EA015363B1 - Агенты, специфически связывающие фактор роста гепатоцитов, и их применение - Google Patents

Abstract

Описываются специфические связывающие агенты, взаимодействующие с фактором роста гепатоцитов (ФРГ). Описываются способы лечения рака путем назначения фармацевтически эффективного количества специфического связывающего вещества, взаимодействующего с ФРГ. Описываются способы детектирования количества ФРГ (фактора роста гепатоцитов) в образце, используя специфический связывающий с ФРГ агент.

Description

В данной заявке утверждается преимущество предварительной заявки на патент США № 60/488681, поданной 18 июля 2003 года, которая включена в данное изобретение для всех целей путем ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к специфическим связывающим агентам, взаимодействующим с фактором роста гепатоцитов ФРГ (НОР Нера!осу!е Сго\\!11 Рас!ог). Также описываются композиции, способы производства указанных композиций и способы лечения различных заболеваний, подобных определенным типам рака, включая твердые опухоли и гематологические злокачественные заболевания, но не ограничиваясь ими.

Предпосылки создания изобретения

Было установлено, что фактор роста гепатоцитов (ФРГ) является сильнодействующим митогеном для гепатоцитов. Было также установлено, что ФРГ является секреторным белком фибробластов и гладкой мышцы, вызывающим подвижность эпителиальных клеток. В литературе ФРГ также называют фактором рассеяния (ФР).

ФРГ является мультифункциональным гетеродимерным полипетидом, производимым в основном мезенхимными клетками, действующими в качестве лиганда для киназы тирозина рецептора Мет (Ме!). Рецептор Мет человека также известен как с-те!. Было показано, что активация через каскад реакций киназы тирозина рецептора Мет-ФРГ (Мет-ФРГ) приводит к ряду клеточных реакций, включая пролиферацию (митоз), рассеяние (подвижность), стимуляцию движения клетки через матрицу (инвазию) и разветвленный морфогенез, но не ограничиваются ими. Активация ίη νίνο через каскад реакций Мет-ФРГ (Мет-ФРГ) играет роль, например, в нервном возбуждении, регенерации печени, заживлении ран, развитии кровеносных сосудов, росте, инвазии, морфологической дифференциации и нормальном эмбриологическом развитии. В дополнении к этим функциям пара Мет-ФРГ может также играть роль при раке у человека. Было показано, что отклоняющаяся от нормы (аберрантная) активация Мет-ФРГ вызывает онкогенез, в частности, при развитии инвазивных и метастатических фенотипов. Было также обнаружено, что некоторые болезнетворные организмы (патогены), такие как малярия, также используют аберрантную активацию Мет-ФРГ. См. Карроло и др. (Сагго1о е! а1.), Природная медицина (Να! Меб.), 2003, 9(11):1363-9 (12 октября 2003 года), содержание которого включено в данный материал путем ссылки для любой цели.

Далее, в некоторых группах отмечалось, что ФРГ может играть роль в развитии кровеносных сосудов и заболеваниях, вызванных им, подобных пролиферативной диабетической ретинопатии (поражении сетчатки) или дегенерации желтого пятна. См., например, Грант Д.С. и др. (Огап!, Ό.8. е! а1.), Труды Академии естественных наук США (Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А): 90(5) 1937-41 (1993); Буссолино и др. (Ви88о11по е! а1.), Журнал биологии клетки (1. Се11. Вю1.), 119 (3):629-641 (1992); Монтесано и др. (Моп!е8апо е! а1.), Клетка (Се11.), 67:901-908 (1991); Кенон и др. (Сапоп е! а1.), Британский журнал офтальмологии (Вг. 1. Орй!йа1то1.) 84(7): 732-5 (2000). ФРГ может также играть роль в апоптозе или программируемой смерти клетки. Опухоли могут возникать тогда, когда нормальные регуляторные механизмы не могут поддерживать баланс между пролиферацией и апоптозом (утратой клеток), так что клетки накапливаются в избыточном количестве. ФРГ может влиять как на пролиферацию, так и на апоптоз, в зависимости от биологического контекста.

Из-за того, что ФРГ задействован во многих физиологических процессах, в некоторых случаях может быть полезным иметь молекулы, способные регулировать его активность. Например, в некоторых случаях подобные молекулы могут быть полезны при лечении различных типов рака.

Краткое содержание изобретения

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СЭК.), выбранный из СЭКба, СЭК2а и С1)Юа.

при этом СЭК1а включает аминокислотную последовательность а Ь с б е ί д 11 ί _) к 1 т п о р ср где аминокислота а выбирается из лизина, аргинина или глютамина; аминокислота Ь выбирается из серина или аланина; аминокислота с является серином, аминокислота б является глютамином; аминокислота е выбирается из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ί выбирается из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбирается из лейцина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 1 выбирается из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ί является серином или не присутствует; аминокислота _) является серином или не присутствует; аминокислота к выбирается из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбирается из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбирается из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота п выбирается из аспарагина или серина; аминокислота о выбирается из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбирается из аланина, глицина или аспарагина;

при этом СЭК2а включает аминокислотную последовательность г 8 ! и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глютаминовой кислоты или глицина; аминокислота 8 является аланином, аминокислота ! является серином, аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глюта

- 1 015363 миновой кислоты, глютамина или аланина и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

при этом СБЯЗа включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' 6' е' Г д' 11', где аминокислота у выбрана из глютамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глютамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота 6' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокислота ί¹ является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином и аминокислота 1' является треонином или аспарагином; и при этом полипептид в соединении с тяжелой цепью антитела способен связывать фактор роста гепатоцитов (ФРГ).

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СОК), выбранный из СЭК1Ь. СЭК2Ь и СВЯЗЬ, при этом СВКГЬ включает аминокислотную последовательность а Ь с б е ί д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбирается из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота б является тирозином; аминокислота е выбирается из тирозина или глицина; аминокислота ί выбирается из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

при этом СБЯ2Ь включает аминокислотную последовательность 1 ί _) к 1 т η о р д г 5 I и ν ν х, где аминокислота 1 выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глютаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота _) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина или гистидина; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота η выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота д выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота 5 выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота ΐ выбрана из глютамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и выбрана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина, валина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глютамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

при этом СВЯЗЬ включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' ί¹ д' 1' 1' _) ' к' 1' т' η' о' р' д' г', где аминокислота у выбрана из глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина, глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, гистидина, пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глютаминовой кислоты, тирозина или лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина, аспарагина, глицина, гистидина, тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина, серина, глютаминовой кислоты, тирозина, глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота б' является глицином или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота ί' является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота 1' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота _)' выбрана из тирозина, глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина, фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина, глицина, аспарагиновой кислоты, пролина или серина или не присутствует; аминокислота η' выбрана из глицина, валина, тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина, аланина, глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина, фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина, тирозина, изолейцина, или пролина; и где полипептид в соединении с легкой цепью антитела способен связывать фактор роста гепатоцитов (ФРГ).

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированный специфический связывающий агент, при этом специфический связывающий агент включает:

(ί) первый полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СБЯ), выбранный из СВЯ1а, СБЯ2а и СБЯЗа, при этом СБЯ1а включает аминокислотную последовательность а Ь с б е ί д 1 ί _) к 1 т η о р д, где аминокислота а выбрана из лизина, аргинина или глютамина; аминокислота Ь выбрана из серина или аланина; аминокислота с является серином, аминокислота б является глютамином; аминокислота е выбрана из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ί выбрана из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбрана из лейцина или фенилаланина

- 2 015363 или не присутствует; аминокислота к выбрана из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ι является серином или не присутствует; аминокислота_) является серином или не присутствует; аминокислота к выбрана из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбрала из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота η выбрана из аспарагина или серина; аминокислота о выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбрана из аланина, глицина или аспарагина;

при этом ί.ΌΒ2 включает аминокислотную последовательность г з I и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глютаминовой кислоты или глицина; аминокислота з является аланином, аминокислота ΐ является серином, аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глютаминовой кислоты, глютамина или аланина и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

при этом СЭВЗа включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' й' е' I¹ д' к', где аминокислота у выбрана из глютамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глютамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота й' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокислота I¹ является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином и аминокислота Ь' является треонином или аспарагином; и при этом первый полипептид в соединении с тяжелой цепью антитела способен связывать фактор роста гепатоцитов (ФРГ);

(ίί) второй полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СОВ), выбранный из СОВ1Ь, СЭВ2Ь или СЭРЗЬ. при этом СЭВ1Ь включает аминокислотную последовательность а Ь с й е ί д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбрана из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота й является тирозином; аминокислота е выбрана из тирозина или глицина; аминокислота ί выбрана из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

при этом СЭВ2Ь включает аминокислотную последовательность к ί _) к 1 т η о р с.| г з ΐ и ν ν х, где аминокислота к выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глютаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота_) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина или гистидина; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота η выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота с.| выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота з выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота ΐ выбрана из глютамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и выбрана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина, валина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глютамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

при этом СЭВЗЬ включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' й' е' Г д' к' 1' _)' к' 1' т' η' о' р' д' г', где аминокислота у выбрана из глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина, глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, гистидина, пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глютаминовой кислоты, тирозина или лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина, аспарагина, глицина, гистидина, тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина, серина, глютаминовой кислоты, тирозина, глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота й' выбрана из глицина или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота I¹ является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота к' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота выбрана из тирозина, глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина, фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина, глицина, аспарагиновой кислоты, пролина или серина или не присутствует; аминокислота η' выбрана из глицина, валина, тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина, аланина, глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина, фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина, тирозина, изолейцина или пролина; и где второй полипептид в соединении с легкой цепью антитела способен связывать ФРГ.

- З 015363

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 и 42.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает выделенный полипептид, включающий по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей №: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую по крайней мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей №: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СИВ), выбранный из СОВ1а, СЭВ2а и СОВ3а, при этом СЭВ 1а включает аминокислотную последовательность а Ь с е £ д 11 ί _) к 1 т η о р д, где аминокислота а выбрана из лизина, аргинина или глютамина; аминокислота Ь выбрана из серина или аланина; аминокислота с является серином, аминокислота б является глютамином; аминокислота е выбрана из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота £ выбрана из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбрана из лейцина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ί является серином или не присутствует; аминокислота _) является серином или не присутствует; аминокислота к выбрана из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбрана из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота η выбрана из аспарагина или серина; аминокислота о выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбрана из аланина, глицина или аспарагина;

при этом СОВ2а включает аминокислотную последовательность г 5 1 и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глютаминовой кислоты или глицина; аминокислота 5 является аланином, аминокислота 1 является серином, аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глютаминовой кислоты, глютамина или аланина и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

при этом СЭВ3а включает последовательность аминокислот у ζ а' Ь' с' б' е' I¹ д' 1', где аминокислота у выбрана из глютамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глютамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота б' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокислота £' является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином; и аминокислота 1' является треонином или аспарагином; и где полипептид в соединении с тяжелой цепью антитела способен связывать фактор роста гепатоцитов (ФРГ).

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, включающий по крайней мере один гипервариабельный участок (СОВ), выбранный из СЭВШ СЭВ2Ь и СОВ3Ь, при этом СЭВ1Ь включает аминокислотную последовательность а Ь с б е £ д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбрана из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота б является тирозином; аминокислота е выбрана из тирозина или глицина; аминокислота £ выбрана из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

при этом С0В2Ь включает аминокислотную последовательность 1 ί _) к 1 т η о р с.| г 5 1 и ν ν х, где аминокислота 1 выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глютаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота _) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина или гистидина; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота η выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота с.| выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота 5 выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота 1 выбрана из глютамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и выбрана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина, валина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глютамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

- 4 015363 при этом СЭРЗЬ включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' 6' е' Г д' 6' 1' ф к' 1' т' п' о' р' д' г', где аминокислота у выбрана из глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина, глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, гистидина, пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глютаминовой кислоты, тирозина или лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина, аспарагина, глицина, гистидина, тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина, серина, глютаминовой кислоты, тирозина, глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 6' является глицином или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота ί¹ является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота 6' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота _)' выбрана из тирозина, глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина, фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина, глицина, аспарагиновой кислоты, пролина или серина или не присутствует; аминокислота п' выбрана из глицина, валина, тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина, аланина, глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина, фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина, тирозина, изолейцина или пролина; и где полипептид в соединении с легкой цепью антитела способен связывать ФРГ.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает изолированную клеточную линию, производящую антитело, выбранное из 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает способ ингибирования связывания ФРГ с метионином (Ме1), включающий назначение специфического связующего агента с ФРГ.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает полипептид, включающий по крайне мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает полипептид, фактически включающий по крайне мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает специфический связывающий агент, способный связывать по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает домен связывания антитела или антигена, способный связывать по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает способ получения антитела, способного связывать фактор роста гепатоцита (ФРГ), включающий введение животному по крайней мере одного полипептида, выбранного из последовательностей №: 164 и 165, и получение антитела, способного связывать ФРГ от животного.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает способ снижения или предотвращения связывания специфического связывающего агента с фактором роста гепатоцита (ФРГ) путем введения полипептида, включающего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает способ снижения или предотвращения связывания специфического связывающего агента с фактором роста гепатоцита (ФРГ) путем введения полипептида, состоящего по крайней мере из одной аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 164 и 165.

Другие примеры осуществления изобретения будут очевидны из приводимого здесь раскрытия сущности изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А показана дендрограмма легких каппа-цепей некоторых антител к ФРГ (НОР Нера1осу1е Сго\\111 Рас1ог), показывающая их отношения зародышевой линии. Обозначения гена зародышевой линии указаны справа от обозначения антитела. На фиг. 1В показано выстраивание различных областей легкой каппа-цепи аминокислотной последовательности некоторых антител к ФРГ. Обозначения гена зародышевой линии указаны слева. Участки СОЯ указаны жирными линиями над выстроенными последовательностями.

На фиг. 2А показана дендрограмма тяжелых гамма цепей некоторых антител к ФРГ (НОР Нера1осу1е Сго\\111 Рас1ог). показывающая их отношения зародышевой линии Обозначения гена зародышевой линии указаны справа от обозначения антитела. На фиг. 2В показано выстраивание вариабельных облас

- 5 015363 тей тяжелой гамма цепи аминокислотных последовательностей некоторых антител к ФРГ. Обозначения гена зародышевой линии указаны слева. Участки СИЯ указаны жирными линиями над выстроенными последовательностями.

На фиг. 3 показаны последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области как из легких (ЫдЦ сНат V гсщоп). так и тяжелых (Неауу сНат V гещоп) цепей некоторых антител к ФРГ. Для каждой последовательности приводится название антитела. обозначение зародышевой линии и идентификационный номер последовательности (ЬЕЦ ΙΌ Νο:). Подчеркнута природная последовательность сигнального пептида. Также показаны последовательности ДНК постоянных областей каппа (Нишап Карра Сопк1аШ Яещоп). 1дО1 и 1дС2 (Нишап Сопк1ап1 Яещоп) человека.

На фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности вариабельных областей легких (Ыдй! сНат V гещоп) и тяжелых (Неауу сНат V гещоп) цепей некоторых антител к ФРГ. Для каждой последовательности указывается название антитела. обозначение зародышевой линии и идентификационный номер последовательности (8ЕО ΙΌ N3:). Подчеркнута природная последовательность сигнального пептида. Также показаны последовательности постоянных областей каппа (Нишап Карра Сопк1аШ Яещоп). 1дС1 и 1дС2 (Нишап Сопк1ап1 Яещоп) человека.

На фиг. 5 показаны последовательности гипервариабельных участков (СИЯк) легких (Ъ1дй1 сНат) и тяжелых (Неауу сНат) цепей некоторых антител к ФРГ. Для каждой последовательности указаны название антитела и идентификационный номер последовательности (8ЕО ΙΌ №). На фиг. 5А показаны аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (СИЯк) легкой цепи некоторых антител к ФРГ. На фиг. 5В показаны аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (СИЯк) тяжелой цепи некоторых антител к ФРГ.

На фиг. 6 показаны результаты определения К_с некоторых антител к ФРГ. рассмотренные в примере 8. На фиг. 6А показаны данные кинетического способа. На фиг. 6В показаны данные из способа равновесного раствора.

На фиг. 7 показаны авторадиограммы от вестерн-блотов. рассмотренные в примере 8. тестирующих способность некоторых антител связываться с ФРГ человека и с ФРГ мыши. Полоски слева (линии 1-4) показывают авторадиограммы из экспериментов. выполненных при нередуцирующих условиях. Полоски справа (линии 5-8) показывают авторадиограммы из экспериментов. выполненных при редуцирующих условиях.

На фиг. 8 показаны данные флуоресцентного активированного сортировщика клеток (ЕАС8). рассмотренные в примере 8. оценивающие связывание некоторых антител с определенными мишенями. Верхняя часть фиг. 8 показывает данные ЕАС8 из контрольных образцов. в которых отсутствовали специфические связывающие агенты. Полоски 1 и 2 (слева) показывают данные контрольных образцов. в которых отсутствуют мишени. инкубированные. соответственно. флуоресцинизотиоцианатом ФИТЦ (ЕГГС) и пентаэритритом (РЕ). Полоски 3 и 4 показывают данные из контрольных образцов. содержащих ФИТЦ и РЕ. промаркированные. соответственно. 65 ФРГ. но в которых отсутствует специфический связывающий агент. Полоски под жирной линией показывают данные флуоресцентного активированного сортировщика клеток (ЕАС8) из экспериментов с тестированием пяти антител к ФРГ. Для каждого антитела первая полоска слева показывает данные из контрольных образцов (соШго1) с отсутствующей мишенью. а полоски со второй по четвертую показывают данные из экспериментов. в которых мишенью были: ФРГ человека (НиНОЕ). ФРГ мыши (шиНОГ) и. соответственно. ФРГ 65 (НиНОЕ65) человека.

На фиг. 9А показана схема плазмида. кодирующего авидин. примыкающего к множественному сайту клонирования. использовавшемуся для генерации слитых белков. включающих авидин и белокмишень. как рассмотрено в примере 8. На фиг. 9В показана последовательность авидина цыпленка.

На фиг. 10А и 10В даны схематические представления некоторых слитых белков и результаты анализов связывания. рассмотренных в примерах 8С и 8И. с использованием данных слитых белков. На фиг. 10С показано схематическое представление некоторых слитых белков. имеющих точковую мутацию. вставки или делеции. На фиг. 10И представлены аминокислотные последовательности ФРГ человека (Нишап НОЕ) и мыши (шоике НОЕ) в области аминокислот 451-731 (последовательности №: 120 и 121 соответственно. (8ЕО ΙΌ №)). с указанием соответствующей согласованной (Сопкепкик) последовательности (последовательность №: 122).

На фиг. 11А и 11В показаны анализы НРЬС (жидкостной хроматографии высокого разрешения) экспериментов по защите протеазы на ФРГ человека. как рассмотрено в примере 8Е. На фиг. 11С показаны аминокислотные последовательности пептидов. защищенных от протеолитического переваривания путем связывания с антителом 2.12.1 в данной работе.

На фиг. 12А-12И показаны результаты конкурирующих связывающих анализов. рассмотренных в примере 8.

На фиг. 13 показаны данные 1С50 от нейтрализационных анализов. рассмотренных в примере 9.

На фиг. 14 показаны данные из нейтрализационных анализов в клетках РС3. рассмотренные в примере 10.

На фиг. 15 показаны данные из ингибирующих анализов в клетках И-87. рассмотренные в примере 10.

- 6 015363

На фиг. 16 показаны результаты экспериментов, рассмотренных в примере 11, оценивающие влияние некоторых антител к ФРГ на опухоли ксенотрансплантата ϋ-87 МС у мышей. На фиг. 16А показаны данные отклика дозы для антитела 2.4.4. на рост опухоли ксенотрансплантата ϋ-87 МС в модели минимальной остаточной болезни. На фиг. 16В показаны данные отклика дозы для антитела 2.4.4. на рост опухоли ксенотрансплантата ϋ-87 МС в модели установившейся болезни. На фиг. 16С, 16Ό, 16Е и 16Г показаны данные экспериментов тестирующих антитела к ФРГ в модели минимальной остаточной болезни и-87 (16С и 16Ό) или в модели установившейся болезни ϋ-87 (16Е и 16Г).

Детальное описание некоторых показательных примеров осуществления изобретения

Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее описание являются иллюстративными и поясняющими и не ограничивают заявленное изобретение. В данной заявке использование единственного числа включает множественное число, за исключением случаев, когда конкретно указано противоположное. В данной заявке использование или означает и/или, за исключением случаев, когда конкретно указано противоположное. Далее, использование термина включающий, а также других форм, таких как включает и включенный, не имеет ограничительного характера. Также, такие термины как элемент или компонент включают как элементы и компоненты, входящие в один блок, так и элементы и компоненты, включающие более одного подблока, за исключением случаев, когда конкретно указано противоположное. Также использование термина часть может включать часть элемента или весь элемент.

Используемые в данной заявке заглавия предназначены исключительно для организационной цели и не должны толковаться как ограничивающие описываемый предмет. Все документы или части документов, приводимые в данной заявке, включая патенты, патентные заявки, статьи, книги и академические трактаты, но не ограничиваясь ими, полностью включены в данную заявку путем ссылки для любой цели.

Определения

Стандартные методики могут использоваться для рекомбинантной ДНК; синтеза олигонуклеотидов и культуры и трансформации тканей (например, электрошоковое открытие клеточных пор (электропорация), липофекция). Ферментные реакции и методики очистки могут выполняться в соответствии со спецификациями производителя или как это обычно используется в данной области или описывается в данной заявке. Вышеупомянутые методики и процедуры, в общем, могут выполняться в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более специфических ссылках, которые приводятся и рассматриваются по всему описанию настоящей заявки. См., например, Сембрук и др. (8ашЬтоок с1 а1.), Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (2-е изд., Колд Спринг Харбор Лаборитори Пресс, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк (1989)), (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (2'¹ еб., Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ртезз, Со1б 8рпп§ НагЬог, Ν.Υ. (1989)), включенное в данную заявку в качестве ссылки для любых целей. За исключением случаев, когда даны конкретные определения, лабораторные процедуры и методики аналитической химии, синтетической органической химии и медико-фармацевтической химии и номенклатуры, используемые в связи с ними, описанные в данной заявке, хорошо известны и обычно используются в данной отрасли. Стандартные методики могут использоваться для химического синтеза, химических анализов, приготовления фармацевтических препаратов, составления и доставки составов и лечения пациентов.

При использовании в соответствии с настоящим раскрытием сущности изобретения следующие термины, за исключением по иному указанных случаев, будут иметь следующее значение.

Термин фактор роста гепатоцита или ФРГ относится к полипептиду, описанному Накамура и др. (Аакаишга е1 а1.), Природа (№Ш.1ге). 342:440-443 (1989) или к его фрагментам, а также связанным полипептидам, которые включают аллельные варианты, сплайсовые варианты, производные варианты, замещающие варианты, делеционные варианты и/или инсерционные варианты, слитые полипептиды и межвидовые гомологи, но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид ФРГ включает концевые остатки, такие как остатки последовательности лидера, остатки при конъюгировании лекарственного препарата с антителом, обеспечивающим направленную доставку препарата к ткани или органу-мишени, аминоконцевые остатки метионина, остатки лизина, остатки метки и/или остатки слитого белка, но не ограничиваются ими.

Термин специфический связывающий агент относится к природной или не природной молекуле, которая специфически связывается с мишенью. Примеры специфических связывающих агентов включают белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, карбогидраты, липиды и небольшие молекулярные соединения, но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент является антителом. В некоторых примерах осуществления изобретения специфически связывающий агент является областью связывания антигена.

Термин специфический связывающий агент с ФРГ относится к специфическому связывающему агенту, специфически связывающему любую часть ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ является антителом к ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент является областью связывания антигена.

Термин поликлональное антитело относится к гетерогенной смеси антител, связывающихся с раз

- 7 015363 личными эпитопами того же антигена.

Термин моноклональные антитела относится к коллекции антител, закодированных той же молекулой нуклеиновой кислоты. В некоторых примерах осуществления изобретения моноклональные антитела производятся отдельной гибридомой, или другой клеточной линией, или трансгенным млекопитающим. Моноклональные антитела обычно распознают тот же эпитоп. Термин моноклональный не ограничивается каким-либо определенным способом производства антитела.

Термин химерное антитело относится к антителу, в котором часть антитела является гомологичной к последовательности определенных видов или определенных классов антител, в то время как другая часть антитела является гомологичной к последовательности различных видов или классов антитела. См., например, патент США № 4816567 и Моррисон и др. (Μοτηκοη с1 а1.), Труды академии естественных наук (Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ) США, 81:6851-6855 (1985).

Термин антитело с трансплантированным гипервариабельным участком (СЭЯ) относится к антителу, в котором СЭЯ от одного антитела вставлено в каркас другого антитела. В некоторых примерах осуществления изобретения антитело, из которого получено СЭЯ и антитело, из которого производится каркас, происходят от различных видов. В некоторых примерах осуществления изобретения антитело, из которого выводится СЭЯ и антитело, из которого производится каркас, происходят от различных изотипов.

Термин мультиспецифическое антитело относится к антителу, в котором две или более вариабельных областей связываются с различными эпитопами. Эпитопы могут быть на одной и той же или на различных мишенях. В некоторых примерах осуществления изобретения мультиспецифическое антитело является двуспецифическим антителом, распознающим два различных эпитопа на одном и том же или на различных антигенах.

Термин каталитическое антитело относится к антителу, к которому присоединяются одна или более каталитических составляющих. В некоторых примерах осуществления изобретения каталитическое антитело является цитотоксическим антителом, включающим цитотоксическую составляющую.

Термин гуманизированное антитело относится к антителу, в котором вся или часть каркасной области антитела получена от человека, но все или часть одного или более участков СЭЯ получены от других видов, например от мыши.

Термин полностью человеческое антитело относится к антителу, в котором как СЭЯ, так и каркас включают в основном человеческие последовательности. В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела производятся в млекопитающих, не являющихся человеком, включая мышей, крыс и зайцеобразных, но не ограничиваясь ими. В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела производятся в гибридомных клетках. В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела производятся рекомбинантно.

Термин антиидиотипное антитело относится к антителу, которое специфически связывается с другим антителом.

Термин специфически связывает относится к способности специфического связывающего агента связываться с мишенью с большим аффинитетом, чем при связывании с не мишенью. В некоторых примерах осуществления изобретения специфическое связывание относится к связыванию для мишени с аффинитетом, по крайней мере в 10, 50, 100, 250, 500 или 1000 раз превышающим аффинитет к не мишени. В некоторых примерах осуществления изобретения аффинитет определяется твердофазным иммуноферментным анализом аффинитета (ЕЫ8А). В некоторых примерах осуществления изобретения аффинитет определяется анализом последствий В1Асоге. В некоторых примерах осуществления изобретения аффинитет определяется кинетическим способом. В некоторых примерах осуществления изобретения аффинитет определяется способом равновесного раствора.

Термин эпитоп относится к части молекулы, способной связываться специфическим связывающим агентом. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп обычно включает химически активные поверхностные группировки молекул, такие как, например, боковые цепи аминокислот или карбогидратов, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитопы могут быть смежными или несмежными. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитопы могут быть мимикрическими потому, что они включают трехмерную структуру, которая подобна эпитопу, используемому для генерации антитела, но, тем не менее, они совсем не содержат или содержат только некоторые остатки аминокислот, обнаруживаемых в том эпитопе, который использовался для генерации антитела.

Термин ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп относится к эпитопу, который, будучи связанным специфическим связывающим агентом, приводит к снижению биологической активности ίη νίνο, ίη νίΐτο и/или ίη ίάιι. В некоторых примерах осуществления изобретения нейтрализующий эпитоп расположен на или связан с биологически активной областью мишени.

Термин активирующий эпитоп относится к эпитопу, который, будучи связанным специфическим связывающим агентом, вызывает активацию или поддержание биологической активности ίη νίνο, ίη νίίτο и/или ίη δίΐιι. В некоторых примерах осуществления изобретения активирующий эпитоп расположен на или связан с биологически активной областью мишени.

- 8 015363

Термин изолированный полинуклеотид при использовании в данной заявке означает полинуклеотид геномной комплементарной ДНК (кДНК) или синтетического происхождения или их некоторую комбинацию, который в силу своего происхождения как изолированного полинуклеотида (1) не связан со всей или частью полинуклеотида, в которой изолированный полинуклеотид находится в природе, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе как часть более крупной последовательности.

Термин выделенный белок, упомянутый в данной заявке, означает белок, кодируемый кДНК, рекомбинантной РНК или имеющий синтетическое происхождение или их некоторую комбинацию, который (1) свободен, по крайней мере, от некоторых белков, с которыми он обычно обнаруживается, (2) и практически свободен от других белков из того же источника, например от тех же видов, (3) экспрессируется клеткой от различных видов или (4) не встречается в природе.

Термин полипептид используется в данной заявке в качестве родового термина по отношению к природным белкам или модификациям подобных белков, имеющих делеции, добавления и/или замещения одной или более аминокислот природной последовательности. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид имеет делеции, добавления и/или замещения по крайней мере одной, но не более чем 50, 30, 20, 15, 10, 8, 5 или 3 аминокислот природной последовательности.

Термин встречающийся в природе при использовании в данной заявке в применении к объекту относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептид или полинуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирусы), которые могут быть выделены из некоторого источника в природе и которые намеренно не модифицировались человеком в лаборатории или по иному, являются встречающимися в природе.

Термин функционально связанный при использовании в данной заявке относится к компонентам, которые имеют связь, позволяющую им функционировать предназначенным образом. Например, контрольная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Термин контрольная последовательность при использовании в данной заявке относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут производить экспрессию и обработку кодирующих последовательностей, с которой они лигируются. Природа подобных контрольных последовательностей может различаться в зависимости от организма хозяина. В соответствии с некоторыми примерами осуществлении изобретения контрольные последовательности для прокариотов могут включать промотор, области связывания рибосом и последовательность завершения транскрипции. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения контрольные последовательности для эукариотов могут включать промоторы, один или более генов-усилителей (энхансеров) и последовательность завершения транскрипции. В некоторых примерах осуществления изобретения контрольные последовательности могут включать последовательности лидера и/последовательности слитого партнера.

Термин полинуклеотид при использовании в данной заявке означает полимерную форму нуклеотидов, имеющих длину по крайней мере 10 оснований. В некоторых примерах осуществления данного изобретения основания могут быть рибонуклеотидами или деоксирибонуклеотидами или модифицированной формой любого типа нуклеотидов. Термин включает однонитевые и двухнитевые формы ДНК.

Термин олигонуклеотид, используемый в данной заявке, включает встречающиеся в природе и модифицированные нуклеотиды, соединенные вместе встречающимися в природе и/или не встречающимися в природе связками олигонуклеотидов.

Олигонуклеотиды являются подгруппой полинуклеотидов, обычно включающей длину в 200 или менее оснований. В некоторых примерах осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 60 оснований. В некоторых примерах осуществления изобретения олигонуклеотиды имеют длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 оснований. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двухнитиевыми, например, при использовании для конструирования мутанта гена. Олигонуклеотиды могут быть сенсорными или антисенсорными олигонуклеотидами.

Термин встречающиеся в природе нуклеотиды включает диоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобное. Термин олигонуклеотидные связи включает такие олигонуклеотидные связи как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфороаниладат, фосфороамидат и тому подобное. См., например, Ла Планш и др. (ЪаР1апе11с е! а1.), Остатки нуклеиновых кислот (Νιιοί. Ас1бк. Век.), 14:9081 (1986); Стек и др. (81ес е! а1.), Журнал американского химического общества (1. Ат. СНет. 8ос.), 106:6077 (1984); Штейн и др. (81ет е! а1.), Остатки нуклеиновых кислот (№е1. А1бк. Век.), 16:3209 (1988); Зон и др. (Ζοη е! а1.), Создание противораковых лекарственных средств (Αηίί-Сапеет Эгид Оек1дп), 6:539 (1991); Зон и др. (Ζοη е! а1.), Олигонуклеотиды и аналоги: практический подход (О11допис1еоббек апб Апа1одиек: А Ртасбса1 АрргоасН), с. 87-108, издание Ф. Экштейн, Окфсорд Юниверсити Пресс, Оксфорд, Англия (Е. Ескк1ет. Еб., ОхГогб ишуеткйу Ргекк, ОхГогб Епд1апб (1991)); Стек и др. (81ес е! а1.), патент США № 5151510; Улманн и Пейман Кемикал Ревьюз (ИЫтапп апб Реутап Сйет1са1 Веу1е^к), 90:543 (1990), раскрытие сущности кото

- 9 015363 рых включено в данную заявку путем ссылки для любой цели. В некоторых примерах осуществления изобретения олигонуклеотид может включать метку для детектирования.

Идентичность и сходство связанных полипептидов могут быть легко рассчитаны известными способами. Эти способы включают те, которые описаны в Вычислительной молекулярной биологии (Сотри1айопа1 Мо1еси1аг Вю1оду). Леск А.М. (Ьекк. А.М.). издание Оксфорд Юниверсити Пресс, Нью-Йорк (1988); Биорасчеты: Информатика и геномные проекты (ВюсотриНпд: 1иГогтабск апб Оепоте Рго)ес!к). Смит Д.В. (διηίΐΐι. Ό.\ν.). издание Академик Пресс, (Асабетю Ргекк). Нью-Йорк (1993); Компьютерный анализ данных последовательностей. ч. 1 (Сотри1ет Апа1ук1к о! Бесщепсе Эа!а. Рай 1). Гриффин А.М. и Гриффин Х.Г. (ОпГГш. А.М.. апб ОпГГш. Н.О.). издание Хумана Пресс. (Нитапа Ргекк). Нью-Джерси (1994); Анализ последовательностей в молекулярной биологии (Бедиепсе Апа1уДк ш Мо1еси1аг Вю1оду). фон Хайндже Г. (уоп Ненце. О.). Академик Пресс (Асабепис Ргекк) (1987); Учебник для начинающих по анализу последовательностей (Бециепсе Апа1уДк Рптет). Грибсков М. и Деверо Дж. (ОпЬккоу. М. апб Эеуегеих. 1.). издание М. Б1оск1оп Ргекк. Нью-Йорк (1991); Карильо и др. (СатШо е! а1.). Журнал прикладной математики СИАМ (Б1АМ 1. АррПеб Ма1й.). 48:1073 (1988). но не ограничиваются ими.

Некоторые способы определения идентичности предназначены для получения наибольшего согласования между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Способы компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают. без ограничения. пакет программ компьютерной группы по генетике (ОСО). включая алгоритм программ по генетике (ОАР) (Деверо и др. (Эеуегеих е! а1.). Остатки нуклеиновых кислот (Ыиск Ас1б. Кек.). 12:387 (1984); Компьютерная группа по генетике (Оепебск Сотри!ег Огоир). Висконсин. Мэдисон. VI. ВЬАБТР. ВЬАЭТХ апб ГАБТА (Алтшул и др. (А1!ксйи1 е! а1.). Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.). 215:403-410 (1990)). Программу ВЬАБТХ можно получить в Национальном Центре Биотехнологической Информации (ИСВ1) и других источниках (ВЬАБТ Мапиа1. Алтшул и др. (А11ксйи1 е! а1.). ХСВ/ЖМ/МН Бетесда. Мэрилэнд 20894; Алтшул и др. (А11ксйи1 е! а1.). там же (1990)). Хорошо известный алгоритм Смита Вотермена может также использоваться для определения идентичности.

Некоторые схемы сравнительного анализа первичной структуры для сравнения первичной структуры двух аминокислотных последовательностей могут привести к совпадению только короткой области двух последовательностей. и эта маленькая согласованная область может иметь очень высокую идентичность последовательности. даже несмотря на то. что нет значительной связи между двумя полномерными последовательностями. Соответственно. в некоторых примерах осуществления изобретения выбранные способы сравнения первичной структуры (программа ОАР) приведут к сравнению первичных структур. которое охватывает по крайней мере 50 смежных аминокислот полипептида мишени.

