PT2320948E - Métodos para o tratamento de lesões por reperfusão - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE LESÕES POR REPERFUSÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de polipéptidos relacionados com a flagelina para tratar os tecidos dos efeitos da reperfusão.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Os tecidos privados de sangue e de oxigénio sofrem necrose isquémica ou enfarte com eventuais danos irreversíveis nos orgãos. Uma vez que o fluxo de sangue e o oxigénio são restabelecidos no órgão ou tecido (reperfusão), o órgão não volta imediatamente ao estado normal pre-isquémico. A reperfusão do fluxo coronário é necessária para reanimar o tecido ou orgão isquémico ou hipóxico. A reperfusão periódica facilita o resgate de células e diminui a morbidade e a mortalidade. A reperfusão de uma área isquémica pode resultar numa disfunção paradoxal incluindo uma marcada disfunção das células endoteliais, o que resulta em vasoconstrição, ativação de plaquetas e leucócitos, aumento da produção oxidante, e um aumento do líquido e extravasamento de proteína.

Ao longo das últimas duas décadas tem-se assistido a várias intervenções farmacológicas destinadas a limitar as lesões por reperfusão. Infelizmente, o sucesso de alguns agentes tem sido limitado ao modelo experimental de isquemia e reperfusão. A ausência de benefícios clínicos consistentes pode estar relacionada com uma variedade de fatores, incluindo uma conceção deficiente do ensaio clínico, 2 estudos farmacocinéticos/farmacodinâmicos inadequados e a complexidade do ser humano no modelo in vivo.

Existe a necessidade de na arte distinguir estratégias terapêuticas para isquémia vs. reperfusão e é possivel que a combinação de agentes seja necessária para desencadear o máximo beneficio clinico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É fornecido neste documento um método de tratamento de um tecido de mamifero a partir dos efeitos da reperfusão, que podem compreender a administração a um mamifero em necessidade, de uma composição compreendendo flagelina. A composição pode ser administrada em combinação com um antioxidante, que pode ser selecionado do grupo consistindo de amifostina e vitamina E. A reperfusão pode ser causada por uma lesão, que pode ser isquémia ou hipóxia. A isquémia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em taquicardia, enfarte, hipotensão, embolia, tromoboembolia (coágulo de sangue), anemia falciforme, pressão localizada nas extremidades do corpo e tumores. A hipóxia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de hipóxia hipoxémica (envenenamento por monóxido de carbono; apneia do sono, doença pulmonar obstrutiva crónica, paragem respiratória; shunts), hipóxia anémica (conteúdo 02 baixo), hipóxia hipoxémica e hipóxia histotóxica. A pressão localizada pode ser devida a um torniquete. A composição pode ser administrada antes de, juntamente com, ou após o influxo de oxigénio. O tecido pode ser selecionado a partir do grupo que consiste no trato gastrointestinal, pulmão, rim, figado, sistema cardiovascular, endotélio dos vasos sanguíneos, o sistema 3 nervoso central, o sistema nervoso periférico, músculo, osso e folículo capilar.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 demonstra o nível de creatinina no soro de ratos, durante 5 dias após administração intravenosa de flagelina em concentrações de 0,01 pg, 0,5 pg, 1,0 pg, ou 5,0 pg /corpo. A Fig. 2 demonstra o efeito da flagelina administrado a ratos antes da aplicação da isquemia renal e medição da taxa de sobrevivência e de creatinina após a reperfusão dos rins isquémicos. O painel A apresenta a percentagem de sobrevivência de ratos que foram pré-tratados com flagelina nas concentrações de 0,01 pg, 0,5 pg, 1,0 pg, ou 5,0 pg /corpo ou PBS como controlo. O painel B apresenta o nível de creatinina no mesmo grupo de ratos pré-tratados e de controlo. A Fig. 3 demonstra a histopatologia das células renais isquémicas 24 horas após a reperfusão que foram pré-tratadas com PBS ou flagelina quer em concentrações de 0,01 pg, 0,5 pg, 1,0 pg, ou 5,0 pg /corpo. A coluna de controlo (placebo) indica as células renais isoladas de ratos que não foram impostas com isquemia renal. A Fig. 4 demonstra a histopatologia das células renais, 7 dias após a reperfusão. No primeiro painel, a lâmina histopatológica apresenta as células renais isoladas de rato pré-tratadas com PBS antes da isquemia renal e seguido por reperfusão dos rins isquémicos. No primeiro painel, a lâmina histopatológica apresenta as células renais isoladas de rato pré-tratadas com PBS antes da isquemia renal e 4 seguido por reperfusão dos rins isquémicos. No segundo painel, a lâmina histopatológica apresenta células renais isoladas de rato pré-tratadas com flagelina, numa concentração de 0,5 yg /corpo, mas não impostas com isquemia renal. O terceiro painel demonstra a lâmina histopatológica apresentando células renais isoladas de rato pré-tratadas com flagelina com uma concentração de 0,5 yg/corpo e impostas com isquemia renal e seguida por reperfusão dos rins isquémicos. A Fig. 5 demonstra a análise da infiltração de leucócitos 9 horas e 24 horas após a reperfusão isquémica em células renais isoladas de ratos pré-tratados com PBS ou flagelina a 0,5 yg/corpo. A Fig. 5a apresenta células do tecido renal imuno-histologicamente marcadas para os niveis de infiltração neutrofilica 9 horas e 24 horas após a reperfusão em células renais tratadas isquémicas e não isquémicas de ratos pré-tratados com PBS ou flagelina a 0,5 yg/corpo. A Figura 5b apresenta o número de neutrófilos, macrófagos, células T CD4+, e células T CD8+ que se infiltram nas células do tecido renal, isoladas de ratos pré-tratados com PBS ou flagelina uma concentração de 0,5 yg/corpo. Figura 5c A Fig. 6 demonstra o papel critico das quimiocinas de prevenção da flagelina CXCL1/KC e CXCL2/KC para orientar a infiltração dos leucócitos nos tecidos renais isquémicos. A Fig. 6B demonstra que os niveis de mARN de proteínas em fase aguda IL-Ib e IL-6 mas não os de TNFa foram também reduzidos em rins isquémicos 9 horas após-reperfusão, em animais pré-condicionados com flagelina. A Fig. 7 demonstra os niveis de sobrevivência e de creatinina em grupos de ratos C57BL/6 que foram submetidos a 45 minutos de oclusão pedicular renal bilateral e foram 5 administrados 0,5 yg de flagelina em vários instantes após a remoção das pinças renais. A Fig. 8 demonstra a administração de 0,5 yg de flagelina dentro de 30 minutos de reperfusão isquémica dos rins isquémicos dos ratos tipo selvagem C57BL/6 reconstituídos com medula óssea do tipo selvagem diminuiu os níveis de mARN de CXCL1 e CXCL2. Em recetores MyD88_/“ reconstituído com MyD88_/“ ou medula óssea do tipo selvagem, pouco mARN CXCL1 e CXCL2 foi induzido durante a reperfusão de rins isquémicos e a administração de flagelina durante a reperfusão destes rins não diminuem os níveis de mARN destas quimiocinas. Ao contrário, os recetores do tipo selvagem de medula óssea de dadores MyD88'/_ expressaram níveis elevados de mARN CXCL1 e CXCL2 e estes níveis foram reduzidos pela administração de flagelina durante a reperfusão dos rins isquémicos. A Fig. 9 demonstra as secções renais dos ratos do tipo selvagem C57BL/6 e BALB/c que foram marcadas com anticorpo anti-TLR5. A Figura 9b demonstra que os níveis de expressão de mARN TLR5 foram baixos nos rins antes da imposição da isquemia/reperfusão renal mas aumentou rapidamente durante a reperfusão dos rins isquémicos. A Figura 10 apresenta a estrutura do domínio de flagelina bacteriana. 0 vestígio do esqueleto de Ca, distribuição do núcleo hidrófobo e informação estrutural do F41. Quatro núcleos distintos hidrófobos que definem os domínios Dl, D2a, D2b e D3. Todos os átomos na cadeia lateral hidrófoba são exibidos com o esqueleto de Ca. Os átomos da cadeia lateral são codificados por cores: Ala, amarelo; Leu, He ou Vai, cor-de-laranja; Phe e Tyr, roxo (átomos de carbono) e vermelho (átomos de oxigénio), c, posição e região de várias características estruturais na sequência de 6 aminoácidos da flagelina. São apresentadas, de cima para baixo: o fragmento F41 em azul; três folhas b dobram-se em castanho; a distribuição da estrutura secundária com hélice a em amarelo, estrutura b em verde, e a volta b a roxo; marca de verificação em azul a cada 50 residuos; dominios DO, Dl, D2 e D3; a região de contacto da subunidade axial no interior do proto-elemento em azul ciano; a sequência de aminoácidos bem conservada a vermelho e a região variável em violeta; mutações pontuais no F41 que produzem os elementos de diferentes super-hélices. As letras na parte inferior indicam a morfologia dos elementos mutantes: L (D107E, R124A, R124S, G426A), linear tipo L; R (A449V), linear tipo R; C (D313Y, A414V, A427V, N433D), enrolada33. A Figura 11 apresenta um esquema de dominios de flagelina de Salmonella, seus fragmentos e sua interação com TLR5. As barras escuras indicam regiões do gene da flagelina utilizado para construir os fragmentos compreendendo A, B, C, A' e B'. A Figura 12 ilustra os derivados da flagelina. A estrutura de dominio e os limites próximos (coordenadas de aminoácidos) dos derivados selecionados da flagelina (listados à direita). A flagelina FliC de Salmonella dublin é codificada em 505 aminoácidos (aa) . A Figura 13 apresenta a sequência de nucleótidos e de aminoácidos para as seguintes variantes de flagelina: AA' (SEQ ID N° : 7-8), AB' (SEQ ID N° : 9-10), BA' (SEQ ID N° : 11-12), BB' (SEQ ID N°: 13-14), CA' (SEQ ID N°: 15-16), CB' (SEQ ID N°: 17-18), A (SEQ ID N°: 19-20), B (SEQ ID N°: 21-22), C (SEQ ID N°: 23-24), GST-A' (SEQ ID N°: 25-26), GST-B' (SEQ ID N°: 27-28), AA'nl-170 (SEQ ID N°: 29-30), AA'η1-163 (SEQ ID N° : 33-34), AA'n54-170 (SEQ ID N° : 31-32), AA'n54-163 (SEQ ID N°: 335-36), AB'nl-170 (SEQ ID N° : 37- 7 38), AB'nl-163 (SEQ ID N° : 39-40), AA'nl-129 (SEQ ID N° : 41-42), A A ' n 5 4 -12 9 (SEQ ID N° : 43-44), AB'nl-129 (SEQ ID N°: 45-46), AB'n54-129 (SEQ ID N°: 47-48), AA'nl-100 (SEQ ID N°: 49-50), AB'nl-100 (SEQ ID N°: 51-52), AA'nl-70 (SEQ ID N° : 53-54) e AB'nl-70 (SEQ ID N° : 55-56). A sequência líder pRSETb é apresentada em itálico (a líder inclui Met, que também é o aminoácido 1 da FliC). O domínio constante N terminal é sublinhado. A sequência de aminoácidos ligante está a negrito. O domínio constante C terminal é sublinhado. A GST, se estiver presente, é destacada. A Figura 14A apresenta a histologia do músculo do membro posterior de ratos 14 dias após a reperfusão a seguir a 3 horas de isquemia quente, usando uma mancha de hematoxilina/eosina onde o rato tenha sido administrado com 0,5 pg de CBLB502 em 15 minutos de reperfusão. A Figura 14B apresenta a histologia do músculo do membro posterior de ratos 14 dias após a reperfusão a seguir a 3 horas de isquemia quente, usando uma mancha onde o rato tenha sido administrado com veículo (PBS) em 15 minutos de reperfusão. A Figura 14C apresenta a proporção do edema do tecido húmido/seco no membro de ratos administrados quer com CBLB502 ou PBS dentro de 15 minutos de reperfusão, após 3 horas de isquemia. A proporção do edema foi medido também no membro de ratos administrados com CBLB501 ou PBS, mas poupados a 3 horas de isquemia. A Figura 15 apresenta a proporção de vazamentos vasculares húmidos/secos usando Corante Azul por grama de peso do membro de ratos administrados quer com CBLB501 ou PBS dentro de 15 minutos de reperfusão, após 3 horas de isquemia. A proporção do vazamento vascular foi medida também no membro de ratos administrados com CBLB501 ou PBS, mas poupados a 3 horas de isquemia. A Fig. 15 apresenta a comparação de sequências de aminoácidos da terminação conservada amino (Fig. 15-A) e carboxilo (Fig. 15B) de 21 espécies de bactérias. Os 13 aminoácidos conservados importantes para a atividade TLR5 são apresentados com sombreado. As sequências de aminoácidos são identificadas pelos seus números de adesão TrEMBL (primeira letra = Q) ou Swiss-Prot (primeira letra = P) ·

