ES2713068T3

ES2713068T3 - Derivados de IGFBP-3 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2713068T3
Application number: ES12705682T
Authority: ES
Inventors: Jean-François Godeau; Bouc Yves Le
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2011-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: WO2012113900A1; JP2014508760A; JP6190275B2; CA2825357A1; EP2678353A1; CA2825357C; EP2678353B1; US20150290297A1; US9878016B2; US20140005098A1

Abstract

Un derivado polipeptídico de IGFBP-3 que comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, en el que: el dominio N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biológicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y la subunidad ácido-lábil (ALS); el dominio intermedio comprende la secuencia de aminoácidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 humana de tipo salvaje, en el que 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 o 92 residuos de aminoácidos contiguos de dicha secuencia de aminoácidos se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escisión proteolítica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4; y el dominio C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biológicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS.

Description

DESCRIPCION

Derivados de IGFBP-3 y usos de los mismos

Solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Europea N.° EP 11 305 197.3 presentada el 24 ^{de febrero de}2011^.

Estado de la tecnica

El sistema IGF (factor de crecimiento insulmico) consiste en un conjunto bien caracterizado de polipeptidos que las celulas utilizan para comunicarse con su entorno fisiologico. Este sistema comprende dos receptores de superficie celular (IGF1R e IGF2R), dos ligandos peptfdicos (IGF-I e IGF-II), una familia de seis protemas de union a IGF de alta ^{afinidad (IGFBP-1 a}6 ^{), asf como enzimas de degradacion de IGFBP asociadas, denominadas colectivamente}proteasas. La v^a de senalizacion de IGF no solo es un participante importante en el crecimiento estatural de los mairnferos, sino que tambien esta implicado en la proliferacion y la supervivencia celular. A pesar de que la hormona del crecimiento (Gh ) es el principal regulador de la produccion de IGF-I en muchos tejidos, los IGF se producen de manera casi ubicua y circulan a altas concentraciones en el suero unido principalmente a las IGBP. Para que los IGF ejerzan sus efectos a traves de la asociacion con IGF1R, su receptor de la superficie celular de la tirosina cinasa, primero deben disociarse de los complejos formados con la IGFBP cuyas afinidades por IGF-I e IGF-II son a veces mayores que las de IGF1R. Por lo tanto, la interaccion receptor-ligando es altamente dependiente de los niveles de IGF "libres" que estan fuertemente regulados por las IGFBP presentes en el suero y otros fluidos biologicos. Por lo tanto, la interaccion de los IGF con los IGFBP puede prevenir los efectos adversos de los IGF, tal como la proliferacion celular descontrolada o la hipoglucemia. Por el contrario, la alteracion del complejo IGF/IGFBP es un requisito previo probable para que los IGF ejerzan sus efectos mitogenicos y metabolicos a traves del receptor de IGF.

La via de senalizacion de IGF desregulada ha emergido como un participante principal en la patogenia de numerosos tumores malignos, asf como en su resistencia a los agentes quimioterapeuticos (Samani et al., Endocr. Rev., 2006, 24: 24). El aumento de la actividad en esta via promueve la proliferacion celular a traves de la activacion de la via Ras/MAPK/ERK, y contrarresta las senales pro-apoptoticas a traves de la activacion de la via de senalizacion de PI3-cinasa. Por estas razones, el direccionamiento de la via de senalizacion de IGF para reducir su actividad se ha convertido en un desaffo importante de la investigacion medica actual (Yuen y Macaulay, Expert. Opin. Ther. Targets, 2008, 12: 589-603).

Ademas, la modificacion del suministro de IGF a ciertos tejidos podna ayudar a controlar el transcurso de una amplia diversidad de enfermedades humanas, incluido el enanismo debido a la deficiencia de IGF, diabetes tipo I y tipo II, pero tambien enfermedades degenerativas, tal como distrofia muscular miotonica (Heatwole et al., Arch. Neurol., 2011, 68^{: 37-44), neurodegeneracion por esclerosis lateral amiotrofica (Goberdhan et al., Differentiation, 2003, 71: 375-397)}y retinopatfas vasculo-proliferativas tales como las que complican la diabetes, la prematuridad y el envejecimiento e incluso arteriosclerosis. Ademas, un aumento agudo en el IGF biodisponible puede ser beneficioso para los pacientes que padecen quemaduras, isquemia cerebral o cardfaca, smdromes de desgaste y perdidas de densidad mineral osea ^{(Clemmons, Nat. Rev. Drug Discov., 2007,}6 ^{: 821-833).}

Las concentraciones de IGF-I e IGF-II en la sangre estan, al menos en parte, determinadas indirectamente por los niveles de IGFBP. La protema 3 de union al factor de crecimiento insulmico (IGFBP-3) es la IGFBP mas abundante en la sangre y tiene la afinidad mas alta por el IGF-I y el IGF-II y, por lo tanto, es el principal deposito de IGF en el torrente sangumeo (Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 1995, 16: 3-34). Ademas de su papel en el secuestro y transporte de IGF, IGFBP-3 puede tener sus propios efectos biologicos. En lmea con sus cinco congeneres de IGFBP, IGFBP-3 consiste en tres dominios de tamano aproximadamente igual, de los cuales solo los dominios N-terminal y C-terminal participan en la union al IGF (Sitar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103: 13028-13033). El dominio intermedio, que esta poco estructurado, es el objetivo de las escisiones proteolfticas cruciales para algunas de sus funciones (Fowlkes et al., Endocrinology, 2004, 145: 620-626). Las proteasas degradantes de IGFBP inducen la liberacion de IGF, a partir de complejos iGf/IGFBP-3, lo que hace que el IGF este disponible para la accion biologica. Ademas, ciertas proteasas libres de IGFBP tambien pueden ser activadas por las proteasas, dando como resultado una afinidad reducida para los IGF.

Se han utilizado varios enfoques para dirigirse a la via de senalizacion de IGF incluyendo (1) la reduccion de los niveles de IGF-1 o la bioactividad utilizando anticuerpos espedficos de ligando (Goya et al., Cancer Res., 2004, 64: 6252 6258) o antagonistas de la hormona del crecimiento (GH) (Divisova et al., Breast Cancer Res. Treat., 2006, 98: 315 327) y (2) la inhibicion de la funcion del receptor de IGF utilizando (a) anticuerpos espedficos del receptor, tales como los anticuerpos anti-IGFIR desarrollados por Pfizer (CP-751871 - Lacy et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3196-3203; Haluska et al., Clin. Cancer Res., 2007, 13: 5834-5840; De Bono et al., Clin. Cancer Res., 2007, 13: 3611-3616), Amgen (AMG479 - Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2007, 25: 3002; Sarantopoulos et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3583)), Sanofi-Aventis (AVE1642 - Tolcher et al., J. Clin. Oncol., 2008, 25: 3582), Imclone (A12 - Higano et al., J. Clin. Oncol., 2007, 25: 3505), Merck (MK0646 - Hidalgo et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3520; Atzori et al., J. Clin. Oncol., 2008, 26: 3519) y Roche (R1507 - Rodon et al., J. Clin. Oncol., 2007, 26: 3590) o (b) los inhibidores de tirosina cinasa de molecula ^{pequena (Haluska et al., Cancer Res., 2006,}66^{: 362-371; Ji et al., Mol. Cancer Ther., 2007,}6^{: 2158-2167;}Zimmermann et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18: 4075-4080; Mulvihill et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 16: 1359-1375; Hofmann et al., Drug Discov. Today, 2005, 10:1041-1047; Vasilcanu et al., Oncogene, 2008, 27: 1629 1638).

La administracion de IGF-I recombinante (llamada mecasermina, nombre comercial: Increlex™ de Tercica, Inc.), cuando esta indicada, se ve obstaculizada por efectos secundarios no deseados tal como hipoglucemia, la corta semivida de IGF-I libre y al mismo tiempo una reducida eficacia debido a las IGFBP endogenas. En un intento por aumentar la semivida mientras se reducen estos efectos secundarios del IGF-1 humano recombinante (rhIGF-1), se ha desarrollado un enfoque que consiste en la administracion de un complejo compuesto de cantidades equimolares de rhIGF-1 e IGFBP-3 humana recombinante (rhIGFBP-3) (rinfabato de mecasermina, nombre comercial: SomatoKine™ o Iplex™ de Insmed Corp.). La eficacia del complejo rhIGF-1/rhIGFBP-3 se ha probado en sujetos con resistencia a la insulina grave (Regan et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., May 2010, 95: 2113-2122), smdrome de insensibilidad a la hormona del crecimiento (Kemp et al., Endocr. & Metabol., 2006, 15: 409-415; Tonella et al., Horm. Res. Paediatr., Feb. 2010, 73: 140-147), diabetes tipo 1 (Clemmons et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 2000, 85: 1518 1524), diabetes tipo 2 (Clemmons et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 2005, 90: 6561-6568), osteoporosis (Boonen et al., ^{Endocrinol. Metab., 2002, 87: 1593-1599), quemaduras (Jeschke et al., Mol. Med., 2002,}8^{: 238-246), distrofia}miotonica tipo 1 (Heatwole et al., Arch. Neurol., Sept. 2010), asf como en ninos de bajo paso al nacer (Iniguez et al., Clin. Endocrinol., 2006, 65: 687-392).

Estos estudios son alentadores porque demuestran la utilidad de este enfoque para administrar IGF-I con fines terapeuticos.

El documento WO 2004/007543 describe IGFBP-2 modificadas, que son resistentes a la escision proteolftica y que no se unen a la matriz extracelular (ECM) pero conservan su afinidad por los IGF. Estas IGFBP-2 modificadas se describen como utiles en el tratamiento del cancer.

La secuencia basica en IGFBP-3, aminoacidos 228-232 (KGRKR) cuando se reemplaza por MDGEA, da como resultado variantes de IGFBP-3 con union reducida a IGF-I y afinidad reducida por ALS (Baxter, et al, Progress in Growth Factor Res., 1995, 6:215-222).

Objeto de la invencion

La presente invencion se refiere a derivados de IGFBP-3 que son utiles en una diversidad de aplicaciones terapeuticas y/o de diagnostico.

En particular, en un aspecto, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que son resistentes a la escision proteolftica y que muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS (subunidad acido-labil) que son identicas o sustancialmente similar a las afinidades de union correspondientes de IGFBP-3 de tipo silvestre.

Mas espedficamente, la presente invencion proporciona un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 que comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, en el que:

(i) el dominio N-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biologicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y la subunidad acido-labil (ALS);

(ii) el dominio intermedio comprende la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 humana ^{de tipo salvaje, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91 o 92 residuos de aminoacidos contiguos de dicha secuencia de}aminoacidos se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4; y

(iii) el dominio C-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biologicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS.

En determinadas realizaciones, el dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:2.

En otras realizaciones, el dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre consiste en la secuencia expuesta en la ^{SEQ ID NO: 2, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91 o 92 residuos de aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 2 se}reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

En determinadas realizaciones, (i) la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (ii) la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

En determinadas realizaciones, (i) el dominio N-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3 consiste en la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 1; y (ii) el dominio C-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3 consiste en la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 3.

En un aspecto relacionado, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que son resistentes a la escision proteolttica, que muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II y heparina que son identicas o sustancialmente similares a las afinidades de union respectivas de IGFBP-3 de tipo silvestre, pero que no se unen a ALS. Mas espedficamente, tal derivado de IGFBP-3 es como se define en el presente documento, excepto que el dominio C-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 3, en la que los residuos de aminoacidos 43 a 47 en la SEQ ID NO: 3 se reemplazan con AGGSG (SEQ ID NO: 5).

En otro aspecto relacionado, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que tienen una afinidad aumentada por IGF y una semivida en plasma prolongada. Mas espedficamente, tal derivado de IGFBP-3 es como se define en el presente documento y comprende ademas, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos del fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1.

En otro aspecto relacionado, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que comprenden ademas la secuencia de aminoacidos de iGF-I. Mas espedficamente, en tal derivado de IGFBP-3, el IGF-I forma un complejo con el derivado polipeptfdico de IGFBP-3. En determinadas realizaciones preferidas, la secuencia de aminoacidos de IGF-I es la secuencia de aminoacidos de IGF-I humano.

En aun otro aspecto relacionado, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que son susceptibles de biotinilacion por la enzima BirA. Mas espedficamente, tal derivado de IGFBP-3 es como se define en el presente documento y ademas comprende un sustrato de la enzima BirA unido covalentemente al extremo terminal del dominio C-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3. En determinadas realizaciones, el sustrato de la enzima BirA tiene ^{la secuencia expuesta en la s Eq ID NO:}6^{. En determinadas realizaciones, el derivado de IGFBP-3 comprende biotina}adicional unida covalentemente al sustrato de la enzima BirA.

Todavfa en otro aspecto relacionado, la presente invencion proporciona derivados de IGFBP-3 que son protemas indicadoras estables dotadas de alta afinidad tanto por IGF-I como por IGF-II. Mas espedficamente, tal derivado de IGFBP-3 es como se define en el presente documento y comprende ademas, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP (fosfatasa alcalina secretada).