Например. используя компьютерный алгоритм ОАР. (Компьютерная группа по генетике (Оепейск Сотри!ег Огоир). Университет Висконсина. Мэдисон. Висконсин). два полипептида. для которых должен быть определен процент идентичности последовательности. сравниваются для оптимального согласования их соответствующих аминокислот (согласованный охват. как определяется алгоритмом). В некоторых примерах осуществления изобретения сокращение отверстия бреши (которое вычисляется как 3Х средней диагонали; средняя диагональ является средней диагональю используемой матрицы сравнения; диагональ - это счет или номер. приписываемый каждому превосходному согласованию аминокислоты определенной матрицей сравнения) и сокращение расширения бреши (которое обычно составляет 1/10 раз от сокращения отверстия бреши). а также матрица сравнения. подобная РАМ 250 или ВЬОБИМ 62. используются вместе с алгоритмом. В некоторых примерах осуществления изобретения алгоритм также использует стандартную матрицу сравнения (см. Дейхофф и др. (ЭауБоГГ е! а1.). Атлас белковых последовательностей и структуры (Абак оГ Рго1еш Бесщепсе апб БйисШте). 5(3) (1978) для матрицы сравнения РАМ 250; Хейнкофф и др. (НешкоГГ е! а1.). Труды академии естественных наук (Ргос. №!1. Асаб. Бс1). США. 89:10915-10919 (1992) для матрицы сравнения ВЬОБИМ 62).

В некоторых примерах осуществления изобретения параметры для сравнения последовательности полипептида включают следующие;

алгоритм: Нидлмен и др. (Иееб1етап е! а1.). Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.). 48-443453 (1970);

матрица сравнения: ВЬОБИМ 62 из Хейнкофф и др. (НешкоГГ е! а1.). там же (1992);

сокращение бреши: 12;

сокращение длины бреши: 4;

порог сходства: 0.

Программа ОАР может быть полезна с вышеупомянутыми параметрами. В некоторых примерах осуществления изобретения вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения полипептидов (вместе с отсутствием сокращения для концевых брешей). при использовании алгоритма ОАР.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает тяжелую цепь. включающую вариабельную область. включающую аминокислотную последовательность. по крайней мере на 90% идентичную последовательности аминокислот. выбранной из последовательно

- 10 015363 стей №: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает тяжелую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, по крайней мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает тяжелую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, по крайней мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает легкую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 и 42. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает легкую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, по крайней мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 и 42. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент включает легкую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, по крайней мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 и 42.

При использовании в данной заявке двадцать обычных аминокислот и их сокращения соответствуют обычному использованию. См. Иммунология - Синтез (2-е изд.), Е.С. Голуб и Д.Р. Грен (Е.8. Со1иЬ и Ό.Κ.. Степ), издание 8шаиег ΛδδοοίαΙοδ. Сандерленд, Массачусетс (1991), включенную в данную заявку путем ссылки для любой цели. Стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, подобные α-, α-дизамещенным аминокислотам, Ν-алкильные аминокислоты, молочная кислота и другие неординарные аминокислоты могут также быть приемлемыми компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры неординарных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглютамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В используемом здесь обозначении аминокислот левостороннее направление является аминоконцевым направлением и правостороннее направление является карбоксиконцевым направлением в соответствии со стандартным использованием и употреблением.

Подобным же образом, за исключением по иному определенных случаев, левосторонний конец однонитевых полинуклеотидных последовательностей является концом 5'; левостороннее направление двухнитевых полинуклеотидных последовательностей называется направлением 5'. Направление с 5' по 3' добавления зарождающихся транскриптов РНК называется направлением транскриптов; области последовательности на нити ДНК, имеющие ту же последовательность, что и РНК, и расположенные с 5' по 5' конец транскрипта РНК, называются обратной последовательностью; области последовательности на нити ДНК, имеющие ту же последовательность, что и РНК и расположенные с 3' по 3' конец транскрипта ДНК, называются прямыми последовательностями.

Консервативные замещения аминокислот могут включать не встречающиеся в природе остатки аминокислот, обычно включенные химическим синтезом пептидов, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсированные или инвертированные формы элементов аминокислот.

Естественно, встречающиеся остатки могут быть разделены на классы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:

1) гидрофобные: норлейцин, Мек А1а, Уа1, Ьеи, 11е;

2) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ет, Тйг, Акп, С1п;

3) кислотные: Акр, С1и;

4) базовые: Ηίκ, Ьук, Агд;

5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: С1у, Рго; и

6) ароматические: Тгр, Туг, Рйе.

Например, неконсервативные замещения могут включать обмен члена одного из этих классов на член другого класса. Подобные замещенные остатки могут быть введены в области антитела человека, являющиеся гомологичным с нечеловеческими антителами, или в негомологичные области молекулы.

При производстве подобных изменений в соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения может быть рассмотрен гидротерапевтический показатель аминокислот. Каждой аминокислоте приписывается гидротерапевтический показатель на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Это изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глютамат (-3,5); глютамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин

- 11 015363 (-3,9) и аргинин (-4,5).

Важность гидротерапевтического показателя аминокислоты при наделении белка интерактивной биологической функцией известна в данной области, Кайт и др. (Ку1е с1 а1.), Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Βίο1.), 157:105-131 (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими сходный гидротерапевтический индекс или показатель, и все равно сохранять сходную биологическую активность. В некоторых примерах осуществления изобретения включено замещение аминокислот, гидротерапевтические показатели которых находятся в пределах +/-2, путем осуществления изменений на базе гидротерапевтического показателя. В некоторых примерах осуществления изобретения включаются замещения в пределах +/-1 и в некоторых примерах осуществления изобретения включаются замещения в пределах +/-0,5.

В данной области также известно, что замещение подобных аминокислот может эффективно производиться на основании гидрофильности, особенно там, где биологически функциональный белок или пептид, созданный подобным образом, предполагается для использования в иммунологических применениях, как и в настоящем случае. В некоторых примерах осуществления изобретения наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, регулируемая гидрофильностью смежных аминокислот, корелируется с иммуногенетичностью и антигенетичностью, т.е. с биологическим свойством белка.

Следующие значения гидрофильности были предписаны этим остаткам аминокислот: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 +/-1); глютамат (+3,0 +/-1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глютамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 +/-1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При производстве изменений, основываясь на сходных значениях гидрофильности, в некоторых примерах осуществления изобретения включено замещение аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах +/-2 и в некоторых примерах осуществления изобретения включены значения, находящиеся в пределах +/-0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Эти области называются эпитопными сердцевинными областями.

Показательные замещения аминокислот показаны в таблице.

Замещения аминокислот

Исходные остатки	Показательные замещения	Предпочтительные замещения
А1а	Уа1, Ьеи, Пе	Уа1
Аг§	Ьуз, О1п, Азл	Ьуз
Азп	О1п	О1п
Азр	О1и	О1и
Суз	Зег, А1а	Зег
О1п	Азп	Азп
О1и	Азр	Азр
П1у	Рго, А1а	А1а
Н18	Азп, С1п, Ьуз, Агд	Агд
Не	Ьеи, Уа1, МеГ, А1а, РЬе, норлейцин (Иойеисше)	Ьеи
Ьеи	Норлейцин (Ыог1еисше), Пе Уа1, МеГ, А1а, РЬе	Пе
Ьуз	Агд, 1,4 диамино-масляная кислота (ΏϊαητίηοВиГупс Αΰΐά), <3111, Азп	Агд
Ме!	Ьеи, РЬе, Пе	Ьеи
РЬе	Ьеи, Уа1,11е, А1а, Туг	Ьеи
Рго	А1а	О1у
Зег	ТЬг, А1а, Суз	ТЬг
ТЬг	Зег	Зег
Тгр	Туг, РЬе	Туг
Туг	Тгр, РЬе, ТЬг, Зег	РЬе
\''а!	Пе, Мег, Ьеи, РЬе А1а, норлейцин (Мигкистпе)	Ьеи

- 12 015363

Опытный специалист сможет определить варианты показанных здесь полипептидов, используя известные методики. В некоторых примерах осуществления изобретения специалист в данной области может определить приемлемые области молекулы, которые могут быть заменены без нарушения активности путем конъюгирования областей мишени, считающихся не имеющими значения для активности. В некоторых примерах осуществления изобретения можно идентифицировать остатки и части молекулы, которые сохраняются среди подобных полипептидов. В некоторых примерах осуществления изобретения даже области, которые могут быть важными для биологической активности или для структуры, могут подвергаться консервативным замещениям аминокислот без нарушения биологической активности или без неблагоприятного воздействия на структуру полипептида.

В дополнении к этому, специалист в данной области может рассмотреть структурально функциональные исследования идентификации остатков в подобных полипептидах, имеющих значение для активности или структуры. С учетом подобного сравнения можно предсказать важность остатков аминокислот в белке, соответствующих остаткам аминокислот, имеющим значение для активности или структуры в сходных белках. Специалист в данной области может выбрать химически подобные замещения аминокислот для прогнозирования подобных важных остатков аминокислот.

Специалист в данной области может также проанализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в сопоставлении с данной структурой в сходных полипептидах. С учетом подобной информации специалист в данной области может прогнозировать выстраивание остатков аминокислот антитела по отношению к его трехмерной структуре. В некоторых примерах осуществления изобретения специалист в данной области может решить не производить радикальных изменений в остатках аминокислот, прогнозируемых на поверхности белка, так как подобные остатки могут участвовать в важных взаимосвязях с другими молекулами. Более того, специалист в данной области может сгенерировать тестовые варианты, содержащие отдельное замещение аминокислоты в каждом желаемом остатке аминокислоты. Варианты затем могут быть отсеяны с использованием анализов активности, известных специалистам в данной области. Подобные варианты могли бы использоваться для сбора информации о приемлемых вариантах. Например, если было обнаружено, что изменение определенного остатка аминокислоты приводило к нарушенной, нежелательно сниженной или неустойчивой активности, можно было бы избегать вариантов с подобным изменением. Другими словами, основываясь на информации, собранной от подобных рутинных экспериментов, специалисты в данной области могут с готовностью определить аминокислоты, в которых следует избегать дальнейших замен, либо по отдельности, либо в комбинации с другими мутациями.

Ряд научных публикаций был посвящен прогнозированию вторичной структуры. См. Моулт Дж., (Мои1! 1.), Программная работа по биотехнологии (Сигг. Ор. ίη Вю!есй.), 7(4):422-427 (1996), Чоу и др. (Сйои е! а1.), Биохимия (Вюсйетщйу), 13(2):222-245 (1974); Чоу и др. (Сйои е! а1.), Биохимия (Вюсйетщйу), 113(2):211-222 (1974); Чоу и др. (Сйои е! а1.), Современная энзимология. Связанные области молекулярной биологии (Λάν. Епхуто1. Ве1а!. Лгеа Мо1. Вю1.), 47:45-148 (1978); Чоу и др. (Сйои е! а1.), Годовой обзор по биохимии (Апп. Вег. Вюсйет.), 47:251- 276 и Чоу и др. (Сйои е! а1.), Журнал биофизики (Вюрйук. 1.), 26:367-384 (1979). Более того, в настоящее время имеются компьютерные программы, оказывающие помощь в прогнозировании вторичной структуры. Один способ прогнозирования вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, имеющие идентичность последовательности более 30% или сходство более 40%, часто имеют сходные структуральные топологии. Недавний рост базы данных структуры белка (РОВ) обеспечил увеличение прогнозируемости вторичной структуры, включая потенциальное число складок внутри структуры полипептида или белка. См. Холм и др. (Но1т е! а1.), Остатки нуклеиновых кислот (№с1. Ас1б. Век.), 279(1):244-247 (1999). Было предположено (Бреннер и др. (Вгеппег е! а1.), Текущие проблемы структуральной биологии (Сигг. Ор. 8йис. Вю1.), 7(3):369-376 (1997)), что в данном полипептиде или белке имеется ограниченное количество складок и что как только было бы разрешено критическое число структур, структуральное прогнозирование стало бы значительно более аккуратным.

Дополнительные способы прогнозирования вторичной структуры включают продевание (Джоунз Д.) (1опек, Ό.), Текущие проблемы структуральной биологии (Сигг. Орш. 8йис!. Вю1.), 7(3):377-87 (1997); Сипл и др. (81рр1 е! а1.), Структура (8йис!иге), 4(1): 15-19 (1996)), профильный анализ (Боуи и др.) (Во\\зе е! а1.), Наука (8аепсе), 253:164-170 (1991); Грибсков и др. (Οηϋκ^ν е! а1.), Ме!й. Епхут., 183:146159 (1990); Грибсков и др. (СпЬккоу е! а1.), Труды академии естественных наук (Ргос. №11. Асаб. 8сь), 84(13): 4355-4358 (1987)) и эволюционное связывание (см. Холм (Но1т), там же (кирга) и Бреннер (Вгеппег), там же (кирга) (1997)).

В некоторых примерах осуществления изобретения варианты специфического связывающего агента включают гликозилированные варианты, в которых число и/или тип участков гликозилирования было изменено по сравнению с аминокислотными последовательностями полипептида родителя. В некоторых примерах осуществления изобретения варианты белка включают большее или меньшее число Ν-связанных участков гликозилирования, чем у нативного белка. Ν-связанный участок гликозилирования характеризуется последовательностью: Акп-Х-8ет или Акп-Х-Тйг, где остаток аминокислоты, обозначенный как X, может быть любым остатком аминокислоты, кроме пролина. Замещение остатков ами

- 13 015363 нокислот для создания этой последовательности обеспечивает потенциально новый участок для добавления Ν-связанной цепи карбогидратов. Альтернативно, замещения, которые устраняют эту последовательность, удалят существующую Ν-связанную цепь карбогидратов. Также предусмотрена реорганизация Ν-связанных цепей карбогидратов, в которых один или более участков гликозилирования (обычно встречающихся в природе) удаляются и создаются один или более новых Ν-связанных участков. Дополнительные предпочтительные варианты антитела включают цистеиновые варианты, в которых один или более остатков цистеина удаляются или замещаются другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с аминокислотной последовательностью родителя. Варианты цистеина могут быть полезны, когда антитела должны быть повторно сложены в биологически активную конформацию, подобную существующей после изоляции нерастворимых тел включения. Варианты цистеина обычно имеют меньше цистеиновых остатков, чем нативный белок, и обычно имеют четное число для минимизации взаимодействий, происходящих от непарных цистеинов.

В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения замещения аминокислот - это такие замещения, которые (1) снижают подверженность протеолизу, (2) снижают подверженность окислению, (3) изменяют связывающее сродство для формирования протеиновых комплексов, (4) изменяют связывающие сродства и/или (4) обеспечивают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства на подобных полипептидах. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения отдельные или множественные замещения аминокислот (в некоторых примерах осуществления изобретения консервативные замещения аминокислот) могут выполняться во встречающейся в природе последовательности (в некоторых примерах осуществления изобретения в части полипептида за переделами домена(-ов), формирующего межмолекулярные контакты). В некоторых примерах осуществления изобретения консервативное замещение аминокислот обычно не может значительно изменить структурные характеристики родительской последовательности (например, замена аминокислоты не должна иметь тенденцию ломать спираль, встречающуюся в родительской последовательности или нарушать другие типы вторичной структуры, характеризующие родительскую последовательность). Примеры признанных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в работе Протеины, структуры и молекулярные принципы (РгсЛсиъ. 81гис1игс5 апб Мо1еси1аг ΡΓίηοίρΙοκ), издательство Крейтон (Сге1дЙоп, Еб.), В.Х. Фриман и компания (ν.Η. Ртеешап апб Сотрапу), Нью-Йорк (1984); Введение в структуру белка (1п1гобис1юп 1о Рго1еш §1тис1иге), К. Бранден и Дж. Туз (С. Вгапбеп апб 1. Тоохе), издание Гарланд Паблишинг (Сат1апб РиЫщЫпд), Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1991) и Торнтон и др. (ТйогЩоп е1 а1.), Природа 354:105 (1991), которые включены в данный материал путем ссылки.

Термин производная относится к молекуле, включающей химическую модификацию, отличную от вставки, делеции или замещения аминокислот. В некоторых примерах осуществления изобретения производные включают ковалентные модификации, включая химическое связывание с полимерами, липидами и другими органическими или неорганическими частицами, но не ограничиваясь данным. В некоторых примерах осуществления изобретения химически модифицированный специфический связывающий агент может иметь больший циркулирующий период полураспада, чем специфический связывающий агент, не подвергавшийся химической модификации. В некоторых примерах осуществления изобретения химически модифицированный специфический связывающий агент может иметь улучшенную емкость мишени для желаемых клеток, тканей и/или органов. В некоторых примерах осуществления изобретения производный специфический связывающий агент ковалентно модифицирован и включает одну или более растворимых в воде полимерных приставок, включая полиметиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, но не ограничиваясь ими. См., например, патенты США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. В некоторых примерах осуществления изобретения производный специфический связывающий агент включает один или более полимер, включая монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры с основой на карбогидратах, поли-(№винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, пропиленоксидный/этиленоксидный сополимер, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол) и поливиниловый спирт, но не ограничиваясь ими, а также смеси подобных полимеров.

В некоторых примерах осуществления изобретения производный ковалентно модифицирован с подблоками полиэтиленгликоля (РЕС). В некоторых примерах осуществления изобретения один или более растворимых в воде полимеров прикреплен к одной или более специфических позиций, например, у аминоконца продукта замещения (производного). В некоторых примерах осуществления изобретения один или более растворимых в воде полимеров произвольно присоединен к одной или более стороне цепи производного. В некоторых примерах осуществления изобретения РЕС используется для улучшения терапевтической способности специфического связывающего агента. В некоторых примерах осуществления изобретения РЕС используется для улучшения терапевтической способности гуманизированного антитела. Некоторые подобные способы рассмотрены, например, в патенте США № 6133426, включенном в данный материал путем ссылки для любой цели.

Термин фрагмент полипептида при использовании в данной заявке означает полипептид, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию. В некоторых примерах осуществления изобре

- 14 015363 тения фрагменты имеют длину по крайней мере от 5 до 478 аминокислот. Будет понятно, что в некоторых примерах осуществления изобретения фрагменты имеют длину по крайней мере 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот.

Аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической промышленности как непептидные лекарства со свойствами, аналогичными свойствам матричному пептиду. Эти типы непептидных соединений называются пептидными миметиками или пептидомиметиками. Фаучер (Раисйете), Журнал современных лекарственных средств (1. Α6ν. Эгид. Ке8.), 15:29 (1986); Вебер и Фрейдингер (УеЬег апб Бте1бшдег), ΤΙΝ8 с. 392 (1985) и Эванс и др. (Εναηδ е1 а1.), Журнал медицинской химии (1. Меб. Сйет.) 30:1229 (1987), включенные в данную заявку путем ссылки для любых целей. Подобные соединения часто разрабатываются с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, структурально подобные терапевтически полезным пептидам, могут использоваться для производства подобного же терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики структурально подобны парадигмальному полипептиду (т.е. полипептиду, который имеет биохимические свойства или фармацевтическую активность), подобному антителу человека, но имеют одну или более пептидных связей, по возможности замещенные связью, выбранной из --ΟΗ₂ΝΗ--, --СН₂8--, --СН₂СН₂--, --СН=СН- (цис и транс), --СОСН₂--, --СН(ОН)СН₂-- и --СН₂8О-, способами, хорошо известными в данной области. Систематическое замещение одной или более аминокислот согласованной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизина) может использоваться в некоторых примерах осуществления изобретения для генерации более стабильных пептидов. В дополнении к этому могут быть сгенерированы ограниченные пептиды, содержащие согласованную последовательность или практически идентичный вариант согласованной последовательности, способами, известными в данной области (Ризо и Гиераш) (Ρίζο апб 61ета8сй), Ежегодный обзор по биохимии (Αηη. Рет. Вюсйет.), 61:387 (1992), включенный в данную заявку путем ссылки для любой цели; например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, циклизирующие пептид.

Термины антитело или пептид(-ы) антитела относятся к неповрежденному антителу или его связывающему фрагменту, конкурирующему с неповрежденным антителом за специфическое связывание. В некоторых примерах осуществления изобретения связывающие фрагменты производятся методиками рекомбинантной ДНК. В некоторых примерах осуществления изобретения связывающие фрагменты производятся ферментным или химическим дроблением неповрежденных антител. Связывающие фрагменты включают, без ограничения, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ'), Ρν и одноцепьевые антитела.

Термин тяжелая цепь включает любой полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области, чтобы придать специфичность мишени. Термин легкая цепь включает любой полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области, чтобы придать специфичность мишени. Тяжелая цепь полной длины включает домен вариабельной области, У_Н и три домена постоянной области, С_Н1, С_Н2, и С_Н3. Домен У_Н представляет собой аминоконец полипептида и домен С_Н3 представляет собой карбоксильный конец. Термин тяжелая цепь при использовании в данной заявке включает тяжелую цепь полной длины и ее фрагменты. Легкая цепь полной длины включает вариабельную область, У_ъ и домен постоянной области Сь. Подобно тяжелой цепи домен вариабельной области легкой цепи является аминоконцом полипептида. Термин легкая цепь при использовании в данной заявке включает легкую цепь полной дины и ее фрагменты. Фрагмент РаЬ состоит из одной легкой цепи и С_Н1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы РаЬ не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент РаЬ' включает одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, включающую большую часть постоянной области, между доменами СН1 и СН2, так что может быть образована межцепочечная дисульфидная связь между двумя тяжелыми цепями для образования молекулы Р(аЬ')2. Область Ρν включает вариабельные области как тяжелой, так и легкой цепей, но в ней отсутствуют постоянные области. Одноцепочечные антитела - это молекулы Ρν, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи были соединены гибким соединителем для образования отдельной цепи полипептида, формирующего область связывания антигена. Антитела с отдельной цепью детально рассматриваются, например, в \УО 88/01649 и патентах США №№ 4946778 и 5260203.

Термин вариабельная область или вариабельный домен относится к части легкой и/или тяжелых цепей антитела, обычно включающей приблизительно аминоконец из 120 по 130 аминокислот в тяжелой цепи и от около 100 по 110 аминокислот аминоконца в легкой цепи. В некоторых примерах осуществления изобретения вариабельные области различных антител сильно различаются в аминокислотной последовательности, даже среди антител одного и того же вида. Вариабельная область антитела обычно определяет специфичность определенного антитела к его мишени.

Термин иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина относится к фрагменту полипептида, включающему, по крайней мере, вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина и легкой цепи иммуноглобулина. В некоторых примерах осуществления изобретения иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина способен связывать лиганд, предотвращая связывание лиганда с его рецептором, и тем самым, прерывая биологический отклик, получаемый в результате связывания лиганда с рецептором. В некоторых примерах осуществления изобретения иммунологически

- 15 015363 функциональный фрагмент иммуноглобулина способен связываться с рецептором, предотвращая связывание лиганда с его рецептором и, тем самым, прерывая биологический отклик, получаемый в результате связывания лиганда с рецептором. В некоторых примерах осуществления изобретения иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина способен связывать рецептор и активировать или инактивировать данный рецептор.

Бивалентное антитело, отличное от мультиспецифического или мультифункционального антитела, в некоторых примерах осуществления изобретения обычно понимается как имеющее идентичные участки связывания.

Специфический связывающий агент фактически ингибирует прикрепление лиганда к рецептору, когда избыток специфического связующего агента снижает количество рецептора, связанного с контррецептором по крайней мере на 20, 40, 60, 80, 85% или более (при измерении ίη тПго конкурентным анализом связывания).

Термин мишень относится к молекуле или части молекулы, способной связываться специфическим связывающим агентом. В некоторых примерах осуществления изобретения мишень может иметь один или более эпитопов. В некоторых примерах осуществления изобретения мишень является антигеном.

Термин эпитоп включает любую детерминанту полипептида, способную специфически связываться с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. В некоторых примерах осуществления изобретения детерминанты эпитопа включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахара, фосфорил, или сульфонил, и в некоторых примерах осуществления изобретения могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп является областью антигена, связываемой антителом. В некоторых примерах осуществления изобретения антитело специфически связывает антиген, когда он предпочтительно распознает свой антиген мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых примерах осуществления изобретения говорится, что антитело специфически связывает антиген, когда константа диссоциации составляет <1 мкмоль. В некоторых примерах осуществления изобретения, когда константа диссоциации составляет <100 нмоль и в некоторых примерах осуществления изобретения, когда константа диссоциации составляет <10 нмоль.

Термин агент при использовании в данной заявке означает химическое соединение, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, изготовленный из биологических материалов.

При использовании в данной заявке термины метка или меченый относятся к включению детектируемого маркера, например, путем включения меченой радиоактивным изотопом аминокислоты или присоединения к полипептиду частиц биотина, поддающихся детектированию маркированным авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или обладающим ферментной активностью, поддающейся детектированию оптическими или калориметрическими способами). В некоторых примерах осуществления изобретения метка или маркер могут также быть терапевтическими. Различные способы мечения полипептидов и глюкопротеинов известны в данной области и могут быть использованы. Примеры меток для полипептидов включают следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, ЗН, 14С, 15Ν, 35 8, 90Υ, 99 Тс, 111 Ιη, 125 I, 131 I), флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, лантанид, фосфор), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, β-галоктозидаза, люцефираза, алкалин фосфотаза), химиолюминисцентные, биотинилиновые группы, заданные эпитопы полипетида, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности зиппер пары лейцина, связывающие участки для вторичных антител, связывающие домены металла, метки эпитопа), но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения метки присоединяются спейсерными ножками различной длины для снижения потенциального стерического препятствия.

Термин биологический образец при использовании в данной заявке включает любое количество вещества от живой массы или прежде живого существа, но не ограничивается им. Подобные живые существа включают людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных, но не ограничиваются ими. Подобные вещества включают кровь, сыворотку, мочу, клетки, органы, ткани, кость, костный мозг, узлы лимфы и кожу, но не ограничиваются ими.

Термин рак включает твердые опухоли и гематологические злокачественные образования, но не ограничиваются ими. Примеры рака включают рак молочной железы, рак прямой кишки, желудочную карциному, глиому, карциному сквамозных клеток головы и шеи, наследственную и спорадическую папиллярную почечную карциному, лейкемию, лимфому, синдром Ли-Фраумени, злокачественную плевральную мезотелиому, меланому, множественная миелому, карциному не-малых клеток легких, остеосаркому, рак яичников, рак надпочечников, рак простаты, рак малых клеток легких, синовиальную саркому, карциному щитовидной железы и переходную клеточную саркому мочевого пузыря, но не ограничиваются ими.

Термин активность ФРГ включает любое биологическое воздействие ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения активность ФРГ является активностью Ме1-НСБ (Мет ФРГ). В некоторых

- 16 015363 примерах осуществления изобретения активность ФРГ является независимой от Мет активностью ФРГ.

Термин активация Мет-ФРГ включает взаимодействие ФРГ с рецептором Мет.

Термин активность Мет-ФРГ включает любую биологическую активность, возникающую в результате активации Мет-ФРГ. Показательная активность включает невральную индукцию, регенерацию печени, заживление ран, рост, инвазию, морфологическую дифференциацию, эмбриологическое развитие, рассеяние, пролиферацию, апоптоз, подвижность клеток, метастазы, миграцию, прикрепление клеток, образование групп интегрина, фосфорилирование паксиллина, формирование фокальных прикреплений, и рак, возникающий в результате аберрантной активации Мет-ФРГ, но не ограничивается данным.

Термин аберрантная активация Мет-ФРГ включает любое обстоятельство, при котором активация Мет-ФРГ не приводит к стимуляции любой активности Мет-ФРГ тогда, когда обычно активация приводит к подобной активности. Аберрантая активация Мет-ФРГ также включает любое обстоятельство, при котором активация Мет-ФРГ приводит к меньшей активности Мет-ФРГ, чем это произошло бы при нормальной активации. Аберрантная активация также включает любое обстоятельство, при котором активация Мет-ФРГ приводит к большей активности, чем это произошло бы при нормальной активации. Аберрантная активация Мет-ФРГ может привести, например, к некоторым видам рака.

Термин независимая от Мет активность ФРГ относится к любой биологической активности под воздействием ФРГ, не зависящей от связывания ФРГ с рецептором Мет. Подобная активность включает биологическую активность, вызванную взаимодействием ФРГ с другими рецептором и биологическую активность, вызванную ФРГ по другим каналам, например Рон или мет/рон гетеродимерами, но не ограничивается ею.

Термин аберрантная активность ФРГ относится к любому обстоятельству, при котором активность ФРГ либо выше, либо ниже, чем следует. При некоторых обстоятельствах аберрантная активность ФРГ происходит от аберрантной активации ФРГ. При некоторых обстоятельствах аберрантная активность ФРГ происходит от превышающей норму концентрации ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения аберрантная активность ФРГ происходит от концентрации ФРГ, которая ниже, чем следует.

Термин фармацевтический агент или лекарство при использовании в данной заявке означают химическое соединение или композицию, способную вызвать желаемый терапевтический эффект при соответствующем введении пациенту.

Термин модулятор при использовании в данной заявке является соединением, изменяющим или видоизменяющим активность или функцию молекулы. Например, модулятор может вызвать увеличение или уменьшение величины некоторой активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции наблюдаемой при отсутствии модулятора. В некоторых примерах осуществления изобретения модулятор является ингибитором, снижающим величину, по крайней мере одной активности или функции молекулы. Некоторые показательные активности и функции молекулы включают связывающее сродство, ферментную активность и трансдукцию сигнала, но не ограничиваются ими. Некоторые показательные ингибиторы включают протеины, пептиды, антитела, пептитела, карбогидраты или небольшие органические молекулы, но не ограничиваются ими. Пептитела описаны, например, в патенте США № 6660843 (соответствующим заявке РСТ №. \УО 01/83525).

При использовании в данной заявке термин практически чистый означает, что вид объекта является преобладающим присутствующим видом (т.е. на молярной основе он является более преобладающим, чем любые другие индивидуальные виды в композиции). В некоторых примерах осуществления изобретения практически очищенная фракция является композицией, отличающейся тем, что объектные виды включают по крайней мере около 50% (на молярной основе) всех видов макромолекулы. В некоторых примерах осуществления изобретения практически чистая композиция будет включать около 80, 85, 90, 95 или 99% всех видов макромолекул, присутствующих в композиции. В некоторых примерах осуществления изобретения объектные виды очищены до фактической однородности (виды загрязнителей не могут быть обнаружены в композиции с помощью обычных способов детектирования), отличающейся тем, что композиция состоит из фактически одного вида макромолекулы.

Термин пациент включает людей и животные субъекты.

Некоторые показательные специфические связывающие агенты.

В некоторых случаях ФРГ связывает рецептор Мет и индуцирует фосфорилирование Мет. В некоторых случаях обычное индуцируемое ФРГ фосфорилирование Мет регулирует разнообразные клеточные процессы. В некоторых примерах осуществления изобретения аберрантная активность Мет-ФРГ связана с рядом состояний болезни человека. Например, в некоторых случаях чрезмерная активность ФРГ связана с рядом видов рака. Следовательно, в некоторых случаях модуляция активности ФРГ может быть полезной терапевтически. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты с ФРГ используются для уменьшения величины активности ФРГ с аномально высокого уровня. В некоторых примерах осуществления изобретения уменьшение активности ФРГ с аномально высокого уровня уменьшает онкогенную активность и снижает степень тяжести рака. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения специфические связывающие агенты с ФРГ используются для лечения рака. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связываю

- 17 015363 щие агенты с ФРГ используются для профилактики рака.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты с ФРГ используются для лечения рака, в котором активность ФРГ является нормальной. При таких видах рака, например, снижение активности ФРГ до уровня ниже нормального способно обеспечить терапевтический эффект.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ используется для модуляции по крайней мере одной активности Мет-ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ используется для модуляции по крайней мере одной независящей от Мет-ФРГ активности. В некоторых примерах осуществления изобретения более одного специфического связывающего агента с ФРГ используется для модуляции активности ФРГ.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты с ФРГ представляют собой полностью моноклональные антитела человека. В некоторых примерах осуществления изобретения обеспечивается кодирование нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, включающих тяжелую и легкую цепи молекул иммуноглобулина, в частности последовательностей, соответствующих вариабельным областям. В некоторых примерах осуществления изобретения обеспечиваются последовательности, соответствующие гипервариабельным участкам (СОЯк), а именно с СЭЯ1 по СОЯ 3. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения обеспечивается гибридомная клеточная линия, экспрессирующая подобную молекулу иммуноглобулина. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения обеспечивается гибридомная клеточная линия, экспрессирующая моноклональное антитело. В некоторых примерах осуществления изобретения гибридомная клеточная линия выбрана по крайней мере из 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1. В некоторых примерах осуществления изобретения обеспечивается очищенное моноклональное антитело человека к ФРГ человека.

Способность клонировать и реконструировать локусы человека, имеющие размер мегаоснования, в дрожжевых искусственных хромосомах (УАС§) и вводить их в зародышевую линию мыши обеспечивает подход, проливающий свет на функциональные компоненты очень больших или неразработанно картированных локусов, а также генерировать приемлемые модели человеческой болезни. Далее, использование подобной технологии для замещения локусов мыши их человеческими эквивалентами может обеспечить понимание экспрессии и регулирования генной продукции человека во время развития, их связь с другими системами и их участие в вызывании и прогрессировании болезни.

Важным практическим применением данной стратегии является гуманизация гуморальной иммунной системы мыши. Введение локусов иммуноглобулина человека (1д) в мышь, у которой были инактивированы эндогенные гены 1д, предлагает возможность изучить механизмы, стоящие за программируемой экспрессией и сбором антител, а также за их ролью в развитии В клеток. Далее, подобная стратегия может обеспечить источник для производства полностью человеческих моноклональных антител (МаЬ§). В некоторых примерах осуществления изобретения ожидается, что полностью человеческие антитела сведут к минимуму иммуногенные и аллергические отклики, присущие мышиным или производным от мыши МаЬ§, и, таким образом, в некоторых примерах осуществления изобретения увеличат эффективность и безопасность принимаемых антител. В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела могут использоваться для лечения хронических или рецидивирующих болезней человека, таких как рак, малярия или пролиферативная диабетическая ретинопатия, которые могут приводить к повторным назначениям антител.

Можно вывести штаммы мыши, отсутствующие при мышином производстве антител, с большими фрагментами локусов иммуноглобулина (1д) человека, предположив, что подобная мышь будет производить антитела человека при отсутствии мышиных антител. Большие фрагменты 1д человека могут сохранить большое разнообразие вариабельного гена, а также соответствующее регулирование производства антител и экспрессии. С помощью использования мышиных механизмов для диверсификации антитела и выбора и при отсутствии иммунологической толерантности к протеинам человека репродуцированный репертуар антитела человека в этих мышиных штаммах может дать высокоаффинитетные полностью человеческие антитела против любого представляющего интерес антигена, включая антигены человека. Используя гибридомную технологию, могут быть произведены и выбраны специфические к антигенам МаЬ§ человека с желаемой специфичностью. Некоторые показательные способы описаны в XVО 98/24893, патенте США № 5545807, ЕР 546073В1 и 546073А1.

В некоторых примерах осуществления изобретения можно использовать постоянные области от видов, отличных от человека, вместе с вариабельными областями человека.

Встречающаяся в природе структура антитела.

Встречающиеся в природе структурные единицы антитела обычно включают тетрамер. Каждый подобный тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар цепей полипептидов, при этом каждая пара имеет одну полную легкую (в некоторых примерах осуществления изобретения около 25 кДа) и одну полную тяжелую цепь (в некоторых примерах осуществления изобретения около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи обычно включает вариабельную область с приблизительно от 100 до 110

- 18 015363 или более аминокислот, обычно отвечающую за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно определяет постоянную область, которая может отвечать за эффекторную функцию. Легкие цепи человека обычно классифицируются как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи обычно классифицируются как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как 1дМ, 1дО, 1дС, 1дА и 1дЕ соответственно. 1дС имеет ряд подклассов, включающих 1дС1, 1дС2, 1д С3 и 1дС4, но не ограничиваются ими. 1дМ имеет подклассы, включающие 1дМ1 и 1дМ2, но не ограничиваются ими. 1дА подобным же образом подразделен на подклассы, включающие 1дА1 и 1дА2, но не ограничиваются ими. Внутри полной легкой и тяжелой цепей вариабельные и постоянные области соединены областью I из около 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область Ό из еще около 10 аминокислот. См., например, Фундаментальная иммунология, глава 7 (Рипбатеп1а1 1ттипо1оду с1. 7), Поль В. (Раи1, ^.), 2-е изд., издательство Ва\^геп Рге55, Нью-Йорк (1989) (включенную полностью в данную заявку путем ссылки для всех целей). Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи обычно образуют участок связывания антигена.

Вариабельные области обычно демонстрируют такую же общую структуру, как сохранившиеся каркасные области (РВ), соединенные тремя гипервариабельными участками, также называемыми областями определения комплементарности или СЭВ5. СЭВ5 от двух цепей каждой пары обычно выравниваются каркасными областями, которые могут позволить связываться со специфичным эпитопом. От Ν-конца до С-конца вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно включают домены РВ1, СЭВ1, РВ2, СЭВ2, РВ3, СЭВ3 и РВ4. Назначение аминокислот каждому домену обычно происходит в соответствии с определениями последовательности КАБАТ (КаЬа1) протеинов, представляющих иммунологический интерес (Национальный институт здравоохранении, Бетесда, Мериленд (1987 и 1991)) или Хотия и Леск Дж. (С1ю11иа & Ье5к I.), Молекулярная биология (Мо1. Бю1.) 196:901-917 (1987); Хотия и др. (Сйо1Ыа е1 а1.), Природа Ща1иге), 342:878-883 (1989).

