WO2007054600A2 - Combinación de glicoisoformas para el tratamiento o prevención de la septicemia, línea celular transgénica productora de glicoformas de eritropoyetina, composición farmacéutica que comprende a dicha combinación - Google Patents

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combination
glycoisoforms
cell line
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Ricardo Agustín LÓPEZ
Marcelo Gustavo Daelli
Dardo Alexis Pereira Bacci
Gabriel Ignacio Amadeo
Miriam Patricia Pereiro
Cristina Noemi Artana
Néstor MASKIN
Bernardo César PISTILLO
Carolina Didier
Marina Etcheverrigaray
Ricardo Kratje
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Protech Pharma, S.A.
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • glycoisoforms for the treatment or prevention of septicemia transgenic cell line producing erythropoietin glycoforms
  • pharmaceutical composition comprising said combination, procedures for obtaining the cell line, procedure for producing said combination of glycoisoforms and methods of treatment and prevention of septicemia
  • the present invention relates to a transgenic cell line producing a combination of erythropoietin glycoforms, wherein said glycoisoforms may comprise an amount of sialic acid of between 4 to 10 sialic acid molecules per erythropoietin molecule, the combination of glycoisoforms for the treatment or prevention of septicemia, a pharmaceutical composition comprising said combination, procedures for obtaining the cell line, procedure for producing said combination of glycoisoforms and methods of treatment and prevention of septicemia.
  • EPO Human erythropoietin
  • erythropoietin a protein widely used to stimulate erythropoiesis, in its natural and recombinant form (produced in transgenic lines of eukaryotic cells) contains four complex chains of oligosaccharides linked to the polypeptide chain, three of them in unions of type N and one in a union of type O, whose specific location is well known (Elliott, S. et. al .; The Journal of Biological Chemistry, 279 (16): 16854-16862, 2004; Watson et al, Glycobiology 4 (2): 227-237, 1994).
  • Oligosaccharides with N-type junctions may contain a variable number of sialic acid terminal residues and this significantly affects EPO activity (Egrie, J. and Browne, J., Br. J. Cancer, 84 (l): 3 -10, 2001; Goldwasser et al, J. Biol. Chem. 249: 4202-4206, 1974).
  • a major Sialic acid content prolongs the half-life of EPO in the blood but decreases the affinity for the receptor related to its hematopoietic activity.
  • an EPO with a lower content of sialic acid or lacking it has a low 'in vivo' half-life and a high affinity for the receptor related to its hematopoietic activity.
  • EPO glycoisoforms Each of these EPO glycoisoforms can be isolated from the rest because they have a different charge, for example by means of the isoelectric focusing technique.
  • the mixture of EPO glycoisoforms produced by recombinant cells may be different according to the cell line used. For example, when EPO is produced in CHO cells, glycoisoforms contain from 1 to 14 sialic acid molecules.
  • 2002/0169129 discloses a method comprising ad- minister an effective dose of recombinant human EPO to improve the quality of life of a patient.
  • the patent application of Campana W. M: et al., US No. 2004/0018978 discloses a method of treatment of neuropathic pain and protection of the peripheral nervous system comprising administering erythropoietin.
  • US Patent No. 6,268,336 discloses a method of treating liver diseases that comprises administering erythropoietin.
  • WO 03/057242 of Van Gilst, WH et al. Discloses the use of erythropoietin for the treatment or prevention of cardiac deficiencies.
  • 6,784,154 to Westenfelder Ch discloses a method for renal protection and the treatment of acute ischemic renal failure comprising administering erythropoietin.
  • WO 04/012759 of Haller H. et al . discloses the use of erythropoietin for stimulation, mobilization, proliferation and differentiation of endothelial precursor cells.
  • Sepsis is the systemic response to infection. This response can sometimes be exacerbated and affect the functioning of organs such as: kidney, liver, heart, lung, intestine, pancreas, CNS, adrenal and bone marrow, it can also alter metabolism, coagulation, immune system, Regional perfusion of the organs and systemic circulation causing septic shock.
  • organs such as: kidney, liver, heart, lung, intestine, pancreas, CNS, adrenal and bone marrow, it can also alter metabolism, coagulation, immune system, Regional perfusion of the organs and systemic circulation causing septic shock.
  • Sepsis mortality increases directly proportional to the presence and severity of shock and the number of organ failures and ranges from 30% in the absence of them to 100% when four or more organs are compromised (Fry DE, Pearlstein L, Fulton RL et al, Multiple system organ failure.The role of uncontrolled infection.Arch Surg 115: 136-140, 1980) .In spite of the developments achieved, sepsis remains the most important cause of mortality in the Care units Non-coronary intensive (Angus DC, ET. AL. Crit Care Med; 29: 1303-10, 2001).
  • lymphocyte loss due to apoptosis may be responsible for the marked immunosuppression that is frequently observed in septic patients (Wang SD, et al., J Immunol; 152: 5014-21, 1994).
  • Other cell types such as hepatocytes (Rogers HW, et. Al., J Immunol; 156: 679-84, 1996), columnar epithelial cells of the intestinal tract (Hotchkis RS, et.
  • Said combination may lack any of said glycoisoforms or may be constituted by different proportions of each glycoisoform.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, recombinant erythropoietin, analogs, mimics, mimetics, or fragments thereof.
  • Said combination of erythropoietin has therapeutic and preventive activity in septicemia.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, recombinant erythropoietin, analogs, mimetics, mimics, or fragments thereof.
  • the cell line is a CHO cell line and even more preferably the cell line is the AB2H52 cell line deposited in the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) under the accession number DSM ACC2727.
  • DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
  • the combination of produced and purified erythropoietin has therapeutic activity as an agent for the treatment and prevention of sepsis.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, recombinant erythropoietin, analogs, mimetics, mimics, or fragments thereof.
  • Said composition may comprise any excipient known in the art of drug production.
  • [16] b.purify and isolate the combination of erythropoietin glycoisoforms.
  • the cell line culture can be carried out in a medium comprising additives such as N-acetylglucosamine, ammonium chloride, sodium chloride or combinations thereof and where the purification and isolation step of the combination of Erythropoietin is carried out by at least one chromatographic stage.
  • the Erythropoietin combination comprises an isoelectric point profile between 4 and 5.3.
  • the culture medium has an osmolality of between 310 and 450 milliosmol / kg of solvent.
  • Said combination may lack any of said glycoisoforms or may be constituted by different proportions of each glycoisoform.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, mimetic, recombinant erythropoietin, analogs, mimics, or fragments thereof.
  • the method comprises the steps of:
  • the culture medium has an osmolality of between 310 and 450 milliosmol / kg of solvent.
  • Said combination may lack any of said glycoisoforms or may be constituted by different proportions of each glycoisoform.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, recombinant erythropoietin, analogs, mimetics, mimics, or fragments thereof.
  • the method can be carried out by administering a dose between 10 ⁇ g / Kg and 1000 ⁇ g / Kg for an adult of 70 kg of the combination of human recombinant erythropoietin glycoisoforms of this invention.
  • This combination may lack any of said glycoisoforms or may be constituted by different proportions of each glycoisoform.
  • Erythropoietin is human erythropoietin and can be a natural, recombinant erythropoietin, analogs, mimetics, mutants, or fragments thereof.
  • the method can be carried out by administering a dose between 10 ⁇ g / Kg and 1000 ⁇ g / Kg for a 70 kg mammal of the erythropoietin combination of the present invention.
  • Figure 1 The restriction map of the plasmid used in the transfection of the CHO.K1 cell line is shown in the figure;
  • Figure 2A shows an SDS-PAGE stained with Coomasie Blue
  • FIG. 2B shows the Western Blota bands. starting from the gel of figure 2A;
  • Figure 2C is the graphical representation of the distance migrated by each molecular weight (PM) pattern as a function of the logarithm of the PM.
  • lane 1 corresponds to 25 ⁇ g of commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen);
  • lane 2 corresponds to 25 ⁇ g of the erythropoietin of the invention
  • lane 3 corresponds to PM patterns (BioRad, USA)
  • lane 4 corresponds to 5 ⁇ g commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen)
  • lane 5 corresponds to 5 ⁇ g of the erythropoietin of the invention;
  • Figure 3 shows the bands of the isoelectric focusing test stained with Coomasie Blue.
  • Lane 1 corresponds to Asialo-EPO
  • Lane 2 corresponds to the erythropoietin of the invention
  • lane 3 corresponds to commercial erythropoietin (Eprex, Cilag-Jansen)
  • lane 4 corresponds to pl patterns (Amersham Bioscience).
  • Figure 3B is a graphical representation of the pl as a function of the migration distance of each pl obtained;
  • Figure 4 shows survival curves of mice with experimentally provoked sepsis. The animals received 1 hour before a ligation and double puncture of the cecum (LPC) dose of 5 ⁇ g / kg, 15 ⁇ g / kg, 30 ⁇ g / kg or 50 ⁇ g / kg of the combination of EPO glycoisoforms of the invention or Placebo (Control).
  • LPC cecum
  • Figure 5 shows survival curves of mice with experimentally induced sepsis. The animals received 1 hour before the LPC dose of 15 ⁇ g / kg, 30 ⁇ g / kg or 50 ⁇ g / kg of commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen) or Placebo (Control).
  • EPO Eprex, Cilag-Jansen
  • Placebo Control
  • Figure 6 shows survival curves of mice with experimentally induced sepsis. The animals received a dose of 15 ⁇ g / kg, 30 ⁇ g / kg or 50 ⁇ g / kg of Asialo-EPO or Placebo (Control) 1 hour before the LPC.
  • Figure 7 shows the frequency of general histopathological lesions in septic mice treated preventively with 50 ⁇ g of commercial EPO or with 50 ⁇ g of the EPO combination of the invention.
  • Figure 8 shows survival curves of mice with experimentally induced sepsis. Animals received 1 hour after the LPC dose of 15 ⁇ g / Kg, 30 ⁇ g / Kg or 50 ⁇ g / Kg of the combination of EPO glycoisoforms of the invention or Placebo (Control).
  • the erythropoietin of the invention refers to a set or combination of erythropoietin glycoisoforms.
  • An erythropoietin glycoisoform is defined as an erythropoietin having a single isoelectric point (pl). Different glycoisoforms have the same amino acid sequence but differ in their pl.
  • transgenic eukaryotic cell lines are provided, preferably transgenic cell lines expressing erythropoietin, particularly a combination of erythropoietin glycoisoforms, wherein said combination comprises glycoisoforms comprising 4 sialic acid molecules per erythropoietin molecule. to isoforms comprising 10 molecules of sialic acid per molecule of erythropoietin. For example glyco-forms comprising 4, 5, 6, 7, 8, 9 and / or 10 sialic acid molecules per erythropoietin molecule.
  • the eukaryotic cell line can be, without limiting it to, mammalian cell lines such as the CHO, Vero, MDCK lines, preferably the eukaryotic cell line is the CHO line and more preferably it is the AB2H52 transgenic cell line deposited under Treaty from Budapest on June 22, 2005 in the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) under the DSM access number ACC2727.
  • mammalian cell lines such as the CHO, Vero, MDCK lines
  • the eukaryotic cell line is the CHO line and more preferably it is the AB2H52 transgenic cell line deposited under Treaty from Budapest on June 22, 2005 in the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) under the DSM access number ACC2727.
  • the erythropoietin produced by the cell line of the invention includes but is not limited to erythropoietin mutations such as those having altered amino acids at the carboxy terminal end (see US Patent No. 5,457,089, incorporated here entirely as a reference), analogs; peptides that bind to the receptor; small molecules that mimic erythropoietin referred to herein as mimetics (US Patent No. 2002/0016350, incorporated herein entirely by reference); natural erythropoietin; imitators, for example those modified in order to reduce their immunogenicity (US Patent No.
  • erythropoietin with any amino acid skeleton as long as the cell line produces glycoisoforms comprising between 4 and 10 sialic acid molecules per molecule of erythropoietin.
  • the amino acid skeleton of erythropoietin may be SEQ ID No. 1.
  • the cell line of the invention was obtained by transfecting CHO.K1 cells with the plasmid shown in Figure 1.
  • the cells selected in culture that produced erythropoietin were cloned and the combination of glycoisoforms produced by Western blot of isoelectric focusing was evaluated. followed by a band densitometry test.
  • the cell line of the present invention can be obtained by selecting the clones that produce the combination of erythropoietin glycoisoforms of the invention.