Los derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 de la presente invencion pueden ser utiles en una diversidad de tratamientos terapeuticos. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento, excepto los asociados con la secuencia de aminoacidos de IGF-1, se proporcionan para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado de canceres y retinopatfas proliferativas. En otras realizaciones, los derivados de IGFBP-3 asociados con la secuencia de aminoacidos de IGF-I se proporcionan para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en resistencia a la hormona de crecimiento, deficiencia de IGF-I, quemaduras graves, desgaste por VIH, fibrosis qrnstica, enfermedad celfaca, anorexia nerviosa, enfermedad de desgaste muscular, distrofia miotonica, esclerosis lateral amiotrofica, osteoporosis, resistencia grave a la insulina, diabetes de tipo I, diabetes tipo II, isquemia cerebral, e isquemia cardfaca.

El presente documento tambien describe un metodo de tratamiento de un trastorno en un sujeto, comprendiendo el metodo una etapa de administrar una cantidad eficaz de un derivado de IGFBP-3 al sujeto. La administracion de un derivado de IGFBP-3 a un sujeto puede ser por cualquier via adecuada, incluyendo, por ejemplo, las vfas parenteral, aerosol, oral, intraocular y topica. El derivado de IGFBP-3 se puede administrar solo o en combinacion con cualquier agente o procedimiento terapeutico adicional. El trastorno a tratar se selecciona del grupo que consiste en canceres y retinopatfas proliferativas, o del grupo que consiste en resistencia a la hormona del crecimiento, deficiencia de IGF-I, quemaduras graves, desgaste por VlH, fibrosis qrnstica, enfermedad celfaca, anorexia nerviosa, enfermedad de desgaste muscular, distrofia miotonica, esclerosis lateral amiotrofica, osteoporosis, resistencia grave a la insulina, diabetes de tipo I, diabetes tipo II, isquemia cerebral, afecciones neurodegenerativas (tal como enfermedad de Alzheimer), isquemia cardfaca, retinopatfa del prematuro, e injertos.

Los derivados de IGFBP-3 pueden administrarse per se o como composiciones farmaceuticas. Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de un derivado de IGFBP-3 de la invencion y al menos un vehnculo o excipiente fisiologicamente aceptable. La composicion farmaceutica puede adaptarse para la administracion en combinacion con al menos un agente terapeutico adicional. La composicion farmaceutica puede comprender ademas al menos un agente terapeutico adicional.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para determinar la concentracion de pro-IGF-II en una muestra biologica, comprendiendo el metodo las etapas de:

poner en contacto la muestra biologica con un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 que comprende, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP, para permitir la formacion de un complejo entre el derivado de IGFBP-3 y cualquier pro-IGF-II presente en la muestra biologica, en donde pro-IGF-II es una forma parcialmente procesada de IGF-II; y

determinar la concentracion de pro-IGF-II en la muestra biologica midiendo la actividad alcalina de SeAP en el complejo.

En un aspecto relacionado, la presente invencion proporciona un kit que comprende un derivado polipeptidico de IGFBP-3 que comprende, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP y al menos un reactivo para medir la actividad alcalina.

Estos y otros objetos, ventajas y caractensticas de la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica que hayan lefdo la siguiente descripcion detallada de las realizaciones preferidas.

Descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un mapa de restriccion del plasmido pDB3s-H6-IGFBP-3 (panel superior) posteriormente utilizado como plantilla para generar, mediante mutagenesis de sitio dirigido el plasmido mutante (pDB3s-H6-^{IGFBP-3) que codifica H}6^{-mini- IGFBP-3 (panel inferior). El ultimo plasmido codifica la protema mini-IGFBD-3}descrita en la Figura 2.

La Figura 2(A) es una representacion esquematica de IGFBP-3 recombinante de tipo silvestre (H6-IGFBP-3) y mutada (mini-IGFBP-3). La Figura 2(B) muestra un alineamiento de las secuencias de aminoacidos de mutema H6-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3. El dominio N-terminal se presenta en color azul, el dominio intermedio en color gris, y el dominio C-terminal en color naranja. La secuencia de purificacion de hexa-histidina se presenta en color verde y los sitios potenciales de N-glucosilacion estan simbolizados por indicadores.

La Figura 3 es un grafico que muestra la cinetica de asociacion y disociacion del complejo mini-IGFBP-3/IGF-II analizado por resonancia de plasmon superficial (vease el Ejemplo 2 para obtener detalles experimentales).

La Figura 4 presenta geles que muestran la susceptibilidad de IGFBP-3 de tipo silvestre (izquierda) y de mini-IGFBP-3 (derecha) a la degradacion proteolttica por trombina (vease el Ejemplo 2 para obtener detalles experimentales).

La Figura 5 muestra un mapa de restriccion del vector de transferencia pRH-3s-avitag obtenido por mutagenesis de sitio dirigido y en el que la secuencia de codificacion de mini-IGFBP-3 se ha insertado para producir secuencialmente el vector pRH-3s-H6-mini-IGFBP-3, el virus recombinante AcMNPV-mini-IGFBP-3 y la protema recombinante mini-IGFBP-3-avitag.

La Figura 6 muestra los resultados de un analisis electroforetico de mini-IGFBP-3-Avitag recombinante despues de la biotinilacion enzimatica dirigida. Panel izquierdo: H6-IGFBP-3 (A) recombinante purificado, mini-IGFBP-3 (B) y mini-IGFBP-3-Avitag (C) se analizaron mediante SDS-PAGE y se tineron con azul brillante de Coomassie. Panel derecho: Se sometio mini-IGFBP-3-Avitag purificado a biotinilacion con biotina y la enzima BirA, y se cargo una almuota del producto de reaccion en un analisis por SDS-PAGE (E) lado a lado con un anticuerpo monoclonal (7E8) biotinilado qmmicamente previamente (D). Vease el Ejemplo 3 para obtener detalles experimentales.

La Figura 7(A ) muestra el analisis electroforetico de diferentes extractos de protemas de (a) sobrenadante de cultivo de celulas Sf-9 infectadas por un virus que produce de mini-IGFBP-3 parental, (b) sobrenadante de cultivo de celulas Sf-9 infectadas por un virus que produce mini-IGFBP-3-avitag, y (c) mini-IGFBP-3-avitag purificado. La Figura 7(B) muestra el analisis electroforetico de los extractos de protemas despues de la biotinilacion de BirA dirigida, la separacion por SDS-PAGE, la transferencia en una membrana de PVDF, la incubacion con estreptavidina-AP y la actividad de APasa mediante la adicion de NBT/BCIP. Los carriles c, d y e corresponden a los carriles biotinilados a, b y c, respectivamente. En la Figura 7(C), despues de una dialisis extensa contra PBS, el medio de cultivo en bruto que contema mini-IGFBP-3-avitag-biotina (carril e) se inyecto en un chip de estreptavidina. Despues del lavado con NaCl 1 M, se inyectaron secuencialmente una solucion que contema el ^{anticuerpo monoclonal anti-IGFBP-3}6^E8 ^{y una solucion que contema IGF-II.}

La Figura 8(A) muestra el mapa de restriccion del vector de transferencia pMJ-SeAP-mini-IGFBP-3 construido para producir la protema de fusion indicadora SeAP-mini-IGFBP-3. La Figura 8(B) es una representacion esquematica del ensayo "sandwich" de fase solida desarrollado para determinar las concentraciones de pro-IGF-II en plasma humano. La Figura 8(C) es un grafico que muestra los niveles de pro-IGF-II determinados usando el ensayo "sandwich" en el plasma de adultos sanos, pacientes con hipoglucemia de tumor de celulas de los islotes (NICTH) y pacientes con NICTH despues de la eliminacion del tumor. Vease el Ejemplo 4 para obtener detalles experimentales.

La Figura 9(A) muestra el mapa de restriccion del vector de transferencia pYM-mini-IGFBP-3 construido para producir la protema de fusion mini-IGFBP-3-FcIgG1. La Figura 9(B) es una representacion esquematica de la inmunoadhesina resultante.

La Figura 10(A) es un grafico que muestra la afinidad de union relativa de mini-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3-Fc hacia IGF-II. El ensayo en fase solida utilizado midio la capacidad de aumentar las concentraciones de IGF-II libre para desplazar la union del trazador de IGF-II biotinilado a mini-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3-Fc inmovilizado en un soporte (vease el Ejemplo 5 para obtener detalles experimentales). La Figura 10(B) es un grafico que muestra los efectos de mini-IGFBP-3-Fc sobre la proliferacion y supervivencia de tres lmeas de celulas tumorales humanas cultivadas ^{en presencia de FCS al 10%: Hep3B, HuH7 y INA-}6^{. Los efectos de mini-IGFBP-3-Fc se comparan con los efectos}de la picropodofilina (ppp), un compuesto que se sabe que interfiere con la via de senalizacion del IGF-R (vease el Ejemplo 5 para obtener detalles experimentales).

La Figura 11(A ) muestra los efectos inhibidores de mini-IGFBP-3-Fc sobre la fosforilacion de AKT en celulas de ^{mieloma INA-}6^{. Estos efectos se comparan con los de ppp (vease el Ejemplo 5 para obtener detalles}experimentales). La Figura 11(B) es un grafico que muestra los efectos de mini-IGFBP-3-Fc sobre la fosforilacion de AKT en las celulas MiaPaCa-2 (arriba a la izquierda), las celulas HT-29 (arriba a la derecha), y las celulas A549 (abajo a la izquierda) y de mini-IGFBP-3-Fc en la fosforilacion de AKT en celulas A549 (abajo a la derecha) despues de diferentes tiempos de incubacion, como se indica (vease el Ejemplo 5 para obtener detalles experimentales).

La Figura 12 muestra la descomposicion de las concentraciones de derivados de mini-IGFBP-3 en plasma de raton. Se inyectaron por via intravenosa 250 |jg de la protema indicada a grupos (n = 3) de ratones en el momento cero. Las muestras de sangre se extrajeron en los puntos de tiempo indicados, se centrifugaron y se mantuvieron congeladas. Las concentraciones de protemas inyectadas se determinaron mediante un ELISA de tipo sandwich interno utilizando anticuerpos monoclonales espedficos de IGFBP-3 antihumanos.

La Figura 13 muestra los efectos in vivo sobre los parametros de senalizacion clave del tumor de un tratamiento de 12 horas con mini-IGFBP-3 o mini-IGFBP-Fc administrado a ratones portadores de xenoinjertos de tumor ^{colorrectal humano HT-29. (Vease el Ejemplo}6 ^{para obtener detalles experimentales).}

Definiciones

A lo largo de la memoria descriptiva, se emplean varios terminos que se definen en los parrafos siguientes.

Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a un ser humano u otro mairnfero (por ejemplo, primate, raton, rata, conejo y similares). En muchas realizaciones de la presente invencion, el sujeto es un ser humano. En dichas realizaciones, a menudo se denomina al sujeto como un "individuo" o un "paciente". Los terminos "individuo" y "paciente" no indican ninguna edad en particular.

El termino "tratamiento" se usa en el presente documento para caracterizar un metodo o proceso que tiene como ^{objetivo (}1^{) retrasar o prevenir la aparicion de una enfermedad o afeccion; (}2 ^{) ralentizar o detener el avance, el}empeoramiento o el deterioro de los smtomas de la enfermedad o afeccion; (3) lograr una mejona de los smtomas de la enfermedad o afeccion; o (4) curar la enfermedad o afeccion. Se puede administrar un tratamiento antes de la aparicion de la enfermedad o afeccion, para una accion profilactica o preventiva. Como alternativa o de manera adicional, se puede administrar un tratamiento despues del inicio de la enfermedad o afeccion, para una accion terapeutica.

Una "composicion farmaceutica" se define en el presente documento como comprendiendo una cantidad eficaz de al menos un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento, y al menos un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, el termino "cantidad eficaz" se refiere a cualquier cantidad de un compuesto, agente, anticuerpo o composicion que sea suficiente para cumplir con su proposito o propositos deseados, por ejemplo, una respuesta biologica o medicinal deseada en una celula, tejido, sistema o sujeto.

El termino "Vehiculo o excipiente farmaceuticamente aceptable" se refiere a un medio portador que no interfiere con la eficacia de la actividad biologica del principio o principios activos y que no es excesivamente toxico para el huesped en la concentracion a la que se administra. El termino incluye disolventes, dispersion, medios, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos, y agentes retardantes de la adsorcion, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18a Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA).

El termino "aislado", como se usa en el presente documento en referencia a una protema o polipeptido, significa una protema o polipeptido, que en virtud de su origen o manipulacion se separa de al menos algunos de los componentes con los que esta naturalmente asociado o con los que esta asociado cuando se obtiene inicialmente. Por "aislado", se entiende como alternativa o ademas que la protema o polipeptido de interes se produce o sintetiza de la mano del hombre.

