KR101254371B1 - 간세포 성장인자에 결합하는 분리된 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간세포 성장인자(HGF)와 상호작용하는 특이 결합제에 관한 것이다. 본 발명은 HGF 에 대한 특이 결합제의 약학적 유효량을 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 HGF 에 대한 특이 결합제를 사용하여 시료 내의 HGF 의 양을 검출하는 방법에 관한 것이다.

간세포 성장인자(HGF), 충실성 종양(solid tumor), Met-HGF 신호전달(Met-HGF) 경로

Description

간세포 성장인자에 결합하는 분리된 항체{ISOLATED ANTIBODIES TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}

본 출원은 본원에서 모든 목적으로 참고문헌으로 인용된, 2003 년 7 월 18 일자로 제출된 미국 가출원 번호 제 60/488,681 호의 이점을 주장하고 있다.

본 발명은 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor ; HGF)에 결합하는 특이 결합제(specific binding agent)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 충실성 종양(solid tumor) 및 혈액 종양을 포함하지만 이것으로 한정하지 않는 특정 유형의 암과 같은 다양한 질환을 치료하기 위한 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 치료방법에 관해서도 기재되어 있다.

간세포 성장인자(HGF)는 간세포에 대한 효력있는 유사분열촉진인자로서 입증되어 왔다. HGF 는 또한 섬유아세포 및 상피세포의 운동성을 유도하는 평활근의 분비 단백질로도 입증되었다. HGF 는 문헌에서 분산 인자(Scatter Factor, SF)로도 언급되어 있다.

HGF 는 Met 수용체 티로신 키나제(Met)에 대한 리간드로서 작용하는, 간엽세포에 의해 우세하게 생산되는 다기능성 이종이량체성(heterodimeric) 폴리펩티드이다. 인체 Met 수용체는 "c-met" 로 공지되어 있다. Met 수용체 티로신 키나제-HGF(Met-HGF) 경로를 통한 신호전달은 다음을 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 일련의 세포 반응을 야기하는 것으로 밝혀졌다 : 증식(유사분열), 분산(scattering, 운동성), 매트릭스를 통한 세포 운동의 자극(침입), 및 분지 형태형성(branching morphogenesis). 생체내에서, Met-HGF 신호전달(Met-HGF) 경로는, 예를 들어, 신경 유도, 간 재생, 창상 치료, 혈관형성, 성장, 침입, 형태학적 분화 및 정상적인 발생학적 발생에 관여한다. 이러한 기능 이외에, Met-HGF 쌍은 또한 인체의 암에도 관여한다. 비정상적인 Met-HGF 신호전달은 종양형성, 특히 침입성 및 전이성 표현형 발생에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 말라리아와 같은 특정 병원체는 또한 비정상적인 Met-HGF 신호전달을 이용하는 것으로 밝혀졌다. Carrolo 등의 Nat Med. 2003 9(11) : 1363-9(Oct. 12, 2003) 문헌을 참조하며, 이 문헌의 내용은 본원에서 참고문헌으로 인용되었다.

또한, 몇몇 연구 그룹은 HGF 가 증식성 당뇨병성 망막증 또는 황반변성과 같은 혈관형성 및 혈관형성-매개 질환에 관여할 수 있음을 보고해 왔다. 예를 들어, Grant, D.S. 등의 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 90(5) 1937-41(1993) ; Bussolino 등의 J. Cell Biol., 119(3) : 629-641(1992) ; Montesano 등의 Cell, 67 : 901-908(1991) ; Canon 등의 Br. J. Ophthalmol. 84(7) : 732-5(2000) 참조하라. HGF 는 또한 아포토시스 또는 세포 예정사(programmed cell death)에 또한 관여할 것이다. 정상적 조절 메커니즘이 증식과 아포토시스 간의 균형을 유지하지 못하여 세포가 지나치게 많은 수로 축적될 때 종양이 발생할 수 있다. HGF 는 생물학적 내용에 좌우되는 증식과 아포토시스 둘 다에 영향을 미칠 수 있다.

HGF 가 많은 생리학적 과정에 관여하기 때문에, 특정 경우에 있어서, HGF 의 활성도를 조절할 수 있는 분자를 입수하는 것이 유용할 것이다. 예를 들어, 특정 예에서, 상기 분자는 여러 상이한 유형의 암을 치료하는데 유용할 것이다.

발명의 요약

특정 실시형태에서, 본 발명은 다음의 CDR1a, CDR2a 및 CDR3a 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 이 폴리펩티드는 항체의 중쇄와 관련하여 간세포 성장인 자(HGF)와 결합할 수 있다 : 상기 CDR1a 는 아미노산 서열 a b c d e f g h i j k l m n o p q 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 리신, 아르기닌 및 글루타민 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b 는 세린 및 알라닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c 는 세린이고 ; 아미노산 d 는 글루타민이고 ; 아미노산 e 는 세린, 글리신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 발린 및 이소루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g 는 루이신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h 는 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k 는 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 이소루이신 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 리신, 아르기닌, 아스파라긴 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 o 는 티로신, 아스파라긴산, 트립토판 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 루이신이며 ; 아미노산 q 는 알라닌, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2a 는 아미노산 서열 r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 r 은 트립토판, 알라닌, 발린, 글루탐산 및 글리신 중에서 선택 한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌이고 ; 아미노산 t 는 세린이고 ; 아미노산 u 는 트레오닌, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 v 는 아르기닌 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루탐산, 글루타민 및 알라닌 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 세린, 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3a 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’를 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루타민 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 z 는 글루타민, 아스파라긴 및 아르기닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 a’는 티로신, 히스티딘, 알라닌 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b’는 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴산, 아스파라긴 및 이소루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c’는 세린, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 d’는 프롤린, 티로신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 루이신 및 트립토판 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 e’는 프롤린이고 ; 아미노산 f’는 프롤린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 트립토판, 루이신, 프롤린, 티로신 또는 이소루이신이고 ; 아미노산 h’는 트레오닌 또는 아스파라긴이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 다음의 CDR1b, CDR2b 및 CDR3b 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 분리된 폴리펩 티드를 제공하며, 이 폴리펩티드는 항체의 경쇄와 관련하여 HGF 와 결합할 수 있다 : 상기 CDR1b 는 아미노산 서열 a b c d e f g 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b 는 아스파라긴산 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c 는 아스파라긴산, 글리신, 세린, 발린, 트레오닌 및 이소루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 d 는 티로신이고 ; 아미노산 e 는 티로신 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 이소루이신, 메티오닌 및 트립토판 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 g 는 히스티딘, 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2b 는 아미노산 서열 h i j k l m n o p q r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 h 는 트립토판, 티로신, 발린, 아스파라긴 및 글루탐산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 i 는 이소루이신, 페닐알라닌 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 j 는 아스파라긴, 세린, 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 k 는 프롤린, 세린, 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o 는 글리신, 트레오닌, 아스파라긴산, 세린, 이소루이신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 트레오닌, 이소루이신 및 리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q 는 아스파라긴 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 r 은 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 t 는 글루타민, 아스파라긴산 및 프롤린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 u 는 리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 v 는 페닐알라닌, 발린 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루타민 및 리신 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3b 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’ l’m’n’o’p’q’r’을 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루탐산, 아스파라긴산, 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 z 는 루이신, 글루탐산, 아스파라긴산, 히스티딘, 프롤린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 a’는 글루탐산, 티로신 및 루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b’는 루이신, 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 티로신 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c’는 아르기닌, 세린, 글루탐산, 티로신, 글리신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 d’는 글리신이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 e’는 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 f’는 아스파라긴산이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 세린 및 아르기닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h’는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i’는 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j’는 티로신, 글루탐산 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k’는 티로신, 페닐알라닌 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l’은 티로신, 아스파라긴산, 히스티딘 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 m’은 티로신, 글리신, 아스파라긴산, 프롤린 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 n’은 글리신, 발린, 티로신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o’는 루이신, 알라닌, 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 p’는 메티오닌, 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q’는 아스파라긴산이며 ; 아미노산 r’은 발린, 티로신, 이소루이신 및 프롤린 중에서 선택한 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 다음의 (ⅰ) 제 1 폴리펩티드 및 (ⅱ) 제 2 폴리펩티드를 포함하는 분리된 특이 결합제를 제공하며, 상기 제 1 폴리펩티드는 항체의 중쇄와 관련하여 간세포 성장인자(HGF)와 결합할 수 있 으며, 상기 제 2 폴리펩티드는 항체의 경쇄와 관련하여 HGF 와 결합할 수 있다 :