В некоторых примерах осуществления изобретения тяжелая цепь антитела связывается с антигеном в отсутствие легкой цепи антитела. В некоторых примерах осуществления изобретения легкая цепь антитела связывается с антигеном в отсутствие тяжелой цепи антитела. В некоторых примерах осуществления изобретения область связывания антигена связывает с антигеном в отсутствие легкой цепи антигена. В некоторых примерах осуществления изобретения область связывания антигена связывает с антигеном в отсутствие тяжелой цепи антигена. В некоторых примерах осуществления изобретения индивидуальная вариабельная область специфически связывается с антигеном в отсутствие других вариабельных областей.

В некоторых примерах осуществления изобретения определяющая делиниация СЭВ и идентификация остатков, включающих участок связывания антитела, получается путем определения структуры антитела и/или определения структуры комплекса антитело-лиганд. В некоторых примерах осуществления изобретения это может быть выполнено с помощью любых различных методик, известных специалистам в данной области, подобных рентгеновской кристаллографии. В некоторых примерах осуществления изобретения различные способы анализа могут использоваться для идентификации и аппроксимации участков СЭВ. Примеры подобных способов включают определение Кабат (КаЬа1), определение Хотия (Сйо1Ыа), определение АЬМ и контактное определение, но не ограничиваются ими.

Определение Кабат является стандартным для нумерации остатков и обычно используется для идентификации участков СЭВ. См., например, Джонсон и Ву ЦоЫъоп апб ^и), Остатки нуклеиновых кислот Щис1ею Ас1б5 Ве5), 28:214-8 (2000). Определение Хотия подобно определению Кабат, но определение Хотия учитывает позицию некоторых структурных замкнутых областей. См., например, Хотия и др. (С1юБа е1 а1.), Журнал молекулярной биологии (I. Мо1. Вю1.), 196:901-17 (1986); Хотия и др. (СйоБа е1 а1.), Природа (№1иге), 342:877-83 (1989). Определение АЬМ использует интегрированный ряд компьютерных программ, производимых Оксфордской молекулярной группой (Ох£огб Мо1еси1аг Сгоир), моделирующих структуру антитела. См., например, Мартин и др. (МагБп е1 а1.), Труды академии естественных наук (Ргос. №111. Асаб. 8а) (США), 86:9268-9272 (1989); АЬМ™, компьютерная программа для моделирования вариабельных областей антител, Оксфорд. Великобритания; Ох£огб Мо1еси1аг Ь1б. Определение АЬМ моделирует третичную структуру антитела от первичной последовательности, используя комбинацию баз данных знаний и способов аЬ шйю, описанных в Самудрала и др. (8атибга1а е1 а1.), Прогнозирование изначальной белковой структуры, используя комбинированный иерархический подход (АЬ 1ш!ю Рго1еш 81гис1иге Ргебюйоп И5тд а СотЬтеб Н1егагсЫа1 Арргоасй), Дополнительные материалы по белкам, структуре, функции и генетике (РВОТЕШ8, 81гис1иге, РипсБоп апб Сепейс5 8ирр1.), 3:194:198 (1999). Контактное определение основывается на анализе имеющихся сложных структур кристалла. См., например, МакКаллум и др. (МасСа11ит е1 а1.), Журнал молекулярной биологии (I. Мо1. Вю1.), 5:732-45 (1996).

По принятому соглашению участки СЭВ в тяжелой цепи обычно называются Н1, Н2 и Н3 и нумеруются последовательно в направлении от аминоконца к карбоксиконцу. Участки СЭВ в легкой цепи обычно называются Ь1, Ь2 и Ь3 и нумеруются последовательно в направлении от аминоконца к карбоксиконцу.

- 19 015363

Биспецифические или бифункциональные антитела.

Биспецифическое или бифункциональное антитело обычно является искусственным гибридным антителом, имеющим две различные пары тяжелой/легкой цепи и два различных участка связывания. Биспецифические антитела могут производиться разнообразными способами, включая гибридомы или связывание фрагментов РаЬ', но не ограничиваются ими. См., например, Сонгсивилей и др. (8опд8М1а1 е! а1.), Клиническая экспериментальная иммунология (С1т. Ехр. 1ттипо1.), 79:315-321 (1990); Костелни и др. (Ко8!е1пу е! а1), Журнал иммунологии (1. 1ттипо1.), 148:1547-1553, 91992.

Приготовление антител.

В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения изобретение включает некоторые антитела, специфически связывающие с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения антитела производятся иммунизацией антигеном. Термин антиген относится к молекуле, используемой в животном для производства антител, способных связываться с данным антигеном и/или иной мишенью. В некоторых примерах осуществления изобретения антитела могут производиться иммунизацией полным ФРГ, растворимой формой ФРГ, сплайс вариантной формой ФРГ или его фрагментом. В некоторых примерах осуществления изобретения антитела по данному изобретению могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут быть рекомбинантными антителами. В некоторых примерах осуществления изобретения антитела по данному изобретению являются антителами человека, приготовленными, например, с помощью иммунизации трансгенных животных, способных производить антитела человека (см., например, опубликованную заявку РСТ № АО 93/12227).

В некоторых примерах осуществления изобретения могут использоваться некоторые стратегии для манипулирования присущими антителам свойствами, такими как аффинитет антитела к его мишени. Подобные стратегии включают использование специфического к участку или произвольного мутагенеза молекулы полинуклеотида, кодирующего антитела для генерации варианта антитела, но не ограничиваются данным. В некоторых примерах осуществления изобретения за подобной генерацией происходит скрининг для вариантов антитела, демонстрирующих желаемое изменение, например увеличенный или уменьшенный аффинитет.

В некоторых примерах осуществления изобретения остатки аминокислот, конъюгированные в мутагенных стратегиях, являются ими и в СОК. В некоторых примерах осуществления изобретения конъюгируются аминокислоты в каркасных областях вариабельных доменов. В некоторых примерах осуществления изобретения было показано, что подобные каркасные области вносят вклад в свойства связывания мишени некоторых антител. См., например, Хадсон (Ниб8оп), Текущее мнение по биотехнологии (Сигг. Орт. Вю!есЬ.), 9:395-402 (1999) и имеющиеся в данной работе ссылки.

В некоторых примерах осуществления изобретения более маленькие и более эффективно отсеянные библиотеки вариантов антител производятся ограничением произвольного или направленного на участок мутагенеза участками гипермутации в СОК, которые являются участками, соответствующими областям, способным к мутации во время процесса вызревания соматического аффинитета. См., например, Чоудхури и Пастан (СНо\\'б1шгу апб Ра8!ап), Природа биотехнологии Ща!иге Вю!есЬ), 17:568-572 (1999) и имеющиеся в ней ссылки. В некоторых примерах осуществления изобретения некоторые типы элементов ДНК могут быть использованы для идентификации участков гипермутации, включая некоторые прямые и инвертированные повторы, некоторые согласованные последовательности, некоторые вторичные структуры и некоторые палиндромы, но не ограничиваясь ими. Например, подобные элементы ДНК, которые могут быть использованы для идентификации участков гипермутации, включают тетрабазовую последовательность, включающую пурин (А или О), за которым следует гуанин (О), за которым следует пиримидин (С или Т), за которым следует либо аденозин либо тирозин (А или Т) (т.е. А/О-О-С/Т-А/Т), но не ограничиваются ими. Другой пример элемента ДНК, который может быть использован для идентификации участков гипермутации, является кодоном серина; А-О-С/Т.

В некоторых примерах осуществления изобретения антитела гуманизированы. В некоторых примерах осуществления изобретения гуманизированное антитело является практически не иммуногенным в людях. В некоторых примерах осуществления изобретения гуманизированное антитело имеет практически такой же аффинитет для мишени, как и антитело от других видов, из которых выведено гуманизированное антитело. См., например, патент США №№ 5530101; 5693761; 5693762; 5585089.

В некоторых примерах осуществления изобретения обнаруживаются аминокислоты вариабельного домена антитела, которые могут быть модифицированы без снижения природного аффинитета области связывания антигена и в то же время снижая его иммуногенность. См., например, патенты США №№ 5766886 и 5869619.

В некоторых примерах осуществления изобретения модификация антитела способами, известными в данной области, обычно приводит к достижению увеличенного связывающего сродства для мишени и/или снижению иммуногенности антитела у реципиента. В некоторых примерах осуществления изобретения гуманизированные антитела модифицируются для устранения участков гликолизации для того, чтобы увеличить аффинитет антитела к его родственному антигену. См., например, Ко и др. (Со е! а1.), Молекулярная иммунология (Мо1. 1ттипо1.), 30:1361-1367 (1993). В некоторых примерах осуществления изобретения для производства гуманизированных антител используются такие методики, как реконст

- 20 015363 руирование, гиперхимеризацию или облицовку/перекладку. См., например, Васвами и др. (Уаз\уанн е! а1.), Анналы аллергии, астмы и иммунологии (Аппа1з о£ А11егду, АзШта, & 1ттипо1.), 81:105 (1998); Рогуска и др. (Кодизка е! а1.), Рго! Епдтеег 9:895-904 (1996) и патент США № 6072035. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные методики обычно снижают иммуногенность путем снижения числа чужеродных остатков, но не предотвращают антиидиотипичные и антиаллотипичные отклики вслед за повторным приемом антител. Некоторые другие способы для снижения иммуногенности описаны, например, в Гиллианд и др. (С1Ш1апб е! а1.), Журнал иммунологии (1. 1ттипо1.), 62(6):3663-71 (1999).

В некоторых случаях гуманизация антител приводит к потере способности связывания антигена. В некоторых примерах осуществления изобретения гуманизированные антитела являются обратно мутированными. В некоторых примерах осуществления изобретения гуманизированное антитело мутируется и включает один или более остатков аминокислот, обнаруживаемых в донорском антителе. См., например, Салданха и др. (8а1бапЬа е! а1.), Молекулярная иммунология (Мо1. 1ттипо1.), 36:709-19 (1999).

В некоторых примерах осуществления изобретения гипервариабельные участки (СЭКз) вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антитела к ФРГ могут быть трансплантированы в каркасные области (ЕКз) от тех же или других видов. В некоторых примерах осуществления изобретения СЭКз вариабельных областей легкой и тяжелой цепи антитела к ФРГ могут быть трансплантированы в согласованные человеческие ЕКз. Для создания согласованных человеческих ЕКз в некоторых примерах осуществления изобретения каркасные области (ЕКз) от нескольких человеческих тяжелых или легких цепей аминокислотных последовательностей выстраиваются для идентификации согласованной последовательности аминокислот. В некоторых примерах осуществления изобретения ЕКз антитела к тяжелой или легкой цепи ФРГ заменяются на ЕКз от другой тяжелой или легкой цепи. В некоторых примерах осуществления изобретения редкие аминокислоты в ЕКз тяжелой или легкой цепей антитела к ФРГ не заменяются, в то время как остальные аминокислоты каркасной области (ЕК) заменяются. Редкие аминокислоты являются специфическими аминокислотами, находящимися в позициях, в которых они обычно не находятся в ЕКз. В некоторых примерах осуществления изобретения трансплантированные вариабельные области от антитела к ФРГ могут использоваться с постоянной областью, отличающейся от постоянной области антитела к ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения трансплантированные вариабельные области являются частью отдельной цепи антитела Εν. Трансплантация СОК описана, например, в патентах США №№ 6180370; 6054297; 5693762; 5859205; 5693761, 5565332; 5585089 и 5530101 и в Джоунз и др. (1опез е! а1), Природа (№!иге), 321:522-525 (1986); Ричманн и др. (ШесНтапп е! а1.), Природа (№!иге), 332:323-327 (1988); Верхойен и др. (УегЕоеуеп е! а1.), Наука (8с1епсе), 239:1534-1536 (1988), Винтер (^ш1ег), ЕЕВ8 Ьейз, 430:92-94 (1998), включенные в данную заявку путем ссылки для любой цели.

В некоторых примерах осуществления изобретения для генерации моноклональных антител используется метод отображения фага. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные методики производят полностью человеческие моноклональные антитела. В некоторых примерах осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий отдельный фрагмент антитела ЕаЬ или Εν, осуществляет экспрессию на поверхности частицы фага. См., например, Хугенбум и др. (НоодепЬоот е! а1.), Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.), 227:381 (1991); Маркс и др. (Магкз е! а1.), Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.), 222:587 (1991); патент США № 5885793. В некоторых примерах осуществления изобретения фаги просеваются для идентификации тех фрагментов антитела, которые имеют аффинитет к мишени. Таким образом, происходят некоторые подобные процессы искусственной иммунной селекции путем отображения репертуара фрагмента антитела на поверхности нитевидного бактериофага и последующий выбор фагов путем их связывания с мишенью. В некоторых подобных процедурах изолируются высоко аффинитетные функциональные агонистические фрагменты антитела. В некоторых подобных примерах осуществления изобретения полный репертуар генов антитела человека создается клонированием природно реорганизованных V генов человека из лимфоцитов периферийной крови. См., например, Муллинекс и др. (МиШпах е! а1.), Труды академии естественных наук (Ргос. №И. Асаб. δα) (США), 87:8095-8099 (1990).

В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения антитела по изобретению приготавливаются путем использования тренсгенной мыши, имеющей значительную вставленную часть антитела человека, производящего геном, но обладающую дефицитом производства эндогенных мышиных антител. Подобные мыши затем способны производить молекулы иммуноглобулина человека и антитела и имеют дефицит производства мышиного иммуноглобулина и антител. Методики, используемые для достижения данного результата, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, раскрытых в описании изобретения. В некоторых примерах осуществления изобретения можно использовать способы, такие как описанные в опубликованной заявке РСТ № XVО 98/24893 или в Мендез и др. (Мепбех е! а1.), Природа Генетики (№!иге Сепебсз), 15:146-156 (1997), включенных в данную заявку путем ссылки для любой цели.

В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения полностью человеческие моноклональные антитела, специфические к ФРГ, производятся следующим образом. Трансгенные мыши, содержащие гены иммуноглобулина человека, иммунизируются представляющим интерес антигеном,

- 21 015363 например ФРГ; от данных мышей получаются лимфатические клетки (подобные В-клеткам), производящие экспрессию антител. Подобные восстановленные клетки сливаются с клеточной линией миелоидного типа для приготовления бессмертных клеточных линий гибридомы, и подобные клеточные линии гибридомы отсеиваются и отбираются для идентификации клеточных линий гибридомы, производящих антитела, специфические к представляющему интерес антигену. В некоторых примерах осуществления изобретения осуществляется производство гибридомной клеточной линии, производящей антитела, специфические к ФРГ.

В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела производятся путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках хозяина или путем экспрессии в гибридомных клетках. В некоторых примерах осуществления изобретения антитела производятся, используя описанную выше методику отображения фага.

В некоторых примерах осуществления изобретения полностью человеческие антитела производятся, подвергая антиген влиянию спленоцитов человека (В или Т клеток) ίη νίίτο, а затем реконструируя подвергнутые влиянию клетки в иммунокомпромиссных мышах, например 8СГО или гюб/ЗСГО. См., например, Брамс и др. (Вгатк е! а1.), Журнал иммунологии (ί. Iттиηο1.), 160:2051-2058 (1998); Карбаллидо и др. (СаЛаЩ^ е! а1.), №11. Меб., 6:103-106 (2000). При некоторых подобных подходах трансплантация эмбриональной ткани человека в мышей 8СГО (ЗСГО-йи) приводит к долгосрочному кроветворению и развитию Т-клеток человека. См., например, Мак Кун и др. (МсСиие е! а1.), Наука (Заенсе), 241:15321639 91988); Ифверсен и др. (ΙίνεΓδεη е! а1.), Зет Iттиηο1., 8:243-248 (1996). В некоторых случаях гуморальный иммунный отклик в подобных химерных мышах зависит от совместного развития Т-клеток человека у животных. См., например, Мартенссон и др. (ΜηιΚηδδοη е! а1.), Иммунология ЦттидоЦ 83:1271-179 (1994). При некоторых подходах лимфоциты периферийной крови человека трансплантируются в мышь 8СГО. См., например, Мозиер и др. (Μοβιογ е! а1.), Природа (ЫаШге), 335:256-259 (1988). В некоторых подобных примерах осуществления изобретения, когда подобные трансплантированные клетки обрабатываются либо примирующим агентом, подобным стафилококковому энтеротоксину А (8ЕА) или не-человеческими моноклональными антителами 0Ό40. детектируются более высокие уровни производства В клеток. См., например, Мартенссон и др. (Μ;π№ΐ55οη е! а1.), Иммунология ^тти^!), 83:224-230 (1995); Мерфи и др. (Мигрйу е! а1.), Кровь (β1οο6), 86:1946-1953 (1995).

В некоторых примерах осуществления изобретения антитела по данному изобретению производятся по крайней мере одной из следующих гибридом: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4,

2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты связывают с ФРГ при константе диссоциации (К_с), составляющей 10^-8, 10^-9 или 10^-10 М. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты связываются с ФРГ при константе диссоциации (К_с) между приблизительно 0,099 и 0,79 нМ при измерении кинетическим способом (фиг. 6А). В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты связывают с ФРГ при К_с, составляющей от менее чем 10 рМ до приблизительно 54 рМ, при измерении способом равновесного раствора (фиг. 6В).

В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают молекулу иммуноглобулина, представляющую по крайней мере один изотип из 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дЕ, 1дА, Ι§ϋ и 1дМ. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают легкую цепь каппа человека и/или тяжелую цепь человека. В некоторых примерах осуществления изобретения тяжелая цепь представляет собой изотип 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дЕ, 1дА, Ι§ϋ или 1дМ. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты были клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают постоянную область, отличную от любых постоянных областей изотипов 1§С1, 1§С2, Ι§63, Ι§64, 1дЕ, 1дА, Ι§Ό и 1дМ.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь Ι§Ο1 человека. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь Ιβ62 человека. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь Ι§Ο3, Ι§Ο4, Ι^Γ, А, Ι§Ό или Ι§Μ человека. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают вариабельные области антител, легированные с постоянной областью, не являющейся постоянной областью для изотипа !дС1 и не являющейся постоянной областью для изотипа Ι§Ο2. В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты были клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих.

В некоторых примерах осуществления изобретения консервативные модификации тяжелых и легких цепей антител по крайней мере от одной гибридомной линии: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1,

1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1 (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидов) произведут антитела к ФРГ, имеющие функциональные и химические характеристики, подобные характеристикам антител из гибридомных линий: 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и

3.10.1, В отличие от этого, в некоторых примерах осуществления изобретения значительные модифика

- 22 015363 ции функциональных и/или химических характеристик антител к ФРГ могут быть выполнены путем выбора замещений в последовательности аминокислот тяжелой и легкой цепей, значительно отличающихся в их воздействии на поддержание (а) структуры молекулярного каркаса в области замещения, например, в качестве пластинчатой или спиральной конформации, (б) зарядом или гидрофобностью молекулы на участке мишени или (в) объемом боковой цепи.

Например, консервативное замещение аминокислоты может включать замещение природного остатка аминокислоты неприродным остатком таким образом, что имеется небольшое или совсем отсутствует воздействие на полярность или заряд остатка аминокислоты в данной позиции. Далее, природный остаток в полипептиде может быть также замещен аланином, как это было описано ранее для мутагенеза со сканированием аланина.

Желательные замещения аминокислот (консервативные или неконсервативные) могут быть определены специалистами в данной области в момент, когда желательны подобные замещения. В некоторых примерах осуществления изобретения замещения аминокислот могут использоваться для идентификации важных остатков антител к ФРГ или для увеличения или уменьшения аффинитета антител к ФРГ, описанного в данной заявке.

В некоторых примерах осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению могут быть выражены в клеточных линиях, отличных от гибридомных клеточных линий. В некоторых примерах осуществления изобретения последовательности, кодирующие определенные антитела, могут использоваться для трансформации приемлемой клетки хозяина млекопитающего. В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения трансформация может производиться любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина, включая пример упаковки полинуклеотида в вирусе (или в вирусном векторе) и трансдукцию клетки хозяина вирусом (или вектором) или процедуры трансфекции, известные в данной области, как это пояснено патентами США №№ 4399216; 4912040; 4740461 и 4959455 (при этом патенты включены в данную заявку путем ссылки для любой цели). В некоторых примерах осуществления изобретения используемые процедуры трансформации могут зависеть от трансформируемого хозяина. Способы введения гетерологовых полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают регулируемую декстраном трансфекцию, осаждение фосфата кальция, регулируемую полибреном трансфекцию, слияние протопласта, электропорез, заключение полинуклеотида(-ов) в капсулы в липосомах и прямое микроинжектирование ДНК в ядро, но не ограничиваются ими.

Клеточные линии млекопитающих, имеющиеся в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области и включают многие бессмертные клеточные линии, которые можно получить из Американской коллекции типовых культур (Ашепсап Туре СнИиге Со11ес11оп - АТСС), включая овариальные клетки китайского хомяка (СНО), клетки НеЬа, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (СО8), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер С2) и ряд других клеточных линий, но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения клеточные линии могут быть выбраны через определение того, какие клеточные линии имеют высокий уровень экспрессии и производят антитела с соответствующими свойствами связывания ФРГ. Хорошо известны соответствующие векторы экспрессии для клеток хозяина млекопитающих.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфические связывающие агенты включают один или более полипептид. В некоторых примерах осуществления изобретения любой из разнообразия векторов экспрессии/систем хозяина может использоваться для экспрессии молекул полинуклеотида, кодирующих полипептиды. Подобные системы включают такие микроорганизмы, как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидом или козмидом вектора экспрессии ДНК; дрожжи, трансформированные векторами экспрессии дрожжей; клеточные системы насекомых, инфицированных векторами экспрессии вируса (например, бациловирусом); системы клеток растений, трансфицированные векторами экспрессии вируса (например, мозаичным вирусом цветной капусты, СаМУ, мозаичным вирусом табака) или трансформированные векторами экспрессии бактерий (например, плазмидами Т1 или рВК.322) или клеточными системами животных, но не ограничиваются ими.

В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид рекомбинантно экспрессируется в дрожжах. Некоторые подобные примеры осуществления изобретения используют коммерчески имеющиеся системы экспрессии, например система экспрессии Пичия (РюЫа Ехргеккюп 8ук!еш), Инвитроген, Сан-Диего, Калифорния (1пу1!годеп, 8ап П1едо, СА), следуя инструкциям изготовителя. В некоторых примерах осуществления изобретения подобная система полагается на последовательность рге-рго-а1рйа для регулирования секреции. В некоторых примерах осуществления изобретения транскрипция вставки приводится промотером оксидазы спирта (АОХ1) при индукции метанолом.

В некоторых примерах осуществления изобретения выделенный полипептид очищается от среды роста дрожжей. В некоторых примерах осуществления изобретения способы, используемые для очистки полипептида от среды роста дрожжей такие же, как способы, используемые для очистки полипептида от супернатантов бактериальных клеток и клеток млекопитающих.

В некоторых примерах осуществления изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, клонируется в палочко-вирусный вектор экспрессии, подобный рУЪ1393 (ФарМинген (РйагМшдеп), Сан

- 23 015363

Диего, Калифорния). В некоторых примерах осуществления изобретения подобный вектор может использоваться в соответствии с рекомендациями изготовителя (РкагМтдеп) для инфицирования клеток 8робор1ега Ргидрегба в свободной от протеина среде §Р9 и для производства рекомбинантного полипептида. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид очищается и концентрируется от подобной среды, используя гепарин - Сефарозовую колонку (Фармация - Ркагтааа).

В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид экспрессируется в системе насекомого. Некоторые системы насекомых для экспрессии полпептида хорошо известны специалистами в данной области. В одной подобной системе вирус нуклеарного гипергидроза (Аи1одгарка саШогшса пис1еаг ро1уЬебго818 νίπ.15 - Ас№У) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках 8робор1ега £гид1регба или в личинках ТпсНоркыа. В некоторых примерах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, может быть вставлена в несущественный ген вируса, например внутрь гена полигедрина, и помещено под контроль промотера для данного гена. В некоторых примерах осуществления изобретения успешная вставка молекулы нуклеиновой кислоты сделает второстепенный ген неактивным. В некоторых примерах осуществления изобретения эта инактивация приводит к детектируемым характеристикам. Например, инактивация гена полигедрина приводит к производству вируса, в котором отсутствует белок покрытия.

В некоторых примерах осуществления изобретения рекомбинантные вирусы могут быть использованы для инфицирования клеток 8. Ргидрегба или личинок ТпсНоркыа. См., например, Смит и др. (8ιηί11ι е1 а1.), Журнал вирусологии (ί. Упо1.), 46:584 (1983); Энгельхард и др. (ЕпдеШагб е1 а1.), Труды академии естественных наук (Ргос. №11. Асаб. 8а) (США), 91:3224-7 (1994).

В некоторых примерах осуществления изобретения полипептиды, изготовленные в бактериальных клетках, производятся как нерастворимые тела вставки в бактериях. В некоторых примерах осуществления изобретения клетки хозяина, включающие подобные тела вставки, собираются центрифугированием; промываются в 0,15 М №С1, 10 мМ ТгЕ, рН 8, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕЭТА) и обрабатываются 0,1 мг/мл лисозима (Сигма (81дта), Сент-Луис, Миссури) в течение 15 мин при комнатной температуре. В некоторых примерах осуществления изобретения лизат очищается ультразвуком и остатки клеток гранулируются центрифугированием в течение 10 мин при 12,000 х д. В некоторых примерах осуществления изобретения содержащая полипептид гранула повторно погружается в 50 мМ ТгЕ, рН 8 и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕЭТА); наносится поверх 50% глицерола и центрифугируется в течение 30 мин при 6000 х д. В некоторых примерах осуществления изобретения эта гранула может быть повторно погружена в стандартный забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР), свободный от Мд++ и Са++. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид далее очищается путем фракционирования повторно погруженной гранулы в денатурирующем полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (8Ό8) (см., например, Сембрук и др. (8атЬгоок е1 а1.), там же). В некоторых примерах осуществления изобретения подобный гель может быть погружен в 0,4 М КС1 для визуализации протеина, который может быть эксцизионирован и электроэлюирован в гелиевый буфер, в котором отсутствует додецилсульфат натрия (8Ό8). В соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения слитый белок С1и1аШюпе-8-Тгап8£ега5е (С8Т) производится в бактериях в качестве растворимого белка. В некоторых примерах осуществления изобретения подобный слитый белок С8Т очищается, используя модуль очистки С8Т (Фармация - Ркагтааа).

В некоторых примерах осуществления изобретения желательно свернуть некоторые полипептиды. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные полипептиды производятся, используя некоторые обсуждаемые здесь рекомбинантные системы. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептиды свертываются и/или окисляются для образования желаемой третичной структуры и/или генерации дисульфидных связей. В некоторых примерах осуществления изобретения подобная структура и/или связи связаны с определенной биологической активностью полипептида. В некоторых примерах осуществления изобретения свертывание выполняется, используя ряд процедур, известных в данной области. Показательные способы включают подвергание солюбилизированного полипептидного агента воздействию рН, обычно выше 7, в присутствии хаотропного агента, но не ограничиваются данным. Показательным хаотропным агентом является гуанидин. В некоторых примерах осуществления изобретения свертывающий/окисляющий раствор также включает редуцирующий агент и окисленную форму этого редуцирующего агента. В некоторых примерах осуществления изобретения редуцирующий агент и его оксидированная форма присутствуют в соотношении, которое генерирует определенный окислительно-восстановительный потенциал, который позволяет произойти перетасовке дисульфидов. В некоторых примерах осуществления изобретения подобная перетасовка позволяет образовать цистеиновые мостики. Показательные окислительно-восстановительные пары включают цистеин/цистамин, глютатион/дитиобис С8Н, хлорид, включающий двухвалентную медь, дитиотреитол ЭТТ/дитиан ЭТТ, и 2-меркаптоэтанол (ЬМЕ)/дитио-ЬМЕ, но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения используется сорастворитель для увеличения эффективности свертывания. Показательные сорастворители включают глицерол, полиэтиленгликоль различных молекулярных весов и аргинин, но не ограничиваются ими.

- 24 015363

В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид практически очищается. Некоторые методики очистки протеина известны специалистам в данной области. В некоторых примерах осуществления изобретения очистка протеина включает сырую фракционную перегонку полипептидных фракций из неполипептидных фракций. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептиды очищаются, используя методики хроматографии и/или электрофореза. Показательные способы очистки включают осаждение сульфатом аммония; осаждение с полиэтиленгликолем (РЕС); иммуноосаждение; тепловую денатурацию с последующим центрифугированием; хроматографию, включая аффинитетную хроматографию (например, Рго1ет-А-8ерЬагоке), ионообменную хроматографию, вытеснительную хроматографию и обратно фазовую хроматографию; гелиевую фильтрацию; гидроксилапатитную хроматографию; изоэлектрическое фокусирование; электрофорез гелем полиакриламида, но не ограничиваются ими, и комбинацию подобной и других методик. В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид очищается быстрой белковой жидкостной хроматографией или жидкостной хроматографией высокого разрешения (НРЬС - Ιιίβΐι ргеккиге 1к|шб сНготоЮдгарНу). В некоторых примерах осуществления изобретения этапы очистки могут быть изменены или некоторые этапы могут быть опущены, и все равно это приводит к приемлемому способу приготовления практически очищенного полипептида.

В некоторых примерах осуществления изобретения можно количественно определить степень очистки полипептидного препарата. Некоторые способы количественной оценки степени очистки известны специалистам в данной области. Некоторые показательные способы включают определение специфической связывающей активности препарата и оценку величины полипептида внутри препарата анализом с помощью додецилсульфата натрия/электрофореза в полиакриламидном геле (δΌδ/РАбЕ), но не ограничиваются ими. Некоторые показательные способы оценки величины очистки препарата полипептида включают расчет связывающей активности препарата и сравнение его со связывающей активностью первоначального экстракта. В некоторых примерах осуществления изобретения результаты подобного расчета выражаются как очистка складки. Единицы, используемые для представления величины связывающей активности, зависят от выполняемого анализа.

В некоторых примерах осуществления изобретения полипептид очищается частично. В некоторых примерах осуществления изобретения частичная очистка может быть выполнена путем использования меньшего количества этапов очистки или путем использования различных форм той же общей схемы очистки. Например, в некоторых примерах осуществления изобретения катионообменная колоночная хроматография, выполняемая с использованием аппарата НРЬС, обычно приводит к большей очистке складки, чем такая же методика с использованием системы хроматографии под низким давлением. В некоторых примерах осуществления изобретения способы, приводящие к более низкой степени очистки, могут иметь преимущества в полном восстановлении полипептида или в поддержании связывающей активности полипептида.

В некоторых случаях электрофорезная миграция полипептида может меняться, иногда значительно, при различных условиях анализа с помощью додецилсульфата натрия/электрофореза в полиакриламидном геле. См., например, Капалди и др. (Сара1б1 е! а1.), ВюсНет. ВюрЬу/Век. Сотт., 76:425 (1977). Следует понимать, что при различных условиях электрофореза могут быть различными очевидные молекулярные веса очищенного или частично очищенного полипептида.

Некоторые показательные эпитопы.

В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются эпитопы, с которыми связывается анти-ФРГ (см., например, пример 8, фиг. 10 и 11, и последовательности №: 164 и 165). В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для предотвращения связывания антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для уменьшения связывания антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для практического ингибирования связывания антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента с ФРГ. Эпитоп практически ингибирует связывание антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента с ФРГ, когда излишек эпитопа снижает количество антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента с ФРГ по крайней мере на 20, 40, 60, 80, 85% или более. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может использоваться для связывания антитела анти-ФРГ или специфического связывающего агента. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для идентификации антител или специфических связывающих агентов, связывающихся с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для выделения антител или специфических связывающих агентов, связывающихся с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для генерации антител или специфических связывающих агентов, связывающихся с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован как иммуноген для генерации антител или специфических связывающих агентов, связывающихся с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может вводиться животному, и впоследствии от животного могут быть получены антитела, связывающиеся с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения эпитоп ФРГ может быть использован для вмешательства в нормальную

- 25 015363 активацию ФРГ -Мет.

Некоторые терапевтические использования.

В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения рака. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более связывающих с ФРГ агентов. В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения рака. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более связывающих с ФРГ агентов и другого терапевтического агента.

В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения или профилактики малярии. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более агентов. связывающих с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения или профилактики малярии. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более связывающих с ФРГ агентов и другого терапевтического агента.

В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения или профилактики пролиферативной диабетической ретинопатии. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более связывающих с ФРГ агентов. В некоторых примерах осуществления изобретения предусматриваются способы лечения или профилактики пролиферативной диабетической ретинопатии. включающие введение терапевтически эффективного количества одного или более связывающих с ФРГ агентов и другого терапевтического агента.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий с ФРГ агент вводится отдельно. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ вводится до приема по крайней мере одного другого терапевтического агента. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ вводится одновременно с приемом по крайней мере одного другого терапевтического агента. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ вводится после приема по крайней мере одного другого терапевтического агента. Терапевтические агенты включают по крайней мере один другой агент для терапии рака. но не ограничиваются им. Показательные агенты для терапии рака включают радиационную терапию и химиотерапию. но не ограничиваются ими.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут назначаться в комбинационной терапии. т.е. в комбинации с другими агентами. В некоторых примерах осуществления изобретения комбинационная терапия включает специфический связывающий агент. способный связывать ФРГ. в комбинации по крайней мере с одним антиангиогенным агентом. Агенты включают синтетически приготовленные ш У11го химические композиции. антитела. области связывания антигена. радионуклиды и их комбинации и конъюгаты. но не ограничиваются ими. В некоторых примерах осуществления изобретения агент может действовать как агонист. антагонист. аллостерический модулятор или токсин. В некоторых примерах осуществления изобретения агент может действовать для ингибирования или стимулирования своей мишени (например. активация или ингибирование рецептора или фермента) и тем самым способствовать умерщвлению клетки или блокировке роста клетки.

Химиотерапевтическое лечение включает использование антинеопластических агентов. но не ограничивается ими. включающих алкилирующие агенты. включающие азотистые иприты. такие как мехлорэтамин. циклофосфамид. ифосфамид. мелфалан и хлорамбуцил; нитромочевины. подобные кармустину (ВС№). ломустину (СС^) и семустину (метил-СС^и); Тето6а1™ (темозоламид). этиленимины/метилмеламины. такие как триэтиленмеламин (ТЕМ). триэтилен. тиофосфорамид (тиотепа). гексаметилмеламин (НММ. алтретамин); соли алкилсульфокислоты. такие как бусульфан; триазины. такие как дакарбазин (ИТ1С); антиметаболиты. включающие такие аналоги фолиевой кислоты. как метотрексат и триметрексат; аналоги пиримидина. такие как 5-фторурацил (5ЕИ). фтородезоксиуридин. гемцитабин. цитозин арабинозид (АгаС. цитарабин). 5-азацитидин. 2.2'-дифтородезоксицитидин. аналоги пурина. такие как 6-меркаптопурин. 6-тиогуанин. азотиоприн. 2'-дезоксикоформицин (пентостатин). эритрогидроксинониладенин (ΕНNА). флюдарабин фосфат и 2-хлородэоксиаденозин (кладрибин. 2-С6А); природные продукты. включающие антимитотические лекарства. такие как паклитаксел. винка алкалоиды. включающие винбластин (МЬВ). винкристин и винорелбин. таксотер. эстрамустин и эстрамустин фосфат; пиподофилотоксины. такие как этопозид и тенипозид; антибиотики. такие как актимомицин Ό. дауномицин (рубидомицин). доксорубицин. митоксантрон. идарубицин. блеомицины. пликамицин (митрамицин). митомицин С и актиномицин; ферменты. такие как Ь-аспарагиназа; биологические модификаторы отклика. такие как интерферон альфа. 1Ь-2. О-С8Е и СМ-8СЕ; различные агенты. включающие платиновые координационные комплексы. такие как цисплатин и карбоплатин. антраценедионы. такие как митоксантрон. замещенная мочевина. такая как гидроксиуреа. производные метилгидразина. включающие Νметилгидразин (М1Н) и прокарбазин. адренокортиковые суппрессанты. такие как митотан (о.р'-ΌΌΌ) и аминоглютетимидин; гормоны и антагонисты. включающие адренокортикостероидные антагонисты. такие как преднизон и эквиваленты. дексаметазон и аминоглютетимидин; Сетхаг™ (гемцитабин). прогестин. такой как гидроксипрогестерон капроат. медроксипрогестерон ацетат и мегестрол ацетат; эстрогены. такие как эквиваленты диэтилстилбестрола и этинил эстрадиола; антиэстрогены. такие как тамокси

- 26 015363 фен; андрогены, включающие тестостерон пропионат и флуоксиместерон/эквиваленты; антиандрогены, такие как флютамид, аналоги гормонов, выделяющих гонадотропин и лейпролид; и нестероидные антиандрогены, такие как флютамид, но не ограничиваются ими.