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os inventores fizeram a surpreendente descoberta de que a flagelina protege contra os efeitos da reperfusão. A ausência ou a diminuição de oxigénio e dos nutrientes do sangue cria uma condição na qual a restauração da circulação resulta em inflamação e danos oxidativos através da indução do stress oxidativo em vez do restabelecimento da função normal. 0 fluxo sanguíneo restabelecido reintroduz o oxigénio dentro das células, o que danifica as proteínas celulares, o ADN e a membrana plasmática. Os danos à membrana celular por sua vez, podem causar a libertação de mais radicais livres. Tais espécies reativas também atuam na sinalização redox para induzir a apoptose de células do tecido isquémico. Além disso, a resposta inflamatória danifica mais ainda o tecido. Os glóbulos brancos transportados para a área pelo sangue que volta renovado, libertam uma série de fatores inflamatórios tais como as interleucinas, bem como radicais livres em resposta ao dano tecidular. Os leucócitos também podem acumular-se em pequenos capilares, obstruindo-os e conduzindo a mais isquemia. Embora não seja demonstrado, teoricamente a flagelina pode fornecer proteção contra os efeitos da reperfusão através da redução do stress oxidativo e inflamatório no tecido evitando assim a apoptose e permitindo uma recuperação mais rápida do tecido para um 9 estado normal. Esta natureza protetora da flagelina pode ser usada quer no início da reperfusão ou ser utilizada para evitar mais danos devidos à reperfusão. A invenção descrita diz respeito, em parte, à administração de flagelina para o tratamento de um tecido de mamífero dos efeitos de reperfusão. 1. Definições. A terminologia utilizada neste documento é apenas para a finalidade de descrever formas de realização particulares e não se destina a ser limitante. Tal como usado na descrição e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente indique o contrário.

Para citar os intervalos numéricos aqui inclusos, cada número interveniente incluído com o mesmo grau de precisão é explicitamente contemplado. Por exemplo, para o intervalo de 6-9, os números 7 e 8 são incluídos, além de 6 e 9, e para intervalo 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são explicitamente contemplados. "Administrar" pode significar uma dose de um agente que induz a atividade NF- KB, significa uma dose única ou doses múltiplas do agente. "Análogo" pode significar, no contexto de um péptido ou polipéptido, um péptido ou polipéptido compreendendo um ou mais aminoácidos não-padrão ou outras variações estruturais do conjunto convencional de aminoácidos. "Anticorpo" pode significar um anticorpo de classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos, seus fragmentos ou derivados, incluindo o Fab, F(ab')2, Fd, e anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e seus derivados. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo purificado po afinidade, ou suas misturas que 10 apresentem especificidade de ligação suficiente para o epitopo desejado ou uma sequência dele derivada. O anticorpo pode ser também um anticorpo quimérico. 0 anticorpo pode ser derivado da ligação de uma ou mais substâncias químicas, porções de péptidos ou polipéptidos conhecidos na arte. O anticorpo pode ser conjugado com uma porção química. A "apoptose" pode significar uma forma de morte celular que inclui a contração progressiva do volume da célula com a preservação da integridade dos organelos citoplasmáticos; a condensação da cromatina (ou seja, condensação nuclear), como vista pela microscopia ótica ou eletrónica; e/ou clivagem do ADN em alguns fragmentos dimensionados, tal como determinado pelos ensaios de sedimentação por centrifugação. A morte celular ocorre quando a integridade da membrana da célula é perdida (p.ex., uma evaginação irregular da membrana) englobando os fragmentos celulares intactos ("corpos apoptóticos") por células fagocíticas. Um "péptido" ou "polipéptido" pode significar uma sequência ligada de aminoácidos e pode ser natural, sintética, ou uma modificação ou combinação de naturais e sintéticas. Os termos "tratando", "tratamento" ou "tratar" podem significar, cada um, aliviar, suprimir, reprimir, eliminar, prevenir ou retardar o aparecimento dos sintomas, sinais clínicos, ou patologia de base de uma condição ou doença, numa base temporária ou permanente. A prevenção da doença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal, antes do início da doença. A supressão da doença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal após a indução da doença, mas antes do seu aparecimento clínico. A repressão da doença envolve administrar uma composição da presente invenção a um animal, após o aparecimento clínico da doença. 11 2. Tratando os Efeitos da Reperfusão É aqui fornecido um método de tratamento dos efeitos da reperfusão por administração a um mamífero em necessidade da mesma, de uma composição compreendendo flagelina. A reperfusão pode ser causada por uma lesão. A reperfusão pode causar danos a um componente corporal quando o fornecimento de sangue regressa ao componente corporal, após a lesão. Os efeitos da reperfusão podem ser mais prejudiciais ao componente corporal do que a lesão em si. Existem vários mecanismos e mediadores da reperfusão incluindo os radicais livres de oxigénio, sobrecarga de cálcio intracelular e a disfunção endotelial. Quantidades excessivas de espécies reativas de oxigénio, quando reintroduzidas num componente corporal previamente danificado, sofrem uma redução sequencial levando à formação de radicais livres de oxigénio. Os radicais oxidantes potentes, tais como o anião superóxido, radical hidroxilo, e peroxinitrite, podem ser produzidos dentro de poucos minutos a partir do refluxo para o componente corporal e podem desempenhar um papel crucial no desenvolvimento da lesão de reperfusão. Os radicais livres de oxigénio também podem ser gerados a partir de outras fontes, além da redução do oxigénio molecular. Estas fontes incluem enzimas, tais como a xantina oxidase, citocromo oxidase, e ciclo-oxigenase e a oxidação de catecolaminas. A reperfusão também é um potente estímulo para a ativação e a acumulação de neutrófilos, o que por sua vez servem como potentes estímulos para a produção de espécies reativas de oxigénio. Especificamente, os principais produtos da queima respiratória dos neutrófilos são agentes oxidantes fortes incluindo o peróxido de hidrogénio, radicais livres de oxigénio e hipoclorito. Os neutrófilos são o tipo mais abundante de fagócitos, normalmente representando 50 a 60% do total dos leucócitos circulantes e geralmente são as 12 primeiras células a chegar ao local do componente corporal danificado. Os radicais livres drivados do oxigénio produzem danos por reagir com ácidos gordos poli-insaturados, resultando na formação de peróxidos lipídicos e hidroperóxidos que danificam o componente corporal e prejudicam o funcionamento de sistemas enzimáticos ligados à membrana. Os radicais livres estimulam a libertação endotelial do fator ativador de plaquetas e de quimiocinas, tais como o fator ativador dos neutrófilos, a quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1 e quimiocina (motivo C-X-C) ligando 1 que atrai mais neutrófilos e amplifica a produção de radicais oxidantes e o grau da lesão de reperfusão. As espécies reativas de oxigénio também atenuam o óxido nítrico, exagerando a lesão endotelial e a disfunção das células e tecidos. Além de um aumento na produção, existe também uma deficiência relativa nas enzimas endógenas de limpeza de oxidantes, que exageram adicionalmente a disfunção cardíaca mediada por radicais livres. A reperfusão pode ainda resultar numa acentuada disfunção das células endoteliais. A disfunção endotelial facilita a expressão de um fenótipo pro-trombótico caracterizado por ativação de neutrófilos e plaquetas, importantes mediadores da reperfusão. Uma vez os neutrófilos entrando em contato com o endotélio disfuncional, eles são ativados e, numa série de etapas bem definidas (enrolamento, adesão firme e transmigração) migram para zonas de lesão tecidular através de junções das células endoteliais como parte da resposta imune inata.

