EA010726B1

EA010726B1 - Агенты, специфически связывающие ангиопоэтин-2

Info

Publication number: EA010726B1
Application number: EA200400510A
Authority: EA
Inventors: Джонатан Дэниэл Олинер
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2008-10-30
Also published as: KR20040051606A; KR20100049682A; HK1152949A1; ES2439221T3; EP1495053B1; EP1495053A2; HK1072775A1; EP2272869A2; KR101089844B1; EA200400510A1; EP2272869A3; HUP0500994A3; AU2002343498B2; JP4637480B2; EP1495053A4; JP5044608B2; ES2389060T3; PT1495053E; NZ531901A; NZ575673A

Abstract

Изобретение относится к специфическим связывающим агентам, таким как полноразмерные антитела человека, которые связываются с ангиопоэтином-2 (ANG-2). Изобретение также относится к фрагментам тяжелой цепи, фрагментам легкой цепи и CDRs антителам и способам получения и использования таких антител.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые распознают и связывают ангиопоэтин-2 (Лид-2). Более детально, изобретение относится к производству, диагностическому использованию и терапевтическому применению моноклональных и поликлональных антител и их фрагментов, которые специфически связывают Апд-2.

Предпосылки создания изобретения

Ангиогенез, формирование новых кровеносных сосудов из уже существующих, является обязательным для многих физиологических и патологических процессов. В норме ангиогенез строго регулируется с помощью про- и антиангиогенических факторов, но в случае таких заболеваний, как рак, глазные неоваскулярные заболевания, артриты и псориаз, этот процесс может пойти неправильно. Бо1ктап, I., №11 Меб., 1:27-31 (1995).

Существует целый ряд заболеваний, для которых известна их связь с нерегулируемым и нежелательным ангиогенезом. Эти патологии включают, но не ограничиваются указанными, глазные неоваскулярные патологии, такие как ретинопатии (включая диабетическую ретинопатию), старческая атрофия макулы; псориаз, гемиангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспалительные заболевания, особенно артриты (включая ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные заболевания, такие как бронхиальная астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и неопластические болезни, например, так называемые солидные опухоли и гемопоэтические опухоли (такие как лейкемии и лимфомы). Другие заболевания, ассоциированные с нежелательным ангиогенезом, хорошо известны специалистам в данной области.

Хотя многие сигнальные трансдуктивные системы задействованы в регуляции ангиогенеза, наиболее хорошо охарактеризованная и обладающая наилучшей избирательностью к клеткам эндотелия является система, включающая Т1е-2 рецептор тирозинкиназы (известный как Т1е-2 или Т1е-2К (также обозначаемый ОРК); (мышиный Т1е-2 также обозначается 1ек) и его лиганды, ангиопоэтины (Се1е. Ν.^. апб Уапсорои1о5, 6. И., Сепек Иеу, 13:1055-1066[1999]). Известно 4 ангиопоэтина; от ангиопоэтина1 (Апд-1) до ангиопоэтина-4 (Апд-4). Эти ангиопоэтины также обозначаются как Т1е-2 лиганды. (Иау15, 8., е! а1., Се11, 87:1161-1169 [1996]; Сгок1к, К., е! а1., Су!одепе! Се11 Сепе!, 84:118-120 [1999]; Но1а5к к, е! а1., 1пуек11да11уе Орй!а1то1оду & У1к1а1 8с1епсе, 42:1617-1625 [1999]; КоЬй/ек, Т. I., е! а1., Сштеп! Вю1оду, 8:529-532 [1998]; Ьт, Р., е! а1., Ргос. УШ. Асаб кс1 И8А, 95:8829-8834 [1998]; Ма1копр1егге, Р. С., е! а1., 8с1епсе, 277:55-60 [1997]; Рагаре!горои1ок, А., е! а1., ЬаЬ 1пуек!, 79:213-223 [1999]; 8а!о, Т. Ν., е! а1., Уинге, 375:70-74 [1998]; 8йуи, К.С., е! а1., С1гси1а!юп, 98:2081-2087 [1998]; 8ип, С., е! а1., Се11, 87-11711180 [1996]; 8иг1, С., е! а1., 8с1епсе, 282:468-471 [1998]; Уа1еп/ие1а, И. М., е! а1., Ргосеебтдк о£ !йе №Цюпа1 Асабету о£ Баепсек о£ !йе И8А, 96:1904-1909 [1999]; ^й/епЫсЫег, В., е! а1., I Вю1 Сйет, 273:1851418521 [1998]). В то время как Апд-1, связываясь с Ие-2, стимулирует фосфорилирование рецептора в культуре эндотелиальных клеток, Апд-2, как было замечено, является агонистом и антагонистом фосфорилирования Т1е-2 рецептора (Иау1к, 8., е! а1., [1996], кирга; Ма1копр1егге, Р.С., е! а1., [1997], кирга; К1т, I., РН. К1т, е! а1., Опсодепе 19(39):4549-4552 (2000); Теюйеп-Кийк/е^кка, К., Р.С. Ма1копр1егге, е! а1., Сагбюуакси1аг Векеагсй 49(3): 659-70(2001)).

Фенотипы Апд-1 и Т1е-2 нокаутированных мышей сходны и позволяют предположить, что стимулированное Апд-1 фосфорилирование Т1е-2 опосредует ремоделирование и стабилизацию развивающихся сосудов в матке путем поддержания клеточной эндотелиальной адгезии. (Иитоп!, И. I., е! а1., Сепек & Иеуе1ортеп!, 8:1897-1909 [1994]; 8а!о, Т. Ν., е! а1., Уинге, 376:70-74 [1995]; 8ип, С., е! а1., [1996], кирга). Считается, что способность Апд-1 стабилизировать сосуды сохраняется у взрослых людей, у которых Апд-1 наиболее широко и конститутивно экспрессирован (Напайап, И., 8с1епсе, 277:48-50 [1997]; 2ад/ад, И., е! а1., Ехрептеп!а1 №иго1оду, 159-391-400 [1999]). В противоположность этому, экспрессия Апд-2, в первую очередь, ограничена местами сосудистой ремодуляции, где, предполагается, он блокирует функционирование Апд-1, таким образом индуцируя состояние сосудистой пластичности, сопровождающей ангиогенез (Напайап, И., [1997], кирга; Но1акй, I., е! а1., 8с1епсе, 284: 1994-1998 [1999]; Ма1копр1егге, Р. С., е! а1., [1997], кирга).

Многие опубликованные исследования наглядно продемонстрировали селективную сосудистую экспрессию Апд-2 при патологических состояниях, ассоциированных с ангиогенезом. Эти патологические состояния включают псориаз, атрофию макулы и рак. (Випопе, С., е! а1., Атепсап 1опгпа1 о£ Ра!йо1оду, 155:1967-1976 [1999]; Е!ой, Т., е! а1., Сапсег Векеагсй, 61:2145-2153 [2001]; Напда1, М., е! а1., 1пуекйдабуе Орй!а1то1оду & У1к1а1 8с1епсе, 42:1617-1625 [2001]; Но1акй, I., е! а1., [1999] кирга; Кигоба, К., е! а1., 1опгпа1 о£ 1пуекбдабуе Иегта!о1оду, 116:713-720 [2001]; О1аш, А., е! а1., 1пуекбдабуе Орй!а1то1оду & У1к1а1 8с1епсе, 40:1912-1920 [1999]; 81га!тапп, А., е! а1., Атепсап 1опгпа1 о£ Ра!йо1оду, 153: 1459-1466 [1998]; Тапака, 8., е! а1., I Сйп 1пуек!, 103:34-345 [1999]; УокЫба, Υ., е! а1., 1п!ета1юпа1 1опгпа1 о£ Опсо1оду, 15:1221-1225 [1999]; Υυπη, К., е! а1., 1опгпа1 о£ Репобоп!а1 Векеагсй, 35:165-171 [2000]; 2адхад, И., е! а1., [1999] кирга). Большинство из этих исследований, в основном, посвящены изучению злокачественных опухолей, многие из которых, по-видимому, обнаруживают экспрессию сосудистого Апд-2. В противоположность тому, что экспрессия Апд-2 связана с патологическим ангиогенезом, его экспрессия в нор- 1 010726 мальных тканях существенно ограничена (Ма18опр1етге, Р.С., е1 а1.. [1997] кирга; Мсхс.|ш1а. 1., е1 а1.. Βίοοΐιοιηίοαΐ апб ВюрЬукюа1 Кекеагсй Соттишсабопк. 260:492-498 [1999]). У здорового взрослого человека существует три основных органа. где происходит ангиогенез: яичники. плацента и матка; указанные органы являются основными у здоровых (т.е. не больных раком) людей. в тканях которых обнаружена матричная РНК (ιηΚ,ΝΑ) Апд-2.

Результаты определенных функциональных исследований позволяют предположить. что Апд-2 может участвовать в ангиогенезе. происходящем в злокачественных опухолях. АНтаб е1 а1. (Сапсег Рек.. 61:1255-1259 [2001]) описал сверхэкспрессию Апд-2 на модели ксенотрансплантации у мышей и показал. что она. скорее всего. ассоциируется с увеличением роста опухоли. См. также Е1о11 е1 а1.. кирга и Тапака е1 а1.. кирга. которые в своих работах показали возможную связь сверхэкспрессии Апд-2 с опухолевой гиперваскуляризацией. Однако. в противоположность этому. Уи е1 а1. (Ат.1. Ра1й. 158:563-570 [2001]) опубликовали данные. согласно которым сверхэкспрессия Апд-2 в клетках легочной карциномы Левиса и ТА3 карциномы молочной железы. предположительно. продлевает продолжительность жизни мышей. которым были трансплантированы клетки вышеуказанных опухолей.

В последние пять лет различные исследования предполагали. что Апд-1. Апд-2 и/или Т1е-2 могут являться возможными мишенями противораковой терапии. Например. патенты США 6166185. 5650490. и 5814464 описывают анти-Т1е-2 лигандные антитела и рецепторные антитела. Ьт е1 а1. (Ргос. №11. Асаб. 8с1 И8А. 95:8829-8834 [1998]) вводили аденовирус. экспрессирующий растворимый Т1е-2. мышам; растворимый Т1е-2. предположительно. уменьшал число и размер опухолей. развивающихся у этих мышей. В аналогичном исследовании. Ьт е1 а1. (1. С1т. 1пуек1.. 100: 2072-2078 [1997]) вводили растворимую форму Т1е-2 крысам; это. предположительно. приводило к уменьшению размера опухолей у крыс. 81ете1к1ег е1 а1. (Сапсег Рек.. 59:3185-3189 [1999]) получили клеточные линии меланомы человека. экспрессирующие внеклеточный домен Т1е-2. инъецируя эти клеточные линии голым мышам. и пришли к выводу. что растворимый Т1е-2. предположительно. приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и опухолевого ангиогенеза. Обобщая эту информацию и данные о том. что и Апд-1. и Апд-2 связываются с Т1е-2. из этих исследований не совсем ясно. каким образом Апд-1. Апд-2 или Т1е-2 могут являться привлекательными мишенями для противораковой терапии.

Как показано многими исследователями. слияние определенных белков или их фрагментов со стабильным белком плазмы. таким как константный участок 1д. увеличивает продолжительность полужизни этих белков [см.. например. заявку АО 00/24782. опубл. 4 мая 2000 г.; патент США 5480981; ЧНепд е1 а1.. 1. 1ттипо1.. 154:5590-5600. (1995); Икйег е1 а1.. Ν. Еп§1. 1. Меб.. 334:1697-1702. (1996); Уап 2ее. К. е1 а1.. 1. 1ттипо1.. 156:2221-2230. (1996); патент США 5808029 от 15 сентября 1998; Сароп е1 а1.. №1иге. 337:525-531. (1989); Натуй е1 а1.. I тти по1ес11.. 1:95-105. (1995); АО 97/23614. опубл. 3 июля 1997; РСТ/И8 97/23183 от 11 декабря 1997; Ыпк1еу. 1. Ехр. Меб.. 174: 561-569. (1991); АО 95/21258. опубл. 10 августа 1995].

Эффективная анти-Апд-2-терапия должна помогать огромному количеству больных раком людей. поскольку многие солидные раки нуждаются в новообразовании сосудов от 1 до 2 мм в диаметре. Такая терапия должна находить широкое применение также в лечении других ассоциированных с ангиогенезом заболеваний. таких как ретинопатии. артриты и псориаз.

Существует еще неразработанная возможность идентифицировать новые агенты. которые специфически распознают и связывают Апд-2. Такие агенты будут полезны для скриннинговых обследований и терапевтического внедрения у больных. страдающих заболеваниями. связанными с активностью Апд-2.

Соответственно. предметом данного изобретения является способ получения специфических связывающих Апд-2 агентов. модулирующих его активность.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к антителам. содержащим тяжелую цепь и легкую цепь. причем указанная тяжелая цепь включает вариабельный участок. выбранный из группы. включающей

533 НС (8Е<2 ГО ΝΟ. 7); 535 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 9); 536 НС (8Е() ГО ΝΟ. 11); 537 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 13); 540 НС (8Еф ГО ΝΟ. 15); 543 НС (8Еф ГО ΝΟ. 17); 544 НС (8ЕЦ Ιϋ ΝΟ. 19); 545

НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 21); 546 НС (8Е<2 ГО ΝΟ. 23); 551 НС (8Еф ГО ΝΟ. 25); 553 НС (8 ЕС) ГО ΝΟ. 27); 555 НС (ЗЕф ГО N0. 29); 558 НС (8Еф Ю N0. 31); 559 НС (8Еф ГО N0. 33); 565 НС (8Еф ГО N0. 35); Р1-С6 НС (8Еф И) N0. 37); РВ1-А7 НС (8Еф ГО N0. 39); ΡΏ-Β2 НС (8Еф N0. 41); РЕ-В7 НС (8Еф ГО N0. 43); Р1-О11 НС (ЗЕф ГО N0. 45); РК-ЕЗ НС (8Еф ГО N0. 47); ОГО4 НС (8Еф ГО N0. 49); ОС1Е8 НС (ЗЕф ГО N0. 51); Н1С12 НС (ЗЕф ГО N0. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 55); 1Р-1С10 НС (8Еф ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2 НС (ЗЕф ГО N0. 59); 1Р-2С11 НС (8Еф ГО N0. 61), а также его антигенсвязывающие фрагменты;

легкая цепь включает вариабельный участок. выбранный из группы. включающей

- 2 010726

526 каппа (8ЕХ) ΙΟ ΝΟ. 2); 536 каппа (8ΕΟ ГО N0. 12); 543 каппа (8 Ер ГО N0. 18); 544 каппа (БЕЦ ГО N0.20); 551 каппа (8ЕЦ ГО N0. 26); 553 каппа (8ЕЦ ГО N0. 28); 555 каппа (8Е0 ΙΠ N0. 30); 558 каппа (8ЕЦ ГО N0. 32); 565 каппа (8ЕЦ ГО N0. 36); ГЕ-В7 каппа (8ЕС) ГО N0. 44); ЕЬС11 каппа (8Е0 ΙΟ ΝΟ. 46); РК-ЕЗ каппа (БЕЦ 10 N0. 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (БЕЦ ΙΟ N0.56); 1Р-2С11 каппа (БЕЦ ГО N0. 62); 528 каппа (БЕЦ ГО N0. 4); 531 каппа (БЕЦ ГО N0.6); 533 каппа (БЕЦ ГО ΝΟ. 8); 535 лямбда (БЕЦ Ю N0. 10); 537 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 14); 540 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 16); 545 лямбда (БЕЦ ГО N0. 22); 546 лямбда (БЕЦ 10 N0. 24); 559 лямбда (БЕЦ ГО N0. 34); П-С6 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 38); ЕВ1-А7 лямбда (БЕЦ ΙΠ N0. 40); Ρϋ-Β2 лямбда (БЕЦ ГО N0. 42); 0104 лямбда (БЕЦ ГО N0. 50); 0С1Е8 лямбда (8ЕЦ 10 N0. 52); Н1С12 лямбда (БЕЦ ГО N0. 54); 1Р-1С10 лямбда (БЕЦ ГО

N0. 58); ΙΚ-2Ε2 лямбда (БЕЦ ГО N0. 60), а также его антигенсвязывающие фрагменты.

Изобретение также относится к специфическим связывающим агентам, содержащим по крайней мере один белок, выбранный из группы, включающей

БЕЦ Ю ΝΟ. 1; 8Е0 ГО N0. 3; БЕЦ ГО N0. 5; 8ЕЦ ГО ΝΟ. 7; 8ЕЦ ГО ΝΟ. 9; 8ЕЦ ГО ΝΟ. 11; 8ЕЦ ГО

N0. 13; 8ЕЦ ГО N0.15; БЕЦ ГО ΝΟ. 17; БЕЦ ГО N0. 19; 8Е0 ГО N0. 21; 8Е0 ГО ΝΟ. 23;

БЕЦ ГО N0. 25; БЕЦ ГО N0. 27; 8Е0 ГО N0. 29; 8Е0 ΙΟ ΝΟ. 31; БЕЦ ГО N0. 33; 8Е0 10 N0. 35; БЕЦ ГО N0. 37; 8Е0 ГО N0. 39; 8Е0 ГО N0. 41; БЕЦ ГО N0. 43; БЕЦ ГО ΝΟ. 45;

БЕЦ ГО N0. 47; БЕЦ ГО N0. 49; БЕЦ ΙΟ ΝΟ. 51; 8Е0 ГО N0. 53; БЕЦ Ю N0. 55; 8Е0 ГО N0. 57; 8ЕЦ ГО N0. 59; БЕЦ ГО ΝΟ. 61; 8Е0 Ю N0. 2; БЕЦ ГО N0. 12; 8Ер Ю N0. 18; БЕЦ ГО N0. 20; 8Е0 ГО N0. 26; 8Е0 ΙΟ N0. 28; БЕЦ ГО N0. 30; 8Е0 Ю N0. 32; 8Е0 ΙΟ N0. 36; БЕЦ ГО N0. 44; 8Е0 ГО N0. 46; БЕЦ ГО N0.48; БЕЦ ГО N0. 56; 8Е0 ГО ΝΟ. 62; БЕЦ ГО N0. 4; БЕЦ ГО N0. 6; 8Е0 ГО N0. 8; 8Е0 ГО N0. 10; БЕЦ ГО N0. 14; БЕЦ ГО N0. 16; БЕЦ Ю N0. 22; 8Е0 Ю N0. 24; БЕЦ ГО N0. 34; БЕЦ Ю N0.38; 8Е0 ΙΟ N0. 40; 8Е0 ГО N0. 42; БЕЦ ГО N0. 50; БЕЦ ГО N0. 52; 8Е0 Ю N0. 54; 8Е0 ГО N0. 58 и БЕЦ Ю N0. 60, а также фрагменты данного белка.

Специфическими связывающими агентами могут быть, например, антитела, поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные или полные антитела человека. Антитела могут состоять и из одной цепи. Изобретение также относится к гибридоме, продуцирующей моноклональные антитела, соответствующие изобретению.

Изобретение также относится к конъюгатам, раскрытым в описании. Этими соединениями могут быть, например, специфические связывающие агенты (скажем, антитела), заявленные в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим специфические связывающие агенты (например, антитела), заявленные в соответствии с настоящим изобретением, а также к вектору, содержащему такие молекулы нуклеиновой кислоты, и к клеткам-хозяевам, содержащим указанный вектор.

Кроме того, изобретение относится к способу получения специфических связывающих агентов, включающему: (а) трансформацию клеток-хозяев, содержащих по крайней мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический связывающий агент по π. 1; (б) экспрессию нуклеиновой кислоты в указанных клетках-хозяевах; и (с) выделение указанного специфического связывающего агента. Изобретение также относится к способу получения антител, включающему: (а) трансформацию клеток-хозяев, содержащих по крайней мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, согласно настоящему изобретению; (б) экспрессию нуклеиновой кислоты в указанных клетках-хозяевах; и (с) выделение указанного специфического связывающего агента.

Помимо этого, изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих путем введения терапевтически эффективного количества специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к способу лечения рака у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к способу лечения рака у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества антител, заявлен

-3 010726 ных в соответствии с настоящим изобретением.

Также изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим специфические связывающие агенты, заявленные согласно настоящему изобретению, и дополнительный агент в фармакологически доступной форме. Фармацевтическая композиция может содержать антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и дополнительный агент в фармакологически доступной форме.

Изобретение относится к способу модулирования или ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения одного или более специфического связывающего агента, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к способу модулирования или ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение также относится к способу модулирования сосудистой проницаемости или утечки плазмы в организме млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к способу лечения глазных неоваскулярных заболеваний, ожирения, гемоангиобластомы, гемангиомы, артериосклероза, воспалительных заболеваний, воспалительных нарушений, атеросклероза, эндометриоза, неопластических заболеваний, заболеваний костной системы у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение также относится к способу модулирования сосудистой проницаемости или утечки плазмы в организме млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение также относится к способу лечения глазных неоваскулярных заболеваний, ожирения, гемоангиобластомы, гемангиомы, артериосклероза, воспалительных заболеваний, воспалительных нарушений, атеросклероза, эндометриоза, неопластических заболеваний, заболеваний костной системы у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, изобретение также относится к способу лечения рака у млекопитающих путем введения терапевтически эффективного количества специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, и химиотерапевтического агента. Специалистам в данной области должно быть понятно, что специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не обязательно должны вводиться одновременно.

Изобретение также относится к способу лечения рака у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, и химиотерапевтического агента. Антитела и химиотерапевтический агент не обязательно должны вводиться одновременно.

Изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, содержащему область 1, определяющую комплементарность (СИЯ 1), выбранную из группы, включающей

526 НС (8ЕЦ П> N0.1); 528 НС (8Е(? ГО N0. 3); 531 НС (5ЕЦ ГО

N0. 5); 533 НС (8Е<2 ГО N0 7); 535 НС (5Εζ) ГО N0. 9); 536 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 11); 537 НС (8ЕЦ ГО N0. 13); 540 НС (8Е0 ГО ΝΟ. 15); 543 НС (8Е<3 ГО N0. 17); 544 НС (8Ер ГО N0.

19); 545 НС (8Е0 ГО N0. 21); 546 НС (8Е(} ΙΒ ΝΟ. 23); 551 НС (8ЕЦ ГО N0. 25); 553 НС (8ЕЦ ГО N0. 27); 555 НС (8ЕГ) ГО N0. 29); 558 НС (8ЕЦ ГО N0. 31); 559 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ.

33); 565 НС (8Е() ГО N0. 35); Р1-С6 НС (8Εζ) ГО N0. 37); РВ1-А7 НС (8ЕС) ГО N0. 39);

Ρϋ-Β2 НС (8ЕЦ ГО N0. 41); РЕ-В7 НС (8Е0 ГО N0. 43); Г.Т-С11 НС (8Е<2 ГО ΝΟ. 45); РКЕЗ НС (8Εζ> ГО ΝΟ. 47); О1Г>4 НС (8ЕЦ ГО N0. 49); 0С1Е8 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 51); Н1С12

НС (8Е<2 ГО N0. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (8ЕЦ ГО N0. 55); 1Г-1С10 НС (8ЕЦ ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2

НС (8Е0 ГО ΝΟ. 59); 1Р-1С11 НС (8Е<2 ГО N0. 61); 526 каппа (8ЕС? ГО N0.2); 536 каппа (8ЕЦ ГО N0.12); 543 каппа (8ЕЦ ГО N0. 18); 544 каппа (8Е0 ГО N0. 20); 551 каппа (8ЕЦ

ГО ΝΟ. 26); 553 каппа (8Εζ> ГО N0. 28); 555 каппа (8ЕЦ ГО N0. 30); 558 каппа (8ЕЦ ГО

ΝΟ. 32); 565 каппа (8Е() ГО ΝΟ. 36); РЕ-В7 каппа (8ЕЦ ГО N0. 44); Р.1-С11 каппа (8Е0 ГО

N0. 46); РК-ЕЗ каппа (8Е(^ ГО N0. 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (8Е(} ГО N0. 56); 1Р-2С11 каппа (8Е(2 ГО N0. 62); 528 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 4); 531 лямбда (8Е<2 ГО N0. 6); 533 лямбда (8ЕЦ 10 N0. 8); 535 лямбда (ЗЕО ГО N0. 10); 537 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 14); 540 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 16); 545 лямбда (8Е0 ГО N0. 22); 546 лямбда (8ЕЦ ГО ΝΟ. 24); 559 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 34); Р1-С6 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 38); РВ1-А7 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 40); ΡΏ-Β2

- 4 010726 лямбда <8Ер ГО N0. 42); Ο1Ό4 лямбда (ЗЕф ГО N0. 50); ОС1Е8 лямбда (8Еф ГО N0. 52);

Н1С12 лямбда (8Еф ГО N0. 54); 1Р-1С10 лямбда (8Εζ) ΙΕ» N0. 58); и ΙΚ-2Ε2 лямбда (8Еф ГО N0. 60).

Изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, содержащему область 2, определяющую комплементарность (СИЯ 2), выбранную из группы, включающей

526 НС (8Еф ГО N0. 1); 528 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 3); 531 НС (8Еф ГО

ΝΟ. 5); 533 НС (8Еф ГО ΝΟ. 7); 535 НС (8Еф ГО N0. 9); 536 НС (ЗЕф ГО N0. 11); 537 НС (8Е<2 ГО N0. 13); 540 НС (ЗЕф ГО N0. 15); 543 НС (ЗЕф ГО N0. 17); 544 НС (5Еф ГО N0.

19); 545 НС (8Еф ГО N0. 21); 546 НС (8Еф ГО N0. 23); 551 НС (8Еф ГО ΝΟ. 25); 553 НС (8Еф ГО ΝΟ. 27); 555 НС (ЗЕф ГО N0. 29); 558 НС (8Еф ГО N0. 31); 559 НС (8Еф ГО N0.

33); 565 НС (8Еф ГО N0. 35); Р1-С6 НС (8Еф ГО N0. 37); РВ1-А7 НС (8Еф ГО N0. 39);

РО-В2 НС (8Е«2 ГО N0. 41); РЕ-В7 НС (8Еф ГО N0. 43); Р.Т-О11 НС <5Е<2 ГО ΝΟ. 45); РКЕЗ НС (8Еф ГО N0. 47); 0Ш4 НС (8Еф ГО N0. 49); 0С1Е8 НС (8Еф ГО N0 51); Н1С12

НС (ЗЕф ГО N0. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 55); 1Р-1С10 НС (8Еф ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2

НС (8Еф ГО N0. 59); 1Р-1С11 НС (8Еф ГО N0. 61); 526 каппа (8Еф ГО N0. 2); 536 каппа (ЗЕф ГО N0. 12); 543 каппа (8Еф ГО N0. 18); 544 каппа (8Еф ГО N0. 20); 551 каппа (8Еф

ГО N0. 26); 553 каппа (8Еф ГО N0. 28); 555 каипа (8Еф ГО ΝΟ. 30); 558 каппа (8Еф ГО

N0. 32); 565 каппа (8Еф ГО N0. 36); РЕ-В7 каппа (8Еф ГО N0. 44); П-011 каппа (ЗЕф ГО

N0. 46); ГК-ЕЗ каппа (8Еф ГО N0. 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (8Еф ГО N0. 56); 1Р-2С11 каппа (8Еф ГО ΝΟ. 62); 528 лямбда (ЗЕф ГО ΝΟ. 4); 531 лямбда (8Еф ГО N0. 6); 533 лямбда (ЗЕф ГО N0. 8); 535 лямбда (8Еф Ю N0. 10); 537 лямбда (8ЕС? ГО N0. 14); 540 лямбда (8Еф ГО N0. 16); 545 лямбда (8Еф ГО N0. 22); 546 лямбда (8Еф ГО N0. 24); 559 лямбда (8Еф ГО N0. 34); Р1-С6 лямбда (8Еф ГО N0. 38); РВ1-А7 лямбда (8Еф ГО ΝΟ. 40); ГО-В2 лямбда (8Еф ГО N0. 42); ОЮ4 лямбда (ЗЕф ГО N0. 50); 0С1Е8 лямбда (8Еф ГО N0. 52);

Н1С12 лямбда (8Еф ГО N0. 54); 1Р-1С10 лямбда (8Еф ГО N0. 58); и ТК-2Е2 лямбда (ЗЕф ΙϋΝΟ. 60).

Изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, содержащему область 3, определяющую комплементарность (СОЯ 3), выбранную из группы, включающей

526 НС (8Еф ГО N0.1); 528 НС (8Еф ГО ΝΟ. 3); 531 НС (8Еф ГО

ΝΟ. 5); 533 НС (ЗЕф ГО N0.7); 535 НС (ЗЕф ГО N0.9); 536 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 11); 537 НС (ЗЕф Ю N0. 13); 540 НС (ЗЕф ГО N0. 15); 543 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 17); 544 НС (ЗЕф ГО N0.

19); 545 НС (ЗЕф ГО N0. 21); 546 НС (ЗЕф ГО N0. 23); 551 НС (ЗЕф ГО N0. 25); 553 НС (ЗЕф ГО N0. 27); 555 НС (ЗЕф ГО N0. 29); 558 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 31); 559 НС (ЗЕф ГО N0.

- 5 010726

33); 565 НС (БЕЦ ГО ΝΟ. 35); Г1-С6 НС (8Е<3 ГО N0. 37); РВ1-А7 НС (8ЕЦ ГО ΝΟ. 39);

НЭ-В2 НС (8ЕЦ ГО N0. 41); ГЕ-В7 НС (БЕЦ Ю N0. 43); П-011 НС (БЕЦ ГО N0. 45); РКЕЗ НС (БЕЦ ГО N0. 47); ОЮ4 НС (БЕЦ ГО N0. 49); 6С1Е8 НС (БЕЦ ГО N0. 51); Н1С12

НС (БЕЦ ГО N0. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (БЕЦ ГО N0. 55); 1Р-1С10 НС (8Е<? ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2

НС (БЕЦ ГО N0. 59); 1Р-2С11 НС (БЕЦ ГО N0. 61); 526 каппа (БЕЦ ГО N0. 2); 536 каппа (БЕЦ ГО N0. 12); 543 каппа (БЕЦ ГО N0. 18); 544 каппа (БЕЦ ГО N0. 20); 551 каппа (БЕЦ

ГО N0. 26); 553 каппа (БЕЦ ГО N0. 28); 555 каппа (БЕЦ ГО N0. 30); 558 каппа (БЕЦ ГО

N0. 32); 565 каппа (БЕЦ ГО N0. 36); РЕ-В7 каппа (БЕЦ ГО N0. 44); Е1-011 каппа (БЕЦ ГО

N0. 46); ГК-ЕЗ каппа (БЕЦ ГО N0. 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (БЕЦ ГО ΝΟ. 56); 1Р-2С11 каппа (БЕЦ ГО N0. 62); 528 каппа (БЕЦ ГО N0. 4); 531 каппа (БЕЦ ГО N0. 6); 533 лямбда (БЕЦ

Ш N0. 8); 535 лямбда (БЕЦ ГО N0. 10); 537 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 14); 540 лямбда (8ЕЦ ГО

N0. 16); 545 лямбда (БЕЦ ГО N0, 22); 546 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 24); 559 лямбда (БЕЦ ГО

N0. 34); Е1-С6 лямбда (БЕЦ ГО ΝΟ. 38); ЕВ1-А7 лямбда (БЕЦ ГО N0. 40); ΡΤ1-Β2 лямбда (БЕЦ ГО N0. 42); 0104 лямбда (8ЕЦ ГО ΝΟ. 50); ОС1Е8 лямбда (БЕЦ ГО N0 52); Н1С12 лямбда (БЕЦ ГО N0. 54); 1Р-1С10 лямбда (БЕЦ ГО N0. 58); и ΙΚ-2Ε2 лямбда (БЕЦ ГО N0.

60).

Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический связывающий агент, заявленный в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, изобретение относится к способу определения уровня ангиопоэтина-2 в биологических образцах, включающему: (а) взаимодействие специфического связывающего агента, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, с биологическим образцом; и (б) определение продолжительности связывания специфического агента, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, и биологического образца. Изобретение также относится к способу определения уровня ангиопоэтина-2 в биологических образцах, включающему: (а) взаимодействие антитела, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, и биологического образца; и (б) определение продолжительности связывания антитела с биологическим образцом.

Изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества полипептида или композиций, описанных выше. Изобретение также относится к способу модулирования ангиогенеза у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества полипептида или композиций, описанных выше. Изобретение также относится к способу ингибирования опухолевого роста, характеризующегося нежелательным ангиогенезом у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества полипептида или композиций, описанных выше. Кроме того, изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающих, заключающемуся во введении терапевтически эффективного количества полипептида или композиций, описанных выше, и химиотерапевтического агента. Наиболее подходящим химиотерапевтическим агентом может быть или 5-РИ, или СРТ-11, или Тахо1еге. Однако возможно использование других подходящих химиотерапевтических агентов и других вариантов лечения рака.

Необходимо отметить, что специфические связывающие агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться для лечения целого ряда заболеваний, ассоциированных с дерегулируемым и нежелательным ангиогенезом. К таким заболеваниям относятся, но не ограничиваются указанными, глазные неоваскулярные патологии, такие как ретинопатии (включая диабетическую ретинопатию и старческую атрофию макулы), псориаз, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспалительные заболевания, в особенности артриты (включая ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные расстройства, такие как хроническая астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и неопластические заболевания, например, так называемые твердые опухоли и гемопоэтические злокачественные заболевания (жидкие опухоли, такие как лейкемия). Другие заболевания, для терапии которых возможно применение специфических связывающих агентов, очевидны для специалистов в данной области. К таким заболеваниям относятся, но не ограничиваются указанными, ожирение, проницаемость сосудов, утечка плазмы и заболевания костной системы, включая остеопороз. Таким образом, изобретение также относится к способам лечения вышеуказанных заболеваний, ассоциированных с дерегулируемым и нежелательным ангиогенезом.

Другие аспекты данного изобретения очевидны из описания.

- 6 010726

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует графическую зависимость размеров опухоли (ось у) от времени (ось х) при изучении опухолей мышей, обработанных антителами к Аид-2 (клон 533, 537 или 544), полученными в соответствии с настоящим изобретением, и контрольным антителами или фосфатным буферным раствором (РВ8). Детали описаны в примерах.

Фиг. 2А, 2В и 2С иллюстрируют данные по эпитопному картированию (Θ.Ό. 370) полноразмерного Апд-2 человека (йАид-2), Ν-концевого участка Апд-2 и С-концевого участка Апд-2 соответственно, с помощью пептидных антител ΤΝ8-ί'οη4-ί.'. Ы-7-Ν и 12-9-3-С, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, а также с помощью контрольных пептидных антител Т1е-2-Ес, С2В8 или 5В12. Детали описаны в примерах.

Детальное описание изобретения

Указанный раздел включен в описание исключительно в технических целях и ни в какой степени не ограничивает сущности раскрытых в нем изобретений.

Для получения рекомбинантной молекулы ДНК, белка и антител могут использоваться стандартные способы, так же, как и для культуры ткани и трансформации клеток. Ферментные реакции и способы очистки осуществляются стандартно, согласно приведенным инструкциям, или обычно используются известные в этой области методики, например описанные у БатЬгоок е1 а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаЮгу Маииа1. СоИ 8ртшд НагЬог ЬаЬотаФгу Ртезз, СоИ 8ртшд НагЬог, ΝΥ [1989]), или раскрытые в настоящем изобретении. Если не указано иное, например специфические термины, в описании раскрываются номенклатурные обозначения и лабораторные методики аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, которые очевидны для специалистов в данной области. Стандартные способы могут использоваться для химического синтеза, химического анализа, получения, приготовления и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов.

Термины

В соответствии с настоящим изобретением описанные ниже термины, если специальным образом не оговорено иное, имеют приведенное ниже значение.

Термин Апд-2 относится к полипептиду, как показано на фиг. 6 патента США 6166185 (Т1е-2лиганд-2), или его фрагментам, а также к полипептидам, которые представляют собой аллельные варианты, сплайсинговые варианты, варианты, основанные на заменах, делециях и/или вставках аминокислот, производные, пептиды и полипептиды слияния и межвидовые гомологи указанного полипептида. Апд-2 полипептид может включать или не включать дополнительные концевые аминокислотные остатки, например, лидерные последовательности, направляющие последовательности, аминоконцевой метионин, аминоконцевой метионин и остаток лизина и/или аминокислотные метки или последовательности белков слияния, что зависит от способа получения полипептида Апд-2.

Термин биологически активный, когда используется совместно со специфическими связывающими Апд-1 и/или Апд-2 агентами, означает пептид или полипептид, имеющий по крайней мере одну активность, характерную для Апд-1 и/или Апд-2 специфического связывающего агента. Специфический связывающий агент Апд-2 может представлять собой агонист, антагонист, нейтрализующий или блокирующий агент, соответствующий по крайней мере одной биологической активности Апд-2.

Понятие специфический связывающий агент означает молекулу, предпочтительно молекулу белка, которая связывает Апд-2 (а также его варианты и производные, как определено выше) с наибольшей аффиностью, чем другие ангиопоэтины. Специфическим связывающим агентом может быть белок, пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или вещество с низкой молекулярной массой, преимущественно связывающееся с Апд-2. Согласно настоящему изобретению наилучшими специфическими связывающими агентами являются антитела, такие как поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬ), химерные антитела, СЭВ-привитые антитела, мультиспецифические антитела, биспецифические антитела, каталитические антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, антиидиотипические (апО-Ιά) антитела и антитела, которые могут быть помечены в растворимой и связанной форме, а также их фрагменты, варианты и производные, используемые как самостоятельно, так и в комбинации с другими аминокислотными последовательностями, обеспечиваемыми существующими технологиями.

Такие технологии включают, но не ограничиваются указанными, ферментное расщепление, химическое расщепление, пептидный синтез и рекомбинантные методики. Специфические связывающие агенты Апд-2, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, способны связывать участки Апд2, которые, например, модулируют, ингибируют или промотируют биологическую активность Апд-2 и/или другие активности, ассоциированные с Апд-2.

Термин поликлональные антитела означает гетерогенную смесь антител, которые распознают и связывают различные эпитопы одного антигена. Поликлональные антитела могут быть получены из препаратов неочищенной сыворотки или могут быть очищены с помощью антигенной аффинной хроматографии или протеин А/протеин С аффинной хроматографии.

Термин моноклональные антитела относится к антителам, кодируемым одной и той же молекулой нуклеиновой кислоты, которые могут вырабатываться определенной гибридомной или другой клеточной линией или синтезироваться в организме трансгенного млекопитающего. При этом каждое антитело спе

- 7 010726 цифически распознает один и тот же эпитоп антигена. Понятие моноклональный не ограничивается каким-либо определенным способом получения антитела, так же, как и не ограничивается антителами, продуцируемыми каким-либо определенным видом животного, например мышью, крысой и т.д.

Термин химерные антитела относится к антителам, у которых участки тяжелых и/или легких цепей идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям в антителах, выделенных из организма животных определенного вида и принадлежащих к определенному классу или подклассу, в то время как остальные участки цепей идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям в антителах, выделенных из организма животных другого вида и принадлежащих к другому классу или подклассу. В объем изобретения также включены фрагменты указанных антител, которые обеспечивают желательную биологическую активность (т.е. способность специфически связывать Аид-2). См. патент США 4816567 и Моткоп е1 а1., Ргос №111. Асаб 8е1 (И8А), 81:6851-6855 [1985].

Термин СЭВ-привитые антитела означает антитела, в которых СЭВ одного антитела определенного вида млекопитающего или изотипа рекомбинантно встроен в каркасную область другого антитела того же или другого вида млекопитающего или изотипа.

Термин мультиспецифические антитела означает антитела, имеющие вариабельные участки, которые распознают более чем один эпитоп одного или более антигена. Подклассом этого типа антител являются биспецифические антитела, которые распознают два отдельных эпитопа одного и того же или разных антигенов.

Каталитические антитела относятся к антителам, в состав которых входят структуры, обладающие одной или более цитотоксической или, более точно, одной или более биологической активностью.

Термин гуманизированные антитела относится к специфическому типу СЭВ-привитых антител, в которых каркасный участок получен из человеческих антител, но при этом каждая СЭВ заменена перенесенным участком, полученным из антител другого вида млекопитающего, например, мыши. Термин СЭВ раскрывается ниже.

Термин полные человеческие антитела относится к антителам, у которых как СЭВ, так и каркасная часть кодируются одной или более одной молекулой ДНК человека.

Термин антиидиотипические антитела относится к любым антителам, которые специфически связываются с другими антителами, распознающими антигены. Для получения любого антиидиотипического антитела может быть использован любой способ, описанный здесь, для получения Апд-2 специфических антител, за исключением того, что указанные антиидиотипические антитела получают, например, иммунизацией животных Апд-2 специфическими антителами или их фрагментами, связывающими Апд2, а не самим Апд-2 полипептидом или его фрагментом.

Термин варианты, используемый здесь, относится к полипептидам, полученным из природной (или по крайней мере известной) аминокислотной последовательности связывающего агента путем вставок, делеций и/или замещений аминокислотных остатков. Варианты, используемые в соответствии с настоящим изобретением, включают белки слияния, как описано ниже.

Понятие производные относится к связывающим агентам, которые были химически модифицированы определенным образом и отличаются от вариантов, полученных путем инсерции, делеций и/или замещения аминокислотных остатков природного связывающего агента.

Понятие специфическое связывание Апд-2 относится к способности специфических связывающих агентов (таких, как антитела или их фрагменты), заявленных в соответствии с настоящим изобретением, распознавать и связывать зрелый, полноразмерный или усеченный полипептид Апд-2 человека или его ортологи таким образом, что их аффинность (определяемая, например, методом аффинного иммуноферментного анализа или методом В1Асоге, как описано здесь) или нейтрализующая способность (определяемая, например, методом нейтрализационного иммуноферментного анализа, как описано здесь) является по крайней мере в 10 раз больше, но предпочтительнее в 50 раз больше, 100, 250 или 500 раз больше или даже в 1000 раз больше, чем их аффинность или нейтрализующая способность в отношении другого ангиопоэтина, или другого пептида или полипептида.

Термин антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающий участок относится к области специфического связывающего агента (такого, как молекула антитела), которая содержит специфические аминокислотные остатки (или другие структуры) и взаимодействует с антигеном и определяет специфичность и аффинность специфического связывающего агента по отношению к антигену. В молекуле антитела антигенсвязывающий домен обычно обозначается как СЭВ (область, определяющая комплементарность, от англ. сотр1етеп1атйу-бе1етт1шпд гедюп).

Термин эпитоп относится к тому участку любой молекулы, который может распознаваться и с которым может связываться один или более антигенсвязывающий участок специфического связывающего агента, например, антитела. Эпитоп обычно состоит из химически активных поверхностно сгруппированных молекул, таких как, например, молекулы аминокислот или боковые цепи молекулы углевода, и имеет специфическую трехмерную пространственную структуру и определенный заряд. Эпитопы, как описано здесь, могут быть смежными и несмежными. Кроме того, эпитопы могут быть миметиками в том смысле, что они включают трехмерную пространственную структуру, которая идентична таковой эпитопа, используемого для получения антител, или содержат только некоторые из аминокислотных ос

- 8 010726 татков, обнаруживаемых в Лид-2, который используется для стимуляции антительного иммунного ответа.

Термин ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп относится к эпитопу, связывание которого со специфическим связывающим агентом, таким как антитело, приводит к утрате (или по крайней мере снижению) биологической активности молекулы, клетки или организма, содержащего данный эпитоп, ίη νίνο, ίη νίίτο, ίη 8Йи. Согласно настоящему изобретению нейтрализующий эпитоп находится в биологически активном участке Апд-2 или связан с ним. В противоположность этому, термин активирующий эпитоп относится к эпитопу, связывание которого со специфическим связывающим агентом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, приводит к стимуляции или, по крайней мере, поддержанию биологической активности Апд-2.

Термин фрагмент антитела относится к пептиду или полипептиду, который представляет собой меньше по размеру соединение, чем целое интактное антитело. Целые антитела содержат два функционально независимых фрагмента или участка: антигенсвязывающий участок, известный как РаЬ, и карбоксильный терминальный кристаллизующийся участок, известный как Ре-участок. РаЬ-участок включает первый константный домен как тяжелой, так и легкой цепи (СН1 и СЬ1) вместе с вариабельными участками как тяжелой, так и легкой цепи, которые связывают специфический антиген. Каждый вариабельный участок тяжелой и легкой цепей включает три области, определяющие комплементарность (СЭК.8), и каркас из аминокислотных остатков, который отделяет СЭК друг от друга. Рс-участок содержит второй и третий константные участки (СН2 и СН3) тяжелой цепи и задействован в активации комплемента и атаки фагоцитирующих клеток. У некоторых антител Рс и РаЬ участки разделены шарнирной областью; в зависимости от того, каким образом протеолитически расщепляется полноразмерное антитело, она может быть связана как с РаЬ, так и с Рс участком. Например, в результате расщепления антитела протеазой протамином образуется фрагмент, состоящий из шарнирной области и Рс-участка, а расщепление антитела пепсином приводит к образованию фрагмента, в котором шарнирная область связана с обоими РаЬ-участками одновременно. Поскольку два РаЬ-участка остаются ковалентно связанными после воздействия пепсина, образовавшийся фрагмент обозначается как Р(аЬ')2 фрагмент.

Рс-домен может иметь сравнительно большое время полужизни в сыворотке, в то время как РаЬ является короткоживущим. [Сароп с1 а1., ЫаШге, 337:525-31 (1989)]. Будучи экспрессируемым как часть белка слияния, Рс-домен может приобретать более длительное время полужизни в сыворотке, а также проявлять такие функциональные особенности, как связывание Рс-рецептора, связывание белка А, связывание комплемента и, возможно, даже перенос через плаценту того белка, с которым он был слит. Рсучасток может быть природным участком или может быть изменен для улучшения определенных свойств антител, таких, как их терапевтические свойства и время циркуляции.