Раковая терапия, которая может назначаться со специфическим связывающим агентом с ФРГ, также включает направленную терапию, но не ограничивается ею. Примеры направленной терапии включают использование терапевтических антител, но не ограничивается данным. Показательные примеры терапевтических антител включают мышиные антитела, мышиночеловеческие химерные антитела, СРЯтрансплантированные, гуманизированные и полностью человеческие антитела и синтетические антитела, но не ограничиваются ими, включая антитела, выбранные путем скрининга библиотек антител, но не ограничиваясь данным. Показательные антитела включают антитела, связывающиеся с поверхностными протеинами Нег2, СЭС20, СЭСЗЗ, муциноподобные гликопротеины и рецептор эпидермального фактора роста (ЕСЕЯ), присутствующие в опухолевых клетках, но не ограничиваются ими, и по выбору оказывают цистостатическое и/или цитотоксическое воздействие на клетки опухоли, проявляющие эти белки. Показательные антитела включают НЕЯСЕРТШ™ (трастузумаб), который может использоваться при лечении рака молочной железы и других форм рака, и ΡΙΤυΧΛΝ™ (ритуксимаб), ΖΕνΆΕΙΝ™ (ибритумомаб тиуксетан), СЬЕЕУЕС™ и ^ΥМРНΟСI^Ε™ (эпратузумаб), который может использоваться для лечения лимфомы не Ходжкина и других форм рака. Некоторые показательные антитела включают ЕЯΒΙΤυΧ™ (1МС-С225); эртинолиб (Иресса); ВЕХХАЯ™ (тозитумомаб йода 1З1); ингибиторы КОЯ (рецепторов домена киназы); антитела анти УЕСЕ (васкулярный эндотелиальный фактор роста) и антагонисты (например, ΑνηδΙίη™ и УЕСАЕ-ТЯАР); антитела рецептора анти УЕСЕ (васкулярный эндотелиальный фактор роста) и области связывания антигена; антитела анти-Αηд-1 и Апд-2 и области связывания антигена; антитела к Т1е-2 и другие рецепторы Аид-1 и Аид-2; лиганды Т1е-2; антитела против ингибиторов киназы Т1е-2 и СатраШ® (алемтузумаб). В некоторых примерах осуществления изобретения раковые терапевтические агенты являются полипептидами, селективно индуцирующими апоптоз в раковых клетках, включая полипептид ТЯА1Ь, относящийся к ΊΝΕ, но не ограничиваясь им.

В некоторых примерах осуществления изобретения раковые терапевтические агенты являются антиангиогенными агентами, снижающими ангиогенезис. Некоторые подобные агенты включают 1Ь-8; СатраШ; В-ЕСЕ; антагонисты ЕСЕ; антагонисты Тек (Церретти и др.) (СеггеШ е1 а1.), публикацию США № 200З/0162712; Церретти и др. (СеггеШ е! а1.), патент США № 641З9З2 и Церретти и др. (СеггеШ е! а1.), патент США № 6521424, каждый из которых включен в данную заявку путем ссылки для любой цели); агенты анти-ТАЕАК (включающие антитела и области связывания антигенов, не ограничиваясь ими); растворимые антагонисты рецептора ТАЕАК (Вилей (Айеу), патент США № 6727225); домен дисинтеграции АРАМ для антогонизации связывания интегрина с его лигандами (Фенслоу и др. (ЕагМохх е1 а1.), публикация США № 2002/0042З68); рецептор анти-ерй и антитела анти-ерЬгт; области связывания антигена или антагонисты (патенты США №№ 5981245; 572881З; 5969110; 6596852; 62З2447; 6057124 и члены их семейства патентов-аналогов); агенты анти-УЕСЕ (например, антитела или области связывания антигена, связывающие именно VΕСЕ (васкулярный эндотелиальный фактор роста) или растворимые рецепторы УЕСЕ или их области связывания лигандов), такие как Аха51т™ или УЕСЕ-ТЯАР™ и агенты рецептора анти-УЕСЕ (например, антитела или области связывания антигена, связывающиеся именно с ними), ингибирующие агенты ЕСЕЯ (например, антитела или области связывания антигена, связывающиеся именно с ними), такие как панитумумаб, 1ЯЕ88А™ (деΠ(^п^Ь), ТАЯСЕУА (ег1ойшЬ), агенты антиАмд-1 и анти-ΑNС-2 (например, антитела или области связывания антигена, связывающиеся именно с ними или с их рецепторами, например, Т1е-2/ТЕК), и агенты, ингибирующие киназу анти-Т1е-2 (например, антитела или области связывания антигена антитела, связывающиеся именно с ними и ингибирующие активность факторов роста, таких как антагонисты факторов роста гепатоцита (ФРГ, также известного как фактор рассеяния) и антитела или области связывания антигена, связывающиеся именно с рецептором с-теГ; антагонисты анти-РРСЕ-ВВ; антитела или областей связывания антигена с лигандами РРСЕ-ВВ и ингибиторы киназы РОСЕЯ, но не ограничиваются ими.

В некоторых примерах осуществления изобретения агенты раковой терапии являются ингибиторами ангиогенезиса. Некоторые подобные ингибиторы включают 8Р-7784 (РШег США); циленгитид (Мегск КСаА, Германия, ЕПВ 770622); октанатрий пегаптаниб, (Сйеаб 8^1^5, США); альфастатин, (ВюАс1а, Великобритания); М-РСА, (Се1деге, США, и8 5712291); иломастат (АггКа, США, и8 5892112); семаксаниб (РΓ^ζе^, США, и8 579278З); ваталаниб (ШтагЩ, Швейцария); 2-метоксиэстрадиол (ЕЩгетеб, США); ТЬС ЕЬЬ-11 (Е1ащ Ирландия); ацетат анекортав (А1соп, США); а1рйа-Р148 МаЬ (Атадещ США); СЕР-7055 (СерМощ США); анти-νη МаЬ (Сгисе11, Нидерланды); РАС: антиангиогенный (СоищСйет, Канада); ангиоцидин (ΙηΚίικ РНагтасеиНсаЕ США); КМ-2550 (Куо^а Накко, Япония); 8υ-0879 (РΓ^ζе^. США); ССР-79787 (ХохаПш Швейцария, ЕР 970070); технология АЯСЕКТ (Апаб, США); ®’1С:8И-81еа1111 (7о11П5оп & 1оЬп5оп, США); фрагмент фибриногена - Е (ВюАс1а, Великобритания); ингибитор ангиогенезиса (Тадеи Великобритания); ТВС-16З5 (Εηсу5^νе Рйагтасеийсак, США); 8С-2З6 (РШег США); АВТ567 (АЬЬой, США), метастатин (ЕЩгеМеб, США); ингибитор ангиогенезиса (Тпрер, Швеция); маспин (8о5е1, Япония); 2-метоксиэстрадиол (Опсо1о§у 8аег1се5 Сотрою!^, США); ЕЯ-6820З-00 (ШАХ, США);

- 27 015363 бенефин (Ьапе ЬаЬк, США); Τζ-93 (Ткитига, Япония); ΤΑΝ-1120 (Такеба, Япония); ЕР-111142 (Рнрвата, Япония, ДР 02233610); плателет фактор-4 (Кер1Юеп, США, ЕР 407122); антагонист васкулярного эндотелиального фактора роста (Вогеап, Дания); раковая терапия (Университет Южной Каролины, США); бевацизумаб (ρΙΝΝ) (Сепе1есй, США); ингибиторы ангиогенезиса (δυΟΕΝ, США); ХЬ 784 (ЕхейхЦ, США); ХЬ 647 (Ехе11х18, США); МаЬ, альфа5бета3 интегрин, второе поколение (Лррйеб Мо1еси1аг Его1нйоп, США и Меб1ттипе, США); генная терапия, ретинопатия (ОхГогб ВюМебюа, Великобритания); гидрохлорид энзастаурина (υδΑΝ), (Ь111у, США); СЕР 7055 (Серйа1оп, США и 8апоД-8уп1йе1аЬо, Франция); ВС 1 (Генуэзский институт раковых исследований, Италия); ингибитор ангиогенезиса (^10^11113, Австралия); антагонист УЕСР (Реде пего п, США); гВР1 21 и ВР1-производный антиангиогенетик (ХОМА, США); ΡΙ 88 (Ргодеп, Австралия); циленгитид (ρΙΝΝ) (Мегск ΚΟπΑ, Германия; Мюнхенский технический университет, Германия; Зспррк Сйшс апб Кекеагсй Роипбайоп, США); цетуксимаб (ΙΝΝ) (ΑτόμΙΝ, Франция); ΑΥΈ 8062 (Α^^ηοтοΐο, Япония); Αδ 1404 (Раковая исследовательская лаборатория, Новая Зеландия); δΟ 292 (Те11О8, США); эндостатин (Детская клиника Бостона, США); ΑΤΝ 161 США);

ЛNС!ОδΤЛΤ!N (Детская клиника Бостона, США); 2-метоксиэстрадиол, (Детская клиника Бостона, США); ΖΌ 6474 (Л8ί^аΖеηеса, Великобритания); ΖΌ 6126 ^пдюдепе Рйагтасеийсак, Великобритания); ΡΡΙ 2458 (РгаесЦСША); ΑΖΌ 9935 (Л8ί^аΖеηеса, Великобритания), ΑΖΌ 2171 (Л8ί^аΖеηеса, Великобритания), ваталаниб (ρΙΝΝ) (Nονа^ί^8, Швейцария и δθ^ππ§ ΑΟ, Германия); ингибиторы пути тканевого фактора (ЕпПеМеб, США); пегаптаниб (Р1пп) (СНеаб δ^ι^δ, США); ксанторризол (Уоп§е1 ипКе^ку, Южная Корея); вакцина, базирующаяся на гене, УЕСР - 2 (δαίρρδ С1шю апб Кекеагсй Роипбайоп, США); δΡν5.2, (δиρ^аΐек, Канада); δϋΧ 103 (Университет Калифорнии в Сан-Диего, США); РХ 478 (Рго1Х, США); метастатин (ЕпПеМеб, США); тропонин Ι (Гарвардский Университет, США); δυ 6668 (8иСЕ^ США); ОXI 4503 (ОХЮЕИЕ, США); о-гуанидины (И1теп8юпа1 РйагтасеийсаЬ, США); мотупорамин С (Университет Британской Колумбии, Канада); СИР 791 (СеШесй Сгои]!, Великобритания); атипримод (ρΙΝΝ), (С1аxοδт^ΐйΚ1^ηе, Великобритания); Е 7820 (ЕБаг Япония); СУС 381 (Гарвардский университет, США); АЕ 941 (Αеΐета, Канада); вакцина, ангиогенезис (ЕпПеМеб, США); ингибитор активатора плазминогена урокиназы (Иепбгеоп, США); оглуфанид (ρΙΝΝ) (Ме1тоЯее, США); ингибиторы ШР-1 альфа (Xеηονа, Великобритания); СЕР 5214 (Сеρйа1οη, США); ВΑΥ №δ 2622 (Вауег, Германия); ангиоцидин ДпКте, США); А6 ^пд^от, США), КК 31372 (Корейский исследовательский институт химической технологии, Южная Корея); С\У 2286 (С1аxοδт^ίйΚ1^ηе, Великобритания); ЕНТ 0101 (ЕхопНй, Франция); СР 868596 (Р&ег, США); СР 564959 (ОЗЕ США); СР 547632 (Р&ег, США); 786034 (С1аxοδт^ΐйΚ1^ηе, Великобритания); ΚΡΝ 633 (Киш Вге^егу, Япония); система доставки лекарств, интраокулярная, 2метоксиэстрадиол (ЕпНеМеб, США); ангинекс (Маастрихтский университет, Нидерланды и Университет Миннесоты, США); ΑΕΤ 510 (ΑЬЬοΐ, США); ΑΑΤ 993 (Nονа^ί^8, Швейцария); УЕС (Р^οΐеοтΤесй, США); ингибиторы альфа-фактора некроза опухоли (Национальный институт старения, США); δυ 11248 (Р&ег, США и δυСΕN υδΑ); ΑΕΤ 518 ^ЬЮ!, США); УН16 (УапЮ КопдсЬапд, Китай); δ-3ΑРС (Бостонский детский госпиталь, США и ЕпНеМеб, США); МΑЬ, КИК (ЗтОопе δу8ΐет8, США); альфа5бета1 (Рго1е1п Иеыдп, США); КИК ингибитор киназы (СеШесй ΟϊΌνιρ., Великобритания и .Гойпкоп & .Гойпкоп, США); СРВ 116 (Университет Южной Флориды, США и Йельский университет, США); Сδ 706, (Яапкуо, Япония); пролекарство комбретастатин Α4 (Государственный университет Аризоны, США); хондроитиназа ΑС ЦВЕХ, Канада); ВΑΥ №δ 2690 (Вауег, Германия); ΑСМ 1470 (Гарвардский университет, США, Такеда, Япония и ТАР, США); ΑΟ 13925 ^дотоп, США); тетратиомолибдат (Университет Мичигана, США); ΟΕ’δ 100 (Вейнский государственный университет, США); СУ 247 (Гуу Меб1са1, Великобритания); СКИ 732 (СЬопд Кип Иапд, Южная Корея); МΑЬ, васкулярный эндотелиальный фактор роста, (Xеηονа, Великобритания); ирзогладин (ΙΝΝ) (N^ρροη δй^ηуаки, Япония); КС 13577 (ΑτόμΙΝ, Франция); \УХ 360 (^йех, Германия); скваламин (ρΙΝΝ), (Сепаега, США); КР! 4610 (Ыгпа, США); раковая терапия (Ма^^ηονа, Австралия); ингибиторы гепараназы (ИЮЩИЕ Израиль); КЬ 3106 (Ко1оп, Южная Корея); гонокиол (Университет Эмори, США); ΖΚ СИК №с11еппд ΑΠ Германия); ΖΚ №с11еппд ΑΠ Германия);

ΖΚ 229561 (Nονа^ί^8, Швейцария и δθκππ§ ΑΠ Германия); ХМР 300 (ХОМА, США); УСΑ 1102 (ИаЮю, Япония); модуляторы рецептора УЕСР (Рйа^тасορе^а. США); антагонисты УЕ-кадгерин-2 (ЗтОопе δνδ1етк, США); вазостатин (Национальные институты здоровья, США); вакцина, Р1к-1 (ЗтОопе δу8ΐет8, США); ΤΖ 93 (Τ^πιπιπ, Япония); Τитδΐаΐ^η (Ве!й ЬпШ Но^Пай США); усеченный растворимый РЕ-Τ 1 (васкулярный эндотелиальный фактор роста рецептора 1) (Мегск&Со, США); Ие-2 лиганды (Кедепегоп, США); ингибитор тромбомпондин 1 ^НедЬему НеаИй, Ебисайоп апб Кекеагсй Роипбайоп, США); 2бензолсульфонамид, 4-(5-(4-хлорофенил)-3-(трифторометил)-1Н-пиразол-1-ил)-; ΑΓΓίνη и С-Ме!. ΑΥΈ 8062 ((2δ)-2-амино-3-гидрокси-N-[2-метокси-5-[(1Ζ)-2-(3,4,5-триметоксифенил)этенил)]ρ хенил]пропанамид моногидрохлорид); меттелимумаб (ρΙΝΝ) (иммуноглобулин С-4, анти(человеческий трансформирующий фактор роста, бета 1 (человеческая моноклональная СΛΤ 192. гамма.4-цепь), дисульфид с человеческим моноклональным димером СЛΤ 192.каппа.-цепи); лиганд Р1!3; СИ40 лиганд; интерлейкин-2; интерлейкин-12; 4-1ВВ лиганд; антитела анти-4-1ВВ; антагонисты ЕУ и антагонисты рецептора ΤΝΕ, включающие ΤNРК/Ес, антагонисты Τ\VΕЛI< и Τ^ΕΑΚ-К, включая Τ\VΕЛI<-К./Ес; ΤΕΑΙΕ; антагонисты УЕСР, включая антитела анти-УЕСР; антагонисты рецептора УЕСР (включая УЕСР-К1 и УЕСР-К2, также известные как Р1И и Р1к1 или КИК); антагонист СИ 148 (также называемые ИЕР-1, ЕСКГР и

- 28 015363

РТРЮ, см. Такаши и др. (ТакайакЫ е! а1.), Журнал американского общества нефрологии (1. Ат. 8ос. ЫерЬго1.), 10:2135-45 (1999), включенный в данную заявку путем ссылки для любой цели); ингибитор тромбоспондин 1 и ингибиторы одного или обоих Т1е-2 или Т1е-2 лигандов (таких как Апд-2), но не ограничиваются ими. Ряд ингибиторов Апд-2 известен в данной области, включая антитела анти-Апд-2, описанные в опубликованной заявке на патент США № 20030124129 (соответствующей заявке РСТ № \νϋ 03/030833) и в патенте США № 6166185, содержание которых включено в данную заявку полностью путем ссылки. Дополнительно, в данной области также хорошо известны пептидные тела Апд-2 и они могут быть найдены в опубликованной заявке на патент США № 20030229023 (соответствующей заявке РСТ № νθ 03/057134) и опубликованной заявке на патент США № 20030236193, содержание которых включено в данную заявку полностью путем ссылки.

Некоторые раковые терапевтические агенты включают талидомид и аналоги талидомида (N-(2,6диоксо-3-пиперидил)фталамид); текогалан натрия (сульфатированный полисахарид пептидогликана); ТАN 1120 (8-ацетил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-10-[(октагидро-5-гидрокси-2-(2гидроксипропил)-4,10-диметилпирано [3,4-б]-1,3,6-диоксазоцин-8-ил]окси]-5,12-нафтаценедион); сурадиста (7,7'-[карбонил-бис-[имино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2диил)карбонилимино]]-бис-1,3-тетранатиевая соль нафталендисульфоновой кислоты); 8и 302; 8и 301; 8И 1498 ((Е)-2-циано-3-[4-гидрокси-3,5-бис-(1-метилэтил)фенил]-№(3-фенилпропил)-2пропенамид); 8и 1433 (4-(6,7-диметил-2-хиноксалинил)-1,2-бензолодиол); 8Т 1514; 8В 25989; растворимый Т1е-2; производные 8ЕВМ, Рйагток; семаксаниб (рШ^(3-[(3,5-диметил-1Н-пиррол-2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2Ниндол-2-он); 8 836; ВС 8803; ΒΕ8ΉΝ; В 440(3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-(1-метил-6-нитро-1Н-индол-3ил)-1Н-пиррол-2,5-дион); В 123942 (1-[6-(1,2,4-тиадиазол-5-ил)-3-пиридазинил]-№[3-(трифторометил)фе нил]-4-пиперидинамин); ингибитор пролил гидроксилазы; высокие гены прогрессии; приномастат (ΙΝΝ) ((8)-2,2-диметил-4-[[р-(4-пиридилокси)фенил]сульфонил]-3-тиоморфолинкарбогид роксамовая кислота); Νν 1030; ΝΜ 3 (8-гидрокси-6-метокси-альфа-метил-1-оксо-1Н-2-бензопиран-3-уксусная кислота); ΝΡ 681; ΝΡ 050; М1С; МЕТН2; МЕТН1; манассантин Β (альфа-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-диметоксифенил)-2гидрокси-1-метилэтокси]-3-метоксифенил]тетрагидро-3,4-диметил-2-фуранил]-2-метоксифенокси]этил]1,3-бензодиоксол-5-метанол); КЭВ моноклональное антитело; альфа5бета3 моноклональное антитело интегрин; ЬУ 290293 (2-амино-4-(3-пиридинил)-4Н-нафтол[1,2-Ь]пиран-3-карбонитрил); КР 0201448; КМ 2550; интегрин специфические пептиды; INСN 401; СУК1 66475; СУК1 66462; гринстатин (101-354плазминоген (человеческий)); генная терапия для ревматоидного артрита, рака простаты, рака яичников, глиомы, эндостатина, колоректального рака, АТЕ ВТР1, антиангиогенезависимые гены, ингибитор ангиогенезиса или ангиогенезис; ингибитор желатиназы; ЕВ 111142 (5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2.5]окт-6-ил эфир 4,5-дегидрокси-2-гексеновой кислоты); форфенимекс (ρΙΝΝ) (8)-альфа-амино-3-гидрокси-4-(гидроскиметил)бензолоуксусная кислота); антагонист фибронектина (1-ацетил-Е-пролил-Е-гистидил-Е-серил-Е-цистеинил-Е-аспартамид); ингибитор рецептора фактора роста фибробласта; антагонист фактора роста фибробласта; ЕСЕ 27164 гексанатриевая соль (7,7'[карбонил-бис-[имино(1-метил)-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиролл-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,5-нафталинтрисульфоновой кислоты); ЕСЕ 26752 (8,8'-[карбонил-бис-[имино(1метил-1Н-пиролле-4,2-диил)карбонилимино(1 -метил)-1Н-пирроле-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,6нафталинтрисульфоновая кислота; эндотелиальный полипептид II, активирующий моноциты; VΕСЕΒ антисенсорный олигонуклеотид; антиангиогенный и трофический факторы; АNСНΟΒ ангиостатический агент; эндостатин; Эе1-1 ангиогенный белок; СТ 3577; конторстатин; СМ 101; хондроитиназа АС; СОР-845; Сап8!айп; В8Т 2002; В8Т 2001; ВЬ8 0597; ΒΙΒΕ 1000; АВВЕ8ТШ; апомигрен (коллаген XV типа 1304-1388 (предшественник человеческого гена СОЬ 15А1 цепи альфа1); ангиоингибин; ааАТШ, А 36; 9альфа-фторомедроксипрогестерон ацетат ((6-альфа)-17-(ацетокси)-9-фторо-6метил-прегн-4ин-3,20 дион); 2-метил-2-фталимидоглутаровая кислота (2-(1,3-дигидро-1-оксо-2Н-изоиндол-2-ил)-2метилпентанедионовая кислота; моноклональное антитело Β^1, меченное иттрием 90; семаксаниб (3(4,4-диметилпиррол-2-илметилен)индолин-2-он)(С15Н14 Ν2 О); Р1 88 (фосфоманнопентаоз сульфат); альвоцидиб (4Н-1-бензопиран-4-он),2-(2-хлорофенил)-5,7-дигирокси-8-(3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил)-цис-(-)-)(С21Н20 С1 Ν О5); Е 7820; 8и 11248 (5-[3-фторо-2-оксо-1,2-дигидроиндол-(32)илидинметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксиловая кислота (2-диэтиламиноэтил)амид) (С22 Н27 Е Ν4 О2); скваламин (холестан-7,24-диол,3-[[3-[(4-аминобутил)аминопропил]амино]-, 24-(сульфат водорода), (3.бета.,5.альфа.,7.альфа.)-) (С34 Н65 Ν3 О58); эриохром черный Т; АСМ 1470 (карбаминовая кислота, (хлороацетил)-, 5-метокси-4-[2-метил-3 -(3 -метил-2-бутенил)оксиранил]-1 -оксаспирол[2,5]окт-6-ил эфир, [3В[3альфа, 4альфа(2В, 3В), 5бета, 6бета]]) (С19 Н28 С1 Ν О6); ΛΖΙ) 9935; ΒΙΒΕ 100; ΛΖΙ) 2171; АΒТ 828; К8-интерлейкин-2; утероглобин; А 6; Ν8ϋ 639366 (1-[3-(диэтиламино)-2гидроксипропиламино]-4-(оксиран-2-илметиламино)антрахинон фумерат) (С24 Н29 Ν3 О4.С4 Н4 О4); Ι8ν 616; анти-ЕЭ-В слитые белки; НШ 77; тропонин I, Βί.’-1 моноклональное антитело; 8РV 5.2; ЕВ 68203; СКЭ 731 (3-(3,4,5-триметоксифенил)-2(Е)-пропеновая кислота (3В,48,58,6В)-4-[2(В)-метил-3(В)3(В)(3-метил-2-бутенил)оксиран-2-ил]-5-метокси-1-оксаспирол[2.5]окст-6-ил эфир) (С28 Н38 О8); [МС1С11; ааАТШ; 8С 7; СМ 101; ангиокол; крингле 5; СКЭ 732 (3-[4-[2-диметиламино)этокси]фенил]-2(Е)пропеновая кислота) (С29 Н41 Ν О6); и 995; канстатин; 80 885; СТ 2584 (1-[11-(додециламино)-10- 29 015363 гидроксиундецил]-3,7-диметилксантин) (С30 Н55 N5 О3); салмозин; ЕМАР II; ТХ 1920 (1-(4метилпиперазино)-2-(2-нитро-1Н-1-имидазоил)-1-этанон) (С10 Н15 N5 О3); ингибитор альфа-у-бета-х; СН1В 11509 (№1-пропинил)глицил-[№(2-нафтил)]глицил-^[-(карбамоилметил)]глицин бис-(4-метксифенил)метиламид) (С 36 Н37 N5 О6); В8Т 2002; В8Т 2001; В 0829; ЕВ 111142; 4,5-дигидрокси-2(Е)гексеновая кислота (3В,48,58,6В)-4-[1(В),2(В)-эпокси-1,5-диметил-4-ксенил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]октан-6-ил эфир (С 22 Н34 О7) и ингибиторы киназы, включая №(4-хлорфенил)-4-(4пиридинилметил)-1-фталазинамин; 4-[4-[[[[4-хлоро-3-(трифторометил)фенил]амино]карбонил]амино]феноксил]-И-метил-2-пиридинкарбоксамид; №[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фторо-1,2-дигидро-2-оксо-3Ниндол-3 -илидин)метил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -карбоксамид; 3 -[(4-бромо-2,6-дифторофенил)метокси5-[[[[4-1-пирролидинил)бутил]амино]карбонил]амино]4-изотиазолкарбоксамид; №(4-бромо-2-фторофенил)-6-метокси-7-[(1-метил-4-пиперидинил)метокси]-4-хиназолинамин; 3 -[5,6,7,13 -тетрагидро-9-[(1 метилэтокси)метил]-5-оксо-12Н-индено[2,1-а]пирроло[3,4-с]карбазол-12-ил]пропил эфир Ν,Ν-диметилглицин; №[5-[[[5-(1,1-диметилэтил)2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид; N-[3хлоро-4-[(3-фторофенил)метокси]фенил]-6-[5-[[[2-метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин; 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-Ы-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]аминофенил] бензамид; №(3-хлоро-4-фторофенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин; №(3-этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин; №(3-((((2В)-1-метил-2-пирролидинил)метокси)окси)-5-(трифторометил)фенил)2-((3-(1,3-оксазол-5-ил)фенил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-(((4-фторофенил)метил)амино)-И-(3-((((2В)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторометил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; №[3-(азетидин-3-илметокси)-5-трифторометилфенил]-2-(4фторобензиламино)никотинамид; 6-фторо-И-(4-(1-метилэтил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино-Д-|-(3-(((28)-2-пирролинил метил)окси)-5(трифторометил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; №(3-(1,1-диметилэтил)-1Н-пиразол-5-ил)-2-((4пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3,3 -диметил-2,3-дигидро-1 -бензофуран-6-ил)2-((4пиридинилметил)амино)-3-пиридикарбоксамид; №(3-((((28)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5(трифторометил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-И-(3-((2-(1-пирролидинил)этил)окси)-4-(трифторометил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N (3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4(пентафтороэтил)3-(((28)-2-пирролидинилметил)окси)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)3-пиридинкарбоксамид; №(3-((3-азетидинилметил)окси)-5-трифторометил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3пиридинкарбоксамид; №(3-(4-пиперидинилокси)-5-(трифторометил)фенил)-2-((2-(3-пиридинил)этил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; №(4,4-диметил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Ниндазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-И-[3-(1-метилпирролидин-2-илметокси)-5трифторометилфенил] никотинамид; N-[1 -(2-диметиламиноацетил)-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6ил]-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-И-[3-(пирролидин-2-илметокси)-

5- трифторометилфенил]никотинамид; №( 1-ацетил-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; №(4,4-диметил-1 -оксо-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-

6- иламино)никотинамид; №[4-(трет-бутил)-3-(3-пиперидилпропил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3- пиридил)]карбоксамид; №[5-(трет-бутил)изоксазол-3-ил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид и №[4-(трет-бутил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)карбоксамид, но не ограничиваясь ими; и ингибиторы киназы, раскрытые в патентах США №№ 6258812; 6235764; 6630500; 6515004; 6713485; 5521184; 5770599; 5747498; 5990141; публикациях США №№ И8 20030105091 и публикациях Договора о патентной кооперации №№ \¥О 01/37820; 01/32651; 02/68406; 02/66470; 02/55501; 04/05279; 04/07481; 04/07458; 04/09784; 02/59110; 99/45009; 98/35958; 00/59509; 99/61422; 00/12089 и 00/2871, каждая из которых включена в данную заявку путем ссылки для любых целей.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может вводиться до, одновременно с и после лечения агентом раковой терапии. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может вводиться профилактически для предотвращения или ослабления начала потери костей при метастатическом раке. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может вводиться для лечения существующего состояния потери костей из-за метастаз.

Примеры рака включают рак молочной железы, колоректальный рак, гастритную карциному, глиому, карциному сквазмозных клеток головы и шеи, наследственную и спорадическую папиллярную почечную карциному, лейкемию, лимфому, синдром Ли-Фроумени, злокачественную плевральную мезотелиому, меланому, множественную миелому, немалоклеточную карциному легких, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, малоклеточный рак легких, синовиальную саркому, карциному щитовидной железы и переходно-клеточный рак мочевого пузыря, но не ограничиваются ими.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может использоваться отдельно или по крайней мере с одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения рака. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может использоваться совместно с терапевтически эффективным количеством дополнитель

- 30 015363 ного терапевтического агента. Показательные терапевтические агенты, которые могут приниматься со специфическим связывающим агентом с ФРГ, включают членов семейства гелданамицинов аназамициновых антибиотиков, но не ограничиваются ими; Рго-НСР; ΝΚ2; ингибиторы пептида с-Ме1; антагониста гомологии 2 СгЬ2 8гс; модулятор СаЬ1; доминантно-отрицательный 8гс; ингибитор фон-ХиппеляЛандау, включая вортманнин, но не ограничиваясь им; ингибиторы киназы Р13, другую антирецепторную терапию, анти-ЕСРВ, ингибитор СОХ-2, Се1еЬгех™; Уюхх™; васкулярный эндотелиальный фактор роста (УЕСР), УЕСР модулятор, фибробластовый фактор роста (РСР), РСР модулятор, эпидермальный фактор роста (ЕСР); ЕСР модулятор; кератиноцитовый фактор роста (КСР), относящаяся к КСР молекула, модулятор КСР; матричный модулятор металлопротеиназы (ММР).

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ используется с определенными терапевтическими агентами для лечения разнообразных форм рака. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ используется с определенными терапевтическими агентами для лечения или профилактики малярии. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ используется с определенными терапевтическими агентами для лечения или профилактики пролиферативной диабетической ретинопатии. В некоторых примерах осуществления изобретения, принимая во внимание состояние и желаемый уровень лечения, могут назначаться два, три или более агента. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные агенты могут быть обеспечены путем включения в тот же состав. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные агенты и специфический связывающий агент с ФРГ могут быть обеспечены вместе путем включения в тот же состав. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные агенты могут быть приготовлены отдельно и обеспечены совместно путем включения в лечебный комплект. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные агенты и специфические связывающие агенты с ФРГ могут быть приготовлены отдельно и обеспечены совместно путем включения в лечебный комплект. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные агенты могут быть обеспечены отдельно. В некоторых примерах осуществления изобретения при введении с помощью генной терапии белковые агенты, кодирующие гены и/или специфические связывающие агенты с ФРГ могут включаться в тот же вектор. В некоторых примерах осуществления изобретения при введении с помощью генной терапии белковые агенты, кодирующие гены и/или специфические связывающие агенты с ФРГ могут находиться под контролем одинаковой области промотера. В некоторых примерах осуществления изобретения гены, кодирующие белковые агенты и/или специфический связывающий агент с ФРГ, могут находиться в отдельных векторах.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает фармацевтические композиции, включающие специфический связывающий агент с ФРГ вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом.

В некоторых примерах осуществления изобретения изобретение предусматривает фармацевтические композиции, включающие специфический связывающий агент с ФРГ и терапевтически эффективное количество по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом.

В некоторых примерах осуществления изобретения настоящее изобретение направлено на терапию, включающую специфический связывающий агент с ФРГ и по крайней мере один ингибитор протеазы серина и способы лечения при использовании подобной терапии. В некоторых примерах осуществления изобретения терапия включает специфический связывающий агент с ФРГ и ингибитор протеазы серина и по крайней мере одну дополнительную молекулу, описанную в данной заявке.

В некоторых случаях нарушение баланса протеазы/ингибитора протеазы может привести к спровоцированному протеазой разрушению ткани, включая опухолевую инвазию нормальной ткани, приводящую к метастазам, но не ограничивается данным.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может использоваться по крайней мере с одним терапевтическим агентом для лечения воспалений. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ может использоваться по крайней мере с одним терапевтическим агентом для лечения иммунных расстройств. Показательные терапевтические агенты для лечения воспалений и иммунных расстройств включают циклооксигеназу тип 1 (СОХ-1) и циклооксигеназу тип 2 (СОХ-2), ингибиторы модуляторов малых молекул митогенно активированной киназы белка 38 кДа (р38МАРК), но не ограничиваются ими; модуляторы малых молекул внутриклеточных молекул, вовлеченных в воспалительные пути, отличающиеся тем, что подобные внутриклеточные молекулы включают _)пк, 1КК, NР-кΒ, ΖΑΓ70 и 1ск, но не ограничиваются ими. Некоторые показательные терапевтические агенты для лечения воспалений описаны, например, в Динарелло С.А. и Молдавер Л.Л. (С.А. Итаге11о апй Ь.Ь.Мо1йа^ег). Провоспалительные и антивоспалительные цитокины при ревматоидном артрите: учебник для клиницистов (РготПатшаЮгу апй Апй1пГ1атта1огу СуЮктез ίη Ркеита1о1й ΑγΙΠγιΙικ: А Рптег £ог С11п1с1апз), 3-е изд., (2001) Эмген Инк. (Атдеп 1пс.) Саузенд Оукс (Ткоизапй Оакз), Калифорния.

В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтические композиции будут включать

- 31 015363 более одного специфического связывающего агента с ФРГ. В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтические композиции будут включать более одного специфического связывающего агента с ФРГ, отличающегося тем, что специфические связывающие агенты с ФРГ связывают более одного эпитопа.

В некоторых примерах осуществления изобретения приемлемые вещества составов предпочтительно нетоксичны для реципиентов при используемых дозах и концентрациях.

В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтические композиции будут включать вещества состава для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, чистоты, цвета, изотонности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проникновения композиции. В некоторых примерах осуществления изобретения приемлемые вещества состава включают аминокислоты (такие как глицин, глютамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные вещества; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты); наполнители (такие как маннитол или глицин); хелатообразователи (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ΈΌΤΛ)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие карбогидраты (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, отдушки и растворяющие агенты; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); полипептиды с низким молекулярным весом; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как бензалкониум хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или гидропероксид); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннитол или сорбитол); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или увлажняющие агенты (такие как плюрониловые гели, полиэтиленгликоль (РЕО), сорбитановые эфиры, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерол, тилоксапал); усиливающие стабильность агенты (такие как сахароза или сорбитол); усиливающие тонус агенты (такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, сорбитол маннитола); средства доставки; растворители; инертные наполнители и/или фармацевтические адъюванты, но не ограничиваются ими (Фармацевтические науки Ремингтон (ЯеттЛп'з Рйагтасеибса1 Заепсез), 18-е изд., А.Р. Дженнаро (А.Я. Оеппаго), издание Маск РиЬНзЫпд Сотрапу (1990).

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий с ФРГ агент и/или терапевтическая молекула связаны продлевающим период полураспада средством, известным в данной области техники. Подобные средства включают полиэтилен гликоль и декстран, но не ограничиваются ими. Подобные средства описаны, например, в заявке на патент США № 09/428082 и опубликованной заявке РСТ № νθ 99/25044, включение в данную заявку путем ссылки для любой цели.

В некоторых примерах осуществления изобретения оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистами в данной области в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозы. См., например, Фармацевтические науки Ремингтон (Кетш1оп'8 Р6агтасеибса1 8с1епсе5) там же. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость ш у1уо и скорость выведения 1п у1уо антител по данному изобретению.