(ⅰ) 다음의 CDR1a, CDR2a 및 CDR3a 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 제 1 폴리펩티드 상기 CDR1a 는 아미노산 서열 a b c d e f g h i j k l m n o p q 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 리신, 아르기닌 및 글루타민 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b 는 세린 및 알라닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c 는 세린이고 ; 아미노산 d 는 글루타민이고 ; 아미노산 e 는 세린, 글리신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 발린 및 이소루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g 는 루이신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h 는 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k 는 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 이소루이신 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 리신, 아르기닌, 아스파라긴 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 o 는 티로신, 아스파라긴산, 트립토판 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 루이신이며 ; 아미노산 q 는 알라닌, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2a 는 아미노산 서열 r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 r 은 트립토판, 알라닌, 발린, 글루탐산 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌이고 ; 아미노산 t 는 세린이고 ; 아미노산 u 는 트레오닌, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 v 는 아르기닌 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루탐산, 글루타민 및 알라닌 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 세린, 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3a 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’를 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루타민 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 z 는 글루타민, 아스파라긴 및 아르기닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 a’는 티로신, 히스티딘, 알라닌 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b’는 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴산, 아스파라긴 및 이소루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c’는 세린, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 d’는 프롤린, 티로신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 루이신 및 트립토판 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 e’는 프롤린이고 ; 아미노산 f’는 프롤린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 트립토판, 루이신, 프롤린, 티로신 또는 이소루이신이고 ; 아미노산 h’는 트레오닌 또는 아스파라긴이며 ;

