 경부, 갑상선과 (편평세포암종(squamous cell carcinoma)을 포함하는) 피부; 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 넌-호지킨스(non-Hodgkins lymphoma), 텀모양세포 림프종, 조직구(histiocytic) 림프종, 및 버켓츠 (Burketts) 림프종을 포함하는 림프계의 조혈(hematopoietic) 종양들; 급성 및 만성 골수 백혈병, 골수형성이성질환(myelodysplastic syndrome), 골수 (myeloid) 백혈병, 및 전골수구 백혈병(promyelocytic leukemia)을 포함하는 골수계의 조혈 종양들; 별아교세포종(astrocytoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 신경교종(glioma) 및 신경집종(schwannomas)을 포함하는 중추신경계 및 말초신경계의 종양들; 섬유육종(fibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyoscarcoma) 및 골육종(osteosarcoma)을 포함하는 중간엽 세포(mesenchymal origin)의 종양들; 그리고 흑색종, 이종피부 색소병(xenoderma pigmentosum), 각질가시세포종(keratoacanthoma), 생식세포종(seminoma), 갑상선 소포암(follicular cancer), 기형암종(teratocarcinoma)과 위장관 또는 복부골반강(abdominopelvic cavity)을 포함하는 다른 종양들이 된다.
본 방법은, 면역 촉진제, 싸이토킨 또는 화학적 치료의 사용을 포함하는, 다른 암 치료하는 방법들과 결합될 수 있다. 면역 촉진제는 성장 호르몬, 프로락틴 또는 비타민 D가 된다.
6. 감염된 세포의 치료
여기에서는 약제에 의해 형질 변환된 세포의 동시 전달에 의해 감연성의 질병을 치료하는 방법이 제공된다. 본 방법은 바이러스, 박테리아, 원충 기생충 또는 균류 전염을 치료하는데 이용된다. 본 방법은 시스템에 최소한의 영향을 주면서 감염된 세포들의 TLR 신호처리의 오토크라인(autocrine) 활동을 초래하는 세호내 주입에 의해 감염 질병을 치료하는데 이용된다. 그리하여, 감염 세포들에 대한 선천적인 특정 면역 반응성을 가져오게 한다. 본 방법은 바이러스, 박테리아, 원충 기생충 또는 균류 전염을 치료하기 위해 다른 치료법들과 결합되어 이용된다.
본 방법은 약제를 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법은 약제를 포함하는 백신의 투여를 포함하며, 선택된 항원을 발현하는 구조를 포함하는 다른 백신과 결합하여 이용될 수 있다.
실시예 1
바이 - 시스트로닉 ( Bi - cistronic ) 발현 TLR5 / 플라젤린 벡터의 합성과 종양 세포의 치료
톨 유사 수용체 5(TLR5)와 플라젤린 CBLB502를 발현하기 위해 벡터 구조가 생성되었다. 벡터 pCD515는 이러한 구조에 대한 주요 요소로 사용되었다. 인체의 TLR5의 cDNA 서열과 톨 유사 수용체 효능제의 CBLB502를 인코딩하는 DNA는 알칼라인 포스파타제로부터 유도되는 리더 펩타이드와 각각 결합되어, 세포 외부로 분비하기 위해 소포체(ER)와 골기체를 통해 발현된 단백질의 라우팅을 실행하게 된다.
pCD515-CMV-hTLR5-EF1-502s 벡터 구조는 세포의 표면에서 CBLB502 플라젤린(CBLB502S)의 분비 형태와 톨 유사 수용체5(TLR5)를 발현하고 있다. 이러한 아데노바이러스 벡터는 유효한 합성과 포유류에 의한 분비를 실현하기 위해 CBLB502의 수정을 요구하였다. 아데노바이러스 구조는 알칼라인 포스파타제로부터 유도되는 리더 핵산 서열(Atgctgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggc)로 구성되며 단절된(truncated) 살모넬라 플라젤린(fliC) 유전자의 복제된 업스트림이다(플라젤린의 분비 가능 형태를 인코드하는 것(예를 들면, CBLB502S). Butdela et al., Science 320:226-230(2008)참조). EF1(연장도 인자: elongation factor 1α) 프로모터는 CBLB502S를 인코딩하는 이러한 카세트(cassette)의 복제된 업스트림이다. TLR5 유전자는 인체로부터 도출되며 도 9에 도시된 바와 같이 아미노산 서열을 가지고 있다. CMV 프로모터는 TLR5 유전 인자의 복제된 업스트림이다. 이러한 구조는 TLR5와 CBLB502S를 동시에 발현하고 있다. 이러한 구조는 도 1a에 도시되어 있다.
pCD515-CMV-hTLR5 발현 벡터는 인체의 TLR5(도 9 참조)의 형태를 발현하기 위해 구성되었다. 아데노바이러스 구조는 hTLR5 카세트의 강한 CMV 프로모터 복제 업스트림을 포함한다. 이러한 구조는 도 1b에 도시되어 있다.
pCVD515-CMV-Sseap-502 발현 벡터는 분비된 플라젤린 CBLB502와 톨 유사체(toll-like)를 발현하기 위해 구성되었다. 아데노바이러스 구조는 리더 서열 SEAP 502 플라젤린(fliC) 유전 인자의 강한 CMV 프로모터 복제 업스트림을 포함한다. 이러한 구조는 도 1c에 도시되어 있다. [복제 정보 필요]
실시예 2
바이 - 시스트로닉 ( Bi - cistronic ) 발현 TLR5 / 플라젤린 벡터의 합성과 종양 세포의 치료
NF-κB-반응성 GFP를 발현하고 TLR5 상태가 다른 두 개의 리포터 포유류 세포 라인들은 벡터 구조는 pCD515, pCD515-CMV-hTKR5-EF1-502s, pCD515-CMV-hTKR5-502, pCD515-CMV-hTKR5와 pCD515-CMV-Sseap-502에 의해 형질 변경되었다(아래 표 3 참조).