Термин вариабельный участок или вариабельный домен относится к части легкой и/или тяжелой цепи антитела, обычно включающей приблизительно 120-130 аминоконцевых аминокислот в тяжелой цепи и около 100-110 аминоконцевых аминокислот в легкой цепи. Вариабельные участки сильно различаются по аминокислотным последовательностям даже в антителах животных одного вида. Вариабельный участок антитела обычно определяет специфичность связывания каждым определенным антителом своего определенного антигена. Вариабельность последовательностей наблюдается в областях, определяющих комплементарность (СЭКз), в то время как более консервативные участки вариабельного домена называются каркасными (РК от англ. Рташе^отк Кедюп). СЭК.8 легких и тяжелых цепей содержат аминокислоты, которые в значительной степени определяют взаимодействие антитела с антигеном, тем не менее, аминокислоты в РК участках могут значительно влиять на связывание/распознавание антигена, как обсуждается здесь ниже.

Термин легкая цепь, когда используется по отношению к антителу, относится сразу к двум различным типам цепей, обозначаемым каппа (к) и лямбда (λ), причем С-концевые участки практически одинаковы (константны) у легких цепей всех типов.

Термин тяжелая цепь, когда используется по отношению к антителу, относится сразу к пяти различным типам цепей, обозначаемым альфа, дельта, ипсилон, гамма и мю, которые также имеют константные С-концевые участки. Комбинации тяжелых и легких цепей дают начало пяти известным классам антител: 1дА, 1дЭ. 1дЕ, 1дС и 1дМ, соответственно, включая четыре известных подкласса 1дС, обозначаемых как 1дС1, 1дС₂, 1дС₃ и 1дС₄.

Термин природный, когда используется по отношению к биологическому материалу, такому, как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т. д., характеризует то, что может быть обнаружено в природе и еще не модифицировано человеком.

Термин изолированный, используемый по отношению к Апд-2 или к специфическому связывающему агенту Апд-2, относится к соединению, которое не загрязнено по крайней мере одним контаминирующим полипептидом, или к соединению, которое обнаруживается в своем природном окружении и, предпочтительно, практически свободно от каких-либо контаминирующих полипептидов млекопитающих, способных препятствовать его терапевтическому и диагностическому применению.

Термин зрелый, когда он используется по отношению к Апд-2, анти-Апд-2-антителам или любому другому специфическому связывающему агенту Апд-2 белковой природы, относится к пептиду или по

- 9 010726 липептиду, у которого отсутствуют лидерные или сигнальные последовательности. Когда связывающий агент, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, экспрессируется, например, в прокариотической клетке-хозяине, зрелый пептид или полипептид может также включать дополнительные аминокислотные остатки (но по-прежнему не иметь лидерной последовательности), такие как аминоконцевой метионин или один или более остаток метионина и лизина. Пептид или полипептид, полученный таким образом, может быть использован как с дополнительными аминокислотными последовательностями, так и без них; в последнем случае они удаляются.

Термины эффективное количество и терапевтически эффективное количество, когда они используются по отношению к специфическим связывающим агентам Апд-2, означают такое количество специфического связывающего агента, которое является полезным или необходимым для поддержания заметных изменений уровня одной или более биологических активностей Апд-2. Изменения могут выражаться как в повышении, так и в снижении уровня Апд-2-активности. Наиболее предпочтительным изменением является снижение Апд-2-активности.

Специфические связывающие агенты и антитела.

Используемый термин специфический связывающий агент относится к молекуле, которая обладает способностью специфично распознавать и связывать Апд-2, как описано здесь. Подходящими специфическими агентами могут быть, но не ограничиваются указанными, антитела и их производные, полипептиды и малые молекулы. Подходящие специфические связывающие агенты могут быть получены с помощью способов, известных специалистам в данной области. Показательный специфический связывающий агент полипептида Апд-2, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, способен связывать определенное количество полипептида Апд-2 и, предпочтительно, модулировать активность и функцию такого полипептида.

Специфические связывающие агенты, такие как антитела и их фрагменты, которые специфически связывают Апд-2-полипептид, входят в объем настоящего изобретения. Антитела могут быть поликлональными, включая моноспецифические поликлональные антитела, моноклональными (тАЬк), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, такими как СИЯк-привитые антитела, человеческими, одноцепочечными, каталитическими, мультиспецифическими и/или биспецифическими, а также их фрагментами, вариантами и производными.

Поликлональные антитела, направленные к Апд-2-полипептиду, обычно получают путем множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций животным (например, кроликам, хомякам, козам, овцам, лошадям, свиньям, крысам, песчанкам, морским свинкам, мышам или любым другим подходящим видам млекопитающих, впрочем как и видам, не являющимся млекопитающими) Апд-2полипептида или его фрагмента совместно с адъювантом или без него. Такие адъюванты включают, но не ограничиваются указанными, полные или неполные адъюванты Фрейнда; минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, и поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, поверхностноактивные полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин моллюска фиссуреллы и динитрофенол. БЦЖ (бациллы Кальметта-Герена, от англ. Ьас1Ш Са1те!!е-Сиегеш) и СогупеЬас!егшт рагуит могут потенциально использоваться в качестве адъювантов у человека. Часто оказывается полезным соединение антигенного полипептида с белком-носителем, который является иммунногенным для иммунизируемого вида животного, таким, как гемоцианин моллюска фиссуреллы, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или ингибитор трипсина, выделенный из бобов сои. Кроме того, для усиления иммунного ответа используются агрегирующие агенты, например, квасцы. После иммунизации у животных берут кровь и исследуют сыворотку на предмет наличия в ней антител к Апд-2-полипептиду; титр антител может быть определен с помощью методик, описанных здесь в примерах. Поликлональные антитела могут использоваться вместе с сывороткой, из которой они были выделены, или могут быть очищены от нее, с помощью, например, антигенной аффинной хроматографии или протеин А/протеин С аффинной хроматографии.

Моноклональные антитела, направленные к Апд-2-полипептиду, могут быть получены, например (без ограничений указанным), с помощью гибридомной технологии или современной фаговодисплейной методики. Например, моноклональные антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью гибиридомной технологии, как описано у КоЫег е! а1., №1иге 256:495 [1975]; технологии человеческой В-клеточной гибридомы [КокЬог е! а1., 1ттипо1 Тобау 4:72 (1983); Со!е е! а1., Ргос ИаБ. Асаб 8с1 (Л8А) 80:2026-2030 (1983); Вгобеиг е! а1., Мопос1опа1 АпбЬобу Ргобисйоп Тесйтциек апб АррНсайопк, рр. 51-63, Магсе1 Эеккег. 1пс., Иете Уогк, (1987)] и ЕВУгибридомной технологии [Со1е е! а1., Мопос1опа1 АпбЬоб1е8 апб Сапсег Тйегару, А1ап Я Ыкк 1пс, №\ν Уогк Ν.Υ., рр. 77-96 (1985)]. Также настоящее изобретение предлагает гибридомные клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, реагирующие с Апд-2-полипептидом.

Когда используется гибридомная технология, могут применяться миеломные клеточные линии. Такие клеточные линии, используемые в методике гибридомного слияния, предпочтительно, не продуцируют антитела, обладают эффективной способностью к слиянию и ферментной недостаточностью, позволяющей им расти на определенных селективных средах, поддерживающих рост только необходимых клеток, полученных путем слияния (гибридом). Например, мышиные клеточные линии, используемые

- 10 010726 для слияния, представляют собой 8р-20, Р3-Х63/Ад8, Р3-Х63-Ад8.653, N81/1.Ад41, 8р210-Ад14, ΡΘ, Ν8Ο/υ, МРС-11, МРО11-Х45-СТС1.7 и 8194/5ХХО Ви1; крысиные клеточные линии, используемые для слияния, представляют собой В210.ВСУ3. У3-Ад 1.2.3, ΙΡ983Ρ и 4В210. К другим клеточным линиям, полезным для слияния, относятся и-266, СМ1500-СКС2, ЫСК.-ЬО№НМу2 и ИС729-6. Гибридомы и другие клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, также могут быть новыми и входить в объем настоящего изобретения.

Фагово-дисплейная методика может также использоваться для получения моноклональных антител любого вида животного. Преимущественно, данная технология применяется для получения полноразмерных моноклональных антител человека, причем полинуклеотид, кодирующий одиночный РаЬ или Ρν фрагмент антитела, экспрессируется на поверхности фаговой частицы. [НоодепЬоот е! а1., 1 Мо1 Вю1 227:381 (1991); Магкк е! а1., 1 Мо1 Вю1 222:581 (1991); см. также патент США 5885793)]. Каждый фаг может быть скринирован с помощью методов связывания, описанных здесь, для идентификации тех фрагментов антител, которые имеют аффинность к Апд-2. Таким образом, эти подходы имитируют иммунную селекцию путем представления набора антительных фрагментов на поверхности нитевидного бактериофага и последующую селекцию фага путем обеспечения связывания этих фрагментов с Апд-2. Подобная процедура описана в заявке № РСТ/И898/17364, поданной Абатк е! а1., раскрывающей выделение высокоаффинных и функционально агонистических фрагментов антител к МРЬ- и ткк-рецепторам при использовании указанных подходов, согласно которым полный набор генов антител человека может быть создан путем клонирования природных перегруппированных человеческих V генов из лимфоцитов периферической крови, как уже раньше описано. [МиШпах е! а1., Ргос №11. Асаб8с1 (И8А) 87:8095-8099 (1990)].

После того, как полинуклеотидные последовательности, кодирующие каждую цепь полноразмерного моноклонального антитела или РаЬ или Ρν фрагмента (фрагментов), в соответствии с настоящим изобретением, идентифицированы, клетки-хозяева, как эукариотические, так и прокариотические, могут быть использованы для экспрессии полинуклеотидов моноклональных антител с помощью рекомбинантных технологий, хорошо известных и обычных для данной области. В противоположность этому, трансгенных животных получают путем встраивания в геном животного-реципиента, которым может быть, например, мышь, кролик, коза или корова, полинуклеотида, кодирующего нужный специфический связывающий агент, таким образом, что обеспечивается экспрессия молекулы полинуклеотида, кодирующей моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент. В одном случае полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент, могут быть лигированы с регуляторными последовательностями, специфичными для молочной железы млекопитающих, и такие химерные полинуклеотиды могут быть встроены в клетки зародышевой линии животного-мишени. Полученное таким образом трансгенное животное продуцирует необходимое антитело с молоком [Ро11ок е! а1., 1 1ттипо1 Ме!й 231:147-157 (1999); Ьй11е е! а1., 1ттипо1 Тобау 8:364-370 (2000)]. К тому же для экспрессии и получения Апд-2 специфических связывающих агентов, таких как моноклональные антитела, могут использоваться растения; в подходящие растения путем трансфекции переносят полинуклеотид, кодирующий моноклональные антитела или другие специфические связывающие агенты.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения моноклональные или поликлональные антитела или их фрагменты, полученные из других млекопитающих, кроме человека, могут быть гуманизированы или химеризованы. Методы для химеризации нечеловеческих антител хорошо известны в данной области. (см. патенты США Νϋ5. 5859205, 5585089 и 5693762). Гуманизация производится, например, с помощью технологий, также хорошо известных в данной области знаний [1опе5 е! а1., №!иге 321:522-525 (1986); Шесйтапп е! а1., №!иге, 332:323-327 (1988); Vе^йоеуеп е! а1., 8с1епсе 239:1534-1536 (1988)], например, путем замещения, по крайней мере, области, определяющей комплементарность (СИКк), в антителе грызуна соответствующими участками антител человека. Изобретение также относится к вариантам и производным таких антител человека, которые описаны здесь и хорошо известны специалистам в данной области.

Изобретение также относится к полноразмерным антителам человека, которые связывают Апд-2полипептид, а также к их фрагментам, вариантам и/или производным. Такие антитела могут быть получены с помощью фагово-дисплейной технологии, описанной выше. Кроме того, в случае отсутствия эндогенного синтеза иммуноглобулинов для их получения могут быть использованы трансгенные животные (например, мыши), способные продуцировать набор человеческих антител. Это может быть достигнуто путем иммунизации животных Аид-2-антигеном или его фрагментами, причем эти фрагменты имеют аминокислотные последовательности, специфичные для Апд-2. Такие иммуногены могут быть соединены с носителем, но это необязательно. См., например, 1акоЬо\з15 е! а1., Ргос №!1. Асаб8с1 (И8А), 90:2551-2555 (1993); ^акоЬоν^!5 е! а1., №!иге 362:255-258 (1993); Вгиддегтапп е! а1., Уеаг ш 1ттипо, 7:33 (1993). Согласно одной такой методике указанных трансгенных животных получают путем повреждения эндогенного локуса, кодирующего тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, и втраивания вместо него в геном этих животных локуса, кодирующего человеческие протеины тяжелых и легких цепей. Частично модифицированные животные, не имеющие полного набора соответствующих модификаций, затем пе

- 11 010726 рекрестно скрещиваются для получения животных, имеющих все необходимые модификации иммунной системы. После введения иммуногена эти животные становятся способными продуцировать антитела с человеческими вариабельными участками, включая человеческие (а не, например, мышиные) аминокислотные последовательности, которые являются иммуноспецифичными для заданных антигенов. См. заявки РСТ N08., РСТ7ИБ96/05928 и РСТУиБ93/06926. Дополнительные методики описаны в патенте США № 5545807, заявках РСТ N08. РСТ/ИБ91/245, РСТ/СБ89/01207 и в ЕР 546073В1 и ЕР 546073А1. Человеческие антитела также могут быть получены путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клеткаххозяевах или путем экспрессии в гибридомных клетках, как описано здесь. Трансгеноз может быть достигнут разными способами. См., например, Вгиддетап с1 а1., 1ттипо1 Тобау 17:391-7 (1996). Согласно одному подходу минилокус конструируют таким образом, что сегменты гена, перенесенные в клетки зародышевой линии, тесно прилегают друг к другу. За счет ограничений по размеру (т.е., в целом, менее 30 кЬ) полученные в результате этого минилокусы содержат ограниченное число различных генных сегментов, но все еще способны продуцировать большой спектр антител. Минилокусы, содержащие только последовательности ДНК человека, включая промоторы и энхансеры, полностью функциональны в организме трансгенных мышей.

Для получения большого числа генных сегментов в организме трансгенных животных используют искусственные хромосомы дрожжей (УЛСк. от англ. уеак! αΠίΓίοίαΙ сйготокотек). УАСк могут иметь размер от нескольких сот килобаз до 1 МЬ и встраиваются в геном мыши (или любого другого подходящего животного) путем микроинъекции непосредственно в яйцеклетку или путем их переноса в эмбриональные линии стволовых клеток (ЕБ). Обычно УАСк переносятся в ЕБ клетки путем липофекции очищенной ДНК или путем слияния дрожжевого сферопласта, при том что очищенная ДНК переносится в мицелий, и процедуру слияния осуществляют так же, как и при получении гибридом. Отбор необходимых ЕБ клеток, несущих трансфицированную ДНК, производится путем включения в УАС любого селективного маркера, известного специалистам в области данных технологий. Альтернативой данному способу является использование векторов бактериофага Р1, которые амплифицируют в бактериях-хозяевах Е. со11. В то время как эти векторы несут меньше встроенной ДНК, чем УАСк, соответствующие клоны вырастают быстро и имеют высокую продуктивность, что позволяет осуществить прямую микроинъекцию векторов в яйцеклетку мыши. Показано, что использование наборов различных Р1 векторов приводит к эффективной гомологичной рекомбинации.

После того, как подходящая трансгенная мышь (или другое подходящее животное) была идентифицирована на предмет определения сывороточных уровней циркулирующих антител с помощью методики, известной из уровня техники (например, ЕЫБА), трансгенную мышь скрещивают с мышью, у которой был разрушен эндогенный локус 1д. В результате получается потомство, у которого большинство Вклеток экспрессируют человеческие антитела.

Согласно другой методике полноразмерный 1д локус животного замещают человеческим 1д локусом, после чего животное начинает экспрессировать только человеческие антитела. Еще один подход заключается в замещении участков локуса животного специфическими и соответствующими участками локуса человека. Обычно животные, полученные после этой процедуры, могут экспрессировать химерные антитела (в противоположность полным человеческим антителам), чья структура зависит от природы перенесенного в геном мыши 1д локуса.

Человеческие антитела также могут быть получены путем экспозиции спленоцитов человека (Вили Т-клеток) антигену ίη уйго с последующим восстановлением экспонированных клеток в иммунокомпромиссных мышах, например БСШ или поб/БСГО. См. Вгатк е! а1., 1 1ттипо1, 160:2051-2058 [1998]; СагЬаШбо е1 а1., №1 Меб, 6: 103-106 [2000]. Согласно одному подходу трансплантация человеческой эмбриональной ткани БСШ мышам (БСШ-йи) приводит к длительному гемопоэзу и созреванию человеческих Т-клеток. [МсСипе е! а1., Бс1епсе 241:1532-1639 (1988); ИУеткеп е! а1., Бет 1ттипо1 8:243-248 (1996)]. Любой гуморальный иммунный ответ химерных мышей полностью зависит от развития Т-клеток в организме этих животных. [Майепккоп е1 а1., 1ттипо1 83:1271-179 (1994)]. Согласно другому подходу лимфоциты периферической крови человека интраперитонеально (или другим образом) трансплантируются БСШ мышам. [Мо81ег е1 а1., №1иге 335:256-259 (1988)]. Когда трансплантируемые клетки обрабатывают праймирующим агентом, таким как Стафилококковый Энтеротоксин А (БЕА) |Маг1епк8оп е1 а1., 1ттипо1 84:224-230 (1995)], или моноклональными антителами к СЭ40 человека [Мшрйу е1 а1., В1ооб 86:1946-1953 (1995)], регистрируется высокий уровень продукции В-клеток.

Альтернативно, конструируют полный набор синтетических тяжелых цепей антитела человека из неперестроенных сегментов У-гена путем объединения каждого УН-сегмента с Ό-сегментом выборочных нуклеотидов вместе с 1-сегментом [НоодепЬоот е! а1., 1 Мо1 Вю1 227:381-388 (1992)]. Таким же образом, набор легких цепей создается путем объединения каждого У-сегмента человека с 1-сегментом [ОпГЙйк е! а1., ЕМВО 1 13:3245-3260 (1994)]. Нуклеотиды, кодирующие полное антитело (т.е. оба вида цепей, легкие и тяжелые), объединяются в один одноцепочечный Εν-фрагмент и получившийся полинуклеотид связывают с полинуклеотидом, кодирующим малый белок оболочки нитевидного бактериофага. Когда этот белок слияния экспрессируется на поверхности фага, полинуклеотид, кодирующий специфическое антитело, идентифицируют методом селекции, используя иммобилизованный антиген.

- 12 010726

Согласно другому подходу антительные фрагменты конструируют как два ЕаЬ-фрагмента путем слияния одной цепи с фаговым протеином и помещения другой цепи в периплазму бактерий [НоодепЬоот е! а1., Мис1 Άείάε Век 19:4133-4137 [1999]; ВагЬак е! а1., Ргос Ыа11. Асак8с1 (И8А) 88:7978-7982 (1991)].

Промышленное получение химерных, гуманизированных, СЭВ-привитых и полных антител человека или их фрагментов обычно осуществляется с помощью рекомбинантных технологий. Полинуклеотидные молекулы, кодирующие тяжелые и легкие цепи каждого антитела и их фрагменты, могут быть встроены в клетки-хозяева и экспрессированы с помощью технологий и процедур, описанных здесь. Предпочтительным способом является получение антител в клетках-хозяевах млекопитающих железы, таких как СНО-клетки. Детали данного метода описаны ниже.

Партнеры-слияния специфических связывающих агентов.

Еще одним объектом изобретения являются полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности вариабельных доменов Апд-2-антител. Такие последовательности, как описанные здесь аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелых цепей, или как описанные здесь аминокислотные последовательности вариабельных участков легких цепей, могут быть слиты как по Ν’концевому участку так и по С-концевому участку с одним или более доменом Ес-фрагмента 1дС человека. Будучи соединенным с терапевтическим белком, таким как ЕаЬ-фрагмент Апд-2 специфического антитела, Ес-домен может приобретать более длительное время полужизни в сыворотке, а также проявлять такие функциональные особенности, как связывание Ес-рецептора, связывание белка А, связывание комплемента и даже возможно перенос через плаценту того белка, с которым он был слит [Сароп е! а1., №!иге, 337:525-531 (1989)].

В одном случае, шарнирная область антитела, СН2- и СН3-участки могут быть слиты как с Νконцевыми, так и с С-концевыми участками полипептидов специфических связывающих агентов, таких, как анти-Апд-2 ЕаЬ- или Εν-фрагментов (полученных, например, с помощью фагово-дисплейной методики), с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. Полученный пептид слияния может быть очищен методом аффинной колоночной хроматографии с использованием протеина А или протеина С сефарозы. Пептиды и протеины, слитые с Ес-фрагментом, обнаруживают гораздо большее время полужизни ш ν^νо, чем их неслитые аналоги. Также, слияние с Ес-фрагментом делает возможным димеризацию/мультимеризацию полипептида слияния. Ес-участок может быть природным участком или может быть изменен для улучшения определенных свойств антител, таких, как их терапевтические свойства, время циркуляции и способность к агрегации. Другие примеры, известные в данной области, включают слияние Ес-фрагмента, который может быть человеческим или принадлежать любому другому виду животного, а также синтетическим, с Ν-концевым участком СО30Ь с целью лечения болезни Ходжкина, анапластической лимфомы и Т-клеточной лейкемии (патент США № 5480981), а также слияние Ес-фрагмента с Т№-рецептором с целью лечения септического шока [Е18Йег е! а1., N Епд1 1 Мек, 334: 1697-1702 (1996)] и слияние Ес-фрагмента с Ск4-рецептором с целью лечения СПИДа [Сароп е! а1., Шипе, 337:525-31 (1989)].

Каталитические антитела представляют собой другой тип слитых молекул и включают антитела, к которым присоединено одно или более соединений, обладающих цитотоксичностью, или, наиболее часто, одно или более биологически активных соединений. См., например, Вакег е! а1., Скет Еиг 1 12:20912095 (2000). Цитотоксические соединения такого рода улучшают цитотоксичность, опосредованную антителами, и включают такие вещества, как цитокины, прямо или косвенно стимулирующие клеточную гибель, радиоизотопы, химиотерапевтические препараты (включая пролекарства), бактериальные токсины (например, рицин, гелонин и т.д.), химические соединения (например, маутанзиноидные токсины, калехемицин и т.д.), радиоконъюгаты, ферментные конъюгаты [конъюгаты РНК-азы, направляемая антителами ферментная/пролекарственная терапия (АЭЕРТ, от англ. ап11Ьоку-кпес!ек епхуте/ргокгид Шегару)] и т.д. Согласно одному подходу цитотоксический агент может быть прикреплен к одному компоненту биспецифического или мультиспецифического антитела путем связывания данного агента с одним из альтернативных сайтов распознавания антигена данного антитела. Как альтернатива, белковые цитотоксины могут экспрессироваться как белки слияния со специфическим связывающим агентом после слияния полинуклеотида, кодирующего токсин, с полинуклеотидом, кодирующим связывающий агент. Согласно другому подходу специфический связывающий агент может быть ковалентно модифицирован, чтобы он включал желаемый цитотоксин.

Примерами таких белков слияния являются иммуногенные полипептиды, белки с длительным временем полужизни, такие как константные участки иммуноглобулинов, белковые маркеры, протеины и полипептиды, обеспечивающие очистку необходимого полипептида специфического связывающего агента, и полипептидные последовательности, обеспечивающие формирование мультимерных белков (таких, как лейциновые застежки-молнии, необходимые для формирования димеров и их стабильности).

Такие инсерционные варианты обычно включают целую нативную молекулу первого полипептида или ее существенную часть, связанную с Ν- или С-концевыми участками целой молекулы или ее части второго полипептида. Например, белки слияния обычно содержат лидерные последовательности других видов, чтобы предотвратить рекомбинантную экспрессию белка в гетерологичном хозяине. Другой по

- 13 010726 лезный белок слияния включает дополнительный иммунологически активный домен, такой как эпитоп антитела, для того, чтобы обеспечить очистку белка слияния. Включение сайта расщепления по месту слияния или рядом с ним будет способствовать удалению постороннего полипептида после очистки. Другие полезные белки слияния включают функциональные домены, такие как активные сайты ферментов, домены гликозилирования, клеточные сигнальные молекулы или трансмембранные участки.

Существует множество коммерчески доступных систем для экспрессии белков слияния, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Наиболее полезные системы включают, но не ограничиваются указанными, систему глутатион-8-трансферазы (С8Т) (Рйаттас1а), мальтозную систему связывания белка (ΝΕΒ, Всусг1у. МА), РЬАС систему (ΙΒΙ, №\ν Науеп, СТ) и 6хН18 систему (Οίηςοη. СНай\\όγ11ι. СА). Эти системы способны продуцировать рекомбинантные полипептиды, используя лишь небольшое количество дополнительных аминокислот, которые практически не влияют на антигенные свойства рекомбинантных полипептидов. Например, обе РЬАС система и 6хНщ система добавляют только короткие последовательности, причем известно, что каждая из них почти не обладает антигенными свойствами и не влияет значительным образом на восстановление нативной конформации полипептида. Другое рассматриваемое Ν-концевое слияние, которое может оказаться полезным, - это слияние дипептида метионин-лизин с Ν-концевым участком белка или полипептида. Такой вариант слияния может способствовать выгодному увеличению экспрессии и активности белка.

Особенно полезным вариантом слияния может быть такая конструкция слияния, в которой пептид специфического связывающего агента соединяется с гаптеном с целью увеличения иммуногенности этого специфического связывающего агента; такая конструкция может оказаться полезной, например, для получения антиидиотипических антител согласно настоящему изобретению. Такие конструкции слияния хорошо знакомы специалистам в данной области, например, слияние специфического связывающего агента с хелперным антигеном, таким как Ь§р70, или белковой последовательностью, например, цепью дифтерийного токсина, или с цитокином, таким как ИЛ 2, и могут быть полезны для получения иммунного ответа. Согласно другому подходу может быть сделана такая конструкция слияния, которая будет способствовать увеличению нацеливания антигенных композиций специфического связывающего агента на специфическую область или сайт.

Также рассматриваются другие конструкции слияния, включающие гетерологичные полипептиды с заданными свойствами, например, константный участок 1д для продления времени полужизни в сыворотке, или антитело или его фрагмент для нацеливания. Другие конструкции слияния используются для получения полипептидных гибридов, когда желательно отделить партнер слияния от нужного пептида. Согласно одному подходу партнер слияния связывается с рекомбинантным полипептидом специфического связывающего агента пептидной последовательностью, содержащей специфический сайт распознавания для протеазы. Примером подходящих последовательностей являются последовательности, распознаваемые протеазой вируса табачной мозаики (ЫГе Тесйпо1од1е8, СаййегеЬигдМО) или Фактором Ха (№\ν Епд1апб Вю1аЬ§, Веует1у, МА).

Изобретение также относится к полипептидам слияния, содержащим целый вариабельный домен Апд-2-антитела или его часть, таким, как вариабельный участок тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями, как описано выше, или вариабельный участок легкой цепи с аминокислотными последовательностями, как также описано выше, в комбинации с усеченным тканевым фактором (1ТР), нацеливающим агентом, состоящим из усеченной формы человеческого белка, индуцирующего свертывание, который действует как фактор свертывания в опухолевых сосудах. Слияние 1ТР с антителом к Апд-2 или его фрагментами может способствовать доставке анти-Апд-2-антител к клеткам-мишеням.

Варианты специфических связывающих агентов.

Варианты специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, включают инсерционные, делеционные варианты и/или варианты, основанные на замещении. В одном аспекте изобретения инсерционные варианты подразумевают замещение одним или более аминокислотным остатком аминокислотных последовательностей специфических связывающих агентов. Инсерции могут быть локализованы как в одном, так и в обоих концевых участках белка, или могут быть расположены во внутренних участках аминокислотных последовательностей специфических связывающих агентов. Инсерционные варианты с дополнительными аминокислотными последовательностями, как в одном, так и в обоих концевых участках белка, могут включать, например, белки слияния и белки, включающие аминокислотные ярлыки и метки. Инсерционные варианты включают полипептиды специфических связывающих агентов, в которых один или более аминокислотный остаток добавляется к аминокислотным последовательностям специфических связывающих агентов или их фрагментам.

Варианты специфических связывающих агентов, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также включают зрелые специфические связывающие агенты. У таких специфических связывающих агентов удалена лидерная или сигнальная последовательность, тем не менее полученный в результате этого полипептид имеет дополнительные аминоконцевые остатки по сравнению с полипептидом Апд2 дикого типа. Вариантами специфических связывающих агентов являются полипептид с дополнительным остатком метионина в положении-1 (Мет^-1-специфический связывающий агент) и полипептид с до

- 14 010726 полнительными метионином и лизином в положениях -2 и -1 (Мет^-2-Лиз^-1-специфический связывающий агент). Варианты специфических связывающих агентов с дополнительными остатками Мет, Мет-Лиз, Лиз (или с одним или более основными остатками) особенно полезны для увеличения рекомбинантной продукции в бактериальных клетках-хозяевах.

Изобретение также охватывает специфические связывающие агенты, имеющие дополнительные аминокислотные остатки, которые являются результатом применения специфических экспрессирующих систем. Например, использование коммерчески доступных векторов, которые экспрессируют нужный полипептид как часть продукта слияния, полученного с помощью системы глутатион-8-трансферазы (С8Т), обеспечивает получение такого полипептида, имеющего дополнительный остаток глицина в аминокислотном положении-1, после того, как этот полипептид был отделен от компонента С8Т. Также рассматриваются варианты, полученные после экспрессии в других векторных системах, включая такие, у которых полигистидиновые метки встраиваются в аминокислотные последовательности, обычно в карбоксильный и/или аминоконцевой участок последовательности.

Инсерционные варианты также включают белки слияния, описанные выше, у которых амино- и/или карбоксиконцевые участки полипептида специфического связывающего агента слиты с другим полипептидом или его фрагментом, или аминокислотными последовательностями, которые обычно не распознаются как часть какой-либо специфической белковой последовательности.

Изобретение также относится к делеционным вариантам полипептидов специфических связывающих агентов, из которых удален один или более аминокислотный остаток. Делеции могут быть осуществлены как в одном, так и в обоих концевых участках полипептида специфического связывающего агента, а также могут заключаться в удалении одного или более аминокислотного остатка из аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Делеционные варианты непременно включают все фрагменты полипептида специфического связывающего агента, ответственные за его функцию.

Антительные фрагменты включают те участки антитела, которые связываются с эпитопом антигенного полипептида. Примерами таких фрагментов являются ЕаЬ- и Е(аЬ')2-фрагменты, полученные, например, путем ферментативного или химического расщепления полноразмерных антител. К другим связывающим фрагментам относятся, например, фрагменты, полученные с помощью рекомбинантных ДНКтехнологий, таких как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные участки антител. Изобретение также охватывает полипептидные фрагменты Апд-2 специфического связывающего агента, причем эти фрагменты сохраняют способность специфически связывать Апд-2-полипептид. Фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 или более следующих друг за другом аминокислот белка или полипептида, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, представлены здесь. Выделенные полипептидные фрагменты демонстрируют уникальные и специфические иммунологические свойства, характерные для специфического связывающего агента, заявленного в соответствии с настоящим изобретением. Полипептидные фрагменты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением и имеющие желательные иммунологические свойства, могут быть получены любым из способов, хорошо известных и рутинных для специалистов в данной области.

Изобретение также относится к вариантам специфических связывающих агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, основанным на замещении аминокислот. Варианты, основанные на замещении, обычно считаются сходными с первоначальным полипептидом или имеют определенную процентную идентичность с первоначальным полипептидом и включают такие полипептиды, у которых один или более аминокислотный остаток удален и замещен альтернативным остатком. С одной стороны, замены консервативны по своей природе, но тем не менее изобретение охватывает и неконсервативные замены.

Идентичность и схожесть родственных полипептидов может быть легко подсчитана с помощью хорошо известных методов. Такие методы включают, но не ограничиваются указанными, описанные, например, в Сотри1а1юпа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., еб., ОхГогб ИшуегШу Ргекк, Ыете Уогк (1988); Вюсотрийпд: 1пГогтайск апб Сепоте Рго)ес1к 8тЬ11 Э.А.. еб., Асабетю Ргекк, Ыете Уогк (1993); СотрШег Апа1ук1к оГ 8ес.|иепсе Оа1а, Рай 1, СггГйп, А.М. апб Спйт, Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, Ыете 1егкеу (1994); 8ес.|иепсе Апайкук Рптег, СпЬккоу, М. апб Иетеуеих, I., ебк., М. 81оск1оп Ргекк, Ыете Уогк (1991); апб СагШо е1 а1., 81АМ I. АррЬеб МаШ., 48:1073 (1988).

Предпочтительные методы для определения степени родства или процентной идентичности двух полипептидов разработаны таким образом, чтобы обеспечить наибольшее перекрывание между двумя тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности раскрыты в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные методы для определения идентичности двух последовательностей, основанные на компьютерных программах, включают, но не ограничиваются указанными, ССС программный пакет, включающий САР (Оехегеих е1 а1., Ыис1 Ас1б Век., 12:387 (1984); Сепейск СотрШег Сгоир, ИпьуегкЬу оГ А1ксопкш,Маб1коп, ΑΙ, ВЬА8ТР, ВЬА8ТЫ и ЕА8ТА (АЙксЬи1 е1 а1., Σ Мо1 Вю1., 215:403-410 (1990)). Программа ВБА8ТХ общедоступна и может быть получена в Национальном Центре Биотехнологической Информации (ЫСВ1) и из других источников (ВБА8Т Мапиа1., АЙксЬи1 е1 а1. ХСВ/Ж-М/МН ВеШекба, МИ 20894; АЙксЬи1 е1 а1., кирга (1990)). Хорошо известный алгоритм Смита Ва

- 15 010726 термана также может быть использован для определения идентичности.

Некоторые схемы выравнивания для сравнения двух аминокислотных последовательностей могут привести к перекрыванию только короткого участка и эти небольшие выровненные участки могут иметь очень высокую степень идентичности, даже несмотря на то, что не существует значительного родства между двумя полноразмерными последовательностями. Соответственно, в определенных случаях, выборочный метод выравнивания (программа САР) может привести к выравниванию, которое охватывает по меньшей мере 10% полной длины сравниваемого полипептида; т.е. по крайней мере 40 последовательно расположенных аминокислот из по крайней мере 400 аминокислот полноразмерного полипептида подлежат сравнению, по крайней мере 30 последовательно расположенных аминокислот из по крайней мере от 300 до около 400 аминокислот полноразмерного полипептида подлежат сравнению, по крайней мере 20 последовательно расположенных аминокислот из 200 до около 300 аминокислотных последовательностей подлежат сравнению и по крайней мере 10 последовательно расположенных аминокислот из около 100 до 200 аминокислотных последовательностей подлежат сравнению.

Например, при использовании компьютерного алгоритма САР (СепеОсз Сотри1ег Сгоир, Ишуегзйу оГ ГС15соп51п, МаЛзоп, XVI) два полипептида, для которых необходимо определить процентную идентичность последовательностей, выравниваются для оптимального перекрывания их соответствующих аминокислотных последовательностей (шаг перекрывания, как определено алгоритмом). В определенных вариантах штрафная функция за открытие щели (которая обычно рассчитывается как средняя 3Х диагональ; средняя диагональ есть средняя величина диагонали матрицы сравнения, подлежащей использованию; диагональ - это очко или номер, определяемый для каждого предполагаемого перекрывания аминокислот с помощью определенной матрицы сравнения) и штрафная функция за расширение щели (которая обычно составляет 1/10 штрафной функции за открывания щели), так же, как и матрица сравнения, такая как РАМ 250 или ВЬОБИМ 62, используется совместно с алгоритмом. В определенных случаях стандартная матрица сравнения (см. ОауйоГГ е! а1., АЙаз оГ Рго1ет Бециепсе апб 81гис1иге, 5(3)(1978)) для матрицы сравнения РАМ 250 [НеткоГГ е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 89:10915-10919 (1992) для матрицы сравнения ВЬО8ИМ 62] также используется алгоритмом.

В определенных случаях параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующее:

Алгоритм: №еб1етапп е! а1., I. Мо1. Вю1., 48:443-453 (1970)

Матрица сравнения: ВЬО8ИМ 62 из Неп1коГГ е! а1., зирга (1992)

Штрафная функция: 12

Штрафная функция за длину щели: 4

Пороговая величина подобия: 0

Программа САР с вышеуказанными параметрами может оказаться приемлемой. В определенных ситуациях вышеуказанные параметры могут являться недостаточными для сравнения полипептидов (вместе с отсутствием штрафной функции за конец щелей) при использовании алгоритма САР.

В определенных случаях параметры для сравнения последовательностей полипептидных молекул включают следующее:

Алгоритм: №еб1етапп е! а1., зирга (1970)

Матрица сравнения: совпадения = +10, несовпадения = 0

Штрафная функция: 50

Штрафная функция за длину щели: 3

Программа САР также может оказаться приемлемой для вышеуказанных параметров. Вышеуказанные параметры являются недостаточными для сравнения полинуклеотидных молекул.

Другие показательные алгоритмы, дар орешпд репаШез, дар ех!епз1оп репаШез, матрицы сравнения, пороговые величины подобия и т. д. могут использоваться, в том числе и включенные в программное руководство, ГС|зсопз1п Раскаде, Версия 9, сентябрь 1997. Какую программу предпочесть, будет очевидным для специалистов в этой области и будет зависеть от того специфического сравнения, которое необходимо осуществить, например, сравнения ДНК и ДНК, белка и белка, белка и ДНК; и, кроме того, даже сравнения заданных пар последовательностей (в этом случае предпочтительными являются САР или Вез£Рй программы) или одной последовательности и большой базы данных о последовательностях (в этой ситуации предпочтительно использовать РА8ТА или ВБА8ТА).

В соответствии с настоящим изобретением используется двадцать основных аминокислот и их производных. См. 1ттипо1оду-А 8уп!11ез1з (2^пб ЕбШоп, Е.8. Со1иЬ апб Ό.Κ. Сгеп, Ебз., 8шаиег Аззос1а!ез, δω^τ^ά, Мазз. (1991)), данные источники приведены здесь в качестве ссылки.

Аминокислоты могут иметь как Ь-, так и Ό-стереоконфигурацию (кроме глицина, который не является ни Ό-, ни Ь-изомером), и полипептиды, и соединения, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать комбинации стереоизомеров. Однако Ь-стереоконфигурация является предпочтительной. Изобретение также относится к реверсивным молекулам, у которых последовательности аминоконцевого участка аминокислоты и последовательности карбоксиконцевого участка аминокислоты поменяны местами. Например, реверсивная молекула для молекулы, имеющей нормальную последовательность X -Х -Х , будет выглядеть как X -X -X . Изобретение также относится к ретро-реверсивным

- 16 010726 молекулам, у которых, как указано выше, аминоконцевой участок аминокислоты и карбоксиконцевой участок поменяны местами, и остатки, которые обычно являются Ь-энантиомерами, становятся Όизомерами.

Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати основных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-,α-замещенные аминокислоты, Ν-алкилированные аминокислоты, молочная кислота и другие необычные формы аминокислот, также могут быть подходящими компонентами для полипептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Примерами необычных аминокислот являются аминоадипиновая кислота, β-аланин, β-аминопропионовая кислота, аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота, аминокапроновая кислота, аминогептановая кислота, аминоизомасляная кислота, аминопимелиновая кислота, диаминомасляная кислота, десмозин, диаминопимелиновая кислота, диаминопропионовая кислота, Ν-этилглицин, Ν-этиласпарагин, ксироксилизин, алло-ксироксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, Ν-метилглицин, саркозин, Ν-метилизолейцин, Νметилвалин, норвалин, норлейцин, оритин, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν,триметиллизин, ε -Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и аминокислоты (например, 4гидроксипролин).

Так же, если специально не указано иное, левый конец одноцепочечной полинуклеотидной последовательности является 5' концом; левостороннее направление двуцепочечной полинуклеотидной последовательности также рассматривается как 5' направление. Направление от 5' конца к 3' концу, в котором идет добавление транскриптов к образующейся цепи РНК, называется транскрипционным направлением; участки последовательности одной цепи ДНК, имеющие ту же самую структуру, что и РНК и соответствующие 5'-5' концевому участку РНК-транскрипта, называются вышележащими последовательностями (ирйгеат кедиепсек); участки последовательности одной цепи ДНК, имеющие ту же самую структуру, что и РНК и соответствующие 3'-3' концевому участку РНК-транскрипта, называются нижележащими последовательностями (бо\упк1геат кедиепсек).

Консервативные аминокислотные замены могут относится к неприродным остаткам, которые обычно включаются в структуру белка путем химического пептидного синтеза, по сравнению с синтезом в биологических системах. Сказанное относится к пептидомиметикам и другим белкам, содержащим реверсивные или инвертированные формы аминокислотных остатков.

Существующие в природе остатки могут быть разделены на классы, основываясь на свойствах их боковых цепей:

1) гидрофобные: Мек А1а, Уа1., Ьеи, 11е;

2) нейтрально гидрофильные: Сук, 8ет, ТЬг, Акп, С1п;

3) кислые: Акр, С1и;

4) основные: Н1к, Ьук, Агд;

5) остатки, влияющие на пространственную ориентацию цепей: С1у, Рго; и

6) ароматические: Тгр, Туг, РЬе.

Например, неконсервативные замены могут включать замену представителя одного такого класса представителем другого класса. Такие замещенные остатки могут быть встроены в участки антител че ловека, гомологичные нечеловеческим антителам, или в негомологичные участки молекулы антитела.

При производстве таких замен, согласно определенным подходам, должен учитываться гидропатический индекс аминокислот. Для каждой аминокислоты установлен гидропатический индекс на основании ее заряда и гидрофобности. Вот эти индексы: изолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9) и аргинин (-4.5).

Роль гидропатического индекса в обеспечении биологической функции взаимодействия белков понятно из уровня техники. Ку1е е1 а1., I. Мо1. ΒίοΙ., 157:105-131 (1982). Известно, что определенные аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими такой же гидропатический индекс; при этом белок будет сохранять свою биологическую активность. Согласно одному подходу при производстве замен, основанных на гидропатическом индексе, в такие замены включают аминокислоты, чей гидропатический индекс лежит в диапазоне от -2 до +2. Другие подходы включают замены аминокислот, чей индекс лежит в диапазоне от -1 до +1; третьи - замены аминокислот с индексом от -0.5 до +0.5.

Также из области техники известно, что замена схожих аминокислот будет эффективной, если она основывается на гидрофильности этих аминокислот, особенно в тех случаях, когда биологически функциональный белок или пептид, полученный таким образом, предназначен для использования в иммунологических целях, как в настоящем изобретении. В определенных случаях наибольшая локальная гидрофильность белка, складывающаяся из гидрофильности составляющих его аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е. биологическими свойствами этого белка.

Приводим результаты оценки гидрофильности для следующих аминокислотных остатков: аргинин

- 17 010726 (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.0±1); глутамат (+3.0± 1); серин (+0.3); аспарагин (+0.2); глутамин (+0.2); глицин (0); треонин (-0.4); пролин (-0.5±); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); иэолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин (-2.5) и триптофан (-3.4). При производстве замен, основанных на одинаковой гидрофильности, при определенных подходах, производятся замены аминокислот, чья гидрофильность варьирует в пределах ± 2; при определенных подходах, в замены включают аминокислоты гидрофильностью ± 1, при других подходах - аминокислоты с гидрофильностью ± 0.5.

Возможно также идентифицировать эпитопы в основной аминокислотной последовательности, основываясь на гидрофильности. Такие участки также называются основными участками эпитопа.

Примеры аминокислотных замен приведены в табл. 1

Таблица 1

Аминокислотные замены

Исходные остатки	Примеры замен	Предпочтительные замены
А1а	Уа1, Ьеи, Не	Уа1
Ат₈ -	Ьуз, О1п, Азп	Ьуз
Азп	С1п, СИи, Азр	О1п
Азр	О1и, СИп, Азп	О1и
Суз	Зег, А!а	5ег
О1п	Азп,СИи, Азр	Азп
С1и	Азр, Азп, О1п	Азр
С1у	Рго, А1а	А1а
ΗΪ3	Азп, СИп, Ьуз, Аг£	Аге
Не	Ьеи, Уа1, Ме!, А1а, РЬе, Норлейцин	Ьеи
Ьеи	Норлейцин, 11е, Уа1, Ме!, А1а, РЬе	Не ' ......
Ьуз	Ат£, 1,4 Диамино-масляная кислота, Сйп, Азп	Аг§

Ме1	Ьеи, Рйе, Не	Ьеи
РЬе	Ьеи, Уа1,11с, А1а, Тут	Ьеи
Рго	А1а	О1у
8ег	ТЬг, А1а, Суз	ТЬг
Пи	8ег	Зег
Тгр	Туг, РЬе	Туг
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег	РЬе
Уа1	Не, Ме!, Ьеи, РИе, А1а, Норлейцин	Ьеи

Специалист без труда сможет выделить подходящие варианты полипептида, как будет показано ниже, используя хорошо известные технологии. В определенных случаях специалист может также идентифицировать подходящие участки молекулы, которые могут быть заменены участками-мишенями, не влияющими на активность, соответственно, без нарушения активности данной молекулы. В определенных случаях специалист может идентифицировать остатки и части молекулы, которые являются постоянными у сходных полипептидов. При определенном подходе даже участки, являющиеся необходимыми для биологической активности или сохранения структуры молекулы, могут быть задействованы в консервативных заменах без нарушения биологической активности и без серьезного влияния на структуру полипептида.