(ⅱ) 다음의 CDR1b, CDR2b 및 CDR3b 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 제 2 폴리펩티드 상기 CDR1b 는 아미노산 서열 a b c d e f g 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b 는 아스파라긴산 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c 는 아스파라긴산, 글리신, 세린, 발린, 트레오닌 및 이소루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 d 는 티로신이고 ; 아미노산 e 는 티로신 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 이소루이신, 메티오닌 및 트립토판 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 g 는 히스티딘, 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2b 는 아미노산 서열 h i j k l m n o p q r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 h 는 트립토판, 티로신, 발린, 아스파라긴 및 글루탐산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 i 는 이소루이신, 페닐알라닌 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 j 는 아스파라긴, 세린, 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 k 는 프롤린, 세린, 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o 는 글리신, 트레오닌, 아스파라긴산, 세린, 이소루이신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 트레오닌, 이소루이신 및 리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q 는 아스파라긴 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 r 은 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 t 는 글루타민, 아스파라긴산 및 프롤린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 u 는 리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 v 는 페닐알라닌, 발린 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루타민 및 리신 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3b 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’i’ j’k’l’m’n’o’p’q’r’을 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루탐산, 아스파라긴산, 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 z 는 루이신, 글루탐산, 아스파라긴산, 히스티딘, 프롤린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 a’는 글루탐산, 티로신 및 루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b’는 루이신, 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 티로신 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c’는 아르기닌, 세린, 글루탐산, 티로신, 글리신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 d’는 글리신이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 e’는 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 f’는 아스파라긴산 이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 세린 및 아르기닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h’는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i’는 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j’는 티로신, 글루탐산 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k’는 티로신, 페닐알라닌 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l’은 티로신, 아스파라긴산, 히스티딘 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 m’은 티로신, 글리신, 아스파라긴산, 프롤린 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 n’은 글리신, 발린, 티로신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o’는 루이신, 알라닌, 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 p’는 메티오닌, 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q’는 아스파라긴산이며 ; 아미노산 r’ 은 발린, 티로신, 이소루이신 및 프롤린 중에서 선택한 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 중에서 선택한 적어도 하나의 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 중에서 선택한 적어도 하나의 누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 다음의 CDR1a, CDR2a 및 CDR3a 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 분자를 제공한다 : 상기 CDR1a 는 아미노산 서열 a b c d e f g h i j k l m n o p q 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 리신, 아르기닌 및 글루타민 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b 는 세린 및 알라닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c 는 세린이고 ; 아미노산 d 는 글루타민이고 ; 아미노산 e 는 세린, 글리신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 발린 및 이 소루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g 는 루이신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h 는 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k 는 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 이소루이신 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 리신, 아르기닌, 아스파라긴 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 o 는 티로신, 아스파라긴산, 트립토판 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 루이신이며 ; 아미노산 q 는 알라닌, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2a 는 아미노산 서열 r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 r 은 트립토판, 알라닌, 발린, 글루탐산 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌이고 ; 아미노산 t 는 세린이고 ; 아미노산 u 는 트레오닌, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 v 는 아르기닌 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루탐산, 글루타민 및 알라닌 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 세린, 아스파라긴 및 트레오닌 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3a 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’를 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루타민 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 z 는 글루타민, 아스파라긴 및 아르기닌 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 a’는 티로신, 히스티딘, 알라닌 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 b’는 페닐알라닌, 티로신, 아스파라긴산, 아스파라긴 및 이소루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 c’는 세린, 글리신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 d’는 프롤린, 티로신, 트레오닌, 페닐알라닌, 아스파라긴산, 루이신 및 트립토판 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 e’는 프롤린이고 ; 아미노산 f’는 프롤린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 트립토판, 루이신, 프롤린, 티로신 또는 이소루이신이고 ; 아미노산 h’는 트레오닌 또는 아스파라긴이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 다음의 CDR1b, CDR2b 및 CDR3b 중에서 선택한 적어도 하나의 상보성 결정영역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 이 폴리펩티드는 항체의 경쇄와 관련하여 HGF 와 결합할 수 있다 : 상기 CDR1b 는 아미노산 서열 a b c d e f g 를 포함하며, 여기에서 아미노산 a 는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b 는 아스파라긴산 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c 는 아스파라긴산, 글리신, 세린, 발린, 트레오닌 및 이소루이신 중에서 선택 한 것이고 ; 아미노산 d 는 티로신이고 ; 아미노산 e 는 티로신 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 f 는 이소루이신, 메티오닌 및 트립토판 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 g 는 히스티딘, 아스파라긴 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR2b 는 아미노산 서열 h i j k l m n o p q r s t u v w x 를 포함하며, 여기에서 아미노산 h 는 트립토판, 티로신, 발린, 아스파라긴 및 글루탐산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 i 는 이소루이신, 페닐알라닌 및 발린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 j 는 아스파라긴, 세린, 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 k 는 프롤린, 세린, 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 l 은 아스파라긴, 세린 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 m 은 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 n 은 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o 는 글리신, 트레오닌, 아스파라긴산, 세린, 이소루이신 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 p 는 트레오닌, 이소루이신 및 리신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q 는 아스파라긴 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 r 은 티로신 및 히스티딘 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 s 는 알라닌 및 아스파라긴 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 t 는 글루타민, 아스파라긴산 및 프롤린 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 u 는 리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 아미 노산 v 는 페닐알라닌, 발린 및 루이신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 w 는 글루타민 및 리신 중에서 선택한 것이며 ; 아미노산 x 는 글리신 및 세린 중에서 선택한 것이고 ; 상기 CDR3b 는 아미노산 서열 y z a’b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’ l’m’n’o’p’q’r’을 포함하며, 여기에서 아미노산 y 는 글루탐산, 아스파라긴산, 세린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 z 는 루이신, 글루탐산, 아스파라긴산, 히스티딘, 프롤린 및 글리신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 a’는 글루탐산, 티로신 및 루이신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 b’는 루이신, 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 티로신 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 c’는 아르기닌, 세린, 글루탐산, 티로신, 글리신 및 페닐알라닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 d’는 글리신이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 e’는 트립토판 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 f’는 아스파라긴산이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 g’는 세린 및 아르기닌 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 h’는 세린이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 i’는 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 j’는 티로신, 글루탐산 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 k’는 티로신, 페닐알라닌 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 l’은 티로신, 아스파라긴산, 히스티딘 및 트립토판 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 m’은 티로신, 글리신, 아스파라긴산, 프롤린 및 세린 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 n’은 글리신, 발린, 티로신 및 아스파라긴산 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 o’는 루이신, 알라닌, 글리신 및 티로신 중에서 선택한 것이거나 또는 존재하지 않고 ; 아미노산 p’는 메티오닌, 페닐알라닌 및 티로신 중에서 선택한 것이고 ; 아미노산 q’는 아스파라긴산이며 ; 아미노산 r’은 발린, 티로신, 이소루이신 및 프롤린 중에서 선택한 것이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1 중에서 선택한 항체를 생성하는 분리된 세포주를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 결합하는 특이 결합제를 투여함을 포함하는, HGF 와 Met 의 결합을 저해하는 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열에 결합할 수 있는 특이 결합제를 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 도메인을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 폴리펩티드를 동물에게 투여하고 동물로부터 HGF 와 결합할 수 있는 항체를 수득함을 포함하는, 간세포 성장인자(HGF)와 결합할 수 있는 항체를 수득하는 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 특이 결합제와 간세포 성장인자(HGF)의 결합을 감소시키거나 저해하는 방법 을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 164 및 165 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 투여함으로써 특이 결합제와 간세포 성장인자(HGF)의 결합을 감소시키거나 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시형태는 본원에 기재되어 있는 바에 의해 쉽게 명백해질 것이다.

도 1A 는 항체의 생식계열 상관관계를 나타내는, HGF 에 결합하는 특정 항체의 카파 경쇄의 계통도(dendrogram)를 나타낸 것이다. 생식계열 유전자 동정은 항체 명칭의 오른쪽에 나타내었다. 도 1B 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타낸 것이다. 생식계열 유전자 동정은 왼쪽에 나타내었다. CDR 영역은 배열된 서열 위에 굵은 선으로 표시하였다.

도 2A 는 항체의 생식계열 상관관계를 나타내는, HGF 에 결합하는 특정 항체의 감마 중쇄의 계통도를 나타낸 것이다. 생식계열 유전자 동정은 항체 명칭의 오른쪽에 나타내었다. 도 2B 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 감마 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타낸 것이다. 생식계열 유전자 동정은 왼쪽에 나타내었다. CDR 영역은 배열된 서열 위에 굵은 선으로 표시하였다.

도 3A 내지 3E 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 나타낸 것이다. 각각의 서열에 대하여 항체 명칭, 생식계열 명칭 및 서열 ID 를 나타내었다. 자연 시그날 펩티드 서열은 밑줄로 표시하였다. 또한 인체 카파, IgG1 및 IgG2 불변 영역의 DNA 서열도 나타내었다.

도 4A 내지 4C 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 각각의 서열에 대하여 항체 명칭, 생식계열 명칭 및 서열 ID 를 나타내었다. 천연의 신호 펩티드 서열은 밑줄로 표시하였다. 또한 인체 카파, IgG1 및 IgG2 불변 영역의 아미노산 서열도 나타내었다.

도 5 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 경쇄 및 중쇄의 상보성 결정 영역(CDRs)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 각각의 서열에 대하여 항체 명칭 및 서열 ID 를 나타내었다. 도 5A 는 HGF 에 결합 하는 특정 항체의 경쇄 CDRs 의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 5Ba 및 5Bb 는 HGF 에 결합하는 특정 항체의 중쇄 CDRs 의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 6 은 실시예 8 에 기재되어 있는, HGF 에 결합하는 특정 항체의 K_D 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 6A 는 동력학적 방법으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다. 도 6B 는 평형/용액 방법으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다.