As alterações na homeostase intracelular do cálcio desempenham um importante papel no desenvolvimento da reperfusão. A reperfusão pode ser associada ao aumento de cálcio intracelular; este efeito pode estar relacionado com uma maior entrada de cálcio sarcolemal por canais de cálcio do tipo-L ou pode ser secundária para alterações no ciclo do cálcio no retículo sarcoplasmático. Além da sobrecarga 13 de cálcio intracelular, alterações na sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio têm sido implicadas na reperfusão. A ativação de proteases cálcio-dependentes (calpaína I) com consequente proteólise miofibrilar foi sugerida como sublinhando a lesão de reperfusão, tal como a proteólise da troponina. A reperfusão de células do tecido submetido a uma lesão têm um metabolismo celular alterado, que, por sua vez, podem contribuir para retardar a recuperação funcional. Por exemplo, uma lesão pode induzir o metabolismo anaeróbio numa célula com uma produção em rede de lactato. A libertação de lactato persiste durante a fase de reperfusão, sugerindo um atraso na recuperação do metabolismo aeróbio normal. Da mesma forma, a atividade do piruvato desidrogenase mitocondrial (PDH) pode ser inibida até 40% após uma lesão e pode permanecer deprimida até 30 minutos após a reperfusão.

Cada um desses eventos durante a reperfusão pode levar ao stress das células do tecido e morte celular programada (apoptose) e necrose das células do tecido. A apoptose normalmente funciona para "limpar" os tecidos das células feridas e geneticamente danificadas, enquanto as citocinas servem para mobilizar o sistema de defesa do organismo contra o agente patogénico. No entanto, em condições de danos graves, ambos os mecanismos de resposta ao stress podem, or si só, atuar como causas de morte. a. Flagelina A flagelina pode ser um polipéptido relacionado com a flagelina. A flagelina pode ser de qualquer origem, incluindo uma variedade de espécies de bactérias Gram- positivas e Gram- negativas. A flagelina pode ter a sequência de aminoácidos de uma das 23 flagelinas de espécies de bactérias que estão representadas na figura 7 14 da Publicação da Patente U.S N° 2003/0044429, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência. As sequências nucleotidicas que codificam para os polipéptidos de flagelina listados na figura 7 do documento U.S. 2003/0044429 estão publicamente disponiveis através de fontes, que incluem a base de dados do NCBI Genbank. A flagelina pode ser o componente principal do flagelo bacteriano. A flagelina pode ser composta por três dominios (Fig. 10) . O domínio 1 (Dl) e o domínio 2 (D2) podem ser descontínuos e podem ser formados quando resíduos na terminação amino e na terminação carboxilo são justapostos por meio da formação de uma estrutura em grampo. As terminações amino e carboxilo compreendendo os domínios Dl e D2 podem ser as mais conservadas, considerando que o domínio médio hipervariável (D3) pode ser altamente variável. Os estudos com uma proteína recombinante contendo os amino Dl e D2 e os carboxilo Dl e D2 separados por uma dobradiça Escherichia coli (ND1-2/ECH/CD2) indicam que os Dl e D2 podem ser bioativos quando acoplados a um elemento ECH. Esta quimera, mas não a dobradiça isoladamente, pode induzir a degradação de IkBa, a ativação de NF-kB e a produção de NO e IL-8 em duas linhas de células epiteliais intestinais. 0 domínio D3 não conservado pode estar na superfície do filamento flagelar e pode conter os principais epítopos antigénicos. A atividade pró-inflamatória potentes da flagelina pode residir nas regiões dos Dl e D2 N e C altamente conservadas. A flagelina pode induzir a atividade NF-kB através da ligação ao recetor 5 semelhante a Toll (TLR5). A família TLR pode ser composta por, pelo menos, 10 membros e é essencial na defesa imune inata contra agentes patogénicos. O sistema imune inato pode reconhecer padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) que são conservados em agentes patogénicos microbianos. O TLR pode reconhecer uma estrutura conservada que é particular para a 15 flagelina bacteriana. A estrutura conservada pode ser composta por um grande grupo de resíduos, que são, de algum modo, permissivos à variação no conteúdo em aminoácidos. Smith et al., Nat Immunol. 4:1247-53 (2003) identificaram 13 aminoácidos conservados na flagelina que são parte da estrutura conservada reconhecida pelo TLR5. Os 13 aminoácidos conservados da flagelina que podem ser importantes para a atividade do TLR5 são apresentados na Fig. 11. A flagelina pode pertencer a uma espécie de Salmonela, um exemplo representativo do que pode ser a S. dublin (codificado pelo Número de Adesão GenBank M84972) (SEQ ID N°: 1). O polipéptido relacionado com a flagelina pode ser um fragmento, variante, análogo, homólogo, ou derivado da SEQ ID N°: 1, ou uma sua combinação, que se liga ao TLR5 e induz a atividade mediada pelo TLR5, tal como a atividade das NF-kB. Um fragmento, variante, análogo, homólogo ou derivado da flagelina pode ser obtido através de um desenho com base racional, baseado na estrutura do domínio da Flagelina e na estrutura conservada reconhecida pelo TLR5. A flagelina pode compreender, pelo menos, 10, 11, 12, ou 13 dos 13 aminoácidos conservados apresentados na Fig. 11 (posições 89, 90, 91, 95, 98, 101, 115, 422, 423, 426, 431, 436 e 452). A flagelina pode ser pelo menos 30-99% idêntica aos aminoácidos 1 174 e 418 505 da SEQ ID N°: 1. A Fig. 26 lista a percentagem de identidade das terminações amino- e carboxilo- da flagelina com a atividade estimuladora do TLR5 conhecida, quando comparada com a SEQ ID N°: 1. A flagelina pode ser um polipéptido de flagelina de qualquer espécie de bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa incluindo, mas não se limitando a, polipéptidos de flagelina divulgados na Pub. Pat. U.S. 2003/000044429, cujos conteúdos são incorporados neste documento, e os péptidos de flagelina correspondentes aos números de adesão listados nos resultados BLAST apresentados na Fig. 25 da 16

Pub. da Pat. U.S. 2003/000044429, ou suas variantes. A flagelina pode estimular a atividade do TLR5. Foram feitos vários mutantes delecionais da flagelina que mantêm pelo menos alguma atividade estimulante do TLR5. A flagelina pode ser um mutante delecional divulgado nos exemplos aqui inclusos e pode compreender uma sequência traduzida com o Número de Adesão GenBank, D 13689, carecendo dos aminoácidos 185-306 ou 444-492, ou com o Número de Adesão GenBank M84973 carecendo dos aminoácidos 179-415, ou uma sua variante. A flagelina pode compreender inserções do transposão e alterações ao dominio D3 variável. 0 dominio D3 pode ser substituído em parte, ou na totalidade, com uma dobradiça ou um polipéptido ligante que permite que os dominios Dl e D2 dobrem corretamente, de modo que a variante estimule a atividade do TLR5. Os elementos da variante dobradiça podem ser encontrados na proteina MukB de E. coli e podem ter uma sequência conforme estabelecida nas SEQ ID N°s: 3 e 4, ou uma sua variante.

Outros agentes podem ser utilizados para alvejar os recetores TLR5. Estes agentes podem ser agonistas do TLR5 e estimular a atividade do TLR5. O agonista pode ser um anticorpo anti-TLR5 ou outra molécula pequena. b. Lesões