Кроме того, специалист может провести структурно-функциональные исследования для идентификации тех остатков сходных полипептидов, которые являются необходимыми для активности и структуры полипептида. На основе такого сравнения можно предсказать важность аминокислотных остатков в белке и соотнести их с аминокислотными остатками, имеющими существенное значение для активности и структуры сходного белка. Специалист в данной области может выбирать, на основе такой предсказан

- 18 010726 ной значимости аминокислотных остатков, химически сходные остатки, которые подлежат замене.

Специалист в этой области также может анализировать трехмерную пространственную структуру и аминокислотную последовательность сходных полипептидов. На основе таких данных специалист в данной области может предсказывать расстановку аминокислотных остатков в молекуле антитела, зависящую от трехмерной пространственной структуры антитела. При таком подходе специалист в данной области может не делать радикальных изменений в аминокислотных остатках, для которых предсказана их локализация на поверхности белка, поскольку эти остатки могут быть вовлечены в важное взаимодействие с другими молекулами. Кроме того, специалист в данной области может создавать тестовые варианты, содержащие определенную аминокислотную замену по каждому аминокислотному остатку. Эти варианты могут быть потом скринированы с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Такие тестовые варианты могут использоваться для получения информации о подходящих вариантах. Например, можно выяснить, что замена определенного аминокислотного остатка приводит к нарушенной, нежелательно сниженной или неподходящей активности; варианты с такой заменой не будут использоваться. С другой стороны, основываясь на информации, полученной с помощью таких рутинных экспериментов, специалист в данной области может точно определить аминокислоты, замещения которых в дальнейшем следует избегать как самих по себе, так и в сочетании с другими мутациями.

Многочисленные научные публикации были посвящены предсказанию вторичной структуры. См. Мои1! I., Сигг. Ор. ίη Вю1есЬ, 7(4): 422-427 (1996), Сйои е! а1., Вюсйетййу, 13(2): 222-245 (1974); Сйои е! а1., Вюсйетййу, 113(2):211-222 (1974); Сйои е! а1., Αάν. Еп7уто1. Ке1а!. Лгеак Мо1. Вю1., 47:45-148 (1978); Сйои е! а1., Αηη. Вет. Вюсйет., 47:251-276 и Сйои е! а1., Вюрйук. I., 26:367-384 (1979). Кроме того, постоянно доступны специальные компьютерные программы, позволяющие предсказать вторичную структуру. Один метод предсказания вторичной структуры базируется на гомологичном моделировании. Например, два полипептида или белка, имеющие последовательности, совпадающие более чем на 30% или совпадающие более чем на 40%, очень часто имеют общую структурную топографию. Недавнее расширение базы данных о структуре белков позволило увеличить предсказуемость вторичной структуры, включая потенциальное число складок в структуре белков или полипептидов. См. Но1т е! а1., Ыис1. Ααά. Век., 27(1):244 -247 (1999). Было предположено (Вгеппег е! а1., Сигг. Ор. 81гис!. Вю1., 7(3):369-376 (1997)), что существует ограниченное количество складок в заданном полипептиде или белке, и установление критического числа таких складок позволит предсказывать структуру белка или полипептида намного более точно.

Дополнительные методы предсказания вторичной структуры включают нанизывание (Шгеабшд) Цоиек, Ό., Сигг. Ορίη. 81гис!. Вю1., 7(3): 377-87 (1997); δίρρί е! а1., 8!гис!иге, 4(1):15-19 (1996)), профильный анализ (Во\\зе е! а1., 8с1енсе. 253:164-170 (1991); СпЬккот е! а1., Ме!й. Еηζут., 183: 146-159 (1990); СпЬккот е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск, 84 (13):4355-4358 (1987)) и анализ эволюционной связи (См. Но1т, кирга (1999), анй Втоп^т, кирга (1997)).

В определенных случаях варианты антител включают гликозилированные антитела, в которых число и/или тип сайта гликозилирования изменено по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного полипептида. В частности, белковые варианты включают большее или меньшее число Ν’связанных сайтов гликозилирования по сравнению с нативным белком. Ν-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью: Ακη-Χ-Зег или Ακη-Χ-Тйг, при этом аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любую аминокислоту, за исключением пролина. Замена аминокислотных остатков для создания таких последовательностей обеспечивает потенциально новый сайт для добавления Ν-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замена, которая элиминирует такую последовательность, будет удалять существующую Ν-связанную углеводную цепь. Изобретение также предусматривает реорганизацию Ν-связанных углеводных цепей, при этом один или более Νсвязанный сайт гликозилирования (обычно тот, который существует в природе) элиминируется, а вместо него один или более Ν-связанный сайт создается. Дополнительные предпочтительные варианты антител включают цистеиновые варианты, в которых один или более остаток цистеина удален или заменен другим аминокислотным остатком (например, серином) по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного белка. Цистеиновые варианты могут оказаться полезными в тех случаях, когда должна быть восстановлена конформация антител, обеспечивающая их биологическую активность, например, после выделения нерастворимых телец включения. Цистеиновые варианты в общем имеют меньше цистеиновых остатков по сравнению с нативным белком, и обычно их четное число для того, чтобы минимизировать взаимодействия, обусловленные неспаренными цистеиновыми остатками.

Согласно определенному подходу аминокислотные замены: (1) снижают восприимчивость к протеолизу, (2) сокращают восприимчивость к окислению, (3) меняют связывающую аффинность для формирования белковых комплексов, (4) изменяют связывающую аффинность и/или (5) придают новые свойства или изменяют функциональные свойства таких полипептидов. Согласно такому подходу одиночные или множественные аминокислотные замены (в определенных вариантах консервативные аминокислотные замены) могут быть произведены в природно-существующих последовательностях (в определенных случаях, в участке полипептида вне домена(ов), формирующих межмолекулярные контакты). В определенных случаях консервативные аминокислотные замены могут существенно не изменять структурные

- 19 010726 характеристики исходной последовательности (например, перемещение аминокислот не должно приводить к нарушению спирали, характерной для исходной последовательности, а также не должно изменять другие типы вторичной структуры, характерные для исходной структуры). Примеры хорошо известных из области техники вторичных и третичных структур описаны в следующих работах: Рго1еш8, 8(гис1иге5 апб Мо1еси1аг Ртшаркк (СгещЫоп. Еб., А. Н. Етеетап аиб Сотрапу, Ыете Уогк (1984)); 1п1гобисбоп οί Рго1еш 8(гис1иге (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе, ебк., Оаг1апб РиЬШЫпд, Ыете Уотк, Ν.Υ. (1991)); и Т1югп1оп е( а1. Уинге 354:105 (1991).

Молекулы специфических связывающих агентов, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, представляющие собой пептидные или полипептидные варианты замен, могут иметь от 10 до 20% замещенных оригинальных аминокислотных последовательностей. Для вариантов антител тяжелая цепь может иметь 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещенную аминокислоту, в то время как легкая цепь может иметь 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1 замещенную аминокислоту.

Производные специфических связывающих агентов

Изобретение также относится к производным полипептидов специфически связывающих агентов. Производные включают полипептиды специфических связывающих агентов, имеющие модификации в виде инсерций, делеций или замен аминокислотных остатков. Предпочтительно модификации являются ковалентными по своей природе, и включают, например, химическое связывание с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими молекулами. Производные полипептидов специфических связывающих агентов, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут обладать увеличенным временем полужизни в сыворотке или обладать повышенной тропностью к нужным клеткам, тканям или органам.

Изобретение также охватывает производные связывающих агентов, ковалентно модифицированные для включения одного или более водорастворимого полимера, такого, как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах США №к: 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Другие хорошо известные специалистам полимеры включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры, поли-(№винил пирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, гомополимеры, сополимер полипропилен-оксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол) и поливиниловый спирт, так же как смеси указанных полимеров. Особенно предпочтительными продуктами являются специфические связывающие агенты, ковалентно модифицированные субъединицами полиэтиленгликоля (РЕО). Водорастворимые полимеры могут быть присоединены к специфическим участкам, например, к аминоконцу полипептида специфического связывающего агента, или могут быть произвольно распределены на боковых цепях полипептида. Использование РЕО для улучшения терапевтической активности специфических связывающих агентов и, в особенности, гуманизированных антител, описано в патенте США 6133426, Соп/а1е5 е! а1., от 17 октября 2000 г.

Сайты-мишени для мутагенеза антител

Для манипулирования присущими Апд-2 специфическому антителу свойствами, такими как, например, аффинность антитела к клетке-мишени, могут быть использованы определенные подходы. Эти подходы включают применение сайт-специфического или произвольного мутагенеза полинуклеотидной молекулы, кодирующей антитело, с целью получения вариантов антител, с последующей стадией скрининга для отбора вариантов антител, которые обнаруживают нужные изменения, т.е. увеличенную или сниженную аффинность.

К аминокислотным последовательностям, наиболее часто являющимся мишенями для мутагенеза, в первую очередь относятся последовательности СЭШ. Как описано выше, именно эти участки содержат остатки, непосредственно взаимодействующие с Апд-2, и аминокислоты, влияющие на пространственную организацию этих остатков. Кроме того, показано, что аминокислоты в каркасных участках вариабельных доменов, расположенные вне СЭВ участков, также могут вносить существенный вклад в антигенсвязывающие свойства антитела и поэтому могут быть мишенями мутагенеза для изменения этих свойств. См. Нибкоп, Сигг Орт Вю1ес1т 9:395-402 (1999) и ссылки к ним.

Меньшие и более эффективно скринируемые библиотеки вариантов антител могут быть получены путем ограничивающего случайного или сайт-специфического мутагенеза в отношении сайтов в СЭК.8, которые соответствуют областям, склонным к гипермутировнию в процессе созревания соматической аффинности. См. С’1ю\\б1шгу и Ра§1ап, №-11иге Вю1ес1т 17:568-572 [1999] и ссылки к ним. К типам элементов ДНК, для которых известна их способность определять сайты гипермутагенеза, относятся прямые и инвертированные повторы, определенные согласованные последовательности, втроичные структуры и палиндромы. Согласованные последовательности ДНК включают четырехосновную последовательность Пурин-О-Пиримидин - А/Т (т.е. А или О-О-С или Т-А или Т) и сериновый кодон ΑΟΥ (в котором вместо Υ может быть С или Т).

Таким образом, подходы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают стратегии мутагенеза, имеющие своей целью увеличить аффинность антитела к его мишени. Эти стратегии

- 20 010726 включают мутагенез целых вариабельных тяжелых и легких цепей, мутагенез только СОВ участков, мутагенез согласованных сайтов гипермутаций с СЭРк, мутагенез каркасных участков, а также различные комбинации этих вариантов (мутагенез в этом случае может быть произвольным или сайтспецифичным). Точное описание СОВ участков и идентификация остатков, входящих в антигенсвязывающий участок антитела, может быть достигнута путем определения структуры заданного антитела и комплекса антитело-лиганд с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких, как, например, рентгеновская кристаллография. Различные методы, основанные на анализе и характеристике кристаллических структур антител, хорошо известны специалистам в данной области и могут быть применены для приблизительного определения структуры СОВ участков. Примерами таких широко применяемых методов являются методы КаЬа!, С1о!Ыа, АЬМ и контактное определение.

Метод КаЬа! основан на вариабельности последовательностей и является наиболее часто применяемым методом определения СЭР к ЦоНпкоп апк ^и, №.1с1е1с Ас1кк Век, 28:214-8 (2000)]. Метод С1ю11иа основан на определении местонахождения структурных петельных участков. |С1ю11иа е! а1., 1 Мо1 Вю1., 196: 901-17(1986); С1о!Ыа е! а1., Шипе, 342: 877-83 (1989)]. Метод АЬМ является компромиссом между методами КаЬа! и СНоЙиа. АЬМ - это интегральный набор программ для моделирования структуры антител, разработанный Оксфордской Молекулярной Группой (ОхГогк Мо1еси1аг Сгоир) [Магйп е! а1., Ргос №111 Асак 8с1 (И8А) 86:9268-9272 (1989); Веек е! а1., АВМ™ - компьютерная программа для моделирования вариабельных участков антител, ОхГогк, ИК; ОхГогк Мо1еси1аг, Ь!к.]. АЬМ создает модели третичной структуры антитела из первичных последовательностей, используя комбинации известных баз данных и методов. Дополнительный метод определения, известный как метод контактного определения, был представлен выше. [МасСа11ит е! а1., 1 Мо1 Вю1, 5:732-45 (1996)]. Этот метод основан на анализе доступных комплексов кристаллических структур.

Принято, что СЭВ участки в тяжелых цепях обычно обозначаются Н1, Н2 и Н3 и нумеруются последовательно от аминоконцевого участка к карбоксиконцевому участку. СЭВ участки в легких цепях обычно обозначаются Ь1, Ь2 и Ь3 и последовательно нумеруются от аминоконцевого участка и карбоксиконцевому.

СЭВ-Н1 обычно имеет примерно от 10 до 12 остатков в длину и обычно начинается через 4 аминокислотных остатка после Сук, в соответствии с данными С1ю11иа и АЬМ, или через 5 аминокислотных остатка после Сук, согласно КаЬа!. За Н1 обычно следует Тгр, чаще Тгр-Уа1, то также может быть последовательность Тгр-11е или Тгр-А1а. Длина Н1 приблизительно от 10 до 12 аминокислотных остатков согласно АЬМ, в то время как С1ю11иа исключает 4 последних остатка.

СЭВ-Н2 обычно начинается через 15 аминокислотных остатков после окончания Н1, в соответствии с данными КаЬа! и АЬМ. Остатками, предшествующими Н2, обычно являются Ьеи-С1и-Тгр-11е-С1у, хотя существует множество вариантов. После Н2 обычно следует аминокислотная последовательность Ьук/Агд-Ьеи/11е/Уа1/Рйе/Тйг/А1а-Тйг/8ег/11е/А1а. Согласно КаЬа! длина Н1 составляет приблизительно от 16 до 19 остатков, в то время как по данным АЬМ она обычно включает от 9 до 12 остатков.

СЭВ-Н3 участок обычно начинается через 33 аминокислотных остатка после окончания Н2 и обычно ему предшествует аминокислотная последовательность Сук-А1а-Агд. После Н3 обычно следует аминокислотный остаток С1у. Длина Н3 может быть любой, в промежутке от 3 до 25 аминокислотных остатков.

СЭВ-Ь1 обычно начинается приблизительно после 24-го аминокислотного остатка сразу за Сук. Остатком, следующим за СЭВ-Ы, всегда является Тгр и с него начинаются последовательности Тгр-ТугС1п, Тгр-Ьеи-С1п, Тгр-Рйе-С1п или Тгр-Туг-Ьеи. Длина СЭВ-Ь1 обычно составляет от 10 до 17 аминокислотных остатков. Структура СЭВ-Ь1 для антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, полностью соответствует указанной схеме, поскольку этот участок содержит 15 аминокислот и следует за Сук, а за ним идет последовательность Тгр-Туг-С1п.

СЭВ-Ь2 начинается приблизительно через 16 аминокислотных остатков после окончания Ь1. Он следует за аминокислотными последовательностями 11е-Туг, Уа1-Туг, 11е-Ьук или 11е-Р1е. Длина СЭВ-Ь2 составляет приблизительно 7 аминокислотных остатков.

СЭВ-Ь3 обычно начинается через 33 аминокислотных остатка после окончания Ь2 и обычно следует за Сук. После Ь3 обычно следуют аминокислотные последовательности Р1е-С1у-ХХХ-С1у. Длина СЭВ-Ь3 составляет приблизительно от 7 до 13 аминокислотных остатков.

Различные способы для модификации антител были описаны в уровне техники.

Например, патент США 5530101 (Онееп е! а1., 1ипе 25, 1996) описывает методы получения гуманизированных антител, в которых последовательность каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина на 65-95% идентична аналогичной последовательности донорного иммуноглобулина. Каждая цепь гуманизированного иммуноглобулина обычно содержит, в дополнение к СЭВк, аминокислоты, взятые из каркасного участка донорного иммуноглобулина, которые, например, способны взаимодействовать с СЭР к для изменения связывающей аффинности; это такие аминокислоты, которые располагаются точно рядом в СЭВ участке донорного иммуноглобулина, или аминокислоты, чей размер предсказывается вплоть до 3 ангстремов с помощью молекулярного моделирования. Как тяжелые, так и легкие цепи могут быть созданы с помощью использования одного или не

- 21 010726 скольких различных позиционных критериев. В комбинации с интактными антителами гуманизированные иммуноглобулины, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть по большей части неимуногенными в человеческом организме, но сохранять такую же аффинность к антигенам, таким, как белки и другие соединения, содержащие эпитоп, как и донорные иммуноглобулины. См. также родственные методики, изложенные в патенте США 5693761, Онееп е! а1., от 2 декабря 1997 (Полинуклеотиды, кодирующие гуманизированные иммуноглобулины); патенте США 5693762, Оиееп е! а1., от 2 декабря 1997 (Гуманизированные иммуноглобулины); патенте США 5585089, Онееп е! а1., от 17 декабря 1996 (Гуманизированные иммуноглобулины).

В одном примере, см. патент США 5565332, НоодепЬоот е! а1., от 15 октября 1996 (Получение химерных антител - комбинаторный подход) описываются методы получения антител, фрагментов антител, которые имеют такую же специфичность связывания, как и исходное антитело, но в большей степени сходны с антителами человека. Гуманизированные антитела получают с помощью комбинирования цепей, используя, например, фагово-дисплейную технологию, причем полипептид, содержащий тяжелые или легкие цепи с вариабельными доменами антитела нечеловеческого происхождения, специфического к заданному антигену, комбинируется с набором комлементарных вариабельных доменов (легкой или тяжелой) цепи антител человека. Гибридные пары, которые являются специфичными для заданного антигена, идентифицируются, а цепи антител человека из выборочных пар комбинируются с набором комплементарных вариабельных доменов (легкой или тяжелой) цепи антител человека. Согласно другому подходу часть СОЯ участка антитела нечеловеческого происхождения комбинируется с набором частей СОЯ участка антител человека. Из полученной библиотеки полипептидных димеров антител отбирают гибриды и используют их на второй стадии гуманизирования путем комбинирования цепей. Альтернативно, указанная вторая стадия может опускаться, если гибрид уже обладает в достаточной степени свойствами антител человека, чтобы было возможно его терапевтическое использование. Методы модификации антител с целью придания им свойств человеческих антител также описаны. См. также ^т!ег, ЕЕВ8 Ье!!§ 430:92-92 (1998).

В другом примере, см. патент США 6054297, Сайег е! а1., от 25 апреля 2000 г., описывается метод получения гуманизированных антител путем замещения аминокислотной последовательности СОЯ соответствующей аминокислотной последовательностью СОЯ антитела человека и/или замещения аминокислотной последовательности ЕЯ соответствующей аминокислотной последовательностью ЕЯ участка антитела человека.

Еще один пример, описанный в патенте США 5766886 8!ибшска е! а1., от 16 июня 1998 г. (Модифицированные вариабельные домены антител), включает методы идентификации аминокислотных остатков вариабельных доменов, которые могут быть модифицированы без уменьшения нативной аффинности антиген-связывающего домена, но со снижением его иммуногенности по отношению к гетерологичным видам, а также методы получения таких модифицированных вариабельных доменов антител, которые могут быть полезными для применения у гетерологичных видов. См. также патент США 5869619 8!ибшска от 9 февраля 1999 г.

Как уже обсуждалось, модификация антител любым из способов, известных специалистам, обычно производится для достижения увеличенной связывающей аффинности к антигену и/или снижения иммуногенности антитела в организме реципиента. Согласно одному подходу гуманизированные антитела модифицируются таким образом, что у них удаляются сайты гликозилирования с целью увеличения их аффиности к специфическому антигену [Со е! а1., Мо1 1ттипо1 30:1361-1367 (1993)]. Технологии такие, как решейпинг (гекйартд), гиперхимеризация (ЕурегсЫтеп/аБоп), вениринг/ресурфэйсинг (уепеегтд/гекшЕастд), позволяют получать антитела со значительным терапевтическим потенциалом. |Уа8\\'ат1 е! а1., Аппа1к о£ А11егду, АкШта, & 1ттипо1 81:105 (1998); Яодикка е! а1., Рго! Епдтеег 9:895904 (1996)]. См. также патент США 6072035 Нагбтап е! а1., от 6 июня 2000 г., который описывает методы восстановления исходной структуры антител (гекйартд). В то время как эти технологии снижают иммуногенность антител путем сокращения числа инородных остатков, они не препятствуют антиидиотипическому и антиаллотипическому иммунному ответу, появляющемуся после повторных введений антител. Альтернативные методики для снижения иммуногенности антител описаны в источнике: СПШапб е! а1., I 1ттипо1 62(6):3663-71 (1999).

Во многих случаях гуманизированные антитела имеют сниженную способность связывать антиген. В таком случае является предпочтительным ремутировать гуманизированное антитело с тем, чтобы включить в его структуру один или более аминокислотный остаток, обнаруживаемый в оригинальном антителе (чаще всего в антителе грызуна), для того, чтобы попытаться восстановить связывающую аффинность антитела. См., например, 8а1бапНа е! а1., Мо1 1ттипо1 36:709-19 (1999).

Непептидные аналоги специфических связывающих агентов/белковые миметики

Изобретение также относится к небелковым аналогам специфических связывающих агентов, обеспечивающих стабильную структуру и минимальную биодеградацию. Пептидные аналоги/миметики специфических связывающих агентов могут быть получены на основе выбранного ингибиторного пептида путем замещения одного или более аминокислотного остатка непептидными молекулами. Желательно, чтобы непептидные молекулы способствовали сохранению естественной конформации пептида или ста

- 22 010726 билизировали предпочтительную, т. е. биоактивную, конформацию, обеспечивающую способность распознавать и связывать Апд-2. С одной стороны, полученные аналоги/миметики демонстрируют увеличенную связывающую аффинность к Апд-2. Один пример метода, используемого для получения непептидных миметиков/аналогов из белковых специфических связывающих агентов, описан в источнике: ЫасНшап е! а1., Яеди1 Рер1 57:359-370 (1995). При необходимости, пептиды специфических связывающих агентов, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть модифицированы, например, путем гликозилирования, аминирования, карбоксилирования или фосфорилирования, а также путем создания аддитивных солей кислоты, дополнительных кислых солей, амидов, эфиров, в особенности Сконцевых эфиров и Ν-ацилированных производных пептидов, которые тоже входят в объем настоящего изобретения. Пептиды специфических связывающих агентов также могут быть модифицированы для создания белковых производных путем формирования ковалентных и нековалентных комплексов с другими молекулами. Ковалентно-связанные комплексы могут быть получены путем соединения химических молекул с функциональными группами боковых цепей аминокислот, входящих в состав пептидов специфических связывающих агентов, или путем присоединения этих химических молекул к Ν- или Сконцевым участкам.

В особенности, предполагается, что пептиды специфических связывающих агентов могут быть соединены с маркерной группой, включающей, но не ограничивающейся указанными, радиоактивную метку, флуоресцентную метку, фермент (например, катализирующий колориметрическую или флуоресцентную реакцию), подложку, твердый матрикс или носитель (например, биотин или авидин). Изобретение, соответственно, обеспечивает получение соединения, содержащего молекулы антител, причем это соединение предпочтительно содержит маркерную группу, выбранную из группы, включающей радиоактивную метку, флуоресцентную метку, фермент, подложку, твердый матрикс или носитель. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области, например, чаще всего применяются биотиновые метки, описанные, например, в патенте США № 3817837; в патенте США № 3850752; патенте США № 3996345 и патенте США № 4277437. Другие метки, которые могут оказаться полезными, включают, но не ограничиваются указанными, радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. Патенты США, касающиеся использования таких меток, включают, например, патент США № 3817837; патент США № 3850752; патент США № 3939350 и патент США № 3996345. Каждый из пептидов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, может содержать одну, две или более указанных меток.

Методы получения специфических связывающих агентов

Специфические связывающие агенты настоящего изобретения, являющиеся по своей структуре белками, могут быть получены путем химического синтеза в растворе или на твердом субстрате в соответствии с существующими технологиями. Существующий лимит для твердофазного синтеза составляет 85-100 аминокислот в длину. Однако технологии химического синтеза могут быть применены для химического связывания серии небольших пептидов для получения полноразмерного полипептида. Различные автоматические синтезаторы являются коммерчески доступными и могут быть использованы в соответствии с известным протоколом. См., например, 81е\\'аг1 и Уоиид е! а1., 8о11й Рйаке Рерййе 8уп111е515. 2й. ей., Р1егсе Сйешюа1 Со., (1984); Тагп е! а1., I Ат Скет 8ос, 105:6442, (1983); МетДе1й, 8с1епсе, 232:341347, (1986) и Вагапу апй Метйе1й, ТНе Рерййек, Сго55 апй Ме1епйо£ег, ей§, Асайетю Рге§8, №\ν Уогк, 1284; Вагапу е! а1., Ιπΐ. I. Рерййе Рго1еш Яек., 30, 705-739 (1987) и патент США № 5424398); каждая из этих работ приведена здесь в качестве ссылки.

Методы твердофазного синтеза подразумевают использование сополимера (стиролдивинилбензола), содержащего 0,1-1,0 мМ аминов на один грамм полимера. Такие методы пептидного синтеза используют бутилоксикарбонил (ΐ-ВОС) или 9-фторенилметилоксикарбонил (РМОС) для защиты альфа-аминогрупп. Оба метода подразумевают ступенчатый синтез, при котором на каждом шагу добавляется единичная аминокислота, начиная с С-концевого участка пептида (см. С'ойдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1§ ш 1ттипо1оду, \Уйеу 1п1ег8с1еи8е, 1991, υπίΐ 9). После завершения химического синтеза, с синтезированного пептида снимается защита для удаления блокирующих аминокислоты групп 1-ВОС или РМОС, после чего пептид выделяют из полимера путем обработки кислотой при пониженной температуре (например, жидкой НР-10% анизолом в течение 25 мин-1 ч при температуре 0°С). После упаривания реагентов, пептиды специфического связывающего агента экстрагируют из полимера 1%-ным раствором уксусной кислоты и затем лиофизилируют с получением неочищенного материала. Такой материал может быть очищен с помощью такой технологии, как гель-фильтрация на Сефадексе 0-15 с использованием 15%-ной уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация подходящих фракций, полученных с колонки, приведет к получению гомогенных пептидов специфического связывающего агента или пептидных производных, которые могут быть определены с помощью таких стандартных технологий как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, жидкостная хроматография высокого разрешения, ультрафиолетовая абсорбционная спектроскопия, молярная ротация, и подсчитаны с помощью твердофазовой деградации по Эдману.

Химический синтез антител к Аид-2, а также их производных, вариантов и фрагментов, также, как и других специфических связывающих агентов Апд-2 белковой природы, допускает включение в структу

- 23 010726 ру агента аминокислот, не являющихся природными.

Технологии рекомбинантных ДНК являются подходящими для получения полноразмерных антител или других крупных белковых специфических связывающих агентов и их фрагментов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Молекула кДНК, кодирующая антитело или его фрагмент, может быть встроена в экспрессирующий вектор, который, в свою очередь, будет помещен в клетку-хозяин для продукции антител или их фрагментов. Понятно, что молекулы кДНК, кодирующие такие антитела, могут быть модифицированы по сравнению с исходными молекулами кДНК (которые были транслированы с мРНК), чтобы обеспечить вырожденность кодонов или включить в их состав предпочтительные кодоны, использующиеся в определенных типах клеток-хозяев.

В целом, молекулы ДНК, кодирующие антитела, могут быть получены с помощью методик, описанных здесь в примерах. Когда необходимо получить РаЬ молекулы или СОКз, родственные оригинальной молекуле антитела, можно скринировать подходящую библиотеку (фагово-дисплейную библиотеку; лимфоцитарную библиотеку и т.д.), используя стандартные технологии для идентифицирования и клонирования родственных РаЬк/СОКк. ДНК-зонды, используемые для такого скрининга, могут быть полноразмерными или усеченными нуклеотидными последовательностями, кодирующими РаЬ-фрагменты исходного антитела, один или более СЭР 5 РаЬ-фрагмента исходного антитела, или другие подходящие зонды. Когда ДНК фрагменты используются в качестве зондов, стандартными условиями гибридизации являются условия, описанные у Аи8иЬе1 е1 а1. (Сиггеп! РгоЮсо15 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сиггеп! Рго1осо15 Рге55 [1994]). После гибридизации блоты отмывают в условиях подходящей строгости, в зависимости от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология зонда и клона, тип библиотеки, подлежащей скринингу, и количество клонов, подлежащих скринингу. Примерами условий с высокой строгостью использующихся для скрининга являются 0,1 X 88С и 0,1% 8Ό8 при температуре 50-65°С.

Различные системы вектор экспрессии/хозяин могут быть использованы для экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих специфические связывающие агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением. Такие системы включают, но не ограничиваются указанными, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом; плазмидные или космидные экспрессионные ДНК векторы; дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессионными векторами; системы клеток насекомых, трансформированные вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусными векторами); системы растительных клеток, трансформированные вирусными экспрессионными векторами (например, векторами на основе вируса мозаики цветной капусты, СаМУ; вируса табачной мозаики, ТМУ) или трансформированные бактериальными экспрессионными векторами (например, Т1 или рВР322 плазмидами); или системы клеток животных.

Клетки млекопитающих, которые являются полезными в рекомбинантной продукции специфических связывающих агентов, включают, но не ограничиваются указанными, УЕРО-клетки, НеЬа-клетки, клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), СО8 клетки (такие как СО8-7), XV138, ВНК, НерС2, 3Т3, ΡΙΝ, МБСК, А549, РС12, К562 и клетки 293, так же, как и гибридомные клеточные линии, как описано здесь. Клетки млекопитающих являются подходящими для получения таких специфических связывающих агентов и фрагментов антител, которые обычно являются гликозилированными и требуют правильного восстановления структуры для своей активности. Предпочтительными клетками млекопитающих являются СНО клетки, гибридомные клетки и миелоидные клетки.

Некоторые примерные протоколы для рекомбинантной экспрессии специфических связывающих агентов описаны здесь ниже.

Термин экспрессионный вектор относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору, предназначенному для экспрессии полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью ДНК (РНК) в составе такого вектора. Экспрессионный вектор может содержать транскрипционную единицу, включающую: (1) генетический элемент или элементы, играющие регуляторную роль в генной экспрессии, например, промоторы и энхансеры, (2) структуры или последовательности, кодирующие связывающий агент, транскрибируемые с образованием мРНК и транслируемые в белки, и (3) подходящие последовательности, инициирующие и терминирующие транскрипцию. Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевых или эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают лидирующую последовательность, делающую возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином.

Альтернативно, когда рекомбинантный белок специфического связывающего агента экспрессируется без лидирующей или транспортной последовательности, он может включать аминоконцевой остаток метионина. Этот остаток может быть впоследствии выщеплен или не выщеплен из экспрессированного рекомбинантного белка для получения конечного продукта специфического связывающего агента.

Например, специфические связывающие агенты могут быть рекомбинантно экспрессированы в дрожжах с использованием коммерчески доступной экспрессионной системы, например, с помощью дрожжевой экспрессионной системы [РюЫа Ехргекмоп 8у51ет (1пуйгодеп, 8ап О1едо, СА)], следуя инструкции производителя. Эта система также задействует для направления секреции пре-про-альфа последовательность, но транскрипция вставки контролируется промотором алкогольоксидазы (АОХ1), который индуцируется метанолом.

- 24 010726

Полученный пептид специфического связывающего агента очищается от дрожжевой ростовой среды с помощью, например, методов, используемых для очистки белка от супернатантов бактериальных клеток и клеток млекопитающих.

Альтернативно, кДНК, кодирующая белок специфического связывающего агента, может быть клонирована в бакуловирусном экспрессионном векторе рУЪ1393 (РйатМтдеп, 8ап Ωίοβο. СА). Такой вектор может быть использован, в соответствии с инструкцией производителя (РйатМтдеп) для заражения клеток насекомого 8роборГета ГтидЧретба в зЕ9 небелковой среде и для получения рекомбинантного белка. Протеин специфического связывающего агента может быть очищен и выделен из среды с помощью гепариново-сефарозной колонки (Рйаттааа).

Альтернативно, пептид может быть экспрессирован в системе клеток насекомых. Такие системы для экспрессии белков хорошо известны специалистам в данной области. В одной такой системе в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8роборГета ГтидЧретба или в клетках ТпеНорРыа 1атуае может использоваться вирус ядерного полиэдроза АиГодтарйа сайГотшса (АсИРУ). Последовательность, кодирующая специфический связывающий агент, может быть клонирована в несущественном участке вируса, таком как ген полиэдрина, и помещена под контроль полиэдринового промотора. Успешное встраивание гена, кодирующего пептид специфического связывающего агента, приведет к тому, что ген полиэдрина будет инактивирован, и полученный рекомбинантный вирус утратит способность синтезировать белок оболочки.

Рекомбинантные вирусы могут быть использованы для заражения клеток 8. ГтидЧретба или клеток Т. 1агуае, в которых экспрессируется белок [8шйй е1 а1., Ч Упо1 46:584 (1983); Епде1Нагб е1 а1., Ргос №11 Асаб 8с1 (И8А) 91:3224-7 (1994)].

В другом примере последовательность ДНК, кодирующая пептид специфического связывающего агента, может быть амплифицирована с помощью ПЦР и клонирована в подходящем векторе, например, рСЕХ-3Х (Рйагшааа). РСЕХ вектор создан для получения белков слияния, содержащих глутатион-8трансферазу (С8Т), кодируемую вектором, и белков специфических связывающих агентов, кодируемых фрагментом ДНК, встроенным в клонирующий сайт вектора. Праймеры для ПЦР могут быть получены таким образом, чтобы обеспечить включение подходящих сайтов расщепления. Когда компонент, используемый для слияния со специфическим связывающим агентом, применяется исключительно для обеспечения экспрессии или нежелательно его прикрепление к нужному пептиду, рекомбинантный белок слияния специфического связывающего агента может быть вырезан из С8Т участка белка слияния. РСЕХ-3Х конструктом пептида специфического связывающего агента трансформируют ХЬ-1 В1ие клетки (8Гта1адепе, Ьа Ло11а СА) Е. сой и отдельные трансформанты изолируют и выращивают. Плазмидные ДНК индивидуальных трансформантов могут быть очищены и частично секвенированы, с использованием автоматического секвенсора для того, чтобы обнаружить включение вставки, кодирующей специфический связывающий агент, в нужной ориентации.

Экспрессия полинуклеотидов, кодирующих антитела к Апд-2 и их фрагменты, с использованием рекомбинантных систем, описанных выше, может привести к получению антител и их фрагментов, нуждающихся в восстановлении структуры (правильном восстановлении различных дисульфидных мостиков) для того, чтобы они были биологически активными. Типичные методы восстановления структуры антител описаны здесь в примерах и в последующем разделе.

Специфические связывающие агенты, полученные в бактериальных клетках, продуцируются в составе бактериальных нерастворимых телец включения и могут быть очищены, как описано ниже. Клетки-хозяева центрифугируют, отмывают в 0,15 М ЫаС1, 10 мМ ТЙ8, рН 8; 1 мМ ЭДТА; и обрабатывают 0,1 мг/мл лизоцима (81дта, 8ΐ. Ьошб, МО) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизат осветляют обработкой ультразвуком и клеточный дебрис осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 12000 Х д. Осадок, содержащий специфический связывающий агент, может быть ресуспендирован в 50 мМ Тп8, рН 8, и 10 мМ ЭДТА, нанесен на раствор 50%-го глицерина и центрифугирован в течение 30 мин при 6000 Х д. Осадок может быть также ресуспендирован в стандартном фосфатном буферном растворе (РВ8), свободном от ионов Мд⁺² и Са⁺². Специфический связывающий агент может быть также выделен путем фракционирования ресуспендированного осадка в денатурирующем полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8) (8атЬтоок е1 а1., зирта). Гель вымачивают в 0,4 М КС1 для визуализации белка, который вырезают из геля и элюируют под действием электрического тока в буфере для гель-электрофореза, не содержащем 8Ό8. Если О8Т белки слияния продуцируются в бактериях как растворимые белки, их центрифугируют с помощью системы очистки О8Т (О8Т Рштйсайоп Моби1е, РйаттасЧа).

Системы клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных белков хорошо известны специалистам в данной области. Штаммы клеток-хозяев могут быть выбраны на основе их способности процессировать экспрессируемый белок или обеспечивать посттрансляционные модификации белка, которые необходимы для проявления белком нужной активности. Такие модификации полипептида включают, но не ограничиваются указанными, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование и связывание с липидами. Различные клетки-хозяева, такие как СНО, НеЬа, МОСК, 293, ^У138, гибридомные клеточные линии и подобные им клетки, имеют специфические клеточные сис

- 25 010726 темы и характерные механизмы для обеспечения такой посттрансляционной модификации белка и могут быть использованы для обеспечения модификации и процессинга чужеродного белка, получаемого с помощью таких клеток.

Существует целый ряд систем селекции для выделения клеток, трансформированных с целью рекомбинантного получения белка. Такие системы селекции включают, но не ограничиваются указанными, гены Η8ν тимидинкиназы, гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы и аденин фосфорибозилтрансферазы в !к-, йдр!- или арй-клетках, соответственно. Также, антиметаболическая устойчивость может быть использована как основа селекции по ΌΗΡΚ, обеспечивающей резистентность к метотрексату; др!, обеспечивающей резистентность к мукофеноловой кислоте; пео, обеспечивающей резистентность к аминогликозиду 0418 и хлорсульфону; и йубго, обеспечивающей резистентность к гигромицину. Дополнительные гены, кодирующие продукты, по которым может быть проведена селекция, включают ген !грВ, продукт которого позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана; и ген ЫкИ, продукт которого позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркеры, обеспечивающие визуальную индикацию для идентификации трансформантов, включают антоциан, β-глюкуронидазу и ее субстрат, 0И8, и люциферазу и ее субстрат, люциферин.

Очистка и восстановление структуры (рефолдинг) специфических связывающих агентов

В определенных случаях специфические связывающие агенты, полученные с помощью методов, описанных выше, нуждаются в рефолдинге и окислении для придания им правильной третичной структуры и в создании дисульфидных мостиков для того, чтобы быть биологически активными. Рефолдинг может быть достигнут с помощью набора методов, хорошо известных специалистам в данной области. Такие методы включают, например, экспозицию растворимого полипептидного агента при рН обычно выше 7 в присутствии хаотропного агента. Выбор хоатропного агента аналогичен выбору растворителя телец включения, однако хаотропный агент применяется в меньшей концентрации. Примером хаотропного агента является гуанидин. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления также содержит восстанавливающий агент и его окисленную форму в специфической пропорции для создания определенного восстановительно-окислительного потенциала, чтобы перемешанные дисульфиды образовали цистеиновые мостики. Некоторые обычно используемые восстановительно-окислительные пары включают цистеин/цистамин, глутатион/дитио-бис-08Н, хлорид меди, дитиотреитол ΌΤΤ/дитиан ΌΤΤ, и 2-меркаптоэтанол (ЬМЕ)/ дитио- ЬМЕ. Во многих случаях для повышения эффективности рефолдинга может быть использован сорастворитель. Как правило, в качестве сорастворителей используют глицерол, полиэтиленгликоль различного молекулярного веса и аргинин.

Было бы желательно произвести очистку белковых специфических связывающих агентов и их вариантов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Методы очистки белков хорошо известны специалистам в данной области. Такие методы, например, включают грубое фракционирование полипептидных и неполипептидных фракций. После отделения полипептида специфического связывающего агента от других белков, нужный полипептид может быть дополнительно очищен с помощью хроматографии и электрофореза для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенизации). Аналитическими методами, применяемыми для получения очищенного пептида специфического связывающего агента, являются ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование. Наиболее эффективным методом очистки пептидов является жидкостная хроматография быстрого разделения белков или жидкостная хроматография высокого давления (НРЬС).

Определенные аспекты настоящего изобретения касаются очистки, и в определенных случаях, существенной очистки белка или пептида специфического связывающего агента. Термин очищенный белок или пептид специфического связывающего агента, используемый здесь, означает композицию, изолированную от других компонентов, в то время как белок или пептид специфического связывающего агента очищен до уровня, который соотносится с той степенью чистоты, в которой он существует в природе. Термин очищенный белок или пептид специфического связывающего агента также относится к белку и пептиду специфического связывающего агента, свободному от окружения, в котором он существует в природе.

В целом, термин очищенный относится к специфическому связывающему агенту, который подвергся фракционированию с удалением примесных компонентов, но который в значительной степени сохраняет свою биологическую активность. Термин по существу очищенный относится к белку или пептиду специфического связывающего агента, который составляет большую часть препарата специфического связывающего агента, а именно около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 95%.

Методы для количественной оценки уровня очистки специфического связывающего агента будут понятны специалистам в данной области из настоящего изобретения. Эти методы включают, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества специфического связывающего агента во фракции, полученной в результате электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Э8/РА0Е). Предпочтительным методом для оценки чистоты фракции специфического связывающего агента является вычисление связывающей активности фракции по сравнению со связывающей активностью первоначального экстракта, и на основе

- 26 010726 этого определяют степень очистки. которую выражают понятием кратность очистки. Выбор современных приборов. использующихся для определения связывающей активности. безусловно. зависит от методики исследования. применяемой для определения активности после очистки. и от того. обнаруживает ли экспрессируемый белок или пептид специфического связывающего агента выявляемую активность.

Различные технологии. являющиеся подходящими для очистки белка специфического связывающего агента. хорошо известны специалистам в данной области знаний. Они включают. например. преципитацию с сульфатом аммония. полиэтиленгликолем. антителами (иммунопреципитацию) и другими подобными соединениями или тепловую денатурацию с последующим центрифугированием; хроматографию. такую как аффинная хроматография (например. на Протеин-А-Сефарозе). ионообменная хроматография. гель-фильтрационная хроматография. обратнофазовая хроматография. гидроксиапатитная и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование. электрофорез в геле и комбинации любых из этих методов. Из области техники известно. что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменен. или можно пропускать определенные стадии. и при этом метод все равно останется подходящим для получения очищенного специфического связывающего агента.

Не существует такого общего требования. что специфический связывающий агент всегда должен быть получен в максимально возможной очищенной форме. В действительности. показано. что не по существу очищенные специфические связывающие агенты могут использоваться в определенных случаях. Частичная очистка может быть достигнута путем использования нескольких стадий очистки в комбинации или путем применения различных вариантов той же общей схемы очистки. Например. известно. что катионообменная колоночная хроматография. осуществленная с помощью НРЬС системы. приводит к значительному повышению кратности очистки по сравнению с хроматографией. проведенной в системе низкого давления. Методы. приводящие к низкой степени очистки. могут оказаться полезными для восстановления белкового продукта специфического связывающего агента или поддержания связывающей активности экспрессируемого белка специфического связывающего агента.

Известно. что перемещение полипептида в геле может варьировать иногда значительным образом при различных условиях осуществления δΌδ/РАбЕ [Сара1б1 е! а1.. ВюсНет Вюрйук\Рек Сотт. 76:425 (1977)]. Таким образом. можно предположить. что при различных условиях электрофореза явная молекулярная масса выявленных продуктов очищенных или частично очищенных специфических связывающих агентов будет различна.

Исследования связывания

Иммунологические исследования связывания обычно предполагают использование захватывающего агента для специфического связывания и часто иммобилизации анализируемого антигена-мишени. Захватывающий агент - это соединение. которое специфически связывается с анализируемым антигеном. В одном варианте настоящего изобретения захватывающим агентом является антитело или его фрагмент. специфически связывающий Апд-2. Такие иммунологические исследования связывания хорошо известны специалистам [см. Ака1. еб.. Мебюбк ш Се11 Вю1оду. Уо1. 37. АпДЬоб1ек ш Се11 Вю1оду. Асабетю Ргекк. 1пс.. Νον Уогк (1993)].

Иммунологические исследования связывания часто подразумевают использование маркерного агента. который просигнализирует о наличии комплекса связывания. сформированного захватывающим агентом и антигеном. Маркерным агентом может быть одна из молекул. содержащаяся в комплексе связывания; т.е. это может быть маркерный специфический связывающий агент или маркерный антиген к специфическому связывающему агенту. Альтернативно. маркерным агентом может быть третья молекула. обычно другое антитело. связывающееся с образовавшимся комплексом. Маркерным агентом может быть. например. антитело к специфическому связывающему агенту. несущее метку. Второе антитело. специфичное к комплексу связывания. может не иметь метки. но может быть связано четвертой молекулой. специфичной к тому типу антител. к которому принадлежит второе антитело. Например. второе антитело может быть модифицировано с помощью выявляемой метки. такой как биотин. которая затем может быть связана с четвертой молекулой. например меченным ферментом стрептавидином. Другие белки. способные специфично связываться с константными участками иммуноглобулина. такие. как белок А или белок С. могут также использоваться в качестве маркерных агентов. Эти связывающие белки являются нормальными структурными белками клеточной стенки бактерии стрептококка и демонстрируют сильную неиммуногенную реактогенность по отношению к константным участкам иммуноглобулинов различных видов животных [см.. в основном. Акегк!гот. 1 1ттипо1. 135:2589-2542 (1985); апб СйаиЬеп. Моб РаШо1. 10:585-591 (1997)].