В некоторых примерах осуществления изобретения первичные средства или носители в фармацевтической композиции могут быть по своей природе либо водными, либо безводными. Например, в некоторых примерах осуществления изобретения приемлемое средство или носитель могут быть водой для инъекции, физиологическим солевым раствором или искусственной спинно-мозговой жидкостью, возможно дополненными другими общими по составу веществами для парентерального приема. В некоторых примерах осуществления изобретения нейтральный буферизированный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, являются дальнейшими показательными средствами доставки. В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтические композиции включают буфер Тпз с рН около 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН около 4,0-5,5, которые далее могут включать сорбитол или его приемлемый заменитель. В некоторых примерах осуществления изобретения композиция, включающая специфический связывающий агент с ФРГ, по крайней мере с или без одного терапевтического агента, могут быть приготовлены для хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с дополнительными агентами для приготовления состава (Фармацевтические науки Ремингтон (ЯеттЛп'з Рйагтасеибса1 Заепсез, там же)) в форме лиофилизированного брикета или водного раствора. Далее, в некоторых примерах осуществления изобретения композиция, включающая специфический связывающий агент с ФРГ, по крайней мере с или без одного терапевтического агента, могут быть приготовлены как лиофилизат, используя соответствующие инертные наполнители, такие как сахароза.

В некоторых примерах осуществления изобретения композиции по данному изобретению могут быть выбраны для парентеральной доставки. В некоторых примерах осуществления изобретения компо

- 32 015363 зиции могут быть выбраны для вдыхания или для доставки через пищеварительный тракт. как. например. перорально.

Приготовление подобных фармацевтически приемлемых композиций находится в рамках известного уровня.

В некоторых примерах осуществления изобретения компоненты состава присутствуют в концентрациях. которые приемлемы для места введения. В некоторых примерах осуществления изобретения используются буферы для поддержания композиции на физиологическом рН или слегка более низком рН. обычно в рамках диапазона рН от около 5 до около 8.

В некоторых примерах осуществления изобретения. когда предусматривается парентеральное введение. фармацевтическая композиция может быть в форме безпирогенного. парентерально приемлемого водного раствора. включающего желаемый специфический связывающий агент с ФРГ. с дополнительными терапевтическими агентами или без них. в фармацевтически приемлемом наполнителе. В некоторых примерах осуществления изобретения наполнитель для парентеральной инъекции является стерильной дистиллированной водой. в которой специфический связывающий агент с ФРГ. по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента. приготовлен в качестве стерильного. изотонного. должным образом сохраненного раствора. В некоторых примерах осуществления изобретения приготовление может включать составление желаемой молекулы с помощью агента. такого как вводимые микросферы. биоэродирующие частицы. полимерные соединения (такие как полимер молочной кислоты или полигликолиевая кислота). гранулы или липосомы. способные обеспечить контролируемое или устойчивое высвобождение продукта. который затем может быть доставлен путем инъекции вещества замедленного всасывания. В некоторых примерах осуществления изобретения может также использоваться гиалуроновая кислота. которая может способствовать обеспечению устойчивой продолжительности при циркуляции. В некоторых примерах осуществления изобретения для введения желаемой молекулы могут использоваться имплантируемые устройства доставки лекарств.

В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтическая композиция может быть приготовлена для ингаляции. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ. по крайней мере с или без одного терапевтического агента. может быть приготовлен в виде сухого порошка для вдыхания. В некоторых примерах осуществления изобретения раствор для ингаляции. включающий специфический связывающий агент с ФРГ. по крайней мере с или без одного терапевтического агента. может быть приготовлен с диспергатором для аэрозольной доставки. В некоторых примерах осуществления изобретения растворы могут быть распылены. Пульмонарное введение далее описано в заявке РСТ № РСТ/ИБ 94/001875. в которой описывается пульмонарная доставка химически модифицированных белков.

В некоторых примерах осуществления изобретения предусматривается. что составы могут приниматься перорально. В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ. по крайней мере с или без одного вводящегося подобным образом терапевтического агента. может быть составлен с или без носителей. обычно используемых при составлении твердых лекарственных форм. таких как таблетки или капсулы. В некоторых примерах осуществления изобретения капсула может быть сконструирована для высвобождения активной части состава в точке желудочно-кишечного тракта тогда. когда биологическая усвояемость доведена до максимума и предсистемная деградация сведена к минимуму. В некоторых примерах осуществления изобретения по крайней мере один дополнительный агент может быть включен для упрощения адсорбции специфического связывающего агента с ФРГ и/или любого дополнительного терапевтического агента. В некоторых примерах осуществления изобретения могут также использоваться растворители. отдушки. воски с низкой точкой плавления. растительные масла. смазки. суспендирующие агенты. размельчающие таблетки агенты и связки.

В некоторых примерах осуществления изобретения фармацевтическая композиция может включать эффективное количество специфического связывающего агента с ФРГ. по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента. в смеси с нетоксическими наполнителями. приемлемыми для изготовителей таблеток. В некоторых примерах осуществления изобретения при растворении таблеток в стерильной воде или другом приемлемом растворителе растворы могут быть приготовлены в форме унифицированной стандартной дозы. В некоторых примерах осуществления изобретения приемлемые наполнители включают инертные растворители. такие как карбонат кальция. карбонат натрия или бикорбанат. лактозу или фосфат кальция; или такие связывающие агенты. как крахмал. желатин или акация; или смазывающие агенты. такие как стеарат магния. стеариновая кислота или тальк. но не ограничиваются ими.

Дополнительные фармацевтические композиции будут очевидны специалистам в данной области. включая составы. содержащие специфические связывающие агенты с ФРГ. по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента. в устойчивых составах или составах с контролируемой доставкой. В некоторых примерах осуществления изобретения специалистам в данной области также известны методики для составления других разнообразных устойчивых средств или средств с контролируемой доставкой. таких как липосомные носители. биоэродируемые микрочастицы или пористые гранулы и депоинъекций. См.. например. заявку РСТ № РСТ/иБ 93/00829. в которой описывается кон

- 33 015363 тролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. В некоторых примерах осуществления изобретения препараты устойчивого высвобождения могут включать полунепроницаемые полимерные матрицы в форме фигурных изделий, например пленок или микрокапсул. Матрицы с устойчивым высвобождением могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (И8 3773919 и ЕР 058481), сополимеры Ь-глютаминовой кислоты и гамма этил-Ь-глютамат (Сидман и др. (81бтап е! а1.), Биополимеры (Вюро1утегк), 22:547-556(1983)), поли (2-гидроксиэтил-метакрилат) (Лангер и др. (Ьапдег е! а1.), Журнал биомедицинских материальных ресурсов (1. Вютеб. Ма!ег. Век.), 15:167-277 (1981) и Лангер (Ьапдег), СНет. ТесН., 12:98-105 (1982)), этиленвинилацетат (Лангер и др. (Ьапдег е! а1.), там же) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988). В некоторых примерах осуществления изобретения композиции с устойчивым высвобождением могут также включать липосомы, которые могут быть приготовлены любым из нескольких способов, известных в данной области. См., например, Эпштейн и др. (Еррк!ет е! а1.), Труды академии естественных наук США (Ргос. №!1. Асаб. 8οΐ И8А), 82:3688-3692 (1985); ЕР 036676; 088046 и 143949.

Фармацевтические композиции, предназначенные для введения ίπ у1уо, обычно являются стерильными. В некоторых примерах осуществления изобретения это может быть выполнено путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. В некоторых примерах осуществления изобретения, когда композиция является лиофилизированной, стерилизация с использованием этого способа может проводиться либо до, либо после лиофилизации и воспроизведения. В некоторых примерах осуществления изобретения композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизированной форме или в растворе. В некоторых примерах осуществления изобретения парентеральные композиции обычно помещаются в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например мешок с внутривенным раствором или пробирка, имеющая крышку, протыкаемую гиподермической инъекционной иглой.

В некоторых примерах осуществления изобретения, как только фармацевтическая композиция была приготовлена, она может храниться в стерильных пробирках в качестве раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидрированного или лиофилизированного порошка. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные составы смогут храниться либо в готовой к использованию форме или в форме (например, лиофилизированной), которая восстанавливается перед введением.

В некоторых примерах осуществления изобретения настоящее изобретение направлено на комплекты для создания однодозовой единицы введения. В некоторых примерах осуществления изобретения комплекты могут, каждый, содержать как первый контейнер, имеющий высушенный белок, так и второй контейнер, имеющий водный состав. В некоторых примерах осуществления изобретения включаются комплекты, содержащие единые и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, жидкостные шприцы и лиошприцы).

В некоторых примерах осуществления изобретения эффективное количество фармацевтической композиции, включающей специфически связывающий агент с ФРГ, по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, подлежащего терапевтическому использованию, будет зависеть, например, от терапевтического контекста и целей. Специалист в данной области поймет, что приемлемые уровни доз для лечения в соответствии с некоторыми примерами осуществления изобретения будут таким образом меняться частично в зависимости от доставленной молекулы, для которой используется специфический связывающий агент с ФРГ, с или без одного дополнительного агента, пути введения и размера (вес тела, поверхность тела или размер органа) и/или состояния (возраст и общее состояние здоровья). В некоторых примерах осуществления изобретения клиницист может титровать дозу и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. В некоторых примерах осуществления изобретения типичная доза может колебаться в диапазоне от около 0,1 мкг/кг до около 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. В некоторых примерах осуществления изобретения доза может колебаться в диапазоне от 0,1 мкг/кг до около 100 мг/кг; или 1 мкг/кг до около 100 мг/кг; или 5 мкг/кг до около 100 мг/кг.

В некоторых примерах осуществления изобретения частота приема доз будет учитывать фармакокинетические параметры специфического связывающего агента с ФРГ и/или любых дополнительных терапевтических агентов в используемом составе. В некоторых примерах осуществления изобретения клиницист будет назначать композицию до тех пор, пока не достигается доза, которая дает желаемый эффект. В некоторых примерах осуществления изобретения композиция может поэтому назначаться как отдельная доза или как две или более доз (которые могут содержать или не содержать тоже количество желаемой молекулы) в течение времени, или в качестве непрерывной инфузии через имплантационное устройство или катетер. Дальнейшее уточнение приемлемой дозы обычно делается специалистами в данной области и входит в объем обычно выполняемых ими задач. В некоторых примерах осуществления изобретения соответствующие дозы могут быть уточнены через использование соответствующих данных о дозовом отклике.

В некоторых примерах осуществления изобретения путь введения фармацевтической композиции согласуется с известными способами, например перорально, с помощью инъекций путем внутривенного, внутрибрюшинного, внутрицеребрального (внутрипаренхимального), внутрицеребровентрикулярного, внутримышечного, внутриокулярного, внутриартериального, внутриворотновенного или интралезионно

- 34 015363 го введения; с помощью системы устойчивого высвобождения или имплантационных устройств. В некоторых примерах осуществления изобретения композиции могут быть введены путем инъекции ударной дозы вещества, или непрерывно путем инфузии, или путем имплантационного устройства.

В некоторых примерах осуществления изобретения композиция может вводиться локально, путем имплантации мембраны, губки или другого соответствующего материала, на который была абсорбирована или заключена в капсулу желаемая молекула. В некоторых примерах осуществления изобретения, где используется имплантационное устройство, устройство может быть имплантировано в любую приемлемую ткань или орган, и доставка желаемой молекулы может происходить через диффузию, введение ударной дозы с синхронизированным высвобождением или непрерывное введение.

В некоторых примерах осуществления изобретения может быть желательным использовать фармацевтическую композицию, включающую специфический связывающий агент с ФРГ, по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, способом ех νί\Ό. В некоторых подобных случаях клетки, удаленные из пациента ткани, и/или органы подвергаются воздействию фармацевтической композиции, включающей специфический связывающий агент с ФРГ, по крайней мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, после чего клетки, ткани и/или органы затем обратно имплантируются пациенту.

В некоторых примерах осуществления изобретения специфический связывающий агент с ФРГ и/или любые дополнительные терапевтические агенты могут быть доставлены путем имплантации некоторых клеток, которые подвергались генной инженерии, используя способы, подобные описанным здесь, для экспрессии и секреции полипептидов. В некоторых примерах осуществления изобретения подобные клетки могут быть клетками животного или человека и могут быть аутогенными, гетерогенными или ксеногенными. В некоторых примерах осуществления изобретения клетки могут быть иммортализованы. В некоторых примерах осуществления изобретения для того, чтобы снизить шанс иммунологического отклика, клетки могут быть заключены в капсулу для избежания инфильтрации окружающих тканей. В некоторых примерах осуществления изобретения материалы для заключения в капсулу обычно являются биосовместимыми, полупроницаемыми оболочками или мембранами, которые позволяют осуществлять высвобождение протеинового продукта(-ов), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой человека или другими пагубными факторами окружающих тканей.

Примеры

Следующие примеры, включая проведенные эксперименты и полученные результаты, представлены только для иллюстрации и не могут толковаться как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Генерация гибридом анти-ФРГ.

Антитела к ФРГ индуцировались в мышах ХепоМои8е® (АЬдешх, Фремонт, Калифорния), которые являются мышами, содержащими гены иммуноглобулина человека. Три группы мышей ХепоМои8е, группы 1а, 1б и 2 использовались для производства антител к ФРГ и они обобщены в табл. 1. Группа 1а состояла из мышей ХепоМои8е® штамм ХМО2, производящих полностью человеческие антитела 1дО2_К. Мыши группы 1а были иммунизированы ФРГ. ФРГ был приготовлен, используя стандартные рекомбинантные методики, с использованием последовательности, приведенной в Накамура и др. Щакатига е! а1.), Природа Ща!иге), 342:440-443 (1989).

Группа 1б также состояла из мышей ХепоМои8е® штамм ХМО2, но мыши группы 1б были иммунизированы ФРГ, который был химически конъюгирован до эпитопа Т-клетки (ТСЕ), имеющей последовательность: О1п Туг 11е Ьу8 А1а А8п 8ег Ьу8 Р1е 11е О1у 11е ТЬг О1и Ьеи Ьу8 Ьу8 Су8 (последовательность №: 47). ТСЕ был конъюгирован до ФРГ путем перекрестного связывания через С-концевой цистин ТСЕ с Ν-концом ФРГ, используя 8и1рЬо-8МСС (Пирс (Р1егсе), номер по каталогу 22322) и детиотреит (Фишер Сайнтифик (Р181ег 8с1еп!Шс)). Получаемый конъюгированный ТСЕ-ФРГ был отделен от неконъюгированного пептида с использованием колонки Сеп!псоп® (Аткоп).

Группа 2 состояла из мышей ХепоМои8е® штамм ХМО1, производящих полностью человеческие антитела 1дО1_К. Мыши группы 2 были иммунизированы описанным выше конъюгированным ТСЕ-ФРГ.

Мышам всех трех групп была восемь раз сделана инъекция антигена (либо ФРГ, либо ТСЕ-ФРГ) в соответствии с графиком в табл. 1. При первоначальной иммунизации каждой мыши вводилось всего 10 мкг антигена в опорную часть задней ноги (5 мкг на опорную часть). Эти инъекции содержали адъювант Т1!егМах® Оо1б (Сигма (81дта), номер по каталогу Т2684). В инъекциях с 2 по 7 каждой мыши вводилось в целом 5 мкг антигена в адъюванте геля квасцов (адъювант геля фосфата алюминия; 8ирег£о8 Вю8ес!ог а/8, распространяемого компанией Е.М. 8агдеп! Ри1р апб СНет1са1 Со., Клиффон, Нью-Джерси, номер по каталогу 1452-250). Заключительная инъекция содержала в целом 10 мкг антигена на мышь и не содержала адъюванта.

- 35 015363

Таблица 1

Иммунизация мыши

	Группа 1а	Группа 16	Группа 2
Штамм	ХМО2	ХМО2	ХМ (31
Кол-во мышей	8	8	10
Антиген	ФРГ	ФРГ-ТСЕ	ФРГ-ТСЕ
1-ая инъекция	10 микрограмм/	10 микрограмм/	10 микрограмм/
(день 1)	мышь ТйегМах	мышь ТИегМах	мышь ТйегМах
	ОоЦ	Οοΐά	Οοΐά
2-ая ревакцинация	5 микрограмм/	5 микрограмм,7	5 микрограмм/
(день 7)	мышь в геле	мышь в геле	мышь в геле
	квасцов	квасцов	квасцов
3-яя ревакцинация	5 микрограмм/	5 микрограмм/	5 микрограмм/
(день 9)	мышь в геле	мышь в геле	мышь в геле
	квасцов	квасцов	квасцов
4-ая ревакцинация	5 микрограмм/	5 микрограмм/	5 микрограмм/
(день 13)	мышь в геле	мышь в геле	мышь в геле
	квасцов	квасцов	квасцов
5-ая ревакцинация	5 микрограмм/	5 микрограмм/	5 микрограмм/
(день 16)	мышь в геле	мышь в геле	мышь в геле
	квасцов	квасцов	квасцов
6-ая ревакцинация	5 микрограмм/	5 микрограмм/	5 микрограмм/

(день 20)	мышь в геле квасцов	мышь в геле квасцов	мышь в геле квасцов
Отбор крови (день 22)
7-ая ревакцинация (день 24)	5 микрограмм/ мышь в геле квасцов	5 микрограмм/ мышь в геле квасцов	5 микрограмм/ мышь в геле квасцов
8-ая ревакцинация (день 27)	5 микрограмм/ мышь в О-РВ8 (забуференый фосфатом физиологический раствор)	5 микрограмм/ мышь в О-РВ8	5 микрограмм/ мышь в О-РВ8

Каждой мыши делался отбор крови через два дня после шестой инъекции. Образцы крови анализировались твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫ8А) для определения титра антител к ФРГ. В этих твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫ8А) 96-луночные планшеты (ИкЬег 8с1епййс, номер по каталогу 12-565-136) покрывались ФРГ в 0,1 М буфере карбоната (рН 9,6). Добавлялись образцы крови и планшеты инкубировались в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации планшеты три раза промывались моющим раствором (0,05% Т\тееп 20 в ЗФР - забуференный фосфатом раствор) и добавлялось 100 мкл/лунка вторичного антитела. Вторичное антитело было гусиным античеловеческим антителом 1§СЕс. конъюгированным с пероксидазой хрена (8ои1Ьегп Вю1есН номер по каталогу 9060-05). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре планшеты промывались и добавлялось 100 мкл/лунка проявляющего раствора ТМВ (ВюЕХ ЬаЬ номер по каталогу ТМ8К-0100-01). После 10 мин добавлялось 50 мкл/лунка стоп-реагента ТМВ (ВюЕХ ЬаЬ номер по каталогу 8ТРВ-010001). Планшеты считывались на считывающем устройстве для планшетов для твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А) при длине волны 450 нм.

Через четыре дня после заключительной инъекции мыши были умерщвлены и были собраны их осушенные лимфатические узлы и были восстановлены лимфоциты. Лимфоциты от мышей каждой из трех групп группировались отдельно. Для обогащения образцов лимфоцитов В-клетками Т-клетки были обеднены путем добавления магнитных гранул анти-СЭ90 (М1Йепу1 Вю1есН номер по каталогу 491-01) и затем пропускались через колонку Ь8+ (МШепут Вю1есН номер по каталогу 424-01).

Каждый из трех образцов с лимфоцитами, обогащенными В-клетками, затем подвергался слиянию с

- 36 015363 клетками миеломы Р3, используя электрическое устройство для слияния клеток (Сепе!гошс, 1пс., модель ЕСМ 2001) для получения гибридом. Три группы слитых гибридомных линий клеток затем были помещены в 96-луночный планшет при плотности 1х 10⁶ входных В-клеток, обогащенных лимфоцитами на лунку в гибридомной среде (компоненты см. в табл. 2), содержащей гипоксантинин-азасерин (Сигма 81дта). Гибридомные линии культивировались в течение 14 дней при температуре 37°С в 15% СО₂.

После 14 дней супернатанты культуры были проанализированы твердофазным иммуноферментным анализом (ЕБ18А) для обнаружения присутствия человеческих антител к ФРГ 1дС, используя тот же протокол, который использовался для анализа образцов крови, описанный выше. Супернатанты культуры, которые оказались положительными в данном твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЬ18А), были протестированы на присутствие человеческой каппа-цепи во втором твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЫ8А). В этом втором твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЫ8А) условия были идентичны первому ЕБ18А, за исключением того, что вторичное антитело было антителом гусиной античеловеческой каппа-цепи, конъюгированным с пероксидазой хрена. Гибридомы, которые оказались положительными в обоих анализах ЕБ18А, были далее расширены для получения 5 мл супернатанта для функционального тестирования ш νί!ΐΌ, рассматриваемого в примерах 8 и 9. Были протестированы супернатанты от 82 клонов, соответствующих мышам из группы 1а, 42 клонов, соответствующих мышам из группы 1б, и 176 клонов, соответствующих мышам из группы 2.

Основываясь на результатах этих функциональных анализов, было идентифицировано несколько гибридомных линий, производящих антитела к ФРГ. Ограничивающее растворение было использовано для выделения от трех до шести клонов из каждой линии. Клоны были обозначены номером гибридомной линии (например, 1.24) и номером клона (например, 1.24.1). Не было обнаружено разницы между различными клонами определенной линии с помощью функциональных анализов, рассмотренных в примерах 8 и 9. Эти выделенные клоны были, каждый, расширены в 50-100-мл гибридомной среде и оставлены расти до истощения (т.е. менее чем 10% жизнеспособности клетки). Концентрация и эффективность антител к ФРГ в супернатантах этих культур определялась анализом ЕЫ8А и путем функционального тестирования ш уИго, как рассматривалось в примерах 8 и 9. Было идентифицировано десять гибридом с наивысшим титром антител к ФРГ. Эти гибридомы были обозначены 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1.

- 37 015363

Таблица 2

Состав среды

Гибридомная среда
Компонент	Источник
Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ)	Гибко (61Ьсо)
15% плодная бычья сыворотка (крови)	Хайклон (Нус1опе), номер по каталогу 8Н 30070.03
1% 200 мМл - глютамин	Сигма (81§та) номер по каталогу 02150
1% 100Х не-эфирные аминокислоты	Сигма (81§ша) номер по каталогу М7145
1% 100Х пенициллин/стрептомицин	Сигма (81§ша) номер по каталогу Р 7539 (10000 и/мл пенициллин/10мг/мл стрептомицин)
10и/мл 1Ь-6	Боерингер Манхейм (ВоеЬппдег Маплйейп), номер по каталогу 1299972
1 ампула/л среды ΟΡΙ Дополнение (оксалоацетат, иуруват, бычий инсулин)	Сигма (81§та) номер по каталогу О 5003
Среда Н8ГМ
Н8РМ	Гибко (01Ьсо) номер по каталогу 12045076
10% ультра низкая сыворотка 1е,С1	Гибко (СНЬсо) номер по каталогу 16250- 078
2 ммол/л Ь-глютамин	.ТНК 200тМ номер по каталогу 59202
1% 100Х не-эфирные аминокислоты	Л1К 100 X номер по каталогу 58572
1% 100 X пенициллин/стрептоцид	Джемини (Сепнш) номер по каталогу 400- 109
Среда Интегра (1п1едга)
Н8РМ	Гибко (О±со) номер по каталогу 12045- 076
10% ультра низкая сыворотка 1§О	Гибко (СНЬсо) номер по каталогу 16250- 078
2 ммол/л Ь-глютамин	ΙΗΚ 200тМ номер по каталогу 59202
1%ΝΕΑΑ	ШК. 100 X номер по каталогу 58572
4г/л глюкозы	Л Вакег, номер по каталогу 1920-07

Пример 2. Производство антител из гибридом.

Антитела готовились из десяти гибридом. рассмотренных в примере 1. используя одну из двух различных систем: встроенные колбы фирмы Интегра (1п(ецга) и барботажные роллерные колбы.

Встроенные колбы фирмы Интегра (1пТедга).

Семь гибридомных линий. 2.12.1. 1.24.2. 1.29.1. 1.74.1. 1.75.1. 1.60.2 и 2.40.1. выращивалась отдельно в колбах Т75 в 20мл среды Н8ЕМ (компоненты среды см. в табл. 2). Когда гибридомы становились почти конфлюэнтными в колбах Т75. он перемещались в колбы Интегра (1п(ецга Вюкаепсек. !п(ецга СЬ 1000. номер по каталогу 90005).

Колба Интегра является колбой с культурой клеток. которая разделена мембраной на две камеры. небольшую камеру и большую камеру. Объем из 20-30 мл клеток гибридомы при минимальной плотности клеток 1 х 10⁶ клеток на 1 мл для каждой из семи гибридомных линий помещался в небольшую камеру семи колб Интегра в среде Интегра (см. табл. 2 в отношении компонентов среды Интегра). Только среда Интегра помещалась в большие камеры колб Интегра. Мембрана. разделяющая две камеры. проницаема для питательных веществ с небольшим молекулярным весом. но непроницаема для гибридомных клеток и антител. производимых данными клетками. Таким образом. гибридомные клетки и антитела. производимые данными гибридомными клетками. сохранялись в небольшой камере.

Спустя одну неделю среда удалялась из обеих камер каждой из семи колб Интегра и заменялась свежей средой Интегра. Среда. собранная из семи небольших камер. хранилась отдельно. После второй недели роста среда из небольших камер собиралась снова. Собранная среда от первой недели от каждой

- 38 015363 гибридомной линии объединялась с собранной средой от недели 2 от той же гибридомной линии. Получаемые в результате образцы семи собранных сред от семи гибридомных линий были центрифугированы для удаления клеток и осадка (15 мин/ при 3000 об/мин) и получаемые в результате супернатанты отфильтровывались (0.22 единиц в минуту).

Барботажные роллерные колбы (3 л).

Три гибридомные линии. 3.10.1. 2.4.4 и 2.12.1. были выращены отдельно в колбах Т75 в 20 мл среды НБГМ. Когда гибридомы достигли достаточной плотности клеток. они были перемещены в колбы Т175. Подобным же образом. когда гибридомы достигли достаточной плотности клеток в колбах Т175. они были перемещены в 100-мл роллерные колбы. затем в 500-мл роллерные колбы и затем в 1-л роллерные колбы. Когда клетки достигали достаточной плотности клеток в 1-л роллерной колбе. они перемещались в 3-л барботажные роллерные колбы (Беллко Биотекнолоджи (Ве11со Вю1есБио1оду). номер по каталогу 1965-300. с патрубком бокового рычага. номер по каталогу 1965-30003).

Трехлитровая барботажная роллерная колба является стеклянным сосудом. в котором культуры смешиваются с помощью лопасти. управляемой магнитной платформой. Роллер соединен с газовой линией для обеспечения 5% СО₂ и воздуха.

Гибридома 3.10.1.

В две 3-л барботажные роллерные колбы высевались гибридомные клетки от гибридомной линии 3.10.1 в среде НБГМ с добавлениями. отмеченными в табл. 3. в которой суммируются условия роста для этих двух барботажных колб.

Таблица 3

Условия выращивания гибридомы 3.10.1

Условия	Роллер 1	Роллер 2
Плотность засева (10Е6 клеток/мл)	0,46	0,46
Н8ГВ, (Гибко (СНЬсо), номер по каталогу 12045-076)	X	X
Ультра низкая сыворотка (Гибко (СпЬсо). номер по каталогу 16250-078)	5%	5%
Ь-глютамин (1НК, номер по каталогу 59202-500М)	8 ммоль/л	2ммоль/л
Р/8 (Джемини (бетпм) номер по каталогу 400-109)	1%	1%
ΝΕΑΑ (ΊΗΚ, номер по каталогу 58572 - 77Р)	1%	1%
Пептон (Дифко (ϋί&ο) номер по каталогу 211693)	1 г/л	1г/л
2М глюкоза (1Т Вакег, номер по каталогу 1920-07)	8 г/л	2г/л
Антивспениватель С (Сигма (81§ша) номер по каталогу А-8011)	2мл/л	2мл/л
Эффективность производства	24	34

Культуры выращивались в течение 15 дней и затем собирались. когда жизнеспособность была ниже 20%. как это определялось исключением трипановой лазури. Сбор состоял из центрифугирования в течение 15 мин при 7000 об/мин и последующей фильтрации получаемого в результате супернатанта через 0.22-мкм фильтр. Эффективность производства определялась путем измерения величины белка. присутствующего в конечных собранных образцах. с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (НРЬС) белка А. и это представлено в табл.3.

Гибридома 2.4.4.

Пять 3-л барботажных роллерных колб были засеяны гибридомными клетками от гибридомы 2.4.4 в среде НБГМ с добавлениями. отмеченными в табл.4. в которой обобщаются условия роста для этих пяти барботажных колб.

- 39 015363

Таблица 4

Условия выращивания гибридомы 2.4.4

Условия	Роллер 1	Роллер 2	Роллер 3	Роллер 4	Роллер 5
Плотность засева (10Е6 клеток/мл)	0,3	0,3	0,18	0,18	0,4
Н8ГВ, (Гибко (С1Ьсо), номер по каталогу 12045076)	X	X	X	X	X
Ультра низкая сыворотка (Гибко (СНЬсо), номер по каталогу 16250-078)	5%	5%	5%	5%	5%
Ь-глютамин (ΊΗΒ, номер по каталогу 59202-500М)	8 ммоль/л	2 ммоль/л	2 ммольХл	8 ммоль/л	4 ммоль'л
Р/8 (Джемини (θοηιίηί) номер по каталогу 400-109)	1%	1%	1%	1%	1%
ΝΕΑΑ (.ТНК, номер по каталогу 58572 - 77Р)	1%	1%	1%	1%	1%
Пептон	1г/л	1г\л	1г/л	1г/л	1г/л
2М глюкоза	8 г/л	2 г/л	2 г/л	8 г/л	4 г/л
Антивспениватель С	2м л/л	2мл/л	2мл/л	2мл/л	2мл/л
Эффективность производства (и§/мл)	41	82	38	45	79
Длительность культуры (дни)	10	10	7	7	8

Культуры выращивались в течение 7, 8 или 10 дней, как указано в табл.4, и собирались, когда жизнеспособность клетки была ниже 20%, как описано выше.

Гибридома 2.12.1.

Шесть 3-л барботажных роллерных колб засевались гибридомными клетками от гибридомной линии 2.12.1 в среде Н8РМ с добавлениями, отмеченными в табл. 5, в которой обобщаются условия роста для этих трех барботажных роллерных колб.

- 40 015363

Таблица 5

Условия роста гибридомы 2.12.1

Условия	Роллер 1	Роллер 2	Роллер 3	Роллер 4	Роллер 5	Роллер 6
Плотность засева (10Е6 клеток/мл)	0,2	0,2	0,4	0,4	0,4	0,4
Н8ГВ, (Гибко (СНЪсо), номер по каталогу 12045076)	X	X	X	X	X	X
Ультра низкая сыворотка 1§Сг (Гибко (СйЬсо), номер по каталогу 16250-078)	5%	5%	5%	5%	5%	5%
Ь-глютамин (ЖЕ, номер по каталогу 59202-500М)	2 ммоль/л	8 ммоль/л	4 ммоль/л	4 ммоль/л	4 ммоль/л	4 ммоль/л
Р/8 (Джемини (ΟβΓηϊηί) номер по каталогу 400-109)	1%	1%	1%	1%	1%	1%
ΝΕΑΑ (ШК, номер по каталогу 58572 - 77Р)	1%	1%	1%	1%	1%	1%
Пептон	1 г/л	1 г/л	1 г/л	1 г\л	1 г/л	1 г/л
2М глюкоза	2 г/л	8 г/л	4 г/л	4 г/л	4 г/л	4 г/л
Антивспениватель С	2 мл/л	2 мл/л	2 мл/л	2 мл/л	2 мл/л	2 мл/л
Эффективность производства (мг/мл)	44	49	65	65	65	65
Длительность культуры (дни)	7	7	11	11	11	11

Культуры выращивались в течение 7 или 11 дней, как указано в табл. 5, и собирались, когда жизнеспособность была ниже 20%, как описано выше.

Пример 3. Клонирование и анализ последовательности легкой и тяжелой цепей антитела.

А. Клонирование легких цепей.

Десять гибридом (1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 и 3.10.1) были идентифицированы как производящие экспрессию моноклональных антител к ФРГ, как рассмотрено в примере 1. Общая РНК была выделена из каждой из этих десяти гибридом с использованием реагента ΤΚ.Ιζο1® (Инвитроген (Ιηνίίτο^η), Карлсбад, Калифорния). Концы 5' от этих десяти общих препаратов РНК были адаптированы для 5' быстрого экстракопирования концов кДНК (ЯАСЕ) с использованием набора Сег1еК.асег® (Инвитроген). Эти десять 5'-модифицированных препаратов РНК были затем использованы в десяти отдельных реакциях ЯАСЕ, при этом в каждой использовалась произвольная затравка с расширяющим адаптером (5'-ООС СОО АТА ООС СТС ΟΆΝ ΝΝΝ ΝΝΤ-3') (последовательность №: 48), для генерации десяти молекул кДНК.

Десять молекул кДНК были затем экстракопированы в отдельных полимеразных реакциях синтеза цепи (РСЯ) для генерации десяти последовательностей легких цепей каппа. Для каждой из этих реакций передняя затравка была передней гнездовой затравкой ОегеЯасег™ (5'-ООА САС ТОА САТ ООА СТО аАо ОАО ТА-3') (последовательность №: 49). Обратная затравка (5'-ООО ОТС АОО СТО ОАА СТО АОО-3') (последовательность №: 50) была запрограммирована для связывания с комплементарностью последовательности к легкой цепи каппа.

Каждая из десяти экстракопированных последовательностей легкой цепи каппа затем была отдельно лигирована в отдельные плазмиды рСЯ4-ТОРО (Ιηνίίτο^η). Полученные в результате десять плазмидов, каждый, включающий одну из десяти последовательностей легких цепей каппа, были затем отдель

- 41 015363 но экстракопированы в бактерии, и несколько клонов каждого было секвентировано. Эти последовательности использовались для создания праймеров полимеразно-цепьевой реакции (РСК) для экстракопирования десяти последовательностей легкой цепи каппа с открытой рамкой считывания из клонированных плазмидов следующим образом.

Комплекты затравки для каждой из десяти полимеразно-цепьевых реакций (РСК) включали 5'-затравку и 3'-затравку. Каждая 5'-затравка включала часть, комплементарную к последовательности аминотерминала определенной последовательности легкой цепи каппа, оптимизированную последовательность Козак (Кохак) и один или более сайтов рестрикции. Например, последовательность 5'-затравки, используемой в реакции с плазмидом, в конечном итоге выведенном из гибридомы 3.10.1, была

5’- АСА АСА ААС СТТ СТА САС САС САТ ССА АСС ССС АСС ТСА

ХЬа1 Кохак

ССТ ТСТ СТТ-3' (последовательность № 51)

3'-затравка для каждой полимеразно-цепьевой реакции (РСК) включала часть, комплементарную к карбоксильному терминалу последовательности определенной последовательности легкой цепи каппа, включая терминирующий кодон и сайт рестрикции. Например, последовательность 3'-затравки, используемой в реакции с плазмидом, в конечном итоге выведенном из гибридомы 3.10.1, была

5’- СТТ СТС САС ТСА АСА СТС ТСС ССТ СТТ САА ССТ

8а11 *

С-3’ (последовательность № 52)

Отдельные наборы затравок использовались в отдельных полимеразно-цепьевых реакциях (РСК) с соответствующими клонированными плазмидами для экстракопирования десяти областей кодирования последовательностей легкой цепи каппа. Десять продуктов экстракопирования от этих реакций были отдельно изолированы гелем и очищены при использовании С1Ас.|шск® гелиевым экстракционным набором (номер по каталогу 28702, Р1адеп, Уа1епаа, СА). Эти очищенные продукты затем по отдельности были рассечены соответствующими рестрикционными ферментами для получения областей кодирования последовательностей легкой цепи каппа, свободных от плазмида. Например, очищенный продукт, соответствующий гибридоме 3.10.1, был разрезан ХЬа1 и 8а11, сайтами, которые были введены затравками во время экстракопирования полимеразно-цепьевой реакцией (РСК) клонированного плазмида, как рассматривалось выше. Получаемые в результате рестрикционные переваренные области кодирования последовательности легкой цепи каппа были снова отдельно изолированы гелем и очищены с использованием С1Ас.|шск® гелиевым экстракицонным комплектом (номер по каталогу 28704, Эйджен (А1адеп), Валенсия, Калифорния).

Эти десять очищенных рестрикционных расщепленных последовательностей областей кодирования легкой цепи каппа были затем по отдельности лигированы в вектор экспрессии млекопитающих рЭ8Ка20 (νθ 90/14363) для создания десяти отдельных векторов экспрессии легкой цепи каппа, соответствующей десяти первоначальным гибридомам. Вставки вектора экспрессии десяти легких цепей каппа были затем секвентированы. Было подтверждено, что вектор экспрессии рЭ8Ка20, содержащий область кодирования легкой цепи каппа, в конечном итоге выведенный из гибридомы 3.10.1 (рЭ8Ка20:3.10.1), включает 5473 базовые пары, включая фрагмент РСК 719 базовых пар, кодировавший 235 остатков аминокислот (включая 20 аминокислот сигнальной последовательности каппа-цепи) легкой цепи каппа 3.10.1. Этот вектор экспрессии включал семь функциональных областей, как описано в табл. 6.