  • the selected cell line can be cultured in the presence of ammonium chloride, sodium chloride, N-acetylglucosamine or combinations thereof to induce the production and release of the combination of erythropoietin glycoisoforms of the invention (glyco-forms 4 to 10 combined in different proportions, one or more of the glycoisoforms being absent in the combination).
  • the combination of glycoisoforms may comprise an amount of between 2 and 12% of glycoisoform 4, between 5 and 25% of glycoisoform 5, between 9 and 34% of glycoisoform 6, between 9 and 34% of glycoisoform 7, between 10 and 35% of the glycoisoform 8, between 2 and 23% of the glycoisoform 9 and between 0 and 2% of the glycoisoform 10.
  • the isoelectric point (pl) of the erythropoietin of the invention Asialo erythropoietin and commercial erythropoietin (Eprex, Cilag-Jansen).
  • the erythropoietin street (1) shows only bands a and b corresponding to a pl of 6.7 and 6.6 respectively.
  • Lane 2 where the erythropoietin of the invention was seeded shows the bands from c to i corresponding to a pl between 4.0 and 5.3. Street 3 where the commercial EPO was planted shows bands from j to m corresponding to a pl between 3.5 and 4.3.
  • Erythropyetine of the invention 7.6 moles of sialic acid / mole of polypeptide.
  • Asialo-EPO 4.4 moles of sialic acid / mole polypeptide.
  • Commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen): 11.3 moles of sialic acid / mole polypeptide.
  • the pl, percentages and sialic acid content of each glycoisoform of the erythropoietin of the invention was determined by the isoelectric focusing technique (Table 1). The sialic acid content of each of the glycoisoforms is shown in the following table:
  • the combination of the invention may comprise any proportion of glycoisoforms of each of the isoforms 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10; and all of them combined in different ways are within the scope of the present invention.
  • one or more of the glycoisoforms may be absent or the proportion of each glycoisoform present in the combination could be different. All these variants are within the scope of the present invention.
  • Sham group refers to animals that underwent simulated surgery to assess surgical stress).
  • EPO of the invention can be used at higher doses are to produce thrombopoietic effect.
  • Commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen) decreased mortality when administered at a dose of 15 ⁇ g / Kg ( Figure 5).
  • commercial EPO was not effective, increasing mortality due to the damage caused by the increase in erythropoiesis and its consequent thrombopoietic effect.
  • Asialo-EPO did not reduce mortality in all doses studied ( Figure 6).
  • erythropoietin may prevent or be useful for the treatment of sepsis as long as said erythropoietin is not Asialo-EPO.
  • any combination of erythropoietin glycoisoforms or a single glycoisoform is useful for the treatment and prevention of septicemia, septic shock and other disorders such as severe hypovolemic shock or cardiogenic origin, and other non-infectious causes such as polytrauma, pancreatitis, severe burns, and those caused by toxic agents, hypoxia, ischemia or necrosis among others.
  • the combination of glycoisoforms for the treatment and prevention of septicemia is the combination comprising glycoisoforms of 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 sialic acid molecules per erythropoietin molecule. More preferably it is the combination of glycoisoforms that releases the cell line of the present invention to the culture medium.
  • Table 5 shows that the incidence of severe renal damage (severe congestion, acute tubular necrosis or focal renal necrosis) was as follows: Control: 28.5%, commercial EPO: 14.2%, EPO combination of the invention: no renal lesions were observed . 25% in the control group, 37.5% in the commercial EPO group and 12.5% in the group of animals treated with the EPO combination of the invention presented hepatic involvement (severe congestion or necrosis).
  • mice of the group treated with the combination of isoforms of the present invention had no cardiac lesions, while 37.5% of the control group and 25% of the group of animals treated with commercial EPO had myocardial damage (congestion). No mice had brain injury, except for an animal from the control group that presented inflammatory infiltrate.
  • the invention also encompasses a pharmaceutical composition for the treatment of septicemia or other related disorders.
  • the pharmaceutical composition for the treatment or prevention of septicemia comprises different combinations of erythropoietin glycoisoforms, for example a combination of glycoisoforms, wherein said combination comprises glycoisoforms of 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 sialic acid molecules per erythropoietin molecule, where one or more glycoisoforms may be absent in said combination or said combination may comprise different proportions in each glycoisoform. More preferably it is the combination of glycoisoforms that releases the cell line of the present invention to the culture medium; and excipient known in the state of the art.
  • composition of the invention may be made in the form of, for example, tablets, tablets, capsules, particles; sublingual, intranasal, injectable or other forms known in the art, all of which are within the scope of the present invention.
  • composition of the present invention may comprise each
  • Example 1 Obtaining an erythropoietin-producing cell line.
  • the CHO.K1 cell line (ATCC CCL-61) was used.
  • the culture medium called Medium 1 (consisting of a 1: 1 mixture of D-MEM (Gibco) and Ham's F12 (Gibco) media supplemented with sodium bicarbonate (Gibco) 2,441 was used for the growth and maintenance stages.
  • the cells were transfected with the plasmid called pnrepo ( Figure 1), obtained from cloning the human erythropoietin gene into the commercial eukaryotic expression plasmid pClneo.
  • Transfected cells were selected using the antibiotic Neomycin and the producer cell lines were analyzed using the immunodot assay.
  • Example 2 Evaluation of the glycosylation pattern of the glycoisoforms produced.
  • the electrophoretic support was prepared using the acrylamide / bisacrylamide mixture in a concentration of 8% (P / V) with the addition of 7 M urea and ampholytes to generate a pH range between 3 and 10.
  • Example 3 Obtaining clones of erythropoietin producing cells with low sialic acid content.
  • Example 4 enrichment and purification of human erythropoietin isoforms with lower sialic acid content.
  • the culture supernatant was filtered in cartridges with a pore size of 3-0.8 ⁇ m and sequentially in cartridges with a pore size of 0.8-0.45 ⁇ m ( PaIl Technology, USA), using a pressure of less than 0.5 kgf / cm.
  • the filtered crop was immediately processed.
  • the elution product was concentrated to a volume of between 75 and 100 ml and a buffer change was made with 20 mM Tris solution pH 6.5 using a Pellicon tangential ultrafiltration system (Millipore, USA) with cartridges 10 kDa pore size and 0.1 m surface. It was diafiltered using 10 times the volume of the concentrate. The obtained product was stored at -20 0 C or immediately processed.
  • the apparent molecular weight was determined by interpolation of the distance migrated by each sample in a graphical representation of the distance migrated by each marker based on its molecular weight.
  • the electrophoretic support was prepared using a mixture of acrylamide / bisacrylamide in a concentration of 8% (P / V) with the addition of 7 M urea and ampholytes to generate a pH gradient between 3 and 10.
  • the gel It was pre-focused for 1 hour at 2000 V - 100 mA - 10 W. Subsequently, 20 ⁇ g of the different EPO preparations were seeded in a volume of 20 ⁇ l, proceeding to focus for 40 minutes using the same conditions indicated above. As controls, isoelectric point markers (GE Healthcare) were planted.
  • the apparent isoelectric point was determined by interpolation of the distance migrated by each sample in a graphic representation of the distance migrated by each marker based on its isoelectric point.
  • Example 6 In vitro analysis of the biological activity of erythropoietin
  • Glutamine (Fluka, Germany) 200 mM, 0.75g NaHCO3 (Gibco, USA), 50mg / ml gentamicin (Parafarm, Argentina), sterilized by filtration through 0.22mm pore filters; supplemented with 10% V / V fetal bovine serum (SFB) (Bioser, Argentina), 5ml 5mM deb-mercaptoethanol (Merck, Germany), and 5ng / ml rhGM-CSF (Growgen, Bioprofarma S.A., Argentina.
  • V / V fetal bovine serum (SFB)
  • 5ml 5mM deb-mercaptoethanol (Merck, Germany)
  • 5ng / ml rhGM-CSF Crowgen, Bioprofarma S.A., Argentina.
  • Test medium Growth culture medium lacking rhGM-CSF.
  • Washing medium Growth culture medium lacking rhGM-CSF and
  • 50 ml of the cell suspensions were seeded in each cavity of a 96-well plate (except in the wells corresponding to the color reagent control) and were added: 50 ⁇ l of the purified erythropoietin of the invention according to Example 4, 50 ⁇ l of a commercial erythropoietin (Eprex, Cilag-Jansen) (7500 mU / ml) in serially diluted dilutions such that the curve concentrations will vary between 15 and 2000 mU / ml, 50 ⁇ l of Asialo EPO and 50 ⁇ l of test medium as appropriate. The plates were incubated at 37 ° C for 72 hours.
  • [122] -control positive 50ml of test medium, supplemented with 7500 mU / ml of
  • FBCB-UNL with free access to water and balanced diet.
  • the temperature of the sector was maintained at 23 ° C.
  • the lighting regime was 12 hours. light - 12 hours. darkness.
  • the animals were randomly divided into 3 groups of 6 animals. Each group was also divided into 3 subgroups of 2 animals each. Each subgroup was kept in separate cages.
  • the animals were anesthetized through intramuscular injection of a mixture of 140 ⁇ l of Ketamine 50 mg / ml and 75 ⁇ l of Xylazine 20 mg / ml. Once anesthetized, the animals were inoculated with an injection into the main vein of the tail. Each animal was injected with 500 ⁇ g of the corresponding erythropoietin according to treatment scheme, in a volume of 500 ⁇ l of solution, using tuberculin syringes provided with 29g needles.
  • the plasma concentration of the different erythropoietins injected was determined by a sandwich ELISA (Amadeo, I., et al., J. Immunol. Meth. 293: 191-205,
  • A are already constants of the initial phase that reflect the distribution of erythropoietin in all intracellular fluids of the animal
  • B and ⁇ are constants of the elimination phase related to actual plasma clearance (Donahue et al., Cold Spring Harbor Symp Quant. Biol. 51, 685-692, 1986, incorporated herein by reference in its entirety).
  • These constants were estimated from the empirical data using computer tools (Microcal TM Origin TM Version 5.0, Microcal Software, USA).
  • the half-life of distribution (T ⁇ ), the half-life of elimination (T ⁇ ) and total plasma clearance (CL) were calculated using equations (2), (3) (4), respectively:
  • Dilutions of the sample to be analyzed were made using a phosphate / albumin buffer pH 7.2.
  • the buffer was prepared according to the following instructions: dissolve 10.75 g of disodium acid phosphate and 7.6 g of sodium chloride in 900 ml of distilled water; add 5 ml of a concentrated solution of human albumin 200 mg. / mi and complete with distilled water c.s.p. a final volume of 1,000 mi. Adjust the pH to 7.2 with dilute sodium hydroxide solution or with dilute phosphoric acid.
  • mice were anesthetized with sodium pentothal (3 mg / 0.5 ml / mouse) and bled through the retrorbital sinus, using heparinized capillaries. The blood was transferred to Eppendorf tubes with 5 ⁇ l of sodium heparin.
  • the reticulocytes were quantified by taking 5 ⁇ l of a reticulocyte buffer pH 7.2.
  • the buffer was prepared according to the following protocol: dissolve 10.75 g of disodium acid phosphate, 7.6 g of sodium chloride, 0.2 g of sodium azide and 0.74 g of EDTA in distilled water and then bring to volume end of 1,000 mi. Adjust the pH to 7.2.
  • Example 9 Evaluation of the erythropoietin of the invention as an active ingredient for the treatment of sepsis, and determination of the appropriate dose.
  • mice Female CfI mice of 5 to 7 weeks of age, approximately 25-3Og in weight, were used.
  • mice were anesthetized intraperitoneally with ketamine / Xylazine (133: 10 ug / g mouse) (Holliday® 50 mg / ml ketamine and Narcoxil® 20 mg / ml xylazine). Subsequently, a minimal medial laparotomy was performed. The cecum was ligated with surgical suture 1 cm from its distal end, taking care not to obstruct the ileocecal valve. Two holes were made with an 18g needle in the blind distal to the ligation site. The blind was compressed so that a small amount of enteric content passed through the holes, the blind was introduced into the peritoneal cavity and the abdominal wall was closed in two planes. Finally, to ensure hydration of the mice, 1 ml of 0.9% saline was injected subcutaneously and from there all animals had free access to water and food.
  • ketamine / Xylazine 133: 10 ug / g mouse
  • mice were treated with sepsis.