도 7A 및 7B 는 실시예 8 에 기재되어 있는, 인체 HGF 및 마우스 HGF 에 결합하는 특정 항체의 능력을 시험하는 웨스턴 블롯으로 수득한 자동방사선 사진을 나타낸 것이다. 왼쪽의 패널(1-4 레인)은 비-환원성 조건 하에서 수행한 실험으로 수득한 자동방사선 사진을 나타낸 것이다. 오른쪽의 패널(5-8 레인)은 환원성 조건 하에서 수행한 실험으로 수득한 자동방사선 사진을 나타낸 것이다.

도 8 은 실시예 8 에 기재되어 있는, 특정 표적과 특정 항체의 결합을 평가하는 실험으로 수득한 형광 활성화 세포 선별(Fluorescence Activated Cell Sorter ; FACS) 데이터를 나타낸 것이다. 도 8 의 상 부는 특이 결합제가 결여된 대조 시료의 FACS 데이터를 나타낸 것이다. 패널 1 및 2(왼쪽)는 각각 FITC 및 PE 와 함께 항온한 표적이 결여된 대조 시료의 데이터를 나타낸 것이다. 패널 3 및 4 는 각각 FITC 및 d5 HGF 가 표지된 PE 는 함유하지만 특이 결합제는 결여된 대조 시료의 데이터를 나타낸 것이다. 굵은 선 아래의 패널은 HGF 에 결합하는 5 개의 항체를 시험한 실험으로 수득한 FACS 데이터를 나타낸 것이다. 각각의 항체에 대하여, 첫 번째 패널(왼쪽)은 표적이 결여된 대조 시료에서 수득한 데이터를 나타내고, 두 번째 내지 네 번째 패널은 각각 인체 HGF, 마우스 HGF 및 인체 d5 HGF 를 표적으로 하는 실험으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다.

도 9A 는 실시예 8 에 기재한 바와 같이 아비딘 및 표적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 생성하는데 사용되는 다중 클로닝 부위에 결합하는 아비딘을 코드하는 플라스미드의 계락도를 나타낸 것이다. 도 9B 는 닭 아비딘의 서열을 나타낸 것이다.

도 10A 및 10B 는 실시예 8C 및 8D 에 기재되어 있는, 융합 단백질 및 상기 융합 단백질을 사용하는 결합 검정으로 수득한 결과를 도시하여 표현한 것이다. 도 10C 는 점 돌연변이, 삽입 또는 결실을 갖는 특정 융합단백질을 도시하여 나타낸 것이다. 도 10D 는 확인된 대 응되는 공통서열(SEQ ID NO : 22)을 갖는 아미노산 451-731 영역 내의 인체 및 마우스 HGF 의 아미노산 서열(각각 SEQ ID NO : 120 및 121)을 나타낸 것이다.

도 11A 및 11B 는 실시예 8E 에 기재되어 있는 바와 같이, 인체 HGF 에 관한 단백질 분해효소 보호 실험의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11C 는 상기 실험에서 항체 2.12.1 을 결합시켜서 단백질 분해로부터 보호시킨 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 12A 내지 12D 는 실시예 8 에 기재되어 있는 경쟁적 결합 검정의 결과를 나타낸 것이다.

도 13 은 실시예 9 에 기재되어 있는 중화 검정으로 수득한 IC50 데이터를 나타낸 것이다.

도 14 는 실시예 10 에 기재되어 있는 PC3 세포를 이용한 중화 검정으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다.

도 15 는 실시예 10 에 기재되어 있는 U-87 세포를 이용한 저해 검정으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다.

도 16 은 실시예 11 에 기재되어 있는, 마우스의 U-87 MG 이종이식편 종양에 관한 HGF 에 결합하는 특정 항체의 효과를 평가한 실험으로 수득한 결과를 나타낸 것이다. 도 16A 는 최소 잔류병(minimal residual disease) 모델에서 U-87 MG 이종이식편 종양 성장에 관한 항체 2.4.4 에 대한 투여-반응성 데이터를 나타낸 것이다. 도 16B 는 확립된 질환 모델에서 U-87 이종이식편 종양 성장에 관한 항체 2.4.4 에 대한 투여-반응성 데이터를 나타낸 것이다. 도 16C, 16D, 16E 및 16F 는 U-87 최소 잔류병 모델(16C 및 16D) 또는 U-87 확립된 질환 모델(16E 및 16F)에서 HGF 에 결합하는 항체를 시험한 머리-머리 실험으로 수득한 데이터를 나타낸 것이다.

하기의 일반적인 설명 및 상세한 설명은 전형적이고 설명적이나 청구하고 있는 바와 같이 본 발명을 한정하려는 것은 아니다. 특이적으로 다른 식으로 나타내는 경우를 제외하고는, 본원에서 단수형은 복수형을 포함한다. 다른 식으로 나타내는 경우를 제외하고는, 본원에서 "또는" 의 사용은 "및/또는" 을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including)" 뿐만 아니라 "포함한다(includes)" 및 "포함되는(included)" 과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한 특이적으로 다른 식으로 나타내는 경우를 제외하고는, "요소" 또는 "성분" 과 같은 용어는 하나의 유닛을 포함하는 요소와 성분 및 하나 이상의 서브유닛을 포함하는 요소와 성분을 포함한다. 또한 용어 "부분" 의 사용은 성분의 일부 또는 전체를 포함한다.

본원에서 사용되는 절의 제목은 단지 구성상의 목적일 뿐 기재되어 있는 제제를 한정하려는 것이 아니다. 본원에 기재되어 있는, 특허, 특허 출원서, 기사, 책 및 논문을 포함하나 이에 한정되지 않는 모든 문서 또는 일부 문서를 본원에 참고문헌으로 인용하였다.

정의

재조합 DNA, 올리고누클레오티드 합성 및 조직배양과 형질전환(예를 들어, 일렉트로포레이션, 리포펙션)에 대하여 표준 기술을 사용할 수 있다. 효소학적 반응 및 정제 기술은 제조업자의 설명서에 따라 수행하거나 또는 본 분야에서 일반적으로 수행되는 바에 따르거나 본원에 기재되어 있는 바에 따라 수행할 수 있다. 다음의 기술 및 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있는 통상적인 방법 및 본 명세서에 걸쳐 기재되어 있고 논의되는 다양하고 일반적이며 좀 더 특정한 참고문헌에 기재되어 있는 바에 따라 일반적으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual[2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]을 참조하라. 특별한 의미를 부여하고자 하는 경우를 제외하고는, 분석화학, 합성 유기화학 및 본원에 기재되어 있는 의약품 화학과 약학적 화학과 관련되어 사용되는 명명법 및 상기 화학 분야의 실험실 방법과 기술은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조방법, 제형화와 수송 및 환자의 치료에 대하여 사용할 수 있다.