Os efeitos da reperfusão podem ser causados por uma lesão no componente corporal. As lesões podem ser devidas à isquemia, hipóxia, enfarte, ou uma embolia. O tratamento das lesões pode levar a reperfusão e danos adicionais ao componente corporal. (1) Isquemia 17 A isquemia pode ser uma escassez absoluta ou relativa do fornecimento de sangue a um componente corporal. A escassez relativa pode ser uma incompatibilidade, no entanto, pequena do sangue fornecido (distribuição do oxigénio) a um componente corporal vs. o sangue necessário para um componente corporal fazer a oxigenação adequada. A isquémia também pode ser um fluxo inadequado de sangue a uma parte do corpo devido a uma constrição ou obstrução dos vasos sanguíneos que o fornecem e pode afetar qualquer componente corporal no corpo. Um fornecimento de sangue insuficiente faz com que os componentes do organismo se tornem hipóxicos, ou, se não for fornecido oxigénio de todo, anóxicos. Isto pode causar necrose. Os mecanismos de isquemia podem variar muito. Por exemplo, a isquemia para qualquer componente corporal pode ser devida a taquicardia (batimento anormalmente rápido do coração), aterosclerose (placa carregada de lipidos obstruindo o lúmen das artérias), hipotensão (pressão arterial baixa no choque sético, insuficiência cardiaca), tromboembolismo (coágulos sanguíneos), compressão exterior de vasos sanguíneos (tumor), embolias (corpos estranhos na circulação, p.ex., embolia do fluido amniótico), anemia falciforme (hemoglobina anormalmente formada) enfartes, forças g induzidas que restringem o fluxo de sangue e forçam o sangue para as extremidades do corpo, frio extremo localizado devido a ulcerações, gelo, terapia de compressão por frio inadequada, e qualquer outra força que restringe o fluxo sanguíneo para as extremidades, como um torniquete. A força para restringir o fluxo sanguíneo às extremidades pode ser necessária devido a lacerações graves, incisões, perfurações, tais como um esfaqueamento, lesões por esmagamento devido a trauma causado por uma força brusca, e trauma balístico causado por arma ou ferimentos causados por estilhaços. A isquémia pode ser uma caracteristica das doenças do coração, colite isquémica, 18 ataques de isquémia transitórios, acidentes vasculares cerebrais, lesão renal aquda, ruptura de malformações arteriovenosas e doença oclusiva arterial periférica. (2) Hipóxia A hipóxia pode ser a privação do fornecimento adequado de oxiqénio. A hipóxia pode ser uma condição patológica em que o corpo como um todo (hipóxia generalizada) ou uma região do corpo (hipóxia tecidular) é privado do fornecimento adequado de oxigénio. Uma variação dos niveis de oxigénio arterial no pode ser devida a uma incompatibilidade entre o fornecimento e a necessidade de oxigénio dos componentes do corpo. A completa privação do fornecimento em oxigénio é a anóxia. A hipóxia pode ser hipóxia hipoxémica, hipóxia anémica, hipóxia hipoxémica, hipóxia histotóxica, hipóxia histotóxica e hipóxia isquémica. A hipóxia hipoxémica pode ser um fornecimento inadequado de oxigénio ao corpo como um todo, causada pela baixa pressão parcial do oxigénio no sangue arterial. A hipóxia hipoxémica pode ser devida à baixa pressão parcial do oxigénio atmosférico, tal como em altitudes elevadas, substituição do oxigénio na mistura de respiração da atmosfera modificada como um esgoto, substituição de oxigénio intencionalmente, como no uso recreativo de óxido nitroso, uma diminuição na saturação por oxigénio do sangue devida à apnéia do sono, ou hipopnéias, ventilação pulmonar inadequada, tal como a doença pulmonar obstrutiva crónica ou paragem respiratória, "shunts" anatómicos ou mecânicos na circulação pulmonar ou um shunt da direita para a esquerda no coração e no pulmão. Os shunts podem causar o colapso dos alvéolos que ainda são perfundidos ou um bloco na ventilação para uma área do pulmão. Os shunts podem 19 apresentar sangue destinado ao sistema pulmonar para não ser ventilado e evitar trocas gasosas devido aos vasos Thebesia vazios no ventrículo esquerdo e à circulação brônquica, que alimenta os brônquios com o oxigénio. A hipóxia anémica pode ser o teor total em oxigénio que é reduzido, mas a pressão arterial de oxigénio é normal. A hipóxia hipoxémica pode ser quando o sangue não consegue fornecer oxigénio aos componentes alvo do corpo. A hipóxia hipoxémica pode ser causada por intoxicação com monóxido de carbono que inibe a capacidade da hemoglobina para libertar o oxigénio ligado a ela, ou meta-hemoglobinemia, uma hemoglobina anormal que se acumula no sangue. A hipóxia histotóxica pode ser devida à incapacidade de efetivamente usar oxigénio devido a enzimas deficientes de fosforilação oxidativa. (3) Enfarte 0 enfarte é um tipo de condição patológica que pode causar isquemia. 0 enfarte pode ser uma área macroscópica do tecido necrótico que causou a perda de um fornecimento sanguíneo adequado devido a uma oclusão. 0 enfarte pode ser um enfarte branco composto por plaquetas e provocar a necrose em tecidos de órgãos tais como o coração, baço e rins. 0 enfarte pode ser um enfarte vermelho composto por glóbulos vermelhos e cadeias de fibrina em tecidos de órgãos do pulmão. A doença associada ao enfarte pode incluir o enfarte do miocárdio, embolia pulmonar, acidente vascular cerebral (AVC), insuficiência renal aguda, doença oclusiva arterial periférica (por exemplo, gangrena) , sindrome do anticorpo anti-fosfolipidico, sepsis, artrite das células gigantes, hérnia e vólvulo. (4) Embolia 20 A embolia é um tipo de condição patológica que pode causar isquémia. A embolia pode ser um objeto que migra de uma parte do corpo e causa uma oclusão ou bloqueio de um vaso sanguíneo noutra parte do corpo. Uma embolia pode ser tromboembolia, embolia gorda, embolia gasosa, embolia sética, embolia tecidular, embolia devida a um corpo estranho, embolia do líquido amniótico. A tromboembolia pode ser um coágulo sanguíneo que está totalmente ou parcialmente isolado do local da trombose. A embolia gorda pode ser tecido adiposo endógeno que escapa para a circulação sanguínea. A fratura dos ossos é um exemplo de um vazamento de tecido gordo para os vasos e artérias lesionados. A embolia gasosa pode ser uma rutura dos alvéolos e o ar inalado vai para dentro dos vasos sanguíneos. A punção da veia subclávia ou terapia intravenosa são exemplos de fuga de ar para os vasos sanguíneos. Uma embolia gasosa pode ser provocada por gases como o azoto e o hélio por serem insolúveis e formarem pequenas bolhas no sangue. c. Componente Corporal A presente invenção refere-se ao tratamento de um componente do corpo de um mamífero. O componente do corpo pode ser um órgão, um tecido ou uma célula. O componente do corpo pode ser proveniente de um abdómen, acetábulo, tecido adiposo, córtex adrenal, na glândula adrenal, medula adrenal, macrófago alveolar, âmnio, aorta, artéria, ascite, líquido ascítico, gânglio linfático axilar, bexiga, sangue, ossos, medula óssea, intestino, cérebro, mama, brônquio, cartilagem, tronco caudal, cerebelo, colo do útero, vilosidade coriónica, cólon, membrana conjuntiva, tecido conjuntivo, córnea, derme, gânglio da raiz dorsal, duodeno, displasia da mucosa da língua, ovo, embrião, sistema 21 endócrino, endométrio, endotélio, epiderme, epitélio, eritropoiético, olho, fibroblasto, barbatana, feto, pé, prepúcio, gânglio de Gasser, estroma gengival, gónada, gânglio linfático inguinal, coração, úmero, ileo, intestino, ileocecal, ileo, ilhéus de Langerhans, rim, larvas, larvar, laringe, fígado, pulmão, pulmão (bronquioalveolar), linfa, gânglios linfáticos, tecido linfático, linfóide, órgãos linfóides, mamária, gânglios alveolares mamários, glândula mamária, mesonefros, mesotélio, ecdise ninfal, boca, músculo, nasal, septo nasal, sistema nervoso, neural, junção gastro-esofágica, esófago, oral, ovárica, mesênquima do palato, pancreas, ovário papilar, pénis, sangue periférico, peritoneu, faringe, hipófise, placenta, derrame pleural, líquido pleural, próstata, ovário pupal, reto, retina, gânglio linfático axial direito, dueto salivar, glândula salivar, músculo esquelético, pele, intestino delgado, intestino delgado, tecidos moles, baço, esterno, estômago, cauda, testículo, testículos, coxa, timo, tiróide, glândula tiróide, língua, amígdalas, traqueia, tronco, corneto, cordão umbilical, umbigo, útero, vagina, vísceras, vulva, trato gastrointestinal, pulmões, rins, fígado, sistema cardiovascular, endotélio dos vasos sanguíneos, sistema nervoso central e periférico, músculo, osso, folículos capilares e saco vitelino. 3. Composição A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de flagelina. A composição pode ser uma composição farmacêutica, que pode ser produzida através de métodos bem conhecidos na arte. A composição pode também compreender um co-agente. Como descrito acima, a composição pode ser 22 administrada a um mamífero para tratar os efeitos da reperfusão. a. Administração A administração de composições utilizando o método aqui descrito pode ser por via oral, parentérica, sublingual, transdérmica, retal, transmucosal, tópica, inalatória, administração bucal, ou suas combinações. A administração parentérica inclui, mas não está limitada a, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intratecal e intra-articular. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação adequada aceitável, de acordo com a prática veterinária normal. 0 veterinário pode facilmente determinar a posologia e a via de administração, que é mais apropriada para um determinado animal. As composições podem ser administradas a um paciente humano, gato, cão, animal de grande porte, ou uma ave. A composição pode ser administrada simultaneamente ou metronomicamente com outros tratamentos. 0 termo "simultâneo" ou "simultaneamente" como usado aqui, significa que a composição e outro tratamento pode ser administrado com um intervalo de 48 horas, de preferência, 24 horas, mais preferencialmente 12 horas, ainda mais preferencialmente 6 horas, do modo mais preferido, 3 horas ou menos, entre si. 0 termo "metronomicamente" como usado aqui significa a administração da composição em instantes diferentes do outro tratamento e a uma certa frequência relativa à administração repetida. A composição pode ser administrada em qualquer ponto anterior à reperfusão, incluindo cerca de 120 hr, 118 hr, 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr, 106 hr, 104 hr, 102 hr, 100 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr, 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 23 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr, 56 hr, 54 hr, 52 hr, 50hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr, 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr , 14 hr, r 12 hr, , 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr , 2 hr, 1 hr, 55 : mins • r 50 mins. / L- 15 mins. , 4 C ) mi ns . , 35 min s . , 30 min s., 25 min: 3 · , 20 mins • r 15 mins :, 1( 0 mins, 9 mins , 8 min s, 7 mins. , 6 min s., 5 mi ns . , 4 min s . , 3 mins, 2 mins , e 1 min ante s da repe rfus ão. A composi ção pode ser admini str, ada em qualquer ponto anterior à le são, in .clui ndo cerca de 120 hr, 11 8 hr , 116 hr, 114 hr, 112 hr, 110 hr, 108 hr ·, i 06 hr, 104 hr, 102 hr, 1 00 hr, 98 hr, 96 hr, 94 hr, 92 hr , 90 hr, 88 hr, 86 hr, 84 hr, 82 hr, 80 hr, 78 hr, 76 hr, 74 hr, 72 hr, 70 hr, 68 hr, 66 hr, 64 hr, 62 hr, 60 hr, 58 hr , 56 hr, 54 : hr, 52 hr , 50hr, 48 hr, 46 hr, 44 hr, 42 hr, 40 hr, 38 hr, 36 hr, 34 hr, 32 hr, 30 hr, 28 hr, 26 hr, 24 hr , 22 hr, 20 hr, 18 hr, 16 hr, 14 hr, 12 hr, 10 hr, 8 hr, 6 hr, 4 hr, 3 hr, 2 hr, 1 hr , 55 mi ns . , 50 mi ns . , 45 min s . , 40 min s., 35 mins ·, 3 0 mins. 2 5 mi .ns . , 20 mi ns . , 15 min s, 10 ] mins , 9 min s, 8 min s, 7 mins. , 6 min s., 5 mins. , 4 min s . , 3 mi ns, 2 min lS, e 1 min ante s da lesão. A composição pode ser administrada em qualquer ponto após a reperfusão , incluindo cerca de 1 ] min, 2 mins., 3 mi ns. , 4 min s., 5 mins • r 6 : mins • r 7 mins. 8 mins . , 9 min s., 10 min s., 15 mins • r 20 mins • r 25 mins ., 30 mins. , 35 mins., 40 min s. , 45 mins., 50 min s. , 55 min s., 1 hr, 2 hr, 3 hr , 4 hr, 6 hr, 8 hr, 10 : hr, 12 hr, 14 hr, 16 hr, 18 hr, 20 hr, 22 hr, 24 hr, 26 hr, 28 hr, 30 hr, 32 hr , 34 hr, 36 hr, 38 hr, 40 hr, 42 hr, 44 hr, 46 hr, 48 hr, 50 hr, 52 hr, 54 hr, 56 hr, 58 hr, 60 hr, 62 hr, 64 hr, 66 hr , 68 hr, 70 hr, 72 hr, 74 hr, 76 hr, 78 hr, 80 hr, 82 hr, 84 hr, 86 hr, 88 hr, 90 hr, 92 hr, 94 hr, 96 hr, 98 hr, 100 hr, 1 02 hr, 1 04 hr, 106 hr , ic ) 8 hr, 110 hr, 112 hr , i 14 hr, 116 hr, 118 hr , e 120 hr após a reperfusão. b. Formulação 24 0 método pode compreender a administração de uma composição para tratar os efeitos da reperfusão. As composições aqui fornecidas podem estar na forma de comprimidos ou pastilhas formulados de forma convencional. Por exemplo, os comprimidos e as cápsulas para administração por via oral podem conter excipientes convencionais incluindo, mas não se limitando a, agentes aglomerantes, de preenchimento, lubrificantes, desintegrantes e humectantes. Os agentes aglomerantes incluem, mas não estão limitados a, xarope, acacia, gelatina, sorbitol, goma adragante, mucilagem de amido, polivinilpirrolidona. Os agentes de preenchimento incluem, mas não estão limitados a, lactose, açúcar, celulose microcristalina,amido de milho, fosfato de cálcio e sorbitol. Os lubrificantes incluem, mas não estão limitados a, estearato de magnésio, ácido esteárico, talco, polietilenoglicol e silica. Os desintegrantes incluem, mas não estão limitados a, fécula de batata e sódioglicolato de amido. Os agentes humectantes incluem, mas não estão limitados a, laurilssulfato de sódio. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na arte.