Во время исследования каждая комбинация реагентов может потребовать стадии инкубации и/или отмывания. Стадия инкубации может длиться по времени от нескольких секунд до нескольких часов. предпочтительно от около 5 мин до около 24 ч. Однако время инкубации зависит от модификации способа. анализируемого антигена. объема раствора. концентрации и т. п. Обычно исследования проводят при температуре окружающей среды. хотя они могут проводиться и при различных температурах.

А. Неконкурентные исследования связывания.

Иммунологические исследования связывания могут быть неконкурентного типа. Эти исследования подразумевают прямое измерение количества захваченного антигена. Например. согласно одной пред

- 27 010726 почтительной модификации сэндвич-метода, захватывающий агент (антитело) может быть непосредственно связан с твердым субстратом, на котором он иммобилизуется. Такие иммобилизованные антитела затем связываются с антигеном (захватывают антиген) в тестируемом образце. Далее захваченный антиген связывают с меченным агентом, например, вторым антителом, соединенным с меткой. Согласно другой предпочтительной модификации сэндвич-метода второе антитело не имеет метки, но может быть связано со специфическим к нему меченным антителом того же видового происхождения. Второе антитело также может быть модифицировано с помощью выявляемого соединения, например, биотина, с которым способен связываться третий меченный агент, такой как стрептавидин. [См. Наг1о\у апб Ьапе, АпБЬоб1ек, А ЬайоШогу Мапиа1., Сй 14, Со1б Брппд НагЬог ЬаЬога1огу, ΝΥ (1988); работа приведена здесь в качестве ссылки].

B. Конкурентные исследования связывания.

Иммунологические исследования связывания могут быть конкурентного типа. Количество захваченного агента, присутствующее в образце, определяют непрямым образом путем измерения количества добавленного агента, конкурирующего с захватываемым соединением, присутствующим в образце, за связывание с захватывающим агентом. В одном предпочтительном варианте конкурентного исследования связывания, известное количество захватываемого агента, обычно меченного, добавляется к образцу и затем этот образец связывают с антителом (захватывающим агентом). Количество меченного соединения, связавшегося с антителом, обратно пропорционально концентрации тестируемого вещества в образце (См. Наг1о\\' апб Ьапе, АпйЬоб1ек, А ЬайоШогу Мапиа1., Сй 14, рр. 579-583 кирга).

В другом предпочтительном конкурентном исследовании связывания антитело иммобилизировано на твердой подложке. Количество белка, связывающегося с антителом, может быть определено как путем измерения количества белка, присутствующего в комплексе белок/антитело, так и альтернативно этому способу, путем измерения количества не связавшегося в комплекс белка. Количество белка может быть определено с помощью метки. (См. Наг1о\\' апб Ьапе, АпйЬоб1ек, А ЬаЬога1огу Мапиа1., Сй 14, кирга).

В другом предпочтительном конкурентном исследовании связывания используется ингибирование гаптеном. Так, известное количество захватываемого агента иммобилизируется на твердой подложке. Известное количество антитела добавляется к образцу, и этот образец соединяют с иммобилизируемым захватываемым агентом. Количество антитела, связавшееся с иммобилизуемым захватываемым агентом, обратно пропорционально количеству этого захватываемого агента, присутствующему в образце. Количество иммобилизованного антитела может быть определено как путем оценки непосредственно иммобилизованной фракции антитела, так и путем оценки фракции, оставшейся в растворе. Определение может быть прямым, когда само антитело связано с меткой, или непрямым, когда добавляют меченное соединение, которое специфически связывается с антителом, как описано выше.

C. Применение конкурентных исследований связывания.

Конкурентные исследования связывания могут применяться для определения перекрестной реактивности, чтобы специалист смог установить, входит ли в состав белкового или ферментного комплекса, который был выявлен с помощью заявленного специфического связывающего агента, нужный белок, а не вещество, обладающее с ним перекрестной реактивностью, и что используемое антитело действительно специфично по отношению к этому белку и не связывает других антигенов. В исследованиях такого рода антиген может быть иммобилизован на твердой подложке и к образцу добавляют смесь неизвестных белков, которые будут конкурировать с иммобилизованным белком за связывание со специфическими связывающими агентами. Способность белков конкурировать с иммобилизованным антигеном за связывание с антителами специфических связывающих агентов сравнивают со связыванием этих же белков, которые были иммобилизованы на твердой подложке, с данными антителами, для определения перекрестной реактивности смеси белков.

Ό. Другие исследования связывания.

Настоящее изобретение также относится к методам Вестерн-блоттинга для определения количества присутствующего в образце Апд-2. Технология обычно заключается в разделении белков образца с помощью электрофореза в геле на основе их молекулярного веса и в последующем переносе их на подходящую твердую подложку, такую как нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или производные нейлонового фильтра. Образец инкубируют с антителами или их фрагментами, специфически связывающими Апд-2, и выявляют полученный комплекс. Указанные антитела могут быть непосредственным образом соединены с меткой или, альтернативно, могут быть впоследствии выявлены с помощью меченных вторых антител, связывающихся с первыми.

Исследования связывания для определения Апд-2 специфических связывающих агентов, препятствующих взаимодействию Апд-2 с его рецептором, описаны ниже в примерах.

Диагностические исследования

Антитела и их фрагменты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть полезными для диагностики заболеваний и состояний, характеризующихся экспрессией Апд-2 или его субъединиц, или для исследований, применяющихся для контролирования состояния пациентов, принимающих индукторы Апд-2, его фрагменты, агонисты или ингибиторы активности Апд-2. Диагностические исследования Апд-2 включают методы, использующие специфический связывающий агент и метку

- 28 010726 для определения Апд-2 в жидких средах тела человека или в клеточных или тканевых материалах. Специфические связывающие агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться как с модификацией, так и без нее. В предпочтительном диагностическом исследовании специфические связывающие агенты метят, например, путем присоединения метки или репортерной молекулы. Большое разнообразие меток и репортерных молекул хорошо известно, некоторые из них были уже описаны здесь. В особенности, настоящее изобретение наиболее полезно для диагностики заболеваний человека.

Разнообразные методы для выявления белков Апд-2, использующие как моноклональные, так и поликлональные специфичные к ним антитела, хорошо известны специалистам. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), радиоиммунный анализ (К1А) и флуоресцентный метод разделения клеток (ГАС8). Двухсайтовое, иммунологическое исследование с помощью моноклональных антител, реагирующих с двумя неперекрывающимися эпитопами Апд-2, является предпочтительным, но может быть применено и конкурентное исследование связывания. Такие исследования описаны, например, Маббох е! а1., ί Ехр Меб. 158:1211 [1983].

Чтобы создать основу для диагностики, обычно устанавливают нормальные или стандартные уровни экспрессии человеческого Апд-2. Это может быть осуществлено путем объединения жидкостей организма или клеточных экстрактов здорового субъекта, предпочтительно, человека со специфическим связывающим агентом, например, антителом к Апд-2, в условиях, подходящих для формирования комплекса, что хорошо известно специалистам в данной области. Количество образовавшихся стандартных комплексов может быть подсчитано путем сравнения связывания специфических связывающих агентов с известным количеством белка Апд-2 как в контрольном, так и в исследуемом образце. Затем стандартные уровни, полученные при исследовании нормального образца, сравнивают с уровнями, полученными при исследовании образца, взятого из организма потенциально больного субъекта. Отклонение между стандартным и выявленным в образце уровнями Апд-2 и определяет его роль в возникновении данного заболевания.

Для диагностического использования, в определенных случаях, специфические связывающие агенты соединяют с выявляемой меткой, которой может быть любая молекула, способная генерировать, как непосредственно, так и опосредованно, регистрируемый сигнал. Например, меткой может быть радио3 14 32 35 125 изотоп, такой как Н, С, Р, 8 или I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеина изотиоцианат, родамин, люциферин, или фермент, такой как щелочная фосфатаза, βгалактозидаза, или пероксидаза хрена [Вауег е! а1., Ме!й Епх, 184: 138-163, (1990)].

Заболевания

Изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, который связывается с Апд-2 и является полезным для лечения заболеваний и патологических состояний человека. Агенты, модулирующие связывающую активность Апд-2, или другую клеточную активность, могут использоваться в комбинации с другими терапевтическими агентами для увеличения их терапевтических эффектов или снижения возможных побочных эффектов.

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к реагентам и методам, полезным для лечения заболеваний и состояний, характеризующихся нежелательной и отклоняющейся от нормального уровня активностью Апд-2 в клетках. Такие заболевания включают рак и другие гиперпролиферативные состояния, такие как гиперплазия, псориаз, контактный дерматит, иммунологические нарушения, а также бесплодие.

Изобретение также относится к способам лечения рака у животных и человека, заключающимся во введении животным эффективного количества специфического связывающего агента, который ингибирует или снижает активность Апд-2. Изобретение, кроме того, относится к способам ингибирования роста раковых клеток, включая процессы клеточной пролиферации, инвазии и метастазирования в биологических системах. Способы подразумевают использование соединений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, в качестве ингибиторов клеточного роста раковых клеток. Предпочтительно эти способы применяют для ингибирования или снижения роста раковых клеток, инвазии, метастазирования или для снижения частоты опухолевых заболеваний у животных, преимущественно млекопитающих. Способы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут применяться в исследовательских целях, например, для исследования роста раковых клеток и изучения их свойств, а также для исследования соединений, способных влиять на рост раковых клеток.

Рак, для лечения которого возможно применение методов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, встречается преимущественно у млекопитающих. К таким млекопитающим относятся человек и другие приматы, домашние животные, такие как кошки и собаки, лабораторные животные, такие как крысы, мыши и кролики, и животные, выращиваемые на фермах, такие как лошади, свиньи, овцы и крупный рогатый скот.

Опухоли или неоплазии представляют собой такую форму тканевого роста, при которой клеточное деление является неконтролируемым и прогрессирующим. В некоторых случаях такой рост может быть благоприятным, но в других он является заведомо злокачественным и может привести к гибели организма. Злокачественные опухоли или раковые опухоли отличаются от доброкачественных тем, что для них

- 29 010726 характерна агрессивная клеточная пролиферация, они могут прорастать в окружающие ткани и обладают способностью к метастазированию. Кроме того, для злокачественных опухолей характерна сходная структура и очень низкая степень клеточной дифференцировки (недифференцированные опухоли); кроме того, по внешнему виду они похожи на окружающие их ткани. Это свойство также называют аплазией.

Неоплазии, для лечения которых могут применяться способы, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также включают солидные опухоли, т. е. карциномы и саркомы. К карциномам относят злокачественные опухоли, происходящие из эпителиальных клеток, инфильтрирующие (инвазирующие) окружающие ткани и дающие метастазы. Аденокарциномы - это карциномы, происходящие из железистого эпителия или из определенной железистой структуры. Другая широкая категория включает саркомы, опухоли, происходящие из соединительной ткани или гомогенной субстанции, такой как эмбриональная соединительная ткань. Изобретение также относится к лечению опухолей, происходящих из миелоидной или лимфоидной ткани, таких как лейкозы, лимфомы и других опухолей, которые обычно не представляют собой опухолевую массу, но поражают сосудистую и лимфоцитарную системы.

К типам рака, которые подлежат лечению с помощью способов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, относятся, например, АКТГ-продуцирующая опухоль, острый лимфоцитарный лейкоз, острый нелимфоцитарный лейкоз, рак коры надпочечников, рак мочевого пузыря, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, рак прямой кишки, кожная Т-клеточная лимфома, рак эндометрия, рак пищевода, саркома Юинга, рак желчного пузыря, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, лимфома Ходжкина, саркома Капоши, рак почки, рак печени, рак легкого (мелко- и крупноклеточный), злокачественный канцероматоз брюшины, злокачественный канцероматоз плевры, меланома, мезотелиома, множественная миелома, нейробластома, глиома, неходжкинская лимфома, остеосаркома, рак яичников, рак яичников (из зародышевых клеток), рак поджелудочной железы, рак полового члена, рак простаты, ретинобластома, рак кожи, мягкотканная саркома, плоскоклеточный рак, рак ротовой полости, рак яичек, рак щитовидной железы, трофобластические неоплазмы, рак матки, рак влагалища, рак вульвы и опухоль Вильмса.

Изобретение в особенности относится к лечению различных типов экспериментально определенных раковых заболеваний. В этих иллюстративных экспериментах используют стандартные модели ш νίΐΌ и ш у|уо, известные из уровня техники. Такие эксперименты проводятся для того, чтобы определить агенты, которые могут оказаться полезными для использования в лечебном режиме ш νί\Ό. Однако очевидно, что применение способа, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, не ограничивается только лечением этих типов опухолей, но и распространяется на любые солидные опухоли, происходящие из любого органа или системы. Способ, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, наилучшим образом подходит для ингибирования роста или, по крайней мере, снижения его темпов, злокачественных опухолей, инвазия и метастазирование которых ассоциированы с экспрессией или активностью Апд-2.

Изобретение также включает применение специфического связывающего агента, такого как антитело, заявленного в соответствии с настоящим изобретением, в комбинации с противоопухолевым химиотерапевтическим агентом, которым может быть любой подходящий химиотерапевтический агент. Комбинирование специфического связывающего агента с другими подобными соединениями может служить основой для разработки химиотерапевтической схемы. Различные химиотерапевтические схемы могут быть разработаны практикующим врачом в данной области медицины и могут входить в способ, заявленный в соответствии с настоящим изобретением. Могут использоваться любые химиотерапевтические агенты, включая алкилирующие агенты, антиметаболиты, гормоны и антагонисты, радиоизотопы, а также натуральные препараты. Например, соединение, заявленное в соответствии с настоящим изобретением, может вводиться совместно с антибиотиком, таким как доксирубицин и другими аналогами антрациклина, с азотсодержащими алкалоидами растения горчицы, таким как циклофосфамид, аналогами пиримидина, такими как 5-фторурацил, цисплатин, гидроксимочевина, таксол и их природными или синтетическими аналогами, и им подобными. В качестве другого примера, в частности, в случаях смешанных опухолей, таких как аденокарцинома молочной железы, в состав которой входят гонадотропинзависимые и гонадотропин-независимые клетки, соединение, заявленное в соответствии с настоящим изобретением, может применяться совместно с лейпрорелином или гозерелином (синтетические белковые аналоги гонадотропин-рилизинг гормона). Другие антинеопластические схемы подразумевают использование соединений тетрациклинового ряда вместе с иными подходами, например, хирургией, радиационным облучением и т.д., которые называются здесь сопутствующими антинеопластическими подходами. Таким образом, заявленный в соответствии с изобретением способ может применяться совместно с подходящими методиками для снижения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

Соответственно, настоящее изобретение относится к композициям и способам, полезным для лечения различных видов злокачественных опухолей, в том числе солидных опухолей и лейкозов. К указанным заболеваниям относятся (но не ограничиваются указанными): аденокарцинома молочной железы,

- 30 010726 простаты и толстого кишечника; все формы бронхогенной карциномы легкого; миелоид; меланома; гепатома; нейробластома; папиллома; апудома; хористома; бранхиома; злокачественный карциноидный синдром; карциноидная болезнь сердца; карцинома (например, карцинома Уолкера, базальноклеточная, базальноплоскоклеточная, карцинома Брауна-Пирса, протоковая карцинома, опухоль Эрлиха, Кребс 2, карцинома меркелевских клеток, слизистая карцинома, немелкоклеточная карцинома легкого, овсяноклеточная карцинома, папиллокарцинома, фиброзная, бронхиолярная, бронхогенная, плоскоклеточная и переходно-клеточная); гистиоцитоз; лейкоз; злокачественный гистиоцитоз; болезнь Ходжкина; иммунопролиферативная мелкоклеточная карцинома легкого; неходжкинская лимфома; плазмоцитома; ретикулоэндотелиоз; меланома; хондробластома; хондрома; хондросаркома; фиброма; фибросаркома; гигантоклеточные опухоли; гистиоцитома; липома; липосаркома; мезотелиома; миксома; миксосаркома; остеома; остеосаркома; хондрома; краниофарингиома; дисгерминома; гамартома; мезенхимома; мезонефрома; миосаркома; адамантинома; цементома; одонтома; тератома; тимома; опухоль трофобласта. Кроме того, способ, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать для лечения следующих опухолей: аденома, холангиома, холестеатома, циклиндрома, цистаденокарцинома, цистаденома, опухоль, происходящая из клеток гранулезы, андробластома, гепатома, гидроаденома, опухоль, происходящая из островковых клеток, опухоль, происходящая из клеток Лейдига, папиллома, опухоль, происходящая из клеток Сертолли, опухоль, происходящая из клеток теки, лейомиома, лейомиосаркома, миобластома, миома, миосаркома, рабдомиома, рабдомиосаркома, эпендимома, ганглионеврома, глиома, медуллобластома, менингиома, невринома, нейробластома, нейроэпителиома, нейрофиброма, неврома, параганглиома, нехромаффинная параганглиома, ангиокератома, ангиолимфоидная гиперплазия с эозинофилией, склерозирующая ангиома, ангиоматоз, гломусная опухоль, гемангиоэндотелиома, гемангиома, гемангиоперицитома, гемангиосаркома, лимфангиома, лимфангиомиома, лимфангиосаркома, пинеалома, карциносаркома, хондросаркома, листовидная цистосаркома, фибросаркома, гемангиосаркома, лейкосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, миксосаркома, карцинома яичников, саркома, неоплазмы, нейрофиброматоз и цервикальная дисплазия.

К другому аспекту настоящего изобретения относится использование материалов и способов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, для профилактики и лечения любого гиперпролиферативного состояния кожи, включая псориаз и контактый дерматит или другие гиперпролиферативные заболевания. Показано, что у больных псориазом и контактным дерматитом отмечается повышенный уровень Апд-2 в очагах поражения [ОдозЫ е! а1., 1 Ιπν. Эегта!о1, 110:818-23 (1998)]. Предпочтительно специфические связывающие Апд-2 агенты в комбинации с другими фармацевтическими препаратами будут использоваться для лечения пациентов, имеющих такие клинические симптомы. Специфические связывающие агенты могут применяться совместно с любым из известных переносчиков согласно схемам введения, описанным здесь, или любым схемам, хорошо известным специалистам в данной области.

Изобретение также относится к способам лечения различных ретинопатий (включая диабетическую ретинопатию и старческую дегенерацию макулы), связанных с нежелательным ангиогенезом, а также к способам лечения нарушений/болезней женской репродуктивной системы, таких как эндометриоз, фиброид матки и других состояний, ассоциированных с дисфункциональной сосудистой пролиферацией (включая рост капилляров в эндометрии) в течение женского репродуктивного цикла.

Изобретение также относится к способам лечения состояний, связанных с патологическим ростом сосудов, таких как мозговые артериовенозные врожденные мальформации (АУМз), повреждения слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, образование язв слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, особенно у пациентов, имеющих язвенную болезнь в анамнезе, ишемия, возникшая после инсульта, различные заболевания легких, заболевания печени и возникшая в результате этого портальная гипертензия, а также портальная гипертензия непеченочного происхождения.

Также настоящее изобретение относится к способам профилактики злокачественных новообразований, заключающимся в применении соединений, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. К этим соединениям относятся специфические связывающие Апд-2 агенты.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям специфических связывающих Апд-2 агентов. Фармацевтические композиции, содержащие антитела, подробно описаны, например, в патенте США 6171586, выданному Ьат е! а1., 9 января 2001 г. Такие композиции содержат терапевтически или фармакологически эффективное количество специфического связывающего агента, такого как антитело, или его фрагмент, вариант, производное или белок слияния, как описано здесь, в комбинации с фармакологически доступным агентом. В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция содержит специфический связывающий агент, модулирующий частично или полностью только одну биологическую активность Апд-2, в комбинации с фармакологически доступным агентом. В общем, специфические связывающие агенты должны быть полностью очищены для применения у животных.

Фармацевтическая композиция может содержать ингредиенты для изменения, поддержания и сохранения на определенном уровне, например, рН, осмолярности, вязкости, чистоты, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, степени адсорбции

- 31 010726 или проникающей способности фармацевтической композиции. К подходящим ингредиентам относятся, но не ограничиваются указанными, аминокислоты (такие, как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин); противомикробные средства, антиоксиданты (такие, как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидроген-сульфит натрия); буферные составы (такие, как бораты, бикарбонаты, цитраты, фосфаты, Тг1к-НС1 и другие органические кислоты); агенты, увеличивающие объем композиции (такие, как маннит или глицин), хелатообразующие средства [такие, как этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)]; комплексообразующие агенты (такие, как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); активаторы наполнителей; моносахариды; дисахариды и другие углеводороды (такие, как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие, как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, ароматизаторы и разбавители; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры (такие, как поливинилпирролидон); полипептиды с низким молекулярным весом; солеобразующие ионы (например, натрий); консерванты (такие, как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота и перекись водорода); растворители (такие, как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие, как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (такие, как Плюроник, полиэтиленгликоль, эфир сорбита, полисорбиты такие, как полисорбит 20, полисорбит 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерол, тилоксапал); агенты, увеличивающие стабильность (такие, как сахароза или сорбит); агенты, повышающие тонус (такие, как галиды щелочных металлов (предпочтительно натрия или калия хлорид), манит, сорбит); средства доставки; наполнители и/или фармакологические адъюванты (Веттдоп'к Рйагтасеибса1 8аепсек, 18'¹' Еб1йоп, А. В. Оеппаго, еб., Маск РиЬйкЫпд Сотрапу, 1990).

Оптимальная фармацевтическая композиция будет составляться специалистом в данной области, исходя из назначенного пути введения и необходимой дозировки. См., например, ВеттдФп'к Рйагтасеи1юа1 8аепсек, кирга. Такие композиции могут влиять на физические свойства, стабильность, скорость высвобождаемого ш у|уо агента, скорость высвобождаемого ш у|уо специфического связывающего агента.

Носители, входящие в состав фармацевтической композиции, могут иметь как водную, так и неводную природу. Например, подходящим носителем может быть вода для инъекций, физиологический раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, по возможности совместно с другими материалами, обычно используемыми для парентерального введения. Нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином, также являются примерами таких носителей. Другие фармацевтические композиции включают Тпк буфер с рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН примерно 4,0-5,5, которые могут также содержать сорбит или его подходящий аналог. Согласно одному варианту заявленного изобретения композиции, содержащие специфические связывающие агенты, могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить их длительное хранение, путем смешивания выбранной композиции, имеющей определенную степень очистки, и подходящего агента (Веттдоп'к Рйагтасеийса1 8с1епсек кирга), в лиофилизированной форме или в форме водного раствора. Кроме того, продукт специфического связывающего агента может быть получен в виде лиофилизата при использовании подходящего наполнителя, такого как сахароза.

Фармацевтические композиции могут вводиться парентерально. Альтернативно, существуют фармацевтические композиции для ингаляционного и энтерального введения, например, для орального, ушного, глазного, ректального или вагинального применения. Приготовление такого рода фармакологически доступных композиций находится в компетенции специалистов в данной области.

Дополнительные ингредиенты должны присутствовать в концентрации, которая является приемлемой для места введения препарата. Например, буферные растворы используются для поддержания композиции в пределах физиологичного или слегка пониженного рН, обычно в пределах от 5 до 8.

Когда требуется парентеральное введение, фармацевтические композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, изготавливают в форме апирогенного водного раствора, доступного для парентерального введения, содержащего необходимый специфический связывающий агент в комплексе с фармакологически доступным носителем. Наиболее подходящим носителем для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода для инъекций, в которой специфический связывающий агент представлен как стерильный, изотонический, должным образом законсервированный раствор. Также, к другим препаратам на основе специфических связывающих агентов можно отнести составы, включающие необходимое активное начало (специфический связывающий агент) и дополнительный ингредиент, например, такой, как инъецируемые микросферы, биорастворимые частицы, полимерные соединения (полимер молочной кислоты, полимер гликолевой кислоты), бусины, или липосомы, которые обеспечивают контролируемое или отложенное высвобождение активного начала, которое доставляется к тканям из депо, образовавшегося в месте инъекции. Также, в таких композициях может быть использована гиалуроновая кислота, способная увеличивать продолжительность непрерывной циркуляции препарата. К другим способам доставки необходимого препарата относится имплантация специальных приборов, доставляющих препарат к тканям.

Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтические композиции для парен

- 32 010726 терального применения могут быть приготовлены в водной форме, предпочтительно на основе забуференных физиологических растворов, таких, как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие, как натриевая карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии, содержащие активное соединение, могут быть приготовлены и как подходящие масляные суспензии для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают масла, такие, как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие, как этилолеат, триглицериды, или липосомы. Также для доставки препарата могут использоваться нелипидные поликатионные аминополимеры. Суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или какие-либо агенты для повышения растворимости активных соединений и позволяющие приготовить растворы более высокой концентрации.

Согласно другому варианту настоящего изобретения могут разрабатываться фармакологические композиции для ингаляционного введения. Например, специфический связывающий агент может быть представлен в виде сухого порошка для ингаляций.

Растворы полипептидов или нуклеиновых кислот для ингаляций могут быть объединены с пропеллентом для аэрозольной доставки. Согласно еще одному подходу растворы могут быть применены с помощью небулайзеров. Способы ингаляционного введения также описаны в РСТ заявке Ыо. РСТ/и894/001875, которая раскрывает способы доставки химически модифицированных белков в легкие.

Также рассматривается возможность орального введения определенных фармацевтических композиций. Согласно одному варианту настоящего изобретения молекулы специфических связывающих агентов, которые используются в оральной форме, могут быть применены совместно с носителями, которые обычно включаются в состав твердых лекарственных форм, таких, как капсулы и таблетки, при их изготовлении, а также без них. Например, капсула может быть приготовлена таким образом, чтобы обеспечивать высвобождение активного начала в нужном отделе желудочно-кишечного тракта с обеспечением максимальной биодоступности препарата и минимальной пресистемной деградации препарата. Для улучшения абсорбции молекулы специфического связывающего агента могут быть использованы дополнительные агенты. Также могут использоваться разбавители, ароматизаторы, воски с низкой точкой плавления, овощные масла, любриканты, суспендирующие агенты, таблетированные дезинтегрирующие агенты и склеивающие вещества.

Фармацевтические композиции для орального введения также могут содержать фармакологическидоступные носители, хорошо известные специалистам, в дозировках, подходящих для орального применения. Такие носители делают возможным изготовление фармацевтических композиций в форме таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и им подобных, для того, чтобы пациент имел возможность принимать их с пищей.

Фармацевтические препараты для приема внутрь могут быть получены путем комбинирования активного начала с твердым наполнителем и обработки полученной гранулярной смеси (обычно после измельчения) для получения таблеток или драже. При необходимости могут быть добавлены дополнительные вещества. К подходящим наполнителям относятся углеводные или белковые соединения, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, манит и сорбит; крахмал зерновых растений, таких как пшеница, рис; крахмал картофеля или других растений; целлюлоза, такая как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натриевая карбоксиметилцеллюлоза; камеди, такие как гуммиарабик и трагакан; и белки, такие как желатин или коллаген. При необходимости могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как перекрестно-связанный поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соли, такие как альгинат натрия.

Ядра драже покрываются оболочкой, состоящей, например, из концентрированного раствора сахара, который также может включать гуммиарабик, тальк, полвинилпирролидон, углеводный гель, полиэтиленгликолъ и/или диоксид титана, глазурь-образующие агенты и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Для идентификации продукта или для оценки количества активного вещества, т. е. для определения его дозировки, к оболочкам таблеток и драже добавляют красители или пигменты.

К фармацевтическим препаратам, которые можно принимать внутрь, также относятся пуш-фит (рикЬ-ίϊΐ) капсулы, приготовленные на основе желатина, а также мягкие, герметичные капсулы на основе желатина с оболочкой из глицерола или сорбита. Пуш-фит капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями и склеивающими веществами, такими как лактоза или крахмал, любрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, в смеси со стабилизаторами. В мягких капсулах активное соединение может быть растворено или суспендировано в подходящем жидком веществе, таком как масло, жидкий полиэтиленгликоль, совместно со стабилизаторами или без них.

Другой вариант фармацевтической композиции включает эффективное количество специфического связывающего агента в смеси с нетоксичным наполнителем, подходящим для формирования таблеток. Путем растворения таблетки в стерильной воде или в любом другом подходящем растворителе может быть приготовлен раствор, содержащий единичную дозу препарата. К подходящим наполнителям относятся, но не ограничиваются указанными, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат

- 33 010726 или бикарбонат натрия, лактоза, фосфат кальция; или склеивающие агенты, такие, как крахмал, желатин или гуммиарабик; или любриканты, такие, как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Дополнительные фармацевтические композиции очевидны специалистам в данной области, включая композиции, содержащие молекулы специфического связывающего агента с отложенным или контролируемым высвобождением. Технологии изготовления различных вариантов композиций с отложенным или контролируемым высвобождением препарата, таких как липосомные носители, биорастворимые микрочастицы или пористые бусины и депо-инъекции, также хорошо известны специалистам в данной области. См., например, заявку РСТ/Ц893/00829, описывающую контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц, используемых для доставки фармакологического препарата. К дополнительным примерам лекарственных форм с отложенным высвобождением препарата следует отнести полупроницаемые полимерные матрицы, имеющие определенную форму, например, форму пленки или микрокапсулы. К матрицам, обеспечивающим отложенное высвобождение, относятся полиэфиры, гидрогели, полилактиды (И.8. 3773919, ЕР 58, 481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамат [81йтап е! а1., Вюро1утег§, 22:547-556 (1983)], поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) [Ьаидег е! а1., 1 Вютей Ма!ег Ве8,15:167-227, (1981)] и [Ьаидег е! а1., Скет Теск, 12:98-105(1982)], этиленвинилацетат (Ьаидег е! а1., кирга) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133, 988). К композициям с отложенным высвобождением препарата также относятся липосомы, которые могут быть приготовлены любым способом, известным специалистам в данной области. См., например, Ерр^еш е! а1., Ргос ЫаИ. Асай 8с1 (И8А), 82:3688-3692 (1985); ЕР 36676; ЕР 88046; ЕР 143949.

Фармацевтические композиции для применения ίη νίνο должны быть стерильны. Это может быть достигнуто с помощью фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Когда композиция существует в лиофилизированной форме, стерилизация с использованием этого метода может быть проведена как до, так и после лиофилизации и восстановления композиции. В дополнение, композиции для парентерального введения обычно заключают в контейнер, имеющий стерильное отверстие, например, внутривенный растворимый баллон или ампулу, имеющую пробку, которая проницаема для подкожной инъекционной иглы.

После того как фармацевтическая композиция приготовлена, она хранится в стерильной ампуле в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие композиции могут храниться в виде готовых к применению форм или в виде форм (например, лиофилизированных), требующих восстановления перед введением.

Настоящее изобретение также относится к наборам для получения лекарственных форм, содержащих дозу для однократного введения. Каждый набор может состоять из первого контейнера, содержащего сухой белок, и второго контейнера, содержащего водный состав. Также в объем изобретения входят наборы, содержащие одноразовые или многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидким веществом и лиофилизатом).

Эффективное количество фармацевтической композиции, применяемое для лечения, будет зависеть от конкретной терапевтической ситуации и цели. Специалист в данной области может понять, что подходящие дозировки для лечения зависят, в частности, от природы доставляемого вещества, задачи, которая решается с помощью специфических связывающих агентов, способа введения и размеров (вес, общая поверхность тела, размер органа) и состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. Кроме того, клиницист может оттитровывать дозу и изменять путь введения для достижения максимального терапевтического эффекта. Обычно дозировка варьирует от примерно 0,1 до приблизительно 100 мг/кг, в зависимости от факторов, указанных выше. Согласно другим подходам дозировка может варьировать от 0,1 до примерно 100 мг/кг, или от 1 до 100 мг/кг, или от 5 до 100 мг/кг.

Для любого соединения терапевтическая доза может быть установлена с помощью исследований, проводимых как на культуре клеток, так и на экспериментальных животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки и свиньи. Экспериментальные животные также используются для определения подходящих концентраций препарата и путей его введения. Полученная таким образом информация затем оказывается полезной для определения терапевтических доз и путей ведения препарата у людей.

Точную дозировку препарата определяют исходя из ситуации, требующей его применения. Точную дозу и путь введения необходимо устанавливать для того, чтобы обеспечить достаточный уровень активного соединения в крови и достичь необходимого терапевтического эффекта. К факторам, которые необходимо учитывать при подборе дозы, относятся серьезность и род заболевания, общее состояние здоровья пациента, его возраст, вес, а также время и частота введения препарата, сочетание этого препарата с другими лекарственными средствами, возможные аллергические реакции и устойчивость заболевания к терапии. Длительно действующие фармацевтические композиции могут вводиться каждые 3-4 дня, каждую неделю или раз в две недели в зависимости от времени полужизни данного препарата.

Частота введения фармацевтической композиции зависит от фармакокинетических характеристик молекулы специфического связывающего агента, используемой в данной рецептуре. Обычно, фармацевтическую композицию вводят столько раз, сколько необходимо для достижения средней терапевтической дозы и, соответственно, желаемого терапевтического эффекта. Возможно использование лекарственных форм как для однократного введения, так и для многократного введения (в тех же или различных

- 34 010726 концентрациях), а также для непрерывной инфузии. На протяжении курса терапии доза препарата постоянно корректируется. Подходящая для пациента доза подбирается исходя из оценки данных, полученных после применения стандартных дозировок.

Выбор пути введения коррелирует с существующими технологиями, т.е. препарат может вводиться орально, внутривенно, интраперитонеально, интрацеребрально (в вещество головного мозга), интрацеребровентрикулярно (в вещество и желудочки головного мозга), внутримышечно, интраокулярно (в глазное яблоко), внутриартериально, интрапортально (в воротную вену), непосредственно в поврежденные ткани и органы, интрамедуллярно (в спинной мозг), интратрахеально, интравентрикулярно (в желудочки сердца), внутрикожно, подкожно, интраназально, энтерально, местно, сублингвально (под язык), в уретру, вагинально, ректально или с помощью систем, непрерывно выделяющих препарат или с помощью имплантационных технологий. При необходимости фармацевтическая композиция может вводиться болюсно или непрерывно с помощью инфузии, а также с путем применения имплантационных технологий.

Как альтернатива или дополнение к указанным выше способам, возможно применение фармацевтических композиций местно с помощью имплантации в ткани мембраны, губки или иного подходящего материала, на котором предварительно было адсорбировано, или в которое было инкапсулировано активное вещество. При использовании имплантационных технологий специальный носитель имплантируется в любую подходящую ткань или орган, а поступление активного вещества происходит путем диффузии, рассчитанного по времени болюсного выброса или постоянного высвобождения препарата.

В определенных случаях необходимо так называемое применение композиции ех у1уо. В таком случае, клетки, ткани или органы, удаленные из организма пациента обрабатывают лекарственным препаратом, после чего эти клетки, ткани и/или органы имплантируют пациенту.

В некоторых случаях, полипептид специфического связывающего агента может быть введен в организм с помощью имплантации клеток, которые были генетически модифицированы с помощью технологий, описанных здесь для экспрессии и выделения полипептидов. Это могут быть клетки животного или человека, и могут быть аутологичными, гетерологичными и ксеногенными. По выбору, клетки могут быть бессмертными. Для снижения возможного иммунного ответа, а также для предотвращения инфильтрации окружающих тканей клетки инкапсулируют. Материалы для инкапсуляции обычно биосовместимы с организмом человека и представляют собой полупроницаемые полимерные мембраны или ограждения, которые обеспечивают высвобождение белкового продукта (продуктов), но препятствуют разрушению клеток иммунной системой пациента или другими факторами окружающих тканей.

Комбинированная терапия

Для лечения патологических состояний, ассоциированных с Апд-2, специфические связывающие агенты могут применяться в комбинации с другими методами лечения. К таким методам относятся, например, облучение, химиотерапия, а также другие методы, применяемые для замедления опухолевого роста.

Для химиотерапии используют следующие противоопухолевые препараты, например: алкилирующие агенты, включающие азотсодержащие алкалоиды растения горчицы, такие, как мехлорэтамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; производные нитрозомочевины, такие, как кармустин (ВСИи), ломустин (ί,'ί,'Νυ) и семустин (метил-ССNυ); этиленимины/митилмеламины такие, как триэтилмеламин (ТЕМ), триэтилен, тиофосфамид (тиотепа), гексаметилеламин (НММ, альтретамин); алкилированные сульфонаты, такие, как бусульфан; триазины, такие, как дакарбазин (ЭТ1С); антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие, как метотрексат и триметрексат, пиримидиновые аналоги, такие, как 5-фторурацил, фтордезоксиуридин, гемцитабин, цитозиновый арабинозид (АгаС, циторабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин, пуриновые аналоги, такие, как 6-меркаптопурин, 6тиогуанин, азатиоприн, 2'-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (ЕНNА), флударабина фосфат и 2-хлородиоксиаденозин (кладрибин, 2-СбА); природные средства, включая антимитотические средства, такие, как паклитаксел, алкалоиды растения Барвинок розовый, включая винбластин (УЪВ), винкристин и винорельбин, таксотер, эстрамустин, эстрамустина фосфат; подофиллины, такие, как этопозид и тенипозид; антибиотики, такие, как актиномицин Ό, дауномицин (рибидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицин, пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие, как Ь-аспарагиназа; средства, модулирующие иммунный ответ, такие, как интерферон-альфа, 1Ь-2, С-С8Р, СМ-С8Р; другие разнообразные агенты, такие, как комплексные препараты платины, включая цисплатин и карбоплатин, антрацендионы, такие, как митоксантрон, замещенная мочевина, например, гидроксимочевина, производные метилгидразина, такие, как Ν-метилгидразин (М1Н) и прокарбазин, ингибиторы синтеза гормонов надпочечников, такие, как митотан (о,р'-ЭПП) и аминоглутетимид; гормоны и их аналоги, включая кортикостероиды, такие, как преднизолон и его эквиваленты и дексаметазон; прогестины, такие, как гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эстрогены, такие, как диэтилстилбестрол и аналоги этинилэстрадиола; препараты с антиэстрогенной активностью, такие, как тамоксифен; андрогены, включая тестостерона пропионат и аналоги флуоксиместерона; препараты с антиандрогенной активностью, такие, как флутамид; аналоги гонадотропин-рилизинг гормона и лейпролиды; и антиандрогенные препараты нестероидной

- 35 010726 природы, такие как флутамид.

Для комбинированной терапии с использованием факторов роста применяют цитокины, лимфокины, факторы роста или другие гемопоэтические факторы, такие, как М-С8Е, СМ-С8Е, ΤΝΕ, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-

3, Ш-4, Ш-5, 1Ь-6, Ш-7, Ш-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18, ΙΕΝ, ΤΝΕ0, ΤΝΕ1, ΤΝΕ2, С-С8Е, Мед-С8Е, СМ-С8Е, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Другие фармацевтические композиции могут содержать известные ангиопоэтины, например, Апд-1,-2,-4,А, и/или Апд-подобный пептид человека, и/или фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ). К факторам роста относятся: ангиогенин, белок морфогенеза костей 1, белок морфогенеза костей 2, белок морфогенеза костей 3, белок морфогенеза костей 4, белок морфогенеза костей 5, белок морфогенеза костей 6, белок морфогенеза костей 7, белок морфогенеза костей 8, белок морфогенеза костей 9, белок морфогенеза костей 10, белок морфогенеза костей 11, белок морфогенеза костей 12, белок морфогенеза костей 13, белок морфогенеза костей 14, белок морфогенеза костей 15, белок 1А-рецептора морфогенеза костей, белок ΙΒрецептора морфогенеза костей, нейротрофический фактор мозгового происхождения, цилиарный нейротрофический фактор, рецепторный цилиарный нейротрофический фактор, индуцированный цитокином хемотактический фактор нейтрофилов 1, индуцированный цитокином хемотактический фактор нейтрофилов 2, индуцированный цитокином хемотактический фактор нейтрофилов 3, эндотелиальный фактор роста, эндотелии-1, эпидермальный фактор роста, нейтрофильный аттрактант эпителиального происхождения, фактор роста фибробластов 4, фактор роста фибробластов 5, фактор роста фибробластов 6, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 8, фактор роста фибробластов 8Ь, фактор роста фибробластов 8с, фактор роста фибробластов 9, фактор роста фибробластов 10, кислый фактор роста фибробластов, основный фактор роста фибробластов, нейротрофический фактор рецептора 1, происходящий из глиальной клеточной линии, нейротрофический фактор рецептора-2, происходящий из глиальной клеточной линии, белок, имеющий отношение к росту, белок, имеющий отношение к росту 2, белок, имеющий отношение к росту 3, связывающий гепарин эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецепторный фактор роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста Ι, рецепторный инсулиноподобный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста ΙΙ, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, фактор роста кератиноцитов, фактор ингибирующий лейкоз, рецепторный фактор ингибирующий лейкоз 1, фактор роста нервов, рецепторный фактор роста нервов, нейротропин-3, нейротропин-

4, плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста 2, ростовой фактор эндотелиальных клеток тромбоцитарного происхождения, фактор роста тромбоцитарного происхождения, цепь А фактора роста тромбоцитарного происхождения, АА фактор роста тромбоцитарного происхождения, АВ фактор роста тромбоцитарного происхождения, В фактор роста тромбоцитарного происхождения, ВВ фактор роста тромбоцитарного происхождения, ростовой фактор рецептора 1 тромбоцитарного происхождения, ростовой фактор рецептора 2 тромбоцитарного происхождения, фактор стимулирующий рост пре-В клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор роста 1, трансформирующий фактор роста 2, трансформирующий фактор роста 3, трансформирующий фактор роста 1.2, трансформирующий фактор роста 4, трансформирующий фактор роста 5, латентный трансформирующий фактор роста 1, белок, связывающий трансформирующий фактор роста Ι, белок, связывающий трансформирующий фактор роста II, белок, связывающий трансформирующий фактор роста-ΙΙΙ, активатор рецептора плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов и химерные белки и их биологически и иммунологически активные фрагменты.

Иммунотерапевтические средства

Иммунотерапия основывается на применении иммуноэффекторных клеток и молекул для атаки и разрушения раковых клеток. Иммунными эффекторами могут быть, например, антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, которые распознают какой-либо маркер на поверхности клетки-мишени. Антитела могут сами по себе являться действующим началом терапии или привлекать другие клетки, непосредственно осуществляющие гибель раковых клеток. Возможно соединение антител с лекарственными средствами или токсинами (химиотерапевтическими препаратами, радионуклидами, А цепью рицина, токсином холерного вибриона, токсином бактерии коклюша и т.д.), и полученное соединение будет выступать в роли атакующего агента.

В соответствии с настоящим изобретением мутантные формы Апд-2 могут являться мишенями для иммунотерапии с помощью антител и конъюгатов антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Особо следует отметить, что композиции АТ могут быть использованы в комбинированном терапевтическом подходе совместно с другими видами анти-Апд-2-терапии.

Доказано, что пассивная иммунотерапия является особенно эффективной для лечения целого ряда раковых заболеваний. См., например, \¥О 98/39027.

Нижеследующие примеры приведены здесь в качестве иллюстраций и ни в коем случае не должны рассматриваться как ограничение сущности изобретения.

Пример 1. Экспрессия Апд-2 в нормальных и патологических тканях.

Экспрессия Апд-2 в нормальных и патологических тканях была изучена с помощью гибридизации ίπ 81!и. Фрагменты последовательностей Апд-2 человека (Регистрационный номер в Генбанке: АЕ004327, нуклеотиды 1274-1726) и мыши (Регистрационный номер в Генбанке: АЕ0044326, нуклеотиды 1135

- 36 010726

1588), были амплифицированы на основе кДНК, выделенной из легких эмбрионов человека и мыши, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) при использовании обратной транскриптазы, клонированы в р0ЕМ-Т плазмиде и вирифицированы секвенированием. ³³Р-меченные пробы антисмысловой РНК были транскрибированы с линеализированных плазмидных матриц с помощью ³³Р-ИТР и РНКполимеразы. Из блоков фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей были получены срезы толщиной 5 мкм, которые затем поместили на предметные стекла. До гибридизации ш 81!и ткань пермеабилизируют 0,2М НС1, обрабатывают протеинкиназой К и ацетилируют с помощью триэтаноламина или уксусного ангидрида. Срезу гибридизируют с радиоактивно-меченными пробами в течение ночи при температуре 55°С, затем расщепляют РНКазой и отмывают в условиях высокой строгости около 0,1Х 88С при температуре 55°С. Срезы помещают в эмульсию Кобак ЭТВ2, экспонируют при температуре 4°С в течение 2-3 недель и окрашивают. Срезы анализируют в темном поле и при стандартном освещении для оценки морфологии ткани и выявления сигнала гибридизации.

Результаты исследования демонстрируют, что у здорового человека экспрессия Апд-2 ограничивается несколькими органами, имеющими ангиогенную васкуляризацию, а именно яичник, плацента и матка. Не обнаруживается экспрессия Апд-2 в здоровых тканях человеческого сердца, головного мозга, почки, печени, легкого, поджелудочной железы, селезенки, мышц, миндалин, тимуса, червеобразного отростка, лимфатических узлов, желчного пузыря, предстательной железы и яичка. У 5-недельных мышей (но не у взрослых людей или обезьян) обнаружена выраженная экспрессия Апд-2 в νа8а гес!а. Для того чтобы определить, является ли эта экспрессия остаточной после эмбрионального развития, этот эксперимент был повторен на почках, взятых у мышей, возраст которых варьирует до одного года, при использовании пробы на основе Апд-2 мыши в условиях, описанных выше. Было выявлено снижение экспрессии Апд-2 в течение постнатального развития, но при этом она все еще сохранялась у мышей, возрастом 1 год.