  • the animals of the first group received 50 ⁇ g of commercial EPO (Eprex, Cilag-Jansen) subcutaneously, the second group 50 ⁇ g of the preparation of the invention and the third group equal volume of physiological solution long before the LPC.
  • the mice were sacrificed randomly within the first six days of the LPC.
  • the following organs were evaluated by a histopathological study using the hematoxylin-eosin technique: brain, heart, lung, intestine, liver and kidney. Based on the histopathological study, the associated lesions were established for each organ and for each animal. The histopathological analysis was performed independently and blindly.

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Abstract

Combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas glicoisoformas pueden comprender una cantidad de ácido siálico de entre 4 a 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetinala, la combinación de glicoisoformas se puede usar para el tratamiento o prevención de la septicemia/sepsis, una composición farmacéutica que comprende a dicha combinación, una línea celular productora de una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, procedimientos para obtener la línea celular, procedimiento para producir dicha combinación de glicoisoformas y métodos de tratamiento y prevención de la septicemia/sepsis.

Description

Description
Combinación de glicoisoformas para el tratamiento o prevención de la septicemia, línea celular transgénica productora de glicoformas de eritropoyetina, composición farmacéutica que comprende a dicha combinación, procedimientos para obtener la línea celular, procedimiento para producir dicha combinación de glicoisoformas y métodos de tratamiento y prevención de la septicemia.
[1] La presente invención se relaciona con una línea celular transgénica productora de una combinación de glicoformas de eritropoyetina, en donde dichas glicoisoformas pueden comprender una cantidad de ácido siálico de entre 4 a 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, la combinación de glicoisoformas para el tratamiento o prevención de la septicemia, una composición farmacéutica que comprende a dicha combinación, procedimientos para obtener la línea celular, procedimiento para producir dicha combinación de glicoisoformas y métodos de tratamiento y prevención de la septicemia.
Antecedentes
[2] Las modificaciones en el patrón de glicosilación de las glicoproteínas producidas por células eucariotas pueden afectar algunas de sus propiedades biológicas, tales como su transporte, su secreción, su estabilidad y su interacción con otras moléculas y con receptores (Witter A. and Howard, S, Biochem 29: 4175-4180, 1990; Hart, Curr. Op.Cell Biol., 4: 1017-1023, 1992; Gooche et al, Bio/Technology 9: 1347-1355, 1991; Parekh et al, Curr. Op. CeIl. Biol., 1: 750-754, 1991; Bevilacqua, M. and Nelson, R., J. Clin. Invest. 91: 379-387, 1993; Nelson et al, J. Clin.Invest. 91:1157-1166, 1993; Norgard, et al, Proc. Nati, Acad. Sci. USA 90:1068-1072, 1993; Imai et al, Nature 361:555-557, 1993.
[3] La eritropoyetina humana (EPO), una proteína ampliamente utilizada para estimular la eritopoyesis, en su forma natural y recombinante (producida en líneas transgénicas de células eucariotas) contienen cuatro cadenas complejas de oligosacáridos unidas a la cadena polipeptídica, tres de ellas en uniones del tipo N y una en una unión del tipo O, cuya ubicación específica es bien conocida ( Elliott, S. et. al.; The Journal of Biological Chemistry, 279(16): 16854-16862, 2004; Watson et al, Glycobiology 4(2):227-237, 1994 ). Los oligosacáridos con uniones del tipo N pueden contener un número variable de residuos terminales de ácido siálico y esto afecta notablemente la actividad de la EPO (Egrie, J. and Browne, J., Br. J. Cáncer, 84(l):3-10, 2001; Goldwasser et al, J. Biol. Chem. 249: 4202-4206, 1974). Por ejemplo, un mayor contenido de ácido siálico prolonga la vida media de la EPO en la sangre pero disminuye la afinidad por el receptor relacionado con su actividad hematopoyética. Inversamente una EPO con un menor contenido de ácido siálico o carente del mismo posee una baja vida media 'in vivo' y una elevada afinidad por el receptor relacionado con su actividad hematopoyética. (Fukuda et al, Blood 73: 84-89, 1989; Spivak J and Hogans, B. Blood 73:90-99, 1989; Imai et al, Eur. J. Biochem.194: 457-462, 1990, Higuchi et al, J. Biol. Chem. 267(11): 7703-7709, 1991). Para que la EPO actúe como estimulante de la eritropoyesis 'in vivo' es necesario que esté continuamente presente en la sangre en una concentración adecuada y por lo tanto, una larga vida media 'in vivo' favorece notablemente su acción eritropoyética. En contraste, por tiempos cortos y en alta concentración 'in vivo' ejerce un efecto protector sobre los tejidos (Morishita, E., et. Al.; Neuroscience; 76: 105-116, 1997) un hecho que sugiere que la EPO con bajo contenido, o carente de ácido siálico, es útil para inducir la protección tisular sin generar efectos eritropoy éticos. Esto sería muy importante debido que el aumento de glóbulos rojos en la sangre puede ser altamente riesgoso. Por otro lado, si la EPO no contiene ácido siálico (asialo-EPO) posee una vida media 'in vivo' excesivamente baja y por lo tanto, no tiene utilidad ni para estimular la eritopoyesis ni para proteger los tejidos.
[4] Es conocido que la EPO recombinante producida en líneas celulares eucariotas es una combinación de especies moleculares que comparten una misma cadena polipeptídica pero que difieren en la cantidad de ácido siálico terminal presente en las cadenas oligosacaridicas. A estas diferentes formas de la EPO se las conoce con el nombre de glicoisoformas de EPO. Cada una de estas glicoisoformas de EPO puede ser aislada del resto debido a que poseen diferente carga, por ejemplo mediante la técnica de isoelectroenfoque. La mezcla de glicoisoformas de EPO producida por células re- combinantes puede ser distinta de acuerdo a la línea celular empleada. Por ejemplo, cuando la EPO se produce en células CHO las glicoisoformas contienen desde 1 hasta 14 moléculas de ácido siálico.
[5] Más allá de su uso practico en la estimulación de la eritropoyesis, y debido principalmente a su efecto como protector tisular, la EPO ha sido propuesta como principio activo para el tratamiento de diversas anomalías y enfermedades. Por ejemplo en la solicitud de patente de Baker et al. US N° 2004/0198663 se divulga un método para reducir los efectos de la isquemia de miocardio y el daño asociado mediante la administración de cantidades efectivas de eritropoyetina. En el documento de patente de Weiss S. et al., US N° 6.165.783 se divulga un método para inducir la diferenciación de células madres neuronales o tratar enfermedades neurodegenerativas mediante la aplicación de cantidades efectivas de eritropoyetina. La solicitud de patente de Zaharia, V US N° 2002/0169129 divulga un método que comprende ad- ministrar una dosis efectiva de EPO humana recombinante para mejorar la calidad de vida de un paciente. La solicitud de patente de Campana W. M: et al., US N° 2004/0018978 divulga un método de tratamiento del dolor neuropático y la protección del sistema nervioso periférico que comprende administrar eritropoyetina. La patente US N° 6.268.336 divulga un método de tratamiento de las enfermedades hepáticas que comprende administrar eritropoyetina. El documento de patente WO 03/057242 de Van Gilst, W. H. et al., divulga el uso de eritropoyetina para el tratamiento o prevención de las deficiencias cardíacas. La patente US N° 6.784.154 de Westenfelder Ch divulga un método para la protección renal y el tratamiento de la insuficiencia renal aguda isquémica que comprende administrar eritropoyetina. El documento de patente WO 04/012759 de Haller H. et al.; divulga el uso de eritropoyetina para la estimulación, movilización, proliferación y diferenciación de las células precursoras endoteliales.
[6] Durante muchos años el objetivo de los investigadores estaba centrado en obtener eritropoyetinas con alto contenido de ácido siálico en función de asegurar una elevada vida media plasmática, incrementando por ejemplo los sitios de glicosilación o enriqueciendo en las glicoisoformas de eritropoyetina con mayor contenido de ácido siálico (ver Patente US N° 5.856.298 de Strickland T. W.). Otro procedimiento para incrementar la glicosilación se describe en la patente US N° 6.673.575 de Franze R. et al; y en el documento de patente WO 03/080852 se divulga un proceso cromatográfico para producir eritropoyetinas de alta pureza y con un perfil deseado de glicoisoformas.
[7] Por otra parte, en la patente US N° 6.531.121 de Brines M. et al., se divulga la administración de asialoeritropoyetina para la protección y mantenimiento de la viabilidad celular, tisular o de órganos. Demostrándose que la asialo eritropoyetina (asialo-EPO) tiene una actividad diferente a las anteriormente descritas.
[8] La sepsis es la respuesta sistémica a la infección. Esta respuesta en ocasiones puede estar exacerbada y afectar el funcionamiento de órganos tales como: riñon, hígado, corazón, pulmón, intestino, páncreas, SNC, suprarrenales y la médula ósea, también puede alterar el metabolismo, la coagulación, el sistema inmune, la perfusión regional de los órganos y la circulación sistémica provocando shock séptico. La mortalidad de la sepsis se incrementa en forma directamente proporcional a la presencia y gravedad del shock y al número de fallas de órganos y va desde el 30% en ausencia de ellas hasta el 100% cuando cuatro o mas órganos están comprometidos (Fry DE, Pearlstein L, Fulton RL et al, Múltiple system organ failure.The role ofuncontrolled infection.Arch Surg 115: 136-140, 1980).A pesar de los desarrollos alcanzados la sepsis continúa siendo la causa más importante de mortalidad en las unidades de Cuidados Intensivos no coronarios (Angus DC, ET. AL. Crit Care Med; 29:1303-10, 2001). Las bases de la terapéutica actual son: la expansión del volumen plasmático con cristaloides y/o coloides, el soporte de órganos que fallan incluyendo el shock, el control estricto de la glucemia, el uso de antibióticos adecuados y de drogas que modulan la respuesta inflamatoria y pro-coagulante (Dellinger P, EC, ET AL.Crit Care Me; 32: 858-73, 2004; Bernard G, Vincent JL, Laterre PF et al. Efficacy and safety of Recombinant Human Activated Protein C for Severe Sepsis. N Eng J Med 2001; 344: 699-709; Bernard GR, Margolis BD, Shanies HM, et al. Extended Evaluation of Recombinant Human Activated Protein C United States Trial (ENHANCE US)* Chest. 2004; 125: 2206-2216).Sin embargo, la mortalidad permanece muy alta por lo que continúan las investigaciones intentando alcanzar mejores resultados terapéuticos. En este sentido son de destacar los estudios relacionados con la posibilidad de activar señales defensivas de respuesta al stress en células de distintos tejidos de los pacientes sépticos.
[9] Diversos estudios han postulado que la pérdida de linfocitos por apoptosis puede ser la responsable de la marcada inmunodepresión que frecuentemente se observa en los pacientes sépticos (Wang SD, et al.,J Immunol; 152: 5014-21, 1994). Otros tipos de células, como los hepatocitos (Rogers HW, et. al., J Immunol; 156: 679-84, 1996), las células epiteliales columnares del tracto intestinal (Hotchkis RS, et. al.,Crit Care Med; 25:1298-1307, 1997) y las células del endotelio vascular (Haimovitz-Friedman A, et al., J Exp Med; 186: 1831-41, 1997) también pueden morir por apoptosis durante el proceso de sepsis. Un estudio reciente efectuado en pacientes fallecidos por sepsis/ shock séptico ha demostrado que la apoptosis ocurre sistemáticamente en muchos tipos celulares siendo particularmente vulnerables las células linfoides y las epiteliales columnares del intestino (Hotchkis RS, et al., Crit Care Med; 27: 1230-517,1999).A los fines de esta patente, cuando se lee sepsis debe entenderse también como septicemia.
[10] Existe la necesidad de encontrar principios activos y formulaciones que disminuyan la mortalidad producida por la septicemia. Sorprendentemente los inventores han hallado que ciertas combinaciones de glicoisoformas de eritropoyetina previenen efectivamente la septicemia y pueden además ser empleadas para un tratamiento exitoso en pacientes sépticos.
Resumen de la Invención
[11] Es un objeto de la presente invención proveer una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina para el tratamiento y la prevención de la septicemia, en donde dichas glicoisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Dicha combinación puede carecer de alguna de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una eritropoyetina natural, recombinante, análogos, imitantes, miméticos, o fragmentos de las mismas. Dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad terapéutica y preventiva en la septicemia.