As composições aqui fornecidas podem também ser formulações liquidas, incluindo, mas não se limitando a, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes e elixires. As composições também podem ser formuladas como um produto seco para a constituição com a água ou outro veiculo adequado antes da utilização. Tais preparações liquidas podem conter aditivos, incluindo, mas não se limitando a, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, veículos não aquosos e conservantes. 0 agente de suspensão inclui, mas não está limitado a, xarope de sorbitol, metil-celulose, xarope de glicose/açúcar, gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumínio e gorduras hidrogenadas comestíveis. Os agentes emulsionantes 25 incluem, mas não estão limitados a, lecitina, mono-oleato de sorbitano e acacia. Os veículos não aquosos incluem, mas não estão limitados a, óleos comestíveis, óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos, propileno glicol e álcool etílico. Os conservantes incluem, mas não estão limitados a p-hidroxibenzoato de metilo ou propilo e ácido sórbico.

As composições aqui fornecidas também podem ser formuladas como supositórios, que podem conter bases supositórias incluindo, mas não se limitando a, manteiga de cacau ou glicéridos. As composições aqui fornecidas podem também ser formuladas para a inalação, que podem estar sob a forma de, incluindo mas não se limitando a, uma solução, suspensão ou emulsão que pode ser administrada como um pó seco ou sob a forma de aerossol utilizando um propulsor, tal como o diclorodifluorometano ou o tricloromonofluorometano. As composições aqui fornecidas podem também ser formuladas como formulações transdérmicas compreendendo veículos aquosos ou não aquosos, incluindo, mas não se limitando a, cremes, pomadas, loções, pastas, gesso terapêutico, adesivo, ou membrana.

As composições aqui fornecidas podem também ser formuladas para a administração parentérica, incluindo, mas não se limitando, por injeção ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser na forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, incluindo, mas não se limitando a, agentes de suspensão, estabilização e agentes dispersantes. A composição também pode ser fornecida na forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, incluindo, mas não se limitando a, água estéril, isenta de pirógenos. As composições fornecidas neste documento também podem ser formuladas como uma preparação do depósito, que pode ser administrada por implante ou por injeção intramuscular. As composições podem ser formuladas com materiais poliméricos 26 ou hidrófobos adequados (como uma emulsão num óleo aceitável, por exemplo), resinas permutadoras de iões, ou como derivados parcialmente solúveis (como um sal moderadamente solúvel, por exemplo). d. Dosagem 0 método pode compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição para um paciente em necessidade da mesma. A quantidade terapeuticamente eficaz necessária para uso na terapia varia de acordo com a natureza da condição a ser tratada, o tempo desejado para aumentar as células-tronco hematopoéticas na corrente sanguinea e a idade/condição do paciente. No entanto, em geral, as doses empregues para o tratamento de humanos adultos tipicamente estão na faixa de 0,001 mg/kg até cerca de 200 mg/kg por dia. A dose pode ser de cerca de 1 pg/kg até cerca de 100 pg/kg por dia. A dose desejada pode ser convenientemente administrada numa dose única, ou como várias doses administradas em intervalos adequados, por exemplo, como dois, três, quatro ou mais sub-doses por dia. Múltiplas doses podem ser desejadas ou necessárias. A dose pode ser qualquer dose incluindo, mas não se limitando a cerca de 0, 1 pg/kg, 0,2 : pg/kg, 0,3 pg/kg, 0,4 pg/kg, 0,5 pg/kg, 0, 6 pg/kg, 0,7 pg/kg, 0,8 pg/kg, 0,9 pg/kg, 1 pg/kg, 25 pg/kg, 50 pg/kg , 75 pg/kg, 100 pg/kg, 125 pg/kg, 150 pg/kg, 175 pg/kg , 200 pg/kg, 225 pg/kg, 250 pg/kg, 275 pg/kg, 300 pg/kg, 325 pg/kg, 350 pg/kg, 375 pg/kg, 400 pg/kg, 425 pg/kg, 450 pg/kg, 475 pg/kg, 500 pg/kg, 525 pg/kg, 550 pg/kg, 575 pg/kg, 600 pg/kg, 625 pg/kg, 650 pg/kg, 675 pg/kg, 700 pg/kg, 725 pg/kg, 750 pg/kg, 775 pg/kg, 800 pg/kg, 825 pg/kg, 850 pg/kg, 875 pg/kg, 900 pg/kg, 925 pg/kg, 950 pg/kg, 975 pg/kg ou 1 mg/kg. 27 4. Co-agente A flagelina ou a composição pode ser co-administrada com um co-agente. 0 co-agente pode ser qualquer composto que retarda ou impede os efeitos da reperfusão. 0 co-agente pode ser um antioxidante. Os antioxidantes podem ser capazes de diminuir e prevenir a oxidação de outras moléculas, células, tecidos ou órgãos. 0 antioxidante pode ser a vitamina E, ácido ascórbico, glutationo, ácido lipóico, ácido úrico, carotenos tais como o β-caroteno e retinol, vitamina E e coenzima Q, tióis, tais como cisteína, cisteamina, glutationo e bilirrubina, amifostina e flavonóides. 0 co-agente pode ser um inibidor do antiporte sódio-hidrogénio. A lesão e a reperfusão podem resultar numa em acidose intracelular acentuada. Um inibidor do antiporte de sódio-hidrogénio pode ser usado para reduzir a extrusão de protões e evitar aumentos do Ca2+. Um inibidor de sódio-hidrogénio pode ser cariporida. 0 co-agente pode ser insulina. A insulina pode ser usada para estimular a atividade PDH e evitar a inibição da actividade PDH após a reperfusão. 0 co-agente pode ser adenosina. A adenosina pode ser usada para abrir canais de KATP mitocondrial. 5. Tratamento de Combinação 0 método pode ser utilizado em combinação com outros métodos para tratar a lesão. Os outros métodos podem ser os tratamentos do enfarte do miocárdio (ataque cardiaco), embolia pulmonar, acidente vascular cerebral (AVC), doença arterial periférica oclusiva (por exemplo, gangrena), sindrome do anticorpo anti-fosfolipídico, sepsis, artrite de células gigantes, hérnia, vólvulo, cancros do tumor 28 sólido, doença de descompressão, anemia falciforme, punção da veia subclávia, fraturas ósseas, doença de altitude elevada, o uso recreativo de óxido nitroso, apneia do sono, hipopneias, shunts, anemia, envenenamento por monóxido de carbono, meta-hemoglobinemia, tromboembolia, embolia gorda, embolia gasosa, embolia sética, embolia do tecido, embolia por presença de corpo estranho, embolia do liquido amniótico, forças g induzidas e pressão externa para evitar o fluxo de sangue devido a cortes graves, castração, ou mutilação. 0 método também pode ser usado em combinação com métodos de tratamento das lesões por reperfusão como a administração de doses baixas de sulfato de hidrogénio (H2S) , glisodeno, ou glialina de trigo, ou executando a hipotermia terapêutica ou pinçamento aórtico. A presente invenção tem múltiplos aspetos, ilustrados pelos seguintes exemplos não-limitantes.