Экспрессия Апд-2 также была выявлена практически во всех типах опухолей, включая опухоли, наиболее часто встречающиеся у человека, такие как карцинома толстого кишечника (5 случаев), карцинома молочной железы (10 случаев), карцинома легкого (8 случаев), глиобластома (1 случай), метастазирующие опухоли человека, такие как карцинома молочной железы (2 случая), карцинома легкого (2 случая) и карцинома яичников (2 случая), которые метастазируют в головной мозг; а также в опухолях, смоделированных на грызунах, таких как С6 (глиома крыс), НТ29 (карцинома толстого кишечника человека), Со1о-205 (карцинома толстой кишки человека), НСТ116 (карцинома толстой кишки человека), А431 (эпидермоидная карцинома человека), А673 (рабдомиосаркома человека), НТ1080 (фибросаркома человека), РС-3 (карцинома простаты человека), В16Р10 (меланома мышей), Ме!йА (саркома мышей) и метастазы легочной саркомы Льюиса. Экспрессия Апд-2 также была определена в новообразованных сосудах, прорастающих Матригелеву складку в ответ на νΕ0Ρ, а также у мышей с гипоксией, являющихся моделями преждевременного развития ретинопатии.

Пример 2. Получение рекомбинантного тАпд-2 белка и поликлональной анти-Апд-2 сыворотки кролика.

Полноразмерная, меченная гистидином мышиная кДНК, кодирующая Апд-2 была получена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (С1оп!есй Абνапίаде РСР Кй, Са!.# К1905-01) на основе библиотеки кДНК (Ма^аΐйоп-Κеабу-с^NА, Са!.# 7459-1, С1опе!есй, 1пс.) 15-дневного эмбриона мыши с использованием ПЦР-праймеров для полноразмерного Апд-2 человека. Полученный ПЦР продукт был лигирован в вектор экспресии, содержащий промотер СМV, и полученная плазмида была трансфецирована в НТ 1080 клетки фибросаркомы человека (полученных из АТСС) с помощью Ρυ0ΕΝΕ6 Трансфекционного Реагента (Росйе, Са!. #1814443). Устойчивые клоны были изолированы с помощью 0418 селекции.

Рекомбинантный полипептид тАпд-2 был очищен от кондиционированной среды (С.М.) клеток. Кондиционированная среда (СМ.), содержащая тАпд-2-Н1к, была очищена с помощью двухступенчатой хроматографии. Вкратце, кондиционированная среда была оттитрована до рН 8,9 путем добавления Тпк буфера с рН 9,5 до конечной концентрации примерно 20 мМ. Дополнительно, к среде были добавлены детергенты СНАР8 до конечной концентрации 5 мМ. СМ. затем была нанесена непосредственно на анионно-обменную колонку с Ц-сефарозой ££ (Рйатташа). Затем колонку отмыли с помощью примерно 10 мМ Тпк рН 8,0, содержащего около 50 мМ №С1. Рекомбинантный тАпд-2-Н1к был элюирован в одну стадию, с использованием 10 мМ Тпк рН 8,0, содержащего примерно 350 мМ №С1 и около 5 мМ СНАР8.

К элюату, полученному с Ц-сефарозной колонки, добавили примерно 4 мкМ имидазола и наслоили его на иммобилизованную металлом аффинную колонку (№-№ТА 8ирегПо\\· Ю1адеп|). Связанный белок был элюирован с помощью РВ8, содержащего примерно 5 мМ СНАР8 и примерно 100мМ имидазола. Затем элюат довели до концентрации приблизительно 1,0 мг/мл, с последующим диализом против РВ8. Степень очистки тАпд-2-Н1к составила 90%, как было определено с помощью 8И8-РА0Е при окрашивании по Кумасси.

Кролики были иммунизированы введением около 0,2 мг тАпд-2 для получения антител. Кроликам ввели около 1 мл Нип!ег'8 ТйетМах® (81дта) и тАпд-2 в соотношении 1:1. Четыре недели спустя кролики получили повторную инъекцию или бустер; еще через две недели они получили еще одну бустерную

- 37 010726 инъекцию, и на седьмой неделе сыворотка была выделена и был определен титр антител к тАпд-2. Если титр сыворотки был высокий, то у кроликов забирали 50 мл крови каждую неделю в течение шести последующих недель. Однако, если титр сыворотки был низкий, то кролики получали дополнительную бустерную инъекцию, после чего у них забирали 50 мл крови каждую неделю в течение шести последующих недель, начиная на 9 неделе. После шести заборов крови кроликам давали отдохнуть в течение шести недель. Если требовалось больше сыворотки, кроликов бустировали снова через месяц после последнего забора крови.

С помощью нейтрализующей ЕЬ18А (описанной ниже) поликлональная сыворотка кролика, содержащая антитела к Апд-2, взятая у двух кроликов 5254 и 5255, исследовалась на способность нейтрализовывать Апд-2: Т1е-2 взаимодействие.

Пример 3. Молекулярные исследования для оценки антител к Апд-2.

Молекулярные исследования (Аффинная ЕБ18А, Нейтрализующая ЕБ18А и В1Асоге) были разработаны для исследования антител, связывающих Апд-2 и родственные ему белки, и для исследования влияния этих антител на Апд-2:Т1е-2 взаимодействие. Эти исследования, проведенные ίη У1!го и в клетках, описаны ниже.

A. Аффинный твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А).

Для первоначального скринирования антител к Апд-2 используют очищенный Апд-2 человека (В и Ό Системы, 1пс; номер каталога 623-ΛΝ; Апд-2 представлен в виде смеси двух усеченных вариантов) и Апд-2 полипептид мыши (приготовленный, как описано выше). Для исследования связывания получают Апд-2 человека из кондиционированной среды 293Т клеток человека, трансфецированных полноразмерной ДНК, кодирующей Апд-2 человека и культивированных в бессывороточной среде ОМЕМ, содержащей альбумин сыворотки быка (В8А) примерно 50 мкг/мл.

При использовании микропланшет для титрования, в каждую лунку добавили Апд-2 из расчета 100 микролитров на одну лунку, планшеты инкубировали в течение 2 ч, после чего планшеты четыре раза отмыли с помощью фосфатного буферного раствора (РВ8), содержащего примерно 0,1% Т\уееп-20. Затем лунки блокировали с использованием приблизительно 5% В8А в РВ8 из расчета около 250 мкл на лунку, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации избыток блокирующего раствора удалили, и в каждую лунку добавили около 100 мкл тестируемых антител к Апд-2 в серийных разведениях, начиная с концентрации около 40 нМ с последующим 4-х кратным разведением в РВ8, содержащим 0,1% Тетееп-20. Отмывание повторили несколько раз, после чего в каждую лунку добавили антитела козы к 1дС(Ес)-НВР (Р1егсе Сйет1са1 Со., каталог # 31416) человека, предварительно разведенные 1:5000 в РВ8, содержащем 1% В8А (сывороточный альбумин быка), из расчета 100 мкл на одну лунку. Планшеты инкубировали приблизительно 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты пять раз отмыли в РВ8, содержащем около 0,1% Тетееп-20, после чего в каждую лунку добавили ТМВсубстрат (Жидкая Субстратная Система 3,3', 5,5'-Тетраметилбензидина; 81дта сйетка1 Сотрапу, 8!. Ьошк, МО, номер каталога Т8665) из расчета 100 мкл на лунку, после чего планшеты инкубируют около 5-15 мин пока не появится голубое окрашивавие. Затем исследовали поглощение в спектрофотометре при длине волны 370 нм.

B. Нейтрализационный твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А).

Микропланшеты, с которыми были связаны полипептиды Апд-2 человека, были приготовлены, как описано выше для Аффинной ЕЬ18А. Были приготовлены серийные разведения антител к Апд-2, как описано выше для Аффинной ЕЫ8А, в растворе РВ8, содержащем около 1% В8А и около 1нМ Т1е2 (приготовленного как Т1е-2-Ес молекула, в которой порция Т1е2 содержит только растворимую внеклеточную часть молекулы; В и Ό Системы, номер каталога 313-Т1). После добавления около 100 мкл раствора антитело/Т1е2 в каждую лунку, планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, а затем отмыли пять раз в РВ8, содержащем примерно 0,1% Тетееп-2. После отмывания в каждую лунку добавили антитела к Т1е-2 из расчета 100 мкл на лунку до конечной концентрации примерно 1 мкг/мл, и планшеты инкубировали примерно в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем, в каждую лунку добавили антитела козы к 1дС-НВР (Р1егсе Сйет1са1 СО., каталог # 31432) мыши в разведении 1:10,000 в РВ8, содержащем примерно 1% В8А, из расчета 100 мкл на лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего их отмыли 5 раз в РВ8, содержащем около 1% Тетееп-20. Затем в каждую лунку добавили ТМВ-субстрат (описан выше) из расчета 100 мкл на лунку и подождали пока появится окрашивание. Затем исследовали поглощение в спектрофотометре при длине волны 370 нм.

C. Аффинный В1Асоге.

Аффинный анализ каждого тестируемого антитела к Апд-2 проводится с помощью системы В1Асоге® 2000 (В1асоге, 1пс., Р1кса1а^ау, Νί) с использованием РВ8 и 0,05% сурфактанта Р20 (В1Асоге, 1пс.) в качестве буфера для разгона. Рекомбинантный С белок (ВерНдеп, №ебйат, МА) был иммобилизован на сенсорном чипе СМ5, который соответствует категории, служащей для проведения исследования, посредством первичных аминогрупп при использовании Набора Связывания Аминов (В1Асоге, 1пс.) в соответствии с инструкцией производителя.

Исследования связывания производились путем соединения около 100 Ви каждого тестируемого

- 38 010726 антитела к Αη§-2 с иммобилизованным С белком, после чего различные концентрации (0-100 нМ) 1ιιιΑη§-2 или ιηΑη§-2 помещали на связывающую антитело поверхность со скоростью потока около 50 мкл/мин в течение 3 мин. Кинетические показатели связывающей способности антител, включая к_а(константа скорости ассоциации), к_б (константа скорости диссоциации) и К_с (константа равновесия диссоциации) определяли при использовании компьютерной программы 3.1 βΙΑ-оценки (Высоте, 1пс.). Низкая константа равновесия диссоциации означает высокую аффинность антител к Αη§-2.

Пример 4. Получение полноразмерных антител к Αη§-2 человека с помощью фагово-дисплейной методики.

Полноразмерные антитела к Αη§-2 человека были получены с помощью Тагде! Циек! РЬаде О1кр1ау ЕаЬ 11Ьгагу (Тагде! Циек!, 1пс.) против Αη§-2 полипептида человека (Κ и Ό 8ук!етк 1пс., каталожный номер 623 - ΑΝ) согласно методике, изложенной ниже.

Αη§-2 человека был иммобилизован на поверхности полистироловых магнитных бусин двумя способами: прямым покрытием бус Αη§-2 в концентрации 50 мкг/мл при температуре 4°С в течение ночи; непрямым захватом Αη§-2 антителами козы к Αη§-2 в концентрации 50 мкг/мл при температуре 4°С в течение ночи. Поверхность бус блокировали 2% молоком в РВ8 (МРВ8). Фаговую библиотеку Еа.Ь человека предварительно отбирали для удаления фаговых клонов, взаимодействующих с непокрытыми магнитными бусами или с антителами козы к Αη§-2. Затем, покрытые Αη§-2 магнитные бусы инкубировали с фаговой библиотекой при комнатной температуре в течение 1,5 ч. После стадии связывания фагов, поверхность бус 6 раз отмывали МРВ8, содержащим около 0,1% Т^ееп-2, затем еще 6 раз РВ8, содержащим около 0,1% Т^ееп-2, и затем 2 раза РВ8. Связавшиеся фаги сначала элюировали примерно 100 мкг/мл Т1е-2-Ес человека (Κ ηηά Ό 8ук!етк М^еароНк, М^, и далее около 100 мМ триэтаноламина. Элюированными фагами инфицировали бактерии Е.со11 ТС1, амплифицировали и отобрали из бактериальных клеток для следующего этапа скрининга. Давление селекции увеличивали при последующем использовании более строгих условий отмывания и уменьшая количество вводимых фагов. После 3 этапов селекции были идентифицированы 18 уникальных, связывающих Αη§-2 ЕаЬ клонов, практически все из которых распознавали Αη§-2 человека, Αη§-2 мыши и Αη§-2 крысы, что было измерено с помощью аффинного твердофазного иммуноферментного анализа, описанного выше. Приблизительно 10% этих фагов также связывали Αη§-1 человека. Эти клоны конвертировали в 1дС1 антитела, как описано ниже.

Для получения дополнительного уникального фага, осуществляли второй этап скрининга при использовании той же самой библиотеки, но несколько измененной методики. Согласно этой методике Αη§-2 человека в NаНСΟз буфере при рН 9,6 инкубировали в иммунологических пробирках Νιιικ с максимальной сорбцией в при температуре 4°С в течение ночи. Αη§-2 инкубировали в концентрации примерно 1,5, 0,74 и 0,3 мкг/мл для 1, 2 и 3 стадии отмывания, соответственно. Поверхность иммунологических пробирок блокировали примерно 2% молоком в РВ8 (МРВ8), до того как их инкубировали примерно с 2-мя триллионами фаговых частиц (около 50 копий каждого уникального фага в библиотеке) из той же самой фагово-дисплейной библиотеки, описанной выше (Тагде! Циек!), примерно в 4 мл 2% МРВ8. После стадии инкубации с фагами, поверхность иммунологических пробирок отмывали 20 раз РВ8, содержащим около 0,1% Т^ееп-20, после чего 20 раз РВ8. Связанные фаги элюировали при использовании 1мкМ 1ιΑη§-2 или 1 мкМ Т1е-2 человека (Κ ηηά Ό 8ук!етк, описанные выше). Элюированными фагами инфицировали бактерии Е.со11 ТС1 (поставляемые вместе с фаговой библиотекой), амплифицировали и отобрали из бактериальных клеток для следующей стадии скрининга. С помощью ПЦР-амплификации идентифицировали шестнадцать уникальных, связывающих Αη§-2 ЕаЬ клонов из всех фагов, с которыми связались 1ιΑη§-2 или Т1е-2, и эти клоны анализировали путем рестрикционного расщепления. ДНК каждого клона секвенировали.

Последовательности, кодирующие вариабельный участок каждой тяжелой цепи из каждого фага, амплифицировали с помощью комплементарных праймеров. Праймеры конструировали, чтобы включить в них сайт для ΗίηάΙΙΙ, сайт ХЬа1, последовательность Козака и сигнальную последовательность (транслируемый пептид имел структуру МОМВ νΕΑΟΕ-ΕΟΕ-ΕΕ-ΕΑνΕΚΟΑΚΕ; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 69) на 5' конце вариабельного участка, в то время как ВктВ1 сайт был добавлен на 3'-конце ПЦР-продукта. В качестве примера клонирования тяжелых цепей матричную фаговую ДНК клона 544 (8ΕΌ ΙΌ ΝΟ. 19) амплифицировали с помощью праймеров 2248-21 (СТС СТТ 6Α6 Α66 ТСС СΑС ΑТС ТСА ССТ ^Α ССТ ССТ ССА; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 70), которые добавляют последние семь аминокислот сигнальной последовательности, и праймеров 2502-31 (Α1ΊΓ Α№ ТСТ САС ΑСТ ТСС ТТТ СΑТ СТС САС; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ. 71), которые добавляют сайт для ВктЫ на концевой участок вариабельного участка. Полученный продукт амплифицировали с помощью праймеров 2148-98 (ССС СТС Α6Ό ТСС ТСС ССС ТСС ТСС ТΑТ ТСТ ССТ ТСΑ СΑС СТС ССΑ СΑТ; 8ЕЭ ΙΌ ΝΟ. 72) которые добавляют девять аминокислот к сигнальному пептиду (ΑΟΕΕ6ΕΕΕΕ; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ. 73) и праймеров 2502-31, и затем праймеров 2489-36 (0Α.6 СΑС ΑΑС СТТ СТА СΑС САС СΑТ 6ΟΑ СΑТ СΑС ССТ ССС ССС ТСΑ ССТ ССТ ССС; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ. 74) и праймеров 2502-31. Праймер 2489 добавлял в направлении от 5' к 3' сайт для ΗίηάΙΙΙ, сайт для XЬаI сайт, последовательность Кохака и 6 первых аминокислот сигнальной последовательности. ПЦР продукты расщепляли ХЬаТ и ВктЫ, и затем клонировали в вектор экспрессии млекопитающих, содержащий константный уча

- 39 010726 сток 1дС1 человека. Этот вектор содержал промотор 8У40 и маркер селекции ЭНЕК.

Легкие цепи из каждого фага относились как классу каппа и лямбда. Для каждой легкой цепи были сконструированы комплементарные праймеры, добавляющие в направлении от 5' к 3'-концу сайт для НшбШ, сайт для ХЬа1, последовательность Козака и сигнальную последовательность (см. выше). Те цепи, которые имели свободные от ошибок кодирующие участки, клонировали как полноразмерные продукты. В качестве примера, легкую цепь из фагового клона 536 (8ΕΌ ΙΌ ΝΟ. 11) амплифицировали как полноразмерный кодирующий участок при использовании праймеров 2627-69 (СТО ОТТ ОАО АСС ТСС САС АТС ТСА САТ ТОТ САТ САС ТСА СТС ТСС; 8ЕС) ΙΌ ΝΟ. 75), которые добавляют последние семь аминокислот сигнальной последовательности, и праймер 2458-54 (СТТ СТС САС ТТА ТТА АСА СТС ТСС ССТ СТТ С; 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ. 76), который добавлял сайт для 8аП после стоп-код она. Этот ПЦР продукт затем был амплифицировали, как показано выше, с помощью дополнительных 5' праймеров, 2148-98 и 2448-36, соответственно, которые объединяли в пары с праймером 2458-54, для окончательного добавления сигнальной последовательности и клонирующих сайтов. Полноразмерные легкие цепи были клонированы как ХЬа1-8а11 фрагменты в экспрессионном векторе млекопитающих, как описано выше. Определенные лямбда клоны имели ошибки в константных участках по сравнению с природными последовательностями константных участков антител человека. Для корректировки этих несоответствий провели частично-перекрывающую ПЦР при использовании ДНК, кодирующей правильный константный участок лямбда, и вариабельный участок, полученный из фага. Эти клоны затем клонированы как ХЬа1-8а11 фрагменты, как описано выше.

Тогда как вариабельные участки каппа цепей клонировали отдельно от их константных участков, сайт для ВктВ1 добавили на 3'-конец ПЦР продукта. ПЦР продукт расщепляли ХЬа1 и ВктВ1, и затем вариабельный участок каппа цепи клонировали в вектор экспрессии, содержащий константный участок каппа цепи антитела человека.

Парные конструкты тяжелой и легкой цепей из каждого конвертируемого фага были совместно трансфицированы в клетки СНО при использовании набора для кальциево-фосфатной трансфекции (Ιπνί1годеп Согр.) при соблюдении инструкций производителя. Среду поменяли через 14-16 ч после трансфекции, и примерно через 48 ч клетки пассировали в культуральных чашках для селекции согласно инструкции производителя. Трансфицированные клетки отбирали путем НТ селекции в течение приблизительно 3 недель, в течение этого времени колонии трансфицированных СНО клеток трипсинизировали и объединяли вместе в пул трансфицированных клеток.

Через 48 ч небольшое количество кондиционированной среды отобрали для исследования продукции антител с помощью Вестерн-блот анализа при использовании антител к Рс-фрагментам человека, антител к каппа цепям человека и антител к лямбда цепям человека. Отобранные клеточные популяции затем пассировали в условиях селективного давления при использовании стандартной методики стерильных тканевых культур до тех пор, пока не получали достаточное количество клеток, чтобы засеять каждую их четырех роллерных бутылей объемом 850 см² количеством клеток, составляющим 2х10⁷, и приготовить замороженные стоки клеточных линий с помощью ΌΜ8Ο. После засевания клетки в роллерных бутылках поддерживали в среде ΌΜΕΜ, содержащей около 10% сыворотки (С1Ьсо/ВКЬ, 1пс), с добавлением глутамина и незаменимых аминокислот. Клетки поддерживали в течение двух или трех дней до состояния монослоя примерно 80%. В это время среду в роллерных бутылях заменяли смешанной средой, не содержащей сыворотки (50% ΌΜΕΜ, 50% Р12, С1Ьсо), с добавлением глутамина и незаменимых аминокислот. Кондиционированную среду собирали через 7 дней; для получения одного или двух дополнительных урожаев добавляли свежую бессывороточную среду.

Антитела непосредственно очищали из кондиционированной среды с помощью аффинной хроматографии с С белком, используя стандартную методику. Элюирование с колонки с С белком осуществляли, используя буфер с низким рН (рН примерно 3,0), после чего элюированные антитела нейтрализовали с использованием 1М Тпк при рН 8,5, и затем концентрировали центрифугированием с отсечением по молекулярной массе 10 кО. Затем буфер в концентрированном стоке антител заменяли РВ8.

Было получено 31 антитело, каждое из которых состояло из двух тяжелых цепей и двух легких (каппа или лямбда) цепей, как показано ниже в табл. 2.

- 40 010726

Таблица 2

Тяжелая цепь антитела	Легкая цепь антитела
526 НС*	526 каппа
528 НС*	528 лямбда
531 НС*	531 лямбда
533 НС*	533 лямбда
535 НС*	535 лямбда
536 НС*	536 каппа
537 НС*	537 лямбда
540 НС*	540 лямбда
543 НС*	543 каппа
544 НС*	544 каппа
545 НС*	545 лямбда
546 НС*	546 лямбда
551 НС*	551 каппа
553 НС*	553 каппа
555 НС*	555 каппа
558 НС	558 каппа
559 НС	559 лямбда
565 НС*	565 каппа
Р1-С6НС	Р1-С6 лямбда
РВ1-А7 НС	РВ1-А7 лямбда
ГО-В2НС	ΓΌ-Β2 лямбда
РЕ-В7 НС	РЕ-В7 каппа
Ю-011 НС	П-011 каппа
РК-ЕЗ НС	РК-ЕЗ каппа
ОШ4 НС*	ОЮ4 лямбда
СС1Е8НС	0С1Е8 лямбда
Н1С12НС	Н1С12 лямбда
1А1-1Е7НС	ΙΑ1-1Ε7 каппа
1Р-1С10НС	1Р-1С10 лямбда
ΙΚ-2Ε2 НС	ΙΚ2Ε2 лямбда
1Р-2С11 НС	1Р-2С11 каппа

* Тестированы на связывание с йАпд-2, тАпд-2 и йАпд-1, как описано здесь.

Последующие четыре таблицы содержат последовательности и БЕО Ш N0^ тяжелых и легких (каппа и лямбда) цепей 31 антитела к Апд-2, полученных из фага с формированием полноразмерных 1дС1-антител. Области, определяющие комплементарность (СЭРк) моноклональных антител, были предсказаны при использовании УВАБЕ базы данных, которая основана на методике, описанной КаЬа! е! а1. в источнике: Бес.|иепсек оГ Рго1етк оГ 1ттипо1од1са1 ЕНегек! (ΝΙΗ РиЬНсаНоп №. 91-3242; и.Б. ЭерЕ Неа1!й апб Нитап Бегучсек, 5'¹' еб.). ЕаЬ участки выравнивали по отношению к последовательностям в базе данных (см. ййр://^^^.т^с-сре.сат.ас.ик/^тΐ-бос/^скΐ^^сΐеб/А^ЮNМЕNТБ.йΐт^) и затем визуально сравнивали последовательности между собой. СЭРк для каждого вариабельного участка (легкой или тяжелой цепи) приведены ниже в табл. 7.

- 41 010726

Таблица 3 Тяжелые цепи вариабельных участков

Тяжелые цени антитела (НС)	Последовательность
526 НС (ЗЕф ГО N0. 1)	ЕУфЕУЕЗОСОУУфРОКЗЕКЬЗСААЗОРТЕЗЗУОМНЗУУРфАРОКО ΕΕΑ\Ύ8Α.Τ8686Ο8ΤΥΥΑΗ8νΚΟΙ<ΡΤΊ8№ΝΑΚΝ8ΕΥΕφΜΝ8ΕΚΑΕ ОТАУУУСАКОЬЬПУОГОТОРУАУ^бфОТЬУТУЗЗ
528 НС (ЗЕф ГО N0.3)	фУфЕУф80АЕУККР088УКУ8СКА8СОТР38УА18\ХУКфАРСфСЕ ΕνΜ(30ΠΡΙΡ6ΤΑΝΥΑφΚΓφΟΚνΤΓΓΑΟΕ8Τ8ΤΑΥΜΕΕ88ΕΒ.8ΕϋΤ АУУУСАКОУУСОРОШЕ8РРОУЗУ6фОТЕУТУ88
531 НС (ЗЕф ГО N0. 5)	ЕУфЕУф8САЕЛХКР088УКУ8СКА8СгОТР88УА18ААКфАРОфСтЬ ΕΑΜΟΟΠΡ1ΙΑ·ΙΑΝΑΑφΚΡφΟΚνΤΙΤΑΟΚ8ΤΝΤΑλΤ\'ίΕ1Τ8Ι.Τ8ΗΗΤ ΑνΥΥΟΑΚΟΚΕΏΤΑΜνΡΝΥΨΟφΟΤΕντν88
533 НС (ЗЕф ГО N0.7)	ЕУфЕУф8000УУфР0К5ЕКЬ8САА8ОРТР88УОМН%УК.фАРОКО ΕΕΑΎ8 ΥΙ88 3Ο8πΥΥΑΟ8νΚΟΚΓπ8ΚηΝΑΚΝ8Τ.ΥΕφΜΝ8ΕΡ АЕО ТЛУУА^гСАЕПЬЕОТО1ЬТСУО^СтфОТ1.УТ\Х88
535 НС (ЗЕф ГО N0.9)	фУфЬУф8ОАЕУККРО58УКУ8СКА8СОТР38УА18МУКфАР6фОЕ ΕΨΜΟΟΙΓΡΙΡ6ΤΑΝΥΑφΚΡφΟΚνΤΙΤΑΟΚ8Τ8ΤΑΥΜΕΕ88ΕΚ.8ΕϋΤ ΑνΥΥΟΑΑΡ8ΡΡΤΕΤΟΑΡϋΠνθφΟΤΜντν88
536 НС (ЗЕф ГО N0. 11)	ΕνφΕνφ8000ννφΡσΚ8ΕΚΕ80ΑΑ80ΕΤΡ88ΥΟΜΗΧννΡφΑΡΟΚ0 ΕΕ\νν8ΥΙ883Ο8ΤΙΥΥ.ΑΕι8νΚΘΐυ-ΤΙ8ί<ΟΝΑΚΝ3ΤΥΤφΜΝ3ΕΚΑΕΟ ТАУУУСАЯ1)1АОУП1ЕТОУСтУА’ОфСТт'У88
537 НС (ЗЕф ГО N0.13)	фУфЬУф8ОАЕУККРО88УКУ8СКА8ООТР88УА18ХУУКфАР(ЗфОЕ ΕΨΜΟΟΠΡΙΕ61ΑΝΥΑφΚΓφΟκνΤ1ΤΑΟΚ8Τ8ΤΑΥΜΕΤ8ΟΕΟ8ΕΟΤ АУУУСАКОЗЗОААУАОМЛУОфОТЬУТУЗЗ
540 НС (ЗЕф ГО N0.15)	φνφΕνφ80ΑΕνΚΚΡΟ88νκν80ΚΑ8ΟΟΤΡ88ΥΑΙ8ΧννΚφΑΡΦφ6Ε Ε\νΜ<3ΌΙΙΡΙΕΟΙΑΝΥΑφΚΡφΟΚνΤΙΤΑϋΚΡΤ8ΤΑΥΜΕΕ88Ε68ΕΟΤ ΑνΥΥΟΑΚΑνΡΟΤΕΟΑΡϋΙΨ6φΟΤΜντν88
543 НС (ЗЕф ГО ΝΟ. 17)	φνφΕνφ86ΑΕνΚΚΡσ88νκνεθΚΑ8αθΤΡ88ΥΑΙ8\ννΚφΑΡΟφΟ ΕΕΑΑίΟΚΠΡΠ.ΌΙΑΝΎΑφΚΡφΟΡ.νΤ1ΤΆΠΚ3Τ8ΤΑΥΜΕΕ55ΕΚ.8ΕΟ ΤΑνΥΥΟΑΚΡΥΥϋΡΨ8σΡΟΟΜϋνΨ6φΟΤΤντν88
544 НС (ЗЕф ГО N0.19)	φνφΕνφ8ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν8ΕΚΑ86ΟΤΡ88ΥΑΙ5ψνκφΑΡ6φ6 ЕЕ\ШОО11Р1Р0ТАУУЛфКРфОКУТ1ТАПЕ8Т8ТАУМЕЕ881,К8ЕН ΤΑνΥΥΟΑΚΡΕδΟΥΨΟΟΑΡϋΙΨΟφΟΤΜνΤνδΒ
545 НС (ЗЕф ГО N0.21)	φνφΕφΕ8000ννφΡ0Κ8ΕΚΕ80ΑΑ80ΡΤΡ88Υ0ΜΗΨνΚφΑΡ0Κ0 ΕΕΛ\ΎΑνΐ8ΥΟΟ8ΝΚΥΥΑΟ3νΚ6ΚΡΤΤ8ΡΌΝ8ΚΝΤΕΥΕφΜΝ8ΕΚΑΕ ΟΤΑνΥΥ€ΑΚΘΡνΗΡΟΥΟΟΥΑΙΓ)ΥΨΟφ6ΤΕνΤν88
546 НС (ЗЕф ГО N0. 23)	ΕνφΕνθ86ΟΟΕνφΡΟ65ΕΚΕ80ΑΑ8ΟΡΤΡ35ΥΑΜ3ΧννΚφΑΡ0Κ0 ΕΕΨν8ΑΙ808008ΤΥΥΑΟ8νΚ0ΚΡΤΙ8ΚϋΝ8ΚΝΤΕΥΕφΜΝ8ΕΚΑΕ ΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΊΊ8Ρ8ΤΓ86ΥΡϋΥΨΑφσΤΕντν88
551 НС (ЗЕф ГО N0.25)	φνφΕνφ80ΑΕνΚΚΡ088νκν80ΚΑ8ΟΟΤΡ88ΥΑΙ55ννΚφΑΡΟφ0Ε ΕΨΜΟΟΙΙΡΙΡ6ΤΑΝΥΑφΚΡφΟΚνΤΓΓΑΟΕ8Τ8ΤΑΥΜΕΕ58ΕΚ8ΕϋΤ

-42 010726

	ΑνΥΥΟΑΒΟΥΟΓΨ80Υ8ΕΟΑΓΟΠνθςθΤΜνΤν88
553 НС (8Εζ> ГО ΝΟ. 27)	ЭУ9ЬУС)8САЕУККРСА8УКУ8СЮА8ОУ1ТТ8УАМНААК(ЖО0 ΚΕΕ\ν'Μσ\νΊΝΑΟΝΟΝΤΚΥ8ρΚΡ96Κ.νΤΙΤ№Τ8Α8ΤΑΥΜΕΕ80ΕΚ 8ЕОТАУУУСАКСтУОПУССтЖ№АГОГ\УСтС)6ТМУТУ88
555 ΗύΤδΕρίϋΝΟ. 29)	ЦУЦЕрЕЗОСЮУУЦРОКВЕВЕКСААЗСПТЗЗУАМШУУЖЗАРОКО ЕЕЧ’УАУ18У0С8ККУУ.АП8УКСК1^:Т18К0№КПТЕУЕЦМ№ЕВАЕ ОТАУУУСАК8А8ОНУУ088ОУУ8ОАРО1АУОЦО1МУТУ88
558 НС (8ЕЦ ГО N0.31)	ОУЦЕОЭАУОАОЕЕКЗ’ЗЕ'ГЕЗЕТСАУУбОЗНЗОУУХУКАУГКЭЗРСКО ΕΕ\νΐΟΕΠ4Η8Ο8ΤΝΡΝ]’8ΕΚ8Κ.1Τί8ν0Τ8ΝΝ(?Ρ8ΕΚΕ88νΤΛ,ΑΗΤΑΑ ΥΥΟΑΚΟΗϋΨΟΜ6Κ3ΰΑΑΥΟΙΨ^ΟΤΜντν88
559 НС (8Εζ) ГО ΝΟ. 33)	0ν0Εν08α,ΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν80Κν8ΟΥΤΕΤΕ88ΜΗ\^Ρ0ΑΡΟΚ СЕЕ’ЛЪЮОРОРЕНбЕПУАЦКРрС^ТМТЕОТЗТОТАУМЕЕЗЗЕК.З ЕОТАУУЕСАКОУрУТ8ОТНУЕОН%'’СХХЯЪУТУ88
565 НС (8Е() ГО ΝΟ. 35)	ОУрЕУОЗО.АЕУККРСЗЗУКУЗСКАЗСОТЕЗЗУАЬУ/’УкОАРС^ОЕ ЕиМООИР1РОТАМУАЭКГр6К.\’Т1ТАОЕ8Т8ТАУМЕЕ8.8ЕК8ЕОТ АУУУСАКЗРТУУНП.ТСгГОАРОТАТОЦаТМУТУЙЯ
Е1-С6НС (8Е0 ГО ΝΟ. 37)	рУЦЕУр8СтАЕУККРСт8ЯУКУ8СКА8СтСтТР88УАТ8\УУР().АРО0ОЕ Е\УМОШ1РГЕО1АКУА0К1'0<ЗКУТПАНК.818ГАУМЕ[,88Ек8Е0'ГА νΥΥ0ΑΚΟΡΙΡ8ΟΨΥΓΟΕΨΟΒΟΤΕντν88
ЕВ1-А7НС (8Е0 ГО N0. 39)	СУЦЕУЪЗОСОЕХКРОКЗЕКЕЗСААКОРТРЗЗУОМНУЛ^САРОКб ΕΕ^ΑΑνΐΨΥΌΟ8ΝΚΥΥΑΟ8νΚΟ’ΒΡΤΙ8№Ν8ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑ ЕОТАУУУСА1ШУОРтТ)88ОУОУЖ}0ОТЕУТУ88
Р0-В2 НС (8Е0 ГО ΝΟ. 41)	ОУОЕ.ррЗОРОЕЖРЗЦТЕЗЕТСАТЗСтОП'ЗЗХЗ.ААЧ'КУТКрЗРЗКО ΕΕΑ\'Έ0ΚΤΥΥΚ8Κ\νΥ8ΟΥΑν8ΕΡΓ;ΜΤΙΝΕ0ΤΟΤ8ΚΝρΡ8ΕρΕΝ8ν ΤΡΕΟΤΑνΥΑΤΑΐωΐ<0Ο'ϊΊΟ8ΨΟ0θΊΕνΤν88
ГЕ-В7 НС (8Е0 ГО N0. 43)	ЕУ0ЕУЕ86ООЕС9Раб8ЕКЕ8СААТСР8ЕООУЕММ\УУЕ!.0АР6К.6 ЕЕУЛ'ЗУПСтЯОКТгРУАНЯУКСгКРПЗКПКОКЖУУЕЦМЖГ.КАЕГ.) ΤΑΙΥΥ0ΑΒ.<36Ο8ΑΥΥΕΝΤ8ΟΙΨθρθΤΜνΤν88
ΡΙ-Ο11 НС (8Εζ> ΙΕ) N0. 45)	9УрЕУ98ОАЕУ^гККРОА8УКУ8СК.А8ОУТР’Т.8УО18А^гУКС.АРО0О ΕΕΨΜΟΨΙ8ΑΥΝ<3ΝΤΝΥΑ9ΚΕςθΚ.νΤΜΤΤΟΤ8Τ8ΤΑΥΜΕΕΚ8ΕΚ8 ΟΟΤΑνΥΥΟΜ^<ΟΙΑΑΚ8ΑΥΥΥΟ\©ννΌΟΟ'ΓΓνΤν88
РК-ЕЗ НС (8ЕС ГО N0. 47)	0У9ЕУЦ8ОАЕУККРСА8УКУ8С}СА8ОУТЕТ8УОЕМ%'УР.рА8О9О ΕΕΨΜΟΑΑ^ΨΊ8ΟΝΤΘΥΑ0ΚΕ0ΟΚΙΤΜ·Π<ΝΓ8Ι8'ΓΑΥΝ1ΕΕΙ<8ΕΒ8 ΟΟΤΛ\ΎλΌΑΚΟΡΡ8Οθν/ΈΡΟΑΤνθ0ΟΤΕνΤΥΈ8

- 43 010726

С1В4 НС (8ЕЦ ГО N0. 49)	(^\'0Е\'08САЕУККР655\'К\’8С1СА8ОСТР88НА187>А110АРСЦСгЕ Е^МОКЛРШСИАНУАОКГЦОКУПТАОЕЗТЗТАУМЕЕЗЗЬКЗЕПТА νΥΥ0ΑΤ8ΚΕΕ%ΤΕΥΕϋ ΥΨΟρΟΤΕντνδδ
СС1Е8НС (8ЕС) ГО N0. 51)	0У0ЕУ08САЕУККРСА8УКУ8СКА86¥ТЕГ8¥О18\^УКЙАРС6) ОЬЕЗШО1Щ8АУНОЪГтУАЦКЬЦОК.УТМТТОТ8Т8ТАУМЕУК8 ΕΚ8ΠϋΤΑνΥΥΟΑΚ<Κ}8ΡΥΟΟΥΑΥΡΡΟΥΨΟ(Χ}ΤΕνΤν88
Н1С12НС (8Εζ) ГО N0.53)	ЕУЦЕУЕ8ОООУУ(2РОК5ЕКЕ8САА8ОГТР88УОМН1УУК.С)АРЖ ΟΕΕ\νν8ΥΙ88868ΤΙΥΥΑΟ8νΚ<3ΚΓΤΙ8Κ0ΝΑΚΝ8ΕΥί.9ΜΝ8ΕΚΑ ЕВТЛУУУСАКПЕЕО^ТИЕТСУСП’^ОрбТЕУТУЗЗ
ΙΑ1-1Ε7 НС (8ЕЦ ГО N0. 55)	0νρΕ09%ΌΑαΕΕΚΡ8ΕΤΕ8ΕΤΟΑνΥΩΟ5Ρ8ϋΥΥνν'3ΨΠ<08ΡΟΚ 0ΕΕ\\α0ΕΙΝΗ868™ΡΝΡ8ΕΚ8ΜΏ8νϋΤ8Ν^Ρ8ΕΚΕ88νΤΑΑϋ ТАУ¥УСАК0Н03¥6МСЮ0ААУ013У0Ц0ТМУТУ88
1Р-1СЮНС(8Е0ЮМО. 57)	0\^Е7Е8ОООЕУ0РСО8иШ8САА86ЕТЕР8'1УАМГУ¥КЦАРО ΚΟΕΕν/Ύ8νΠ?8ΝΌΟΤΟΥΑΓ^νΚΟΚΓΤΙ8№Ν8ΚΝΤΕΥΕΕ)ΜΝΟΕ ^\ΕϋΤΑνΥΥΟΜΤϋΥΥ\νθ(Χ3ΊΕντν88
ΙΚ-2Ε2 НС (8ЕЦ ГО N0. 59)	Εν01.Γ.Ε8Γτ0τΟΙ.ν9ΡΟΟ8ΙΛΕ8ΟΑΑ8<τΡΤΡ88ΥΑΜ8ΨνΚ.0ΑΡΟΚ ΟΕΕΨν8ΑΙ8Ο8ΟΟ8ΤΥΥΑΟ8νΚ6ΚΓΤΙ8ΚΟΝ8ΚΝΤΕ3Τ0ΜΝ8ΕΚ. ΑΕηΤΑνΥΥΟΑΚΕΤΙ8Ρ8ΤΡ8ΟΥΡΟΥΨσ06ΤΕντν88
1Р-2С11 НС(8Е(ЗГОЪЮ. 61)	ρν0Εν08αΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν30ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΟΙΝννΐ<ζ)ΑΊΌ(5 ΟΕΕΨΜΟΨΜΝΡΝδΟΝΤΟΥΑΟΚΓΟΟΚνΤΜΤΚΝΤ8Ι8ΤΑΥΜΕΕ88 ЕК8ЕОТАУУУСАКЕ1АУАСТКУСМОУ\ТОПОТТУТУ88

Таблица 4

Каппа цепь вариабельных участков

Легкая цепь антитела (ЬС)	Последовательность
526 каппа (8ЕЦ ГО N0. 2)	^ΓVΜΤ^8Ρ^8^ΡVΊΡΟΕΡΑ8I8СΚ.88^8^^Η8N(^ΥNΥ^^\ΥΥ^ 0ΚΡσ08Ρ9ΕΕΙΥΕ68ΝΗΑ8σνΡΠΚΡ8Ο8Ο8ΟΤΟΡΤΕΚΙ8Κ.νΕΑ Εϋνον ΥΥΟΜΟΑΕζιΤΡΡΤΕΟΟΟΤΚνΕΙΚ
536 каппа (8ЕЦ ГО N0. 12)	ОП'МТр8РЕ8ЕРУ1Р6ЕРАЖСК88Ц8ЬЕЖМО^Т4УЕОЧ/УЕ 0КРО08Р0ЕЕ1УЕС8ПКА8ОУРОЯГ8С8С8С1Т)КП1.К18КУЕА ЕОУОУ ΥΥΕΑίρΟΤΗν/ΡΡΤΓΠΟΟΤΚΕΕΙΚ

- 44 010726

543 каппа (ЗЕС? ГО N0. 18)	В1\Ъ1Т08РЬ8ЕРУТРОЕРА818СВ8808ЬЕН8КСУЕТ1ГОГСУБ φΚΡΟ08Ρς)ΕΕ1ΥΕ68ΝΒΑ8θνΡΟΓίΕ8Ο8Ο8ΟΤϋΓΤΕΚΙ8Β\ΈΑ ЕОУОУ УУСМ0АЬ0ТРЕТР6ООТКУЕ1К
544 каппа (8Εζ) ГО N0. 20)	ΟΓνΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡσΕΡΑ8Ι8ί·Ρ8808ΕΕΗ8ΧΌΥΝντΝ\νΥΕ 9КР(Х)8Р(?]Ы¥ЬО8РЖА8ОУРОИР8О8О8ОТОР1ЪК18КУЕА ЕОУОУ УУСМрСЕ9ТРРТРС0СТКЕЕ1К
551 каппа (8ЕСЭ ГО N0. 26)	ΒΠ'ΜΤΟδΡΕδΕΡνΤΡΟΕΡΑδΚΟΚΕδΟδΕΕΗδΝΟΥΝ^ΤΟ^ΑΤ рКР608РрЕЕ1\Ъ68КВА8ОУРОКЕ8О8О8СТОЕГЕК18ВУЕА Εονον уусмоаеотрьтросоткνπι К
553 каппа (8Е() ГО N0, 28)	ϋΙΥΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι8€Β8808ΕΕΗ8Ν6ΥΝΥΕϋ\νΥΕ фКРО08Рр1,ЕГУТ.О8МВА8ОУРВРЕТ08О8АТОГТ1,К18КУЕА ЕОУОУ ΥΥΟΜΟΑΕςΤΡΕΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ
555 каппа (8Е<3 ГО N0. 30)	ΟΓνΜΤΡ8ΡΕ8ΕΡνΤΡ6ΕΡΑ8Ι8σΚ.8808ΕΕΗ8ΝΟΥΝ')^ΕΏλνΥΕ 9КРСр8Р0ЕЕ1\ЪЛ8М1ЕА56УРОВГ8С8а8СТОГТЕК18КУЕА ЕОУОУ ΥΥΟΜΟΤΕΟΙΡΓΓΡΟΡΟΤΚνϋΙΚ
558 каппа (8Еф ГО N0. 32)	ЕГУЕТ08РОТЕ8Е8РОЕ]<АТЕ8С4М8С)8У8888ЕАУА^ГС)С)КРО 0АРГСЕУУАА88КАТО1РОЕР8О8О8ОТОРТЕТ18ЕЕЕРЕОГА νΥΥΟΟ НУО88РВТГОрОТКУЕ1К
565 каппа (8Е<3 ГО N0. 36)	Е1УЕТ08РСТЕ8Е8РСЕВАТЕ8С1ЕА.808У8888ЕАГСУ90КРО 0АРтУУАА8БКЛТСЕГОГ<Р8С8С86ТОЕТЕТ1$Ш.ЕРЕВЕА УУУСО НУС88РВТРС0СТКУЕ1К
ГЕ-В7 каппа (8Е0 ГО N0. 44)	В1УМТ98РЕ8ЕРУ1таЕРА818СК8808ЕЕН8КаОКУЕОГСУЕ рКР608Р0ЕЕ1\ЪО8НКА8а\ФОНЕ808С80ТОГТЕК18ВУЕА ЕОУОУ ΥΥΟΜ9ΑΕ9ΤΡίΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ
ΓΊ-011 каппа (8Ер ГО N0. 46)	О1УМТрТРЬ8ЕРУТРОЕРА818СК8808ЕЬО8О0ОКТУЬОГСУ Е0КРС08Р0ЕЕМУ1Т881ЕА8ОУРОКР8С868ОТОРТЕК18К.У ЕАЕОУО νΥΥΕΜ()ΑΤΓ)ΕΡΥΤΡΟ0ΟΤΚΕΕΙΚ
РК-ЕЗ каппа (8Е(? ГО N0. 48)	ЫУМТ9ТРЬ88ТУТЕ69РА818СК8898ЬУНЕООМТ¥ЕМГСЪН 01иКК)РРКЕЕ1УК1.5КГС8ОУРОЕК8О8ОАО7НН'ЕК18КУЕР ΕΟνσνΥ УСМРЗТКЕРКТГОРОТКЬЕК
ΙΑΙ-1Ε7 каппа (8ЕС) ГО N0. 56)	ЕГХ'ЕТ08РАТЕ8Е8РОЕКАТЕ8СВА8р8У888ГЕАГСТрОКАС 0АРКЬЫУОТ8ТКАТО1АОКЕ8О8О8ОТОЕ1ЪГ18КЬЕАЕО8А УУУСфф У0Г8РЬТЕ000ТКУЕ1К
1Р-2С11 каппа (8Е() ГО	Е1\ТТ08РОТЕ8Е8РС1ЕГ<АТЕ8СГ<А8р818ТРЕА\ХГС00КРО0А
N0. 62)	ΡΙΟ.ΕΙΥΟΑ8ΝΙΜΤ0ΠΌΒΓ808086Τ0ηΤΉ8ΝΕΕΡΕ0ΓΑνΥ УС0НК1 ΝλνΡΕΤΕΟΟΟΤΚΥΕΙΚ

- 45 010726

Таблица 5

Лямбда цепь вариабельных участков

Легкая цепь антитела (БС)

528 лямбда (БЕЦ ГО N0. 4)

Последовательность

531 лямбда (8Е0 ГО N0.6)

533 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 8)

535 лямбда (8ЕЦ ГО N0.10)

537 лямбда (8ЕЦ ГО N0.14)

540 лямбда (БЕЦ ГО ΝΟ. 16)

5УЕЕТ0РР8У5У8Р60ТА8ГГС8ООКЕ6УТУТ8\\Т09К1’ Ο08ΡνΕνΐΡ0ϋΡΚΚΡ8ΟΙΡΕΚΡ8Ο8Ν8ΟΝΤΑπ,ΤΙ8αΤ0Α МОЕАОУУСОАТОЗТТАУУРОТСТКУТУЕ 08νΕΤ0ΡΡ8ν8ΑΑΡΟ0Κντν8Ο8Ο888ΝΙΟΝΝΥν8ΨΥ0 0ΕΡΟΤΑΡΚΕΕΙΥΟΝΝΚΚΡ8ΟΙΡΏΚΡ8Ο8Κ8ΟΤ8Α1ΈΟΓΓ ΟΕ0ΤΟΟΕΑϋΥΥ€σΤΐνϋ88Ε8ΑΡΨνΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ δΥΕΕΤΟΡΡδνδνδΡΟΟΤΑΚΙΤΟδΟϋΑΕΡΚΟΥΑΥλνΥΟΟΚ ΡθρΑΡνΕνΐΥΚΟ8ΕΚΡ8ΟΙΡΕΚΡ8Ο888ΟΤΤνΤΕΉ8θν0 АЕОЕАПУУСр8АО88НУУРС(ЗОТКЕТУЕ 08νΕΤ0ΡΡ8ν8ΑΑΡσ0ΚνΤΙ8Ο8Ο8Ν8ΝΙΟΝΝΡν8ΨΥ0 ΟΙ,ΡΕιΤΑΡΚΙ.ΕννΌΝΝΚΚΡδΟΙΡϋΚΡδΟεΚΧΟΤδΑΤΕΟΙΤ ОЕфТСОЕАОУУСОТАГОЗЗБЗААЕУУРОбСТКЕТУЕ ΟδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΟνΤΚΟδαΝΝδΝΙΟΝΝΥνδΧνΥΟ 0νΡθΤΑΡΚΕΕνΥ0ΝΗΚΚΡ8ΟΙ8ΟΒΡ868Κ8ΟΤ8ΑΤΕΌΓΓ ΟΕΟΡΟΠΕΑΟΥΥϋΟΤ\νηΤ8Ε8ΑΝλννΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ ΟδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΚνΤΪδόδάδδ’δΝΙΟΑΝΥνδΧνΥΟ 0ΕΡ6ΤΑΡΚΕΕΙΥΝΝΝΚΚΡ8ΟΙΡΟΚΡ8σ8Κ8ϋΤ8ΑΤΕΟΙΤ6 БрТОПЕ.АОУУССЗААГОБЗЕБАЗУуУРСЮОТКЕТХГО

545 лямбда (8ЕЦ ГО ΝΟ. 22)

546 лямбда (БЕЦ ГО N0.24)

08νΕΤ0Ρ88ν8ΟΑΡΟ0ΚνΠ8ΓΤΟ088ΝΙΟΑΟΥϋνΗΨΥ

00ΡΡΟΚΑΡΚΕΕΙΥ0Ν8ΝΚΡ8ανΡ0ΚΕ8Ο8Κ8ΟΤ8Α8ΙΛΙ ΤΟΕΟΡΕΏΕΑΟΥΎϋΟδΥϋδΚΕδΟδνΡΟΟΟΤΚΕΓνΕ 08νΕΤ0Ρ88ν8ΕΑΡΚ0ΒνΤΙ808Ο5Α8ΝΙΟΑΝθν8ΨΥΗ 0\ΤαΚ.-ΥΡΚΕΕΕ8ΗϋΟΕνΤ8θνΤΟΚΕ8ν8Κ8ΟΤ5Α81.ΑΙ5 6ЕН8ООЕСтГЛАСАУАТЮ8ЕЕАУ\Т€ЮОТКЕТУЕ

559 лямбда (8ЕЦ ГО N0. 34)

08.АЕТ0РР8А8С8Р6р81ТКСТСТМ8ОЮ8¥РРУ8АУфВ.