다른 식으로 나타내는 경우를 제외하고는 본 명세서에 사용된 바와 같은 다음의 용어는 다음의 의미로 이해된다 :

용어 "간세포 성장 인자" 또는 "HGF" 는 Nakamura 등의 Nature 342 : 440-443(1989)에 기재되어 있는 바와 같은 폴리펩티드 또는 이의 단편을 의미하며, 뿐만 아니라 대립 변이체, 스플라이스 변이체, 유도 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 관련 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 및 종간 동족체를 의미한다. 특정 실시형태에서, HGF 폴리펩티드는 예를 들어, 선도 서열 잔기, 표적 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 표지 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하나 이에 한정되지 않는 말단 잔기를 포함한다.

용어 "특이 결합제" 는 표적에 특이적으로 결합하는 천연 또는 비-천연의 분자를 의미한다. 특이 결합제의 예는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지방 및 소형 분자 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 항체이다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 항원 결합 영역이다.

용어 "HGF 에 결합하는 특이 결합제" 는 모든 부분의 HGF 에 특이적으로 결합하는 특이 결합제를 의미한다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 HGF 에 결합하는 항체이다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 항원 결합 영역이다.

용어 "폴리클로날 항체" 는 동일한 항원의 다른 에피토프에 결합하는 항체의 이종성 혼합물이다.

용어 "모노클로날 항체" 는 동일한 핵산 분자에 의해 코드되는 항체의 집합을 의미한다. 특정 실시형태에서, 모노클로날 항체는 단일 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 생성되거나 또는 트랜스제닉 포유동물에 의해 생성된다. 모노클로날 항체는 일반적으로 동일한 에피토프를 인지한다. 용어 "모노클로날" 은 항체를 제조하기 위한 모든 특정 방법으로 한정되지 않는다.

용어 "키메라 항체" 는 항체의 일부분은 특정의 종 또는 특정 항체 클래스의 서열과 상동이지만 항체의 다른 일부분은 상이한 종 또는 항체 클래스의 서열과 상동인 항체를 의미한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,816,567 호 및 Morrison 등의 Proc Natl Acad Sci(USA), 81 : 6851-6855(1985)를 참조하라.

용어 "CDR 그래프트된 항체" 는 하나의 항체의 CDR 이 다른 항체의 외곽구조로 삽입된 항체를 의미한다. 특정 실시형태에서, CDR 이 유도된 항체 및 외곽구조가 유도된 항체는 서로 상이한 종이다. 특정 실시형태에서, CDR 이 유도된 항체 및 외곽구조가 유도된 항체는 상이한 이소타입이다.

용어 "다중-특이성 항체" 는 둘 또는 그 이상의 가변 영역이 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 상기 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 다중-특이성 항체는 동일하거나 상이한 항원 상에 존재하는 2 개의 상이한 에피토프를 인지하는 "2 중-특이성 항체" 이다.

용어 "촉매 항체" 는 하나 또는 그 이상의 촉매 성분이 부착된 항체를 의미한다. 특정 실시형태에서, 촉매 항체는 세포독성 성분을 포함하는 세포독성 항체이다.

용어 "인간화 항체" 는 전체 또는 일부분의 항체 외곽구조는 인체로부터 유도되나 전체 또는 일부분의 하나 또는 그 이상의 CDR 영역은 다른 종 예를 들어, 마우스로부터 유도된 항체를 의미한다.

용어 "완전 인간 항체(fully human antibody)" 는 CDR 및 외곽구조 모두가 실질적으로 인체 서열을 포함하는 항체를 의미한다. 특정 실시형태에서, 완전 인간 항체는 마우스, 랫 및 토끼목을 포함하나 이에 한정되지 않는 비-인간 포유동물에서 생성된다. 특정 실시형태에서, 완전 인간 항체는 하이브리도마 세포에서 생성된다. 특정 실시형태에서, 완전 인간 항체는 재조합적으로 생성된다.

용어 "항-이디오타입 항체" 는 다른 항체에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.

용어 "특이적으로 결합한다" 는 특이 결합제가 비-표적에 결합하는 것보다 우수한 친화도로 표적에 결합하는 능력을 의미한다. 특정 실시형태에서, 특이적 결합은 비-표적에 대한 친화도보다 적어도 10, 50, 100, 250, 500 또는 1000 배 이상의 친화도로 표적에 결합함을 의미한다. 특정 실시형태에서, 친화도는 친화 ELISA 검정으로 측정한다. 특정 실시형태에서, 친화도는 BIAcore 검정으로 측정한다. 특정 실시형태에서, 친화도는 동력학적 방법으로 측정한다. 특정 실시형태에서, 친화도는 평형/용액 방법으로 측정한다.

용어 "에피토프" 는 특이 결합제에 의해 결합될 수 있는 분자의 부분을 의미한다. 특정 실시형태에서, 에피토프는 일반적으로 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 곁사슬과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하고 특이적인 전하 특성 뿐만 아니라 3 차원 구조적 특징을 갖는다. 에피토프는 연속적이거나 또는 비-연속적이다. 특정 실시형태에서, 에피토프는 항체를 생성하는데 사용되는 에피토프와 유사한 3 차원 구조를 포함하지만 항체를 생성하는데 에피토프가 사용된다는 점에서 발견된 아미노산 잔기를 포함하지 않거나 단지 일부만 포함한다는 점에서 유사하다.

용어 "저해 및/또는 중화 에피토프" 는 특이 결합제에 의해 결합되는 경우에 생체내, 생체외 및/또는 원위치에서 생물학적 활성도를 감소시키는 에피토프를 의미한다. 특정 실시형태에서, 중화 에피토프는 표적 상에 위치하거나 또는 표적의 생물학적 활성 영역과 관련된다.