Exemplo: 1

Proteção da flagellna dependente da dose sobre a função renal [a flagellna pode ser um agonlsta do TLR5]

Para determinadas doses, a flagelina não afeta a função renal. Este efeito foi demonstrado através da medição dos niveis de creatinina no soro de ratos após a administração sistémica de diferentes doses de flagelina. Os ratos C57BL/6 foram injetados quer com 0,01 yg, 0,5 yg, 1,0 yg, ou 5,0 yg de flagelina e os niveis de creatinina sérica (mg/dL) foram monitorizados diariamente, como apresentado na Figura 1. A administração de 5 yg de flagelina resultou em concentrações no soro aumentadas que foram evidentes em 24 horas após a administração. Depois de 24 horas adicionais (48 horas no total), os níveis de creatinina atingiram um pico e, em seguida, diminuíram novamente para 29 os níveis de base 72 horas após a administração e, em seguida, começaram a aumentar lentamente para níveis baixos novamente (Figura 1). Ao contrário, a administração de 1 yg de flagelina também induziu um aumento nos níveis de creatinina do soro, mas esta só foi detetada como um único pico após 48 horas e em seguida, caiu para os níveis de base 72 horas após a administração. A administração de 0,5 yg e 0,1 yg não induziu quaisquer aumentos mensuráveis nos níveis de creatinina sérica durante todo o período do estudo.

Exemplo 2

Efeito da flagelina dependente da dose sobre a função renal

Para determinadas doses, a flagelina é capaz de proteger o tecido renal de um mamífero dos efeitos de isquemia renal aguda. Este efeito foi demonstrado por administração da flagelina a ratos antes da imposição da isquemia renal e medição da taxa de sobrevivência seguindo-se a reperfusão dos rins isquémicos. Especificamente, 30 minutos antes de serem submetidos a 45 minutos de oclusão do pedículo renal bilateral, grupos de ratos C57BL/6 foram administrados com várias doses de flagelina (0,01 yg, 0,5 yg, 1,0 yg ou 5,0 g por [mu] corpo) em 400 yL de PBS ou PBS isoladamente (400 yL) através da administração intravenosa. A sobrevivência dos ratos, os níveis de creatinina no soro e os dados de histopatologia foram então recolhidos. a. Sobrevivência A oclusão do pedículo renal bilateral foi realizada em ratos como anteriormente detalhado (REFERÊNCIAS). Os ratos foram administrados com 20U (unidades/mL) de heparina 30 sódica por via da administração intraperitoneal 20 minutos antes da cirurgia. Os ratos foram anestesiados com fenobarbital e mantidos quentes sob uma lâmpada de 60W até à cirurgia. Em condições asséticas, a cavidade abdominal foi aberta com uma incisão na linha média e o pediculo renal bilateral foi ocluido não-traumaticamente com uma pinça microvascular (World Precision Instruments, Sarasota, FL) e a lesão foi temporariamente fechada com sutura de seda 4-0. Os ratos foram colocados sobre um bloco térmico sob uma lâmpada de 60 Watts e a ponta do sensor do Termómetro de Monitorização da Memória Certificada Rastreável(TM) (Fisher Scientific) foi colocada na cavidade abdominal para garantir a manutenção da temperatura a 32 °C, durante a imposição da isquemia renal. Os rins foram submetidos a isquemia durante 45 minutos. Após a remoção da pinça, a reperfusão renal imediata e completa foi confirmada visualmente e a cavidade peritoneal foi fechada. Os ratos operados com placebo foram tratados de forma idêntica exceto para o grampo bilateral do pediculo renal. No grupo de controlo, que recebeu PBS sem flagelina, 80% dos animais morreram no prazo de 5 dias após a reperfusão dos rins isquémicos (ver Figura 2a) . Todos os animais que receberam 5 yg de flagelina antes da imposição da isquemia renal morreram no prazo de 5 dias após a reperfusão. Ao contrário, todos os animais que receberam quer 1 ou 0,5 yg de flagelina antes da isquemia renal sobreviveram mais de 45 dias após a reperfusão. O efeito protetor da flagelina na isquemia renal aguda foi também observado como sendo dependente da dose nos animais que receberam 0,1 ou 0,01 yg não foram protegidos contra a lesão. b. Medição da função renal

Os niveis de creatinina no soro também foram medidos para determinar o efeito protetor da flagelina sobre a função 31 renal. Os ratos operados com placebo e os ratos submetidos a lesão renal bilateral IFR foram anestesiados com isofluorano e sangrados pelo plexo pós-orbital usando um tubo microcapilar revestido com heparina em intervalos de 24 horas. 0 soro foi armazenado a -80 °C, até à medição. Os niveis de creatinina no soro foram medidos utilizando o Kit de Creatinina (Sigma Diagnostics, Inc., St Louis, MO) . O efeito protetor da flagelina foi refletido pelos baixos niveis de creatinina no soro determinados 24 horas após a reperfusão em animais que receberam 1,25 ou 0,5 yg flagelina 30 minutos antes da imposição da isquemia (ver Figura 2b) . Os animais que receberam doses baixas não protetoras da flagelina (0,1 e 0,01 [mu] g) tinham niveis mais elevados dos níveis de creatinina que caíram um pouco abaixo daqueles observados no grupo de controlo, que recebeu PBS 30 minutos antes da oclusão do pedículo bilateral. c. Estudos Histológicos do Tecido Renal

Os níveis elevados de creatinina no soro, uma indicação da disfunção renal induzida pela imposição de lesão de isquemia-reperfusão, foram suportados pela histopatologia dos rins isquémicos, 24 horas após a reperfusão (ver Figura 3) . Para a imuno-histoquímica, os rins recuperados foram reduzidos para metade, embebidos em composto OCT (Sakura Finetek U.S.A., Torrence, CA), e imediatamente congelados em azoto líquido. As secções coronais foram cortadas (7 mm), montadas em lâminas, secas durante 1 hora e, em seguida, fixadas em acetona durante 10 minutos. As lâminas foram imersas em PBS durante 10 min e em peróxido de hidrogénio 3%/metanol durante 5 minutos à temperatura ambiente para eliminar a atividade da peroxidase endógena. A atividade da biotina endógena foi bloqueada com o Sistema de Bloqueio da Biotina (DAKO, Carpentaria, CA) . Após o 32 tratamento com soro de ratazana normal (1:100), anti-rato Gr-I mAb (RB6.8C5) diluído de 1:100 em PBS com albumina de soro bovino 1% (BSA) para detetar os neutrófilos, ou diluições de 1:50 de CD4 mAb de ratazana anti-rato (GK1.5) para detetar as células T CD4+ , as CD8a mAb de ratazana anti-rato (53-6,7) para detetar as células T CD8+ ou macrófago mAb de ratazana anti-rato (F4/80) (SEROTEC, Raleigh, NC) foi adicionado às secções. As lâminas do controlo foram incubadas com IgG de ratazana. Após 1 h, as lâminas foram lavadas 3X com PBS e incubadas durante 20 min com antisoro IgG de coelho biotinilado anti-ratazana (Sigma Aldrich) diluído de 1:100 em PBS/ BSA 1%. Depois de 3 lavagens em PBS, as lâminas foram incubadas com estreptavidina-peroxidase de rábano (DAKO) durante 20 min. A solução DAB (3,3'-diaminobenzidina) de substrato-cromagénio (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) foi aplicada às lâminas durante 0,5-3 min. Após a lavagem em dH20, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina, lavadas com dH20, cobertas com lamelas e observadas por microscopia ótica. As imagens foram capturadas usando Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Para corar o TLR5, 1 mg de mAb anti-TLR5 (ABR- Affinity BioReagents, Inc., Golden, CO) foi aplicado às lâminas e incubado durante 1 h à temperatura ambiente e depois de lavar o anticorpo IgG anti-rato de cabra biotinilado diluído de 1:100 durante 30 min à temperatura ambiente. Depois de aplicar o DAB, as lâminas foram lavadas com água de torneira, mergulhadas durante 3 seg. em hematoxilina e, em seguida, lavadas. As lâminas foram desidratadas com concentrações crescentes de etanol a 50% e, em seguida, imersas em citrasolve duas vezes, durante 10 min. cada. As lâminas foram lavadas com água de torneira, cobertas com lamelas e observadas por microscopia ótica. O uso dos níveis séricos de creatinina como um indicador da disfunção renal induzida por imposição de lesões de 33 isquemia-reperfusão foi suportado pela histopatologia dos rins isquémicos 24 horas após a reperfusão (ver Figura 3). Os animais do qrupo de controlo que receberam PBS 30 min antes da imposição da isquemia renal tiveram necrose tubular grave com formação de cápsula evidente 24 horas após a reperfusão. Consistente com a indução da disfunção renal pela administração de 5 yg de flagelina, houve evidência de patologia renal 30 min após a administração de 5 yg de flagelina sem impor isquemia e esse aumento na gravidade na sequência da imposição da isquemia renal e reperfusão com evidente hemorragia, trombose e formação de cápsula. Ao contrário, os animais que receberam 0,5 yg de flagelina 30 min antes da imposição da isquemia apresentaram niveis reduzidos da infiltração leucocitária 24 horas após a reperfusão mas a arquitetura renal parecia relativamente normal. A dose baixa não-protetora, 0,1 yg de flagelina, não evitou a patologia renal induzida pela lesão de isquemia/reperfusão. Quando os rins dos animais sobreviventes foram examinados no dia 7 pós-reperfusão, uma diminuição marcada da necrose tubular e da infiltração leucocitária, bem como a ausência de trombose e formação de cápsula foram observadas em animais que receberam 0,5 yg de flagelina antes da imposição da isquemia renal, (ver Figura 4) . d. Infiltração dos neutrófilos no Tecido Renal Danificado coloração imuno-