ΗΡ0ΚΑΡΚΕΕΙΥϋν8ΝΚΡ80ν80ΒΡ808Κ80ΝΤΑ8Ε'Π80

- 46 010726

	ΕφΑΕΟΕΟΗ\Ύ€38ΡΤΜΝ3ΡνΐΡΟΟΟΤΚΕΤ\Τ
Г1-С6 лямбда (ЗЕф ГО ΝΟ. 38)	φδνΕΤφΡΡδνδΕΑΡΚφΚνΤΙδΌδΟδδδΝΙΟΝΝΑΧΝλνΥφ фЬРОКАРКЕЫУУФФЕЕРЗСгУЗФКРЗФЗКЗФТЗАЗЕАГЗ ОЬКЗЕОЕАВУУСАТтаГОЗЬЗб’УТУРССОТКЫУЕ
ЕВ1-А7 лямбда (ЗЕф ΙΟ ΝΟ. 40)	ΝΡΜΕΤφΡΗ8ν3Ε3ΡΟΚΤνΤΙ30ΤΡ3Οθαΐ<383Ρ\ΉλνΡφφ КРФ38РТГУПГООМфКРТСУРОКРЗААГОТ3838А8ЬТ13Ф ЕТАЕОЕАОУУСфЗЗН8ТА\А'ТССаТКЕТ\Ъ
ΡΏ-Β2 лямбда (ЗЕф ГО ΝΟ. 42)	ΝΕΝ^ΤφΡΗ3ν8Ε8ΡΟΚΤνΤΙ8ΦΤΚ.88Φ3ΙΑΤΝΥνφ\νΥφ φΚΡΟ88ΡΑΤνΐΥΕϋΝφΚΡ8ΦνΡΟΚΡ3Φ8ΙΠΤ83Ν5Α8ΕΤΙ ΒΟΕΤΊΈΟΕ.ΑΟΥΡΟφδΥΟΟΝΝλνΎΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ
СЮ4 лямбда (ЗЕф ГО N0. 50)	ИРМЬТфРИЗУЗЕЗРОКТ νΐΙΡΦΤΚ88Φ8ΙΑ8ΝΥν φν/ΥφΚ ΚΡΟ8ΑΡ8ΐνΐΥΕΟΚφΚΡ8Ολ7ΡϋΚΡ8Ο8©388Ν3Α8ΕΤΙ3Ο ΕΚΤΕΟΕΑϋΥΥΟφδΥΝδΚΟνΜΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ
ОС1Е8 лямбда (ЗЕф ГО N0. 52)	ΝΡΜΕΤφΡΗ8νΕΕ8ΑΦΚΤνΤΙ8ΦΤΚ.38Φ81Α3ΝΥνφ\νΥφ φΚΡΟΤ3ΡΤΝνϊΡΕΠΝφΚΡ8θνΡΟΕΡ8Ο8ΙΟ388Ν8Α3ΕΤΙ8 ΟΕΚΤΕΟΕΑϋΥΡΓφ3ΥΏ5ΝΙ\ννΡ6<}ΟΤΚΕΤνΕ
Н1С12 лямбда (ЗЕф ГО N0. 54)	φ3νΕΤφΡΡ3ν3ΑΑΡΟφΚνΤΙ8036885Ν1ΟΝΝΥν8λνΥφ ΗΕΡΟΤΑΡΚΕΕΓιΌΝΤΝΚΡΐΟνΡΟκτ'δΰϊΚΐΟΤδΛδΕΑΕΑ бЕфАЕОЕАОУУСфЗУФЗЗЬЗФЗЬУРбФФТКЬТУЬ
ГР-1С10 лямбда (ЗЕф ГО ΝΟ. 58)	ΝΡΜΕΤφΡΗ8ν8Ε3ΡΟΚΤνΤΙ8ΦΤΦ56Ο8ΙΑ8ΝΥνφ\νγφ φΕΡΟ8ΑΡΊΤνΐΥΕΟΝφΚΡ3θνΡΟΚΓ5Ο3©8δ8Ν8Α8ΕΤΙ δΟΕΚΤΕϋΕΑϋΥΥΟφΒΥΏδδΤίννΡΦΦΦΤΚΕ'ΠΤ
ΙΚ-2Ε2 лямбда (ЗЕф ГО N0. 60)	φ8ΑΕΤφΡΑ8ν8Φ3Ρ6φ8ΙΤΙ80Τ6Τ53θνθΟΥΝΥν8\νΡφ φΙΙΡ0ΚΑΡΚΕΜΙΥΚνΝΝΚΡ5σΕ5ΝΚΡ503φ8ΟΝΤΑ3ΕΤΙ8 ОЬфАЕОЕАОУУСЗЗУТЗЗЗТЬОРбООТКЕТУЬ

- 47 010726

Таблица 6

Константные участки антител человека

Константный участок антитела	Последе вате л ьность
Константный участок 1 лямбда цепи антитела человека (БЕЦ ГО N0. 63)	СЦРЮШРТУТЕРРРББЕЕЕЦАИКАТЕУСЕГБОГУРСАУТУААК АООБРУКАОУЕТТКРБКЦЗНМКУААББУЕЗЕТРЕЦАКБНКБУ БСЦУТНЕСБТУЕКТУАРТЕСБ

Константный участок 2 лямбда цепи антитела человека (БЕЦ ГО ΝΟ. 64)	ОЦРКААРБУТЕЕРРБЗЕЕЕЦАККАТЕУСЫБОЕУРСАУТУААК А08БРУКАОУЕТТГР8КЦ5ММКУАА85УЕ8ЕТРЕЦАКБНК.8УБ СЦУТНЕОБТУЕКТУАРТЕСБ
Константный участок 3 лямбда цепи антитела человека (БЕЦ ГО N0. 65)	аЦРКААР8УЛЕЕРР88ЕЕЖЦАККАТЕУСЪ15ОЕУТСАУТУАЛУК АО8БРУКАСУЕТТТР5КЦ5КМКУАА55УЕ8ЕТРЕЦ\УК8НКЗУ5 СЦУТНЕОБТУЕКТУАРТЕСБ
Константный участок 7 лямбда цепи антитела человека (БЕЦ ГО ΝΟ. 66)	СгЦРКААРБУТГЛРРЗБЕЕЕЦАККАТЕУСЕУБОЕУРСАУТУАХУ КАОСБРУКУСУЕТТКРБКЦБКМКУААББУЕЗЕТРЕЦУ/КБНКБ УБСКУТНЕСБТУЕКТУАРАЕСБ
Константный участок каппа цепи антитела человека (БЕЦ ГО ΝΟ. 67)	КТУААРБУНЕРРБПЕЦЕКБОТАБУУСЕЕИИРУРКЕАКУЦУЖУ ΟΝΑΕΟ8ΟΝ8(^Ε8ν'ΓΕζ)Ι)8ΚΟ8·ΓΥ8Ε38Τ1.ΊΙ.8ΚΑΟΥΕΚΗΚνΎ АСЕУТНЦСЕББРУТКБИЧКСЕС
Константный участок 1§С1 человека (БЕЦ ГО N0. 68) _	Α8ΤΚ0Ρ8νρΡΕΑΡ58Κ8Τ500ΤΑΑΕΟ€ΕνΚ0ΥΕΡΕΡντν8ΑΝ8 ОАЕТ8ОУНТРРАУЕЦ88ОЕУ5Е88УУТУР858ЕСТЦТУ1СМУЫН КРЗШХАГОККУЕРКБСОКТНТСРРСРАРЕЕЪОбРБУРЕРРРКРК 0ТЕМ18ΚΤΡΕντσνννον5ΗΕΟΡΕνΚΚΝΑΥνθανΕ νΗΝΑΚΤ КР1ШЕЦУН8ТУКУУБУЕТУЕНЦОАТЕЮКЕУКСКУ8ЖАЕРАР 1ЕКТ15КАКООРКЕРОУ'1ТЕРРБКОЕЕТКМОУБЕТСЕУКОЕ\'Рй

Таблица 7

Области, определяющие комплементарность (СЭВк) тяжелых цепей (НС) и легких цепей антител к Апд-2. Легкие цепи: ЬС - лямбда и КС - каппа.

	С0К1	СЭК2	спкз
Антитело	Остатки	Остатки	Остатки
АЬ526НС	26-36	50-66	96-113
АЪ 526 ЬС	23-46	54-62	93-102
АЪ 528 НС	26-36	50-66	96-113
АЪ528ЬС	22-34	56-76	87-98
АВ531НС	26-36	50-66	96-110
АЬ531ЬС	22-36	58-78	89-102
АЪ533 НС	26-36	50-66	96-112
АЪ 533 ЬС	22-34	56-76	87-97
АЬ 535 НС	26-36	50-66	96-111
АЪ 535 ЬС	22-36	58-78	89-103

- 48 010726

АЬ 536 НС	\|26-36	50-66	96-112
АЬ536КС	2340	54-62	93-102
АЬ537НС	26-36	50-66	96-109
АЬ 537 ЬС	22-36	58-78	89-102
АБ540НС	26-36	50-66	96-110
АЬ 540 ЬС	22-36	58-78	89-102
АЬ 543 НС	26-36	50-66	96-113
АЬ 543 КС	23-40	54-62	93-102
АЬ 544 НС	26-36	50-66	96-111
АЬ 544 КС	23-40	54-62	93-102
АБ545НС	26-36	50-66	96-113
АЬ 545 ЬС	22-37	59-79	90-102
АЬ546НС	26-36	50-66	96-113
АЬ 546 ЬС	22-36	58-78	89-101
АЬ551НС	26-36	50-66	96-114
АЬ551 КС	23-40	54-62	93-102
АЬ 553 НС	26-36	50-66	96-113
АЬ553 КС	23-40	54-62	93-102
АЬ 555 НС	26-36	50-66	96-118
АЬ555 КС	23-40	54-62	93-102
АЬ 558 НС	26-36	50-65	95-113
АЬ 558 КС	23-36	50-58	89-98
АЬ559НС	26-36	50-66	96-112
АЬ 559 ЬС	22-37	59-79	90-101
АЬ565 НС	26-36	50-66	96-115
АЬ 565 ЬС	23-36	50-58	89-98
АБР1-С6НС	26-36	50-66	96-110
АЬ Р1-С6 ЬС	22-36	58-78	89-101
АЬРВ1-А7 НС	26-36	50-66	96-112
АЬРВ1-А7 ЬС	22-36	58-80	91-101
АБРВ-В2НС	26-38	52-69	101-112
АЬРО-В2ЬС	22-36	58-80	91-101
АЬРЕ-В7НС	26-36	50-66	96-112

- 49 010726

АЬГЕ-В7ЬС	23-40	54-62	93-102
АЬЕЬОПНС	26-36	50-66	96-115
АЬРЗ-ОИЬС	23-41	55-63	94-103
АЬ ГК-ЕЗ НС	26-36	50-66	96-110
АЬРК-ЕЗЬС	23-40	54-62	93-102
АЬ 0104 НС	26-36	50-66	96-110
АЬ ОЮ4 ЬС	26-36	58-80	91-101
АЬ 0С1Е8 НС	26-36	50-66	96-113
АЬ 0С1Е8 ЬС	22-36	58-80	91-101
АЬ Н1С12 НС	26-36	50-66	96-112
АЬН1С12 ЬС	22-36	58-78	89-102
АЬ ΙΑ1Ε7 НС	26-36	50-65	95-113
АЫА1Е7ЬС	23-36	50-58	89-98
АЫР-1С10НС	26-37	51-66	96-102
АЫР-1С10ЬС	22-36	58-80	91-101
АЫК-2Е2НС	26-36	50-66	96-113
АЫК-2Е2ЬС	22-37	59-79	96-101
АЫР-2С11НС	26-36	50-66	96-112
АЫР-2С11ЕС	23-35	49-57	88-97

Семнадцать антител и негативный контроль антител 1дС1 (обозначенных как ВЭВ1) тестировали при использовании аффинного и нейтрализующего ЕЬ18А (как описано в примере 3 выше), а также с помощью исследований нейтрализации В1Асоге для определения аффинности, нейтрализующей способности и специфических свойств. Результаты приведены ниже в табл. 8; их обсчитывали с помощью стан дартных методик.

Таблица 8

ЕС₅₀ и Ιδ₅₀ антител к Апд-2

	ЬАпд-2	тАп£-2	ЬАпе-1
Антитело	1С50(пМ)	ЕС50 (пМ)	1С50 (пМ)	ЕС50 (пМ)	1С50(пМ)	ЕС50 (пМ)
АЬ536	0.08	0.005	0.05	0,01	114.65	30
АЬ565	0.26		0.26		Нет имгибигювания

- 50 010726

АЪ546	0.37		1.09		Нет ингибирования
АЪ543	051		0.24		Нет ингибирования
АЬ533	0.3		0.08		Нет ингибирования
АЬ537	0.56		0,62		Нет ингибирования
АЬ540	0.70		1.53		Нет ингибирования
АЬ544	0.97		1.82		23.32
АЬ545	1.04	0.02	130	0.05	8.31	2
АЬ528	137		0.73		Нет ингибирования
АЬО1Ш	139		0.60		69.48
АЬ551	1.41		2.88		Нет ингибирования
АЬ553	1.47		1.41		Нет ингибирования
АЬ526	1.83		0.27		243.15
АЬ531	2.15		1.67		Нет ингибирования
АЬ555	2.21		1.76		Нет ингибирования
АЪ535	2.81		2.45		Нет ингибирования
ΚΟΒΙ	Нет ингибирования	Нет г.няакгдявия	Нет ингибирования \|	Нет связывания	Нет ингибирования	Нет ^называния—

Два антитела, клон 536 и клон 545, оценивали при использовании анализа В1Асоге, раскрытого выше. Связывающую способность антител определяли, как описано для В1Асоге анализа (меньшее значение Кп свидетельствует о меньшей аффинности), как описано выше. Результаты приведены в табл. 9.

Таблица 9

Аффинность антител к ЬЛпд-2 и тАпд-2

Пример 5. Исследование терапевтической активности антител к Апд-2.

Фармакокинетические свойства поликлональных антител к Апд-2 кролика, полученных путем очистки при использовании белка С, исследовали на мышах. Двадцати четырем мышам вводили поликлональные антитела кролика к Апд-2 (1мг в расчете на мышь). Четырех животных умерщвляли в следующие временные точки после инъекции антител: один час, шесть часов, один день, три дня, семь дней, четырнадцать дней.

Результаты свидетельствуют, что общая фракция 1§С кролика имеет вычисленное время полужизни в сыворотке примерно 19 дней, в то время как 1дС к Апд-2, содержащийся в общей фракции, имеет время полужизни примерно 8 дней.

Для достижения терапевтической эффективности мышам (10 животных в группе), имеющим А431 ксенотрансплантат опухоли, вводили интраперитонеально 10 доз (доза около 10 мг 1дС для одной мыши) поликлональных антител к тАпд-2, очищенных с помощью белка С, на 1,5, 6, 7, 12, 13, 14, 15 и 18 день

- 51 010726 после ксенотрансплантации. Размеры опухоли измеряли на 7, 12, 15, 19 и 21 день. Вес животных измеряли на 0,7,15 и 21 день. Результаты исследования показали, что поликлональные антитела к Апд-2 ингибировали рост опухолевого ксенотрансплантата А431 примерно на 50% с р=0,008 по сравнению с неиммунной очищенной сывороткой, содержащей поликлональные антитела (доза 10 мг [дС для одной мыши) и растворителем (РВ8); результаты получены с помощью повторных измерений при использовании АХОУА.

Для оценки эффективности полноразмерных моноклональных антител к Апд-2 человека ш у1уо мышам (10 животных в группе), несущим А431 ксентотрансплантат опухоли, интраперитонеально вводили как антитела к Апд-2, клоны 533, 537 или 544, так и негативный контроль, включавший РВ8 или каппа цепь ^С1 человека. Первая доза составляла 420 мкМ белка для одной мыши, последующие три дозы составляли примерно 140 мкМ белка для каждой мыши, последующие четыре дозы составляли примерно 55 мкМ белка для каждой мыши, всего каждой мыши вводили 8 доз. Объем опухоли и вес животных измеряли дважды в неделю. По окончании исследования животные были умерщвлены, и в их сыворотке измеряли уровень антител с помощью ЕЫ8А. Опухолевую ткань и образцы нормальной ткани забирали у всех групп животных.

В результате исследования были обнаружены значительные различия в росте опухоли у группы животных, получавшей антитела к Апд-2, и у контрольной группы животных; эти результаты показаны на фиг. 1. В результате всех трех курсов терапии антителами к Апд-2 было выявлено ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольными группами (во всех трех случаях р<0,005 по сравнению с ЫдС1контролем; данные получены при повторном использовании АNОVА). Напротив, у контрольной группы животных рост опухоли продолжался со значительно большей скоростью.

Пример 6. Эпитопное картирование.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные (аминокислоты 1-495), Νконцевые (аминокислоты 1-254) и С-концевые (аминокислоты 255-495) белки Апд-2 человека (БАпд-2), клонировали в вектор экспрессии млекопитающих с С-концевыми метками 6хН18, включающий промотор СМУ. Три полученных таким образом конструкта и вектор-контроль транзиторно экспрессировали в 293Т клетках. Кондиционированную среду отделяли от транфицированных клеток и измеряли в ней уровень экспрессии Апд-2 при использовании анти-6х1и8 ЕЫ8А и Вестерн-блоттинга.

Связывающие эпитопы антител к Апд-2 и пептител определяли по их способности связывать три варианта Апд-2 человека при использовании ЕЫ8А в соответствии со следующей схемой: планшет с 96 лунками и высокой связывающей способностью покрывали кондиционированной средой из расчета 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Кондиционированную среду отсасывали, планшет блокировали 5% В8А в РВ8 из расчета 200 мкл на лунку при комнатной температуре в течение 1 ч. Блокирующий раствор отсасывали. Добавляли антитела, пептитела или Т1е2-Ес в концентрации 1 мкг/мл в 1% В8А в РВ8 из расчета 100 мкл на лунку, и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Лунки отмывали 4 раза 200 мкМ 0,1% Тетееп в РВ8. Добавляли НЯР-конъюгированные антитела козы к ^С человека или антитела козы к ^С мыши из расчета 100 мкл на лунку, планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Лунки отмывали 4 раза 200 мкл 0,1% Тетееп в РВ8. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл ТМВ-субстрата. Оптическую плотность определяли при длине волны 370 нм.

Результаты приведены здесь на фиг. 2А, 2В и 2С.

- 52 010726

Список последовательностей <110> Амген Инк.

<12О> Антиопоэтин-2-связывающие агенты;

<13О> д-722а <140> Еще не установлено;

<141> 2002-10-11 <150> Ы5 60/328,604 <151> 2001-10-11 <160> 76 <170> Версия РаЬеп! Ιη 3.1 <210> 1 <211> 123 <212> РКТ <213> Ното зарт епз <400> 1

бТи

УаТ

61п

ьеи

Уа1

61 и

Бег

бТу

61 у

б1у

Уа1

УаТ

61 η

Рго

СТу

Агд

1

5

10

15

Бег

Ьеи

Агд

ьеи

Бег

С_У5

АТа

Бег

61 у

РЬе

ТЬг

РЬе

Бег

Туг

20

25

30

61 у

Мет

НТ 5

тгр

УаТ

Агд

61 η

А1а

Рго

С1у

ьуз

61 у

ьеи

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

А Та¹

т4е

Зег

сТу

Бег

сТу

бТу

Бег

тИг

Туг

АТа

АЗр’

•Бег»

УаТ

50

55

60

ЬУЗ

СТ у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Агд

АЗр

АЗП

АТ а

ьуз

АЗП

Бег

ьеи

туг

70 75 80

- 53 010726

ьеи

01 η

мет

АЗП

Бег

Теи

Агд

А1а

01 и

А5р

ТЬг

А1а

ν₃Ί

туг

Туг Суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Ьеи

ьеи

Азр

Туг

Азр

11 е

ьеи

ТЬг

С1у

Рго

Туг

А1а Туг

100

105

110

тгр

С1у

С1 η

01 у

ТЬг

ьеи

Уа1

тНг

Уа1

5ег

Бег

115 120

<210>	2
<2И>	112
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз

<400> 2

Азр 1

11 е Уа1

мег

тЬг 01η Бег рго 5

ьеи

Бег ьеи 10

Рго Уа1 тЬг

Рго 15

с1у

01 и

РГО

А1а

Бег

11е

Бег

суз

Агд

Бег

5ег

01 η

Бег

Ьеи

ьеи

Нтз

5ег

20

25

30

Азп

01 у

туг

АЗП

туг

ьеи

АЗр

тгр

туг

ьеи

01 η

ьуз

РГО

01 у

01 η

5ег

35

40

45

РГО

01 п

Ьеи

ьеи

11е

туг

Ьеи

О1у

Бег

АЗП

Агд

А1а

Бег

О1у

уа!

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Бег

01 у

Бег

01 у

Бег

01 у

ТНг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ьуз

11е

65

70

75

50

Бег

Агд

Уа1

01 и

А1а

61 и

АЗР

Уа1

01 у

уаЛ

Туг

Суз

мет

01 η

А1а

85

90

95

Ьеи

С1п

ТЬг

Рго

рго

ТЬг

рЬе

01 у

С1у 01 у

ТЬг

ьуз

Уа1

01 и

11 е

ьуз

100

105

110

<210>	3
<211>	123
<212>	РР.Т
<213>	ното

<400> 3

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 О1п Бег С1у А1а с1и Уа1 ьуз ьуз рго С1у Бег

10 15

- 54 010726

Зег

Уа1

ЬУЗ

Уа1

Зег

СУЗ

ьуз

А1а

Зег

о1у

01 у

ТЬг

РЬе

Зег

5ег

туг

20

25

30

А1а

11е

Зег

тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

с! у

01 п

01 у

ьеи

01 и

Тгр

мег

35

40

45

61 у

11 е

11е

рго

11 е

РЬе

01 у

ТЬг

А1а

Азп

туг

А1а

01 η

ьуг

РЬе

50

55

60

61п

01 у

Агд

Уа1

ТЬг

11 е

тЬг

А1а

Азр

б1и

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

туг

65

70

75

80

мет

61 и

Ьеи

Зег

ьеи

Агд

5ег

01 и

АЗр

тЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

01 у

Уа1

с! у

Азр

РЬе

Азр

Тгр

ьеи

Зег

РЬе

АЗр

туг

100

105

110

Тгр

01 у

01 η

01 у

ТНг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115 120

<210>	4
<211>	107
<212>	ΡΚΤ
<213>	Ното зартепз

<400> 4

Зег 1

Туг

01 и

Ьеи

ТЬг 61 η Рго Рго Зег Уа1

Зег

Уа1

Зег

Рго

61 у 15

61л

5

10

ТЬг

А1а

Зег

Не

ТЬг

суз

зег

61 у

Азр

ьуз

Ьеи

01 у

Туг

ТЬг

Туг

ТНг

20

25

30

зег

Тгр

РЬе

61л

61 η

ьуз

Рго

61 у

61л

Зег

Рго

Уа1

Ьеи

Уа1

11е

РЬе

35

40

45

61л

АЗр

рЬе

ьуз

Агд

Рго

Зег

01 у

11 е

Рго

61 и

Агд

РЬе

Зег

С1у

зег

50

55

60

АЗП

Зег

61 у

АЗЛ

ТКг

А1а

тЬг

ьеи

ТНг

Не

Зег

61 у

ТЬг

01 п

А1а

МеТ

65

70

75

80

Азр

61 и

А1а

Азр

туг 85

Туг

Суз

61л

А'Та

Тгр 90

АЗР

зег

ТЬг

ТНг

А1а 95

уа!

рЬе

61 у

тЬг

61у

ТНг

ьуз

Уа1

ТЬг

уа!

Ьеи

100 105

- 55 010726

<210>	5
<211>	120
<212>	РйТ
<213>	Ното гарт епз

<400> 5

с!и

Уа1

61 η

беи

уа!

с! п

Зег

С1 у а! а

б! и

уа!

6У5

буг

РГО

61 у

Зег

1

5

10

15

Зег

уа!

ьуз

Уа1

Зег

суг

ί-уэ

А!а 5ег

61 у

С1 у

ТЬг

РЬе

Зег

Туг

20

25

30

д!а

11е

Зег

тгр

Уа!

Агд

61 η

А1а Рго

61 у

61 η

61у

беи

61 и

Тгр

мет

35

40

45

61 у

11 е

11е

РГО

11е

беи

с! у 11е

А1 а

А5ГТ

Туг

А1 а

с! п

буз

РЬе

50

55

60

61 п

61 у

Агд

Уа!

ТЬг

Не

ТВ г

А1а АЕр

бу5

Зег

ТЬг

АЗП

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мег

61 и

беи

тЬг

Зег

1еи

ТЬг

Зег АЗр

А5р

ТЬг

а! а

уа!

Туг

Суз

Е5

90

95

д'! а

дгд

АЗр

Агд

С! и

А5р

тЬг

а!а мег

Уа!

РЬе

АЗП

туг

Тгр

61 у

61 η

100 105 НО

61у ТЬг Ьеи «а.1 ТЬг уа! £ег Зег

	115
<210>	6
<211>	111
<212>	рйт
<213>	Ното
<400>	6

61 η 1

Зег Уа1

1_еи

ТНг 5

61 п

Рго

Бег

Уа! 10

Зег А1а А1а

РГО

61у 15

С7п

буз

Уа1

тЬг

Уа1

Бег

Суз

Зег

61 у

Бег

Зег

А5П

11е

61 у

АЕП

А5П

20

25

30

туг

Уа1

Зег

Тгр

Туг

61 η

беи

Рго

61 у

ТЬг

д!а

Рго

буз

беи

ьеи

40 45

- 56 010726

11 е

Туг

А5р

АЗП

куз

Агд

рго

зег

61 у

Не

Рго

АЗр

Агд

Рйе

Зег

50

55

60

61 у

$ег

Зег

61 у

ТЬг

Зег

а! а

тЬг

ьеи

61 у

Пе

ТЬг

61 у

Ьеи

61 η

65

70

75

80

ТЬг

61 у

А$р

61 и

д!а

Азр

туг

суз

61 у

ТЬг

Тгр

АЗр

Зег

ьеи

85

90

95

зег

А1а

РЬе

Тгр

Уа1

РЬе

61 у

61у

б1у

Тйг

ί-№

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

100

105

110

<210>	1
<211>	122
<212>	РРТ
<213>	Нотпо зарт епз

<400> 7

61 и

уа1

61 п

ί Ьеи

Уа1

61 η

Зег

С1у

61 у

уа!

Уа1

61 п

Рго

61 у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

суз

А1 а

А1а

5ег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

зег

Зег

Туг

20

25

30

С1у

МеЬ

НТ Б

тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

Рго

61 у

ьуз

61у

Ьеи

61 и

т гр

ν&1

35

40

45

Зег

Туг

11 е

Зег

зег

с)у

Зег

ТЬг

11 е

туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61 у

Агд

РЬе

ТЬг

11 е

зег

Агд

АЗр

Азп

А1а

ьуз

АЗП

Зег

ьеи

туг

65

70

75

80

ьеи

С1п

Меъ

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61 и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

туг

суз

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Ьеи

Азр

Туг

Азр

11 е

ьеи

Тог

61 у

туг

С1у

Туг

Тгр

100

105

110

б!у

61 п

61 у

ТЬг

Ьеи

Уа1

тЬг

уа!

Зег

зег

	115
<21О>	8
<211>	106
<212>	РКТ
<213>	Нотпо

- 57 010726

<40

0>

8

Зег

туг

СЗи

Ьеи

тЫ

СЗ η

Рго

Зег

УаЗ

Зег

УаЗ

Зег

Рго

СЗу

СЗп

1

5

10

15

ТЬг

дЗа

Агд

тЗе

тЫ

суз

Зег

СЗу

АЗр

АЗа

ьеи

РГО

ьуз

СЗп

туг

дЗа

20

25

30

Туг

тгр

Туг

сЗп

СЗп

Ьуз

Рго

СЗу

СЗп

дЗа

Рго

УаЗ

ьеи

УаЗ

13 е

Туг

35

40

45

ьуз

А5р

Зег

СЗ и

дгд

Рго

зег

сЗу

13 е

рго

СЗи

дгд

рИе

5ег

сЗу

Зег

50

55

60

Зег

сЗу

тбг

ТЫ

УаЗ

ТЫ

Ьеи

Пи-

13е

сЗу

УаЗ

СЗп

аЗ а

сЗ и

65

70

75

ВО

АЗр

сЗи

АЗ а

АЗр

Туг

Суз

СЗп

Бег

дЗа

АЗр

Зег

5ег

Н1 5

уаЗ

УаЗ

85

90

95

рйе

сЗу

сЗ у

СЗу

ТЬг

ьуз

Ьеи

ТЬг

УаЗ

Ьеи

100 . 105 <210>9 <211> 121 <212> РРТ <213> Ното зартепз <400>9

СЗп таЗ СЗп ьеи УаЗ сЗп зег сЗу дЗа сЗи УаЗ ьуз Ьуз Рго сЗу зег 15 1015

Зег УаЗ ьуз уаЗ зег Суз ьуз дЗа Зег сЗу СЗу тЬг РЬе зег Зег Туг

2530

АЗа

13 е

5ег

Тгр

УаЗ

Агд

СЗп

АЗ а

Рго

СЗу

СЗп

СЗу

ьеи

СЗи

тгр

мес

35

40

45

СЗу

сЗу

11е

13е

Рго

13 е

рЬе

СЗу

тЫ

АЗа

АЗП

туг

дЗа

СЗп

ьуз

рЬе

50

55

60

сЗ η

СЗу

Агд

УаЗ

ТНг

13 е'

ТЫ

АЗа

А5Р

ьуз

зег

тЫ

зег

ТЫ

аЗ а

туг

65

70

75

80

мет

СЗи

ьеи

зег

Зег

ьеи

Агд

Зег

сЗи

А5р

ТЫ

дЗа

уаЗ

Туг

туг

суз

85

90

95

- 58 010726

А1а д1а РЬе

Зег Рго рЬе тЬг 61 и ТЬг Азр д!а РЬе Азр 11 е Тгр 61 у

100 105 110 η 61 у ТЬг мет Уа1 тЬг уа! 115

Зег зег

120

<210>	10
<211>	112
<212>	РРТ
<213?	Ното зар-ί епз

<40

О>

10

61л

5ег

Уа1

ьеи

ТЬг

61л

Рго

Зег

Уа1

5ег

А1а

Рго

61 у

61п

1

5

10

15

ьуз

Уа1

ТЬг

Не

Зег

Суз

Зег

61 у

Зег

АЗП

Зег

АЗП

11 е

61 у

АЗП

АЗЛ

20

25

30

Рке

уа!

Зег

Тгр

Туг

61 η

61п

Цеи

РГО

61 у

тЬг

А1а

Рго

ьуз

1_еи

ьеи

35

40

45

Уа1

туг

Азр

А£П

АЗП

туз

Агд

Рго

Зег

61 у

11е

Рго

АЗр

Агд

₽Ье

5ег

50

55

60

61 у

Зег

Ьуз

Зег

61у

ТЬг

Зег

А1а

тЬг

Ьеи

61 у

11е

ТЬг

б!у

ьеи

61л

65

70

75

80

ТЬг

б!у

Азр

61 и

А1а

АЗр

Туг

туг

Суз

61 у

ТЬг

Тгр

АЗР

Зег

1_еи

85

90

95

Зег

А1а

61и

уа1

уа!

рНе

61у

61 у

ТЬг

туз

теи

ТЬг

Уа1

Теи

100	105	110
<210>	11
<211>	122
<212>	РРТ
<213>	Ното	гарт еп5

<40С> 11

61 и 1

уа!

61л Теи

Уа1 5

61л Зег

61 у 61 у

61 у 10

уа!

61л

Рго

61у 15

дгд

Зег

1еи

Агд Теи

Зег

суз

А1 а

А1а

Зег

61 у

рЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Туг

20

25

30

- 59 010726

61 у

мег

НТ 5

Тгр

Уа1

Агд

61 п

А1 а

Рго

01 у

ЬУ5

61 у

геи

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Туг

11 е

Зег

5ег

б!у

Зег

ТЬг

11е

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

ЬуЗ

61 у

Агд

РНе

тЬг

11 е

Зег

Агд

АЗр

АЗП

А1а

ьуз

АЕП

Зег

Ьей

Туг

65

70

75

80

Геи

61 п

мег

АЗП

5ег

геи

Агд

А1а

61 и

АЕр

ТЬг

А1а

Уа1

туг

Туг

Суз

65

90

95

А1 а

Агд

АЗр

Ьей

Геи

АЕр

Туг

АЕр

Не

Ьей

ТЬг

61 у

туг

61 у

Туг

тгр

100

105

110

61 у

61 η

61 у

тНг

Геи

уа!

ТЬг

Уа1

Зег

115

120

<210>	12
<211>	112
<212>	ΡΚΤ
<213>	Ното ЕартепЕ

<400> 12

АЕр 1

11 е

Уа1

мег тЬг 61 η 5

Зег Рго

Геи

5ег ьей 10

Рго Уа1

тЬг

РГО 15

61 у

61 и

рго

А1 а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

61л

Зег

геи

Ьей

НТ 5

Зег

20

25

30

АЕП

61 у

туг

АЗП

туг

Геи

Азр

Тгр

туг

ьей

61 η

Гуз

РГО

61 у

61 η

Зег

35

40

45

РГО

61 η

Геи

11 е

туг

геи

61 у

5ег

АЗП

Агд

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

АЕр

Агд

рЬе

зег

61 у

5ег

61у

Зег

61 у

ТЪг

Азр

РЬе

ТЬг

Геи

гуз

11 е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

61 и

А1а

61 и

АЕр

уа1

61 у

Уа1

туг

Туг

Суз

Мет

61 η

61 у

85

90

95

ТЬг

Нт 5

Тгр

Рго

Τϊτγ

РНе

61 у

61 η

61 у

ТПГ ту5

ьей

61 и

11е

ьуз

100 105 НО <210> 13 <211> 119

- 60 010726 <21Ξ> ΡΚΤ <213> Ното зарт епз

<400>

13

СТ η

УаТ

СТп

Сеи

УаТ

61 п

Бег

61 у

АТа

61 и

УаТ

ЬУЗ

ьуз

РГО

61 у

Бег

1

5

10

15

Бег

УаТ

су 5

УаТ 20

Бег

Суз

Ьуз

А1а

Бег 25

61 у

ТЬг

РЬе

Бег 30

Бег

Туг

А1а

гТе

Бег

Тгр

УаТ

Агд

СТп

А1а

Рго

61 у

б1п

сТу

Сеи

61 и

тгр

мех

35

40

45

СТу

11е

Не

Рго

11е

Ьеи

С1у

11 е

А1а

АБП

Туг

АТа

61л

ьуз

РЬе

50

55

60

61 п

61у

Агд

УаТ

ТЬг

Не

ТЬг

А1а

АБр

ьуз

Бег

тЬг

зег

ТЬг

дТа

Туг

65

70

75

80

мех

61и

сеи

Бег

бТу

Сеи

СТу

Бег

61 и

АБр

ТЬг

дТа

Уа!

туг

Туг

СУБ

85

90

95

а! а

Ага

61 ν

Бег

А5О

АТ а

д1а

уа!

А1 а

61 ν

мех

тго

61 ν

61 η

61 ν

100 105 110

ТЬг Ьеи УаТ тЬг УаТ Бег Бег

115

<210>	14
<211>	111
<212>	РРТ
<213>	ното

<40О> 14

61 η 1

Бег уа!

ьеи тЬг 61 п 5

РГО РГО

Бег Уа1 10

Бег

А1а

РГО

б1у 15

61 η

АБр

УаТ

ТЬг

1Те

Бег

Суз

Бег

61 у

АЗП

Азп

Бег

Азп

11е

61 у

АБП

Азп

20

25

30

туг

Уа!

Бег

тгр

туг

61 η

61 п

Уа!

РГО

61 у

ТЬг

дТа

РГО

ьуз

ьеи

Сеи

35

40

45

УаТ

Туг

АБр

АБП

НТ 5

ьуз

Агд

РГО

Бег

61у

11е

Бег

АЗр

Агд

рЬе

Бег

55 60

- 61 010726

61 у

бег

ьу5

бег

Азр

ТЬг

бег

А1а

тЬг

Ьеи

дзр

11 е

ТЬг

61 у

Ьеи

61 η

65

70

75

80

РГО

61 у

А5Р

61 и

А1 а

Азр

Туг

туг

Суз

61у

ТЬг

тгр

Азр

ТЬг

бег

Ьеи

85

90

95

бег

А1а

А5Л

тгр

Уа!

РЬе

61 у

ТЬг

Ьуз

ьеи

ТЬг

уа!

ьеи

100

105

110

<210>	15
	120
<212>	РРТ
<213>	Ното
<4ОО>	15

61 η

Уа!

61Л

ьеи

уа!

61л

бег

С1у

А1а

61 и

Уа!

1/5

ьуз

Рго

61 у

бег

1

5

10

15

бег

Уа!

ьуз

Уа1

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

61 у

ТЬг

РЬе

бег

туг

20

25

30

А1а

11е

бег

тгр

Уа1

лгд

61 η

А1а

Рго

61 у

61 п

61 у

ьеи

61 и

тгр

мет

35

40

45

61 у

11 е

Не

рго

11 е

ьеи

61 у

11е

д!а

АЗЛ

Туг

А1а

61л

ьуз

рЬе

50

55

60

С1л

61 у

дгд

уа!

ТЬг

т!е

ТЬг

А1а

АЗр

ьуз

рЬе

ТЬг

бег

ТЬг

д1 а

туг

65

70

75

80

мег

61 и

ьеи

бег

ьеи

61 у

бег

61 и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

туг

Суз

85

90

95

д!а

Агд

А1а

уа!

Рго

с! у

тЬг

61 и

Азр

а! а

РЬе

АЗр

Не

тгр

61 у

С1п

100

105

110

61 у

ТЬг

мег

Уа!

ТЬг

Уа!

бег

Зег

115

120

<210>	16
<211>	111
<212>	РЯТ
<213>	Ното
<400>	16

- 62 010726

С1Г> 1

Зег

Уа1

ьеи

ТЬг 5

61 п

Рго

рго Зег «а! 10

Зег

А1а А1а

Рго

61 у 15

61 п

Гуз

Уа1

ТЬг

11 е

5ег

Суз

Зег

61 у

зег

Зег

АЗП

Не

61 у

А1а

АЗП

20

25

30

туг

Уа1

Зег

Тгр

туг

61 η

61 п

ьеи

Рго

о! у

ТЬг

А1а

Рго

ТУ5

Теи

Ьеи

35

40

45

Не

туг

АЗП

туз

Агд

рго

Зег

61 у

Не

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

С1у

Зег

ьуз

Зег

А5р

ТЬг

Зег

А1а

тпг

ьеи

61 у

11 е

тИг

61 у

геи

61 η

€5

70

75

80

ТЬг

б!у Азр

61 и

А1 а

Азр

туг

Туг

Суз

61 у

А1а

тгр

Азр

Зег

зег

геи

85

90

95

Зег

а! а

Зег

тгр

уа!

РЬе

61 у 61 у

б!у

ТНг

ьуз

ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

100 105 110

<210>	17
<211>	123
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	17

61 п 1

Уа1 61п

геи

Уа1 5

ΰΐ η

Зег С1у А1а 61и 10

Уа1

Гуз Гуз

Рго 61у Зег 15

Зег

Уа1

ьуз

Уа1

Зег

Суз

туз

а! а

Зег

С1у 61у

ТЬг РЬе

Зег

Туг

20

25

30

А1а

Не

5ег

Тгр

Уа1

Агд

61 η

А1а

Рго

61у 61п

61 у Геи

61 и

Т гр

Мет

35

40

45

61 у

Агд

11е

11 е

РГО

11е

Геи

61 у

11 е

А1а

Азп

Туг А1а

61 п

гуз

РЬе

50

55

60

61 η

61 у

Агд

уа1

ТЬг

Г1е

ТЬг

А1а

Азр

туз

Зег

тЬ г Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

мет

61 и

{_еи

зег

Зег

ьеи

Агд

Зег

61и

Азр

ТНг

А1а Уа1

туг

СУ 5

85

90

95

А1а

Агд

Рго Туг

Туг

АЗр

РЬе

тгр

Зег

61 у

Рго

61 у 61 у

МеГ

А5р

уа!

100

105

110

- 63 010726

зег зег

115

120

<210>	18
<211>	112
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз

<4ОО> 18

АЗр 1

11 е

Уа!

мех ТЬг 61п 5

Зег Рго

цен Зег 1_еи 10

рго Уа!