[12] Es otro objeto de la presente invención proveer una línea celular transgénica productora de eritropoyetina, en donde dicha línea celular produce y libera al medio una combinación cualquiera de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas gli- coisoformas pueden comprender por ejemplo una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Dicha combinación puede carecer de alguna de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una eritropoyetina natural, recombinante, análogos, miméticos, imitantes, o fragmentos de las mismas. Preferentemente la línea celular es una línea de células CHO y aún más preferentemente la línea celular es la línea celular AB2H52 depositada en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bajo el número de acceso DSM ACC2727. La combinación de eritropoyetina producida y purificada tiene actividad terapéutica como agente para el tratamiento y la prevención de la septicemia.
[13] Es otro objeto de la presente invención proveer una composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención de la septicemia, en donde dicha composición comprende como principio activo una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas glicoisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y excipiente adecuados. Dicha combinación puede carecer de una o más de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una eritropoyetina natural, recombinante, análogos, miméticos, imitantes, o fragmentos de las mismas. Dicha composición puede comprender cualquier excipiente conocido en el arte de la elaboración de medicamentos.
[14] Es otro objeto de la presente invención proveer un procedimiento para obtener un perfil determinado de glicoisoformas de eritropoyetina, el procedimiento comprende las etapas de:
[15] a.cultivar en un medio de cultivo la línea celular AB2H52 depositada en el DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bajo el número de acceso DSM ACC2727; y
[16] b.purificar y aislar la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina. En donde el cultivo de la línea celular se pude llevar a cabo en un medio que comprenda aditivos tales como N-acetilglucosamina, cloruro de amonio, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos y en donde la etapa de purificación y aislamiento de la combinación de eritropoyetina se lleva a cabo mediante al menos una etapa cromatográfica. La combinación de eritropoyetina comprende un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3. Preferentemente el medio de cultivo tiene una osmolalidad de entre 310 y 450 miliosmol/kg de solvente.
[17] Es otro objeto de la presente invención proveer un procedimiento para obtener una línea celular productora de una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas glicoisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Dicha combinación puede carecer de alguna de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una eritropoyetina natural, mimética, recombinante, análogos, imitantes, o fragmentos de las mismas. El método comprende las etapas de:
[18] a.cultivar en un medio de cultivo una línea celular trangénica productora de eritropoyetina; en donde el medio de cultivo comprende aditivos tales como N- acetilglucosamina, cloruro de amonio, cloruro de sodio o combinaciones de los mismos, todos ellos en diferentes proporciones,
[ 19] b.clonar la línea celular;
[20] c.determinar el clon productor de dicha combinación; y
[21] d.purificar y aislar dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina. Preferentemente el medio de cultivo tiene una osmolalidad de entre 310 y 450 miliosmol/kg de solvente.
[22] Es otro objeto de la presente invención proveer un método para el tratamiento de la septicemia, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas glicoisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Dicha combinación puede carecer de alguna de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una eritropoyetina natural, recombinante, análogos, miméticos, imitantes, o fragmentos de las mismas. El método se puede llevar a cabo administrando una dosis de entre 10 μg/Kg y 1000 μg/ Kg para un adulto de 70Kg de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina re- combinante humana de esta invención.
[23] Es otro objeto de la presente invención proveer un método para la prevención de la septicemia, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de esta invención, en donde dichas glicoisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Dicha combinación puede carecer de alguna de dichas glicoisoformas o puede estar constituida por proporciones diferentes de cada glicoisoforma. La eritropoyetina es eritropoyetina humana y puede ser una er- itropoyetina natural, recombinante, análogos, miméticos, mutantes, o fragmentos de las mismas. El método se puede llevar a cabo administrando una dosis de entre 10 μg/Kg y 1000 μg/Kg para un mamífero de 70Kg de la combinación de eritropoyetina de la presente invención.
[24] Es otro objeto de la presente invención proveer el uso de una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina para la prevención y el tratamiento de la septicemia.
Breve descripción de las figuras
[25] Figura 1 : En la figura se muestra el mapa de restricción del plásmido empleado en la transfección de la línea celular CHO.K1 ;
[26] Figura 2: la figura 2A muestra un SDS-PAGE teñido con Coomasie Blue; la figura
2B muestra las bandas delWestern Blota. partir del gel de la figura 2A; la figura 2C es la representación gráfica de la distancia migrada por cada patrón de peso molecular (PM) en función del logaritmo del PM. En A, B y C la calle 1 corresponde a 25μg de EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen); la calle 2 corresponde a 25 μg de la eritropoyetina de la invención, la calle 3 corresponde a patrones de PM (BioRad, EE.UU), la calle 4 corresponde a 5μg de EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen), la calle 5 corresponde a 5 μg de la eritropoyetina de la invención;
[27] Figura 3; la figura 3 A muestra las bandas del ensayo de isoelectroenfoque teñidas con Coomasie Blue. La calle 1 corresponde a asialo-EPO, la calle 2 corresponde a la eritropoyetina de la invención, la calle 3 corresponde a eritropoyetina comercial(Eprex, Cilag-Jansen)y la calle 4 corresponde a patrones de pl (Amersham Bioscience). La figura 3B es una representación gráfica del pl en función de la distancia de migración de cada pl obtenido;
[28] Figura 4: la figura 4 muestra curvas de supervivencia de ratones con sepsis experi- mentalmente provocada. Los animales recibieron 1 hora antes de una ligadura y doble punción del ciego (LPC) dosis de 5 μg /Kg, 15 μg /Kg, 30 μg /Kg o 50 μg /Kg de la combinación de glicoisoformas de EPO de la invención o Placebo (Control).
[29] Figura 5: la figura 5 muestra curvas de supervivencia de los ratones con sepsis ex- perimentalmente provocada. Los animales recibieron 1 hora antes de la LPC dosis de 15 μg /Kg, 30 μg /Kg o 50 μg /Kg de EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen) o Placebo (Control).
[30] Figura 6: la figura 6 muestra curvas de supervivencia de los ratones con sepsis ex- perimentalmente provocada. Los animales recibieron 1 hora antes de la LPC dosis de 15 μg /Kg, 30 μg /Kg o 50 μg /Kg de Asialo-EPO o Placebo (Control).
[31] Figura 7: la figura 7 muestra la frecuencia de lesiones histopatologicas generales en ratones sépticos tratados en forma preventiva con 50 μg de EPO comercial o con 50 μg de la combinación de EPO de la invención.
[32] Figura 8: la figura 8 muestra curvas de supervivencia de los ratones con sepsis ex- perimentalmente provocada. Los animales recibieron 1 hora después de la LPC dosis de 15 μg /Kg, 30 μg /Kg o 50 μg /Kg de la combinación de glicoisoformas de EPO de la invención o Placebo (Control).
Descripción detallada de la Invención
[33] A los efectos de la presente solicitud de patente siempre que se haga referencia a 'la eritropoyetina de la invención' se refiere a un conjunto o combinación de glicoisoformas de eritropoyetinas.
[34] Una glicoisoforma de eritropoyetina se define como una eritropoyetina que tiene un único punto isoeléctrico (pl). Las diferentes glicoisoformas tienen la misma secuencia de aminoácidos pero difieren en su pl.
[35] De acuerdo a la presente invención se proveen líneas celulares eucariotas trangénicas, preferentemente líneas celulares transgénicas que expresan eritropoyetina, particularmente una combinación de glicoisoformas de eritropoyetinas, en donde dicha combinación comprende desde glicoisoformas que comprenden 4 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina hasta isoformas que comprenden 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Por ejemplo glicoisformas que comprenden 4, 5, 6, 7, 8, 9 y/o 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina.
[36] Por ejemplo la línea celular eucariota puede ser, sin limitarla a, líneas celulares de mamíferos como las líneas CHO, Vero, MDCK, preferentemente la línea celular eucariota es la línea CHO y más preferentemente es la línea celular transgénica AB2H52 depositada bajo Tratado de Budapest el 22 de Junio de 2005 en el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bajo el número de acceso DSM ACC2727.
[37] En referencia al esqueleto de aminoácidos, la eritropoyetina producida por la línea celular de la invención incluye pero no está limitada a muteήias de eritropoyetina como aquéllas que tiene aminoácidos alterados en el extremo carboxi terminal (ver patente US N° 5.457.089, incorporada aquí totalmente como referencia), análogos; péptidos que se unen al receptor; pequeñas moléculas que mimetizan a la eritropoyetina denominadas en la presente solicitud como miméticos (patente US N° 2002/0016350, incorporada aquí totalmente como referencia); eritropoyetina natural; imitantes, por ejemplo aquéllas modificadas en función de reducir su inmunogenicidad (patente US N° 2004/0063917, incorporada aquí totalmente como referencia), o modificadas para incrementar su actividad (patente US 2004/0091961, incorporada aquí totalmente como referencia); conjugada (patente US 2004/0266690, incorporada aquí totalmente como referencia). Los expertos en el arte saben que a los efectos de la presente invención podría producirse eritropoyetina con cualquier esqueleto de aminoácidos siempre que la línea celular produzca glicoisoformas que comprendan entre 4 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Por ejemplo, el esqueleto de aminoácidos de la eritropoyetina puede ser la SEQ ID N° 1.
[38] La línea celular de la invención fue obtenida transfectando células CHO.K1 con el plásmido que se muestra en la Figura 1. Las células seleccionadas en cultivo que producían eritropoyetina se clonaron y se evaluó la combinación de glicoisoformas producidas mediante Western blot de isoelectroenfoque seguido de un ensayo de densitometría de bandas.
[39] En función de desplazar el perfil de glicoisoformas hacia las de menor contenido de ácido siálico, los clones seleccionados fueron cultivados en diferentes condiciones. La presencia en el medio de cultivo de N-acetilglucosamina incrementó los porcentajes relativos de las glicoisoformas menos acídicas. Por otra parte la adición de cloruro de amonio 2,5 mM desplazó también el perfil de isoformas hacia las menos acídicas y finalmente el agregado de cloruro de sodio 50 mM en el medio de cultivo también produjo el desplazamiento deseado. Cualquier experto en el arte sabe que se puede utilizar otras sales diferentes de cloruro de sodio mientras se mantenga la osmolalidad del medio de cultivo en un valor de entre 310 y 450 miliosmol/kg de solvente.
[40] En una realización preferida la línea celular de la presente invención se puede obtener seleccionando los clones que producen la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la invención. En otra realización preferida la línea celular seleccionada puede ser cultivada en presencia de cloruro de amonio, cloruro de sodio, N- acetilglucosamina o combinaciones de los mismos para inducir la producción y liberación de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la invención (glicoisoformas 4 a 10 combinadas en diferentes proporciones, pudiendo estar ausente en la combinación una o más de las glicoisoformas). Por ejemplo, la combinación de glicoisoformas puede comprender una cantidad de entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9 y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10.
[41] En un ensayo comparativo se calculó el peso molecular aparente de la eritropoyetina de la invención y la eritropoyetina comercial (Eprex, Cilag-Jansen). Tal como se puede observar en la Figura 2 elPM de EPO estándar comercial es de 35.500 Da y el PM de la eritropoyetina de la invención es de 33.300 Da. Esta disminución en el peso molecular se debería al menor contenido promedio de ácidos siálicos de la eritropoyetina de la invención.
[42] En otro ensayo comparativo se determinó el punto isoeléctrico (pl) de la eritropoyetina de la invención, asialo eritropoyetina y eritropoyetina comercial (Eprex, Cilag-Jansen). Tal como se muestra en la figura 3, la calle de la asíalo eritropoyetina (1) muestra sólo las bandas a y b que corresponden a un pl de 6,7 y 6,6 respectivamente. La calle 2 donde se sembró la eritropoyetina de la invención muestra las bandas desde c hasta i que corresponde a un pl de entre 4,0 y 5,3. La calle 3 en donde se sembró la EPO comercial muestra bandas desde j hasta m que corresponden a un pl entre 3,5 y 4,3.