용어 "활성화 에피토프" 는 특이 결합제에 의해 결합되는 경우에 생체내, 생체외 및/또는 원위치에서 생물학적 활성도를 활성화시키거나 유지시키는 에피토프를 의미한다. 특정 실시형태에서, 활성화 에피토프는 표적 상에 존재하거나 표적의 생물학적 활성 영역과 관련된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 폴리누클레오티드" 는 게놈, cDNA 나 합성 기원의 폴리누클레오티드 또는 이들의 몇몇 조합물을 의미하며, 이들의 기원에 따라 "분리된 폴리누클레오티드" 는 (1) 폴리누클레오티드의 전체 또는 일부와 관련되지 않으며, 상기 "분리된 폴리누클레오티드" 는 자연 상태로 발견되고, (2) 자연 상태에서는 결합되지 않는 폴리누클레오티드에 결합하거나 또는 (3) 길이가 긴 서열(large sequence)의 부분으로서 자연 발생적이지 않다.

용어 "분리된 단백질" 은 cDNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원에 의해 코드되는 단백질 또는 이들의 몇몇 조합물을 의미하며, 상기 "분리된 단백질" 은 (1) 일반적으로 발견되는 적어도 몇몇의 단백질이 유리된 것이고, (2) 동일한 원(source) 예를 들어, 동일한 종의 다른 단백질이 실질적으로 유리된 것이고, (3) 상이한 종의 세포에서 발현되거나 또는 (4) 자연 발생적이지 않다.

용어 "폴리펩티드" 는 본원에서 천연 단백질 또는 천연 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된, 상기 단백질의 변형을 의미하는 일반명칭으로 사용된다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드는 천연 서열 중 적어도 하나 아니면 많아야 50, 30, 20, 15, 10, 8, 5 또는 3 개의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된다.

대상에 적용된 바와 같이 본원에 사용된 용어 "자연-발생적인" 은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 천연원으로부터 분리될 수 있으며 실험실에서 또는 다른 방식으로 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함) 내에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열은 자연 발생적이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실시가능하게 결합된" 은 적합한 조건 하에서 이들의 기능을 수행할 수 있도록 하는 연관된 성분을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열에 "실시가능하게 결합된" 조절 서열은 조절 서열의 적합한 조건 하에서 코딩 서열을 발현하도록 결합된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 서열" 은 폴리누클레오티드 서열이 결합되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 폴리누클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르다. 특정 실시형태에서, 원핵생물의 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 진핵생물의 조절 서열은 프로모터, 하나 또는 그 이상의 인핸서 및 전사 종결 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, "조절 서열" 은 선도 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리누클레오티드" 는 길이가 적어도 10 개의 염기로 이루어진 누클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 특정 실시형태에서, 염기는 리보누클레오티드나 데옥시리보누클레오티드 또는 어느 한 유형의 누클레오티드의 변형된 형태이다. 상기 폴리누클레오티드는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA 를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고누클레오티드" 는 자연 발생적이고/발생적이거나 비-자연 발생적인 올리고누클레오티드 결합에 의해 함께 결합된, 자연 발생적이고 변형된 누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 일반적으로 200 개의 염기 또는 그 이상의 길이를 포함하는 폴리누클레오티드 서브셋(subset)이다. 특정 실시형태에서, 올리고누클레오티드는 10 내지 60 개의 염기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 올리고누클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 개의 염기 길이를 갖는다. 올리고누클레오티드는 예를 들어, 유전자 돌연변이를 구성하는 데 사용하는 단일 가닥 또는 이중 가닥이다. 올리고누클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고누클레오티드이다.

용어 "자연 발생적인 누클레오티드" 는 데옥시리보누클레오티드 및 리보누클레오티드를 포함한다. 용어 "변형된 누클레오티드" 는 변형되거나 치환된 당기 등을 갖는 누클레오티드를 포함한다. 용어 "올리고누클레오티드 결합" 은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라드에이트, 포스포로아미드에이트 등과 같은 올리고누클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어, 모든 목적으로 본원에 인용문헌으로 인용하고 있는 LaPlanche 등의 Nucl. Acids Res. 14:9081(1986) ; Stec 등의 J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984) ; Stein 등의 Nucl. Acids Res. 16:3209(1988) ; Zon 등의 Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991) ; Zon 등의 Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108[F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)] ; Stec 등의 미국 특허 번호 제 5,151,510 호 ; Uhlmann 및 Peyman Chemical Reviews 90:543(1990) 을 참조하라. 특정 실시형태에서, 올리고누클레오티드는 검출용 표지를 포함할 수 있다.

관련된 폴리펩티드의 동일성 및 유사성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다. 상기 방법은 하기의 문헌에 기재되어 있는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York(1988) ; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York(1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey(1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press(1987) ; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York(1991) ; 및 Carillo 등의 SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988).

동일성을 측정하기 위한 특정한 방법은 시험한 서열이 서로 많이 매치되도록 설계하였다. 동일성을 측정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 기재되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 측정하는 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP 를 포함하는 GCG 프로그램 패키지[Devereux 등의 Nucl. Acid. Res., 12:387(1984) ; Genetics Computer Group, 미국 위스콘신 메디슨에 소재하는 위스콘신 대학에서 입수], BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul 등의 J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)] 를 포함하나 이에 한정되지 않는다. BLASTX 프로그램은 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 및 다른 정보원[BLAST Manual, Altschul 등의 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul 등의 상기문헌(1990)]으로부터 공개적으로 이용가능하다. 널리 공지된 스미스 워터맨 알고리즘도 동일성을 측정하는 데 사용할 수 있다.

두 아미노산 서열을 정렬시키기 위한 특정한 정렬 계획으로 두 서열의 짧은 영역만을 매칭시킬 수 있으며, 전장의 두 서열 간에 현저한 관련성이 없음에도 불구하고 이렇게 정렬된 작은 영역은 매우 높은 서열 동일성을 지닌다. 따라서 특정 실시형태에서, 선택한 정렬 방법(GAP 프로그램)으로 표적 폴리펩티드의 적어도 50 개의 연속적인 아미노산에 미치도록 정렬하였다.

예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, 미국 위스콘신 메디슨에 소재하는 위스콘신 대학에서 입수)를 사용하여, 서열 동일성(%)을 측정할 두 폴리펩티드를 이들 각각의 아미노산(알고리즘에 의해 결정된 바와 같은 "매칭된 길이")이 최적으로 매칭되도록 정렬하였다. 특정 실시형태에서, PAM 250 또는 BLOSUM 62 와 같은 대조 매트릭스 뿐만 아니라 갭 오프닝 패널티(3 X 평균 대각면으로 계산된 것이고 ; "평균 대각면" 은 사용되는 대조 매트릭스의 대각면의 평균이며 ; "대각면" 은 특정의 대조 매트릭스에 의한 각각의 완벽한 아미노산 매치에 대해 정한 점수 또는 숫자이다) 및 갭 신장 패널티(일반적으로 갭 오프닝 패널티의 1/10 배)를 알고리즘과 연합하여 사용하였다. 특정 실시형태에서, 표준 대조 매트릭스[PAM 250 대조 매트릭스에 관한 Dayhoff 등의 Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) ; BLOSUM 62 대조 매트릭스에 관한 Henikoff 등의 Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915-10919(1992)]도 알고리즘에 의해 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드 서열 비교에 대한 파라미터는 다음을 포함한다 : 알고리즘 : Needleman 등의 J. Mol. Biol., 48:443-453(1970) 참조 ; 대조 매트릭스 : Henikoff 등의 상기문헌(1992)의 BLOSUM 62 ; 갭 패널티 : 12 ; 갭 신장 패널티 : 4 ; 유사성의 역치 : 0.