ТЬг

РГО 15

61 у

61 ц

Рго

А1а

Зег

Не

Бег

Суз

лгд

Зег

61 п

зег

Ьеи

!_еи

ΗΊ 5

Зег

20

25

30

АЗП

61 у

Туг

АЗП

Туг

кеи

Азр

Тгр

Туг

кеи

61 η

ьуз

Рго

61 у

61 п

зег

35

40

45

РГО

61 η

к ей

кеи

Пе

Туг

1_еи

61 у

Зег

АЗП

Агд

А1 а

Зег

61 у

Уа1

Рго

50

55

60

А5р

Агд

РЬе

5ег

б1у

Зег

61 у

Зег

61 у

ткг

Азр

РЬе

ТЬг

кеи

куз

11е

65

70

75

80

зег

Агд

Уа1

б!и

А1а

61 и

АЗр

Уа!

61у

Уа1

туг

Туг

Суз

мег

61 η

А1а

85

90

95

1_еи

61 п

ТЬг

РГО

кеи

Тпг

рЬе

61 у

ткг

!_УЗ

уа!

61и

Не

6У5

100	105	110
<210>	±9
<211>	121
<212>	РЙТ
<213>	Ното	5артеп5

<400> 19

61 η

уа1

61 п

цеи

Уа1

61 η

Зег

61 у

А1а

61 и

Уа!

куз

Рго

61 у

а! а

1

5

10

15

Зег

Уа!

куз

Уа1

зег

Суз

1_уз

а! а

Зег

<?1‘У

61 у

ТЬг

РЬе

Зег

туг

20

25

30

А1а

Не

Зег

Тгр

Уа!

Агд

61 η

А1а

рго

61 у

61 п

61 у

Ьеи

61 и

Тгр

мет

40 45

- 64 010726

<51У

61 у

11 е

Рго

11 е

рЬе

61 у

ТНг

А1а

Азп

Туг

А1а

б!п

туз

РЬе

50

55

60

01 η

61 у

Агд

Уа1

ТО г

11е

ТЙГ

А1а

АЗР

61и

Бег

тЬг

Бег

ТЬг

А1а

туг

65

70

75

80

МеТ

61 и

Теи

Бег

Ьеи

Агд

Бег

61 и

Азр

ТЬг

А1 а

Уа1

туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

рНе

61 и

Бег

61 у

туг

тгр

61 у

АЗр

А1а

РЬе

АЗр

Не

тгр

61 у

100

105

110

п С1у ТЬг Мет Та! тЬг Уа1 Бег Бег

	115
<210>	20
<211>	112
<212>	РЙ.Т
<213>	ното
<400>	20

Азр

11е Уа1

мет

ТЬг

61 η

Бег

Рго

теи

Бег

Теи

рго

Уа1

тЬг

Рго

61у

1

5

10

15

61 и

Рго А1а

Бег

Не

Бег

суз

Агд

Бег

61 η

Бег

теи

ΗΊ5

Бег

20

25

30

АЗП

61 у Туг

АЗП

Туг

теи

АЗП

Тгр

туг

теи

61η

туз

РГО

61 у

61 П

Бег

35

40

45

Рта

61 п 11е

Теи

11е

туг

теи

61 у

Бег

Азп

Агд

А1 а

Бег

61 у

Уа1

Рго

50

55

60

АЗр

Агд РЬе

Бег

С1у

Бег

61 у

Бег

61 у

ТЬг

Азр

РЬе

ТНг

Теи

туз

Не

65

70

75

80

Бег

Агд Уа1

61 и

А1а

61 и

АЗр

Уа1

61 у

Уа1

Туг

суз

мет

61 η

61 у

85

90

95

теи

61п ТЬг

Рго

ТЬг

рЬе

61у

С-.1 п

61 у

ТЬг

туз

ьеи

61 и

11 е

туз

100

105

110

<210>	21
<211>	123
<212>	РЕТ
<213>	ношо

- 65 010726 <400> 21

61η

\/а1

61 η

ьеи

61 п

61 и

зег

б!у 61 у

61 у

νπΐ

уа!

61 η

Рго

61 у

Агд

1

5

10

15

Зег

Беи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

д!а Зег

61 у

рЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Бег

туг

20

25

30

€1у

мет

НТ 5

Тгр

Уа7

Агд

6ΐη

д!а Рго

61 у

ьуз

01 у

Ьеи

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

д1а

Уа1

Не

Зег

туг

АЗр

01У

Зег Азп

ьуз

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

ьуз

01 у

Агд

РЬе

тЬг

11 е

Зег

дгд АЗр

А5П

Зег

ьуз

АЗП

ТЬг

ьеи

Туг

65

70

75

80

ьеи

61 η

мет

АЗП

зег

ьеи

Агд

А1а 61 и

АЗр

ТЬг

д1а

Уа1

туг

Туг

Суз

85

90

95

д7а

1_уз

01 у

Рго

Уа1

АЗр

РЬе

Азр туг

б7у

АЗр

туг

А1а

11е

АЗр

Туг

100

105

110

Тгр

61 у

61 η

61у

ТЬг

ьеи

7=1

ТЬг Уа1

Зег

115 120

<210>	22
<211>	111
<212>	РРТ
<213>	Ното

<400> 22

61 п

Зег

Уг1

ьеи

тЬг 61 η

Рго

Зег

Уа1

Зег

61 у

А1а

Рго

61 у

61 η

1

5

10

15

Агд

уа!

тЬг

Х1е

Бег Суз

тЬг

61 у

61 п

Бег

Зег

АЗП

11 е

61 у

А1 а

61у

20

25

30

туг

Азр

Уа1

НТ 5

Тгр Туг

61 п

61 η

РЬе

Рго

61 у

Агд

А1а

РГО

ьуз

Ьеи

35

40

45

Ьеи

11 е

туг

61 у

Азп Бег

Азл

Агд

Рго

Зег

61 у

Уа1

Рго

АЗр

Агд

РЬе

50

55

60

Зег

61у

Бег

Ьуз

Бег 61у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

Ьеи

А1а

11 е

ТЬг

01 у

ьеи

65

70

75

80

- 66 010726 π Рго 61 и Азр 61 и А1а Азр Туг Туг

Суз 61п Зег туг Азр зег Агд

95 ьеи Зег 61у Зег уа! РЬе 61 у 61 у 61 у ткг ьуз ьеи Тпг уа! ьеи

100 105 но

<210>	23
<211>	123
<212>	РКТ
<213>	нолю зартепз

<40

0>

23

61и

Уа1

61 п

ьеи

ча!

АЗр

зег

61 у

С1у

б!у

Ьеи

уа1

61 п

Рго

61 у

1

5

10

15

5ег

ьеи

Агд

ьеи

Зег

суз

А1а

Зег

61 у

РЬе

ТНг

РЬе

Зег

туг

20

25

30

А1а

мет

5ег

Тгр

Уа1

Агд

61 η

А1а

РГО

61 у

ьуз

61 у

ьеи

61 и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

д1а

11 е

Зег

б1у

Зег

61 у

С1у

Зег

ТНг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

61 у

Агд

рЬе

тЬг

Пе

зег

Агд

А$р

АЗП

Зег

Ьуз

АЗП

ТЙГ

ьеи

туг

65

70

75

80

Ьеи

61 η

мет

АЗП

Зег

Ьеи

Агд

А1а

61 и

АЗР

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

д!а

Ьуз

61 и

ТЙГ

11 е

Зег

рНе

зег

ТЙГ

рЬе

Зег

61у

Туг

рЬе

АЗР

Туг

100

105

110

тгр .

А1а

61 η

61у

тЬг

ьеи

Уа1

тЬг

Уа1

Зег

115 120

<210>	24
<211>	110
<212>	рйт
<213>	Ното	зарпепз
<400>	24
61 η 5ег	уа!	ьеи тНг Рго Зег зег νπΐ зег С7и а!з рго Агд сТп

10 15

- 67 010726

Агд

Уа!

ТЬг

Не

Бег

Суз

Бег

5! у Бег

а! а

Бег

АЗП

Не

61 у

А1а

АЗП

20

25

30

61 у

уа!

Бег

Тгр

туг

ΗΊ5

С! η

Уа! рго

61 у

Ь_У5

А1 а

РГО

Агд

Геи

35

40

45

Ьеи

Бег

ΗΊ5

АБр

С! у

геи

Уа!

ТЬг Бег

61 у

Уа!

Рго

АБр

Агд

Геи

Бег

50

55

60

Уа!

Бег

суз

Бег

61у

тЬг

Бег

а!а Бег

1_еи

а! а

Не

Бег

61 у

геи

Н15

65

70

75

60

Бег

А5р

с! и

с! у

АЗр

Туг

Туг Су5

а! а

Уа!

тгр

АБр

Азр

Бег

геи

В5

90

95

АЗП

А1а

Уа!

РЬе

С1у

с! у

с!у ТЬг

ЦУ5

Ьеи

тЬг

Уа!

ьеи

100

105

по

<210>

25

<211>

124

<212>

РЯТ

<213>

Ното

гарпепз

<40

Ό>

25

61 η

Уа!

61 η

Геи

уа!

61 п

Бег

61 у

А1 а

С1и

Уа1

ьуз

Рго

С1у

Бег

1

5

10

15

Бег

уа!

Ьуз

Уа1

Бег

Суз

!_У5

А1 а

Бег

61 у

тНг

РЬе

Бег

Туг

20

25

30

А1 а

11 е

Бег

тгр

Уа1

Агд

61 η

А1а

Рго

б!у

с1п

61 у

Геи

61 и

тгр

мет

35

40

45

61 у

Не

11е

Рго

11 е

РЬе

61 у

тЬг

А1а

АЗП

Туг

А1а

61 η

гуз

РЬе

50

55

60

61 η

61 у

Агд

Уа!

ТЬг

Не

ТЬг

А1 а

Азр

С1и

Бег

тЬг

Бег

тЬг

а! а

Туг

65

70

75

80

мег

61 и

Геи

Бег

Геи

Агд

Бег

61 и

Азр

тЬг

А1а

уа1

Туг

туг

суз

85

90

95

А1а

Агд

61 у

Туг

АБр

РЬе

Тгр

Бег

61 у

туг

Бег

Геи

АЗр

а1 а

РЬе

АЗр

100

105

110

Не

Тгр

61 у

61 η

61 у '

ТЬг

мет

уа!

ТЬг

Уа!

Бег

115 120

- 68 010726

<210>	26
<211>	112
<212>	РКТ
<213>	ното
<400>	25

А5р

11 е

: Уа1

меТ

ТЬг 61п

5ег

Рго

беи

Зег

беи

Рго

Уа!

тЬг

РГО

61 у

1

5

10

15

61 и

Рго

А1а

Зег

Не Зег

суг

Агд

Зег

61 η

Зег

беи

Нт 5

Зег

20

25

30

АЗП

61 у

Туг

АЗП

Туг беи

АЗр

Тгр

Туг

беи

61 η

буз

Рго

61 у

61 η

зег

35

40

45

РГО

61 п

беи

11е туг

беи

61 у

Зег

АЗП

Агд

А1а

Зег

61у

Уа!

Рго

50

55

50

АЗр

Агд

РЬе

Зег

б!у Зег

61 у

Зег

61 у

тЬг

лзр

РЬе

ТЬг

беи

буз

11 е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа!

61и

А1а С1и

АЗр

7а1

61у

Уа!

туг

Суз

МеТ

61 п

а! а

85

90

95

беи

61 η

ТЬг

рго

беи ТЬг

РЬе

61 у

61у

б!у

тЬг

буз

Уа1

61и

Не

буз

100 105 110

<210>	27
<211>	123
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	27

61п

Уа!

61 η

Теи

уа!

61 η

Зег

61 у

А1 а

61 и

Уа!

буз

туз

рго

б!у

л!а

1

5

10

15

зег

Уа!

1-У5

Уа1

Зег

Суз

буз

а! а

Зег

61 у

туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

20

25

30

а! а

Мет

ΗΊ 5

тгр

Уа!

Атд

б!п

А1а

РГО

61 у

С1п

Агд

беи

61и

Тгр

меТ

35

40

45

61 у

Тгр

Х1е

АЗП

А1а

61у

АЗП

61у

АЗП

тЬг

Туз

туг

Зег

61 η

буз

РЬе

55 60

- 69 010726

οΐπ

01У

Агд

Уа1

ТЬг

И е

тЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

А1 а

Зег

ТЬг

А1а

туг

65

70

75

80

МеТ

С1и

кеи

Зег

01 у

кеи

Агд

Зег

01 и

АЗр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

01 у

Уа1

А5р

Туг

01 у

АЗП

Зег

тгр

А1а

РЬе

Азр

11е

100

105

110

Тгр

С1у

01 п

01 у

ТЬг

мет

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115 120

<210>	28
<211>	112
<212>	РЕТ
<213>	Ното зартепз

<400>28

Азр 1

Не

Уа1

мет ткг 5

01 п Зег

Рго

кеи

зег кеи 10

РГО

Уа1

ТЬг

Рго 15

С1у

01 и

РГО

А1а

Зег

Не

зег

суз

Агд

Зег

01 η

Зег

кеи

ΗΊ 5

зег

20

25

30

АЗП

01 у

Туг

АЗП

туг

кеи

АЗр

Тгр

туг

кеи

01 п

1У5

РГО

01 у

о1п

Зег

35

40

45

Рго

61 η

кеи

Не

Туг

кеи

С1у

Зег

АЗП

Агд

А1а

зег

61 у

уа!

РГО

55 60

Азр Агд РЬе ТЬг С1у Зег С1у Зег д!а тНг Азр РЬе ТЬг кеи Агд 11е 65 70 7580

Зег дгд Уа1 С1и А1а 61 и Азр Уа1 О1у Уа1 Туг Туг Суз мет О1п А1а 85 9095 кеи 01 л тЬг Рго кеи тЬг РЬе б!у 01у С1у ТЬг куз У'а! 01 и Не куз

100 105НО

<210>	29
<211>	128
<212>	РРТ
<213 >	Ното зарт епз

<400>29

- 70 010726

б!п

уа!

61 η

ьеи

61 η

61 и

Зег

61у

61 у

61у

уа!

Уа!

61 п

Рго

61 у

Агд

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

СУ5

А1а

Зег

61 у

РЬе

тЬг

РЬе

5ег

Зег

туг

20

25

30

А1а

МеТ

Н1 5

Тгр

Уа1

Агд

61 η

А1а

РГО

С1у

ьуз

С1у

Ьеи

61 и

Тгр

уа!

35

40

45

а! а

Уа1

Не

Зег

туг

А5р

б!у

5ег

АЗП

ЬУЗ

туг

л1а

АБр

Зег

Уа1

50

55

60

ЬУ5

61 у

Агд

РЬе

тЬг

Не

Зег

Агд

А5р

АЗЛ

Зег

ьуз

Азп

тЬг

ьеи

Туг

65

70

75

80

(.ей

61 η

Мех

АЗП

зег

ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

дгд

Зег

а1 а

Зег

Азр

НТ 5

Туг

АБр

зег

61 у

туг

Туг

зег

100

105

110

АБр .

А1а

РЬе

АБр

Не

тгр

61 у

61 η

61 у

тЬг

мет

уа!

ТЬг

Уа!

Зег

115 120 125

<210>	30
<211>	112
<212>	РРТ
<213 >	нолю зартепз

<400> 30

АБр

11 е

Уа1

мег

тЬг

61 η

зег

РГО

1_еи

Зег

Ьеи

РГО

Уа1

тЬг

Рго

61 у

1

5

10

15

61 и

Рго

А1а

Зег

Не

Зег

СУ5

Агд

Зег

61 η

Зег

Ьеи

ьеи

НТ 3

Зег

20

25

30

АБП

63 у

туг

АБП

туг

ьеи

АБр

тгр

туг

ьеи

61 η

ьуз

РГО

61 у

61 η

Зег

35

40

45

РГО

61 п

ьеи

Ьеи

11 е

Туг

Ьеи

А1а

5ег

АБП

Агд

а! а

Зег

С1у

Уа!

Рго

50

55

60

АБр

Агд

рЬе

зег

61 у

Зег

С1у

Зег

61 у

ТЬг~

АБр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Агд

11 е

65

70

75

80

Зег

Агд

ν^Ι

61 и

а! а

61и

АБр

уа!

61у

Уа!

Туг

туг

СуБ

МеТ

61 п

ТЬг

90 95

- 71 010726 ьеи 61η 11е рго 11е тЬг рЬе б!у рго С1у ТЬг ьуз уа! Азр 11е ьуз

100 105 110

<210>	31
<212>	123
<212>	РР.Т
<213>	ното
<40О>	31

61 п

Уа!

01 η

Ьеи

О1п 61п

Тгр

01 у А1а 01 у

Ьеи

Ьу5

рго

Зег

01 и

1

5

10

15

тЬг

ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг Суз

А1а

Уа!

Туг

61 у

01 у

Зег

РЬе

Зег

б!у

туг

20

25

30

Туг

Тгр

Зег

Тгр

11е Агд

01 η

зег

РГО

61 у

ьуз

О1у

ьеи

61 и

Тгр

11 е

35

40

45

С1у

61 и

11е

АЗП

Нтз Зег

С1у

Зег

ТЬ г

АЗП

РЬе

АЗП

Рго

Зег

ьеи

ьуз

50

55

60

СйГ

АГ5

11 е

тЬг

ΤΊ ύ С а ΐ-

ν&1

Л гл

тЬ г

Саг 1

А с га

А е-га га с? ^4

гт! о

РКв

Сйг

* ОИ

бГ

70

75

во

Ьуз

ьеи

Зег

Уа1 ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

Туг

Суз

А1а

85

90

95

Агд

01 у

Н15

АЗр

Тгр С1у

МеТ

61 у

11е

61 у

С1у

А1а

Туг

Азр

11 е

100

105

110

тгр

б!у

01 η

61у

ТЬг Мет

Уа!

тЬг

Уа!

Зег

115

120

<210>	32
<211>	108
<212>	РРТ
<213>	Ното

<401

Э> 32

61 и

11е Уа!

Ьеи

ТЬг

01 η

Зег

Рго

С1у

ТЬг

Ьеи

зег

ьеи

Зег

Рго

01 у

1

5

10

15

01 и

Агд А1а

ТЬг

ьеи

зег

Суз

Асд

А1а

5ег

01 η

Зег

уа!

5ег

Зег

20

25

30

- 72 010726

Зег

ьеи

д1а

Тгр

Туг

с! η

С! η

ьуз

рго

С! у

б! л

а! а

Рго

Агд

Ьеи

35

40

45

Уа!

Туг

л! а

А1а

Зег

дгд

а! а

тЬг

б! у

Не

Рго

Аар

Агд

Р(те

Зег

50

55

60

с! у

Зег

с! у

Зег

61 у

ТЬг

Аар

РЬе

тЬг

ьеи

ТЬг

Не

Зег

Агд

ьеи

01 и

65

70

75

80

РГО

б! и

дар

рЬе

д! а 85

уа!

туг

суз

с! η 90

НТ 5

Туг

б! у

Зег

5ег 95

Рго

дгд

тЬг

рЬе

01 у

б! η

б! у

ТЬг

ьуа

уа!

С! и

И е

ьуа

100 105

<210>	33
<211>	122
<212>	РРТ
<213>	ното
<400>	33

61η Уа! б! η ьеи Уа! с!п Зег с! у а! а 61 и Уа! 1_у5 Ьуа Рго 61 у а! а

1

5

10

15

Зег

Уа1

Ьуа

Уа1

Зег

Суз

ьуа

уа!

Зег

б!у

туг

тЬг

ьеи

тЬг

61 и

Зег

20

25

30

Зег

МеЬ

НТ 5

Тгр

Уа1

Агд

б!п

д1а

РГО

С1 у

Ьуа

б!у

Ьеи

с! и

Тгр

меь

35

40

45

С1 у

б! у

РЬе

дар

Рго

б! и

нт а

б1у

б! и

тЬг

11 е

туг

А1а

61 л

ьуа

РЬе

50

55

60

С1 η

б!у

Дгд

Ьеи

тЬг

мет

тЬг

С1 и

дар

ТЬг

Зег

ТЬг

Аар

тЬг

А1 а

туг

65

70

75

80

Мет

б! и

Ьеи

зег

Ьеи

Агд

Зег

61 и

дар

тЬг

д!а

уа!

туг

РЬе

Суа

85

90

95

Д1 а

Агд

б! у

Уа1

С! л

Уа!

ТЬг

Зег

б! у

Туг

нт а

туг

рЬе

дар

НТ 5

тгр

100

105

но

б! у

61 п

с! у

ТНг

Ьеи

Уа!

ткг

Уа!

Зег

5-ег

115 120 <210> 34 <211> 110

- 73 010726 <212? ΡΚΤ

<21

3>

Ното

зар

ί епз

<40

0>

34

С1п

Зег

д!а

Теи

Ткг

61 η

Рго

рго

зег

А1а

Зег

61 у

зег

Рго

61 у

61 п

1

5

10

15

5ег

Не

ТЬг

11 е

Зег

суз

ткг

б1у

ТЬг

АЗП

Зег

Азр

11е

61 у

Зег

туг

20

25

30

РГО

Рке

Уа1

Зег

тгр

туг

61 п

Агд

Н15

РГО

С1у

ьуз

А1а

РГО

ьуз

Ьеи

35

40

45

ьеи

Т1е

Туг

Азр

Уа1

зег

А5П

Агд

Рго

Зег

С1у

уа!

эег

АЗр

Агд

Рке

50

55

60

зег

61 у

Зег

Ьуз

Зег

61 у

АЗП

Ткг

А1а

Зег

ьеи

ткг

Х1е

зег

61 у

Ьеи

55

70

75

80

61 η

А1а

61 и

А5р

61 и

61 у

АЗР

Туг

туг

суз

Зег

зег

рке

Ткг

мет

АЗП

85

90

95

Зег

РЬе

уа!

Не

Рке

61 ν

ткг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

уа!

ьеи

100 ’ ' ' ' 105 ' 110 <210>35 <211>125 <212> ΡΚΤ <213> Ното зартепз <400>35

61 η

Уа!

61л

ьеи

Уа!

61п

Зег

61 у

А1а

61 и

Уа!

ьуз

Рго

61 у

Зег

1

5

10

15

зег

Уа!

Ьуз

Уа1

Зег

Суз

ьуз

А1а

Зег

61 у

ткг

Рке

5ег

Зег

туг

20

25

30

а! а

11 е

Зег

Тгр

Уа!

Агд

61 л

А1а

Рго

С1у

61 п

61у

Ьеи

61 и

тгр

МеТ

35

40

45

61 у

11 е

РГО

11е

Рке

С1у

ткг

А1а

АЗП

Туг

А1 а

61 п

ьуз

рЬе

50

55

60

61 η

б!у

Агд

Уа!

ТЙГ

Х1е

ткг

А! а

АЗр

61и

Зег

ТЬг

Зег

Ткг

А1а

Туг

65

70

75

80

- 74 010726

МеТ

61 и

Ьеи

бег

Зег 85

Ьеи

Агд

Зег

61 и

Аэр 90

ТЬг

а! а

Уа!

Туг

Туг 95

Суз

а! а

Агд

Зег

РГО

11 е

Туг

туг

АЗр

11 е

ьеи

ТЬг

б!у

11 е

Азр

а! а

РЬе

100

105

110

Азр

11 е

Тгр

61 у

61 п

61 у

ТЬг

мет

Уа!

ТЬг

Уа!

зег

бег

115

120

125

<210>	36
<211>	108
<212>	РКТ
<213>	Ното

<4 ОСЬ 36

61 и 1

Не

Уа!

Ьеи

тЬг 5

61л

Зег

Рго

61 у

ТЬг 10

ьеи

Зег

Ьеи

Зег

РГО 15

61 у

61 и

Агд

А1а

тЬг 20

Ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а 25

Зег

61 η

5ег

Уа1

бег 30

бег

Зег

ьеи

А1 а 35

тгр

туг

61л

61 η

ьуз 40

РГО

61у

61 п

А1а

РГО 45

Агд

Ьеи

Уа!

Туг

А1 а

Зег

Агд

А1 а

тЬг

61у

11 е

РГО

АЗр

Агд

рЬе

зег

55 60

61у Зег с1у 65

зег С1у тЬг 70

Азр рЬе ТЬг ьеи

ТЬг 75

11е Зег

Агд

ьеи

61 и 80

РГО

61 и

АЗР

РЬе

А1а

Уа!

туг

Туг

Суз

61л

Нт 5

Туг

61 у

зег

РГО

90 95 дгд ТЬг РЬе 61 у 61 п б1у ТЬг ьуз Уа! (31 и 11 е Ьуз

100 105

<210>	37
<211>	120
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз

<400> 37

61л Уа! 61л Ьеи Уа! 61л бег б!у А1а С1и Уа! Ьуз Ьуз Рго 61у бег

10 15

- 75 010726

Зег

уа!

ьуз

Уа1 20

Зег

Суз

ьуз

А1а

зег 25

01 у

ТЬг

РЬе

Зег 30

Зег

туг

д!а

'Те

Зег

Тгр

Уа1

Агд

01 η

д’! а

Рго

01 у

01 п

01 у

ьей

01 и

Тгр

мег

35

40

45

01 у

Агд

11е

ιΐε

Рго

11 е

ьео

01 у

11 е

д!а

АЗП

Туг

А1а

01 η

ьуз

рЬе

50

55

50

01 п

С1у

Агд

УаТ

ТЬг

11е

ТЬг

Д1а

Азр

1уз

5ег

тЬг

Зег

ТЬг

А1а

туг

55

70

75

80

мег

С1и

беи

5ег

Зег

ьей

Агд

Зег

о!и

Азр

тЬг

А1а

Уа1

Туг

СУ5

85

90

95

А1а

Агд

Азр

Рго

Не

РГО

зег

01 у

тгр

туг

РЬе

Азр

Сеи

Тгр

01 у

дгд

100

105

110

б!у ТЬг ьей Уа1 тЬг Уа1 зег зег

115 120

<210>	38
<211>	110
<212>	РРТ
<213>	Ното

<400> 38

61 л Зег

Уа1

ьей

Тттг

с! п

РГО

Зег

Уа1

Зег

61 и

А1а

Рго

дгд

61 п

1

5

10

15

Агд Уа1

ТЬг

Не

Зег

Суз

Зег

61у

Зег

Азп

11е

61 у

АЗП

20

25

30

А1а Уа1

АЗП

тгр

Туг

61 η

ьеи

РГО

61 у

ьуз

д1 а

Рго

Суз

ьей

35

40

45

11е туг

туг

АЗр

сеи

Ьей

РГО

Зег

С1у

Уа1

зег

А5р

дгд

рЬе

Зег

50

55

60

С1у Зег

ьуз

Зег

С1у

ТЬг

Зег

А1а

Зег

кеи

д!а

11 е

Зег

61 у

Ьей

Агд

65

70

75

80

Зег б!ы

АЗр

61 и

А1а

Азр

туг

Туг

Суз

д!а

ТЬг

Тгр

АЗр

Зег

ьей

85

90

95

Зег с!у

Тгр

Уа1

РЬе

61 у

61у

ТЬг

ьуз

1еи

ТЬг

уа!

Ьей

100

105

110

- 76 010726

<210>	39
<211>	122
<212>	РКТ
<213 >	Ното зартепз
<400>	39

СТп Уа1 51 п Ьеи Уа! 61 и Бег 61 у 51 у 61 у ьеи Уа1 ьуз Рго 61 у Агд 15 10 15

Бег ьеи Агд ьеи Бег Суз А1а А1а Бег 61у РЬе тЬг РЬе Бег Бег Туг

20

25

30

51 у

Мех

нтз

Тгр

Уа!

Агд

61 η

д!а

Рго

61 у

ьуз

61у

ьеи

С1и

Тгр

уа1

35

40

45

а! а

Уа!

Пе

Тгр

Туг

АБр

61 у

Бег

АЗП

Ьуз

Туг

А1а

АБр

Бег

Уа!

50

55

60

ьуз

£1/

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Бег

Агд

АБр

АЗП

Бег

ьуз

АЗП

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

ьеи

61 п

Мех

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

51и

АЗр

тЬг

А1а

Уа1

туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

61 и

Уа1

61у

АЗП

Туг

туг

Азр

Бег

сТу

туг

С1у

туг

Тгр

100

105

110

51у

61 п

61 у

ТЬг

Ьеи

Уа!

тЬг

Уа1

Бег

115
<210>	40
<211>	НО
<212>	РКТ
<213>	Ното Бартелз
<400>	40

АЗП

РЬе

мех

Ьеи

тЬг

51 η

Рго

НТ 5

Бег

Уа!

Бег

61 и

Бег

РГО

61 у

ьуз

1

5

10

15

ТЬг

Уа!

ТЬг

11е

Бег

Суз

ТЬг

Агд

Бег

61 у

51 у

11е

С1у

Бег

20

25

30

рЬе

Уа!

НТ 5

Тгр

РЬе

61 π

б! η

Агд

Рго

61 у

Бег

Рго

ТЬг

тЬг

уа!

40 45

- 77 010726

11 е

РЬе

А5р

АЗр

АЗП

61 л

Агд

Рго

ТЬг

61 у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

зег

50

55

60

а! а

Не

АЗр

ТЬг

5ег

Зег

А1а

Зег

Ьеи

ТЬг

Пе

Зег

б!у

65

70

75

80

кеи

ТЬг

а! а

61 и

АЗр

С! и

а! а

АЗр

Туг

туг

суз

61 п

Зег

зег

ΗΊ5

5ег

85

90

95

ТЬг

А1 а

Уа!

уа!

РЬе

61 у

ТЬг

куз

кеи

ТЬг

Уа!

кеи

100

105

НО

<210> 41 <211> 122 <212> РР.Т <213> Ното зарпепз <400> 41

61 п Уа!

61 П

кеи

61 η

61п

Зег

б!у

РГО

С!у

кеи

уа!

куЗ

РГО

Зег

61 п

1

5

10

15

тЬг кеи

Зег

кеи

тЬг

суз

А1а

Не

зег

61 у

АЗр

ТЬг

уа!

бег

зег

АЗП

20

25

30

Зег А1а

д!а

Тгр

АЗП

Т гр

Не

Агд

61л

Зег

Рго

Зег

Агд

61 у

кеи

61 и

35

40

45

Тгр ьеи

61 у

Агд

ТЬг

Туг

Агд

Зег

куз

Тгр

туг

Зег

АЗр

туг

А1а

50

55

60

уа! зег

кеи

дгд

61У

Агд

Не

тЬг

11 е

АЗП

1еи

АЗР

тЬг

АЗр

ТЬг

зег

65

70

75

80

!_уЗ АЗП

61 η

РЬе

зег

ъеи

61л

ьеи

АЗП

Зег

Уа!

Ткг

РГО

61 и

АЗр

ТЬг

90 95 д1а Уа1 Туг Туг Суз А1а лгд Азр Агд 61 у 61 у Туг 11е Азр Зег тгр

100 105 110 у 61 п 61 у тЬг кеи Уа! ТЬг Уа! Зег Зег

115 120

<210>	42
<211>	110
<212>	РКТ
<213>	Ното зар!епз

- 78 010726

<40'

9>

42

АЗП

РЬе

МеТ

ьеи

ТЬг

И η

Рго

НТ 5

Зег

уа!

Зег

61 и

Зег

Рго

1

5

10

тЬг

уа!

ТЬг

Не

Зег

суз

ТЬг

Агд

Зег

С1у

Зег

11 е

А1а

20

25

30

туг

Уа1

СТл

Т гр

Туг

οΊπ

61 η

Агд

РГО

61 у

5ег

Зег

РГО

А1а

11е Туг 61 и Азр 50	АЗЛ	61 η	Агд 55	Рго	Зег С1у	уа!	рго 60
61 у	Зег	Не	АЗр	ТЬг	Зег	Бег	АЗЛ	Бег	А1а	Бег	Ьеи

<21О>	43
<211>	122
<212>	РРТ
<213>	Нолю

61 и

мет

АЗП

Тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

РГО

б!у Агд

61 у

ьеи

61 и

Тгр

уа1

35

40

45

Бег

туг

Не

СТу

Зег

61 у

ьуз

ТЬг

11е рЬе

туг

А1а

Азр

Бег

уа!

50

55

60

ьуз

61 у

Агд

рЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

АЗр

АЗП 61у

ьуз

АЗП

Бег

Уа!

туг

65

70

75

80

ьеи

61 η

мет

АЗП

Бег

Ьеи

Агд

А1а

61 и

АЗО тЬг

А1а

Не

туг

Суз

85

90

95

А1а Агд б!у 61 у 61у Зег А1а Туг Туг беи А5п ТЬг Зег Азр 11е Тгр

100 105 НО у б1п 61 у ТЬг МеТ Уа! тЬг уа! Зег зег

115 120

<210>	44
<211>	112
<212>	РКТ
<213>	ното

<400> 44

Азр 1

Не

Уа1

Мег ТЬг 5

61п Зег

РГО

беи

5ег 10

беи

РГО

уа!

тЬг

рго 15

61 у

С1и

Рго

А1 а

Зег

11 е

Зег

Суз

Агд

Зег

5ег

61 η

5ег

беи

НТ 5

Зег

20

25

30

буз

61у

АЗр

АЗП

Туг

беи

АЗр

Тгр

туг

беи

61 п

буз

Рго

61у

61 П

Зег

35

40

45

/-Ί л

[ £» 1 «

1 ЛИ

ГТ а

1 Ш г

гт,,

Саг·

о

Л г> η

А1 а

г! ·/

уа!

РГО

г ΐ и

УД 1 1 1

X 1 У-

туг

/

1 ί 1 -»

гм у

— ί

50

55

б0“

АЗр

Агд

РЬе

Зег

61 у

Зег

С1у

5ег

б!у

ТЬг

АЗр

РЬе

тЬг

беи

буз

11 е

о5

70

75

80

Зег

Агд

Уа!

61 и

а! а

61 и

АЗр

уа!

с! у

уа!

туг

Суз

Меб

61 <т

А! а

85

90

95

беи

31п

ТЬг

Рго

беи

ТЬг

РЬе

61 у

61 у 61у

ТЬг

буз

та!

с! и

Не

буз

100

105

110

<210>	45
<2и>	125
<212>	РКТ
<213>	нолю зартепз

<400>

45

61 п’’ Уа!

61 л

беи

Уа!

61 п

5ег

61у

А1 а

61 и

Уа!

буз

туз

кто

б!у На

1

5

10

15

Зег Уа!

буз

уа!

Зег

суз

буз

А1 а

Зег

С1у

туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег туг

20

25

30

- 80 010726

61 у

Не

Зег

Тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

Рго

61 у

61 η

61у

кеи

61 и

Тгр

МеТ

35

40

45

61 у

Тгр

Не

Зег

А1а

Туг

Азп

61 у

АЗП.

. ТЬг

А5П

Туг

д!а

61 η

куз

кеи

50

55

60

61л

С1У

Агд

Уа1

тЬг

МеТ

ТЬг

Азр

ТЬг

Зег

ТЬг

Зег

ТЬг

А1а

туг

65

70

75

80

мет

61и

кеи

Агд

Зег

кеи

Агд

5ег

АЗр

Азр

ТЬг

А1а

уа1

Туг

Суз

85

90

95

а! а

Агд

Азр

Агд

61 у

Не

А1а

Агд

зег

А1а

туг

Туг

61 у

МеТ

100

105

110

Аар

Уа1

Тгр

61 у

61 η

61 у

ТЬг

Тпг

Уа1

тЬг

Уа1

Зег

115 120 125

<210>	46
<211>	113
<212>	РЕТ
<213>	Нотпо Бартелз

<400> 46

Азр

11 е

Уа1

мет

ТЬг

61л

тЬг

РГО

кеи

Зег

кеи

РГО

Уа1

ТЬг

РГО

61у

1

5

10

15

61 и

Рго

А1 а

зег

Не

Зег

Суз

дгд

Зег

61 п

Зег

кеи

Азр

Зег

20

25

30

АЗр

Азр

С1у

куз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Туг

кеи

61л

Агд

РГО

61 у

61 η

35

40

45

Зег

Рго

61 л

кеи

мет

Туг

ТЬг

Зег

Агд

А1 а

Зег

61у

уа!

50

55

60

РГО

АЗр

Дгд

РЬе

Зег

61 у

Зег

61 у

Зег

61 у

ТЬг

дар

РЬе

ТЬг

кеи

куз

65

70

75

80

Не

Зег

Агд

УаЗ

61 и

А1а

С!и

АЗр

уа!

61у

Уа!

Туг

туг

Суз

мет

61л

85

90

95

а1 а

ТЬг

61л

РЬе

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

61 у

61 п

61 у

ТЬг

куз

кеи

61 и

Не

100 105 ио куз

- 81 010726

<210>	47
<211>	120
<212>	РКТ
<213>	Ното зартелз

<400>47 л Ма1 61 η Ьеи Уа1 61 η Бег 61 у А1а Б1и Уа1 ьуз туг Рго 61 у Д1а

1015

Бег та1 Туз та1 Бег Суз Туз А1а Бег б1у туг тКг Рйе ТЬг Бег Туг

2530

Азр

Тео

Азп

тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

Бег

61 у

61 η

61 у

ьеи

61 и

тгр

мет

35

40

45

61 у

тгр

мет

АЗП

РГО

Тйг

Бег

61 у

АЗ Г)

ТЬг

61 у

Туг

А1а

61 η

Ьуз

РЬе

50

55

60

С1п

61у

Агд

Не

ТЙГ

МеТ

ТЙГ

Агд

А5П

ТЬг

Бег

11 е

Бег

ТЙг

А1а

туг

65

70

75

ВО

Мет

С1и

ьеи

Агд

Бег

Теи

Агд

Бег

АЗР

АЗр

тЬг

д!а

уа!

Туг

Суз

85

90

95

А1а

дгд

АЗр

Рго

Бег

С1у

61 у

Тгр

61и

РЬе

Азр

Туг

ТГР

61 у

61 η

100 105 1Ю

С1у

115

Бег Бег

120

<210>	48
<211>	112
<212>	РКТ
<213>	Ногао зартепз

<400> 48

дзр Не уа1 1

мет

ТНг 61 η 5

ТЙГ РГО

теи

Бег 10

Бег тЬг

Уа1

ТЙГ

ьеи 15

61 у

61 η

Рго

А1а

Бег

11 е

Бег

Суз

Агд

Бег

61 η

Бег

Теи

У'а!

ΗΊ 5

61 и

20

25

30

Азр

61у

АЗП

ТЬг

Туг

Ьеи

АЗП

Тгр

теи

5

61 п

Дгд

Рго

61 у

61 η

РГО

40 45

- 82 010726

Рго

Агд

Геи

11 е

туг

Ьуз

Пе

Бег

ЬУБ

Агд

РЬе

Бег

с! у

Уа!

Рго

50

55

60

А5р

Агд

РЬе

Бег

С1 у

Бег

61 у

А1а

С1 у

ТЬг

А5р

РЬе

тЬг

ьеи

1-У5

11 е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа!

61 и

Рго

61 и

АЗр

Уа!

С1 у

уа!

Туг

Суз

мет

61л

Бег

85

90

95

Ткг

Агд

Рке

Рго

Агд

ТЬг

РЬе

с! у

61 п

б! у

ТЬг

ьу*

Геи

61 и

Не

ьуз

100

105

110

<210>	49
<211>	120
<212>	РРТ
<213>	Ното зарт епз

<400> 49

С1 η

Уа!

С1п

Геи

Уа!

61 п

Бег

61 у

А1а

61 и

уа!

Гуз

гуз

Рго

61 у

Бег

1

5

10

15

Бег

Уа!

ГуБ

Уа!

Зег

Суз

Гуз

А1а

Бег

61 у

С1у

ТЬг

РЬе

Бег

Н1 5

20

25

30

а! а

Не

Бег

Тгр

Уа!

лгд

61п

А1а

РГО

61 у

61 η

61 у

Геи

61и

Тгр

мет

35

40

45

61у

лгд

Не

11 е

РГО

Не

Геи

б!у

Не

А1а

АЗП

туг

А1а

61 η

гуз

РЬе

50

55

60

С1 η

С1 у

Агд

Уа1

тЬг

11 е

ТЬг

А1а

АБр

61 и

Бег

ТЬг

Бег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

мет

61 и

ьеи

Бег

геи

Агд

Бег

С1и

АЗр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

туг

Суз

85

90

95

д!а

ТЬг

Бег

Агд

|_еи

61 и

Тгр

геи

туг

ьеи

АЗр

Туг

тгр

б!у

61 η

100

105

110

61 у тЬг геи Уа! тЬг Уа1 Бег Бег
	115	120
<210>	50
<211>	ПО
<212>	РКТ
<213>	нопга Бартелз

- 83 010726 <400 50

азп РЬе

Мет

ьеи

тЬг

61 η

РГО

ΗΊ5

Зег

уа1

Зег

61 и

Зег

Рго

61 у

ьуз

1

5

10

15

тйг уа!

Не

11 е

РГО

суз

тйг

Агд

Зег

б!у

Зег

Х1е

А1а

Зег

АЗП

20

25

30

Туг Уа1

61л 35

тгр

туг

61 η

ьуз

Агд 40

РГО

61у

зег

А1 а

РГО 45

5ег

11 е

Уа1

11 е Туг

С1и

АЗр

ьуз

61 η

Агд

Рго

Зег

61у

Уа!

Рго

АЗр

Агд

рЬе

5ег

50

55

60

61 у Зег

±1е

Азр

Зег

АЗП

Зег

А1а

Зег

Ьеи

ТЙГ

11 е

5ег

61 у

65

70

75

80

ьеи ьуз

Тйг

61 и

Азр

61 и

А1а

Азр

туг

Суз

61 η

Зег

туг

АЗП

Зег

85

90

95

Агд С1у

Уа!

Мет

рЬе

61у

61 у

Тйг

ьуз

Ьеи

ТЙГ

Уа1

Ьеи

100 105 НО

<210>	51
<211>	123
<212>	ΡΚΤ
<213>	Ното зартепз

<40

0>

51

61 η

Уа!

61п

ьеи

уа1

61 η

Зег

61 у

А1а

С1и

Уа!

ьуз

Рго

61 у

а! а

1

5

10

15

Зег

Уа1

ьуз

уа!

Зег

суз

ьуз

А1а

Зег

61 у

Туг

Тйг

рЬе

ТЙГ

Зег

Туг

20

25

30

С1у

11 е

Зег

тгр

Уа1

Агд

61 п

А1а

РГО

С1у

61 п

61у

ьеи

61 и

Тгр

мет

35

40

45

61 у

тгр

Пе

Зег

А1а

Туг

АЗП

61 у

АЗП

тйг

АЗП

туг

а! а

61 η

ьуз

Ьеи

50

55

60

61л

61 у

Агд

уа!

ТЬг

мет

ТЙГ

Азр

ТЙГ

Зег

ТЙГ

Зег

ТЙГ

А1а

Туг

65

70

75

80

мет

61 и

Уа1

Агд

зег

Ьеи

Агд

Зег

Азр

АЗр

ТЙГ

а! а

Уа!

Туг

туг

суз

85

90

95

- 84 010726

А1а Агд о! у 61у бег Рго Туг

100 у С1у Туг

105 д!а Туг Рго Рйе дзр Туг

110

Тгр б!у 61п 61 у Тйг ьеи Уа1 Тйг Уа1 бег бег

115120

<210>	52
<211>	110
<212>	РКТ
<21Э>	ноте з-артеп-з

<400> 52

дзп РЬе мег Ьеи 1

ТЬг 61 п Рго 5

Н15

Бег

Уа1 10

Ьеи

61 и Бег

А1 а

61 у 15

Ьуз

ТЬг

Уа1

ТЬг

Не

бег Суз

ТЬг

Агд

бег

61 у

бег

Не

А1а

бег

Азп

20

25

30

Туг

уа1

61 η

т гр

Туг

61 п

Агд

Рго

61 у

ТЬг

бег

РГО

ТЬг

АЗП

Уа1

35

40

45

Г1 л -Ь | с

як л Г 1 ГС

/-1,, и ί и

А Г- η

А г- η ГЛЭ 1 Е

<—Ί η и I * ί

А К» Л г-ы

О Г'П, Г 4 V

Сл кОС71

г“1 \г %Л 1 у

V О. 1

Огп Г Г кА

Л С-1-1 м, и

Л ГЛ1 Н

01-1 га 1 1 1 *->

Сл г*

50

р-

55

60

>

С1у

Бег

Не

Азр

Бег

АЗП

бег

А1 а

бег

ьеи

Тпг

Не

бег

б!у

65

70

75

80

ьеи

ьуз

ТЙГ

61 и

Азр

61 и

а! а

Азр

Туг

РЬе

Суз

61 п

Бег

Туг

Азр

Бег

85

90

95

АЗП

Не

Тгр

Уа1

РЬе

61 у

ТЬг

суз

ьеи

ТНг

Уа1

Ьеи

100 105 110

<210>	53
<211>	122
<212 >	РкТ
<213>	Ното зартепз

<400>53 оТи Уа1 б7п ьеи са! б1и Бег с!у б?у б1у Уа1 Уа1 61 η Рго 61 у дгд

1015 бег ьеи дгд Ьеи бег Суз А1а д!а бег с1у РЬе тЬг РЬе бег Бег Туг

2530

- 85 010726

б!у

мег

Н15

Тгр

Уа1

Агд

61 η

А1а

рго

61 у

БуЗ

61 у

Беи

61 и

тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Туг

11 е

Зег

61 у

Зег

ТЬг

Пе

туг

Туг

А1а

АЗр

зег

Уа1

50

55

60

(_У5

61 у

Агд

РЬе

ТНг

Не

Зег

Агд

АЗР

АЗП

А1а

Б уз

АЗП

зег

Беи

туг

65

70

75

80

тек

С1п

мет

АЗП

Зег

Беи

Агд

А1а

61 и

АЗр

тЬг

А1а

Уа1

туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

дгд

Азр

теи

Теи

Азр

туг

Д5р

11е

Беи

ТЬг

61 у

Туг

61у

Туг

Тгр

100

105

110

61у

61 η

61 у

ТЬг

Беи

Уа1

тЬг

Уа1

Зег

115

120

<210>54 <211> 111 <212> РГТ

<213>

Ното

зар

1 епз

<40

о>

54

61 п

Зег

Уа1

Беи

ТНг

С1п

рго

Рго

зег

Уа1

зег

А1а

РГО

61 у

61 η

1

5

10

15

БУЗ

уа!