[43] De los ensayos realizados surge que el contenido medio de ácido siálico es el siguiente:
[44] Eritropyetina de la invención: 7,6 moles de ácido siálico/mol de polipéptido. [45] Asialo-EPO: 4,4 moles de ácido siálico/mol polipéptido. [46] EPO comercial(Eprex, Cilag-Jansen): 11,3 moles de ácido siálico/mol polipéptido. [47] Se determinó el pl, los porcentajes y el contenido de ácido siálico de cada gli- coisoforma de la eritropoyetina de la invención mediante la técnica de isoelec- troenfoque (Tabla 1). El contenido de ácido siálico de cada una de las glicoisoformas se muestra en la siguiente tabla:
[48] Tabla 1
Figure imgf000012_0001
[49] La combinación de la invención puede comprender cualquier proporción de glicoisoformas de cada una de las isoformas 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10; y todas ellas combinadas de diferentes maneras se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En la combinación de la invención podría estar ausente una o más de las glicoisoformas o podría ser diferente la proporción de cada glicoisoforma presente en la combinación. Todas estas variantes se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
[50] Se realizaron ensayos para evaluar comparativamente la actividad biológica de la eritropoyetina de la invención, la eritropoyetina comercial (Eprex, Cilag-Jansen) y la asialo eritropoyetina. Tal como se muestra en la Tabla 2 la eritropoyetina de la invención muestra unaactividad eritropoyética in vitro intermedia entre la asialo-Epo y la EPO comercial.
[51] Tabla 2
[52]
Figure imgf000013_0001
[53] Sin embargo, la actividad hematopoyética in vivo medida utilizando ratones nor- mocitemicos según Farmacopea Europea de la preparación de esta invención es notablemente inferior a la de la EPO comercial (Tabla 3).
[54] Tabla 3 [55]
Figure imgf000013_0002
[56] En función de comparar la vida media plasmática de la eritropoyetina de la invención, la asialo EPO y la EPO comercial(Eprex, Cilag-Jansen)se realizaron ensayos in vivo en ratas Wistar. Los resultados del cleareance plasmático se muestran en la Tabla 4. Tal como era de esperar la eritropoyetina de la invención presenta un clearance plasmático intermedio entre el clearance de la EPO comercial más acídica y la asialoEPO.
[57] Tabla 4 [58]
Figure imgf000013_0003
[59] Posteriormente se estudió el efecto preventivo de la preparación de la invención sobre la sobrevida de ratones sépticos en los cuales la infección se indujo por medio de la técnica de ligadura y punción del ciego (LPC). Se observó que la eritropoyetina de la invenciónredujo la mortalidad cuando se administró en dosis de 15μg/Kg, 30μg/Kg y 50μg/Kg (Figura 4) (p= 0.02, 0.03 y 0.01 respectivamente)(Logrank Test).
[60] Ningún animal del grupo Sham falleció (definición: grupo Sham se refiere a animales a los que se le realizó una cirugía simulada para evaluar el stress quirúrgico).
[61] A diferencia de la eritropoyetina comercial la combinación de glicoisoformas de
EPO de la invención pueden ser utilizadas a dosis mayores son producir efecto trombopoyético. La EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen) disminuyó la mortalidad cuando se administró en una dosis 15 μg/Kg (Figura 5). Sin embargo en dosis mayores la EPO comercial no fue efectiva aumentando la mortandad debido probablemente al daño producido por el aumento de la eritropoyesis y su consecuente efecto trombopoyético. La Asialo-EPO no redujo la mortalidad en todas las dosis estudiadas (Figura 6).
[62] La aplicación de eritropoyetina puede prevenir o ser de utilidad para el tratamiento de la septicemia siempre y cuando dicha eritropoyetina no sea la asialo-EPO.
[63] Tal como se divulga en la presente, cualquier combinación de glicoisoformas de eritropoyetina o una única glicoisoforma son de utilidad para el tratamiento y la prevención de la septicemia, el shock séptico y otros desórdenes tales como shock hipovolémico severo o de origen cardiogénico, y otras causas no infecciosas tales como politraumatismo, pancreatitis, quemaduras severas, y los ocasionados por agentes tóxicos, hipoxia, isquemia o necrosis entre otros.
[64] En una realización preferida la combinación de glicoisoformas para el tratamiento y la prevención de la septicemia es la combinación que comprende glicoisoformas de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina. Más preferentemente es la combinación de glicoisoformas que libera al medio de cultivo la línea celular de la presente invención.
[65] Por otro lado, se estudió el daño multiorgánico (DMO) de los animales tratados. La
Figura 7 muestra que la combinación de isoformas de la invención disminuyó drásticamente la incidencia de lesiones histopatológicas graves asociadas con la sepsis (4.2% vs Control 28% p= 0.001) mientras que con la administración de EPO comercial no se observó dicho beneficio (EPO comercial 25.5% vs Control 28% p= NS). La Tabla 5 muestra que la incidencia de daño renal grave (congestión intensa, necrosis tubular aguda o necrosis renal focal) fue la siguiente: Control: 28.5%, EPO comercial: 14.2%, combinación de EPO de la invención: no se observaron lesiones renales. Presentaron compromiso hepático (congestión intensa o necrosis) el 25% en el grupo control, el 37.5% en el grupo EPO comercial y el 12.5% en el grupo de animales tratados con la combinación de EPO de la invención.
[66] En el grupo de animales tratados con la combinación de EPO de la invención no se observó daño intestinal, mientras que el 42.8% de los animales del grupo control y el 37.5% de los animales tratados con EPO comercial presentaron necrosis o lisis apical del intestino. El 25% de los animales tanto del grupo control como del grupo de animales tratados con EPO comercial y en el 12.5% del grupo de animales tratados con la la combinación de EPO de esta invención tuvieron lesiones pulmonares asociadas con sepsis (necrosis, congestión intraalveolar o hemorrágica).
[67] Los animales del grupo tratado con la combinación de isoformas de la presente invención no tuvieron lesiones cardíacas, mientras que presentaron daño miocárdico (congestión) el 37.5% del grupo control y el 25% del grupo de animales tratados con EPO comercial. Ningún ratón tuvo lesión cerebral, a excepción de un animal del grupo control que presentó infiltrado inflamatorio.
[68] Tabla 5: Lesiones histopatológicas presentes en órganos de animales sobrevivientes de sepsis experimental [69] GRUPO CONTROL
Figure imgf000015_0001
[70] GRUPO DE ANIMALES TRATADOS CON EPO COMERCIAL [71]
Figure imgf000016_0001
[72] Estos resultados demuestran claramente que la combinación de isoformas de EPO de la invención es útil en la prevención del daño multiorgánico y la muerte provocada por la sepsis.
[73] Para verificar si la preparación de la invención es también útil para evitar la muerte provocada por la sepsis una vez que esta establecida, se indujo sepsis experimental en ratones utilizando la técnica LPC. Se observó que la combinación de isoformas de la invención redujo significativamente la mortalidad cuando se administró en una dosis de 50 μg/Kg 1 hora después de la LPC (Fig. 8). Por lo tanto, la preparación de la invención es también útil para mejorar la sobrevida cuando el tratamiento se aplica post-sepsis.
[74] La invención también abarca una composición farmacéutica para el tratamiento de la septicemia u otros desórdenes relacionados. En una realización preferida la composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la septicemia comprende diferentes combinaciones de glicoisoformas de eritropoyetina, por ejemplo una combinación de glicoisoformas, en donde dicha combinación comprende glicoisoformas de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina, en donde puede estar ausente en dicha combinación una o más glicoisoformas o puede dicha combinación comprender diferentes proporciones e cada glicoisoforma. Más preferentemente es la combinación de glicoisoformas que libera al medio de cultivo la línea celular de la presente invención; y excipiente conocidos en el estado del arte.
[75] La composición farmacéutica de la invención puede estar elaborada en la forma de por ejemplo comprimidos, tabletas, cápsulas, partículas; soluciones sublinguales, in- tranasales, inyectable u otras formas conocidas en el arte, encontrándose todas ellas dentro del alcance de la presente invención.
[76] A modo de ejemplo no limitante la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender cada
[77] 1 mL de solución inyectable 400,00 mg/mL de eritropoyetina de la invención; albúmina humana, 1,2 mg de monohidrato de fosfato de sodio monobásico; 1,8 mg de fosfato de sodio dibásico anhidro; 0,7 mg de citrato de sodio; 5,8 mg de cloruro de sodio y 6,8 mg de ácido cítrico en agua USP para inyectables (pH 6.9 ± 0.3).
[78] El uso de la combinación de isoformas de EPO de la invención se puede aplicar a mayores concentraciones que la EPO comercial para el tratamiento o prevención de la septicemia u otros desórdenes asociados sin producir efectos tales como aumento de la eritropoyesis. Por otra parte, la aplicación de asialo-EPO es de escasa utilidad para el tratamiento de la septicemia.
[79] Esta invención se encuentra mejor ilustrada según los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser interpretados como una limitación impuesta al alcance de la misma. Por el contrario, debe entenderse claramente que puede recurrirse a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que luego de leerse la presente descripción, puede sugerir a aquellos entendidos en el tema sin apartarse del espíritu de la presente invención y/o alcance de las reivindicaciones anexas.
Ejemplos
[80] Ejemplo 1 : Obtención de una línea celular productora de eritropoyetina.
[81] Se utilizó la línea celular CHO.K1 (ATCC CCL-61). Se utilizó para las etapas de crecimiento y mantenimiento el medio de cultivo denominado Medio 1 (constituido por una mezcla 1 : 1 de los medios D-MEM (Gibco) y Ham's F12 (Gibco) su- plementados con bicarbonato de sodio (Gibco) 2,441 g/1, D(+) glucosa anhidra (Sigma) 1,183 g/1, piruvato de sodio (Gibco) 0,11 g/1, glutamina (Sigma) 1,10 g/1, triptófano (Sigma) 0,027 g/1, ácido aspártico (Sigma) 0,04 g/1, serina (Sigma) 0,080 g/1, suero fetal bovino (SFB) (Bioser) 8% V/V y gentamicina (Gibco) 50 μg/ml).
[82] Las células fueron transfectadas con el plásmido denominado pnrepo (figura 1), obtenido a partir de clonar el gen de la eritropoyetina humana en el plásmido comercial pClneo de expresión en eucariotas.
[83] Se seleccionaron las células transfectadas empleando el antibiótico Neomicina y se analizaron las líneas celulares productoras empleando el ensayo de inmunodot.
[84] Las líneas celulares que mostraron una alta producción de eritropoyetina se clonaron empleando el método de las diluciones limitantes. Se seleccionaron por inmunodot los clones más productores y se analizó el patrón de isoformas de eritropoyetina producido por cada uno de dichos clones seleccionados.
[85] Ejemplo 2: Evaluación del patrón de glicosilación de las glicoisoformas producidas.
[86] Se estudió el patrón de isoformas producido por cada clon mediante Western blot de isoelectroenfoque seguido por densitometría de bandas. La focalización isoeléctrica se realizó en un equipo Multiphor II (GE, Healthcare).
[87] El soporte electroforético se preparó empleando la mezcla acrilamida/bisacrilamida en una concentración del 8% (P/V) con el agregado de urea 7 M y anfolitos para generar un rango de pH entre 3 y 10.
[88] El pre-enfocado de los anfolitos se llevó a cabo durante 1 h empleando 2000 V-100 mA-10 W, a 10° C. Posteriormente, se sembraron 20 μl (20 μg) de muestras de las glicoisoformas de EPO purificadas parcialmente de los sobrenandantes de los clones seleccionados. Se procedió al enfocado durante 30 min., empleando las mismas condiciones.
[89] Luego de realizado el isoelectroenfoque, el gel fue coloreado con solución de
Coomasie Blue o, alternativamente, se llevó a cabo una transferencia de las isoformas a membranas de nitrocelulosa. La transferencia se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente. [90] Finalmente se detectó la presencia de glicoisoformas de EPO en las membranas de nitrocelulosa mediante una reacción inmunoquímica específica. Se seleccionaron los clones que mostraban un patrón de glicoisoformas en donde predominaban aquéllas con menor contenido de ácido siálico y se realizó un desplazamiento hacia las glicoisoformas con menor contenido de ácido siálico.
[91] Ejemplo 3: Obtención de clones de células productoras de eritropoyetina con bajo contenido de ácido siálico.
[92] En función de obtener clones que produzcan un perfil de isoformas de eritropoyetina humana desplazado hacia aquéllos de menor contenido de ácido siálico, se cultivaron los clones seleccionados en el Ejemplo 2 bajo diferentes condiciones;
[93] a)en medio SMIF 6 adicionado con 20 mM de N-acetilglucosamina (GIcNAc).