Los terminos "protema", "polipeptido", y "peptido '' se usan en el presente documento de manera intercambiable, y se refieren a secuencias de aminoacidos de una diversidad de longitudes, ya sea en sus formas neutras (no cargadas) o como sales, y no modificadas o modificadas por glucosilacion, oxidacion de cadenas laterales o fosforilacion. La secuencia de aminoacidos puede ser una protema nativa de longitud completa. Como alternativa, la secuencia de aminoacidos puede ser un fragmento mas pequeno de la protema de longitud completa. En otras realizaciones mas, la secuencia de aminoacidos se modifica mediante sustituyentes adicionales unidos a las cadenas laterales de aminoacidos, tales como unidades de glucosilo, lfpidos o iones inorganicos tales como fosfatos, asf como modificaciones relacionadas con las conversiones qmmicas de las cadenas tales como oxidacion de grupos sulfidrilo. Por lo tanto, el termino "protema" (o sus terminos equivalentes) pretende incluir la secuencia de aminoacidos de la protema nativa de longitud completa, o un fragmento de la misma, sujeto a aquellas modificaciones que no cambien significativamente sus propiedades espedficas. En particular, el termino "protema" incluye isoformas de protemas, es decir, las variantes que estan codificadas por el mismo gen, pero que difieren en su pi o PM, o ambos. Dichas isoformas pueden diferir en su secuencia de aminoacidos (por ejemplo, como resultado de la variacion alelica, el corte y empalme alternativo o la proteolisis limitada) o, como alternativa, pueden surgir de una modificacion postraduccional diferencial (por ejemplo, glucosilacion, acilacion, fosforilacion).

El termino "analogo", como se usa en el presente documento en referencia a una protema o porcion de protema, se refiere a un polipeptido que posee una funcion similar o identica a la de la protema o porcion de protema pero no necesariamente comprende una secuencia de aminoacidos que es similar o identica a la secuencia de aminoacidos de la protema o porcion de protema o una estructura que es similar o identica a la de la protema o porcion de protema. Preferiblemente, en el contexto de la presente invencion, un analogo de protema tiene una secuencia de aminoacidos que es al menos un 30 %, mas preferiblemente, al menos un 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o un 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de la protema o porcion de protema.

El termino "fragmento de protema" se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos 5 residuos de aminoacidos consecutivos (preferiblemente, al menos aproximadamente: 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250 o mas restos de aminoacidos) de la secuencia de aminoacidos de una protema. El fragmento de una protema puede o no poseer una actividad funcional de la protema.

El termino "biologicamente activo", como se usa en el presente documento para caracterizar una variante, analogo o fragmento de una protema o porcion de protema, se refiere a una molecula que comparte suficiente identidad de secuencia de aminoacidos u homologfa con la protema o porcion de protema para presentar propiedades similares o identicas a la protema o porcion de protema. Por ejemplo, en muchas realizaciones de la presente invencion, un fragmento biologicamente activo del dominio N-terminal de IGFBP-3 es un fragmento que conserva la capacidad del dominio N-terminal de IGFBP-3 para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS. De forma similar, un fragmento biologicamente activo del dominio C-terminal de IGFBP-3 es un fragmento que conserva la capacidad del dominio C-terminal de IGFBP-3 para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS.

El termino "homologo" (u "homologfa"), como se usa en el presente documento, es sinonimo del termino "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos moleculas de polipeptido o entre dos moleculas de acido nucleico. Cuando una posicion en ambas secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o el mismo resto de aminoacido, las moleculas respectivas son entonces homologas en esa posicion. El porcentaje de homologfa entre dos secuencias corresponde al numero de posiciones coincidentes u homologas compartidas por las dos secuencias divididas por el numero de posiciones comparadas y multiplicadas por 100. En general, se hace una comparacion cuando dos secuencias se alinean para proporcionar la maxima homologfa. Las secuencias de aminoacidos homologas comparten secuencias de aminoacidos identicas o similares. Los residuos similares son sustituciones conservativas, o "mutaciones puntuales permitidas" de los residuos de aminoacidos correspondientes en una secuencia de referencia. "Sustituciones conservativas" de un residuo en una secuencia de referencia son sustituciones que son ffsicamente o funcionalmente similares al correspondiente resto de referencia, por ejemplo, que tienen un tamano, forma, carga electrica, propiedades qmmicas, incluida la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrogeno, o similares. Las sustituciones conservativas particularmente preferentes son aquellas que satisfacen los criterios definidos para una "mutacion puntual aceptada" como se describe por Dayhoff et al. ("Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22:354-352).

Los terminos "aproximadamente" y "en torno a", como se usa en el presente documento con referencia a un numero, ^{generalmente incluyen numeros que pertenecen a un intervalo del}10 ^{% en cualquier direccion del numero (mayor o}menor que el numero) a menos que se indique otra cosa o de otro modo sea evidente a partir del contexto (excepto ^{cuando dicho numero exceda el}100 ^{% de un valor posible).}

Descripcion detallada de la invencion

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invencion proporciona derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 que son resistentes a la escision proteolttica. Estos derivados de IGFBP-3 pueden encontrar aplicacion en una amplia diversidad de aplicaciones terapeuticas y/o de diagnostico.

I - Derivados polipeptidicos de IGFBP-3

Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento generalmente comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, en el que: (a) el dominio N-terminal comprende, o consiste como alternativa en, la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 de tipo silvestre, de una variante biologicamente activa del mismo o de un fragmento biologicamente activo del mismo; (b) el dominio intermedio comprende un enlazador resistente a la escision proteolftica; y (c) el dominio C-terminal comprende, o como alternativa consiste en, la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 de tipo silvestre, de una variante biologicamente activa del mismo o de un fragmento biologicamente activo del mismo.

El termino "tipo silvestre", como se usa en el presente documento para caracterizar IGFBP-3 o una porcion de IGFBP-3, tiene su significado en la tecnica y se refiere a la secuencia de origen natural (o nativa) de IGFBP-3 o la porcion de IGFBP-3. Preferiblemente, la IGFBP-3 de tipo silvestre es la IGFBP-3 humana de tipo silvestre.

IGFBP-3 humana

Como se ha mencionado anteriormente, los IGF estan presentes en todo el cuerpo humano casi en asociacion con ^{seis protemas de union de alta afinidad espedficas (IGFBP-1 a}6 ^{), que son determinantes crfticos de la disponibilidad}y acciones de IGF. Mas del 90 % del IGF-1 en plasma esta unido a IGFBP-3, el mas abundante de las seis IGFBP identificadas. Ademas de actuar como la principal protema portadora circulante, la IGFBP-3 se produce en muchos tejidos donde tiene multiples efectos en las funciones celulares, tanto a traves de su capacidad para modular las acciones de IGF como tambien debido a las acciones intrmsecas directas.

En los seres humanos, IGFBP-3 esta codificado por el gen IGFBP3. Se han caracterizado variantes transcripcionales alternativas que codifican diferentes isoformas. Se conocen dos transcripciones alternativas con los numeros de acceso NP_000589.2 y NP_001013416.1.

Por lo tanto, el dominio N-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender, o como alternativa, puede consistir en, la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de cualquier IGFBP-3 de origen natural en seres humanos. El dominio N-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender como alternativa, o consistir en, la secuencia de aminoacidos de un fragmento biologicamente activo del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos de un fragmento del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre que conserva la capacidad del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS (subunidad acido-labil). El dominio N-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender como alternativa, o consistir en, la secuencia de aminoacidos de una variante biologicamente activa del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido que difiere de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre por deleciones, sustituciones, adiciones y/o alteraciones, pero cuya similitud de secuencia general con la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es de tal forma que presenta al menos una afinidad de union identica o similar, si no superior, por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS que el dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre. Preferiblemente, la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 1.

De forma similar, el dominio C-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender, o como alternativa, puede consistir en, la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de cualquier IGFBP-3 de origen natural en seres humanos. El dominio C-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender como alternativa, o consistir en, la secuencia de aminoacidos de un fragmento biologicamente activo del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos de un fragmento del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre que conserva la capacidad del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS. El extremo C-terminal de un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento, puede comprender como alternativa, o consistir en, la secuencia de aminoacidos de una variante biologicamente activa del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos de un polipeptido que difiere de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre por deleciones, sustituciones, adiciones y/o alteraciones, pero cuya similitud de secuencia general con la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es de tal forma que presenta al menos una afinidad de union identica o similar, si no superior, por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS que la IGFBP-3 humana de tipo silvestre. Preferiblemente, la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

Enlazador resistente a la escision proteolitica

Los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento se caracterizan por una resistencia a la escision proteolftica. Como se ha mencionado anteriormente, el dominio intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre esta poco estructurado y es el objetivo de la escision proteolftica. Se ha demostrado que varias proteasas escinden IGFBP-3, incluyendo plasmina, trombina, calicrema, antfgeno espedfico de prostata, metaloproteasas de matriz, y catepsina.

La proteolisis de IGFBP-3 disminuye su afinidad por IGF, lo que aumenta la proporcion global de IGF libre a IGF unido total.

Por el contrario, los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento se disenaron para ser resistentes a la escision proteolftica. El termino "resistente a la escision proteolftica", cuando se usa en el presente documento en referencia a un derivado de IGFBP-3 (o a un enlazador) significa que el derivado de IGFBP-3 (o el enlazador) no experimenta una degradacion enzimatica significativa (es decir, detectable) in vitro y/o in vivo cuando esta en presencia de proteasas que escinden IGFBP-3 de tipo silvestre. Un experto en la tecnica sabra como probar y evaluar la susceptibilidad de un polipeptido a la escision proteolftica.

La resistencia a la accion degradante de las proteasas presentadas por un derivado de IGFBP-3 descrita en el presente documento es resultado del hecho de que su dominio intermedio esta disenado para ser resistente a la escision proteolftica. El dominio intermedio puede consistir en un enlazador que es resistente a la escision proteolftica, o puede comprender un enlazador que es resistente a la escision proteolftica. Por ejemplo, el dominio intermedio de un derivado de IGFBP-3 descrito aqu puede comprender, o como alternativa puede consistir en, la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre, en donde una porcion de dicha secuencia de aminoacidos se reemplaza con un enlazador resistente a la escision proteolftica. En realizaciones en las que la IGFBP-3 de tipo silvestre es IGFBP-3 humana de tipo silvestre, la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre puede ser la expuesta en la SEQ ID NO: 2.

En general, la porcion de la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre que se reemplaza con un enlazador resistente a la escision proteolftica es de tal forma que el dominio intermedio resultante del derivado de IGFBP-3 es resistente a la escision proteolftica. Por lo tanto, preferiblemente, la porcion de la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre que se reemplaza con un enlazador resistente a la escision proteolftica es una porcion sustancial de la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre. Como se usa en el presente documento, el termino "porcion sustancial de la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre" se refiere al menos al 85 % de todo el dominio ^{intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre, o al menos el 87 %, al menos el}88 ^{%, al menos el 89 %, al menos el 90 % o}mas del 90 % de todo el dominio intermedio de la IGFBP-3 de tipo silvestre. Como alternativa o de manera adicional, el termino "porcion sustancial de la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de IGFBP-3 de tipo silvestre" se refiere a 85 residuos de aminoacidos contiguos del dominio intermedio de IGFBP-3 o mas de 85 residuos de ^{aminoacidos contiguos del dominio intermedio de IGFBP-3, tal como, por ejemplo,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91 o 92 residuos}de aminoacidos contiguos del dominio intermedio de IGFBP-3.

El enlazador resistente a la escision proteolftica puede ser cualquier polipeptido que no experimente ninguna degradacion enzimatica significativa in vitro y/o in vivo cuando esta en presencia de proteasas que escinden IGFBP-3 de tipo silvestre. Preferiblemente, el enlazador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 o la secuencia de cualquier variante de la SEQ ID NO: 4 que sea resistente a la escision proteolftica.

El enlazador puede comprender un elemento de proteolisis condicional, es decir, una entidad que experimenta proteolisis solo en condiciones espedficas. Las estrategias y sistemas para producir una protema o un polipeptido sujeto a proteolisis condicional se conocen en la tecnica.

Derivados de mini IGFBP-3

Los derivados de IGFBP-3, como se han descrito anteriormente, comparten al menos dos propiedades principales: (1) son resistentes a la escision proteolftica, y (2) muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS que son identicas a, sustancialmente similares o incluso superiores a las afinidades de union correspondientes de la IGFBP-3 de tipo silvestre. Los presentes inventores han llamado a estos derivados de IGFBP-3, "mini-IGFBP-3".

Usando mini-IGFBP-3 como plataforma o piedra angular de su proyecto, los inventores han disenado y desarrollado otros derivados de IGFBP-3 con diferentes propiedades y posibles aplicaciones.