Figure pct00003
TLR5와 TLR5 효능제 CBLB 502S를 공동 발현하는 벡터는 기존의 TLR중 어느 것도 발현하지 않으며, 단지 TLR5 효능제만으로는 활성화되지 않는 293-널(null) 세포내의 NF-κB 리포터의 발현을 유도하기에 충분하였다. 이러한 실험은 TLR5와 플라젤린 CBLB502S가 트랜스 형태(trans) 또는 시스 형태(cis)로 동작하여 TLR5 신호처리를 활성화시킨다는 것을 입증하였다.
실시예 3
(pCD515-CMV-hTKR5-EF1-502s)를 가지는 바이-시스트로닉(bi-cistronic) 아데노바이러스의 항종양(antitumor) 효과를 실험하기 위해서, 제어 대상의 비주입 종양(non-injected tumor)이 실험의 종료를 요구하는 크기 제한에 도달하기 까지 종양들이 직경 3-5mm에 이르고 종양 크기가 검사되는 경우에, CT26 생쥐 결장 악성 세포로부터 도출되는 Balb/생쥐의 공통 유전형(syngeneic) 종양들을 성장시키는 두 개의 s.c. 중 한 개에, 10ml의 아데노바이러스 서스펜션(1012-1011 IU/ml)이 주입되었다. 제어 생쥐들에 대해서, 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP)을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입되었다(다시 한번, 한 마리의 생쥐 마다 두 개의 종양중 한 개의 종양에 주입). 대표적인 실험의 결과들이 도 4에 도시되었다. (pCD515-CMV-hTKR5-EF1-502s)로 주입된 종양들의 성장이 거의 완전하게 감소됨에 따라 RFP-발현 아데노바이러스가 주입된 제어 대상 동물의 종양과 비교할 때에 동일한 동물내의 주입되지 않은 종양의 성장이 감소하였다. 이러한 결과는 선천성(시스 효과 : cis effect)과 적응성(트랜스 효과 : trans effect) 면역 반응의 보완성(recruitment)을 나타내는 (i) 강력한 인-시스(in-cis)와 (ii) pCD515-CMV-hTKR5-EF1-502s의 가시적인 인-트랜스 효과를 나타내고 있다.
표 1에 기재된 다른 제어 대상 바이러스들중 홀로 주입된 어느 것도(예를 들면, AD5(제어 대상)와 Ad5(TLR5)) 종양들에 대해서 성장 억제 효과를 나타내지 않았다.
그러므로, TLR5의 강압적이고 정상적인 장소가 아닌 위치에서의 발현(ectopic expression)은, 원래 TLR5가 부족한 종양 세포 형태를 TLR5 촉진에 매우 민감하게 응답하도록 한다. 그러므로, 종양의 면역 허용치를 넘어서게 된다. 이것은 후속의 일반적인 항종양 효과를 가지는 적응성 면역 반응의 효과적인 전개를 향상시키는 선천성 면역 반응의 강력한 장점이 되는 것이다.

Claims (23)

  1. 제 1핵산과 제 2핵산을 포함하고, 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체를 인코드하며, 제 2의 핵산은 톨 유사 수용체 효능제(agonist)를 인코드하는 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체 효능제는 플라젤린이 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 벡터는 발현 벡터가 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 벡터는 포유류 발현 벡터가 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스(lentivirus) 또는 리포솜으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1의 핵산은 톨 유사 수용체로부터 분비되는 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 플라젤린은 플라젤린의 분비 형태가 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 플라젤린의 분비 형태는, 도 5에 도시된 TLR5 활성을 위해 중요한 13개의 플라젤린의 보존 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 톨 유사 수용체는 TLR-5가 되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1의 핵산은 도 7에 도시된 서열을 포함하며,
    상기 제 2의 핵산은 도 9에 도시된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제 1항의 상기 벡터를 포함하는 약제가 필요한 경우에, 포유류에 대해 투여하는 단계를 포함하는 포유류내의 암 치료 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 암은 종양이 되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 종양은, 전립선, 가슴, 결장, 식도, 위, 폐, 췌장, 신장, 갑상선, 난소, 목구멍 또는 경부(cervix)로 구성되는 그룹으로부터 시작되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 종양은 육종(sarcomas), 멜레노마(melenomas), 백혈병과 림프종으로 구성되는 그룹으로부터 시작되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 약제는 포유류의 상기 종양에서 인 트랜스(in trans) 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 약제는 포유류의 상기 종양의 내부로 직접 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  17. 제 11항에 있어서,
    상기 약제는 면역 촉진제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  18. 제 11항에 있어서,
    상기 면역 촉진제는 성장 호르몬, 프로락틴과 비타민 D로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 성장 호르몬은 소마토트로핀이 되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  20. 제 11항에 있어서,
    상기 약제는 사이토킨(cytokin)과 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 사이토킨은 줄기 세포 인자가 되는 것을 특징으로 하는 포유류내의 암 치료 방법.
  22. 제 1항의 상기 벡터를 포함하는 약제가 필요한 경우에, 포유류에 대해 투여하는 단계를 포함하는 포유류내의 감염 치료 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 감염은 바이러스, 박테리움, 원충 기생충과 균류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 생물체에 의해 발생되는 감염 치료 방법.
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