- 42 015363

Таблица 6

Вектор экспрессии ρΌ8Κα20:3.10.1 каппа. Плазмидное основание, номер пары

С 2 по 881	Сигнал окончания считывания генетического кода/полиаденилирования от суб-блока а бычьего гипофизарного гликопротеинового гормона (аΡ8Ν) (Гудвин и др. (Οοοάννΐη е1 а1.), 1983, Остатки нуклеиновых кислот ΐ Νικ'Ιβίΰ .ЗскВ Кех. ) 11:6873-82; Инвентарный номер банка генов Х0004)
882 по 2027	Мышиный мини ген дегидрофолат редуктазы (ΌΗΓΚ.), содержащий эндогенный промотор мышиного ΌΗΡΚ, последовательность кодирования кДНК и сигналы окончания считывания генетического кода/полиаденилирования ОНРК (Гассер и др. (Оаязег е1 а1), 1982, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαΐΙ. АсаЗ, 8с1 и.8.А.) 79:65226; Нанберг и др. (ЛипЬегд е! а1.), 1980, Клетка ((./И) 19:355-64; Сецер и др. (8е1гег е1 а1.), 1982, Журнал биологической химии (У. ΒίοΙ. СИет.) 257:5143-7: МакГроган и др. (Мсбгодап е1 а!.), 1985, Журнал биологической химии (У ΒίοΙ. Скет.) 260:2307-141
2031 3947	ПО	Последовательности рВК.322, содержащие ампицилиновый ген маркера резистентности и источник репликации плазмида в Е. соИ (Инвентарный номер банка генов 301749)
3949 4292	по	Начальный стимулятор 8Υ40, ген-усилитель и источник репликации (Тейкбе и др. (ТакеЬе е! ак), 1988, Молекулярная биология клетки (Мо1. СеИ ΒίοΙ.) 8:466-72, Инвентарный номер банка генов .102400)
4299 4565	по	Элемент усилителя трансляции от НТЬУ-1 области ЬТК. (Сейки и др. (8е1к1 е1 ак), 1983, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαίΙ. АсаИ. 8с1. С5.Я.) 80:3618-22, Инвентарный номер банка генов 302029)
4574 4730	по	Интрон от сигналов 8У40, 16 8, 19 8 донора сплайсированного фрагмента/акцептора (Окаяма и Берг (Окауата апй Вещ), 1983. Молекулярная биология клетки (Мо1 СеИ ΒίοΙ.) 3:280-9, Инвентарный номер банка генов 102400)

4755 5473	ПО	кДНК легкой цепи каппа 3.10.1 между сайтами ХЬа! и 8а11

В. Клонирование тяжелых цепей.

Вариабельная область тяжелых цепей антител к ФРГ от десяти гибридом была клонирована с использованием тех же способов, что и способы, использованные для легких цепей, рассмотренные выше в примере 3А. Было выделено общее РНК от каждой из десяти гибридом, 5'-модифицировано для КАСЕ и использовано для генерации молекул кДНК, как описано выше в примере 3А.

Эти десять молекул кДНК были экстракопированы в отдельных полимеразно-цепьевых реакциях (РСК), как рассмотрено для легких цепей в примере 3А, за исключением того, что обратная затравка (5'-ССА САС ТСА САТ ССА СТС ААС САС ТА-3' (последовательность №: 53)) была предназначена для связывания дополнительной последовательности вариабельной области тяжелой цепи. Передняя затравка снова была передней гнездовой затравкой СепеКасег™ (5'-ССА САС ТСА САТ ССА СТС ААС САС ТА-3') (последовательность №: 49).

Каждая из десяти экстракопированных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи была отдельно лигирована в отдельные плазмиды рСК4-ТОРО. Десять получаемых в результате плазмидов, каждый, содержащий одну из десяти последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, был затем отдельно экстракопирован в бактерии, и несколько клонов каждой из них были секвентированы, как описано выше для легких цепей в примере 3А. Эти последовательности были использованы для программирования затравок полимеразно-цепьевой реакции (РСК) для экстракопирования каждой из вариабельных областей тяжелой цепи от клонированных плазмидов следующим образом.

Наборы затравок для каждой из десяти РСК были составлены, используя такую же стратегию, как и использованную для легких цепей, рассмотренную выше в примере 3А. Каждая затравка 5' включала часть, комплементарную (дополнительную) к последовательности аминоконца вариабельной области последовательности определенной тяжелой цепи, оптимизированную последовательность Козак и один или более сайтов рестрикции. Например, последовательность затравки 5', используемой для экстракопирования вариабельной области тяжелой цепи, в конечном итоге выведенная из гибридомы 3.10.1, была

- 43 015363

5’- ЛСС АОА АОС ТТС ТАР АСС АСС АТС ААА САС СТО ТОО ТТС

ХЪа1 Когак

ТТС СТС СТС-3’ (последовательность №54)

3'-затравка для каждой из десяти полимеразно-цепьевых реакций (РСВ) включала часть, комплементарную (дополнительную) к карбоксильному концу согласованной последовательности вариабельной области определенной последовательности тяжелой цепи, включая терминирующий кодон и сайт рестрикции. Например, последовательность 3'-затравки, использованной для экстракопирования вариабельной области тяжелой цепи, в конечном итоге выведенная из гибридомы 3.10.1, была:

5’- ОТО ОАО ОСА СТА ОАО АСО ОТО АСС АСЮ ОТТ СС-3’

ВяпВ1 (последовательность № 55)

Отдельные наборы затравок использовались в отдельных полимеразно-цепьевых реакциях с соответствующими клонированными плазмидами для экстракопирования десяти последовательностей вариабельной области тяжелой цепи. Десять продуктов экстракопирования от этих реакций были отдельно изолированы гелем и очищены, используя комплект для гелиевой экстракции рШАдшск, и разрезаны соответствующими рестрикционными ферментами, как описано для легких цепей в примере 3А. Получаемые в результате рестрикционные расщепленные последовательности вариабельной области тяжелой цепи были снова отдельно изолированы гелем и очищены, используя комплект для гелиевой экстракции риТАдшск, как описано в примере 3А.

Три из этих десяти очищенных рестрикционных расщепленных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи, в конечном итоге выведенные из гибридомы 3.10.1, 1.24.1 и 2.4.4, были затем отдельно лигированы в вектор экспрессии млекопитающего рП8Ка20:ЫдССН для создания трех векторов экспрессии 1дС1 тяжелой цепи. Вектор экспрессии рП8Ка20:ЫдССН является таким же, как и рП8Кл20, за исключением того, что он также содержит последовательность постоянной области 1дС1. Вектор экспрессии рП8Ко.20:ЫдССН обобщен в табл. 7.

- 44 015363

Вектор экспрессии рП8Яа20:ЫдОСН. Плазмидное основание, номер пары

Таблица 7

2 по 881	Сигнал окончания считывания генетического кода/полиаденилирования от суб-блока а бычьего гипофизарного гликопротеинового гормона (аΡδΝ) (Гудвин и др. (ϋοοάννϊπ е! а1.), 1983. Остатки нуклеиновых кислот (Уис1Ас Лаос Лез.) 11:6873-82: Инвентарный номер банка генов Х0004)
882 по 2027	Мышиный мини ген дегидрофолат редуктазы ίϋΐΠΕό, содержащий эндогенный промотор мышиного О НЕК, последовательности кодирования кДНК и сигналы окончания считывания генетического кода/полиаденилирования ОНГК (Гассер и др. (Саззег е1 а1), 1982, Труды академии естественных наук США (Ргос. Ναύ. Ас<м, 5с1 и8.А.) 19:65226; Найберг и др. (МипЬегд е1 а1.), 1980, Клетка (Се!Г) 19:355-64; Сецер и др. |8е1кег е1 а1.), 1982, Журнал биологической химии (У. ΒίοΙ. С1кт.), 257:5143-7: МакГроган и др. (МсСтгодап е1 а1.), 1985, Журнал биологической химии Βίο! СкетА 260:2307-14)
2031 по 3947	Последовательности рВК322, содержащие ампицилиновый ген маркера резистентности и источник репликации плазмида в Е. соИ (Инвентарный номер банка генов ТО1749'1
3949 по 4292	Начальный стимулятор 8У40, ген-усилитель и источник репликации (Тейкбе и др. (ТакеЪе е1 а1.), 1988, Молекулярная биология клетки (Мо1. Се1 ΒίοΙ.) 8:466-72, Инвентарный номер банка генов ГО2400)
4299 по 4565	Элемент усилителя трансляции от ПТЕ\'-1 области ГТЕ (Сейки и др. (8е1И е! а!.), 1983, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαιΙ. Αοαά. Зс1. 1/.8.А ) 80:3618-22, Инвентарный номер банка генов 102029)
4574 по 4730	Интрон от сигналов 5У40, 16 3, 19 8 донора сплайсированного фрагмента/акцептора (Окайама и Берг (Окауата апс1 Вег§). 1983. Молекулярная биология клетки (Мо1. Се11 ΒίοΙ.) 3:280-9, Инвентарный номер банка генов 102400)
4755 по 5791	кДНК тяжелой цепи р1Л1СЬ1 между сайтами ХЪа! и 8а11 Последовательность которой следует далее: ХЬа1 ΒεηιΒΙ ТСТАСАССАСССССАТЗСЗТСААААТТСААТСЗТСТСТА бТЗССТССАССААСбССССА тссстсттсс ссстеосдсс СТССТССААЗ АЗСАССТСТССЗС6САСА6С 6ССССТ363С ТСССТССТСА АЗСАСТАСТТ СССССААССЗ СТСАССЗТСТ СЗТ6СААСТС АСССбСССТЗ АССАЗСЗЗСЗ ТССАСАССТТ ССС66СТ6ТС СТАСАСТССТ САОЗАСТСТА СТСССТСА6С

- 45 015363

АЗСЗТЗЗТЗАССЗТЗСССТС САЗСАЗСТТЗ ЗССАСССА6А ССТАСАТСТЗ СААССТСААТСАСААССССА ЗСААСАССАА ЗЗТЗЗАСААЗ АААЗТТЗАЗС ССАААТСТТЗ ТОАСААААСТ САСАСАТЗСС САССЗТЗССС азсасстзаа стсстзсззз ОАСССТСАЙТ СТТССТСТТС СССССААААС ССААССАСАС ССТСАТСАТС тссссйассс стзаззтсас атзсзтззтз . ЗТЗЗАСЗТСА ЗССАСЗААОАСССТЗАЗСТС ааоттсааст ззтасзтзза ссссстссас ЗТ6САТААТВ ССААЗАСААА ЗССЗСЗЗЗАЗ сазсазтаса асассасзта ссстзтзстс АССЗТССТСА ССЗТССТЗСА ССАСЗАСТСС СТСААТЗЗСА АСЗАЗТАСААЗТЗСААЗЗТС ТССААСАААЗ СССТСССАСС ССССАТСЭАС ААААССАТСТССАААЗССАА АЗЗЗСАЗССС ССАЗААССАС АЗСТЗТАСАС ССТЗСССССА ТСССЗЗЗАТЗ АЗСТЗАССАА 6ААССА63ТС АСССТСАССТ ЗССТЗЗТСАА А63СТТСТАТ СССАССЗАСА ТСЗССЗТЗЗА 6Т363А6АЗС ААТЗЗЗСА6ССЗЗАЗААСАА СТАСААЗАСС АСЗССТСССЗ ТЗСТЗЗАСТС СЗАСЗЗСТСС ТТСТГССТСТ АТАЗСААЗСТ САССЗТЗЗАС ААСАССАСЗТ ЗЗСАЗСАСЗЗ ЗААСЗТСТТС ТСАТССТССЗ ТЗАТЗСАТЗА СССТСТЗСАС ААССАСТАСА СЗСАСААСАС ССТСТСССТЗ ТСТССС6ЭТА За11 А АТС АТ ДАСТ СЗАС (последовательность № 56)

Вариабельные области тяжелой цепи трех вставок вектора экспрессии 1дС1 были секвентированы.

Вектор экспрессии рП8Ва20:к1дССН, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, в конечном итоге выведенный из гибридомы 3.10.1 (рП8Ва20:ЫдССН:3.10.1), обобщен в табл. 8.

Таблица 8

Вектор экспрессии рО8Ва20:ЫдССН:3.10.1. Плазмидное основание, номер пары по 881

Сигнал окончания считывания генетического кода/полиаденилирования от суб-блока а бычьего гипофизарного гликопротеинового гормона (аΡ8Ν) (Гудвин и др. (Οοοάννίη а1.). 1983, Остатки нуклеиновых кислот (Ыис1е1с Аскк Кез } 11,68⁷3-82; Инвентарный номер банка генов Х00004)

882 по 2027	Мышиный мини ген дегидрофолат редуктазы (ОНРК), содержащий эндогенный промотор мышиного ОНРВ., последовательности кодирования кДНК и сигналы окончания считывания генетического кода/полиаденилирования ϋΗΓΚ (Гассер и др. (Саззег е! а1). 1982, Труды академии естественных наук США (Ргос. Ναύ. АсаВ. 5с. и.8.А.) 79:65226; Найберг и др. (ΝιπΛβΓ§ е! а1.), 1980, Клетка (Се11) 19:355-64; Сецер и др. (8е1гег е! а1.), 1982, Журнал биологической химии (.7. ΒίοΙ. Скет.) 257:5143-7: СакГроган и др. (Мсбго^ап е! а1.), 1985, Журнал биологической химии (./. ΒίοΙ. Скет.) 260:2307-14)
2031 3947	ПО	Последовательности рВК322, содержащие ампицилиновый ген маркера резистентности и источник репликации плаз чпда в Е сок (Инвентарный номер банка генов .101749)
3949 4292	по	Начальный промотор 8У40, ген-усилитель и источник репликации (Тейкбе и др. (ТакеЬе е! а1.), 1988, Молекулярная биология клетки (ΜοΙ. Се11 ΒίοΙ.) 8:466-72, Инвентарный номер банка генов 302400)
4299 4565	по	Элемент усилителя трансляции от НТЬУ-1 области 1_ТТ< (Сейки и др. (8е1к1 е! а1.), 1983, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαίΙ. АсаВ. 8а. и.8.А.) 80:3618-22, Инвентарный номер банка генов Ю2029)
4574 4730	по	Интрон от сигналов 8У40, 16 8, 19 8 донора сплайсированного фрагмента/акцептора (Окайама и Берг (Окауата ап<1 Вег§), 1983. Молекулярная биология клетки (Мо1. СеИ ΒίοΙ.) 1280-9, Инвентарный номер банка генов 102400)
4755 6178	по	кДНК 3.10.1 тяжелой цепи 1§О1 между сайтами ХЬа! и 8а11

Каждая из десяти очищенных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи была отдельно лигирована в вектор экспрессии млекопитающего рИ8Ва20, кодирующий постоянную область

- 46 015363

1дО2 для создания десяти векторов экспрессии 1дО2. Каждый из десяти получаемых в результате векторов экспрессии 1дО2 (обозначенный как рО8Ка20:ЫдО2:номер гибридомы) включал последовательности, кодирующие постоянную область 1дО2 и одну из десяти последовательностей вариабельной области тяжелой цепи. Десять вставок вариабельной области тяжелой цепи были секвентированы для подтверждения, что они составляли ту же последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая была идентифицирована в клонированных плазмидах от клонов рСК4 ТОРО. Вектор экспрессии рП8Ка20:ЫдО2, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, в конечном итоге выведенный из гибридомы 2.12.1 (рП8Ка20:ЫдО2:2.12.), представлен в табл. 9.

Таблица 9

Вектор экспрессии рО8Ка20:1дО2:2.12. Плазмидное основание, номер пары

2 по 881	Сигнал окончания считывания генетического кода/полиаденилирования от суб-блока а бычьего гипофизарного гликопротеинового гормона (аΡ8Ν) (Гудвин и др. (ОоосГуш е! а1.), 1983, Остатки нуклеиновых кислот (Е1ис!ек АсЕк Кех.) Ц: 6873-82; Инвентарный номер банка генов Х0004)
882 по 2027	Мышиный мини ген дегидрофолат редуктазы (ИНГЕ.), содержащий эндогенный промотор мышиного ОНГЕ., последовательности кодирования кДНК и сигналы окончания считывания генетического кода/полиаденилирования ОНГЕ (Гассер и др. (Оазвег е! а1), 1982, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαΐΙ. Лсас1. 8с1. и.З.А.) 79:65226; Найберг и др. (№тЬег§ е! а1.), 1980, Клетка (СеП) 19:355-64; Сецер и др. (8е1гег с( а1.), 1982, Журнал биологической химии (7 Βίο!. Скет.) 257:5143-7; МакГроган и др. (МсСтго^ап е1 а1.), 1985, Журнал биологической химии (7 Βίο!. Скет.) 260:2307-14)
2031 3947	ПО	Последовательности рВК322, содержащие ампицилиновый ген маркера резистентности и источник репликации плазмида в Е. соИ (Инвентарный номер банка генов 101749)
3949 4292	по	Начальный промотор 8У40, ген-усилитель и источник репликации (Тейкбе и др. (ТакеЪе е1 ак), 1988, Молекулряная биология клетки (Мо1. СеП Βίο!.) 8:466-72, Инвентарный номер банка генов 102400)
4299 4565	по	Элемент усилителя трансляции от ΗΤίν-Ι области ЬТЕ. (Сейки и др. (δείΐίί е! а1.), 1983, Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαίΙ. АсаВ. Зек и.З.А.) 80:3618-22, Инвентарный номер банка генов 102029)
4574 4730	по	Интрон от сигналов 8¥40, 16 8, 19 8 донора сплайсированного фрагмента/акцептора (Окайама и Берг (Окауата апО Веге.), 1983. Молекулярная биология клетки (Мо1. СеП ΒίοΙ.) 3:280-9, Инвентарный номер банка генов 102400)
4755 6166	по	кДНК 2.12.1 тяжелой цепи 1еСг2 между сайтами ХЬа! и 8а11

Последовательности кДНК для вариабельной области легкой цепи каппа (последовательности №: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19), постоянная область легкой цепи каппа (последовательность №: 21), вариабельные области тяжелой цепи (последовательности №: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20) и постоянные области тяжелой цепи 1дО1 и 1дО2 (последовательности №: 22 и 23) показаны на фиг. 3.

Были определены последовательности полипептидов, предсказанные от каждой из этих последовательностей кДНК. Предсказанные последовательности полипептидов для вариабельных областей легкой цепи каппа (последовательности №: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 и 42), постоянная область легкой цепи каппа (последовательность №: 44), вариабельные области тяжелой цепи (последовательности №: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 и 43) и постоянные области 1дО1и 1дО2 тяжелой цепи (последовательности №: 45 и 46) показаны на фиг. 4.

Основываясь на данных последовательности, были определены гены зародышевой линии, из которой была выведена каждая вариабельная область тяжелой или легкой цепи. Идентичность генов зародышевой линии указана рядом с соответствующей гибридомной линией на фиг. 1-4. Дальнейший анализ связи последовательностей (фиг. 1В и 2В) привел к дендрограммам, показанным на фиг. 1А (вариабельные области легкой цепи каппа) и фиг. 2А (вариабельные области тяжелой цепи).

Пример 4. Промежуточная экспрессия в клетках 293Т.

В десяти отдельных котрансфекциях клетки 293Т были котрансфецированы с вектором экспрессии рО§Ка20, включающим последовательность легкой цепи каппа, описанную в примере 3А (вектор легкой

- 47 015363 цепи) и вектор экспрессии рО8Ва20, включающий последовательность тяжелой цепи, описанной в примере 3В (вектор тяжелой цепи). В этих десяти контрансфекциях клетки 293Т были котрансфецированы как с вектором легкой цепи, так и вектором тяжелой цепи, в конечном итоге выведенном из одной из гибридом, описанных в примере 1. А именно для контрансфекции вектора, в конечном итоге выведенного из гибридомы 3.10.1, использовался вектор тяжелой цепи, включающий 1дС1 (рО8Ва20:ЫдССН:3.10.1). Для контрансфекции векторов, в конечном итоге выведенных из других девяти гибридом, использовалась тяжелая цепь, включающая 1дС2 (рП8Ва20:Н1дС2:номер гибридомы). Котрансфекции выполнялись с использованием либо Еидепе 6, либо Х-ТгетеСепе ВО-1539 (оба от фирмы ВосНе Мо1еси1аг Вюсйетюа1к, Индианополис, Индиана), следуя инструкциям, предоставленным изготовителем.

Сначала котрансфекции проводились с использованием прилипающих клеток 293Т в стандартных вращающихся (роллерных) флаконах. Вращающиеся флаконы были засеяны клетками 4х10⁷ по 5х10⁷ на вращающийся флакон в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ЭМЕМ), содержащей 5% плодной бычьей сыворотки (ЕВ8) (Нус1опе, номер по каталогу 8Н 30070.03), 1х несущественных аминокислот (81дта, номер по каталогу М 7145), 1х пенициллина/стрептомицина (81дта, номер по каталогу Р7539 (10000 и/мл пенициллина/стрептомицина) и 1х пирувата натрия (1пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния). Когда клетки достигали конфлюентности 60-70%, вектор тяжелой цепи и вектор легкой цепи, в конечном итоге выведенные от определенной гибридомы, были котрансфецированы в клетки в течение 24 ч, после чего среда была заменена на такую же среду, в которой отсутствовала сыворотка. Свободная от сыворотки среда два раза собиралась и заменялась на свежую свободную от сыворотки среду через 48 и 96 ч после трансфекции, давая общий объем 1,25 л собранной свободной от сыворотки среды.

Десять отдельных котрансфекций были повторены с использованием свободных от сыворотки адаптированных клеток 293Т в суспензии в той же среде, как и рассмотренная выше, в которой отсутствовала сыворотка. Векторы тяжелой цепи и векторы легкой цепи, соответствующие определенной гибридоме, были котрансфецированы в клетки в объеме культуры 500 мл. Трансфецированные клетки инкубировались в течение 7 дней, после чего собиралась свободная от сыворотки кондиционированная среда.

Пример 5. Экспрессия антитела и клонирование клеток СНО (клеток яичников китайского хомяка).

Клетки яичников китайского хомяка с недостатком ЭНЕВ (СНОб) использовались для генерации стабильной экспрессии рекомбинантных антител к ФРГ. В десяти отдельных котрансфекциях клетки СНОб были котрансфецированы как с вектором тяжелой цепи, так и с вектором легкой цепи, в конечном итоге выведенных из одной из гибридом, рассмотренных в примере 1, как обсуждалось в примере 4. Котрансфекций достигали с использованием стандартного способа с фосфатом кальция.

Трансфецированные клетки от каждой из десяти котрансфекций выращивались отдельно в селекционной среде, содержащей модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (ЭМЕМ) с высоким содержанием глюкозы и при отсутствии гипоксантина-тимидина (С1Ьсо/ВВЬ, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 11965) с 5% диализованной плодной бычьей сывороткой. Подобная среда без гипоксантина-тимидина выбирается для роста клеток, производящих экспрессию рекомбинантого фермента ОНЕВ. Среда от каждого выращенного трансфеканта отсеивалась с использованием стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А) для детектирования человеческих антител.

Пример 6. Экспрессия антител к ФРГ в клонах СНОб'.

Шесть образцов каждого из десяти стабильных клонов СНОб', описанных в примере 5, при этом каждый отдельный клон производил экспрессию одного из десяти различных антител к ФРГ, выращивались отдельно в среде роста. Среда роста представляла собой модифицированную по способу Дульбекко среду Игла с высоким содержанием глюкозы (С1Ьсо/ВВЬ, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 11965), дополненную 5% диализованным ЕВ8, несущественными аминокислотами и Ь-глютамином (Ь1£е ТесНпо1од1ек, Карлсбад, Калифорния). Клетки выращивались при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Когда клоны СНОб' достигали шестилуночной стадии роста, к среде роста добавлялось 10 нМ метотрексата для усиления экспрессии антител. После того как клетки становились конфлюентными, они переносились в 100 мм кюветы. Концентрация метотрексата была доведена с 10 М до 20, 50, 100, 250, 500 нМ, до 1, 2, 4 мкМ и в конечном итоге до 10 мкМ. Клетки выдерживались при каждой концентрации минимум одну неделю и до тех пор, пока они достаточно адаптировались к данной концентрации метотрексата при визуальном определении.

Кондиционированная среда от каждого из клонов анализировалась при каждой концентрации метотрексата для определения уровня экспрессии каждого антитела к ФРГ. Среда анализировалась стандартным анализом ЕЬ18А (твердофазным иммуноферментным анализом) и разрешенным по времени флуоресцентным (ТВЕ) сандвичевым анализом для полуколичественного измерения связывания антител к ФРГ с планшетами, покрытыми человеческим ФРГ.

Усиленные метотреаксатом клоны с самыми высокими уровнями экспрессии антител адаптировались для выращивания в свободной от сыворотки продуцирующей среде следующим образом. Клоны были выделены трипсином из сосуда для культивирования, центрифугированы и повторно суспендированы в 50 мл свободной от сыворотки продуцирующей среде при 4х10⁵ клеток/мл в 250 мл шейкерной

- 48 015363 колбе с крышкой. Культуры инкубировались в теплой комнате при 37°С и перемешивались при приблизительно 125 об/мин. Каждые 3-4 дня клетки сливались и разбавлялись до 4х10⁵ клеток/мл свежей свободной от сыворотки продуцирующей средой. Свежая свободная от сыворотки продуцирующая среда добавлялась приблизительно десять раз для каждой из культур для завершения данной фазы адаптации.

Пример 7. Очистка антитела от рекомбинантной клеточной кондиционированной среды.

Среда собиралась от гибридом, описанных в примере 1, от клеток 293 Т переходной экспрессии, описанных в примере 4, от стабильных трансфекантов, описанных в примере 5, и от усиленных метотрексатом клонов, описанных в примере 6. Среда от каждого из этих источников концентрировалась отдельно приблизительно десятикратно, используя спиральную раневую кассету ΥΜ30 (МШроге, Бедфорд. Массачусетс, номер по каталогу 810Υ30), следуя предоставленным изготовителем инструкциям. Концентрация антитела, присутствующего в каждом образце концентрированной среды, оценивалась жидкостной хроматографией высокого разрешения (НРЬС).

Антитела очищались от образцов концентрированной среды афинитетной смолистой очисткой, используя рекомбинантный белок А 8ерЬаго§е (гРгоА) (АтегкЬат, Пискатавей, Нью-Джерси, номер по каталогу 17-1279-03). гРгоА сначала четыре раза промывался с помощью забуференого фосфатом физиологического раствора (ЗФР). После последней промывки взвесь промытого гРгоА в ЗФР была приготовлена путем смешивания равного объема гРгоА и ЗФР. Взвесь гРгоА была добавлена к каждому образцу концентрированной среды в количестве приблизительно 1 мкл взвеси гРгоА для каждых 5 мкг антитела в образце среды, но не менее чем 50 мкл взвеси гРгоА для любого образца среды. Получаемые в результате образцы среды/взвеси инкубировались в течение ночи при температуре 4°С при встряхивании. Затем образцы среды/взвеси центрифугировались до получения гранул гРгоА. Фракции супернатанта, содержащие несвязанные белки, были отбракованы. Гранулы гРгоА были отдельно повторно суспендированы в 0,5 мл ЗФР, каждая. Повторно суспендированные образцы гРгоА были затем перенесены в 0,45-мкм трубки 8рш-Х (Со81аг, Корнинг, Нью-Йорк, номер по каталогу 8162) и были прокручены для удаления ЗФР (забуференного фосфатом физиологического раствора). гРгоА в трубках 8рш-Х затем 3 раза промывался с помощью 0,5 мл ЗФР на промывку.

Фракции антител были элюированы из гРгоА в трубках 8рш-Х путем добавления 1,5 об. 0,1 М глицина, рН 2,7 и инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре. Трубки 8рш-Х были затем центрифугированы и из каждой трубки 8рш-Х были отдельно собраны элюаты. Элюирование было повторено и были сгруппированы два элюата из каждой трубки 8рш-Х. рН сгруппированных элюатов был нейтрализован 1,25 об. 1,0 М Трис, рН 9,2. Каждый образец был затем отфильтрован через новую трубку 8рш-Х для удаления макрочастиц.

Концентрация белка конечных препаратов была определена анализом Бредфорда с использованием человеческого 1дС в качестве стандарта. Для оценки чистоты каждый из конечных препаратов был отдельно прогнан на отдельных полосах геля додецилсульфата натрия для электрофореза в полиамидном геле (8Э8-РАСЕ), закрашенного Кумасси, и был проинспектирован визуально.

Пример 8. Характеристика связывания антител с ФРГ.

А. Измерения аффинитета.

Используя В1Асоге® (В1асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси) был проведен аффинитетный анализ шести антител к ФРГ, описанных в примере 6 (тех, которые были в конечном итоге выведены из гибридом 3.10.1, 2.4.4, 2.12.1, 1.29.1, 1.75.1 и 1.74.3) в соответствии с инструкциями изготовителя. Проточным буфером для этих анализов был забуференный фосфатом раствор (ЗФР) с 0,005% поверхностноактивного вещества Р20 (В1асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси). Рекомбинантный белок С (Р1егсе, Рокфорд. Иллинойс) был иммобилизован на сенсорном чипе СМ5 до степени чистоты, принятой в исследованиях (В1асоге, 1пс.. Пискатавей, Нью-Джерси) через первичные аминовые группы, используя аминовый соединительный набор (В1асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси) в соответствии с инструкциями изготовителя.

В шести отдельных образцах около 200 резонансных блоков каждого из шести антител к ФРГ были отдельно прикреплены к иммобилизованному белку С, следуя инструкциям изготовителя. Образцы, включающие различные концентрации (0-100 нМ) человеческого ФРГ, были инжектированы через связанную поверхность антитела при скорости потока 50 мкл/мин в течение 3 мин. Были определены связывающие кинетические параметры антитела, включая ка (константу скорости ассоциации), кб (константу скорости диссоциации) и КО (константу равновесия диссоциации), используя компьютерную программу 3.1 оценки В1А (В1Асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси). Более низкие константы равновесия диссоциации указывают на больший аффинитет антитела к ФРГ. Данные представлены на фиг. 6А.

Были также измерены значения КО каждого из четырех антител к ФРГ (которые в конечном итоге были выведены из гибридом 2.4.4, 1.29.1, 1.74.2 и 2.12.1), используя равновесный способ связывания. Этот способ выполнялся с помощью В1Асоге® 3000 (В1Асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси), используя ЗФР с 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 (В1Асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси) в качестве проточного буфера. Четыре антитела к ФРГ были отдельно иммобилизованы на сенсорном чипе СМ5 до степени чистоты, принятой в исследованиях (В1асоге, 1пс., Пискатавей, Нью-Джерси), через первичные

- 49 015363 аминовые группы. используя аминовый соединительный набор (В1асоге. 1пс.. Пискатавей. Нью-Джерси) в соответствии с инструкциями изготовителя.

В отдельных анализах каждые из четырех антител к ФРГ в диапазоне различных концентраций (от 0.01 до 50 нМ) были отдельно инкубированы с каждой из двух различных концентраций (0.05 и 1 нМ) человеческого ФРГ в ЗФР (забуференном фосфатом физиологическом растворе) с 0.005% Р20 и 0.1 мг/мл ВБА при комнатной температуре по крайней мере в течение шести часов. Каждый из этих образцов затем инжектировался поверх поверхности сенсорного чипа СМ5. на которой было иммобилизовано тоже антитело к ФРГ. Получаемый сигнал связывания был пропорционален свободному ФРГ в растворе. Константа равновесия диссоциации (ΚΌ) была получена из нелинейного анализа регрессии конкурентных кривых. используя модель однородного связывания с одним сайтом и двумя кривыми (программное обеспечение КшЕхА. Бар1бупе 1пк1гитеи1к 1пс.. Буаз. Айдахо). Эти значения константы равновесия диссоциации представлены на фиг. 6В.

B. Специфичность связывания антител с ФРГ.

Экспрессия человеческого ФРГ осуществлялась либо в клетках СНО (яичника китайского хомячка) или закупалась у фирмы Κ&Ό Бук!етк (Κ&Ό Бук!етк. Миннеаполис. номер по каталогу 294-НО-005). Рекомбинантный мышиный ФРГ был приготовлен. используя последовательность в Лью и др. (Ъш е! а1.). Молекулярное клонирование и характеристика кДНК. кодирующей мышиный фактор роста гепатоцита (Мо1еси1аг с1ошид апб с11агас!епха!юп оГ сОЫА епсобшд тоике Нера!осу!е дго\\И1 Гас!ог). ВюсЫт. Вюрйук. ас!а.. 16:1216 (2):299-300 (1993). Рекомбинантный мышиный ФРГ был получен либо путем экспрессии в клетках насекомых. используя бациловирусный вектор. или путем экспрессии в клетках 293Т. В любом случае мышиный ФРГ очищался с помощью аффинитетной хроматографии сульфата гепарина.

Каждый из препаратов человеческого и мышиного ФРГ оказался биологически активным. Человеческий ФРГ индуцировал зависящее от дозы фосфорилирование человеческого Ме! в человеческих клетках РС3 (АТСС Мапаккак. УА#СКЬ 1435) и в мышиных 4Т1 клетках (АТСС Мапаккак. УА#СКЬ 2531). Мышиный ФРГ индуцировал фосфорилирование Ме! в мышиных клетках 4Т1. но не в человеческих клетках РС3.

Человеческий и мышиный ФРГ прогонялись на отдельных полосках гелей додецил сульфата натрия для электрофореза в полиакриламидном геле (БЭБ-РАОЕ). Человеческий ФРГ и мышиный ФРГ были по отдельности прогнаны на полоске 100 и на 10 нг. Некоторые гели прогонялись при нередуцирующих условиях. используя бета-меркаптоэтанол. Человеческий ФРГ и мышиный ФРГ в гелях БЭБ-РАОЕ были перемещены в мембраны нитроцеллюлозы. Эти мембраны были отдельно инкубированы с одним из десяти антител к ФРГ. описанных в примере 6. Каждое из десяти антител к ФРГ было отдельно инкубировано с мембранами нитроцеллюлозы из гелей. содержащих человеческий ФРГ и мышиный ФРГ при редуцировании и с нитроцеллюлозными мембранами из гелей. содержащих человеческий ФРГ и мышиный ФРГ при нередуцирующих условиях. Затем мембраны были инкубированы с гусиным античеловеческим антителом 1дО. связанным с НКР (Р1егсе. Рокфорд. Иллинойс. номер по каталогу 31412). Сигнал от гусиного античеловеческого антитела 1дО. связанного с НКР. был детектирован электрохимиолюминисценцией (ЕСЬ™; Атегкйат Рйагтааа Вю!ес11. Пискатавей. Нью-Джерси. номер по каталогу ΚΚΝ2106). следуя инструкциям изготовителя.

На фиг. 7 показаны изображения гелей. тестирующих каждый из десяти антител к ФРГ. описанных в примере 6. Полосы слева показывают гели. тестирующие каждое антитело относительно 100 нг человеческого ФРГ (полоса 1). 10 нг человеческого ФРГ (полоса 2). 100 нг мышиного ФРГ и 10 нг мышиного ФРГ (полоса 4) при нередуцирующих условиях. Полосы справа показывают гели. тестирующие каждое антитело относительно 100 нг человеческого ФРГ (полоса 5). 10 нг человеческого ФРГ (полоса 6). 100 нг мышиного ФРГ (полоса 7) и 10 нг мышиного ФРГ (полоса 8) при редуцирующих условиях. Каждый из тестированных антител к ФРГ связывался с человеческим ФРГ при нередуцирующих условиях (полосы 1 и 2). Ни одно из протестированных антител к ФРГ значительно не связывалось с мышиным ФРГ при нередуцирующих условиях (полосы 3 и 4) или человеческим ФРГ (полосы 5 и 6) или мышиным ФРГ (полосы 7 и 8) при редуцирующих условиях.

C. Картирование эпитопа с использованием слитых белков.

Вектор экспрессии млекопитающего. содержащий последовательность кДНК. кодирующую авидин цыпленка смежную с множественным сайтом клонирования вектора рСЕР4 (1пу|!гоцеп. Карлсбад. Калифорния. СА. номер по каталогу У044-50) был сконструирован. используя стандартные молекулярные методики (фиг. 9А). Этот вектор включал сигнальную последовательность авидина цыпленка (фиг. 9В) для разрешения секреции слитых белков. впоследствии осуществивших экспрессию. Векторы экспрессии были сконструированы вставкой последовательности. кодирующей определенный белок-мишень. в множественный сайт клонирования вектора экспрессии слитого белка. Получаемая в результате каждая слитая генно-инженерная конструкция кодировала белок авидина на Ν-конце белка мишени.