Derivados de mini-IGFBP-3 ALS'

Por lo tanto, en un aspecto, se describen en el presente documento los derivados de IGFBP-3 que (1) son resistentes a la escision proteolftica, (2) muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II y heparina que son identicas, sustancialmente similares o incluso superiores a las afinidades de union correspondientes de la IGFBP-3 de tipo silvestre, pero (3) que no se unen (o no se unen sustancialmente, a ALS. Estos derivados de IGFBP-3 se denominan en el presente documento derivados de "mini-IGFBP-3 ALS".

Tal derivado mini-IGFBP-3 ALS comprende generalmente un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, en el que: (a) el dominio N-terminal comprende, o consiste como alternativa en, la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 de tipo silvestre, de una variante biologicamente activa del mismo o de un fragmento biologicamente activo del mismo; (b) el dominio intermedio comprende un enlazador resistente a la escision proteolftica; y (c) el dominio C-terminal comprende, o como alternativa consiste en, la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 de tipo silvestre, de una variante biologicamente activa del mismo o de un fragmento biologicamente activo del mismo, en donde la porcion del dominio C-terminal que se une a ALS se reemplaza con AGGSG (SEQ ID NO: 5) o cualquier variante de la SEQ ID NO: 5 que no se une a ALS.

En los casos en los que la IGFBP-3 de tipo silvestre es IGFBP-3 humana de tipo silvestre y la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es como se indica en la SEQ ID NO: 3, los residuos de aminoacidos de 43 a 47 en la SEQ ID NO: 3 se reemplazan con AGGSG (SEQ ID NO: 5) o cualquier variante de la misma que no se una a ALS.

Derivados de mini-IGFBP-3-Fc

Tambien se describen en el presente documento los derivados de IGFBP-3 que (1) son resistentes a la escision proteolftica, (2) muestran afinidades de union por IGF-I y/o IGF-II que son superiores a las afinidades correspondientes de IGFBP-3 de tipo silvestre, y (3) tienen una semivida en plasma que es mas larga que la semivida en plasma de IGFBP de tipo silvestre y/o de otros derivados mini-IGFBP-3. Estos derivados de IGFBP-3 se denominan derivados "mini-IGFBP-3-Fc".

De hecho, un derivado mini-IGFBP-3-Fc descrito en el presente documento comprende el fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1 fusionado al mismo, ademas de un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal como se define en el presente documento. El termino "fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1" tiene en el presente documento su significado comprendido en la tecnica y se refiere a la region cristalizable del fragmento de un anticuerpo de la clase IgG1 de protemas de globulina que son las mas abundantes en el suero humano. Preferiblemente, el fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1 se fusiona al extremo terminal del dominio C-terminal del derivado de IGFBP-3-Fc. Cada "brazo" del fragmento Fc de IgG1 (es decir, cada uno de los dos polipeptidos identicos que constituyen el fragmento Fc) se fusiona al extremo terminal del dominio C-terminal de un derivado mini-IGFBP-3. Por consiguiente, tambien se describe en el presente documento una protema de fusion que comprende el fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1 fusionado a dos derivados mini-IGFBP-3-Fc. Los inventores han encontrado que una protema de fusion de este tipo (vease la seccion de Ejemplos) tiene una CI⁵⁰de afinidad aparente que es siete veces mas alta que la de los derivados de IGFBP-3 que no estan fusionados con el fragmento Fc de IgG1.

Como entendera un experto en la tecnica, la parte mini-IGFBP-3 de una protema de fusion "mini-IGFBP-3-Fc" puede o no modificarse para que no presente una union (o sea insignificante) a ALS, como se ha descrito anteriormente.

Complejos mini-IGFBP-3/IGF-I

Tambien se describen en el presente documento complejos IGFBP-3/IGF-I que son resistentes a la escision proteolftica.

Tal complejo IGFBP-3/IGF-I generalmente comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, como se define en el presente documento, y ademas comprende la secuencia de aminoacidos de IGF-I, en donde el IGF-I forma complejo con el derivado polipeptfdico de IGFBP-3. Como se usa en el presente documento, el termino "IGF-I" tiene su significado comprendido en la tecnica y se refiere a una protema pequena (-7.500 kDa) denominada factor de crecimiento insulmico 1 que, en seres humanos, esta codificada por el gen IGF1 (Numeros de acceso NP_0011004753, NP_001104754 y NP_000609).

El IGF-I consiste en una sola cadena de aminoacidos con tres puentes disulfuro intramoleculares. Originalmente se sintetiza como un peptido pro-IGF-I biologicamente inactivo, que posteriormente experimenta una escision endoproteolttica regulada en la forma madura. La secuencia de aminoacidos de IGF-I comprende preferiblemente (o consiste como alternativa en) la secuencia de aminoacidos de IGF-I humano de tipo silvestre (es decir, de cualquier IGF-I de origen natural en seres humanos), o un fragmento biologicamente activo del mismo o una variante biologicamente activa del mismo. Los fragmentos y variantes biologicamente activos adecuados de IGF-I humano de tipo silvestre incluyen aquellos fragmentos y variantes que conservan las propiedades biologicas de IGF-I humano de tipo silvestre (en particular la union a IGFBP-3 y a IGF-1R).

En un complejo IGFBP-3/IGF-I, el derivado de IGFBP-3 y el IGF-I estan asociados por uniones no covalentes. Las interacciones no covalentes incluyen enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, fuerzas de van der Waals, e interacciones hidrofobas. En general, en un complejo IGFBP-3/IGF-I, el derivado de IGFBP-3 y el IGF-I estan asociados de una manera que es identica o similar a la de un complejo de IGFBP-3/IGF-I de origen natural (dentro del cuerpo).

El enlazador de un complejo mini-IGFBP-3:IGF-I descrito en el presente documento puede comprender un elemento de proteolisis condicional, como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, el elemento de proteolisis condicional puede disenarse para permitir la administracion dirigida de IGF-I.

Derivados de mini-IGFBP-3-Avitag

Tambien se describen en el presente documento los derivados de IGFBP-3 que (1) son resistentes a la escision proteolftica, (2) muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS que son identicas a, sustancialmente similares o incluso mas altas que las afinidades de union correspondientes de IGFBP-3 de tipo silvestre, y (3) que son susceptibles de biotinilacion por la enzima BirA. Estos derivados de IGFBP-3 se denominan derivados de "mini-IGFBP-3-avitag".

Tal derivado mini-IGFBP-3-avitag generalmente comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, como se define en el presente documento, y ademas comprende un sustrato de enzima BirA unido covalentemente al extremo terminal del dominio C-terminal del derivado de IGFBP-3. Como se usa en el presente documento, la "enzima BirA" tiene su significado en la tecnica y se refiere a la enzima biotina ligasa de E. Coli que tiene la capacidad de biotinilar protemas en un residuo espedfico en una secuencia de reconocimiento (o sustrato de la enzima BirA) (O'callaghan et al., Anal. Biochem., 1999, 266: 9-15). Como se usa en el presente documento, el termino "sustrato de la enzima BirA" se refiere e incluye cualquier secuencia de aminoacidos diana reconocida por la enzima BirA y a la que la enzima BirA puede unir una biotina. Una diversidad de sustratos de la enzima BirA se conocen en la tecnica, incluyendo los descritos, por ejemplo, en las Pat. de Estados Unidos N.° 5.723.584, Pat. de Estados Unidos N.° 5.487.993, documentos EP 0 550 693 y WO 95/04069, que son adecuados para su uso en el presente documento. Sin embargo, preferiblemente, el sustrato de la enzima BirA tiene la secuencia expuesta en la ^{SEQ ID NO:}6^.

Tambien se describe un derivado mini-IGFBP-3-avitag que generalmente comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, como se define en el presente documento, y que ademas comprende un sustrato de enzima BirA unido covalentemente al extremo terminal del dominio C-terminal del derivado de IGFBP-3 y una molecula de biotina unida covalentemente al sustrato de la enzima BirA. Estos derivados de IGFBP-3 se denominan en el presente documento derivados de "mini-IGFBP-3-avitag-biotina".

Como entendera un experto en la tecnica, la parte mini-IGFBP-3 de un derivado mini-IGFBP-3-avitag o de un derivado mini-IGFBP-3-avitag-biotina puede o no modificarse para presentar ninguna union (o una insignificante) a ALS, como se ha descrito anteriormente.

Derivados de SeAP-mini-IGFBP-3

Tambien se describen derivados de IGFBP-3 que (1) son resistentes a la escision proteolftica, (2) muestran afinidades de union por IGF-I, IGF-II, heparina y ALS que son identicas a, sustancialmente similares o incluso superiores a las afinidades de union correspondientes de IGFBP-3 de tipo silvestre, y (3) que se pueden detectar al estar marcadas con una protema indicadora. Por ejemplo, la protema indicadora puede ser luciferasa, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina y similares. Cuando la protema indicadora es fosfatasa alcalina, estos derivados de IGFBP-3 se denominan derivados de "SeAP-mini-IGFBP-3".

Tal derivado SeAP-mini-IGFBP-3 generalmente comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio, y un dominio C-terminal, como se define en el presente documento, y ademas comprende, fusionada al extremo terminal del dominio N-terminal, la secuencia de aminoacidos de SeAP (fosfatasa alcalina secretada). Como entendera un experto en la tecnica, la parte mini-IGFBP-3 de un derivado SeAP-mini-IGFBP-3 puede o no modificarse para presentar 0 no una union (o una insignificante) a ALS, como se ha descrito anteriormente.

Los terminos "SeAP" y "fosfatasa alcalina secretada" se usan en el presente documento de forma intercambiable. Se refieren a una enzima, codificada por el gen SEAP (Numero de acceso de GenBank NP_001623), y esa es una forma truncada de la fosfatasa alcalina placentaria humana (PLAP). La SEAP tiene las propiedades inusuales de ser extremadamente estable al calor y resistente al inhibidor de la fosfatasa L-homoarginina (Micanovic y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU, 1990, 87: 157-161).

Preparacion de los derivados de IGFBP-3

Los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento pueden prepararse usando cualquiera de una variedad de metodos adecuados conocidos en la tecnica, incluyendo mutagenesis de sitio dirigido y tecnicas recombinantes tales como las empleadas por los presentes inventores (vease la seccion de Ejemplos).

II - Usos de los derivados polipeptidicos de IGFBP-3

Los derivados polipeptidicos de IGFBP-3 descritos en el presente documento pueden usarse en una diversidad de aplicaciones terapeuticas y/o de diagnostico. Tienen la ventaja de derivarse de una protema de origen humano, que ya esta aprobada por la FDA para algunas indicaciones terapeuticas y que se ha demostrado que no esta asociada con ningun efecto secundario importante.

1 - Aplicaciones terapeuticas

A. Indicaciones

Los derivados polipeptidicos de IGFBP-3 descritos en el presente documento pueden ser utiles como agentes que secuestran IGF (lGF-I y/o IGF-II) y, por lo tanto, reducen su biodisponibilidad. Como tales, pueden constituir una alternativa a los anticuerpos monoclonales anti-IGFl-R existentes e inhibidores de la tirosina cinasa como adyuvantes en la quimioterapia o radioterapia de neoplasias humanas (Klinakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 2359 2364; Pollack et al., Nat. Rev. Cancer, 2004, 4: 505-518; Ryan y Goss; Oncologist, 2008, 13: 16-24; Sachdev y Yee, ^{Mol. Cancer Ther., 2007,}6 ^{: 1-12; Samani et al., Endocr. Rev.2006). Algunos derivados polipeptfdicos de IGFBP-3}descritos en el presente documento, tal como mini-IGFBP-3-Fc, son capaces de secuestrar tanto IGF-I como IGF-II presentes en el torrente sangumeo, mientras que otros, tal como mini-IGFBP-3 ALS, son capaces de reducir los IGF tisulares biodisponibles. Esta ultima caractenstica podna dirigirse aun mas al propio tejido tumoral agregando un residuo de biotina al derivado de IGFBP-3 (mini-IGFBP-3-ALS-avitag-biotina). En ambas estrategias, la administracion de un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento da como resultado la regulacion descendente de la ruta de senalizacion de IGF. Este enfoque parece particularmente relevante y prometedor en el caso de pacientes con tumores metastasicos, donde la circulacion de IGFBP-3 intacta esta fuertemente deprimida (Fowlkes et al., Endocr., 2004, 145: 620-626; Miyamoto et al., Cancer Res., 2004, 64: 665-371; Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 333: 1011-1016). La administracion de derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 resistentes a la proteasa producira una privacion sostenida de IGF perjudicial para el tumor que debena potenciar los efectos de otros agentes quimioterapeuticos para reducir la carga tumoral.