[94] b)en medio SMIF 6 adicionado con 2,5 mM de NH 4 Cl.
[95] c)en medio SMIF 6 adicionado con 50 mM de NaCl.
[96] Se evaluó el patrón de glicosilación de las isoformas empleando los métodos descriptos en el Ejemplo 2 y se seleccionaron los clones que producían un patrón de isoformas con un bajo contenido en ácido siálico.
[97] Ejemplo 4: enriquecimiento y purificación de las isoformas de eritropoyetina humana con menor contenido de ácido siálico.
[98] En una primera etapa se llevó a cabo la filtración del sobrenadante del cultivo en cartuchos con un tamaño de poro de 3 - 0,8 μm y secuencialmente en cartuchos con un tamaño de poro de 0,8 - 0,45 μm (PaIl Technology, EE.UU), utilizando una presión inferior a 0,5 kgf/cm . La cosecha filtrada fue inmediatamente procesada.
[99] Posteriormente un volumen de 18 litros del medio filtrado fue aplicado a una columna BPG 100/500 (1O x 12,7 cm) conteniendo 1 litros de Blue-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) previamente equilibrada en fosfatos 50 mM pH 7 a un flujo variable entre 11 y 27 ml/min. Esta metodología permitió la captura de la totalidad de isoformas de EPO presentes en el sobrenadante de cultivo.
[100] Luego se lavó la columna con buffer de equilibrio empleando entre 4 y 7 volúmenes de columna (VC) de solución. La totalidad de las glicoisoformas de EPO adsorbidas fueron recuperadas empleando entre 2,5 y 4 VC de una solución de NaCl 675 mM, etanol 20% (VfV), Tris 20 mM pH 6,5 a un flujo entre 44 y 67 ml/min. La columna fue lavada exhaustivamente empleando agua calidad milliQ y se conservó en solución de etanol al 20% (VN). El producto de la elución se concentró hasta un volumen de entre 75 y 100 mi y se realizó un cambio de buffer con solución de Tris 20 mM pH 6,5 empleando un sistema de ultrafiltración tangencial Pellicon (Millipore, EE.UU.) con cartuchos de 10 kDa de tamaño de poro y 0,1 m de superficie. Se diafiltró empleando 10 veces el volumen del concentrado. El producto obtenido se conservó a -20 0C o se procesó inmediatamente. [101] Se aplicaron entre 2,1 y 6,2 litros del producto obtenido en la etapa anterior en una columna BPG 100/500 (10 x 14 cm) conteniendo 1,1 litros de Q-Sepharose Big Bead (Amersham Biosciences) previamente equilibrada en una solución de Tris 20 mM pH 6,5 a un flujo de 25 ml/min. Se lavó con 1,5 a 2,5 VC de buffer de equilibrio. Las isoformas menos acídicas de EPO se recuperaron empleando entre 3 y 4 VC de una solución de glicina 50 mM.
[102] La elución de glicina 50 mM fue llevada a pH 5 mediante el agregado de buffer acetato 1 M pH 5 y una solución de NaOH 10 N. Un volumen de 2 a 3 litros de muestra fue aplicado a una columna XK 50/20 (2,5 x 5 cm) conteniendo 50 mi de Q- Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) previamente equilibrada en buffer acetato 20 mM pH 5 a un flujo de 25 ml/min.
[103] Se realizaron dos lavados, uno con 5 VC de buffer acetato 20 mM pH 5 y el otro con 1 VC de buffer citratos 20 mM pH 6,5. Las glicoisoformas de EPO menos acídicas se recuperaron con una solución de NaCl 100 mM en citratos 20 mM pH 6,5 recolectando 7 volúmenes de columna. El flujo de trabajo fue constante durante toda la experiencia.
[104] Ejemplo 5: Caracterización de la eritropoyetina de la invención
[ 105] a)Determinación del peso molecular
[106] La determinación del peso molecular aparente de las diferentes muestras de EPO purificadas de acuerdo al ejemplo 4 se realizó mediante electroforesis en gel de poli- acrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) y un agente reductor de enlaces disulfuro (beta-mercaptoetanol). La electroforesis fue llevada a cabo siguiendo esencialmente el método descripto por Laemmli (Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. Nature 227:
680-685, incorporada a la presente como referencia) utilizando el sistema de electroforesis modular Mini Protean II (Bio Rad, CA, EE.UU).
[107] Para ello, muestras de EPO (25 μg) fueron resuspendidas en solución de Tris-HCl
50 mM, SDS 2 % (P/V), glicerol 10% (V/V), β-ME 5% (V/V), azul de bromofenol 0,05% (P/V), pH 6,8. Las muestras fueron incubadas a 100 °C durante 3 min y fueron aplicadas sobre el gel de apilamiento, cuya concentración de acrilamida/bisacrilamida fue del 5% (P/V). El gel de separación fue polimerizado con una concentración de acrilamida/bisacrilamida del 12% (P/V). Simultáneamente, se sembraron marcadores de peso molecular (Bio-Rad) con el fin de determinar el peso molecular aparente de las muestras estudiadas. La corrida electroforética se llevó a cabo a voltaje constante (200 V) hasta que el frente de corrida alcanzó 0,5cm del borde inferior del gel de separación.
[108] Finalmente, el gel fue coloreado mediante tinción con el colorante Azul Brillante de
Coomasie, sumergiéndolo durante 10 minutos en solución de Coomasie R-250 0,1% (P/V) en metanol 40% (V/V) y ácido acético 10% (WV). La decoloración del gel se llevó a cabo empleando solución de metanol 7,5% (V/V) y ácido acético 5% (V/V) hasta la aparición de bandas nítidas sobre un fondo completamente desteñido.
[109] La determinación del peso molecular aparente fue realizada mediante interpolación de la distancia migrada por cada muestra en una representación gráfica de la distancia migrada por cada marcador en función de su peso molecular.
[110] b)determinación del punto isoeléctrico :
[111] La determinación del punto isoeléctrico aparente de las diferentes muestras de EPO fue realizada mediante la técnica de isoelectroenfoque en gel empleando el sistema Multiphor 11 (GE Healthcare, Sweeden).
[112] El soporte electroforético se preparó empleando una mezcla de acrilamida/ bisacrilamida en una concentración del 8% (P/V) con el agregado de urea 7 M y de anfolitos para generar un gradiente de pH comprendido entre 3 y 10. El gel fue pre- enfocado durante 1 hora a 2000 V - 100 mA - 10 W. Posteriormente, se sembraron 20μg de las distintas preparaciones de EPO en un volumen de 20μl, procediéndose al enfocado durante 40 minutos empleando las mismas condiciones antes indicadas. Como controles se sembraron marcadores de punto isoeléctrico (GE Healthcare).
[113] Al finalizar el isoelectroenfoque, el gel fue coloreado con solución de Azul
Brillante de Coomasie y seguidamente sometido a decoloración hasta la aparición de bandas nítidas sobre un fondo completamente desteñido. La determinación del punto isoeléctrico aparente fue realizada mediante interpolación de la distancia migrada por cada muestra en una representación gráfica de la distancia migrada por cada marcador en función de su punto isoeléctrico.
[114] Ejemplo 6: Análisis in vitro de la actividad biológica de la eritropoyetina
[115] La actividad biológica fue realizada en un ensayo de proliferación empleando células TF-I.
[116] Medios de cultivos utilizados :
[117] Medio de crecimiento: 500ml de medio RPMI 1640 (Gibco, USA), 5 mi L-
Glutamina (Fluka, Alemania) 200 mM, 0,75g de NaHCO3 (Gibco, USA), 50mg/ml de gentamicina (Parafarm, Argentina), esterilizado por filtración a través de filtros de 0,22mm de poro; suplementado con 10% V/V de suero fetal bovino (SFB) (Bioser, Argentina), 5ml deb-mercaptoetanol (Merck, Alemania) 5mM, y 5ng/ml de rhGM-CSF (Growgen, Bioprofarma S. A., Argentina.
[118] Medio de ensayo: Medio de cultivo de crecimiento que carece de rhGM-CSF.
[119] Medio de lavado: Medio de cultivo de crecimiento que carece de rhGM-CSF y
SFB.
[120] Se empleó una suspensión de células TF-I en fase de crecimiento logarítmico. Se lavaron las células 3 veces con 30 mi del medio de lavado. Luego, las células se resus- pendieron en el medio de ensayo en una concentración de 200.000 cél/ml y se incubaron durante 2 horas a 37 C. Por último, se sembraron 50ml de las suspensiones celulares en cada cavidad de una placa de 96 pozos (excepto en los pozos correspondientes al control de reactivo de color) y se adicionaron: 50μl de la eritropoyetina de la invención purificada de acuerdo al Ejemplo 4, 50μl de una eritropoyetina comercial(Eprex, Cilag-Jansen)(7500 mU/ml) en diluciones seriadas al medio de forma tal que las concentraciones de la curva variarán entre 15 y 2000 mU/ml, 50μl de asialo EPO y 50μl de medio de ensayo según corresponda. Se incubaron las placas a 37°C durante 72 horas.
[121] Los controles ensayados fueron realizados según el siguiente detalle:
[122] -control positivo: 50mlde medio de ensayo, suplementado con 7500 mU/ml de
EPO.
[123] -control negativo: 50mlde medio de ensayo.
[124] -control de reactivo de color: sólo se colocaron lOOmlde medio de ensayo.
[125] Finalmente, se agregó a cada cavidad 20ml de la solución colorante (2ml de una solución de 2,00 mg/ml de MTS (Promega, USA) y 10OmI de una solución de 0,92 mg/ml de PMS (Sigma, USA)). Se incubó a 37°C y se leyó el color desarrollado a las 6 horas en un lector de ELISA a dos longitudes de onda, 492 y 690 nm.
[126] Ejemplo 7: Evaluación del clearance de eritropoyetina
[127] Se utilizaron 18 ratas hembras de la cepa Wistar entre 8 y 10 semanas de edad, de
20Og de peso, provenientes del bioterio de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA, Argentina).
[128] Los animales se alojaron en el bioterio del Laboratorio de Cultivos Celulares de la
FBCB-UNL, con acceso libre al agua y dieta balanceada.La temperatura del sector fue mantenida en 23°C. El régimen de iluminación fue de 12 hs. luz - 12 hs. oscuridad.
[129] Los animales fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos de 6 animales. Cada grupo fue además dividido en 3 subgrupos de 2 animales cada uno. Cada subgrupo fue mantenido enjaulas separadas.
[130] Las preparaciones evaluadas fueron: la preparación de la invención, EPO comercial
(Eprex, Cilag-Jansen) y Asialo-EPO.
[131] Para preparar la Asialo- EPO se mezclaron EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen), cantidad suficiente de un buffer provisto en el kit Neuroaminidasa-P0720S (New England BioLabs Inc, US A) y cantidad suficiente de la enzima neuroaminidasa provista en dicho kit. Se mezcló y se incubó por 2 h a 37°C. Finalmente la mezcla se dializó contra PBS toda la noche a 4°C.
[132] Los animales fueron anestesiados a través de la inyección intramuscular de una mezcla de 140μl de Ketamina 50 mg/ml y 75μl de Xilacina 20 mg/ml. Una vez anestesiados, los animales se inocularon con una inyección en la vena principal de la cola. Cada animal fue inyectado con 500μg de la eritropoyetina correspondiente según esquema de tratamiento, en un volumen de 500μl de solución, empleando jeringas de tuberculina provistas de agujas 29g. [133] Se realizó el sangrado de los animales por punción de la vena retroorbital con una pipeta Pasteur heparinizada, colectándose la sangre en tubos Falcon de 15ml conteniendo 5OmL de heparina sódica 5000 Ul/ml. Las muestras se centrifugaron 20 min a 700 g y a 20°C en una centrífuga Eppendorf 5403 (Alemania) y el plasma así obtenido se conservó a -200C. [134] Se tomaron muestras de sangre a los animales de cada grupo a los 0, 2, 6, 15, 30 y
60 minutos post inyección y a las 2, 3, 5, 24 y 30 horas post inyección. [135] Se determinó la concentración en plasma de las distintas eritropoyetinas inyectadas mediante un ELISA sandwich (Amadeo, I., et al., J. Immunol. Meth. 293: 191-205,
2004, incorporado totalmente a la presente como referencia). [136] Se construyeron curvas de concentración versus tiempo post-inyección, a partir de las cuales se obtuvieron los siguientes parámetros farmacocinéticos: [137] Concentración máxima en plasma (C max ) y Tiempo máximo (T max ), que corresponde al tiempo cuando se alcanza la concentración máxima C max .