ТЬг

Не 20

Зег

суз

Зег

61у

зег 25

Зег

АЗП

11 е

61 у 30

АЗП

Азп

туг

ν₃1

зег

тгр

Туг

61 η

ΗΊ5

Беи

Рго

61у

ТЬг

А1а

РГО

туз

Беи

35

40

45

Не

туг

С1у

АЗП

тЬг

АЗП

Агд

РГО

зег

С1у

Уа1

Рго

Азр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

61 у

Зег

БуЗ

5ег

61 у

ТЬг

Зег

А1 а

зег

Беи

а! а

11е

А1а

61у

Беи

С1п

65

70

75

80

А1а

61 и

АЗр

61 и

А1а

АЗр

туг

Суз

б1п

зег

Туг

АЗР

Зег

Беи

85

90

95

Зег

61 у

Зег

Беи

уа!

РЬе

61 у

61у

тЬг

Буз

Беи

тЬг

уа!

Беи

100 105 110 <210>55 <211>123

- 86 010726 <212> РИТ <213> Ното 5ар1еп5 <400 55

61 η

Уа!

61 п Ьеи

С1п 01 л

Тгр

61у

А1 а

С1у

Ьеи

ьуз

РГО

5ег

61 и

1

5

10

15

ТЬг

ьеи

Зег ьеи

тЬг суз

а! а

уа!

Туг

б!у

б! у

Зег

рЬе

Зег

61 у

Туг

20

25

30

Туг

Тгр

Зег Тгр

11е Агд

61л

Зег

Рго

61 у

ьуэ

61 у

Ьеи

61 и

Тгр

11е

35

40

45

б!у

61 и

11е Азп

Нт 5 Зег

61 у

Зег

ТЬг

АЗП

рЬе

АЗП

РГО

зег

Ьеи

ьуз

50

55

60

зег

Агд

11е тЬг

11е зег

Уа!

АЗр

ТЬг

Зег

АЗП

61 η

РЬе

Зег

ьеи

65

70

75

80

Ьуз

Ьеи

Зег Зег

Уа1 Таг

а! а

А1 а

АЗр

ТЬг

А1 а

Уа!

Туг

туг

Суз

д1 а

85

90

95

А ГЛ

г:1 ν —' · 7

!4П Δ «СП с-

Тгп ν ' ' Г ·- ¹ -Г

ιτΊ ν ** э

11 е

г’· ν

ЗТ» — ’ р

а! а

д! э.

Туг • '

Азр

11е

Тгр С1у С1п С1у ТНг Мет Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

115 120

<210>	56
<211>	108
<212>	РИТ
<213>	Ното зартепз

<400> 56

61 и

Пе

уа!

ьеи

ТЬг

61 п

5ег

Рго

А1а

ТЬг

ьеи

Зег

ьеи

Зег

Рго

61 у

1

5

10

15

о! и

Агд

А1а

ТЬг

ьеи

Зег

Суз

Агд

А1а

Зег

61 п

зег

уа1

Зег

зег

Зег

20

25

30

рЬе

ьеи

А1 а

Тгр

туг

61 η

Ьуз

А1 а

61 у

61 п

А1а

Рго

ягд-

Ьеи

ьеи

35

40

45

11е

Туг

АЗр

ТЬг

Зег

ТЬг

Агд

А1а

ТЬг

61 у

11 е

А1а

АЗр

Агд

РЬе

Зег

50

55

60

- 87 010726

с! у 65

Зег

б! у

Зег

с! у

тЬг 70

Аар

рЬе

тЬг

Ьеи

ТЬг 75

Не

5ег

Агд

Ьеи

б! и ВО

д! а

б! и

Аар

Зег

А! а

Уа!

Туг

туг

суа

с!п

б!п

туг

Аар

РЬе

Зег

рго

85

90

95

Ьеи

ТЬг

РЬе

б! у

ТЬг

Ьуа

Уа!

б! и

Не

Ьуа

100

105

<210>	57
<211>	112
<212 >	РВТ
<213>	Ното аарт епа

<400>57 б1п Уа! о!п ьеи Уа1 б!и Зег б!у б!у б!у Ьеи Уа! с!п Рго С1у б!у

1015

Зег

ьеи

Агд

Ьеи

Зег

суз

а! а

А! а

Зег

С! У

РЬе

ТЬг

рЬе

РЬе

Зег

ТЬг

20

25

30

Туг

а! а

Мег

ТЬг

ТГП

Уа!

Агд

С! η

а!

РГО

б!у

ьуз

6!ν

Ьеи

б! и

Тгр

35

40

45

Уа!

Зег

Уа!

Не

лгд

Зег

АЗП

б! у

ТЬг

АЗр

туг

А! а

Азр

РЬе

Уа!

50

55

60

ьуз

б! у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Аар

Зег

ьуз

АЗП

ТЬг

ьеи

Туг

65

70

75

80

ьеи

С1 η

мет

АЗП

б!у

Ьеи

Агд

А1а

с! и

АЗр

тЬг

а! а

Уа!

туг

Суз

90 95

МеТ тЬг лар Туг Туп Тгр б! у с1п 01 у ТЬг Ьеи Уа! ' 100105 тЬг Уа! Зег Зег

110

<210>	58
<211>	110
<212>	РКТ
<213>	нолю зартепа

<400>58

Азп РЬе мет ьеи тЬг с!п рго нт а Зег Уа! бег с! и Зег Рго с!у Ьуа

1015

- 88 010726

ТЬг Уа!

ТЬг

Не

Зег

Суз

ТЬг

61 у

Зег

61 у

бег

Не

А1а

5ег

АЗП

20

25

30

туг Уа1

61 η

Тгр

Туг

61 η

61 л

Агд

РГО

61 у

Зег

А1а

Рго

ТЬг

Уа!

35

40

45

11 е туг

61 и

АЗр

АЗП

61 η

Агд

РГО

Зег

61 у

Уа1

РГО

Азр

Агд

РЬе

зег

50

55

60

61у Зег

Не

Абр

Зег

зег

Зег

АЗЛ

Зег

А1а

Зег

ьеи

тЬг

11 е

Зег

С1у

65

70

75

80

Ьеи Ьуз

тЬг

61 и

Азр

С1и

А1 а

Азр

Туг

Суз

61 п

бег

Туг

Азр

бег

85

90

95

Зег тНг

Тгр

Уа!

РЬе

61 у

ТЬг

Ьуз

ьеи

ТЬг

Уа!

ьеи

100 105 110

<210>	59
<211>	123
<212>	РРТ
<213>	Ното
<400>	59

61 и

Уа!

С1п

ι ьеи

Ьеи С1и

Зег

Ну

• 61у

61у

Ьеи

Уа1

61 п

РГО

61 у

61у

1

5

10

15

Зег

Ьеи

Агд

ьеи

зег Суз

Д1 а

А1а

Зег

61у

РЬе

ТЬг

РЬе

бег

Зег

туг

20

25

30

А1а

мег

Зег

тгр

Уа! Агд

61 л

А1а

РГО

б1у

ьуз

б!у

Ьеи

б!и

Тгр

уа!

35

40

45

Зег

А] а

Не

Зег

61у Зег

61 у

Зег

ТЬг

Туг

туг

А1а

А5р

Зег

Уа!

50

55

60

ьуз

61 у

Агд

РЬе

ТЬг Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

АЗП

ТЬг

ьеи

туг

65

70

75

80

ьеи

61 л

мег

АЗЛ

Зег ьеи

Агд

дТа

61и

Азр

ТЬг

А1а

уа!

туг

Туг

суз

85

90

95

А1а

ьуз

61 и

тЬг

Не зег

рЬе

бег

ТЬг

рЬе

Зег

61 у

Туг

РЬе

АЗр

туг

100

105

110

Тгр '

61 у

61 η

С1у '

ТЬг ьеи

Уа1

тЬг

Уа! .

Зег

115

120

- 89 010726

<210>	60
<211>	110
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	60

61 п Зег А1а 1

Ьеи ТЬг 61 η 5

Рго А1а

Зег Уа1 10

5ег

б!у

Зег Рго С1у 61 л 15

Зег Не тЬг

Не

Зег

Суз

ТЬг

С1у

ТЬг

Зег

АЗр

уа1

61 у 61 у

туг

20

25

30

азп Туг уа!

Зег

тгр

РЬе

61 η

61л

Н13

РГО

61 у

ьуз

А1а

Рго

ьуз

ьеи

35

40

45

мах Не туг

ьуз

Уа1

АЗП

Агд

РГО

Зег

61 у

ьеи

Зег

АЗП

Агд

РЬе

50

55

60

Зег Ну Зег

61 п

Зег

61 у

АЗП

тЬг

Д1а

Зег

Ьеи

ТЬг

11 е

зег

61 у

ьеи

65

70

75

80

б!п А1а С1и

Азр

61 и

А1а

АБр

Туг

Суз

Зег

Туг

тЬг

зег

Зег

85

90

95

5ег Тбг ьеи

61 у

РЬе

61 у 61 у

61 у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

уа!

Ьеи

100

105

110

<210>	61
<211>	122
<212>	РР.Т
<213>	Ното
<400>	61

61 п

Уа!

61 п

Ьеи

Уа!

61п

Зег

61 у

А1а

61 и

Уа!

Ьуз

РГО

61 у

А1а

1

5

10

15

Зег

Уа1

ьуз

уа!

Зег

суз

ьуз

А1а

Зег

61 у

туг

ТЬг

РЬе

тЬг

Зег

Туг

20

25

30

АЗр

Не

Азп

тгр

уа!

Агд

61 η

д!а

ТЬг

61 у

61 π

С1у

ьеи

61и

Тгр

Мех

3'5

40

45

61у

тгр

мех

АЗП

РГО

АЗП

Зег

61 у

АЗП

ТЬг

б!у

Туг

А1а

61л

Ьуз

РЬе

50

55

60

- 90 010726

σΐη

61 у

Агд

Уа!

тЬг

МеХ

ткг

Агд

АЗП

ТЬг

Зег

11 е

зег

тЬг

А1а

туг

65

70

75

80

ме~

б!и

кеи

зег

5ег

кеи

Агд

зег

61 и

АЗр

ТЬг

А1а

уа!

Туг

туг

Суз

85

90

95

А1а

ьуз

61и

11 е

А1а

Уа!

А1а

61 у

тЬг

Агд

Туг

61 у

мех

АЗр

Уа!

Тгр

100

105

110

61 у

61 η

61у

ТЬг

уа!

ТЬг

уа!

5ег

Зег

	115
<210>	62
<211>	107
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	62

61 и

11е

Уа!

кеи

ТЬг

61 η

Зег

Рго

61 у

ТЬг

кеи

Зег

кеи

зег

РГО

61 у

1

5

10

15

61 и

лсд

А1а

ТЬг

кеи

Зег

Суз

Агд

а! а

Зег

61 η

Зег

11 е

Зег

тЬг

РЬе

20

25

30

Ьеи

А1а

Т Гр

Туг

61 п

61 η

Ьуз

Рго

61 у

61 η

А1а

Рго

Агд

кеи

11 е

35

40

45

Туг

Азр

А1 а

Зег

ΑΞΠ

Агд

А1а

ТЬг

61 у

11 е

рго

61 у

лгд

РЬе

Зег

61 у

50

55

60

Зег

61 у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

кеи

ТЬг

11е

Зег

АЗП

кеи

61 и

РГО

65

70

75

80

61 и

Азр

РЬе

А1а

Уа!

туг

Туг

Суз

61 η

Н13

Агд

11 е

АЗП

тгр

Рго

кеи

85

90

95

ТЬг

РЬе

61 у

61у

61 у

ТЬг

куз

Уа!

61 и

Пе

куз

100

105

<210>	63
<212>	106
<212>	РКТ
<213>	Ното
<400>	63

- 91 010726

61 у б!п Рго куз А1а абп

Рго

ТЬг

уа!

ТЙГ 10

кеи РЬе

Рго

Бег 15

Бег

1

5

61 и

Ьеи

61 л

а!а абп

ьуз

д!а

ТЬг

ьеи

Уа!

СУБ

кеи

11е

Бег

Азр

20

25

3ϋ

рЬе

Туг

Рго

61 у

А1а Уа1

тЬг

Уа1

А1а

Тгр

куз

а! а

АБр

61 у

Бег

Рго

35

40

45

уа!

суз

А1а

61у

Уа! 61 и

ТЬг

ТНг

Ьуз

Рго

Бег

ьуз

61 η

Бег

АБП

50

55

60

ЬУЗ

Туг

А1а

Бег Бег

туг

ьеи

Бег

ьеи

тЬг

РГО

61 и

61л

Тгр

куз

65

70

75

80

Бег

Н15

Агд

Бег

Туг Бег

Суз

61 η

Уа!

тЬг

НТ15

61 и

61 у

Бег

ТЬг

Уа1

85

90

95

61 и

ЬУЗ

ТНг

Уа!

А1а Рго

тЬг

61 и

Суз

Бег

100 105 <210> 64 <211> 106 <212> РРТ <213> Ното Бартелз <400> 64

С1у

61л

Рго

куз

А1а д!а

Рго

Бег

Уа1

ТЬг

кеи

РЬе

Рго

Бег

1

5

10

15

61 и

кеи

61л

А1а АБП

куз

А1а

ТЬг

кеи

Уа!

Суз

ьеи

11 е

Бег

АБр

20

25

30

Рпе

туг

РГО

61 у

А1а Уа1

тЬг

Уа1

Д1а

Т гр

ьуз

а! а

АБр

Бег

Рго

35

40

45

Уа!

куБ

А1а

б!у

Уа1 61 и

ТЬг

Рго

Бег

ьуз

61л

Бег

АБП

50

55

60

ьуз

Туг

д!а

Бег Бег

Туг

кеи

Бег

кеи

ТЬг

Рго

61 и

61 п

Тгр

ьуз

65

70

75

80

Бег

Н1Б

Агд

Бег

Туг Бег

СУ5

61 η

Уа1

ТЬг

НТ 5

61 и

61 у

Бег

ТЬг

Уа!

85

90

95

61 и

ьуз

ТЬг

Уа1

А1 а рго

ТЬг

61 и

Суз

Бег

100

105

- 92 010726

<210?	65
<211?	106
<212?	РРТ
<213?	ното зартелз

<40

0?

65

61 у

61 п

Рго

ьуз

а! а

А1а

Рго зег Уа!

Ткг

ьеи

Рке

Рго

Зег

1

5

10

15

61 и

Ьеи

С1п

д!а

А5П

Ьуз А1а Ткг

Ьеи

Уа!

Суз

Ьеи

11 е

5ег

АЗр

20

25

30

Рке

туг

Рго

61у

а! а

Уа!

Ткг Уа! д!а

Тгр

ьуз

41 а

Азр

Зег

Рго

35

40

45

Уа!

ьуз

А1 а

С1у

Уа1

61 и

ТЬг ткг ткг

Рго

Зег

ьуз

61 η

5ег

АЗП

АЗЛ

50

55

60

ьуз

Туг

а1 а

А1а

Зег

туг ьеи зег

ьеи

Ткг

Рго

61 и

61 η

Тгр

Ьуз

65

70

75

80

Зег

НТ 5

ьуз

Зег

Туг

Зег

Суз 61п Уа!

Ткг

НТ 5

61 и

61 у

Зег

Ткг

Уа!

85

90

95

61 и

Ьуз

ткг

уа!

А1 а

Рго

Ткг 61 и Суз

Зег

100 105

<210>	66
<211?	106
<212?	РРТ
<213?	Ното
<400?	66

61у 61п 1

Рго

Ь/5

А1а 5

а! а

Рго

Зег

Уа! ткг ьеи 10

рке

Рго

зег 15

зег

61 и

ьеи

61 п

а! а

АЗП

ьуз

а! а

ткг

ьеи

Уа!

Суз

ьеи

Уа1

Зег

А5р

20

25

30

Рке

туг

РГО

61 у

а! а

Уа!

ткг

Уа!

Α1 а

Тгр

ьуз

а! а

АЗр

61 у

зег

РГО

35

40

45

уа!

ьуз

та!

61 у

Уа!

61 и

ткг

Ткг

ьуз

Рго

Зег

ьуз

61 η

зег

АЗП

50

55

60

- 93 010726

ьуз

Туг

дТа

А1а

Зег

Туг

Сеи

Зег

Ьей

ТЬг

Рго

С1 и

61 п

Т гр

СУ*

65

70

75

80

Зег

НТЗ

Агд

5ег

Туг 85

Зег

Суз

Агд

Уа!

ТЬг 90

ΗΊ3

С1 и

61 у

Зег

ТЙГ 95

Уа!

СТ и

Су5

тЬг

Уа!

А1а

Рго

А1а

с! и

Суз

5ег

100

105

<210>	67
<21-1>	107
<212>	РРТ
<213>	Нолю
<400>	67

Агд тЬг 1

Уа!

А1а

д!а 5

Рго зег Уа!

РЬе

11е РЬе рго 10

Рго Зег

Азр 61 и 15

61 η

ьей

су*

зег

61 у

ТЬг

А1 а 5ег

Уа!

Суз

Сеи

сеи

АЗП

РЬе

20

25

30

туг

Рго

А га

б! и

А1 а

Суз

Уа! 61 η

Тгр

суз

уа!

Азр

АЗП

а! а

Сеи

61 п

35'

40

45

зег

61 у

АЗП

5ег

61 η

61 и

Зег Уа!

ТЬг

61 и

С1п

Азр

Зег

Суз

Азр

Зег

50

55

60

ТЬг

Туг

Зег

Ьей

Зег

ТЬг Сеи

ТЬг

Сеи

Зег

су 5

А1 а

АЗр

Туг

61 и

65

70

75

80

ьуз

НТ 5

с уз

Уа!

Туг

А1 а

Суз 61и

Уа!

ТЬг

Н15

61 п

61у

Сеи

зег

Зег

85

90

95

РГО

уаТ

ТЬг

суз

Зег

РЬе

Азп Агд

61 у

61 и

Суз

100

105

<210>	68
<211>	330
<212>	РЕТ
<213>	Ното
<400>	68

А1а 5ег тЬг ьуз 61ν Рго зег Уа! рЬе рго сеи А1а Рго зег Зег Суз

5 ' 10 15

- 94 010726

Зег ТЬг 5ег 61у

61 у

ТЬг А1а

А1а

кеи 61 у 25

Суз кеи Уа1

куз 30

АЗр

Туг

20

РЬе

рго

61 и

Рго

уа1

тЬг

Уа1

зег

тгр

АЗП

зег

61 у

А1а

кеи

тЬг

Зег

35

40

45

61 у

Уа1

НТЗ

тЬг

рЬе

рго

А1а

Уа1

кеи

61 п

Зег

61 у

кеи

Туг

Зег

50

55

60

кеи

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

РГО

Зег

кеи

61 у

ТЬг

61 п

ТЬг

65

70

75

80

Туг

Не

Суз

А5П

уа!

Азп

ИТЗ

куз

Рго

зег

АЗП

тЬг

куз

Уа1

Азр

куз

85

90

95

куз

Уа1

61 и

Рго

куз

Зег

суз

АЗр

куз

тЬг

Н15

тЬг

Суз

Рго

суз

100

105

по

РГО

А1а

Рго

61 и

кеи

61 у

б!у

Рго

Зег

уа1

РЬе

кеи

РЬе

Рго

115

120

125

куз Рго куз Азр тЬг кеи мет 11е 5ег Агд тКг Рго б!и уа! тЬг Суз

130 135140

Уа1 Уа1 Уа1 дзр Уа1 зег нт 5 б!и ляр Рго б1и «а! куз РЬе дзп тгр

145 150 155160

Туг Уа1 Азр 61 у уа! 61 и к'а! Нтз дзп А1а куз ТЬг куь Рго Агд 61 и

165 170175

61и 61п Туг дзп Зег ТЬг Туг дгд Уа1 Уа1 Зег «а! кеи ιНг Уа1 кеи

180 185190

НТ Б

61 η

А5р

тгр

кеи

АЗП

61у

куз

61 и

Туг

куз

суз

куз

Уа1

Зег

Азп

195

200

205

куз

а! а

кеи

РГО

А1а

РГО

Не

61 и

ТЬг

11е

зег

куз

А1а

куз

61 у

210

215

220

С1п

Рго

Агд

б!и

Рго

61 п

Уа1

Туг

ТЬг

кеи

РГО

Рго

Зег

Агд

АЗр

61 и

225

230

235

240

кеи

ТЬг

куз

Азп

61 η

Уа1

зег

кеи

ТЬг

суз

кеи

уа!

1У5

61 у

рЬе

Туг

245

250

255

РГО

Зег

Азр

Не

А1а

уа!

61 и

Тгр

61 и

Зег

АЗП

61 у

61 п

рго

61 и

АЗП

260

265

270

АЗП

Туг

ьуз

ТЬг

ТПГ

РГО

рго

ν₃1

кеи

АЗр

зег

АЗр

61у

Зег

РЬе

275

280

265

- 95 010726

геи ту

г Бег

Гуз геи

ТЬг

уа!

Азр

гуз

5ег

Агд

Тгр

61 η

61 у

АЗП

29ι

0

295

300

уа! рЬ<

= Зег

Суз Зег

Уа!

Мет

НТ 5

б! и

А1а

Геи

НТ 5

АЗП

НТ 5

Туг

ТЬг

305

310

315

320

С! л !.у$ Бег

Геи Бег

геи

Зег

РГО

61 у

гуз

325

330

<210>

69

<2Н>

22

<212>

РРТ

<213>

ногоо

зартепз

<400>

69

МеТ Азр

мет

Агд Уа!

РГО

а! а

с! η

Ьеи

геи

61 у

геи

Геи

геи

Геи

тгр

1

5

10

15

1_еи Агд 61 у А1а Агд Суз

<210>	70
<211>	40
<212>	ΰΝΑ
<213>	Ното гарт епз

<400> дтддтт	70 дада	ддгдссадаг дгсаддгсса дсгдд1дсад	40
<210>	71
<211>	30
<212>	ΡΝΑ
<213>	Ното	5ар1‘еп5

<400> 71 аттасдтстс асадттсдтт тдатстссас

<210>	72
<211>	48
<212>	0ΝΑ
<213>	ното гартепз

- 96 010726 <400> 72 ссдстсадст ссбддддсбс ссдсгагбдб ддббдададд тдссадат 48

<210>	73
<2И>	9
<212>	РКТ
<213>	ноте зартепз
<400>	73

а!а сТп беи беи б1у беи беи беи беи 1 5

<210>	74
<211>	54
<212>	ОКА
<213>	Ното зарЗ епз

ртсгадасса ссатддасаб

<210>	75
<211>	45
<212>	□ ΝΑ
<213>	Ното зарЗ епз
<400>	75

ддтдссадат

тстсс

<210>	76
<211>	31
<212>	ΒΝΑ
<213>	Ното зар!епз
<400>	76

таттаасасг сгсссстдтт

Claims

1. Агент, специфически связывающий ангиопоэтин-2, содержащий по крайней мере один пептид, с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, включающей

ЗЕО Ю N0. 1; ЗЕО Ю ΝΟ. 3; ЗЕО Ю N0.

5; ЗЕО ГО ΝΟ. 7; ЗЕО ГО N0. 9; ЗЕО ГО N0. 11; ЗЕО ГО ΝΟ. 13; ЗЕО ГО N0.15;

ЗЕО ГО ΝΟ. 17; ЗЕО ГО N0. 19; ЗЕО ГО N0. 21; ЗЕО ГО N0. 23; ЗЕО ГО N0. 25;

ЗЕО ГО N0. 27; ЗЕО ГО N0. 29; ЗЕО ГО ΝΟ. 31; ЗЕО Ю N0. 33; ЗЕО ГО N0. 35;

ЗЕО Ю N0. 37; ЗЕО ГО N0. 39; ЗЕО Ю N0. 41; ЗЕО Ю N0. 43; ЗЕО ГО N0. 45;

ЗЕО ГО N0. 47; ЗЕО ГО N0. 49; ЗЕО Ю N0. 51; ЗЕО ГО ΝΟ, 53; ЗЕО ГО ΝΟ. 55;

ЗЕО Ю N0. 57; ЗЕО Ю N0. 59; ЗЕО 10 N0. 61; ЗЕО ГО N0. 2; ЗЕО ГО N0. 12;

ЗЕО ГО ΝΟ. 18; ЗЕО ГО ΝΟ. 20; ЗЕО ГО ΝΟ. 26; ЗЕО ГО ΝΟ. 28; ЗЕО ГО N0. 30;

ЗЕО ГО N0. 32; ЗЕО ГО ΝΟ. 36; ЗЕО ГО N0. 44; ЗЕО ГО N0. 46; ЗЕО ГО N0.48;

ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 56; ЗЕО ГО ΝΟ. 62; ЗЕО ГО ΝΟ. 4; ЗЕО ГО N0. 6; ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 8;

ЗЕО ГО ΝΟ. 10; ЗЕО ГО N0. 14; ЗЕО ГО N0. 16; ЗЕО ГО ΝΟ. 22; ЗЕО Ι0 N0. 24;

ЗЕО ГО ΝΟ. 34; ЗЕО ГО N0.38; ЗЕО ГО ΝΟ. 40; ЗЕО ГО ΝΟ. 42; ЗЕО ГО ΝΟ. 50;

ЗЕО Ю ΝΟ. 52; ЗЕО Ю N0. 54; ЗЕО Ю N0. 58 и ЗЕО Ю ΝΟ. 60, и их фрагменты.

- 97 010726

2. Агент по п.1. являющийся антителом.

3. Агент по п.2. являющийся поликлональным. моноклональным. химерным. гуманизированным или полноразмерным антителом человека.

4. Агент по п.3. являющийся одноцепочечным антителом.

5. Гибридома. продуцирующая моноклональное антитело по п.3.

6. Конъюгат. содержащий агент по п.1.

7. Конъюгат. содержащий агент по любому из пп.2. 3 или 4.

8. Молекула нуклеиновой кислоты. кодирующая агент по п.1.

9. Молекула нуклеиновой кислоты. кодирующая агент по любому из пп.2. 3 или 4.

10. Вектор. содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.8 или 9.

11. Клетка-хозяин. содержащая вектор по п.10.

12. Способ получения агента. специфически связывающего ангиопоэтин-2. включающий:

(a) трансформацию клетки-хозяина по крайней мере одной молекулой нуклеиновой кислоты. кодирующей агент по п.1;

(b) обеспечение экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине; и (c) выделение указанного агента.

13. Способ получения антитела. специфически связывающего ангиопоэтин-2. включающий:

(a) трансформацию клетки-хозяина по крайней мере одной молекулой нуклеиновой кислоты. кодирующей агент по любому из пп.2. 3 или 4;

(b) обеспечение экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине; и (c) выделение указанного антитела.

14. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по п.1.

15. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по п.1.

16. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по любому из пп.2. 3 или 4.

17. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по любому из пп.2. 3 или 4.

18. Фармацевтическая композиция. содержащая специфический связывающий агент по п.1 и дополнительный агент в фармакологически доступной форме.

19. Фармацевтическая композиция. содержащая агент по любому из пп.2. 3 или 4 и дополнительный агент в фармакологически доступной форме.

20. Способ модулирования или ингибирования активности ангиопоэтина-2. заключающийся во введении агента по п.1.

21. Способ модулирования или ингибирования активности ангиопоэтина-2. заключающийся во введении агента по любому из пп.2. 3 или 4.

22. Способ модулирования сосудистой проницаемости или утечки плазмы в организме млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по п.1.

23. Способ лечения глазного неоваскулярного заболевания. ожирения. гемангиобластомы. гемангиомы. артериосклероза. воспалительных заболеваний. воспалительных нарушений. атеросклероза. эндометриоза. неопластических заболеваний. заболеваний костной системы и псориаза у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по п.1.

24. Способ модулирования сосудистой проницаемости или утечки плазмы в организме млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по любому из пп.2. 3 или 4.

25. Способ лечения глазного неоваскулярного заболевания. ожирения. гемангиобластомы. гемангиомы. артериосклероза. воспалительных заболеваний. воспалительных нарушений. атеросклероза. эндометриоза. неопластических заболеваний. заболеваний костной системы и псориаза у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по любому из пп.2. 3 или 4.

26. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по п.1 и химиотерапевтического агента.

27. Способ по п.26. заключающийся в неодновременном введении связывающего агента и химиотерапевтического агента.

28. Способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих. заключающийся во введении терапевтически эффективного количества агента по любому из пп.2. 3 или 4 и химиотерапевтического агента.

29. Способ по п.26. заключающийся в неодновременном введении связывающего агента и химиотерапевтического агента.

30. Агент. специфически связывающий ангиопоэтин-2. содержащий СОК1. выбранную из

- 98 010726

526 НС (ЗЕО ГО N0.1); 528 НС (5Е0 Ю N0. 3); 531 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 5); 533 НС (ЗЕО 10 N0 7); 535 НС (ЗЕО ГО N0. 9); 536 НС (ЗЕО ГО

N0. 11); 537 НС (ЗЕО ГО ΝΟ, 13); 540 НС (ЗЕО Ι0 N0. 15); 543 НС (ЗЕО ГО N0.

17); 544 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 19); 545 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 21); 546 НС (ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 23);

551 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 25); 553 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 27); 555 НС (ЗЕО ГО N0. 29); 558 НС (ЗЕО ГО N0. 31); 559 НС (ЗЕО ГО N0. 33); 565 НС (ЗЕО ГО N0. 35); Е1-С6 НС (ЗЕО ГО N0. 37); ЕВ1-А7 НС (ЗЕО ГО N0. 39); Е0-В2 НС (ЗЕО ГО N0. 41); ЕЕ-В7 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 43); N-011 НС (ЗЕО ГО N0. 45); ЕК-ЕЗ НС (ЗЕО ГО ΝΟ.

47); 0104 НС (ЗЕО ГО N0. 49); 0С1Е8 НС (ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 51); Н1С12 НС (ЗЕО ГО

ΝΟ. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 55); 1Е-1С10 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 57); ΙΚ-2Ε2 НС (ЗЕО ГО N0. 59); 1Р-1С11 НС (ЗЕО ГО N0. 61); 526 каппа (ЗЕО ГО N0.2); 536 каппа (ЗЕО ГО N0.12); 543 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 18); 544 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 20);

551 каппа (ЗЕО ГО N0. 26); 553 каппа (ЗЕО ГО N0. 28); 555 каппа (ЗЕО ГО N0.

30); 558 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 32); 565 каппа (ЗЕО ГО N0. 36); ЕЕ-В7 каппа (ЗЕО

Ю ΝΟ. 44); N-011 каппа (ЗЕО ГО N0. 46); ЕК-ЕЗ каппа (ЗЕО Ι0 N0. 48); ΙΑ11Е7 каппа (ЗЕО ГО N0. 56); 1Р-2С11 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 62); 528 лямбда (ЗЕО ГО N0. 4); 531 лямбда (ЗЕО Ю N0. 6); 533 лямбда (ЗЕО ГО N0. 8); 535 лямбда (ЗЕО ГО N0. 10); 537 лямбда (ЗЕО ГО N0. 14); 540 лямбда (ЗЕО ГО N0. 16);

545 лямбда (ЗЕО ГО N0. 22); 546 лямбда (ЗЕО ГО N0. 24); 559 лямбда (ЗЕО ГО

ΝΟ. 34); Е1-С6 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 38); ЕВ1-А7 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 40); ЕОВ2 лямбда (ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 42); 0104 лямбда (ЗЕО Ю N0. 50); СС1Е8 лямбда (ЗЕО ГО N0. 52); Н1С12 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 54); 1Е-1С10 лямбда (ЗЕО ΙΟ ΝΟ.

58); и ΙΚ-2Ε2 лямбда (ЗЕО 10 ΝΟ. 60), причем локализация СЭК1 соответствует представленной в табл. 7.

31. Агент, специфически связывающий ангиопоэтин-2, содержащий СОЯ2, выбранную из

526 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 1); 528 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 3); 531 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 5); 533 НС (ЗЕО ГО N0. 7); 535 НС (ЗЕО ГО N0. 9); 536 НС (ЗЕО ГО

N0. 11); 537 НС (ЗЕО ГО N0. 13); 540 НС (ЗЕО ГО N0. 15); 543 НС (ЗЕО ГО N0.

17); 544 НС (ЗЕО ГО N0. 19); 545 НС (ЗЕО ГО N0. 21); 546 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 23);

551 НС (ЗЕО ГО N0. 25); 553 НС (ЗЕО ГО N0. 27); 555 НС (ЗЕО ГО N0. 29); 558 НС (ЗЕО Ю N0. 31); 559 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 33); 565 НС (ЗЕО Ю ΝΟ. 35); Г1-С6 НС (ЗЕО Ю N0. 37); ГВ1-А7 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 39); Εϋ-Β2 НС (ЗЕО ГО N0. 41); ЕЕ-В7 НС (ЗЕО ГО N0. 43); N-011 НС (ЗЕО ГО N0. 45); ЕК-ЕЗ НС (ЗЕО ГО ΝΟ.

47); 6104 НС (ЗЕО ГО N0. 49); 0С1Е8 НС (ЗЕО ГО N0. 51); Н1С12 НС (ЗЕО ГО

N0. 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (ЗЕО ГО N0. 55); 1Г-1С10 НС (ЗЕО ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 59); 1Р-1С11 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 61); 526 каппа (ЗЕО ГО N0. 2); 536 каппа (ЗЕО Ю ΝΟ. 12); 543 каппа (ЗЕО Ю N0. 18); 544 каппа (ЗЕО ГО N0. 20);

551 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 26); 553 каппа (ЗЕО Ю ΝΟ. 28); 555 каппа (ЗЕО ГО N0.

30); 558 каппа (ЗЕО Ю ΝΟ. 32); 565 каппа (ЗЕО Ю N0. 36); ЕЕ-В7 каппа (ЗЕО ГО N0. 44); Гб-011 каппа (ЗЕО ГО N0. 46); ЕК-ЕЗ каппа (ЗЕО ГО N0. 48); ΙΑ11Е7 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 56); 1Р-2С11 каппа (ЗЕО <0 N0. 62); 528 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 4); 531 лямбда (ЗЕО ГО N0. 6); 533 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 8); 535 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 10); 537 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 14); 540 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 16);

545 лямбда (ЗЕО ГО N0. 22); 546 лямбда (ЗЕО ГО N0. 24); 559 лямбда (ЗЕО Ю N0. 34); Е1-С6 лямбда (ЗЕО Ю N0. 38); ЕВ1-А7 лямбда (ЗЕО ГО N0. 40); ΕϋВ2 лямбда (ЗЕО ГО N0. 42); 01 ϋ4 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 50); 0С1Е8 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 52); Н1С12 лямбда (ЗЕО ГО N0. 54); 1Г-1С10 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ.

58); и ΙΚ-2Ε2 лямбда (ЗЕО ГО N0. 60),

- 99 010726 причем локализация ί.ΌΚ2 соответствует представленной в табл. 7.

32. Агент, специфически связывающий ангиопоэтин-2, содержащий СОК3, выбранную из

526 НС (ЗЕО ГО N0.1); 528 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 3); 531 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 5); 533 НС (ЗЕО ГО N0.7); 535 НС (ЗЕО ГО N0.9); 536 НС (ЗЕО ГО

551 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 25); 553 НС (ЗЕО ГО N0. 27); 555 НС (ЗЕО ГО N0. 29); 558

НС (ЗЕО ГО N0. 31); 559 НС (ЗЕО ГО N0. 33); 565 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 35); Е1-С6

НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 37); ЕВ1-А7 НС (ЗЕО ГО N0. 39); Е0-В2 НС (ЗЕО ГО N0. 41);

ЕЕ-В7 НС (ЗЕО ГО N0. 43); Еб-611 НС (ЗЕО ГО N0. 45); ЕК-ЕЗ НС (ЗЕО ГО N0.

47); 61 Э4 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 49); 6С1Е8 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 51); Н1С12 НС (ЗЕО ГО

ΝΟ. 53); 1А1-1Е7 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 55); 1Е-1С10 НС (ЗЕО ГО N0. 57); ΙΚ-2Ε2 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 59); 1Р-2С11 НС (ЗЕО ГО N0. 61); 526 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 2); 536 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 12); 543 капла (ЗЕО ГО N0. 18); 544 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 20);

551 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 26); 553 каппа (ЗЕО ГО N0. 28); 555 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ.

ГО ΝΟ. 44); Еб-611 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 46); ЕК-ЕЗ капла (ЗЕО ГО N0. 48); 1А11Е7 каппа (ЗЕО ГО N0. 56); 1Р-2С11 каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 62); 528 каппа (ЗЕО ГО

N0. 4); 531 каппа (ЗЕО ГО N0. 6); 533 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 8); 535 лямбда (ЗЕО

ГО ΝΟ. 10); 537 лямбда (ЗЕО ГО N0. 14); 540 лямбда (ЗЕО ГО N0. 16); 545 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 22); 546 лямбда (ЗЕО ГО N0. 24); 559 лямбда (ЗЕО ГО N0.

34); Е1-С6 лямбда (ЗЕО ГО N0. 38); ЕВ1-А7 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 40); Εϋ-Β2 лямбда (ЗЕО ГО N0. 42); 61ϋ4 лямбда (ЗЕО ГО N0. 50); 6С1Е8 лямбда (ЗЕО

ГО N0. 52); Н1С12 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 54); 1Е-1С10 лямбда (ЗЕО ГО N0. 58); и ΙΚ-2Ε2 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 60), причем локализация ί.ΌΚ3 соответствует представленной в табл. 7.

33. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая агент по любому из пп.30, 31 или 32.

34. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:

(a) обеспечение взаимодействия агента по п.1 с биологическим образцом;

(b) определение продолжительности связывания агента с указанным образцом, и (c) корреляцию продолжительности связывания агента с образцом с уровнем ангиопоэтина-2 в образце.

35. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:

(a) обеспечение взаимодействия агента по п.2 с биологическим образцом;

(b) определение продолжительности связывания антитела с указанным образцом, и (c) корреляцию продолжительности связывания агента с образцом с уровнем ангиопоэтина-2 в образце.

36. Антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает вариабельный участок, выбранный из

526 НС (ЗЕ6 ГО

N0. 1); 528 НС (3ΕΘ ГО N0. 3); 531 НС (3ΕΘ ГО N0.5); 533 НС (ЗЕ6 ГО ΝΟ. 7);

535 НС (ЗЕ6 ГО ΝΟ. 9); 536 НС (ЗЕО 10 ΝΟ. 11); 537 НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 13); 540

НС (3ΕΘ ГО N0.15); 543 НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 17); 544 НС (3ΕΘ ГО N0. 19); 545 НС (ЗЕС ГО ΝΟ. 21); 546 НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 23); 551 НС (8ΕΘ ГО ΝΟ. 25); 553 НС (ЗЕС ГО ΝΟ. 27); 555 НС (3ΕΘ ГО N0. 29); 558 НС (8ΕΘ ГО ΝΟ. 31); 559 НС (ЗЕО ГО N0. 33); 565 НС (ЗЕО ГО N0. 35); Е1-С6 НС (ЗЕ6 ГО N0. 37); ЕВ1-А7

НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 39); Εϋ-Β2 НС (ЗЕО Ю N0. 41); ЕЕ-В7 НС (3ΕΘ ГО N0.43); Еб(311 НС (ЗЕО ГО ΝΟ. 45); ЕК-ЕЗ НС (3ΕΘ ГО N0.47); 6104 НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 49);

СС1Е8 НС (3ΕΘ ГО N0. 51); Н1С12 НС (ЗЕ6 ГО N0. 53); 1А1-Е7 НС (3ΕΘ ГО

ΝΟ. 55); 1Е-1С10 НС (ЗЕ6 ГО ΝΟ. 57); ΙΚ-2Ε2 НС (3ΕΘ ГО ΝΟ. 59); 1Р-2С11 НС (ЗЕ6 ГО ΝΟ. 61)

- 100 010726 и связывающих ангиопоэтин-2 фрагментов данного участка;

и легкая цепь содержит вариабельный участок, выбранный из

526 каппа (8ΕΘ Ю N0.2); 536 каппа (ЗЕС Ю N0. 12); 543 каппа (8Е6 ГО N0.18);

544 каппа (ЗЕС Ю N0.20); 551 каппа (ЗЕС Ю N0. 26); 553 каппа (ЗЕС Ю N0.

28); 555 каппа (8Е6 Ю N0. 30); 558 каппа (ЗЕС Ю N0. 32); 565 каппа (ЗЕС Ю

N0. 36); РЕ-В7 каппа (ЗЕО ГО N0. 44); ЕЗ-611 каппа (ЗЕС Ю N0. 46); РК-ЕЗ каппа (ЗЕО ГО ΝΟ. 48); 1А-1Е7 каппа (ЗЕО ГО N0. 56); 1Р-2С11 каппа (ЗЕО ГО

N0. 62); 528 лямбда (ЗЕО ГО N0. 4); 531 лямбда (ЗЕО ГО N0. 6); 533 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 8); 535 лямбда (ЗЕО ГО N0. 10); 537 лямбда (ЗЕО ГО N0. 14); 540 лямбда (ЗЕО Ю N0. 16); 545 лямбда (8Е0 ГО ΝΟ. 22); 546 лямбда (8Е0 ГО ΝΟ.

24); 559 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 34); Р1-С6 лямбда (ЗЕО ГО N0. 38); РВ1-А7 лямбда (ЗЕО ГО N0. 40); Ρϋ-Β2 лямбда (8Е0 ГО ΝΟ. 42); 0104 лямбда (ЗЕО ГО

ΝΟ. 50); 0С1Е8 лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 52); Н1С12 лямбда (ЗЕО ГО N0. 54); 1Р1 СЮ лямбда (ЗЕО ГО ΝΟ. 58); ΙΚ-2Ε2 лямбда (ЗЕО Ю ΝΟ. 60) и связывающих ангиопоэтин-2 фрагментов данного участка.

37. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.36.

38. Агент по п.32, содержащий 0ΌΒ3. выбранную из 536 НС (8ЕЦ ГО N0. 11) или 536 каппа (8ЕЦ Ш N0. 12), и дополнительно содержащий по меньшей мере одну из СОВ 1 или С0В2 536 каппа (8ЕЦ Ш N0. 12) или 536 НС (8ЕЦ ГО N0. 11).

39. Агент по п.32, содержащий С О КЗ последовательности 8ЕЦ Ш N0. 11 или СЭКЗ последовательности 8 Ер Ш N0. 12.

40. Изолированное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает вариабельный участок, выбранный из С0К.1, С0К2 и СОКЗ последовательности 8 Ер Ю N0. 11, а легкая цепь включает вариабельный участок, выбранный из СОК1, СОК2 и СОКЗ последовательности 8ЕЦ ГО N0. 12.

41. Антитело по п.40, у которого вариабельный участок тяжелой цепи включает последовательность 8 Ер Ю N0. 11, а вариабельный участок легкой цепи включает СОК1, С0К2 и СОКЗ последовательности 8ЕЦ Ш N0. 12.

42. Антитело по п.40, у которого вариабельный участок тяжелой цепи включает С0К1, С0К2 и СОКЗ последовательности 8 Ер Ю N0. 11, а вариабельный участок легкой цепи включает последовательность 8 Ер Ю N0. 12.

43. Антитело по п.40, у которого вариабельный участок тяжелой цепи включает последовательность 8 Ер Ю N0. 11, а вариабельный участок легкой цепи включает последовательность 8ЕЦ ГО N0. 12.

44. Антитело по п.40, которое представляет собой одно цепочечное Εν антитело.

45. Антитело по п.40, которое представляет собой ЕаЬ фрагмент антитела.

46. Антитело по п.40, которое представляет собой ЕаЬ' фрагмент антитела.

47. Антитело по п.40, которое представляет собой (ЕаЬ')г фрагмент антитела.

48. Изолированное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь включает вариабельный участок, содержащий аминокислотную последовательность 8 Ер Ш N0. 11.

49. Изолированное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем легкая цепь включает вариабельный участок, содержащий аминокислотную последовательность 8 Ер Ш N0. 12.

50. Изолированное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность 8 Ер Ш N0. 11, или его антигенсвязывающий фрагмент, причем антигенсвязывающий фрагмент содержит, по меньшей мере, СИВ.1, СИК2 и СИКЗ последовательности 8ЕЦ Ш N0. 11, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность 8 Ер Ш N0. 12, или его антигенсвязывающий фрагмент, причем антигенсвязывающий фрагмент содержит, по меньшей мере, СОВ.1, 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 последовательности 8 Ер Ш N0. 12

51. Изолированное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, содержащее:

a) каркасный участок тяжелой цепи, СИВ.1 участок тяжелой цепи, содержащий ΟΌΕΙ последовательности 8 Ер Ш N0. 11, СИК2 участок тяжелой цепи, содержащий СИК2 последовательности §Ер Ш N0. 11, и СИКЗ участок тяжелой цепи, содержащий СИКЗ последовательности 8 Ер Ш N0. 11, и

b) каркасный участок легкой цепи, ΕΌΕI участок легкой цепи, содержащий ΕΌΕI последовательности §Εζ) Ш N0. 12, СИВ.2 участок легкой цепи, содержащий СИВ.2 последовательности 8 Ер Ш N0. 12, и СИКЗ участок легкой цепи, содержащий СЭКЗ последовательности 8Ер Ш N0. 12.