El secuestro de IGF por un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento tambien puede ser beneficioso en el tratamiento de ciertos trastornos oftalmicos. Los ejemplos de trastornos oftalmicos asociados con un exceso de IGF-I que pueden tratarse incluyen, pero sin limitacion, retinopatfas proliferativas, tal como degeneracion macular relacionada con la edad y retinopatfa diabetica, en las que se ha demostrado que el IGF-I es responsable de la sobreproduccion patogena de VEGF (Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104: 10595-10600; Grant et al., Expert Opin. Invest. Drugs, 2004, 13: 1275-1293). Otros ejemplos incluyen heridas de la retina, cataratas secundarias, heridas epiteliales de la cornea y smdrome de Sjogren. En dichas aplicaciones, un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento puede administrarse, por ejemplo, mediante inyeccion intraocular o por aplicacion a la cornea (por ejemplo, a traves de gotas para los ojos o una capsula de liberacion programada colocada en el fondo de saco).

Un derivado de IGFBP-3 descrito en el presente documento tambien se puede usar como un vector para suministrar IGF-1 cuando se indica la administracion sistematica de IGF-1. Dichas indicaciones incluyen, pero sin limitacion, resistencia a la hormona del crecimiento, deficiencia de IGF-I, quemaduras graves, desgaste por VIH, fibrosis qrnstica, enfermedad celfaca, anorexia nerviosa, enfermedad de desgaste muscular, distrofia miotonica, esclerosis lateral ^{amiotrofica, osteoporosis, resistencia grave a la insulina (Clemmons, Nat. Rev. Drug Discov., 2007,}6 ^{: 821-833),}diabetes tipo I, diabetes tipo II, isquemia cerebral, isquemia cardfaca, e injertos.

Los metodos de tratamiento descritos en el presente documento pueden realizarse usando un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o una composicion farmaceutica del mismo. Estos metodos generalmente comprenden la administracion de una cantidad eficaz de al menos un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 (como se ha definido anteriormente), o una composicion farmaceutica del mismo, a un sujeto que lo necesite. La administracion puede realizarse utilizando cualquiera de los metodos conocidos por un experto en la tecnica. En particular, un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o una composicion del mismo, puede administrarse por cualquiera de varias rutas incluyendo, pero sin limitacion, la ruta en aerosol, parenteral, oral o topica.

En general, un derivado de IGFBP-3 o una composicion del mismo, se administrara en una cantidad eficaz, es decir, una cantidad que sea suficiente para cumplir su proposito previsto. La cantidad exacta de derivado de IGFBP-3 o composicion farmaceutica a administrar variara entre los sujetos, dependiendo de la edad, sexo, peso y el estado general de salud del sujeto que se va a tratar, la respuesta biologica o medica deseada y similares. Una cantidad eficaz es aquella que permite una regulacion descendente eficiente de la via de senalizacion de IGF, el secuestro eficiente de IGF-I y/o iGF-II presente en el torrente sangumeo, y/o la reduccion eficiente de IGF de tejido biodisponible. Una cantidad efectiva tambien puede ser una que permita un suministro eficiente de IGF-1. En general, una cantidad eficaz de un derivado de IGFBP-3 o de una composicion farmaceutica del mismo, es una que da como resultado el tratamiento del trastorno para el que se administra, por ejemplo, ralentizar o detener el avance, gravedad o deterioro de los smtomas del trastorno y/o la mejora de los smtomas del trastorno y/o curar el trastorno. Los efectos de un tratamiento descrito en el presente documento pueden controlarse utilizando cualquiera de los ensayos conocidos en la tecnica para el diagnostico de la enfermedad que se esta tratando.

Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o una composicion del mismo puede administrarse en solitario de acuerdo con un metodo de tratamiento descrito en el presente documento. Como alternativa, un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o una composicion del mismo, se administra en combinacion con al menos un agente terapeutico o procedimiento terapeutico adicional. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o la composicion puede administrarse antes de la administracion del agente terapeutico o del procedimiento terapeutico, simultaneamente con el agente o procedimiento terapeutico, y/o despues de la administracion del agente o procedimiento terapeutico.

Los agentes terapeuticos que pueden administrarse en combinacion con un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o composicion pueden seleccionarse de una gran diversidad de compuestos biologicamente activos que se sabe que tienen un efecto beneficioso en el tratamiento de la enfermedad para la cual se administra del derivado de IGFBP-3 (por ejemplo, agentes anticancerosos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunomoduladores, analgesicos, agentes antimicrobianos, agentes antibacterianos, antibioticos, antioxidantes, agentes antisepticos y combinaciones de los mismos). Los procedimientos terapeuticos que pueden realizarse en combinacion con la administracion de un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 o composicion incluyen, pero sin limitacion, c io ^a , radioterapia y similares.

Los ejemplos mas espedficos de contextos patologicos en los que un derivado polipeptidico de IGFBP-3 o composicion pueden administrarse beneficiosamente en solitario o junto con otras terapias incluyen cancer de pulmon de celulas no pequenas y formas de la enfermedad que han desarrollado resistencia a terapias dirigidas a EGFR (Gefitinib, Erlotinib), carcinoma hepatocelular (sorafenib) y formas que han desarrollado resistencia a dicho agente, cancer de mama amplificado con HER2 asociado a terapias dirigidas contra HER2 (Trastuzumab) y formas que han desarrollado resistencia a este agente, cancer de mama positivo a receptores de estrogeno (ER+) junto con terapias hormonales y particularmente un subconjunto de canceres de mama positivos a receptores de estrogeno (ER+) con niveles bajos de ER que no responden a la terapia hormonal (luminal B), algunos canceres de mama triple negativo, canceres de mama que desarrollan resistencia a las terapias dirigidas al receptor de estrogeno (Fulvestant), tumores estromales gastrointestinales, que son insensibles o resistentes a las terapias dirigidas a PDGFR (imatinib), resistencia a las terapias dirigidas al receptor de androgenos en el cancer de prostata, resistencia a terapias dirigidas a BRAFV600E de melanoma y cancer de colon, terapia del sarcoma de Ewing productor de IGF-I y otros sarcomas, terapia de mieloma multiple (particularmente de mielomas productores de IGF-I) junto con otras terapias, carcinomas hepatocelulares terapeuticos (particularmente de tumores productores de IGF-II), terapia de adenocarcinoma de colon (particularmente tumor productor de IGF-II), terapia de canceres de ovario (particularmente cancer de ovario epitelial y tumores productores de IGF-II), terapia del carcinoma adrenocortical, terapia de algunos canceres de pancreas, y como adyuvante de la terapia hormonal de canceres de mama y prostata, terapia de carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello, terapia de tumores pediatricos tal como tumor de Wilm, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, pero tambien terapia de glioblastoma adulto, terapia de tumores productores de IGF-II, tal como hipoglucemia tumoral de celulas no islotes (NICTH), terapia de osteosarcoma, terapia del mesotelioma.

B. Administracion

Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 (opcionalmente despues de la formulacion con uno o mas vetuculos o excipientes farmaceuticamente aceptables apropiados), en una dosificacion deseada, puede administrarse a un sujeto que lo necesite por cualquier via adecuada. Se conocen diversos sistemas de administracion y se pueden usar para administrar los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento, incluyendo comprimidos, capsulas, soluciones inyectables, encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, etc. Los metodos de administracion incluyen, pero sin limitacion, via dermica, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intralesional, intravenosa, subcutanea, intranasal, pulmonar, epidural, ocular, y oral. Un derivado de IGFBP-3 o composicion puede administrarse por cualquier via conveniente u otra via adecuada, por ejemplo, por infusion o inyeccion en bolo, por adsorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, oral, mucosa, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administracion puede ser sistemica o local. La administracion parenteral puede dirigirse a un tejido determinado del paciente, tal como por cateterizacion. Como apreciaran los expertos en la tecnica, cuando se administra un derivado de IGFBP-3 junto con un agente terapeutico adicional, el derivado de IGFBP-3 y el agente terapeutico se pueden administrar por la misma via (por ejemplo, por via oral) o por diferentes vfas (por ejemplo, por via oral e intravenosa).

C. Dosificacion

La administracion de un derivado de IGFBP-3 (o una composicion del mismo) descrita en el presente documento se realizara en una dosis tal que la cantidad administrada sea eficaz para el proposito previsto. La via de administracion, la formulacion y la dosis administrada dependeran del efecto terapeutico deseado, la gravedad del trastorno que se este tratando, la presencia de cualquier infeccion, la edad, sexo, peso y estado de salud general del paciente, asf como la potencia, biodisponibilidad y semivida in vivo del derivado de IGFBP-3 utilizado, el uso (o no) de terapias concomitantes y otros factores clmicos. Estos factores son facilmente determinables por el medico a cargo en el transcurso de la terapia. Como alternativa o de manera adicional, la dosis a administrar puede determinarse a partir de estudios que utilizan modelos animales. El ajuste de la dosis para lograr una eficacia maxima basada en estos u otros metodos se conoce bien en la tecnica y esta dentro de las capacidades de los medicos capacitados. A medida que los estudios se realizan utilizando los derivados de IGFBP-3 descritos en el presente documento, surgira mas informacion sobre los niveles de dosificacion apropiados y la duracion del tratamiento.

Un tratamiento descrito en el presente documento puede consistir en una dosis unica o dosis multiples. Por lo tanto, la administracion de un derivado de IGFBP-3, o la composicion del mismo, puede ser constante durante un cierto periodo de tiempo o periodica y en intervalos espedficos, por ejemplo, por hora, diariamente, semanal (o en algun otro intervalo de dfas multiples); mensual, anual (por ejemplo, en un formulario de liberacion de tiempo). Como alternativa, la administracion puede tener lugar varias veces durante un periodo de tiempo dado, por ejemplo, dos o mas veces por semana, dos o mas veces al mes, y similares. La administracion puede ser una administracion continua durante un periodo de tiempo, por ejemplo, administracion intravenosa.

2 - Aplicaciones de diagnostico

Algunos de los derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 descritos en el presente documento pueden ser utiles en aplicaciones de diagnostico. En particular, se describe en el presente documento un metodo para determinar la concentracion de pro-IGF-II en una muestra biologica, comprendiendo el metodo las etapas de: (1) poner en contacto la muestra biologica con un derivado polipeptidico de IGFBP-3 que comprende, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP, para permitir la formacion de un complejo entre el derivado de IGFBP-3 y cualquier pro-IGF-II presente en la muestra biologica, en donde pro-IGF-II es una forma parcialmente procesada de iGF-II; y (2) determinar la concentracion de pro-IGF-II en la muestra biologica midiendo la actividad alcalina de SeAP en el complejo.

Como se usa en el presente documento, el termino "pro-IGF-II" tiene su significado en la tecnica y se refiere a una forma parcialmente procesada de IGF-II, ya que se sintetiza originalmente antes de someterse a una escision endoproteolftica regulada en la forma madura (IGF-II).

El termino "muestra b io log ica" se usa en el presente documento en su sentido mas amplio. Una muestra biologica se obtiene generalmente de un sujeto. Una muestra puede ser de cualquier tejido biologico o fluido que pueda contener pro-IGF-II. En los seres humanos, se han detectado pro-formas de IGF-II en el suero, asf como en los fluidos cerebroespinales y amnioticos. Frecuentemente, una muestra biologica sera una "muestra clmica", es decir, una muestra derivada de un paciente, es decir, un sujeto diagnosticado con una enfermedad o que se sospecha que tiene una enfermedad.

La etapa de determinar la concentracion de pro-IGF-II en la muestra biologica midiendo la actividad alcalina de SeAP en el complejo puede realizarse utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluso a traves del uso de fosfato de p-nitrofenilo como se describe en la seccion de Ejemplos.

III - Composiciones farmaceuticas

Como se ha mencionado anteriormente, los derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 descritos en el presente documento pueden administrarse per se o como una composicion farmaceutica. Por consiguiente, se describen en el presente documento composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad eficaz de al menos un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y al menos un vetuculo o excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion puede comprender ademas uno o mas agentes biologicamente activos adicionales.

Los derivados polipeptfdicos de IGFBP-3 y las composiciones farmaceuticas de los mismos pueden administrarse en cualquier cantidad y usando cualquier via de administracion eficaz para lograr el efecto profilactico y/o terapeutico deseado. La formulacion farmaceutica optima puede variar dependiendo de la via de administracion y la dosis deseada. Dichas formulaciones pueden influir en el estado ffsico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo, y la velocidad de depuracion in vivo del principio activo administrado.

Las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden formularse en forma de unidad de dosificacion para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La expresion "forma de dosificacion unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad ffsicamente discreta de un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 para el paciente a tratar. Se entendera, sin embargo, que la dosis diaria total de las composiciones sera decidida por el medico a cargo dentro del alcance de un buen criterio medico.