[138] Se determinaron además otros parámetros farmacocinéticos a partir del ajuste de los datos experimentales mediante una ecuación bi-exponencial para la concentración plasmática (C) como función del tiempo (t), tal como se muestra en la ecuación (1):
[139] C = A.e" αt+ B.e"βt(l)
[140] Donde A y a son constantes de la fase inicial que reflejan la distribución de la eritropoyetina en todos los fluidos intracelulares del animal, mientras que B yβson constantes de la fase de eliminación relacionadas al clearance plasmático real (Donahue et al.,Cold Spring Harbor Symp Quant. Biol.51, 685-692, 1986, incorporada en la presente en su totalidad como referencia). Estas constantes fueron estimadas de los datos empíricos utilizando herramientas informáticas (Microcal™ Origin™ Versión 5.0, Microcal Software, EE. UU.). El tiempo de vida media de distribución (T β), el tiempo de vida media de eliminación (T α ) y el clearance plasmático total (CL) se calcularon empleando las ecuaciones (2), (3) (4), respectivamente:
[141] T a = 0.693/a(2)
[142] T β= 0.693/β(3)
[143] CL = dosis/AC 0-co (4)
[144] Donde AC 0-co es el área bajo la curva de concentración en función del tiempo, de cero a infinito. Las diferencias entre las tres preparaciones se evaluaron mediante un test de Student pareado, considerándose significativas aquellas probabilidades menores a 0,05. [145] Ejemplo 8: Determinación de la actividad eritropoyetica 'in vivo' [146] Para determinar la actividad eritropoy etica 'in vivo' de las distintas preparaciones se realizó un ensayo utilizando ratones normocitopénicos según la Farmacopea Europea.
[147] Se realizaron diluciones de la muestra a analizar utilizando un buffer fosfato/ albúmina pH 7,2. El buffer se preparó de acuerdo a las siguientes instrucciones: disolver 10,75 g de fosfato ácido disódico y 7,6 g de cloruro de sodio en 900 mi de agua destilada; agregar 5 mi de una solución concentrada de albúmina humana 200 mg. /mi y completar con agua destilada c.s.p. un volumen final de 1.000 mi. Ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio diluido o con ácido fosfórico diluido.
[148] Se realizaron tres diluciones seriadas de orden 3 de la muestra y de un Standard internacional de EPO de manera que las diluciones del Standard contenían 20, 60 y 180 UFmI de EPO.
[149] Se inocularon ratones NMRI hembras de dos meses de edad por vía subcutánea con
0,5 mi de cada dilución de la muestra y del Standard, empleando 6 ratones por dilución.
[150] Después de 4 dias los ratones se anestesiaron con pentothal sódico (3 mg/0,5 mi/ ratón) y se sangraron por el seno retrorbital, usando capilares heparinizados. La sangre se transfirió a tubos Eppendorf con 5 μl de heparina sódica.
[151] Se cuantificaron los reticulocitos tomando 5 μl de un buffer de reticulocitos pH 7,2.
El buffer se preparó de acuerdo al siguiente protocolo: disolver 10,75 g de fosfato ácido disódico, 7,6 g de cloruro de sodio, 0,2 g de azida sódica y 0,74g de EDTA en agua destilada y luego llevar a volumen final de 1.000 mi. Ajustar el pH a 7,2.
[152] Se agitó para homogeneizar y se realizó la tinción fluorescente agregando 0,5 mi de solución de trabajo de Naranja de Thiazol a cada tubo. Se mezcló y se dejó 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La lectura se realizó en un citómetro de flujo (Becton Dickinson FACSCalibur P/N 34012420). Se leyeron 60.000 eventos para cada muestra y los datos se procesaron con el programa Retic-count. Los datos se ingresaron en un programa estadístico para obtener la potencia de la muestra.
[153] Ejemplo 9: Evaluación de la eritropoyetina de la invención como principio activo para el tratamiento de la sepsis, y determinación de la dosis adecuada.
[154] Animales: Seutilizaron ratones CfI hembras de 5 a 7 semanas de edad, de aproximadamente 25-3Og de peso.
[155] Los animales se alojaron en el bioterio y permanecieron en el mismo como mínimo
7 días para permitir su aclimatación, con acceso libre al agua y dieta balanceada.La temperatura del sector fue mantenida en20 + 2 °C. El régimen de iluminación fue de 12 hs. luz - 12 hs. oscuridad.
[156] Una hora antes en el caso de prevención ó 1 hora después como tratamiento de la inducción de la sepsis los animales recibieron por vía subcutánea una dosis equivalente a 5 μg/Kg, 15 μg/Kg, 30 μg/Kgy 50 μg/Kgde la eritropoyetina de la invención, EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen) y Asialo-EPO, según corresponda por kg de peso. El grupo control recibió igual volumen de solución fisiológica.
[157] La inducción de la sepsis se llevó a cabo empleando el modelo experimental de sepsis ligadura y doble punción de ciego (LPC) (Witchterman KA, B aune AE, Chaudry IH.Sepsis and septic shock-a review of laboratory models and a proposal. J Surg Res 1980; 29: 189-201, incorporada a la presente sólo como referencia). Brevemente, los animales estuvieron en ayunas durante las 12 horas previas a la intervención. Para evitar hipoglucemia se reemplazó el agua de los bebederos con glucosa al 10%. Los ratones fueron anestesiados intraperitonealmente con ketamina/ Xilazina (133:10 ug/g ratón) (ketamina Holliday® 50 mg/ml y xilacina Narcoxil® 20 mg/ml). Posteriormente, se efectuó una laparotomía medial mínima. El ciego fue ligado con sutura quirúrgica a 1 cm de su extremo distal, cuidando no obstruir la válvula ileocecal. Se efectuaron dos orificios con una aguja de 18g en el ciego distal al sitio de la ligadura. Se comprimió el ciego para que una pequeña cantidad de contenido entérico atraviese los orificios, se introdujo el ciego en la cavidad peritoneal y se cerró la pared abdominal en dos planos. Finalmente, para asegurar la hidratación de los ratones se inyectó por vía subcutánea 1 mi de solución salina al 0,9% y a partir de allí todos los animales tuvieron libre acceso a agua y alimento.
[158] En un grupo de animales se le realizó una cirugía simulada para evaluar el stress quirúrgico (grupo: Sham).
[159] Se evaluó la mortalidad diaria durante 15 días en los ratones que se recuperaron de la anestesia.
[160] Al día 16 se realizó una sangría retroorbital bajo anestesia para determinar hematocrito y hemoglobina, de acuerdo a métodos estándar. Finalmente los animales fueron sacrificados y se les realizó la autopsia.
[161] Análisis estadístico: Lascurvas de supervivencia se granearon como porcentaje de supervivencia y la comparación entre las mismas se calculó con Logrank test.
[162] Ejemplo 10: Estudios de daño multiorgánico
[163] Se trataron diferentes grupos de animales con sepsis. Los animales del primer grupo recibieron 50 μg de EPO comercial (Eprex, Cilag-Jansen) por vía subcutánea, el segundo grupo 50 μg de la preparación de la invención y el tercer grupo igual volumen de solución fisiológica tiempo antes de la LPC. Los ratones fueron sacrificados al azar dentro de los primeros seis días de la LPC. Se evaluaron los siguientes órganos mediante un estudio histopatológico empleando la técnica de hematoxilina-eosina: cerebro, corazón, pulmón, intestino, hígado y riñon. En base al estudio histopatológico se establecieron las lesiones asociadas para cada órgano y para cada animal. El análisis histopatológico fue realizado en forma independiente y ciega. Se utilizó la Prueba exacta de Fisher para comparar la frecuencia de eventos y se consideró como sig- nificativa una p< 0.05. Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

Claims

Claims
[I] Una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina para el tratamiento o prevención de la sepsis, caracterizada porque dicha combinación comprende glicoisoformas de eritropoyetina que comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones.
[2] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[3] La combinación de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque la eritropoyetina es seleccionada del grupo comprendido por eritropoyetina natural, recombinante, miméticos, análogos, mutantes, y fragmentos de las mismas.
[4] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3.
[5] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[6] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para el tratamiento de la sepsis.
[7] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para la prevención de la sepsis.
[8] La combinación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha combinación comprende una cantidad de entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9 y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10.
[9] Una línea celular transgénica productora de glicoisoformas de eritropoyetina, caracterizada porque dicha línea celular es la línea celular AB2H52 depositada en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bajo el número de acceso DSM ACC2727.
[10] La línea celular transgénica de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque dicha línea celular produce y libera al medio una combinación de glicoformas de eritropoyetina.
[II] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[12] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha eritropoyetina humana es seleccionada del grupo comprendido por eritropoyetina natural, recombinante, miméticos, análogos, mutantes, y fragmentos de las mismas.
[13] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para el tratamiento de la sepsis.
[14] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para la prevención de la sepsis.
[15] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[16] La línea celular de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene un perfil de punto isoeléctrico que varía de entre 4 y 5,3.
[17] Una composición farmacéutica para el tratamiento y la prevención de la septicemia, caracterizada porque comprende como principio activo una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dichas gli- coisoformas comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones; y excipientes farmacéuticos aceptables.
[18] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[19] La composición de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada porque la eritropoyetina es seleccionada del grupo comprendido por eritropoyetina natural, recombinante, miméticos, análogos, mutantes, y fragmentos de las mismas.
[20] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3.
[21] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[22] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para el tratamiento de la sepsis.
[23] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para la prevención de la sepsis.
[24] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque los excipientes son seleccionados del grupo comprendido por conservantes, estabilizantes, diluyentes, y combinaciones de los mismos.
[25] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha composición están en la forma de comprimidos, cápsulas, masticables, tabletas, tabletas efervescentes, soluciones inyectables, partículas y soluciones sublinguales.
[26] La composición de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha combinación comprende una cantidad de entre 2 y 12% de la glicoisoforma 4, entre 5 y 25% de la glicoisoforma 5, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 6, entre 9 y 34% de la glicoisoforma 7, entre 10 y 35% de la glicoisoforma 8, entre 2 y 23% de la glicoisoforma 9 y entre 0 y 2% de la glicoisoforma 10.
[27] Un procedimiento para obtener un perfil determinado de glicoisoformas de er- itropoyetina, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de, a. cultivar en un medio de cultivo la línea celular AB2H52 depositada en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bajo el número de acceso DSM ACC2727.; y b. purificar y aislar la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina producidas.
[28] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque el medio de cultivo tiene una osmolalidad de entre 310 y 450 miliosmol/kg de solvente.
[29] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque el medio de cultivo comprende aditivos seleccionados del grupo comprendido por
N-acetilglucosamina, cloruro de amonio, cloruro de sodio y combinaciones de los mismos.
[30] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque la N- acetilglucosamina está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 1 y 100 mM.
[31] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque el cloruro de amonio está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 1 y 5 mM.
[32] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizado porque el cloruro de sodio está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 10 y 75 mM.
[33] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque la etapa b) de purificación y aislamiento comprende al menos una etapa cromatográfica.
[34] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque la combinación de glicoisoformas aisladas en la etapa b) comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones.
[35] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[36] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizado porque la eritropoyetina es seleccionada del grupo comprendido por eritropoyetina natural, recombinante, miméticos, análogos, mutantes, y fragmentos de las mismas.
[37] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3.
[38] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[39] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para el tratamiento de la sepsis.
[40] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizado porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para la prevención de la sepsis.
[41] Un procedimiento para obtener una línea celular productora de una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, caracterizado porque dicha combinación de glicoisoformas comprende glicoisoformas que comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones; y en donde el método comprende las etapas de: a.cultivar en un medio de cultivo una línea celular transgénica productora de eritropoyetina; b.clonar la línea celular; c.determinar el clon productor de dicha combinación; y d.purificar y aislar dicha combinación de glicoisoformas de eritropoyetina.
[42] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque el medio de cultivo tiene una osmolalidad de entre 310 y 450 miliosmol/kg de solvente.
[43] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque el medio de cultivo comprende aditivos seleccionados del grupo comprendido por N-acetilglucosamina, cloruro de amonio, cloruro de sodio y combinaciones de los mismos.