GAP 프로그램은 상기 파라미터로 수행하는 것이 효과적이다. 특정 실시형태에서, 상기에 언급한 파라미터는 GAP 알고리즘을 사용하는 폴리펩티드 비교에 대한 생략형 파라미터(default parameter)이다(말단 갭에 대한 패널티가 없음).

특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.

특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 SEQ ID NO : 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42 중에서 선택한 아미노산 서열과 적어도 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 20 개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상적인 관습에 따른다. 모든 목적으로 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Immunology--A Sytnhesis[2nd Edition, E. S. Golub 및 D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass(1991)] 를 참조하라. 20 개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), α-,α-비치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 이외의 다른 비통상적인 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드에 대한 적합한 성분이다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함한다 : 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 이외의 다른 유사 아미노산과 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린). 본원에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 관습 및 관례에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이고 오른쪽 방향은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게 다른 식으로 특정되는 경우를 제외하고, 단일-가닥 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고 ; 이중-가닥 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향이다. 발생되는 RNA 전사물이 부가되는 5' 에서의 3' 으로의 방향은 전사 방향이라 하고 ; RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥에서 RNA 전사물의 5' 에서 5' 말단까지의 서열 영역은 "상류 서열" 이라 하며 ; RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥에서 RNA 전사물의 3' 에서 3' 말단까지의 서열 영역은 "하류 서열" 이라 한다.

보존적인 아미노산 치환은 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 포함하는데, 이는 일반적으로 생물계에서 합성되는 것 보다 화학적 펩티드 합성에 의한 것을 포함한다. 이러한 아미노산은 펩티도유사체 및 이외의 다른 역상 형태의 아미노산 성분을 포함한다.

자연 발생적인 잔기는 통상적인 곁사슬 특성에 따라 다음과 같은 클래스로 분류할 수 있다 : 1) 소수성 : 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ; 2) 중성의 친수성 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ; 3) 산성 : Asp, Glu ; 4) 염기성 : His, Lys, Arg ; 5) 사슬 기원에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및 6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존적인 치환은 상기 클래스의 한 멤버가 다른 클래스의 멤버로 치환되는 것을 포함한다. 치환된 잔기는 비-인간 항체와 상동인 인간 항체의 영역 또는 분자의 비-상동성 영역으로 도입될 수 있다.

특정 실시형태에 따라 상기와 같이 치환하는데 있어서, 아미노산의 수치료법 수치가 고려된다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특성을 근거로 하여 수치료법 수치가 결정된다. 이 수치는 다음과 같다 : 이소루이신(+4.5) ; 발린(+4.2) ; 루이신(+3.8) ; 페닐알라닌(+2.8) ; 시스테인/시스틴(+2.5) ; 메티오닌(+1.9) ; 알라닌(+1.8) ; 글리신(-0.4) ; 트레오닌(-0.7) ; 세린(-0.8) ; 트립토판(-0.9) ; 티로신(-1.3) ; 프롤린(-1.6) ; 히스티딘(-3.2) ; 글루탐산염(-3.5) ; 글루타민(-3.5) ; 아스파라긴산염(-3.5) ; 아스파라긴(-3.5) ; 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).

단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 아미노산 수치료법 수치의 중요성은 본 분야에서 이해된다. Kyte 등의 J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)를 참조하라. 특정 아미노산은 유사한 수치료법 수치를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며 여전히 유사한 생물학적 활성도를 유지할 수 있음이 공지되어 있다. 특정 실시형태에서 수치료법 수치를 근거로 하여 치환하는 데 있어서, 수치료법 수치가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 실시형태에서, 수치가 ±1 이내인 것들이 포함되며 특정 실시형태에서, ±0.5 이내인 것들이 포함된다.

유사 아미노산은 또한 친수성을 근거로 효과적으로 치환되며, 특히 이같이 치환시켜 생성된 생물학적으로 기능적인 단백질 또는 펩티드는 본원에 기재되어 있는 바와 같은 면역학적 실시형태에서 사용됨이 본 분야에서 이해된다. 특정 실시형태에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 조절되는 단백질의 매우 국소적인 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성에 관련된 것이다.

아미노산 잔기의 친수성값을 하기에 나타내었다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0) ; 아스파라긴산염(+3.0 ± 1) ; 글루탐산염(+3.0 ± 1) ; 세린(+0.3) ; 아스파라긴(+0.2) ; 글루타민(+0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4) ; 프롤린(-0.5 ± 1) ; 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5) ; 시스테인(-1.0) ; 메티오닌(-1.3) ; 발린(-1.5) ; 루이신(-1.8) ; 이소루이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5) ; 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성값을 근거로 하여 치환하는 데 있어서, 특정 실시형태에서는 친수성값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되며, 친수성값이 ±1 이내인 아미노산 및 ±0.5 이내인 아미노산의 치환도 포함된다. 또한 친수성값을 근거로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이러한 영역은 "에피토프 코어 영역" 이라 한다.

일반적인 아미노산 치환기를 하기에 나타내었다.

숙련자들은 널리 공지된 기술을 이용하여 본원에 기재되어 있는 바와 같은 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 분야의 숙련자들은 활성도를 파괴하지 않으면서 활성도에는 중요한 영향을 미치지 않는 표적 영역으로 치환되는 분자의 적당한 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 숙련자들은 유사 폴리펩티드 중에서 보존된 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 생물학적 활성도나 구조에 중요한 영향을 미치는 영역 조차도 생물학적 활성도를 파괴하지 않거나 폴리펩티드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 실시할 수 있다.

부가적으로, 본 분야의 숙련자들은 활성도나 구조에 중요한 유사 폴리펩티드의 잔기를 확인하는 구조-작용 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 통해, 숙련자들은 유사 단백질의 활성도나 구조에 중요한 아미노산 잔기에 해당하는 단백질내 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 중요한 아미노산 잔기로 예측된 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환할 수 있다.