Используя эту методику. были приготовлены слитые белки. включающие авидин. слитые со следующими белками мишени: полномерный человеческий ФРГ. б5 ФРГ. являющийся встречающимся в природе сращенным вариантом человеческого ФРГ (Рубин Дж. и др. (КиЬт. 1. е! а1.) РNАБ. 88:415-419 (1991)); полномерный мышиный ФРГ; химеру № 1. включающую Ν-концевую часть человеческого ФРГ

- 50 015363 (аминокислоты 32-505) и С-концевую часть мышиного ФРГ (аминокислоты 508-728); химеру № 2, содержащую Ν-концевую часть мышиного ФРГ (аминокислоты 33-506) и С-концевую часть человеческого ФРГ (аминокислоты 506-728); и химеру № 3, включающую Ν-концевую часть человеческого ФРГ (аминокислоты 320582) и С-концевую часть мышиного ФРГ (аминокислоты 583-728).

Схематическое представление слитых белков показано на фиг. 10. Ν-концевая область ФРГ содержит четыре крингл-домена, представленных квадратиками, промаркированными как К1-К4. С-концевая область ФРГ делит гомологию с протеазами серина. Область представлена полосками. Пустые квадратики и сплошные полоски показывают последовательности человеческого ФРГ. Затененные квадраты и заштрихованные полоски указывают мышиные последовательности.

Индивидуальные слитые белки были подвергнуты переходной экспрессии в клетках 293Т путем отдельной трансфекции клеток одним из векторов экспрессии слитых белков, используя Липофектамин (С1Ьсо ВВЬ, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 18324), следуя инструкциям изготовителя. Приблизительно через 48 ч после трансфекции кондиционированная среда была собрана и подвергнута анализу.

В отдельных образцах пять из десяти антител к ФРГ, описанных в примере 6 (тех, которые в конечном итоге были выведены из гибридом 2.4.4, 1.74.1, 1.75.1, 3.10.1 и 2.12.1), были отдельно инкубированы со слитыми белками, включающими, каждый, следующие белки-мишени: полномерные человеческие ФРГ, б5 ФРГ и мышиный ФРГ. После инкубации слитые белки в каждом образце были отдельно выбраны, используя гранулы с биотиновым покрытием (8рНего1есН 1пс., Либергивиль, Иллинойс, номер по каталогу ТР-60-5). Полученные в результате гранулярные протеиновые комплексы были отмаркированы путем добавления антиавидинового антитела, маркированного флуоресцинизотиоцианатом (ФИТЦ) (УесЮг ЬаЬ, Берлингейм, Калифорния, номер по каталогу 8Р-2040). Присутствие антител к ФРГ было определено путем добавления фикоэритрина (РЕ), отмаркированного гусиным античеловеческим антителом Р(аЬ')₂ (8ои1йегп Вю1есН Аккоаа1ек, 1пс, Бирмингем, Алабама, номер по каталогу 2043-09).

Эти образцы были затем подвергнуты анализу при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (БАС8). Гранулярные комплексы, промаркированные ФИТЦ (которые указывали на присутствие авидина) и/или РЕ (что указывало на присутствие антитела к ФРГ), были детектированы на сканере БАС8сап фирмы ВесЮп Оюкткоп Вюкаепсе (ВО, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). На чертеже представлены графики рассеяния БАС8 для пяти антител к ФРГ, протестированных как представлено на фиг. 8.

В отдельных образцах два из десяти антител к ФРГ, описанных в примере 6 (те, которые были в конечном итоге выведены из гибридом 2.12.1 и 2.4.4), были отдельно инкубированы со слитыми белками, каждый из которых содержал следующие белки-мишени: полномерный человеческий ФРГ, б5 ФРГ и мышиный ФРГ, химеру № 1, химеру № 2 и химеру № 3. Эти образцы были подвергнуты описанному выше анализу БАС8 (анализу при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции).

Результаты этих экспериментов по связыванию обобщены на фиг. 10А, справа от схематической диаграммы. Ни антитело 2.12.1, ни антитело 2.4.4 не связывалось с химерой № 1. Оба антитела 2.12.1 и антитело 2.4.4 связывались с химерой № 2. Антитело 2.4.4 связывалось с химерой № 3. Антитело 2.12.1 не связывалось с химерой № 3.

Ό. Дальнейшее картирование эпитопа с использованием слитых белков.

Для предоставления дополнительно информации об эпитопе(-ах) ФРГ, с которыми связываются антитела 2.4.4 и 2.12.1, были сконструированы дальнейшие человеческие/мышиные химеры, и они были проанализированы, как описано выше в примере 8С (фиг. 10В). Затравки, использованные для генерации этих химер, показаны в табл.10.

- 51 015363

Таблица 10 Олигонуклеотиды, использованные для генерации химер человеческого/мышиного ФРГ и точковых мутантов, вставок и делеций

Номер послед овательно сти	Олиго №	Последовательность	η	Конструкция	Точки разрыва или мутация
124	3201-76	АТС ССТ СТС ССТ ТСА ТСА ТСС ТСС СТС САТ ТТС	33	Точковый мутант	11НСРР?547О
125	3201-75	АТС ССТ СТС ТСА АС С САА ОСТ САС ТСТ САА ТСА	33	Точковый мутант	11НСРК.647С
126	3201-72	АТС СОТ СТС ТАА СТА ССТ ААА ТСА АТС СТА СТА АСА	36	Точковый мутант	ΗΗΟΡΝ6018
127	3201-71	АТС ССТ СТС ТА6 ТТЛ ТСС АТС САС ААТ ТСС ТСА АА	35	Точковый мутант	6ΗΟΡΝ6018
128	3201-70	АТС ССТ СТС ААТ ТАТ ССА ССА САС САС ССС ТС	32	Точковый Мутант	6ΗΟΡΟ592Ν
129	3201-69	АТС ССТ СТС АТА АТТ ТТС ТТЛ СТА ССА ТТС АТТ ТАС	37	Точковый мутант	11ΗΟΡΟ592Ν
		С
130	3201-68	АТС ССТ СТС ССС ТТТ СТС АТС ТСС ТСТ ТСС ст	32	Точковый мутант	ИНСРС561К.
131	3201-67	АТС СОТ СТС ААА ССС ААА САС СТТ СТС ААТ СТТ Т	34	Точковый мутант	ШСРС561К
132	3201-66	АТС ССТ СТС СТТ ТСС тсс АСА ТСА ТСА АТТ ССА А	34	Точковый мутант	ЙНСРС555Е
133	3201-65	АТС ССТ СТС ССА ААС АСС АСА ТСА САА АТС САА А	34	Точковый мутант	Ы-КЗГС555Е
134	3201-64	ОАО САС СТС СТА ССА АСС ТТС СТА	24	Сайт рестрикции	ИНСЕ ιι- терминал + ΝοιΙ
135	3167-41	АТС ССТ СТС АСА САС ТТС ААА САС ТАТ САА ССТ ТС	3:	Деления	тНОТ ОК делеция
136	3167-42	АТС ССТ СТС СТС ТСТ ССС ТСС ААА АСА ТТС ТСТТ	34	Деления	тНСЕ ОК делеция
137	3167-44	АТС ССТ СТС ААС ААА САС ТТС ААА САТ ТАТ САА ССТ ТС____________________	38	Вставка	ИНСЕ ОК вставка

- 52 015363

138	3167-43	АТС СОТ СТС ТТТ ОТТ тсс АСА АОО ОАА АСА СТО ТСС	36	Вставка	ИНОЕ ЭК вставка
139	3167-37	АТС СОТ СТС ААО СТТ ОСС АОО ССТ ОСТ ОТ	29	Химера 9	ЬНОР аа586-3’
140	3167-40	АТС СОТ СТС ААО СТТ САС ТАА ААС САА ОТС ТСА	33	Химера 9	тНОР5’-аа585
141	3167-38	АТО СОТ СТС ААО СТТ ССТ СОА ССТ ОСА АТС	30	Химера 8	тНОР аа586-3’
142	3167-39	АТС СОТ СТС ААС СТТ САТ ТАА ААС САС АТС ТСА	33	Химера 8	ЬНОГ 5’-аа585
143	3167-37	АТС СОТ СТС ААО СТТ ОСС АОО ССТ ОСТ ОТ	29	Химера 7	ШОР аа586-3’
144	3167-40	АТС СОТ СТС ААС СТТ САО ТАА ААС САА ОТС ТОА	33	Химера 7	тНОР5’-аа585
145	3167-38	АТС ССТ СТС ААО СТТ ОСТ СОА ССТ ОСА АТС	30	Химера 3	тНОЕ аа58б-3’
146	3167-39	АТС ССТ СТС ААО СТТ САТ ТАА ААС САО АТС ТСА	33	Химера 3	ЬНОР 5’-аа585
147	3167-35	АТС СОТ СТС ТАС САТ ОСА ТСС ТТА СТТ ТСА САТ	А -)	Химера 2	ЬНОР аа507-3’
148	3167-36	АТС СОТ СТС АТС СТА СТС ТТС ТТТ ОТС ТТО САА Т	34	Химера 2	тНОР 5’-аа50б
149	3144-31	АТС СОТ СТС ТАС О АТ ОО А ТСС ТТА СТТ ТСА ААТ А	34	Химера 1	тНОР аа507-3’
150	3080-16	АТС СОТ СТС АТС СТА ТОТ ТТС ТТС ОТС ТТО С	31	Химера 1	ЬНОР 5'-аа506
151	3080-04	АТС СОТ СТС АТО САТ ССА АОО ТСА АОО АСА АО	32	Химера 6	ЬНОР аа307-3’
152	3144-28	АТС ССТ СТС АТО САТ ТСА ОТТ ОТТ ТСС АТА ОС	32	Химера 6	тНОР 5’-аа306
153	3079-84	АТО СОТ СТС АТС САТ ОАО СТС САА ТОО ОСА О	31	Химера 5	ЬНОГ аа213-3’
154	3144-27	АТС СОТ СТС АТО САТ ТСА АСТ ТСТ САА САС ТСА	33	Химера 5	тНОР 5’-аа212
155	3079-77	АТО ССТ СТС АТО САТ САТ ТОО ТАА АОО АСО С	31	Химера 4	ЬНОР аа 129-3'
156	3079-78	АТС ССТ СТС АТС САС ТТТ СТА АТА ТАС ТСТ ТТС ТТТ ТС	38	Химера 4	тНОР5’-аа128
157	3079-83	ΑΤΟ СОА ТСС СТА ТОА СТО	32	Сайт рестрикции	ЬНОР с-терминал + ВатН1

		ТОО ТАС СТТ АТА ТО
158	2870-60	АТС ССС ССС САС ААА ОСА ААА САА САА АТА САА ТТС	36	Сайт рестрикции	ЬНОГ 11- терминал + ΝοΐΙ
159	3013-96	СОО САТ ССТ ТАС ААС ТТО ТАТ СТС ААА АТТ АС	32	Сайт рестрикции	тНОР с- терминал + ВатН1
160	3013-95	АТС АТС ОСС ОСС ОСТ САО ААО ААА АСА АСА ААТ .АСА СТТ С________________	40	Сайт рестрикции	тНОР п- терминал + ΝοΐΙ

На фиг. 10В показаны схематические чертежи химерных молекул мышиного и человеческого ФРГ, созданных для исследования, со связывающим поведением антител 2.12.1 и 2.4.4 для каждой химеры, указанной в правой стороне чертежа. Химеры № 1-З в данном исследовании были идентичны химерам № 1-З, описанным в примере 8С и фиг. 10А. Химеры № 4-6 включали увеличенное количество Ν-конца мышиного ФРГ в остальном в абсолютно человеческой молекуле ФРГ. В химере № 7 использовались аминокислоты 507-585 мышиного ФРГ в остальном в абсолютно человеческой молекуле ФРГ и в химере

- 5З 015363 № 8 использовались аминокислоты 507-585 человеческого ФРГ в остальном в абсолютно мышиной молекуле ФРГ. Химера № 9 была сконструирована из аминокислот 1-585 мышиного ФРГ и аминокислот 586-731 человеческого ФРГ.

Связывание антител 2.4.4 и 2.12.1 в химерные белки анализировалось, как описано в примере 8С. После инкубации антитела 2.4.4 либо антитела 2.12.1 с одним из слитых белков, слитые белки в каждом образце отдельно улавливались с использованием покрытых биотином гранул (8р11его1ес11 Шс., Либертивиль, Иллинойс, номер по каталогу ТР-60-5). Получаемые в результате гранулированные протеиновые комплексы были промаркированы путем добавления маркированного ФИТЦ (ФИТЦ) антиавидинового антитела ^ес!ог ЬаЬ. Берлингейм, Калифорния, номер по каталогу 8Р-2040). Присутствие антител к ФРГ определялось путем добавления фикоэритрина (РЕ), маркированного гусиным античеловеческим антителом Е(аЬ')₂ (8ои111егп Βωί^Η А88ос1а!е8, Бчс.. Бирмингем, Алабама, номер по каталогу 2043-09). Затем эти образцы подвергались анализу ЕАС8 (анализу при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции). Гранулярные комплексы, маркированные ФИТЦ (которые указывали на присутствие авидина) и/или РЕ (которые указывали на присутствие антитела к ФРГ) детектировались на сканере Βесΐοη Оккшзоп Β^08С^еηсе ЕАС8сап (ΒΌ, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). В некоторых случаях после нормализации экспрессии с использованием ФИТЦ проводился одноцветный анализ ЕАС8 вслед за связыванием антитела меткой РЕ. Этот способ увеличивал чувствительность анализа и помогал в измерении связывания с конструкциями, не производящими экспрессию на очень высоких уровнях.

Как показано на фиг. 10Β, оба антитела 2.4.4 и 2.12.1 связывали химеру № 8 (фиг. 10Β), содержащую аминокислоты 507-585 человеческого ФРГ. Эти результаты давали основания полагать, что эта область содержит остатки, напрямую или косвенно участвующие в связывании антитела 2.4.4 и 2.12.1 с ФРГ. Химеры, содержащие мышиную последовательность в той же области 507-585 (химеры 7 и 9) не связывали антитела 2.12.1 или 2.4.4. Химера 3 не связывалась с антителом 2.12.1, но действительно связывалась с антителом 2.4.4, несмотря на присутствие аминокислот 507-585 человеческого ФРГ.

Для получения дальнейшей информации об аминокислотах 507-585 человеческого ФРГ (СVΜV8^ΒΥΒNКНIССС8^IКΕ8VV^ТАΒ^СЕР8Β-^^К^ΥΕАV^СIН^VНСΒ^ΕКСК^V^NV8^^VΥСРΕС8^^V^Μ (последовательность №: 123) (см. фиг. 10Ό)) были созданы мутантные ФРГ, содержащие специфические точковые мутации, изменяющие человеческий остаток на мышиный остаток в области аминокислот 507-585 (фиг. 10С), используя затравки, указанные в табл. 10. Были сконструированы человеческие слитые белки ФРГ-авидин, содержащие пять отдельных неконсервативных изменений аминокислот от человеческой последовательности ФРГ к мышиной последовательности ФРГ (регистрационные номера банка генов № NΜ_000601 и NΜ_010427 соответственно). Также были созданы две дополнительные конструкции, одна, содержащая две аминокислотные вставки в последовательность человеческого ФРГ, и другая, содержащая две аминокислотные делеции из мышиной последовательности (фиг. 10С).

Эти конструкции подвергались экспрессии и анализу связывания, как описано в примерах 8С и 8Ό. После инкубации антитела 2.4.4 или антитела 2.12.1 с одним из мутированных белков мутированные белки в каждом образце были отдельно уловлены с использованием покрытых биотином гранул (8рНего1ес11 Шс., Либертивиль, Иллинойс, номер по каталогу ТР-60-5). Получаемые в результате гранулированные белковые комплексы были затем промаркированы путем добавления маркированного ФИТЦ антиавидинового антитела ^ес!ог ЬаЬ, Берлингейм, Калифорния, номер по каталогу 8Р-2040). Присутствие антител к ФРГ определялось путем добавления маркированного фикоэритрином (РЕ) гусиного античеловеческого антитела Е(аЬ')₂ (8он1Негп Βωί^Η А^оаЛе^ Бирмингем, Алабама, номер по каталогу 2043-09). Эти образцы затем подвергались анализу при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (ЕАС8). Гранулярные комплексы, маркированные ФИТЦ (указывающие на присутствие авидина) и/или РЕ (что указывало на присутствие антитела к ФРГ), были детектированы с использованием сканера Βесΐοη Оюкпъоп Β^ο8с^епсе ЕАС8сап (ΒΌ, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). В некоторых случаях после нормализации экспрессии и использованием ФИТЦ выполнялся одноцветный анализ ЕАС8 вслед за связыванием антитела меткой РЕ. Этот способ увеличивал чувствительность анализа и помогал измерению связывания с конструкциями, которые не экспрессировались на очень высоких уровнях.

Было обнаружено, что у аминокислоты 561, а не у аминокислот 592, 601 или 647 нарушалось связывание между мутированным человеческим ФРГ и антителом 2.12.1, а также между мутированным человеческим ФРГ и антителом 2.4.4. Мутация у аминокислоты 555 нарушала связывание антитела 2.12.1, но не мешала связыванию антитела 2.4.4. Вставка двух мышиных аминокислот 540Ν и 541К, не присутствующих в человеческой последовательности (см. фиг. 10Ό), нарушала связывание обоих антител. Делеция этих двух аминокислот из мышиной последовательности ФРГ не приводила к связыванию этих антител с мышиным ФРГ.

Е. Картирование эпитопа путем анализов защиты протеазы.

Дополнительные классические анализы защиты протеазы были также проведены для идентификации эпитопов ФРГ антителом 2.12.1. См. Йи и Скалка (Υί апб 8ка1ка), Картирование эпитопов моноклональных антител против ВИЧ-1 интеграз с помощью ограниченного протеолиза и матричной лазерной десорбирующей масс-спектрометрии времени проведения ионизации, Биополимеры (Наука о пептидах)

- 54 015363 (Марршд Ерборек о£ Мопос1опа1 АпбЬоб1ек Адашк! Н1У-1 1п1едгаке \νίΐ1ι Ытбеб Рго1ео1ук1к апб Ма1пхАкк1к1еб Ьакег Эекогрбоп 1ошха1юп Т1те о£ ЕНцЫ Макк 8рес1готеРу. Вюро1утегк (Рерббе 8аепсе)) 55:308-318 (2000). Человеческий ФРГ (30 гамм (и - в англоязычных странах гамм - единица измерения ДНК (1 мкг)) г/10 гамм л) был смешан с антителом 2.12.1 (40 мкг/4 гамм л) в 2000 гамм л 0.1 М буфера Тпк. рН 7.5 и инкубировался на льду в течение 30 мин. Расщепление с трипсином (1 мкг) выполнялось при 37°С в течение 1 ч. Расщепленное вещество подвергалось обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого разрешения (НРЬС) для сепарации пептидов. Параллельно проводилось подобное же расщепление трипсином только человеческого ФРГ. без антитела 2.12.1. В колонка НРЬС (Уубас С18. 2.1x150 мм. Vубас 1пс.. Гесперия. Калифорния) прогонялась 0.1% трифтороуксусная кислота (ТЕА) с градиентом элюирования 2-35% ацетонитрила в 0.1% ТЕА. Ультрафиолетовый след (ЦУ) элюированных пептидов регистрировался устройством НРЬС НР 1090 (Не\\'1е11 Раскагб. Пало Альто). Две карты НРЬС (жидкостной хроматографии высокого разрешения) были сравнены для исследования пептидов. защищенных связью с антителом 2.12.1 (фиг. 11А).

Последующее Ν-концевое секвентирование и масс-спектрометрия были проведены для идентификации специфических защищенных пептидов. Ν-концевое секвентирование пептида осуществлялось путем деградации Эдмана на секвентере белка АВНРгошке (Аррбеб ВюкуЧетк. Фостер Сити. Калифорния). Аминокислоты в каждом цикле были идентифицированы с помощью времени приживления на соединенном устройстве НРЬС (жидкостной хроматографии высокого разрешения) и сравнения со стандартами аминокислот. Масс-спектрометрия защищенных фрагментов выполнялась на масс-спектрометре Регсербуе ^уадег (Арркеб ВюкуЧетк. Фремингхем. Массачусетс). Ионизация лазерной дисорбцией с помощью матрицы (МЛБО1) проводилась с использованием матрицы. 4-гидроксицианокоричной кислоты (НССА) или синаповой килоты. Молекулярные веса определялись калибровкой относительно известных стандартов (окисленная бета цепь инсулина и цитохром с).

Под-блок α человеческого ФРГ включает аминокислоты 32-494. а под-блок β включает аминокислоты 495-728 (см. 8\\зкк Рго1 ввод Р14210 для человеческого ФРГ). Антитело 2.12.1. связывающееся с человеческим ФРГ. защищало два пика. Т33 и Т38.6 (фиг. 11А). Пик Т38.6 содержал два пептида. оба из которых соответствовали последовательности. находящейся у или около начала под-блока β зрелого ФРГ (см. фиг. 10Ό. последовательность. начинающуюся у выделенного жирным шрифтом подчеркнутого текста (VVNСIРТЯТN (последовательность №: 172)). и фиг. 11С). Т33 был выведен из под-блока α (фиг. 11С). Основываясь на масс-спектрометрии наблюдаемые массы двух пептидов в пике Т38.6 измерялись и составляли 7165 и 6840 Да соответственно. Основываясь на возможных сайтах расщепления трипсина. присутствующих в последовательности ФРГ (см.. например. выделенный жирным шрифтом и подчеркнутый остаток аргинина у аминокислоты 559 человеческого ФРГ на фиг. 10Ό). прогнозируется. что остаток аргинина номер 559 определяет С-конец защищенных пептидов.

Другой дополнительный эксперимент был также предназначен для исследования связывающих антитела пептидов. Смесь ФРГ и антитела 2.12.1. как описано выше. расщеплялась с трипсином в течение одного часа и затем подвергалась фильтрации с помощью Мюгосоп® (Мбброге Согр.. Бедфорд. Массачусетс) для удаления несвязанных пептидов. Ожидалось. что связанные пептиды будут уловлены мембраной вместе с антителом 2.12.1. Нетронутый человеческий ФРГ (15 мкг) добавлялся к смеси пептидантитело 2.12.1 для элюирования связанного пептида(-ов) из комплекса. Образец инкубировался в течение ночи при 4°С и затем вновь подвергался фильтрации с помощью Мюгосоп® для отделения элюированных ФРГ-элюированных пептидов из антитела и нетронутого ФРГ. Оба образца (связанные и несвязанные пептиды) были проанализированы обратнофазовой НРЬС (жидкостной хроматографией высокого разрешения) (фиг. 11В). Связанные пептиды изолировались НРЬС и подвергались Ν-концевому секвентированию и масс-спектрометрии. как описывалось выше.

Когда ФРГ использовался для элюирования связанных пептидов. наблюдался большой пик пептидов (Т48 на фиг. 11В). элюированный из комплекса антитело-ФРГ и с помощью Ν-концевого секвентирования пептидов было идентифицировано. что он содержит те же две последовательности под-блока β. как и обнаруженные выше в Т38.6. Размер пептида(-ов) в пике Т48 был неоднородным. основываясь на масс-спектрометрии. и. следовательно. на основании этих данных не мог быть предсказан точный С-конец. Три других пика (промаркированных # на фиг. 11В) либо не содержали пептида. либо содержали пептид неизвестного происхождения. несвязанный с ФРГ.

Совместно эти два эксперимента указывали. что Ν-концевая область под-блока бета ФРГ является частью эпитопа для антитела 2.12.1. Эти данные дополняют данные в примере 8Ό. где было обнаружено. что участвующие в связывании эпитопы были расположены внутри аминокислот 507-585 человеческого ФРГ. Мутационный анализ и молекулярные массы защищенных пептидов показывают. что связывающий антитело эпитоп человеческого ФРГ расположен внутри аминокислот 495-556 человеческого ФРГ.

Е. Конкурентное связывание антител.

Антитела к ФРГ. описанные в примере 6. в конечном итоге выведенные из гибридомы 2.4.4 (антитело 2.4.4) и антитела к ФРГ. в конечном итоге выведенные из гибридомы 2.12.1 (антитело 2.12.1). были промаркированы ФИТЦ (флуоресцинизотиоцианатом) для следующего использования в конкурентном

- 55 015363 анализе. Антитела 2.4.4 и 2.12.1 были отдельно диализованы в ЗФР (забуференном фосфатом физиологическом растворе), рН 8.5. Метка ФИТЦ-МТС (смешанные изомеры сукцинимидилового эфира (5(6)8РХ]6-флуоресцеин-5-(и-6)-карбоксамидо]гексановой кислоты) (ΜοΚαι1;·π РгоЬек. Номер по каталогу Р-2181) добавлялась к каждому из двух диализованных антител при молярном соотношении 5:1 (метка:антитело) из раствора метки ФИТЦ при 5 мг/мл в ДМСО (диметилсульфоксид). Эти смеси инкубировались при комнатной температуре (20-22°С) в течение ночи в темноте. Затем смеси были отдельно прогнаны через колонки Рйагтааа ΡΌ-10 (Атегкйат, Пискатавей, Нью-Джерси), которые были выровнены ЗФР (забуференном фосфатом физиологическом раствором). Полученные препараты считывались на спектрофотометре при 280 и 495 нМ. Концентрации антител этих препаратов были рассчитаны при использовании поглощающей способности при 280 нМ. Соотношение меченого антитела к немеченому антителу было рассчитано с использованием следующей формулы:

Ах х молекулярный вес антитела = молярное меченое антитело

Е мг антитела/мл молярное немеченое антитело где Ах = поглощаемость метки при 495 нм и Е = коэффициент экстинкции метки=77500. Обычно антитело метилось приблизительно 3:1 (меченное ФИТЦ антитело :немеченое антитело).

Была оценена способность каждого из двух меченых антител конкурировать за связывание с каждым из девяти других антител к ФРГ. Каждое из двух меченых антител к ФРГ инкубировалось отдельно с ФРГ и каждое из двух меченых антител к ФРГ было также отдельно инкубировано с ФРГ в присутствии 50-кратного молярного избытка других девяти антител к ФРГ, которые не были помечены. Таким образом, в девяти отдельных образцах, меченое антитело 2.4.4 было отдельно инкубировано с ФРГ вместе с каждым из девяти других антител к ФРГ, которые не были помечены. Подобным же образом, в девяти отдельных образцах меченое антитело 2.12.1 было отдельно инкубированным ФРГ вместе с каждым из девяти других антител к ФРГ, которые не были помечены. Каждая из этих комбинаций была также повторена, используя сплайсовый вариант ФРГ 65 вместо полномерного ФРГ.

Позитивный контрольный образец конкуренции для данных конкурентных анализов состоял в инкубации каждого меченого антитела 50-кратным молярным излишком того же антитела, которое не было помечено. Таким образом, меченное ФИТЦ антитело 2.12.1 инкубировалось в присутствии, и отдельно в отсутствии, 50-кратного молярного избытка немеченого антитела 2.12.1. Подобным же образом, меченное ФИТЦ антитело 2.4.4 инкубировалось в присутствии и в отсутствии 50-кратного молярного избытка немеченого антитела 2.4.4. Как и ожидалось, флуоресцентные сигналы от образцов в присутствии 50-кратного молярного избытка немеченых антител были значительно ниже, чем флуоресцентные сигналы от образцов, в которые немеченые антитела не добавлялись.

На фиг. 12 представлены профили связывания. Фиг. 12А и 12В показывают эксперименты с использованием меченого антитела 2.12.1. Ключ к кривым во всех полосках на 12А и 12В: А: отрицательный контрольный образец (меченное ФИТЦ антитело 2.12.1 без ФРГ); В: положительный контрольный образец (меченное ФИТЦ антитело 2.12.1 с ФРГ); С: антитело 1.74.1; Ц:антитело 1.75.1; Е: антитело 1.29.1; Р: антитело 3.10.1; О: антитело 1.61.3; Н: антитело 1.24.1; Ι: антитело 1.60.1; 1: антитело 2.40.1; К: антитело 2.12.1; Ь: антитело 2.4.4. На фиг. 12А показаны результаты анализа конкурентного связывания с использованием флуоресцентного антитела 2.12.1 с сплайсовым вариантом белка мишени ФРГ 65. На фиг. 12В показаны результаты конкурентного анализа связывания с использованием флуоресцентного антитела 2.12.1. с полномерным белком мишени ФРГ. На фиг. 12С и 12Ό показаны эксперименты с использованием меченого антитела 2.4.4. Ключ к кривым на всех полосках фиг. 12С и 12Ό. А: отрицательный контрольный образец (меченное ФИТЦ антитело 2.4.4 без ФРГ); В: положительный контрольный образец (меченное ФИТЦ антитело 2.4.4 с ФРГ); С: антитело 1.74.1; Ό: антитело 1.75.1; Е: антитело 1.29.1; Р: антитело 3.10.1; О: антитело 1.61.3; Н: антитело 1.24.1; Ι: антитело 1.60.1; 1: антитело 2.40.1; К: антитело 2.12.1; Ь: антитело 2.4.4. На фиг. 12С показаны результаты из конкурентного анализа связывания с использованием флуоресцентного антитела 2.4.4 с сплайсовым вариантом белка мишени ФРГ 65. На фиг. 12Ό показаны результаты конкурентного анализа связывания с использованием флуоресцентного антитела 2.4.4 с полномерным белком мишени ФРГ.

Данные показывают, что каждое из десяти антител к ФРГ конкурирует с каждым из двух меченых антител за связывание с полномерным ФРГ или ФРГ 65. Некоторые антитела проявляли полную конкуренцию с меченым антителом (например, антитела 2.12.1. 1.24.1 и 2.4.4 конкурируют полностью с меченным ФИТЦ антителом 2.12.1, фиг. 12А и 12В, пики Н, К и Ь соответственно). Другие антитела только частично конкурировали за связывание (например, антитела 2.12.1, 2.40.1 и 1.61.3 частично конкурируют с меченным ФИТЦ 2.4.4, фиг. 12С и 12Ό, пики К, ί и О соответственно).

Пример 9. Нейтрализующие анализы ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ).

Нейтрализационный твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) был разработан для оценки могут ли антитела, рассмотренные в примере 6, прерывать связывание Ме!-ФРГ. 96 луночные планшеты Дельфия (номер по каталогу: ΑΑΑΝΌ-0001, \Уа11ас Ιηα, Гейтерсбург, Мериленд) покрывались ФРГ путем добавления 100 мкл ФРГ при 6,25 мкг/мл на лунку. Планшеты инкубировались при 37°С в течение 1 ч или при 4°С в течение ночи. Затем планшеты блокировались 5% В8А (номер по каталогу 50-61-00,

- 56 015363

КРЬ, Гейтерсбург, Мериленд) в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащим 0,1% Тетееп 20 в течение 1 ч при комнатной температуре при взбалтывании.

Образцы тестов готовились отдельным смешиванием растворимого Ме! (2 нМ, 0,256 мкг/мл) с различными концентрациями определенного тестируемого антитела к ФРГ. Тестируемые концентрации составляли: 667, 223, 74,1, 24,7, 8,2, 2,7, 0,91, 0,30, 0,10 и 0,034 нМ. К каждой лунке планшета добавлялось 10 мкл тестового образца. Планшеты затем инкубировались при 4°С в течение ночи и затем 4 раза промывались ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором), содержащим 0,1% Т\тееп 20. Затем добавлялось 100 мкл биотинилированного антитела анти-сМе!В (номер по каталогу: ВАЕ358, Ε&Ό 8ук1етк 1пс., Миннеаполис, Миннесота) при 2 мкг/мл. Это антитело связывается с комплексами Ме!-ФРГ на планшете, но не связывается с анти-ФРГ антителом, связанным с ФРГ на планшете. Затем планшеты инкубировались в течение 2 ч при встряхивании и промывались 4 раза ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором), содержащим 0,1% Т\тееп 20. Добавлялся Еи-стрептавидин (1:1000 разбавление в буфере анализа) (номер по каталогу 1244-360, \Уа11ас 1пс., Гейтерсбург, Мериленд), и планшеты встряхивались при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты 4 раза промывались ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором), содержащим 0,1% Т\тееп 20. Затем добавлялось 100 мкл усилительного буфера (^а11ас 1пс., номер по каталогу 1244-105, Гейтерсбург, Мериленд). После по крайней мере 5 мин планшеты считывались с использованием способа Европиум на У1с!ог 2 (многометочный счетчик 1420, \Уа11ас 1пс., Гейтерсбург, Мериленд).

Рассчитывался процент ингибирования связывания Ме! с ФРГ (т.е. нейтрализация) и значения 1С₅₀ определялись с использованием уравнения аппроксимации 4 параметров ЕхсеИг!, версия 2.0.6 (Микрософт Инк., Сиэтл, штат Вашингтон). Производилась нейтрализация связывания Ме! с ФРГ в присутствии антител к ФРГ, упомянутая в примере 6. Данные двух экспериментов показаны на фиг. 13.

Пример 10. Нейтрализация в клетках.

А. Фосфорилирование Ме!.

ФРГ вызывает фосфорилирование Ме! в клетках РС-3 (АТСС, Манассас. Вайоминг, # СВЬ 1435). Клетки РС-3 выращивались в 96-луночных планшетах для культивирования тканей Еа1соп (У^/В, СанДиего, Калифорния, номер по каталогу 62740-081) путем добавления 1х10⁴ клеток РС-3 на лунку в 100 мкл ВРМ1 1640 (1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 11875-093), содержащих 5% плодной бычьей сыворотки (Нус1опе, Логан, Юта, номер по каталогу 8Н 30070.03) и 1х пенициллина, стрептомицина, глютамина (1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 10378-016). После 24 ч роста при 37°С в атмосфере 5% СО2 клетки смывались один раз глюкозой с низким содержанием модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (ЭМЕМ) (1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния, номер по каталогу 11885-084), содержащей 0,1% альбумина бычьей сыворотки (81дта, Луис, Миссури, номер по каталогу А-31156) и инкубировались в течение от 18 до 20 ч с 100 мкл глюкозной среды с низким содержанием ЭМЕМ, содержащей 0,1% альбумина бычьей сыворотки (81дта, Луис, Миссури, номер по каталогу А-3156).

Восемь различных разбавлений каждого из десяти антител к ФРГ из примера 6 были по отдельности приготовлены последовательным растворением в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы с 0,1% альбумина бычьей сыворотки, содержащей 200 нг/мл ФРГ. Концентрации антител к ФРГ в отдельных титрах (раствора) составляли: 200, 67, 22, 7, 2,5, 1, 0,3 и 0,1 нМ, определенного антитела к ФРГ. Эти растворы антитела/ФРГ инкубировались в течение 30 мин при температуре 37°С.

Клетки РС-3 один раз промывались 100 мкл ЭМ ЕМ (модифицированной по способу Дульбекко среде Игла) с низким содержанием глюкозы с 0,1% альбумина бычьей сыворотки. 100 мкл каждого из растворов антитела/ФРГ отдельно добавлялись к отдельными лункам с клетками РС-3. После инкубации в течение 10 мин при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ растворы антитело/ФРГ отсасывались из лунок и планшеты помещались на лед на 1-2 мин. Клетки смывались один раз 100 мкл холодного как лед ЗФР (забуференного фосфатом физиологического раствора), содержащего 0,3 мМ ванадата натрия-орто (81дта, Луис, Миссури, номер по каталогу 8-6508). Смытые клетки инкубировались в течение 15-30 мин на льду в 60 мкл лизисного буфера, содержащего 1% Ттйоп Х-100 (Йетсе, Рокфорд, Иллинойс, номер по каталогу 28314), 50 мМ Тпк, рН 8, 100 мМ хлористого натрия, 0,3 ванадата натрия-орто (81дта, Луис, Миссури, номер по каталогу 8-6508) и коктейле 1Х ингибитора протеазы (81дта, номер по каталогу Р-8340).

Покрытые антителом анти-Ме! гранулы приготавливались путем инкубации стрептавидина ЭупаЬебк М-280 (IСЕN 1п!етпайопа1, Гейтерсбург, Мериленд, номер по каталогу 110029) с 4 мкг/мл гусиного анти-Ме! биотина (Κ&Ό 8ук!етк 1пс., Миннеаполис, Минесота, номер по каталогу ВАЕ 358) в течение 30 мин при комнатной температуре в ЗФР (забуференном фосфатом физиологическом растворе), содержащем 1% альбумина бычьей сыворотки (81дта, Сейнт-Луис, Миссури, номер по каталогу А-7888), 0,1% Т\тееп 20 (Вютаб, Херкулес, Калифорния, номер по каталогу 170-6531). Объем 25 мкл гранул, покрытых антителом анти-Ме! на лунку помещался в 96 луночные лабораторные планшеты Сок!аг (Корнинг, Нью-Йорк, номер по каталогу 3365).