A. Formulacion

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables esteriles, pueden formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados. La preparacion inyectable esteril tambien puede ser una solucion, suspension o emulsion inyectable esteril en un diluyente o disolvente atoxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solucion en 2,3-butanodiol. Entre los vetuculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan el agua, solucion de Ringer, U.S.P. y solucion de cloruro sodico isotonica. Ademas, se emplean convencionalmente aceites fijos esteriles en forma de solucion o medio de suspension. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volatil, incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Los acidos grasos tales como el acido oleico tambien se pueden usar en la preparacion de formulaciones inyectables. Los vetuculos lfquidos esteriles son utiles en composiciones en forma lfquida esteril para administracion parenteral.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas esteriles que pueden disolverse o dispersarse en agua esteril u otro medio inyectable esteril antes de su uso. Las composiciones farmaceuticas lfquidas que son soluciones o suspensiones esteriles pueden administrarse, por ejemplo, inyeccion intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutanea. La inyeccion puede ser por inyeccion simple o por infusion gradual. Cuando sea necesario o se desee, la composicion puede incluir un anestesico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyeccion.

Para prolongar el efecto de un principio activo, a menudo es deseable disminuir la absorcion del ingrediente de una inyeccion subcutanea o intramuscular. La demora en la absorcion de un principio activo administrado por via parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo el ingrediente en un vehnculo oleoso. Las formas de deposito inyectables se hacen formando matrices micro-encapsuladas del principio activo en polfmeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolido. Dependiendo de la relacion entre el principio activo y el polfmero y la naturaleza del polfmero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberacion del ingrediente. Los ejemplos de otros polfmeros biodegradables incluyen poli(ortoesteres) y poli(anhndridos). Las formulaciones inyectables de deposito tambien se pueden preparar atrapando el principio activo en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las formas farmaceuticas lfquidas para administracion oral incluyen, pero sin limitacion, emulsiones farmaceuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. Ademas del derivado polipeptfdico de IGFBP-3, la forma de dosificacion lfquida puede contener diluyentes inertes comunmente utilizados en la tecnica tales como, por ejemplo, agua u otro disolvente, agentes solubilizantes y emulsionantes tal como alcohol etflico, alcohol isopropflico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bendlico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, semillas de algodon, nuez molida, mafz, germen, oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfunlico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan y mezclas de los mismos. Ademas de diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes de suspension, conservantes, edulcorantes, saponferos, y agentes perfumantes, agentes espesantes, colorantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes o osmo-reguladores. Los ejemplos de vehnculos lfquidos adecuados para administracion oral incluyen agua (que puede contener aditivos como los anteriores, por ejemplo, derivados de celulosa, tales como la solucion de carboximetilcelulosa sodica), alcoholes (incluidos alcoholes monohndricos y alcoholes polihndricos tales como glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de mam). Para composiciones presurizadas, el vehnculo lfquido puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmaceuticamente aceptable.

Las formas farmaceuticas solidas para administracion oral incluyen, por ejemplo, capsulas, comprimidos, pfldoras, polvos y granulos. En dichas formas farmaceuticas solidas, un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 puede mezclarse con al menos un excipiente o vehnculo inerte, farmaceuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicalcico y uno o mas de: (a) cargas o diluyentes tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitos, y acido silfcico; (b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia; (c) humectantes tales como glicerol; (d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido algmico, determinados silicatos y carbonato de sodio; (e) agentes retardantes de solucion tales como parafina; aceleradores de la absorcion tales como compuestos de amonio cuaternario; (g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetflico y monoestearato de glicerol; (h) absorbentes tales como caolm y arcilla bentonita; y (i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. Otros excipientes adecuados para formulaciones solidas incluyen agentes modificadores de superficie tales como agentes modificadores de superficie no ionicos y anionicos. Los ejemplos representativos de agentes modificadores de superficie incluyen, pero sin limitacion, poloxamero 188, cloruro de benzalconio, estearato de calcio, alcohol cetoesteanlico, cera emulsionante de cetomacrogol, esteres de sorbitan, dioxido de silicio coloidal, fosfatos, dodecilsulfato de sodio, silicato de aluminio y magnesio, y trietanolamina. En el caso de las capsulas, comprimidos y pfldoras, la forma farmaceutica puede comprender agentes tamponantes.

Tambien pueden emplearse composiciones solidas de tipo similar como cargas en capsulas rellenas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o azucar de la leche, asf como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas solidas de dosificacion de comprimidos, grageas, capsulas, pfldoras y granulos pueden prepararse con recubrimientos y envolturas, tales como recubrimientos entericos, recubrimientos de control de la liberacion y otros recubrimientos bien conocidos en la tecnica de la formulacion farmaceutica. Opcionalmente, pueden contener agentes opacificantes y tambien pueden tener una composicion de tal forma que libera el principio o los principios activos unica o preferiblemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones incluidas que pueden utilizarse incluyen sustancias polimericas y ceras.

Puede ser deseable administrar una composicion descrita en el presente documento localmente en un area que necesita tratamiento. Esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitacion, por infusion local durante cirugfa, aplicacion topica, mediante inyeccion, mediante un cateter, por medio de supositorios, por medio de un parche o stent para la piel u otro implante.

Para la administracion topica, la composicion se formula preferiblemente como un gel, una pomada, una locion o una crema que puede incluir vehnculos tales como agua, glicerol, alcohol, propilenglicol, alcoholes grasos, trigliceridos, esteres de acidos grasos, o aceite mineral. Otros vehnculos topicos incluyen petroleo lfquido, palmitato de isopropilo, polietilenglicol, etanol (95 %), polioxietilenmonolaurato (5 %) en agua, o laurilsulfato de sodio (5 %) en agua. Se pueden anadir otros materiales, tales como antioxidantes, humectantes, estabilizadores de viscosidad y agentes similares, segun sea necesario.

Ademas, en determinados casos, se espera que las composiciones se puedan disponer dentro de dispositivos transdermicos colocados sobre, en, o debajo de la piel. Dichos dispositivos incluyen parches, implantes e inyecciones que liberan el principio activo mediante mecanismos de liberacion pasivos o activos. Las administraciones transdermicas incluyen toda la administracion a traves de la superficie del cuerpo y los revestimientos internos del pasaje corporal, incluidos los tejidos epiteliales y mucosos. Dichas administraciones se pueden realizar utilizando las presentes composiciones en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, soluciones y supositorios (rectales y vaginales).

La administracion transdermica se puede realizar mediante el uso de un parche transdermico que contiene un principio activo (es decir, el derivado polipeptfdico de IGFBP-3) y un vehmulo que no es toxico para la piel y permite la administracion del ingrediente para la absorcion sistemica en el torrente sangumeo a traves de la piel. El vehmulo puede adoptar cualquier numero de formas tales como cremas y unguentos, pastas, geles y dispositivos oclusivos. Las cremas y los unguentos pueden ser lfquidos viscosos o emulsiones semisolidas de tipo aceite en agua o agua en aceite. Las pastas compuestas de polvos absorbentes dispersados en petroleo o petroleo hidrofilo que contienen el principio activo pueden ser adecuadas. Se puede usar una diversidad de dispositivos oclusivos para liberar el principio activo en el torrente sangumeo, tal como una membrana semipermeable que cubre un deposito que contiene el principio activo con o sin un vehmulo, o una matriz que contiene el principio activo.

Las formulaciones de supositorios pueden hacerse de materiales tradicionales, incluyendo manteca de cacao, con o sin la adicion de ceras para alterar el punto de fusion del supositorio, y glicerina. Tambien se pueden usar bases de supositorio solubles en agua, tales como polietilenglicoles de diversos pesos moleculares.

Los materiales y metodos para producir diversas formulaciones son conocidos en la tecnica y pueden adaptarse para poner en practica la presente invencion. Se pueden encontrar formulaciones adecuadas para la administracion de anticuerpos, por ejemplo, en "Remington’s Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin, 18a Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA.

B. Agentes biologicamente activos adicionales

Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 descrito en el presente documento puede ser el unico principio activo en una composicion farmaceutica descrita en el presente documento. Como alternativa, la composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas agentes biologicamente activos. Los ejemplos de agentes biologicamente activos adecuados incluyen, pero sin limitacion, agentes anticancerosos, agentes antiinflamatorios, agentes inmunomoduladores, analgesicos, agentes antimicrobianos, agentes antibacterianos, antibioticos, antioxidantes, agentes antisepticos y combinaciones de los mismos.

En dichas composiciones farmaceuticas, el derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y el al menos un agente terapeutico adicional se pueden combinar en una o mas preparaciones para la administracion simultanea, separada o secuencial del derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y el agente o agentes terapeuticos. Mas espedficamente, una composicion descrita en el presente documento puede formularse de tal manera que el derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y el agente o agentes terapeuticos puedan administrarse juntos o independientemente uno del otro. Por ejemplo, un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y un agente terapeutico se pueden formular juntos en una sola composicion. Como alternativa, pueden mantenerse (por ejemplo, en diferentes composiciones y/o recipientes) y administrarse por separado.

C. Paquetes y kits farmaceuticos

En el presente documento tambien se describe un paquete o kit farmaceutico que comprende uno o mas recipientes (por ejemplo, viales, ampollas, tubos de ensayo, matraces o botellas) que contienen uno o mas ingredientes de una composicion farmaceutica, lo que permite la administracion de un derivado polipeptfdico de IGFBP-3. Tambien se describe en el presente documento un kit que comprende uno o mas recipientes que contienen uno o mas ingredientes que permiten la determinacion de la concentracion de pro-IGF-II en una muestra biologica. Tal kit generalmente comprendera un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 como se describe en el presente documento que comprende, fusionada al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP y al menos un reactivo para medir la actividad alcalina de SeAP.

Los diferentes ingredientes de un paquete o kit farmaceutico pueden suministrarse en forma solida (por ejemplo, liofilizada) o lfquida. Cada ingrediente sera generalmente adecuado como alrouotas en su recipiente respectivo o se proporcionara en forma concentrada. Los paquetes o kits descritos en el presente documento pueden incluir medios para la reconstitucion de ingredientes liofilizados. Los recipientes individuales de los kits se mantendran preferiblemente en confinamiento cercano para la venta comercial.

Un paquete o kit puede incluir uno o mas agentes terapeuticos adicionales. Opcionalmente asociado con el recipiente o recipientes puede haber un aviso o un prospecto en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricacion, uso o venta de agentes farmaceuticos o productos biologicos, cuyo aviso refleja la aprobacion por la agencia de fabricacion, uso o venta para administracion humana. El aviso del prospecto puede contener instrucciones para el uso de una composicion farmaceutica de acuerdo con los metodos de tratamiento descritos en el presente documento.

Un identificador, por ejemplo, un codigo de barras, radiofrecuencia, etiquetas de ID, etc., puede estar presente en o sobre el kit. El identificador se puede usar, por ejemplo, para identificar de forma particular el kit con fines de control de calidad, control de inventario, seguimiento del movimiento entre estaciones de trabajo, etc.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos describen algunos de los modos preferentes para hacer y practicar la presente invencion. Sin embargo, debe entenderse que los ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invencion. Ademas, a menos que la descripcion en un ejemplo se presente en tiempo pasado, el texto, como el resto de la memoria descriptiva, no pretende sugerir que los experimentos se realizaron realmente o que los datos se obtienen realmente.

Ejemplo 1: Preparacion de derivados polipeptidicos de IGFBP-3

Construccion de vectores de transferencia

Los siguientes vectores de transferencia se usaron en el presente estudio: pDB-3s-H6, pMJ-SeAP y pYM-Fc-IgG1. pDB-3s-H6 es un vector de transferencia de baculovirus para la expresion de protemas secretoras que se construyo en el laboratorio de los inventores como se ha descrito anteriormente (Netchine et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 2009, 94: 3913-3921). De forma similar, los vectores pMJ-SeAP y pYM-Fc-IgG1 utilizados para producir protemas de fusion secretadas con fosfatasa alcalina (SeAP) o con el fragmento Fc de IgG1 humana tambien se construyeron en el laboratorio de los inventores y se han descrito previamente (Bara et al., Int. J. Cancer, 1998, 75: 767-773; Mahiou et al., Biochem. J., 1998, 330: 1051-1058).

Todos los vectores de transferencia recombinante se construyeron despues de la generacion de fragmentos de PCR usando cebadores que comprenden espaciadores y sitios de restriccion de endonucleasas apropiados. Para minimizar ^{la formacion de estructuras secundarias, estas reacciones se realizaron en dimetilsulfoxido al}10^{% como se ha descrito}anteriormente (Chakrabarti y Schutt, Nucleic Acids Res., 2001,29: 2377-2381) usando un termociclador Perkin Elmer Life Sciences (Norwalk, CT) en las siguientes condiciones: desnaturalizacion inicial a 94 °C durante 10 minutos, seguida de ciclos de 3040 segundos a 94 °C, 60 °C y 72 °C.