Como a infiltração dos neutrófilos e sua ativação é um grande contributo para a lesão tecidular após isquemia renal - reperfusão, rins isquémicos foram recuperados 9 e 24 horas após a reperfusão, provenientes de animais tratados com PBS sozinho ou com 0,5 yg flagelina antes da imposição da isquemia e os niveis de infiltração neutrofilica foram avaliados por ~ 34 histoquímica das secções de tecido preparadas para determinar diretamente o número de neutrófilos, macrófagos, células T CD4+ e células T CD8+ nos rins isquémicos durante a reperfusão, pedaços correspondentes a um quarto dos rins retirados foram cortados e pesados. Os rins foram incubados em meio de cultura RPMI 1640 com soro fetal bovino 2% durante 1 hr e, em seguida, foram enviados através de um filtro de células com 70 mm usando um êmbolo de seringa. As células foram recolhidas e os eritrócitos lisados usando o Tampão de Lise ACK (GIBCO, Grand Island, NY). Depois de 2 lavagens, as células viáveis foram contadas usando exclusão pelo azul de Tripano. As aliquotas de células foram pré-incubadas com anticorpo anti-CDl6/CD32 do recetor Fc (BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 5 min. para bloquear a ligação de anticorpo inespecificos e, em seguida, as amostras foram incubadas com mAb anti-CD45 FITC-conjugado bem como o anticorpo PE- conjugado para detetar macrófagos (F4/80) ou células T CD8+ (53-6,7) e anticorpo APC-conjugado para detetar os neutrófilos (RB6.8C5) ou células T CD4+ (GK1.5) (todos os anticorpos da BD Pharmingen) durante 30 min a 4 °C. As células foram analisadas usando citometria de fluxo em duas cores num FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) . A dispersão em frente e os canais FL1 (CD45+) foram utilizados para reter os leucócitos no tecido renal, seguindo-se a análise das populações especificas de leucócitos. Para cada amostra, foram acumulados 200.000 eventos. Os dados foram analisados utilizando software e programa CellQuest (BD Biosciences). Os números totais de cada população de leucócitos foram calculados por: (o número total de leucócitos contados) x (% da população de leucócitos contabilizada em células CD45+)/100. Os dados são reportados como o número de cada população de leucócitos/g de tecido renal de controlo e animais VR. 35

Foram observados decréscimos marcados na infiltração dos neutrófilos, 9 e 24 horas após a reperfusão quando os animais receberam 0,5 pg de flagelina (ver figura 5a). A quantificação direta da infiltração leucocitária nos rins isquémicos indicou que 0,5 pg de flagelina reduziu a infiltração de neutrófilos quase para os niveis observados nos animais do grupo de controlo operados com o placebo (ver figura 5b). Foram observados decréscimos no número de células T CD4 e CD8 e nos macrófagos em rins isquémicos, 24 horas após a reperfusão e administração de 0,5 pg de flagelina, 30 minutos antes da isquemia reduzir o número de ambas as células T CD4 e CD8 ainda mais.

Exemplo 3 O Estado da Flagelina Diminui a Expressão da Citocina Pró-inflamatória Durante a Reperfusão dos Rins Isquémicos

Este exemplo demonstra o papel critico da flagelina impedindo que as quimiocinas CXCL1/KC e CXCL2/KC orientem a infiltração de leucócitos nos tecidos renais isquémicos. Estudos anteriores indicaram que os niveis mais elevados de neutrófilos quimioatrativos CXCL1/KC e CXCL2/KC em rins isquémicos, ocorrem 9 horas após a reperfusão [REFERÊNCIA] Para começar a investigar os mecanismos subjacentes à diminuição da infiltração de leucócitos em rins isquémicos quando os animais foram condicionados com flagelina 0,5 pg, os rins foram removidos 9 e 24 horas após a reperfusão e os niveis de mARN e proteina dos neutrófilos e macrófagos quimioatrativos foram determinados (Figura 6) . Foram cortados e recolhidos pedaços de um quarto dos rins e congelados em azoto liquido. O ARN total foi extraido utilizando RNeasyTM Mini Kit (Qiagen, Valência, CA) e a a transcrição reversa foi realizada usando o cDNA Arquive Kit 36 de Alta Capacidade (Applied Biosystems, Foster City, CA). A PCR em tempo real foi realizada num Sistema de Deteção de Sequências Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) com KC/CXCL1 teste, iniciadores MIP- 2/CXCL2 e MCP-1/CCL2 e Mrpl32 usado como controlo (Applied Biosystems, Foster City, CA).

As amostras dos rins armazenadas em azoto liquido foram dissolvidas em 500 mL de tampão PBS com EDTA 0,01 M e um cocktail inibidor de proteinase (fluoreto de fenilmetilsulfonilo 10 mg/mL, aprotinina 2 mg/mL, leupeptina 2 mg/mL, Pefabloc SC 100 mg/mL e quimostatina 100 mg/mL) e, em seguida, 1 mL de Triton X-100 1,5% em PBS foi adicionado. Após a incubação com agitação durante lha 4 °C, as amostras foram centrifugadas, o sobrenadante foi recolhido e a concentração total de proteína foi determinada utilizando o Kit de Ensaio de Proteínas BCATM (Pierce, Rockford, IL) . As concentrações KC/CXCL1, MIP-2/CXCL2 e MCP-1/CCL2 foram medidas por ELISA sandwich usando os Kits Quantikine M (R&D Systems, Minneapolis, MN). Para determinar a ativação dos neutrófilos durante a reperfusão dos rins isquémicos, a concentração da mieloperoxidase (MPO) foi medida utilizando o kit de teste ELISA Mouse MPO (Cell Sciences, Canton, MA) . Os resultados são apresentados em termos da concentração de proteína de teste por mg de proteína total no tecido ± DP. O pré-condicionamento com doses protetoras de flagelina (1,25 ou 0,5 yg) resultou em reduções significativas na expressão do mARN e em níveis de proteína dos quimioatrativos de neutrófilos CXCL1 e CXCL2 em 9 horas após a reperfusão. A expressão do mARN do CCL2 ou de níveis de proteína foram baixos em ambos 9 e 24 horas após a reperfusão e não foram adicionalmente influenciados pelo pré-condicionamento com flagelina. Além disso, os níveis de mARN de proteínas de fase aguda IL-Ib e IL-6 mas não os de TNFa foram também reduzidos em rins isquémicos 9 horas após 37 a reperfusão, em animais pré-condicionados com flagelina (Figura 6b).

Exemplo 4

Efeito Protetor da Flagelina Quando Administrado Durante a Reperfusão de Rins Isquémicos

Este exemplo demonstra que a flagelina fornece um efeito protetor aos rins tratados por isquémia aguda quando administrada após o inicio da reperfusão. Como descrito acima, a oclusão do pediculo renal bilateral foi realizada em ratos e os níveis séricos de creatinina foram medidos para determinar o efeito protetor da flagelina sobre a função renal após o início da reperfusão.

Especificamente, os grupos de ratos C57BL/6 que foram submetidos a 45 minutos de oclusão pedicular renal bilateral e foram administrados com 0,5 yg de flagelina em vários instantes após a remoção das pinças renais (Ver Figura 7). A administração da flagelina 30 minutos antes ou 30 minutos após o desclampeamento resgatou a viabilidade de todos os ratos submetidos a lesões isquémicas. A administração da flagelina passada 1 hora, bem como em momentos posteriores, após o início da reperfusão não conseguiu evitar as lesões em nenhum dos ratos. O efeito protetor da administração da flagelina 30 minutos antes do desclampeamento ou 30 minutos após o desclampeamento foi refletido pelos níveis baixos de creatinina sérica monitorizados 24 horas após a reperfusão dos rins isquémicos (Figura 7b).

Exemplo 5 38

Efeito Protetor da Flagelina requer Sinalização do TLR5 nas Células do Parênquima Renal

Este exemplo demonstra a fonte alvo do efeito protetor do tratamento com flagelina durante a reperfusão do tecido. Como discutido nos Exemplos 1-4, os estudos de reperfusão foram realizados em rins isquémicos.

As quimeras reconstituídas a partir da medula óssea induzidas por radiação foram geradas entre ratos C57BL/6 do tipo selvagem e B6.MyD88_/“. As quimeras reconstituídas a partir da medula óssea induzidas por radiação foram geradas por operações de corte das pontas dos fémures e tíbias de ratos C57BL/6 do tipo selvagem e B6. MyD88_/“ e lavagem com meio RPMI 1640 para recolher as células da medula óssea. Os ratos recetores da medula óssea receberam primeiro uma radiação de 1100 Rad g-irradiação e, em seguida, 3 horas mais tarde receberam 20 X 106 células de medula óssea por via intravenosa. Os recetores CD90.1 irradiados receberam a medula óssea a partir de dadores CD90.1 congénitos ou vice-versa. Os recetores reconstituídos receberam antibióticos (sulfametoxazol 0,2 mg/mL e trimetoprime 0,4 mg/mL) na água para beber desde o dia 1 ao dia 7 como profilaxia. Os recetores foram autorizados a recuperar durante 8 a 12 semanas e o quimerismo completo foi confirmado pela coloração de células sanguíneas periféricas com conjugado FITC 90,2 e com conjugado PE 90,1. A Figura 8 demonstra que a administração de 0,5 yg de flagelina dentro dos 30 minutos da reperfusão dos rins isquémicos dos ratos tipo selvagem C57BL/6 reconstituídos com medula óssea do tipo selvagem diminuiu os níveis de mARN de CXCL1 e CXCL2. Nos recetores MyD88_/” reconstituídos quer com MyD88‘/_ ou com medula óssea do tipo selvagem, pouco mARN de CXCL1 e CXCL2 foi induzido durante a 39 reperfusão dos rins isquémicos e a administração de flagelina durante a reperfusão destes rins não diminuiu os níveis de mARN destas quimiocinas. Ao contrário, os recetores do tipo selvagem de medula óssea de dadores MyD88_/“ expressaram níveis elevados de mARN de CXCL1 e CXCL2 e estes níveis foram reduzidos pela administração de flagelina durante a reperfusão dos rins isquémicos. Isso demonstra que o alvo da flagelina foi uma célula renal parenquimatosa em vez de um leucócito.

Para investigar esta situação em maior detalhe, as secções renais dos ratos do tipo selvagem C57BL/6 e BALB/c foram marcadas com anticorpo anti-TLR5 (Figura 9a) . As células coradas positivamente foram principalmente as células da vasculatura e a coloração não foi aparente em células tubulares ou glomérulos renais. As secções renais de ratos Moth Eaten que têm um defeito genético na expressão do TLR 5 não coraram com o anticorpo anti-TLR5. Os níveis de expressão do mARN do TLR5 foram baixos nos rins antes da imposição da isquemia/reperfusão renal mas aumentaram rapidamente durante a reperfusão dos rins isquémicos (Figura 9b).