[44] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 43, caracterizado porque la N- acetilglucosamina está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 1 y 100 mM.
[45] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 43, caracterizado porque el cloruro de amonio está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 1 y 5 mM.
[46] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 43, caracterizado porque el cloruro de sodio está presente en el medio de cultivo en una cantidad de entre 10 y 75 mM.
[47] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque la etapa b) de purificación y aislamiento comprende al menos una etapa cromatográfica.
[48] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque la combinación de glicoisoformas aisladas en la etapa b) comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones.
[49] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizada porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[50] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 49, caracterizado porque la eritropoyetina es seleccionada del grupo comprendido por eritropoyetina natural, recombinante, mimética, análogos, imitantes, y fragmentos de las mismas.
[51] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3.
[52] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[53] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para el tratamiento de la sepsis.
[54] El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizado porque dicha combinación de eritropoyetina tiene actividad como agente para la prevención de la sepsis.
[55] Un método para el tratamiento de la septicemia, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dicha combinación de glicoisoformas comprende glicoisoformas que comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones, y en donde dicha composición comprende además excipientes farmacológicamente aceptables.
[56] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque la er- itropoyetina es eritropoyetina humana.
[57] El método de acuerdo con la reivindicación 56, caracterizado porque la eritropoyetina es eritropoyetina natural, recombinante, análogos, imitantes, miméticos, y fragmentos de las mismas.
[58] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque la eritropoyetina es administrada por una vía seleccionada del grupo comprendido por parenteral, oral, sublingual e intranasal.
[59] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende además un tratamiento seleccionado del grupo comprendido por administración de antibióticos, expansión del volumen plasmático con cristaloides, expansión del volumen plasmático con coloides, soporte de órganos que fallan incluyendo el shock, control estricto de la glucemia, regulación de la inflamación, regulación de la respuesta procoagulante y combinaciones de los mismos.
[60] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque la eritropoyetina se administra en una dosis de entre 10 y 1000 μg/Kg.
[61] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3.
[62] El método de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD.
[63] Un método para la prevención de la septicemia, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una combinación de glicoisoformas de eritropoyetina, en donde dicha combinación de glicoisoformas comprende glicoisoformas que comprenden una cantidad de ácido siálico seleccionado del grupo comprendido por 4, 5, 6, 7, 8, 9, y 10 moléculas de ácido siálico por molécula de eritropoyetina y sus combinaciones; en donde dicha composición comprende además excipientes farmacológicamente aceptables.
[64] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque la eritropoyetina es eritropoyetina humana.
[65] El método de acuerdo con la reivindicación 64, caracterizado porque la eritropoyetina es eritropoyetina natural, recombinante, análogos, imitantes, miméticos, y fragmentos de las mismas.
[66] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque la eritropoyetina es administrada por una vía seleccionada del grupo comprendido por parenteral, oral, sublingual e intranasal.
[67] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende además un tratamiento seleccionado del grupo comprendido por administración de antibióticos, expansión del volumen plasmático con cristaloides, expansión del volumen plasmático con coloides, soporte de órganos que fallan incluyendo el shock, control estricto de la glucemia, regulación de la inflamación, regulación de la respuesta procoagulante y combinaciones de los mismos. [68] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque la er- itropoyetina se administra en una dosis de entre 10 y 1000 μg/Kg. [69] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de punto isoeléctrico de entre 4 y 5,3. [70] El método de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizado porque dicha combinación tiene un perfil de peso molecular que varía de entre 32 y 34 kD. [71] El uso de la eritropoyetina para elaborar un medicamento para el tratamiento de la septicemia. [72] El uso de la eritropoyetina para elaborar un medicamento para la prevención de la septicemia. [73] El uso de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 para elaborar un medicamento para el tratamiento de la septicemia. [74] El uso de la combinación de glicoisoformas de eritropoyetina de la reivindicación 1 para elaborar un medicamento para la prevención de la septicemia.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112741895A (zh) * 2021-01-19 2021-05-04 中国人民解放军陆军军医大学 Epo类似物在制备治疗脓毒症药物中的应用

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5457089A (en) 1989-07-20 1995-10-10 Behringwerke Aktiengesellschaft Muteins of human erythropoietin, the preparation thereof and the use thereof
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US6165783A (en) 1997-10-24 2000-12-26 Neuro Spheres Holdings Ltd. Erythropoietin-mediated neurogenesis
US6268336B1 (en) 1996-06-20 2001-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for treatment of hepatic diseases
US20020016350A1 (en) 1998-04-20 2002-02-07 Connolly Peter J. Substituted amino acids as erythropoietin mimetics
US20020169129A1 (en) 1998-02-04 2002-11-14 Zaharia Veronica C. Method for improving the quality of life of patients by administration of erythropoietin (RhuEPO)
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
WO2003057242A1 (en) 2002-01-09 2003-07-17 Crucell Holland B.V. Use of erythropoietin for the preventive or curative treatment of cardiac failure
WO2003080852A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Lek Pharmaceutical And Chemical Company D.D. Process for the preparation of a desired erythropoietin glyco-isoform profile
US6673575B1 (en) 1997-12-03 2004-01-06 Roche Diagnostics Gmbh Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
US20040018978A1 (en) 2002-06-05 2004-01-29 Campana W Marie Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain
WO2004012759A2 (de) 2002-07-26 2004-02-12 Epoplus Gmbh & Co. Kg Erythropoetin zur stimulation endothelialer voläuferzellen
US20040063917A1 (en) 2001-02-06 2004-04-01 Carr Francis J. Modified erythropoietin (epo) with reduced immunogenicity
US20040091961A1 (en) 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
US20040198663A1 (en) 2003-04-04 2004-10-07 Baker John E. Method of treating cardiac ischemia by using erythropoietin
US20040266690A1 (en) 2003-05-30 2004-12-30 Chadler Pool Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL77081A (en) * 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin
BR9917606A (pt) * 1998-11-06 2002-12-31 Bio Sidus S A Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento
EP1533380B1 (en) * 1999-04-15 2009-11-04 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell comprising at least one E1 protein of adenovirus
US7297680B2 (en) 1999-04-15 2007-11-20 Crucell Holland B.V. Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content
US7767643B2 (en) * 2000-12-29 2010-08-03 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
CA2465007C (en) * 2001-10-29 2012-01-17 Crucell Holland B.V. Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications
AU2002356749A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-10 Hermann Katinger Process for the production of polypeptides in mammalian cell cultures
BR0214489A (pt) 2001-11-28 2004-10-19 Sandoz Ag Processo para a produção de um polipeptìdeo recombinante

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5457089A (en) 1989-07-20 1995-10-10 Behringwerke Aktiengesellschaft Muteins of human erythropoietin, the preparation thereof and the use thereof
US5856298A (en) 1989-10-13 1999-01-05 Amgen Inc. Erythropoietin isoforms
US6268336B1 (en) 1996-06-20 2001-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for treatment of hepatic diseases
US6165783A (en) 1997-10-24 2000-12-26 Neuro Spheres Holdings Ltd. Erythropoietin-mediated neurogenesis
US6673575B1 (en) 1997-12-03 2004-01-06 Roche Diagnostics Gmbh Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
US20020169129A1 (en) 1998-02-04 2002-11-14 Zaharia Veronica C. Method for improving the quality of life of patients by administration of erythropoietin (RhuEPO)
US20020016350A1 (en) 1998-04-20 2002-02-07 Connolly Peter J. Substituted amino acids as erythropoietin mimetics
US6531121B2 (en) 2000-12-29 2003-03-11 The Kenneth S. Warren Institute, Inc. Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs
US20040063917A1 (en) 2001-02-06 2004-04-01 Carr Francis J. Modified erythropoietin (epo) with reduced immunogenicity
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
WO2003057242A1 (en) 2002-01-09 2003-07-17 Crucell Holland B.V. Use of erythropoietin for the preventive or curative treatment of cardiac failure
WO2003080852A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Lek Pharmaceutical And Chemical Company D.D. Process for the preparation of a desired erythropoietin glyco-isoform profile
US20040018978A1 (en) 2002-06-05 2004-01-29 Campana W Marie Use of erythropoietin and erythropoietin mimetics for the treatment of neuropathic pain
WO2004012759A2 (de) 2002-07-26 2004-02-12 Epoplus Gmbh & Co. Kg Erythropoetin zur stimulation endothelialer voläuferzellen
US20040091961A1 (en) 2002-11-08 2004-05-13 Evans Glen A. Enhanced variants of erythropoietin and methods of use
US20040198663A1 (en) 2003-04-04 2004-10-07 Baker John E. Method of treating cardiac ischemia by using erythropoietin
US20040266690A1 (en) 2003-05-30 2004-12-30 Chadler Pool Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase

Non-Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMADEO, I. ET AL., J. IMMUNOL. METH., vol. 293, 2004, pages 191 - 205
ANGUS, D.C. ET AL., CRIT. CARE MED., vol. 29, 2001, pages 1303 - 10
BERNARD, G.; VINCENT, J.L.; LATERRE, P.F. ET AL.: "Efficacy and Safety of Recombinant Human Activated Protein C for Severe Sepsis", N. ENG. J. MED., vol. 344, 2001, pages 699 - 609
BERNARD, G.R.; MARGOLIS, B.D.; SHANIES, H.M. ET AL.: "Extended Evaluation of Recombinant Human Activated Protein C United States Trial (ENHANCE US)", CHEST., vol. 125, 2004, pages 2206 - 2216
BEVILACQUA, M.; NELSON, R., J. CLIN. INVEST., vol. 91, 1993, pages 379 - 387
DELLINGER, P. ET AL., CRIT. CARE MED., vol. 32, 2004, pages 858 - 73
DONAHUE ET AL., COLD SPRING HARBOR SYMP QANT. BIOL., vol. 51, 1986, pages 685 - 692
EGRIE, J.; BROWNE, J., BR. J. CANCER, vol. 84, no. 1, 2001, pages 3 - 10
ELLIOTT, S. ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 279, no. 16, 2004, pages 16854 - 16862
FRY, D.E.; PEARLSTEIN, L.; FULTON, R.L. ET AL.: "Multiple System Organ Failure", THE ROLE OF UNCONTROLLED INFECTION, ARCH. SURG., vol. 115, 1980, pages 136 - 140
FUKUDA ET AL., BLOOD, vol. 73, 1989, pages 84 - 89
GOLDWASSER ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 249, 1974, pages 4202 - 4206
GOOCHE ET AL., BIOFTECHNOLOGY, vol. 9, 1991, pages 1347 - 1355
HAIMOVITZ-FRIEDMAN, A. ET AL., J. EXP. MED., vol. 186, 1997, pages 1832 - 41
HART, CURR. OP. CELL BIOL., vol. 4, 1992, pages 1017 - 1023
HIGUCHI ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 267, no. 11, 1991, pages 7703 - 7709
HOTCHKIS, R.S. ET AL., CRIT. CARE MED., vol. 25, 1997, pages 1298 - 1307
HOTCHKIS, R.S. ET AL., CRIT. CARE MED., vol. 27, 1999, pages 1230 - 517
IMAI ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 194, 1990, pages 457 - 462
IMAI ET AL., NATURE, vol. 361, 1993, pages 555 - 557
LAEMMLI, U.K: "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", NATURE, vol. 227, 1970, pages 680 - 685, XP055108426, DOI: doi:10.1038/227680a0
MORISHITA, E. ET AL., NEUROSCIENCE, vol. 76, 1997, pages 105 - 116
NELSON ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 91, 1993, pages 1157 - 1166
NORGARD ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 1068 - 1072
PAREKH ET AL., CURR. OP. CELL. BIOL., vol. 1, 1991, pages 750 - 754
ROGERS, H.W., J. IMMUNOL., vol. 156, 1996, pages 679 - 84
See also references of EP1947115A4
SPIVAK, J.; HOGANS, B., BLOOD, vol. 73, 1989, pages 90 - 99
WANG, S.D. ET AL., J. IMMUNOL., vol. 152, 1994, pages 5014 - 21
WATSON ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 4, no. 2, 1994, pages 227 - 237
WITCHTERMAN KA; BAUNE AE; CHAUDRY IH.: "Sepsis and septic shock: a review of laboratory models and a proposal", J. SURG. RES., vol. 29, 1980, pages 189 - 201
WITTER, A.; HOWARD, S., BIOCHEM., vol. 29, 1990, pages 4175 - 4180

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