En primer lugar, se construyo un vector de transferencia que albergaba la secuencia de codificacion completa de IGFBP-3 humana en pDB-3s-H6 aguas abajo de una extension N-terminal de hexahistidina (Figura 1). La reaccion de PCR utilizada: 5' - ATC GAA ggc cgt ggg ggc cAG GGC GCG AGC TCG GGG GGC TTG Gg -3' and 5'-Cct cga gTT ATC AGC TGC CCT TGC TCT GCA TGC TGT AGC AGT GCA CGT CCT C-3' (en la que los codones de parada estan subrayados) como cebadores sentido y antisentido, respectivamente; y un plasmido que albergaba el ADNc de IGFBP-3 como plantilla. Los sitios de restriccion Sfil y Xhol anadidos en los cebadores anteriores se presentan en minusculas. El producto de PCR de 815 pb se digirio con endonucleasas de restriccion Sfil y Xhol y se ligo en el vector de transferencia pDB-3s-H6 previamente digerido con las mismas enzimas. El producto de ligacion se utilizo para transformar celulas de E. coli electrocompetentes. Se selecciono un plasmido recombinante, denominado pDB-3s-H6-IGFBP-3, despues de la secuenciacion nucleotidica y se cotransfecto junto con ADN baculoviral en celulas Sf9 para producir el virus recombinante correspondiente que codificaba la protema recombinante H6-IGFBP-3.

Mutagenesis de sitio dirig ido

La mutagenesis de sitio dirigido se realizo utilizando un oligonucleotido mutagenico y una plantilla de ADN de cadena sencilla esencialmente como se ha descrito anteriormente (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82: 488-492) usando el kit de mutagenesis "MutaGene® Phagemid in vitro version 2" (BioRad). En resumen, los vectores de transferencia pMJ-H6-IGFBP-3 y pDB-3s-H6-IGFBP-3, cada uno con un origen de replicacion M13, se utilizaron para transformar la cepa mutante CJ236 (ung-dut-). Se selecciono un clon fagemido para producir partmulas virales despues de la infeccion con el fago auxiliar M13KO7. Despues de la extraccion, el ADN monocatenario correspondiente sirvio como plantilla en una reaccion de polimerizacion que comprendfa un oligonucleotido mutagenico 5'-fosforilado, ADN polimerasa T7 y ADN ligasa T4 como se describe por Kunkel.

El producto monocatenario se uso para transformar una cepa de E. coli electrocompetente en competente para ung dut. Los clones transformantes se cribaron para detectar la presencia de la mutacion mediante mapeo de restriccion y secuenciacion nucleotidica. Este enfoque se uso para acortar el dominio intermedio de IGFBP-3 humana mediante la hibridacion de una plantilla de ADN de IGFBP-3 monocatenario en el siguiente oligonucleotido mutagenico: 5'-GGG ACC ATA TTC TGT CTC acc acc aga ccc gcc aga ccc gcc aga ccc gcc aga ccc gcc acc GCT GAC GGC ACT AGC GTT GAC-3'. En la mutema resultante, los 85 aminoacidos (Residuo 95 a Residuo 179) presentes en el dominio central de IGFBP-3 de tipo silvestre, se han reemplazado por un espaciador de 15 aminoacidos, cuya secuencia es: NH²-GGGSGGSGGSGGSGG-COOH. El plasmido mutado obtenido (pDB-mini-IGFBP-3) sirvio para generar un baculovirus recombinante que codificaba esta mutema de IGFBP-3, denominada "mini-IGFBP-3", que carece de la mayor parte del dominio central nativo.

Una vez que se obtuvo esta secuencia original, se sintetizo una nueva plantilla de ADN monocatenario y se uso para generar nuevos mini-IGFBP-3 mutados mediante mutagenesis de sitio dirigido.

Uno de estos mutantes se creo eliminando la secuencia implicada en la union de ALS para producir mini-IGFBP-3 ALS- Para conseguir este objetivo, los aminoacidos basicos KGRKR en el dominio C-terminal de IGFBP se reemplazaron por la secuencia AGGSG utilizando una plantilla monocatenaria derivada de pBP-mini-IGFBP-3 con: CCACACACCAGCAGAAGCCGCCGCTGCCGCCCGCGGAAGGGCGACACTGC, un oligonucleotido mutagenico.

Se uso la misma plantilla para anadir en el extremo C-terminal de mini-IGFBP-3, el peptido GLNDIFEAQKIEWHE ^{(Beckett et al., Protein Sci., 1999,}8^{: 921-929), un sustrato para la enzima BirA (Schatz, Biotechnology, 1993, 11: 1138}1143) junto con el siguiente oligonucleotido mutagenico: CCCCTCGAGTCATTATTCGTGCCATTCAATTTTTTGGGCTTCAAAAATGTC GTTCAGGCCGCTGCCCTTGCTCTGC. La protema obtenida, -mini-IGFBP-3-avitag, puede biotinilarse enzimaticamente.

Produccion de proteinas de fusion

Para obtener la protema indicadora mini-IGFBP-3, la secuencia codificante de mini-IGFBP-3 se fusiono al extremo 3' de la fosfatasa alcalina secretada (SeAP) por escision de mini-IGFBP-3 del vector pDB 3s-H6-mini-IGFBP-3 obtenido despues de su doble digestion con las endonucleasas de restriccion Sfi1 y Xho1 y la posterior ligacion del fragmento resultante en el vector pMJ-SeAP previamente digerido con las mismas enzimas. El plasmido recombinante resultante se utilizo para generar un baculovirus recombinante que codificaba la protema de fusion indicadora llamada "SeAP-mini-IGFBP-3".

Para obtener la protema de fusion "mini-IGFBP-3 inmunoadhesina", la union de mini-IGFBP-3 al fragmento Fc de IgG1 humana, los amplicones mini-IGFBP-3 que comprenden los sitios de restriccion apropiados se generaron por PCR y se ligaron al vector pYM-FcgG1 correctamente digerido. El plasmido recombinante resultante se utilizo para generar un baculovirus recombinante que codificaba la protema de fusion de inmunoadhesina llamada "IGFBP-3-Fc".

Purificacion de proteinas recombinantes

Se recogio el medio de cultivo de celulas de insecto infectadas con cualquiera de los virus recombinantes descritos anteriormente y la protema recombinante se purifico por IMAC esencialmente como se ha descrito anteriormente (Mahiou et al., 1998 - vease anteriormente). Dado que las proteinas recombinantes requenan una etapa de purificacion adicional mediante cromatograffa de intercambio ionico: la IGFBP-3-Fc inmunoadhesina se purifico adicionalmente mediante cromatograffa de afinidad de protema-A-Sepharose (Mahiou et al., 1998 - vease anteriormente).

Ejemplo 2: Propiedades de Mini-IGFBP-3

La Figura 2 muestra una representacion esquematica de IGFBP-3 de tipo silvestre (H6-IGFBP-3) y de IGFBP-3 recombinante mutada (mini-IGFBP-3), que ilustra el hecho de que esta ultima deriva de H6-IGFBP-3 de tipo silvestre por reemplazo de la mayor parte de su dominio intermedio por el enlazador flexible de 15 aminoacidos indicado logrado ^{por mutagenesis de sitio dirigido. Tambien se presentan en la Figura 2 las secuencias de aminoacidos de H}6^-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3.

Propiedades de union. La cinetica de asociacion y disociacion de mini-IGFBP-3 e IGF-II se estudio mediante resonancia de plasmon superficial (BIAcore). Mini-IGFBP-3 se acoplo covalentemente a una superficie CM-5 a traves de carbodiimida. Despues de la saturacion con una solucion 1 M de etanolamina, se inyecto una solucion de IGF-II en PBS en la superficie, y se reemplazo por un tampon despues de 80 segundos. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 3.

La afinidad de la IGFBP-3 de tipo silvestre (wt) y de la IGFBP-3 mutada (mini-IGFBP-3) por IGF-I e IGF II se determino ^utilizando125^{I-IGF-1 como trazador radioactivo. Se utilizaron diversas concentraciones de IGF-I e IGF-II como}competidores y las constantes de afinidad se determinaron mediante analisis de Scatchard. Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla.

Tabla 1. IGFBP-3 de tipo silvestre (wt) y de IGFBP-3 mutada (mini-IGFBP-3) para IGF-I e IGF II

Resistencia de mini-IGFBP-3 a la degradacion proteolitica. La susceptibilidad de IGFBP-3 de tipo silvestre y de mini-IGFBP-3 a la degradacion proteolftica por trombina se estudio incubando las proteinas purificadas (100 ng) con concentraciones crecientes de trombina (0,0008; 0,004; 0,02 y 0,1 NHI U/ml) durante una hora. Los productos de digestion se separaron entonces por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y se analizaron por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo policlonal de conejo producido contra la molecula de IGFBP-3 completa.

Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4.

Ejemplo 3: Propiedades de mini-IGFBP-3-avitag

La Figura 5 muestra una representacion esquematica de un mapa de restriccion del vector de transferencia pRH-3s-^H6^{-avitag obtenido por mutagenesis de sitio dirigido. En este vector, cualquier secuencia de marco de lectura abierto}flanqueada por los sitios de restriccion Sfi I y Pvu II puede introducirse por PCR en el vector digerido por las mismas enzimas. El polipeptido secretado resultante de la traduccion de la construccion llevara el peptido Avitag a su extremo C-terminal y sera susceptible de biotinilacion enzimatica dirigida utilizando la enzima BirA. La secuencia codificante de mini-IGFBP-3 se introdujo en este vector produciendo secuencialmente, el vector pRH-3s-H6-mini-IGFBP-3, el virus recombinante AcMNPV-mini-IGFBP-3 y la protema recombinante mini-IGFBP-3-avitag.

Biotinilacion enzimatica de mini-IGFBP-3-Avitag. Para evaluar la susceptibilidad de mini-IGFBP-3-Avitag a la biotinilacion enzimatica, H6-IGFBP-3 recombinante purificada, mini-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3-Avitag (1 |jg de cada uno) se analizaron por SDS-PAGE y se tineron con azul brillante de Coomassie. Se purifico por primera vez mini-IGFBP-3-Avitag antes de anadirse a una mezcla de reaccion de biotinilacion que contema biotina y la enzima BirA. Una almuota del producto de reaccion se cargo en un SDS-PAGE lado a lado con un anticuerpo monoclonal (7E8) que previamente se habfa biotinilado qmmicamente. El gel se transfirio a una membrana de PVDF que, despues de la saturacion, se incubo con estreptavidina-HRP. La actividad de la peroxidasa se determino por quimioluminiscencia. ^{Los resultados obtenidos se presentan en la Figura}6^.

Biotinilacion enzimatica dirigida de mini-IGFBP-3-Avitag en extractos en bruto. Los extractos de protemas de (a) un sobrenadante de un cultivo de celulas Sf-9 infectadas por un virus que produce mini-IGFBP-3 parental, (b) un sobrenadante de un cultivo de celulas Sf-9 infectadas por un virus que produce mini-IGFBP-3-Avitag, y (c) mini-IGFBP-3-avitag purificado se sometieron a biotinilacion BirA dirigida. Una almuota de cada una de las muestras se separo entonces por SDS-PAGE y despues se transfirio a una membrana de PVDF, que luego se incubo con estreptavidina-AP. La actividad de APasa se demostro entonces anadiendo NBT/BCIP. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 7.

Despues de una dialisis extensa contra PBS, el medio de cultivo en bruto que contema mini-IGFBP-3-avitag-biotina (carril e en el panel B de la Figura 7) se inyecto en un chip de estreptavidina. Despues del lavado con NaCl 1 M, se ^{inyectaron secuencialmente una solucion que contema el anticuerpo monoclonal anti-IGFBP-3}6^E8 ^{y una solucion que}contema IGF-II. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 7(C).

Ejemplo 4: Protema de fusion indicadora de SeAP-mini-IGFBP-3 y usos de la misma

^{La Figura}8^{(A) muestra el mapa de restriccion del vector de transferencia pMJ-SeAP-mini-IGFBP-3 construido y usado}para producir la protema de fusion indicadora SeAP-mini-IGFBP-3.

^{Ensayo Sandwich en fase solida.} ^{En la Figura}8 ^{(B) se presenta una representacion esquematica de un ensayo}"sandwich" en fase solida desarrollado para determinar las concentraciones de pro-IGF-II en plasma humano. Este ensayo "sandwich" utiliza como reactivo de captura un anticuerpo policlonal anti-IGF-II de peptido E inmovilizado en un soporte y como reactivo indicador espedfico, SeAP-mini-IGFBP-3.

Este ensayo se valido mediante la determinacion de los niveles de pro-IGF-II en el plasma de adultos sanos (n = 40), de pacientes diagnosticados con hipoglucemia tumoral de celulas no islotes (NICTH) (n = 25) y de pacientes con ^{NICTH despues de la extirpacion del tumor (n = 4). Los resultados obtenidos se presentan en la Figura}8^(C).

Ejemplo 5: Propiedades de mini-IGFBP-3-Fc

La Figura 9(A) muestra el mapa de restriccion del vector de transferencia pYM-mini-IGFBP-3 construido y usado para producir la protema de fusion mini-IGFBP-3-FcIgG1, que se representa esquematicamente en la Figura 9(B).