Exemplo 6

Efeito Protetor da Flagelina no Modelo de Isquemia dos Membros Posteriores

Os potenciais efeitos protetores de CBLB502 num modelo de isquemia do membro traseiro do rato foram investigados numa simulação de lesões isquémicas induzidas por um torniquete. Estes estudos são provenientes de estudos indicando que a CBLB502 administrada a ratos submetidos a oclusão pedicular renal bilateral atenuou a lesão isquémica e disfunção renal, incluindo a diminuição da produção de neutrófilos 40 quimioatrativos na resposta à reperfusão, diminuiu a infiltração de neutrófilos no rim isquémico e atenuou os aumentos nos niveis de creatinina no soro e perda de viabilidade. O protetor pode ser dado quer antes da imposição da oclusão pedicular renal, ou ainda mais importante para o uso clinico, até 30 min. após a reperfusão do rim isquémico.

As lesões induzidas pelo torniquete foram modeladas apertando uma banda larga de borracha no membro posterior esquerdo dos ratos durante 2-4 horas. Após o periodo isquémico, a banda de borracha foi alargada e removida. Os animais recuperaram da anestesia, mas apresentaram uma incapacidade de utilização do membro isquémico, o qual arrastaram por periodos até 9 dias. A lesão isquémica também incluiu edema do membro que foi claramente visivel e que foi quantificado por medições de peso húmido-seco e comparação com o membro posterior contralateral, não-isquémico e a indução de niveis elevados de citocinas pró-inflamatórias incluindo neutrófilos quimioatrativos e uma infiltração neutrofilica intensa no membro isquémico. Além disso, a injeção do corante azul de Evan indicou quantidades consideráveis de vazamento vascular no membro isquémico (dados não apresentados).

Estudando os efeitos protetores de CBLB502, os ratos foram novamente submetidos a uma lesão induzida por torniquete, apertando uma banda larga de borracha no membro posterior esquerdo durante 3 horas. Após o periodo isquémico, a banda de borracha foi alargada e removida. Quinze minutos após a remoção da banda de borracha e do inicio da reperfusão, 0,5 yg da CBLB502 ou veiculo (PBS) foram administrados por via intramuscular no membro esquerdo isquémico. Os ratos administrados com CBLB502 têm uma recuperação mais rápida do uso do membro e, ao dia 14 após a reperfusão, tinham uma força de preensão mensurável para o membro isquémico de 10GF. Ao contrário, os ratos administrados apenas com PBS 41 15 minutos após a reperfusão não atingiram essa força até ao dia 21. Os membros administrados com CBLB502 também não tiveram quase nenhuma evidência de edema 25 horas após a reperfusão como evidência de uma proporção de peso húmido/seco de 2,5 vs. 3,4 para o membro isquémico em ratos administrados apenas com veiculo na reperfusão (ver figura 14C) . No que diz respeito ao vazamento vascular, os ratos administrados com CBLB501 tiveram peso reticular do tecido no membro de 7,4 yg em corante Azul de Evan, vs. 13,1 yg para os ratos administrados com veiculo, P<0,001) (ver figura 14D) . Por último, os membros tratados com CBLB502 na reperfusão, tiveram diminuições significativas nos neutrófilos nos tecidos e nos macrófagos quimioatrativos SCXCL2, CCL2 e mieloperoxidase (P<0,05 para cada ensaio) [TEMOS VALORES QUANTIFICADOS?]. A marcação com hematoxilina/eosina foi realizada no músculo do membro traseiro no dia 14 após a reperfusão, após 3 horas da isquemia em ratos tratados com CBLB502 (Figura 14A) ou veiculo (Figura 14B) . A injeção de CBLB502 dentro de 30 min de reperfusão também resultou na diminuição da produção de neutrófilos quimioatrativos e da infiltração de neutrófilos no membro isquémico, decréscimos visíveis no edema e recuperação acelerada (dia 4-6) da utilização de membros isquémicos. O exame histológico indicou também uma maior espessura do feixe de fibras musculares em membros isquémicos dos animais tratados com o protetor (dados não apresentados). Estes resultados serão objeto de investigação mais aprofundada através da medição quantitativa de inflamação e disfunção dos membros em animais submetidos à isquemia dos membros posteriores com vs. sem administração do protetor CBLB502. Esta irá incluir a quantificação de outras citocinas pró-inflamatórias, quantificação direta da infiltração neutrofílica, quantificação da espessura do 42 feixe de fibras musculares e apoptose das fibras musculares e a magnitude e a duração do edema. <110> Cleveland Biolabs, Inc.

<120> POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS COM A FLAGELINA E SEUS USOS <130> 050991.0203.01 PCOO <150 US 01/085,788 <151> 2001-08-01 <160 56 <170 Pateníln versson 3.3

<210 1 <211 >505 <212> PRT <213> Salmonella dubltn <400 1 43 !$et Ala Glís vai U« AStt Thr ASfí set 1«« Ser &ev Leu th« Gin Asfi 1 5 í& IS &§« :-«V! S#« .lys •ΪΛ Ser C.ln Ser Ser Lâ-U ·>Λ Set Set Ala Ϊ le Gív 30 Afçt iee Ser Ser eiy /y leu Arg lie Asn ser e- J i/S Asp Agp Ala Ala Giy Gin 35 40 45 Ala 11* Ai* AS:(4 Arg Phe Rir Ser il* r,ya Oiy i*tt thr Sla Ala 50 55 so Ser Ar® Asa Ala Asft Asp Sl’/ Jl« $«*' íle Ala Gin x»r Tht Giv Óiy 65 70 75 6SJ: Ala Lfiti Asn S.Ui U® Asa Asn Asn h&u Glá AtO Vai Avg ei» Set 05 ¢0 65 Vai Gin Ala thr Asa siy fhr A«p Ser Asp S*r Asp ieu iy» Ser «a 3 00 105 110 SiR JvSp Siu xle Gin Arg Lstí Slu Gle I la Asp Ãrg Vai S»r Asír 115 120 1,25 Oia VAr Gin VAa Asa Giy Vai iys Vai Lsa Ser Gin Aap ASM SiA «e? no 135 140 6ys Ue Qlrt vai Giy Ala Asn a»f «ly eiM fhr lie ¥hr rie Asjp Leu 145 150 135 160 Sl.ft &y;s 1Ϊ8 A®p Vai iys Ser le-u Giy Asp çly Ftae Aan vai Asa í 55 170 ns 61 y FM &ys v.n Ala Rir Vai Qly Asp Aev fcys 0«t Ser Pite Ays Asn ISO 16· 5 no Vai tbr Giy Syr A&p Th !' tyr Ala Ais oiy Ais Asp Lys Tyr Arg V*1 195 200 205 Aap lia Asa Ser Giy Ala vai v«i W:st Mp Ala Ala Ala Ρϊβ Asp iys 210 215 220 ¥*1 Tyf vai Asn Ala Ala As« Oiy 01 a iee Thi '$hr Asp Asp Ale Gia 225 2:39 235 240 Agn Asm fhr Ala Vai Agp Lea tíie fcys yjir Thr :Lya ser Tbr Ai* Gly 255 250 25S th Ι Ala Glu M» m Ala ík Ala Giy Ala 11« ay& ©ly Oiy Lys Gla 260 263 270 ΟΙ,/ ASJt VAt Phe Asp tyr Lya Oiy Vai i‘hs Fhe ΪΑΓ lie Asp Tht Lys 215 230 265 Tbr Gly Asp A*p S3y Ases Giy I.ys vai Ser Thr Thr lie Asn Siy Glu 23# 205 300 Oys VSi Tísr L«« fh.c Vai Ala Asp 11« Ala fht fôly Aia Ais Asp vai 365 310 315 32:0 Asn Al& Ala Thr sOau. Gla Set Set fcjf* Ass Vai tyt Thr Ser Vai vai 325 336 3 35 As» Gly Gin 6ha l’hc ASp Asp l-ys Tíir kys Ãáft Gin Ser Ala Lys 340 34S 350 L-es Ser ASp Sis* Ala Asa Asa Ais Vai tys Gly Gins Ser 5>ya lie 355 366 365 Rir Vai Asa Sly Ala GIss 7y í TAr Ala Ase Ala Thr Gly Asp 5<ys liè ΪΜ 375 3S6 44 fíix £eu λΐ* Qly í,ys Tfcr Ket {%* lie ftsp Ay» Thr M* Set: 6ty vai 38¾ 390 395 4Ô0

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Lisboa, 4 de Junho de 2013.

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo flagelina caracterizada por ser utilizada como um medicamento para o tratamento de um tecido de mamífero dos efeitos da reperfusão.

2. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela reperfusão poder ser causada por uma lesão.

3. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a lesão ser isguemia ou hipóxia.

4. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a isguémia poder ser selecionada a partir do grupo que consiste em taquicardia, enfarte, falha renal aguda, acidente vascular cerebral, hipotensão, embolia, tromoboembolia (coágulo de sangue), anemia falciforme, pressão localizada nas extremidades do corpo e tumores.

5. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a hipóxia poder ser selecionada a partir do grupo que consiste em hipóxia hipoxémica (envenenamento por monóxido de carbono; apneia do sono, doença pulmonar obstrutiva crónica, paragem respiratória; shunts), hipóxia anémica (conteúdo em O2 reduzido), hipóxia hipoxémica e hipóxia histotóxica.

6. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a lesão ser selecionada do grupo 2 consistindo em enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral e lesão renal aguda.

7. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a pressão localizada ser devida a um torniquete.

8. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser administrada antes de, juntamente com, ou após o influxo de oxigénio.

9. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o tecido ser selecionado do grupo que consiste em: trato gastrointestinal, pulmão, rim, figado, sistema cardiovascular, endotélio dos vasos sanguíneos, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico, músculo, osso e folículo capilar.

10. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a composição ser administrada em combinação com um antioxidante.

11. Composição compreendendo flagelina para uso como medicamento de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o antioxidante ser selecionado do grupo consistindo em amifostina e Vitamina E.

12. Composição compreendendo um agonista do receptor semelhante a Toll 5 (TLR5) caracterizada por ser utilizada como um medicamento para o tratamento de um tecido de mamífero dos efeitos da reperfusão. Lisboa, 4 de Junho de 2013.