- 57 015363

Объем 25 мкл каждого различного лизата клеток РС-3 отдельно добавлялся к каждой лунке, содержащей покрытые антителом анти-Ме! гранулы. Планшеты инкубировались в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Объем 12,5 мкл ЗФР, содержащего 1% альбумина бычьей сыворотки (81дта, Луис. Миссури, номер по каталогу А-7888), 0,1% Т\гееп 20 (Вютаб, Херкулес, Калифорния, номер по каталогу 170-6531) и 0,04 мкг антифосфотирозин антитела 4С10 (Ирк!а!е Вю!есйпо1оду, Лейк Плесид, Нью-Йорк, номер по каталогу 05-321) добавлялись на лунку и инкубировались в течение 1 ч при комнатной температуре при встряхивании. Добавлялся объем 12,5 мкл ЗФР, содержащего 1% альбумина бычьей сыворотки, 0,1% Т\гееп 20 и 8 мкг/мл антимышиной метки ОВ1-ТАС (IСЕN 1п!етпа!юпа1, Гейтерсбург, Мериленд, номер по каталогу 110087) и планшеты инкубировались в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. Сигнал (выраженный в отсчетах ΙΟΗΝ) определялся в считывающем устройстве IСЕN М8 (IСЕN 1п!егпа!юпа1, Гейтерсбург, Мериленд). Рассчитывались значения 1С₅₀, используя уравнение аппроксимации четырех параметров и пакет программного обеспечения Ехсе1Пк версия 2.0.6, (Микрософт Инк., Сиэтл, Вашингтон). Данные для двух экспериментов с использованием формата IСЕN показаны на фиг. 14. Для каждого из десяти антител к ФРГ значения 1С₅₀ находились в низком наномолярном до субнаномолярного диапазона.

В. Нейтрализация роста/выживания υ-87 МС.

Клетки И-87 МС (АТСС # НТВ-14) являются человеческой глиобластомной линией, которая экспрессирует как Ме!, так и ФРГ. Рост/выживание этих клеток в культуре не усиливается экзогенным ФРГ. Эндогенное Ме!, однако, кажется, активируется эндогенным ФРГ при условиях роста. Прерывание связывания эндогенного ФРГ с эндогенным Ме! может привести к уменьшению роста и/или выживания.

Клетки И-87 МС выращивались в 96-луночных лабораторных планшетах Сок!ат (Согшпд, НьюЙорк, номер по каталогу 3365) путем добавления 800 клеток на лунку в среде 1МЕМ (С1Ьсо ВВЬ, ВоскУ111е, МО, номер по каталогу 11125-028), содержащей 5% ЕВ8. После приблизительно 24 ч каждая из одиннадцати различных концентраций каждого из десяти антител к ФРГ из примера 6 добавлялась в отдельные лунки с клетками И-87 МС. Концентрации антител к ФРГ в отдельных растворах были: 100, 33,3, 11,1, 3,7, 1,2, 0,4, 0,14, 0,05, 0,015 мкг/мл, 5,1 и 1,7 нг/мл определенного антитела к ФРГ.

Через семь дней после добавления антител к ФРГ среда удалялась из планшетов и клетки фиксировались 100 мкл 10% трихлороуксусной кислоты (81дта 1пс., Сейнт Луис, Миссури, МО, номер по каталогу Т-9159) на лунку и инкубировались при 4°С в течение 1-2 ч. Лунки промывались 5 раз водой из-под крана. Зафиксированные клетки окрашивались 100 мкл 0,4% сульфоргодамина В (81дта, Сейнт Луис, Миссури, номер по каталогу 8-9012) в 1% уксусной кислоте (Екйет, Питтсбург, Пенсильвания, номер по каталогу υΝ2789) с помощью десятиминутной инкубации при комнатной температуре. Вслед за окрашиванием клетки промывались 5 раз 1% уксусной кислотой и высушивались на воздухе. Оптическая плотность планшетов при 540 нм считывалась на микротетрированном устройстве для считывания планшетов (8рес!таМах РЬи8, Мо1еси1аг Оеукек, Саннивейл, Калифорния). Оптическая плотность пропорциональна общему количеству белка, присутствующему в монослое клеток и таким образом является мерилом выживания/пролиферации клеток за 7-дневный период анализа. Для расчета значений 1С₅₀ процент ингибирования рассчитывался в сравнении с клетками, ингибированными с антителом контроля изотипа или без антитела. Значения 1С₅₀ рассчитывались, используя уравнения аппроксимации четырех параметров и пакета программного обеспечения Ехсе1Г1!, версия 1.0.6 (Микрософт Инк., Сиэтл, Вашингтон).

Данные для двух экспериментов показаны на фиг. 15. Все десять антител к ФРГ, описанные в примере 6, ингибировали рост/выживание клеток υ-87 МС. Значения 1С₅₀ каждого антитела обычно были менее 100 нМ.

Пример 11. Нейтрализация в ксенотрансплантантных опухолях.

А. Модель минимального остаточного заболевания ксенотрансплантата υ-87 МС.

Клетки υ-87 МС выращивались до почти конфлюентности и затем суспендировались при концентрации 25х10⁶ клеток/мл. Клетки визуально оценивались как жизнеспособные на >98,5%, как определялось исключением трипановой синьки. Для тестирования отдельного антитела к ФРГ 5х10⁶ клеток υ-87 МС в свободной от сыворотки среде вводились подкожно в правый бок пятидесяти мышей женского пола (СЭ1 Μι/Νικ СНаг1ек В1ует ЬаЬота!от1ек, Вилмингтон, Массачусетс). Пятьдесят мышей были разбиты на пять групп по десять мышей в каждой.

Каждой мыши в определенной группе из десяти мышей делалась внутрибрюшинная инъекция той же самой дозы того же самого антитела к ФРГ, как и рассмотренный в примере 7, или они подвергались воздействию постоянной зоны 1дС1 (контроль изотипа). Протестированные дозы антитела составляли: 1, 3, 10 и 30 мкг на инъекцию. Инъекции антитела проводились два раза в неделю в течение четырех недель, начиная со дня 2 после инъекции клеток υ-87 МС. Измерение опухоли и веса тела регистрировались два раза в неделю в течение 30 дней и объемы опухолей вычислялись по формуле: длина х ширина х высота. Результаты анализировались с помощью статистической программы 8!а!У1ете® (8А8 1пкй!и!е, 1пс., Кери, Северная Каролина) используя повторяемые измерения АNОУА, за которыми следует последующий тест ЗНеГГе.

В отдельных экспериментах каждые из десяти антител к ФРГ, рассмотренных в примере 6, тестиро

- 58 015363 вались по этой модели. На фиг. 16А показан эксперимент отклика на дозу для антитела 2.4.4. Стрелки указывают время дозирования, и дозы показаны в объяснении условных знаков на чертеже. Количество животных для каждой дозы (из 10) без измеримой опухоли показано в скобках. Для двух самых высоких протестированных доз, 10 мкг, вводимых два раза в неделю, и 30 мкг, вводимых два раза в неделю, ингибирование роста опухоли было статистически значимым по сравнению с контрольными животными, получающими контрольный образец изотипа по 30 мкг два раза в неделю (человеческий 1дС2 # РК16.3.1, АЬдешх 1пс., Фремонт, Калифорния). Незначительное, но статистически не значимое, ингибирование роста наблюдалось с 2 более низкими дозами (1 и 3 мкг два раза в неделю). Данные представлены как усредненные +/- стандартная погрешность; п=10 животных на группу и р<0,05 считалось статистически значимым. Эксперименты с тестированием других девяти антител к ФРГ из примера 6 демонстрировали сходное полное ингибирование роста опухоли при более высоких дозах.

B. Модель установившейся болезни ксенотрансплантата И-87 МС.

Клетки И-87 МС в свободной от сыворотки среде вводились в мышей, за чем следовала процедура, описанная выше в примере 11А. Опухоли давали вырасти в течение приблизительно 2 недель до тех пор, пока она не достигала объема ~200 нм³ перед началом внутрибрюшинного дозирования антителами к ФРГ. Мыши подвергались обработке два раза в неделю антителом 2.4.4 при дозе 200, 100 или 30 мкг два раза в неделю, начиная со дня 16, как указано стрелками на фиг. 16В. Объем опухоли измерялся и оценивался, как описано выше. Число животных (10) с неизмеряемой опухолью в день 30 указано в скобках. Полное ингибирование роста опухоли И-87 МС наблюдалось при всех дозах. Статистически значимая регрессия установленных опухолей наблюдалась ко дню 29. В отдельных экспериментах каждые из десяти антител к ФРГ, рассмотренных в примере 6, были протестированы по данной модели, и наблюдалось полное ингибирование при более высоких дозах каждого антитела.

C. Ранжирование антител в модели минимальной остаточной болезни И-87 МС.

Для определения относительной эффективности десяти антител к ФРГ, рассмотренных в примере 11А, была выбрана низкая доза, только частично ингибировавшая рост опухоли в модели минимальной остаточной болезни. Предварительные исследования отклика на дозу (фиг. 16А) давали основания полагать, что 5 мкг два раза в неделю дадут частичное ингибирование антителами к ФРГ. Была проведена серия почти равноценных экспериментов по сравнению 5 различных антител к ФРГ. Результаты двух из этих экспериментов показаны на фиг. 16С и 16Ό. ** указывают те антитела к ФРГ, которые значительно ингибировали рост опухоли по сравнению с ЗФР и антителом 1дС2 контроля изотипа (р<0,0001).

Подобные же эксперименты по расположению по рангам выполнялись с использованием модели установленного заболевания И-87, рассмотренного в примере 11В. В этих экспериментах использовалась доза в 10 мкг 2 раза в неделю. Результаты этих двух экспериментов показаны на фиг. 16Е и 16Р.

Claims (81)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенная легкая цепь антитела к фактору роста гепатоцитов (ФРГ), включающая по крайней мере один гипервариабельный участок (СЭК), выбранный из СЭК1а, СЭК2а и СЭК3а, при этом СЭК1а включает аминокислотную последовательность а Ь с б е £ д 11 ί _) к 1 т п о р д, где аминокислота а выбрана из лизина, аргинина или глутамина; аминокислота Ь выбрана из серина или аланина; аминокислота с является серином; аминокислота б является глутамином; аминокислота е выбрана из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота £ выбрана из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбрана из лейцина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ί является серином или не присутствует; аминокислота _) является серином или не присутствует; аминокислота к выбрана из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбрана из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота п выбрана из аспарагина или серина; аминокислота о выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбрана из аланина, глицина или аспарагина;

   при этом СЭК2а включает аминокислотную последовательность г 5 ΐ и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глутаминовой кислоты или глицина; аминокислота 5 является аланином; аминокислота ΐ является серином; аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глутаминовой кислоты, глутамина или аланина; и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

   при этом СЭК3а включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' ί¹ д' 1', где аминокислота у выбрана из глутамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глутамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота б' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокис

   - 59 015363 последовательность, последовательность, последовательность, последовательность, лота Г является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином и аминокислота 11' является треонином или аспарагином;

   причем указанная легкая цепь в соединении с тяжелой цепью антитела к ФРГ способна связывать ФРГ и нейтрализовать связывание ФРГ с рецептором с-Ме!.
2. 2. Легкая цепь по п.1, включающая по крайней мере одну аминокислотную выбранную из последовательности №: 24 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 26 от остатка 21 до остатка 133; последовательности №: 28 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 30 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 32 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 34 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 36 от остатка 21 до остатка 133; последовательности №: 38 от остатка 21 до остатка 128; последовательности №: 40 от остатка 23 до остатка 129 и последовательности №: 42 от остатка 21 до остатка 128.
3. 3. Легкая цепь по п.1, включающая по крайней мере одну аминокислотную выбранную из последовательностей №: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 и 69.
4. 4. Легкая цепь по п.1, включающая по крайней мере одну аминокислотную выбранную из последовательностей №: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 и 79.
5. 5. Легкая цепь по п.1, включающая по крайней мере одну аминокислотную выбранную из последовательностей №: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 и 89.
6. 6. Выделенная тяжелая цепь антитела к ФРГ, включающая по крайней мере один гипервариабельный участок (СОК), выбранный из СОК1Ь, СЭК2Ь и СОК3Ь, при этом СЭК1Ь включает аминокислотную последовательность а Ь с б е £ д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбрана из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота б является тирозином; аминокислота е выбрана из тирозина или глицина; аминокислота £ выбрана из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

   при этом СЭК2Ь включает аминокислотную последовательность 1 ί _) к 1 т п о р д г з ! и ν ν х, где аминокислота 1 выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глутаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота _) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина, или гистидина, аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота п выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота д выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота з выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота ! выбрана из глутамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и выбрана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина, валина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глутамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

   при этом СЭК3Ь включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' ί¹ д' 1' 1' к' 1' т' п' о' р' д' г', где аминокислота у выбрана из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, гистидина, пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глутаминовой кислоты, тирозина, лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина, аспарагина, глицина, гистидина, тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина, серина, глутаминовой кислоты, тирозина, глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота б' является глицином или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота £' является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота 1' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота _)' выбрана из тирозина, глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина, фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина, глицина, аспарагиновой кислоты, пролина или серина или не присутствует; аминокислота п' выбрана из глицина, валина, тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина, аланина, глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина, фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина, тирозина, изолейцина или пролина; причем указанная тяжелая цепь в соединении с легкой цепью антитела к ФРГ способна связывать ФРГ и нейтрализовать связывание ФРГ с рецептором с-Ме!.

   - 60 015363
7. 7. Тяжелая цепь по п.6, включающая по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

   последовательности №: 27 от остатка 20 до остатка 137; последовательности №: 29 от остатка 20 до остатка 139; последовательности №: 31 от остатка 20 до остатка 148; последовательности №: 33 от остатка 20 до остатка 139; последовательности №: 35 от остатка 20 до остатка 144; последовательности №: 37 от остатка 20 до остатка 142; последовательности №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

   последовательности №: 41 от остатка 20 до остатка 140 и последовательности №: 43 от остатка 20 до остатка 139.
8. 8. Тяжелая цепь по п.6, включающая по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 90, 91, 92, 93, 94. 95, 96, 97, 98 и 99.
9. 9. Тяжелая цепь по п.6, включающая по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 и 109.
10. 10. Тяжелая цепь по п.6, включающая по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 и 119.
11. 11. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:

    (ί) легкую цепь, включающую по крайней мере один гипервариабельный участок (СПК), выбранный из СПК1а, СЭК2а и СВК3а, при этом СЭК1а включает аминокислотную последовательность а Ь с б е Г д 1 ΐ _) к 1 т п о р ς, где аминокислота а выбрана из лизина, аргинина или глутамина; аминокислота Ь выбрана из серина или аланина; аминокислота с является серином; аминокислота б является глутамином; аминокислота е выбрана из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота Г выбрана из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбрана из лейцина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ΐ является серином или не присутствует; аминокислота _) является серином или не присутствует; аминокислота к выбрана из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбрана из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота п выбрана из аспарагина или серина; аминокислота о выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбрана из аланина, глицина или аспарагина;

    при этом СЭК2а включает аминокислотную последовательность г 8 ! и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глутаминовой кислоты или глицина; аминокислота 8 является аланином; аминокислота ! является серином; аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глутаминовой кислоты, глутамина или аланина и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

    при этом СЭК3а включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' Г¹ д' 1', где аминокислота у выбрана из глутамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глутамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота б' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокислота Г' является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином и аминокислота 1' является треонином или аспарагином; и (ίί) тяжелую цепь, включающую по крайней мере один гипервариабельный участок (СПК), выбранный из СОК1Ь, СЭК2Ь и СОК3Ь, при этом СЭК1Ь включает аминокислотную последовательность а Ь с б е Г д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбрана из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота б является тирозином; аминокислота е выбрана из тирозина или глицина; аминокислота Г выбрана из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

    при этом СТОИТЬ включает аминокислотную последовательность 1 ί _) к 1 т п о р с.| г 8 ! и ν ν х, где аминокислота 1 выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глутаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота _) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина или гистидина, аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота п выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота с.| выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота 8 выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота ! выбрана из глутамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и вы

    - 61 015363 брана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина. валина или лейцина; аминокислота и выбрана из глутамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

    при этом СЭК3Ь включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' Г¹ д' Б' 1' _)' к' 1' т' п' о' р' д' г'. где аминокислота у выбрана из глутаминовой кислоты. аспарагиновой кислоты. серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина. глутаминовой кислоты. аспарагиновой кислоты. гистидина. пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глутаминовой кислоты. тирозина. лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина. аспарагина. глицина. гистидина. тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина. серина. глутаминовой кислоты. тирозина. глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота б' является глицином или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота Г' является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота Б' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота _)' выбрана из тирозина. глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина. фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина. аспарагиновой кислоты. гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина. глицина. аспарагиновой кислоты. пролина или серина или не присутствует; аминокислота п' выбрана из глицина. валина. тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина. аланина. глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина. фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина. тирозина. изолейцина или пролина; и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны связывать ФРГ и нейтрализовать связывание ФРГ с рецептором с-Ме!.
12. 12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность. выбранную из последовательности №: 24 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 26 от остатка 21 до остатка 133; последовательности №: 28 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 30 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 32 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 34 от остатка 23 до остатка 129; последовательности №: 36 от остатка 21 до остатка 133; последовательности №: 38 от остатка 21 до остатка 128; последовательности №: 40 от остатка 23 до остатка 129 и последовательности №: 42 от остатка 21 до остатка 128.
13. 13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность. выбранную из последовательности №: 25 от остатка 20 до остатка 141; последовательности №: 27 от остатка 20 до остатка 137; последовательности №: 29 от остатка 20 до остатка 139; последовательности №: 31 от остатка 20 до остатка 148; последовательности №: 33 от остатка 20 до остатка 139; последовательности №: 35 от остатка 20 до остатка 144; последовательности №: 37 от остатка 20 до остатка 142; последовательности №: 39 от остатка 20 до остатка 139; последовательности №: 41 от остатка 20 до остатка 140 и последовательности №: 43 от остатка 20 до остатка 139.
14. 14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 23 до остатка 129. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141.
15. 15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137.
16. 16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139.
17. 17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148.
18. 18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. включающие легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139.

    - 62 015363
19. 19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144.
20. 20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142.
21. 21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139.
22. 22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140.
23. 23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139.
24. 24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 и 69.
25. 25. Антитело по п.11, включающее по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 и 79.
26. 26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 и 89.
27. 27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99.
28. 28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 и 109.
29. 29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 и 119.
30. 30. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие тяжелую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    последовательности №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    последовательности №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    последовательности №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    последовательности №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    последовательности №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 41 от остатка 20 до остатка 140;

    последовательности №: 43 от остатка 20 до остатка 139 и легкую цепь, включающую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности №: 24 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 26 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 28 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 30 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 32 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 34 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 36 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 38 от остатка 21 до остатка 128;

    последовательности №: 40 от остатка 23 до остатка 129 и последовательности №: 42 от остатка 21 до остатка 128.
31. 31. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.30, которые имеют по крайней мере одно свойство, выбранное из следующих:

    а) конкурируют за связывание с ФРГ по крайней мере с одним антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, выбранными из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №:24 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от

    - 63 015363 остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139;

    б) связывается с тем же антигеном, что и по крайней мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139;

    в) связывается с тем же эпитопом ФРГ, что и по крайней мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбранные из

    - 64 015363 антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139;
32. 32. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, включающие тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность на по крайней мере 90, 95 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательности №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    последовательности №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    последовательности №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    последовательности №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    последовательности №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    последовательности №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 41 от остатка 20 до остатка 140 и последовательности №: 43 от остатка 20 до остатка 139 и легкую цепь, содержащую вариабельную область, включающую аминокислотную последовательность на по крайней мере 90, 95 или 99% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из последовательности №: 24 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 26 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 28 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 30 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 32 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 34 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 36 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 38 от остатка 21 до остатка 128;

    последовательности №: 40 от остатка 23 до остатка 129 и последовательности №: 42 от остатка 21 до остатка 128.
33. 33. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.32, которые имеют по крайней мере одно свойство, выбранное из следующих:

    а) конкурирует за связывание с ФРГ по крайней мере с одним антителом, выбранным из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    - 65 015363 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128 и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139;

    б) связывается с тем же антигеном, что и по крайней мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140, и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139; и

    в) связывается с тем же эпитопом ФРГ, что и по крайней мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранные из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от

    - 66 015363 остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139;
34. 34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-33, отличающиеся тем, что тяжелая цепь и легкая цепь соединены линкером (связкой).
35. 35. Фрагмент по любому из пп.11-33 представляющий собой Ρν-фрагмент антитела.
36. 36. Фрагмент по любому из пп.11-33, представляющий собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина.
37. 37. Фрагмент по любому из пп.11-33, представляющий собой РаЬ-фрагмент.
38. 38. Фрагмент по любому из пп.11-33, представляющий собой РаЬ'-фрагмент.
39. 39. Фрагмент по любому из пп.11-33, представляющий собой (РаЬ')₂-фрагмент.
40. 40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-33, являющиеся полностью человеческим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
41. 41. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-33, являющиеся гуманизированным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
42. 42. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-33, являющиеся химерным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
43. 43. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-33, которые ингибируют связывание ФРГ с рецептором с-Ме1.
44. 44. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь по любому из пп.1-5, включающую по крайней мере один гипервариабельный участок (СОВ), выбранный из СОВ1а, СОВ2а и СОВ3а, при этом СОВ1а включает аминокислотную последовательность а Ь с б е £ д 1 ί _) к 1 т п о р д, где аминокислота а выбрана из лизина, аргинина или глутамина; аминокислота Ь выбрана из серина или аланина; аминокислота с является серином; аминокислота б является глутамином; аминокислота е выбрана из серина, глицина или аспарагиновой кислоты; аминокислота £ выбрана из валина или изолейцина или не присутствует; аминокислота д выбрана из лейцина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из фенилаланина или тирозина или не присутствует; аминокислота ί является серином или не присутствует; аминокислота _) является серином или не присутствует; аминокислота к выбрана из аспарагина, треонина или не присутствует; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, изолейцина или валина; аминокислота т выбрана из лизина, аргинина, серина, аспарагина или аспарагиновой кислоты; аминокислота п выбрана из аспарагина или серина; аминокислота о выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, триптофана или аспарагина; аминокислота р является лейцином и аминокислота с.| выбрана из аланина, глицина или аспарагина;

    при этом СОВ2а включает аминокислотную последовательность г 5 1 и ν ν х, где аминокислота г выбрана из триптофана, аланина, валина, глутаминовой кислоты или глицина; аминокислота 5 является

    - 67 015363 аланином; аминокислота ΐ является серином; аминокислота и выбрана из треонина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота ν выбрана из аргинина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глутаминовой кислоты, глутамина или аланина и аминокислота х выбрана из серина, аспарагина или треонина;

    при этом СЭНЗа включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' Г д' 1', где аминокислота у выбрана из глутамина или лейцина; аминокислота ζ выбрана из глутамина, аспарагина или аргинина; аминокислота а' выбрана из тирозина, гистидина, аланина или серина; аминокислота Ь' выбрана из фенилаланина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аспарагина или изолейцина; аминокислота с' выбрана из серина, глицина или аспарагина; аминокислота б' выбрана из пролина, тирозина, треонина, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, лейцина или триптофана; аминокислота е' является пролином; аминокислота ί' является пролином или не присутствует; аминокислота д' является триптофаном, лейцином, пролином, тирозином или изолейцином и аминокислота 1' является треонином или аспарагином.
45. 45. Молекула нуклеиновой кислоты по п.44, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей №: 1, З, 5, 7, 9, 11, 1З, 15, 17 и 19.
46. 46. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь по любому из пп.6-9, включающую по крайней мере один гипервариабельный участок (СОЯ), выбранный из СБЯ1Ь, СЭН2Ь и СВЯЗЬ, при этом СВЯ1Ь включает аминокислотную последовательность а Ь с б е ί д, где аминокислота а является серином или не присутствует; аминокислота Ь выбрана из аспарагиновой кислоты или глицина или не присутствует; аминокислота с выбрана из аспарагиновой кислоты, глицина, серина, валина, треонина или изолейцина; аминокислота б является тирозином; аминокислота е выбрана из тирозина или глицина; аминокислота ί выбрана из изолейцина, метионина или триптофана и аминокислота д выбрана из гистидина, аспарагина или серина;

    при этом СВЯ2Ь включает аминокислотную последовательность 1 ί _) к 1 т η о р д г 5 ΐ и ν ν х, где аминокислота 1 выбрана из триптофана, тирозина, валина, аспарагина или глутаминовой кислоты; аминокислота ί выбрана из изолейцина, фенилаланина или валина; аминокислота _) выбрана из аспарагина, серина, триптофана или тирозина; аминокислота к выбрана из пролина, серина, тирозина или гистидина; аминокислота 1 выбрана из аспарагина, серина или аспарагиновой кислоты; аминокислота т выбрана из серина или глицина; аминокислота η выбрана из глицина или серина или не присутствует; аминокислота о выбрана из глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, серина, изолейцина или аспарагина; аминокислота р выбрана из треонина, изолейцина или лизина; аминокислота д выбрана из аспарагина или тирозина; аминокислота г выбрана из тирозина или гистидина; аминокислота 5 выбрана из аланина или аспарагина; аминокислота ΐ выбрана из глутамина, аспарагиновой кислоты или пролина; аминокислота и выбрана из лизина или серина; аминокислота ν выбрана из фенилаланина, валина или лейцина; аминокислота ν выбрана из глутамина или лизина и аминокислота х выбрана из глицина или серина;

    при этом СВЯЗЬ включает аминокислотную последовательность у ζ а' Ь' с' б' е' Г д' 1' 1' к' 1' т' η' о' р' д' г', где аминокислота у выбрана из глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина или глицина или не присутствует; аминокислота ζ выбрана из лейцина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, гистидина, пролина или глицина или не присутствует; аминокислота а' выбрана из глутаминовой кислоты, тирозина, лейцина или не присутствует; аминокислота Ь' выбрана из лейцина, аспарагина, глицина, гистидина, тирозина или триптофана или не присутствует; аминокислота с' выбрана из аргинина, серина, глутаминовой кислоты, тирозина, глицина или фенилаланина или не присутствует; аминокислота б' является глицином или не присутствует; аминокислота е' выбрана из триптофана или тирозина или не присутствует; аминокислота Г является аспарагиновой кислотой или не присутствует; аминокислота д' выбрана из серина или аргинина или не присутствует; аминокислота 1' является серином или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота _)' выбрана из тирозина, глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота к' выбрана из тирозина, фенилаланина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота 1' выбрана из тирозина, аспарагиновой кислоты, гистидина или триптофана или не присутствует; аминокислота т' выбрана из тирозина, глицина, аспарагиновой кислоты, пролина или серина или не присутствует; аминокислота η' выбрана из глицина, валина, тирозина или аспарагиновой кислоты или не присутствует; аминокислота о' выбрана из лейцина, аланина, глицина или тирозина или не присутствует; аминокислота р' выбрана из метионина, фенилаланина или тирозина; аминокислота д' является аспарагиновой кислотой и аминокислота г' выбрана из валина, тирозина, изолейцина или пролина.
47. 47. Молекула нуклеиновой кислоты по п.46, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из последовательностей №: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20.
48. 48. Клетка-хозяин, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.44 или 45.
49. 49. Клетка-хозяин, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п.46 или 47.
50. 50. Выделенная клеточная линия, продуцирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.З0 или З2.
51. 51. Выделенная клеточная линия по п.50, отличающаяся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из антитела, включающего легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 24 от остатка 2З до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 25 от

    - 68 015363 остатка 20 до остатка 141;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 26 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 28 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 30 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 32 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 34 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 36 от остатка 21 до остатка 133, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 40 от остатка 23 до остатка 129, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 41 от остатка 20 до остатка 140; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включающих легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 42 от остатка 21 до остатка 128, и тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность №: 43 от остатка 20 до остатка 139.
52. 52. Композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.30 или 32 и фармацевтически приемлемый носитель.
53. 53. Композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.30 или 32 и по крайней мере один агент, выбранный из следующих: члена семейства гелданамицинов анизамициновых антибиотиков; антагониста гомологии 2 СгЬ2 8гс; модулятора СаЬ1; доминантного отрицательного 8сг; ингибитора фон Хиппеля-Ландау; нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (Ν8ΛΙΟ); ингибитора СОХ-2; Се1еЬгех™ (целекоксиб); Уюхх™ (рофекоксиб); васкулярного эндотелиального фактора роста (УЕСР); модулятора УЕСР; модулятора фактора роста фибробластов (РСР); модулятора эпидермального фактора роста (ЕСР); фактора роста кератиноцитов (КСР); связанной с КСР молекулы; модулятора КСР; модулятора матричной металлопротеиназы (ММР); 1Ь-2; Пролейкина; Герцептина; Ритуксана; Зевалина; Эрбитукса; Эпратузумаба; антитела к ОРСЬ; ингибитора Апд-2; антитела к УЕСР-2; авастина; антинеопластического агента; антимитотического агента; антиметаболита и алкилсульфоната.
54. 54. Способ лечения рака у пациента, включающий использование композиции по п.52.
55. 55. Способ лечения рака у пациента, включающий использование композиции по п.53.
56. 56. Способ лечения твердой опухоли у пациента, включающий использование композиции по п.52.
57. 57. Способ лечения твердой опухоли у пациента, включающий использование композиции по п.53.
58. 58. Способ лечения рака у пациента, включающий использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.30 или 32 и проведение по крайней мере одного химиотерапевтического лечения.
59. 59. Способ по п.58, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используются перед химиотерапией.
60. 60. Способ по п.58, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используются одновременно с химиотерапией.
61. 61. Способ по п.58, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент назначаются после назначения лечения химиотерапией.
62. 62. Способ лечения рака у пациента, включающий использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.30 или 32 и проведение лучевой терапии.
63. 63. Способ по п.62, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используются перед лучевой терапией.
64. 64. Способ по п.62, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используются одновременно с лучевой терапией.
65. 65. Способ по п.62, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используются после лучевой терапии.

    - 69 015363
66. 66. Способ детектирования уровня фактора роста гепатоцитов (ФРГ) в образце, включающий обеспечение контакта образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.30 или 32.
67. 67. Полипептид, включающий по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165, отличающийся тем, что полипептид способен связываться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.11-33.
68. 68. Полипептид, состоящий главным образом из по крайней мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 164 и 165, отличающийся тем, что полипептид способен связываться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.11-33.
69. 69. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.11-43, способные связывать по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.
70. 70. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.11-43, включающий введение по крайней мере одного полипептида ФРГ, выбранного из полипептидов с последовательностями №: 164 и 165, животному и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, способных связывать ФРГ из организма животных.
71. 71. Способ снижения или предотвращения связывания любого из антител или одного из его антигенсвязывающих фрагментов по пп.14-23 с фактором роста гепатоцита (ФРГ) путем использования полипептида, включающего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.
72. 72. Способ снижения или предотвращения связывания любого из антител или одного из его антигенсвязывающих фрагментов по пп.14-23 с фактором роста гепатоцитов (ФРГ) путем использования полипептида, состоящего из по крайней мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 164 и 165.
73. 73. Способ снижения или предотвращения связывания любого из антител или одного из его антигенсвязывающих фрагментов с фактором роста гепатоцитов (ФРГ) по любому из пп.11-43 путем использования полипептида, включающего по крайней мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей №: 164 и 165.
74. 74. Способ снижения или предотвращения связывания любого из антител или одного из его антигенсвязывающих фрагментов с фактором роста гепатоцитов (ФРГ) по любому из пп.11-43 путем использования полипептида, состоящего из по крайней мере одной аминокислотной последовательности, выбранной из последовательностей №: 164 и 165.
75. 75. Легкая цепь по п.1, которая выбрана из легкой цепи, включающей последовательности №: 60, 70 и 80; легкой цепи, включающей последовательности №: 61,71 и 81;

    легкой цепи, включающей последовательности №: 62, 72 и 82; легкой цепи, включающей последовательности №: 63, 73 и 83;

    легкой цепи, включающей последовательности №: 64, 74 и 84; легкой цепи, включающей последовательности №: 65, 75 и 85;

    легкой цепи, включающей последовательности №: 66, 76 и 86; легкой цепи, включающей последовательности №: 67, 77 и 87;

    легкой цепи, включающей последовательности №: 68, 78 и 88, и легкой цепи, включающей последовательности №: 69, 79 и 89.
76. 76. Тяжелая цепь по п.8, которая выбрана из тяжелой цепи, включающей последовательности №: 90, 100 и 110; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 91, 101 и 111; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 92, 102 и 112; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 93, 103 и 113; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 94, 104 и 114; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 95, 105 и 115; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 96, 106 и 116; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 97, 107 и 117; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 98, 108 и 118; и тяжелой цепи, включающей последовательности №: 99, 109 и 119.
77. 77. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11, которые включают:

    (ί) легкую цепь, выбранную из легкой цепи, включающей последовательности №: 60, 70 и 80; легкой цепи, включающей последовательности №: 61, 71 и 81; легкой цепи, включающей последовательности №: 62, 72 и 82; легкой цепи, включающей последовательности №: 63, 73 и 83; легкой цепи, включающей последовательности №: 64, 74 и 84; легкой цепи, включающей последовательности №: 65, 75 и 85; легкой цепи, включающей последовательности №: 66, 76 и 86; легкой цепи, включающей последовательности №: 67, 77 и 87; легкой цепи, включающей последовательности №: 68, 78 и 88, и легкой цепи, включающей последовательности №: 69, 79 и 89; и (ίί) тяжелую цепь, выбранную из тяжелой цепи, включающей последовательности №: 90, 100 и 110; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 91, 101 и 111; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 92, 102 и 112; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 93, 103 и 113; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 94, 104 и 114; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 95, 105 и 115; тяжелой цепи, включающей последовательности №: 96, 106 и 116; тяжелой цепи,

    - 70 015363 включающей последовательности №: 97. 107 и 117; тяжелой цепи. включающей последовательности №: 98. 108 и 118. и тяжелой цепи. включающей последовательности №: 99. 109 и 119.
78. 78. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. которые выбраны из антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 60. 70 и 80. и тяжелую цепь. включающую последовательности 90. 91 и 92;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 61. 71 и 81. и тяжелую цепь. включающую последовательности 91. 101 и 111;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 62. 72 и 82. и тяжелую цепь. включающую последовательности 92. 102 и 112;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 63. 73 и 83. и тяжелую цепь. включающую последовательности 93. 103 и 113;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 64. 74 и 84. и тяжелую цепь. включающую последовательности 94. 104 и 114;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 65. 75 и 85. и тяжелую цепь. включающую последовательности 95. 105 и 115;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 66. 76 и 86. и тяжелую цепь. включающую последовательности 96. 106 и 116;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 67. 77 и 87. и тяжелую цепь. включающую последовательности 97. 107 и 117;

    антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 68. 78 и 88. и тяжелую цепь. включающую последовательности 98. 108 и 118; и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. включающих легкую цепь. включающую последовательности №: 69. 79 и 89. и тяжелую цепь. включающую последовательности 99. 109 и 119.
79. 79. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. отличающиеся тем. что антитело включает легкую цепь. включающую по крайней мере одну аминокислотную последовательность. выбранную из последовательности №: 24 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 26 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 28 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 30 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 32 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 34 от остатка 23 до остатка 129;

    последовательности №: 36 от остатка 21 до остатка 133;

    последовательности №: 38 от остатка 21 до остатка 128;

    последовательности №: 40 от остатка 23 до остатка 129 и последовательности №: 42 от остатка 21 до остатка 128. и тяжелую цепь. включающую по крайней мере одну аминокислотную последовательность. выбранную из последовательности №: 25 от остатка 20 до остатка 141;

    последовательности №: 27 от остатка 20 до остатка 137;

    последовательности №: 29 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 31 от остатка 20 до остатка 148;

    последовательности №: 33 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 35 от остатка 20 до остатка 144;

    последовательности №: 37 от остатка 20 до остатка 142;

    последовательности №: 39 от остатка 20 до остатка 139;

    последовательности №: 41 от остатка 20 до остатка 140 и последовательности №: 43 от остатка 20 до остатка 139.
80. 80. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. отличающиеся тем. что антитело включает легкую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 38 от остатка 21 до остатка 128 и аминокислотную последовательность №: 44. и тяжелую цепь. включающую аминокислотную последовательность №: 39 от остатка 20 до остатка 139 и последовательность №: 46.
81. 81. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.11. отличающиеся тем. что антитело способно связывать бета-ФРГ подгруппы ФРГ.