Afinidad de mini-IGFBP-3-Fc por IGF-II. Se uso un ensayo en fase solida para estudiar la afinidad de union de mini-IGFBP-3-Fc por IGF-II. En este ensayo, dos protemas de union (mini-IGFBP-3 y mini-IGFBP-3-Fc) se inmovilizaron en un soporte. Se incubaron con el trazador de IGF-II biotinilado y luego se anadieron concentraciones crecientes de IGF-II. Los resultados obtenidos, que se presentan en la Figura 10(A), muestran que el mini-IGFBP-3-Fc se une al IGF-II con mayor afinidad aparente que su equivalente no fusionado (mini-IGFBP-3).

Actividad anti-proliferativa de mini-IGFBP-3-Fc. Se estudiaron los efectos de mini-IGFBP-3-Fc en la proliferacion y supervivencia de tres lmeas celulares de tumores humanos, Hep3B y HuH7 - lmeas celulares de carcinoma ^{hepatocelular) e INA}-6 ^{(lmea celular de mieloma multiple). Para cada lmea celular cultivada en presencia de suero de}ternera fetal (FCS) al 10 %, el efecto de mini-IGFBP-3-Fc se comparo con el efecto de picropodofilina (ppp), un compuesto que se sabe que interfiere con la via de senalizacion de iGf 1-R. Se realizo un ensayo de viabilidad celular 72 horas despues del inicio del cultivo en presencia de mini-IGFVP-3-Fc (100 nM) o ppp (1 jM ) en un medio que contema FCS al 10 % mediante la adicion de WST-1 y supervisando la conversion de formazan. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 10B). Muestran que el mini-IGFBP-3-Fc tiene actividad antiproliferativa en las tres lmeas de celulas tumorales humanas ensayadas.

^{Inhibicion de la fosforilacion de AKT por mini-IGFBP-3-Fc.} ^{La lmea celular de mieloma INA}-6 ^{se cultivo en presencia de FCS al 10 %. Las celulas se incubaron con mini-IGFBP-3 (100 nm) o ppp (1 jM ) durante 3,}6 ^{o 24 horas.}Despues de la incubacion, las celulas se lisaron utilizando un tampon de lisis, y los extractos celulares (normalizados para los contenidos de protemas) se cargaron en gel SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, que se incubo adicionalmente con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el residuo de fosfo-S273 de la protema AKT. La membrana tambien se volvio a sondar despues de la eliminacion con un anticuerpo anti-actina para verificar la carga equivalente. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 11A).

La actividad inhibidora de mini-IGFBP-3-Fc en la fosforilacion de AKT tambien se evaluo en varias lmeas de celulas tumorales humanas: MiaPaCa-2 (cancer de pancreas), HT-29 (cancer de colon) y A549 (cancer de pulmon). La actividad inhibidora de mini-IGFBP-3 en la fosforilacion de AKT se evaluo en celulas A549. Los resultados obtenidos, que se presentan en la Figura 11B), muestran que el mini-IGFBP-3-Fc y el mini-IGFBP-3 son capaces de bloquear la fosforilacion de AKT de todas las lmeas celulares de tumor humano analizadas.

Ejemplo 6: Propiedades de mini-IGFBP-3 y derivados in vivo

Para allanar el terreno para futuras evaluaciones de la actividad de mini-IGFBP-3 in vivo, mini-IGFBP-3 y sus derivados se inyectaron en ratones. Cuando se midio utilizando la prueba ELISA IGFBP-3 espedfica para seres humanos, se pudieron observar varias cineticas.

Como se ve en la Figura 12, despues de la administracion, el mini-IGFBP-3 se elimino del torrente sangumeo con dos cineticas diferentes: el 80-90 % de la dosis inicial abandono el torrente sangumeo en las primeras 3-4 horas, mientras que el 10-20 % restante desaparecio muy lentamente hasta las 48 horas. Como cada esperar, el mini-IGFBP-3 que ^{portaba la union de supresion de la mutacion a ALS desaparecio mucho mas rapido y casi no quedaban protemas}8 horas despues de la inyeccion. Por el contrario, la concentracion serica de mini-IGFBP-3-Fc decayo con una cinetica ^{de pendiente unica mucho mas lenta con una semivida de aproximadamente}12 ^horas.

La lmea celular de adenocarcinoma de colon humano HT-29 productor de IGF-II, que previamente hada demostrado ser sensible a mini-IGFBP-3 in vitro, se uso para evaluar la actividad in vivo de mini-IGFBP-3. Por lo tanto, se establecieron los xenoinjertos HT-29 en ratones desnudos. Una vez que el tumor alcanzo un tamano cntico, los ratones se trataron con mini-IGFBP-3 o mini-IGFBP3-Fc en tres inyecciones i.p. separadas en un intervalo de tres horas y los ratones se sacrificaron despues de 3 horas adicionales. Se evaluaron las vfas de senalizacion de MEK y PI3Cinasa tumorales en estos tumores, junto con el regulador del ciclo celular Rb, mediante la evaluacion del estado de fosforilacion de AKT, ERK-1/2 y Rb, respectivamente, utilizando inmunotransferencias de Western.

^{Mas espedficamente, 2,5 x 10}6 ^{celulas HT-29 se inyectaron s.c. en cada costado de ratones NMRI-nu de 5 semanas de edad. Se permitio que los tumores crecieran hasta un volumen de 500 mm}3 ^{antes de que los ratones se asignaran}al azar a grupos de tratamiento individuales (n = 2) y recibieran tres inyecciones i.p. (340 |jg) de mini-IGFBP-3 o mini-IGFBP-3-Fc cada 3 horas. El grupo de control se inyecto con solucion salina. Doce (12) horas despues del inicio del tratamiento, los ratones se sacrificaron y los tumores extirpados se cortaron por la mitad. Una mitad se congelo instantaneamente en nitrogeno lfquido y se almaceno a -80 °C. La otra mitad se fijo en Finfix, se incluyo en parafina y se proceso para determinar la inmunohistoqdmica. Para el analisis de transferencia de Western, los tumores se homogeneizaron en tampon de lisis (Tris HCl 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,1 %, SDS al 0,1 %, EDTA 1 mM, ortovanadato sodico 2 mM, comprimido de inhibidor de proteasa [Roche Molecular Biochemicals]). Tras la centrifugacion, las concentraciones de protemas se determinaron mediante el ensayo de protemas Bio-Rad (Bio-Rad). Se sometieron quince microgramos de protema en un gel de SDS-PAGE al 4 %-12 % (Invitrogen). Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5 % en TBS-T durante una noche a 4 °C, se lavaron con TBS-T, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante antiraton o anti-conejo en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron en TBS-T. La senal se visualizo utilizando una solucion de quimioluminiscencia mejorada y se expuso a una pelmula. Los anticuerpos de transferencia utilizados fueron fosfor-Akt, Akt, protema cinasa activada por mitogeno ERK1/2, protema cinasa activada por fosforomitogeno pErk1/2, Rb (BD Biosciences), p-actina y G3PDH; los anticuerpos eran de Cell Signaling Technology, a menos que se indique otra cosa.

Como se ve en la Figura 13, un tratamiento de 12 horas con mini-IGFBP-3 o mini-IGFBP-3-Fc, elimino la fosforilacion de AktS473 en tumores de cada raton tratado, lo que indica un fuerte bloqueo de la via de senalizacion de PI3K. Como cada esperar, la via de senalizacion de MEK se interrumpio de manera similar ya que la fosforilacion de Erk1/2 tambien se redujo considerablemente en los tumores tratados en comparacion con sus homologos no tratados. Por lo tanto, el control del ciclo celular se evaluo examinando el estado de fosforilacion de la protema Rb. Como se muestra en la Figura 13, mientras que la protema Rb estaba completamente fosforilada en tumores no tratados, la fosforilacion de Rb disminuyo en todos los tumores tratados. De acuerdo con estos datos, el mdice mitotico fue ligeramente mas bajo (-12 %) en estos tumores en comparacion con su homologo no tratado. En conjunto, estos datos indican que el mini-IGFBP-3 y su derivado mini-IGFBP-3-Fc estan activos in vivo para interrumpir las dos vfas de senalizacion principales activadas por las tirosina cinasas del receptor de IGF-1R o IR-A, lo que lleva al inicio de la detencion del ciclo celular. Por lo tanto, el secuestro de IGF-I libre y de IGF-II libre en un animal portador de un tumor productor de IGF-II por una protema de union a IGF resistente a la proteasa agota los IGF biodisponibles en el tumor a fin de privar al tumor y bloquear las vfas de senalizacion involucradas en el avance del ciclo celular del tumor. La duracion del tratamiento utilizado en estos experimentos fue demasiado corta para observar la activacion de los marcadores ligados a la apoptosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 que comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio C-terminal, en el que:

el dominio N-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biologicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y la subunidad acido-labil (ALS); el dominio intermedio comprende la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 humana de ^{tipo salvaje, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91 o 92 residuos de aminoacidos contiguos de dicha secuencia de}aminoacidos se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4; y el dominio C-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biologicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y ALS.

2. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el dominio intermedio de IGFBP-3 humana de tipo salvaje consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2.

3. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el dominio intermedio del derivado ^{polipeptfdico de iGf BP-3 consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91}o 92 residuos de aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 2 se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

4. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 1; y

la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 3.

5. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

el dominio N-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3 consiste en la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 1; y

el dominio C-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3 consiste en la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 3.

6^{. Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 que comprende un dominio N-terminal, un dominio intermedio y un dominio}C-terminal, en el que:

el dominio N-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de IGFBP-3 humana de tipo silvestre, o de un fragmento biologicamente activo de la misma que conserva la capacidad del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre para unirse a IGF-I, IGF-II, heparina y la subunidad acido-labil (ALS); el dominio intermedio comprende la secuencia de aminoacidos del dominio intermedio de la IGFBP-3 humana de ^{tipo salvaje, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91 o 92 residuos de aminoacidos contiguos de dicha secuencia de}aminoacidos se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4; y el dominio C-terminal comprende la secuencia de aminoacidos del dominio C-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 3, en la que los residuos de aminoacidos 43 a 47 en la SEQ ID NO: 3 se reemplazan con AGGSG (SEQ ID NO: 5).

^{7. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion}6 ^{, en el que el dominio intermedio de IGFBP-}3 humana de tipo salvaje consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2.

8^{. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion}6^{, en el que el dominio intermedio del derivado polipeptfdico de iGf BP-3 consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, en el que 85,}86^{, 87,}88^{, 89, 90, 91}o 92 residuos de aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 2 se reemplazan con un el enlazador que es resistente a la escision proteolftica por proteasas que escinden la IGFBP-3 humana de tipo silvestre y que tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

^{9. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones}6 ^a8^{, en el que:}la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre es la expuesta en la SEQ ID NO: 1.

^{10. El derivado polipeptidico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones}6 ^a8^{, en el que:}el dominio N-terminal del derivado polipeptidico de IGFBP-3 consiste en la secuencia de aminoacidos del dominio N-terminal de la IGFBP-3 humana de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO: 1.

11. El derivado polipeptidico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende ademas, fusionado al mismo, el fragmento Fc de inmunoglobulina IgG1.

12. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademas la secuencia de aminoacidos de IGF-I, en el que el IGF-I forma complejo con el derivado polipeptfdico de IGFBP-3.

13. El derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademas un sustrato de la enzima BirA unido covalentemente al extremo terminal del dominio C-terminal del derivado polipeptfdico de IGFBP-3.

14. El derivado polipeptidico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que el sustrato de la enzima BirA ^{tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:}6^.

15. El derivado polipeptidico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 13 o la reivindicacion 14, que comprende ademas biotina unida covalentemente al sustrato de la enzima BirA.

16. El derivado polipeptidico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende ademas, fusionado al mismo, la secuencia de aminoacidos de SeAP (fosfatasa alcalina secretada).

17. Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 13 a 16 para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en canceres y retinopatfas proliferativas.

18. Un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 12 para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en resistencia a la hormona del crecimiento, deficiencia de IGF-I, quemaduras graves, desgaste por VIH, fibrosis qrnstica, enfermedad celfaca, anorexia nerviosa, enfermedad de desgaste muscular, distrofia miotonica, esclerosis lateral amiotrofica, osteoporosis, resistencia grave a la insulina, diabetes de tipo I, diabetes tipo II, isquemia cerebral, e isquemia cardfaca.

19. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.

20. Un metodo para determinar la concentracion de pro-IGF-II en una muestra biologica, comprendiendo el metodo las etapas de:

poner en contacto la muestra biologica con un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 12 para permitir la formacion de un complejo entre el derivado polipeptfdico de IGFBP-3 y cualquier pro-IGF-II presente en la muestra biologica, en donde pro-IGF-II es una forma parcialmente procesada de IGF-II; y determinar la concentracion de pro-IGF-II en la muestra biologica midiendo la actividad alcalina de SeAP en el complejo.

21. Un kit que comprende un derivado polipeptfdico de IGFBP-3 de acuerdo con la reivindicacion 16 y al menos un reactivo para medir la actividad alcalina.