본 분야의 숙련자들은 또한 유사 폴리펩티드의 구조에 관한 아미노산 서열과 3 차원 구조를 분석할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 이러한 정보를 통해 항체의 3 차원 구조에 관한 항체의 아미노산 잔기의 배열을 예측할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 잔기는 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관계되므로, 본 분야의 숙련자들은 단백질의 표면에서 예측되는 아미노산 잔기에 대한 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있다. 또한, 본 분야의 숙련자들은 각각의 바람직한 아미노산 잔기에서 단일 아미노산을 치환시킨 실험 변이체를 제조할 수 있다. 그런 다음 본 분야의 숙련자들에게 공지된 활성도 검정을 이용하여 이 변이체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 변이체는 적합한 변이체에 관한 정보를 수집하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 변화로 활성도가 손실되거나 바람직하지 못하게 감소되거나 부적합하게 된다면, 이러한 변이를 갖는 변이체는 피하는 것이 좋다. 즉, 본 분야의 숙련자들은 일반적인 실험으로부터 수집한 정보를 토대로, 추가 변이가 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합되어 일어나지 않도록 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

2 차 구조를 예상하는 많은 과학적 발표가 있었다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427(1996) ; Chou 등의 Biochemistry, 13(2):222-245(1974) ; Chou 등의 Biochemistry, 113(2):211-222(1974) ; Chou 등의 Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148(1978) ; Chou 등의 Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 및 Chou 등의 Biophys. J., 26:367-384(1979) 를 참조하라. 또한, 2 차 구조를 예상하는데 도움이 되는 컴퓨터 프로그램을 일반적으로 이용할 수 있다. 2 차 구조를 예상하는 한 방법은 상동성 모델링에 기초하는 방법이다. 예를 들어, 30 % 이상의 서열 동일성 또는 40 % 이상의 유사성을 갖는 두 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사 구조 위상학을 갖는다. 최근 단백질 구조 데이타베이스(PDB)의 발달은 폴리펩티드나 단백질 구조내의 가능한 접힘의 수를 포함하는 2 차 구조의 예상가능성을 높여주었다. Holm 등의 Nucl. Acid. Res. 27(1):244-247(1999) 을 참조하라. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질에서의 제한된 접힘의 수가 존재하며 구조의 임계수(critical number)가 일단 정해지면 구조의 예측은 정확해질 것이라고 제시되어 있다[Brenner 등의 Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376(1997) 참조].

2 차 구조를 예상하는 부가적인 방법은 "트레딩(threading)"[Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87(1997) ; Sippl 등의 Structure, 4(1):15-19(1996) 참조], "프로필 분석"[Bowie 등의 Science, 253:164-170(1991) ; Gribskov 등의 Meth. Enzym., 183:146-159(1990) ; Gribskov 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358(1987) 참조] 및 "친화론적 연관" [Holm 의 상기 문헌(1999) 및 Brenner 의 상기 문헌(1997) 참조] 을 포함한다.

특정 실시형태에서, 특이 결합제 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며, 이는 모폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하였을 때 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 변이된 것이다. 특정 실시형태에서, 단백질 변이체는 천연 단백질보다 많거나 적은 수의 N-결합 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합 글리코실화 부위는 다음 서열을 특징으로 한다 : Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, 여기에서 X 로 나타낸 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기이다. 이러한 서열을 생성하는 아미노산 잔기의 치환은 N-결합 탄수화물 사슬이 부가될 수 있는 부위를 제공한다. 선택적으로, 이러한 서열을 제거하는 치환으로 존재하는 N-결합 탄수화물 사슬을 제거한다. 또한, 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위(일반적으로 자연 발생적인 부위임)가 제거되고 하나 또는 그 이상의 신규한 N-결합 부위가 생성된 N-결합 탄수화물 사슬의 재배열을 제공한다. 모아미노산 서열과 비교하였을 때, 부가적인 바람직한 항체 변이체는 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 모아미노산 서열로부터 결실되거나 또는 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 항체가 불용성 봉입체를 분리한 후와 같이 생물학적으로 활성인 입체구조로 되집힘되는 경우에 유용하다. 일반적으로 시스테인 변이체는 천연 단백질보다 적은 수의 시스테인 잔기를 가지며, 일반적으로 쌍을 이루지 못한 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화시킬 수 있을 정도의 시스테인 잔기를 갖는다.

특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변화시키고, (4) 결합 친화도를 변화시키고/변화시키거나 (5) 이러한 폴리펩티드에 관한 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시킨다. 특정 실시형태에서, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환)은 자연 발생적인 서열(특정 실시형태에서, 분자간 결합을 형성하는 도메인 외부의 폴리펩티드 부분)로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 모서열의 구조적 특징을 현저하게 변화시키지 않는다(예를 들어, 대체 아미노산은 모서열에서 발생하는 나선을 파괴하지 않거나 모서열을 특징으로 하는 다른 유형의 2 차 구조를 붕괴시키지 않는다). 본 분야에서 인지되는 폴리펩티드 2 차 구조 및 3 차 구조의 예는 각각 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Proteins, Structures and Molecular Principles[Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)] ; Introduction to Protein Structure [C. Branden 및 J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York. N.Y.(1991)] ; 및 Thornton 등의 Nature 354:105(1991) 에 기재되어 있다.

용어 "유도체" 는 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환과는 다른 화학적 변이를 포함하는 분자를 의미한다. 특정 실시형태에서, 유도체는 중합체, 지방 또는 다른 유기 성분이나 무기 성분을 수반하는 화학적 결합을 포함하나 이에 한정되지 않는 공유적인 변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 화학적으로 변이된 특이 결합제는 화학적으로 변이되지 않은 특이 결합제보다 순환 반감기가 더 뛰어나다. 특정 실시형태에서, 화학적으로 변이된 특이 결합제는 바람직한 세포, 조직 및/또는 기관을 표적으로 하는 능력을 향상시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 유도된 특이 결합제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체 결합을 포함하도록 공유적으로 변이시킨다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,640,835 호, 제 4,496,689 호, 제 4,301,144 호, 제 4,670,417 호, 제 4,791,192 호 및 제 4,179,337 호를 참조하라. 특정 실시형태에서, 유도된 특이 결합제는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스 또는 이외의 탄수화물 기저 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 동종 중합체, 산화폴리프로필렌/산화에틸렌 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜 뿐만 아니라 이러한 중합체들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 중합체를 포함한다.

특정 실시형태에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 소단위체로 공유적으로 변이된다. 특정 실시형태에서, 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 또는 그 이상의 특이적인 위치 예를 들어, 아미노 말단에 결합한다. 특정 실시형태에서, 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 또는 그 이상의 곁사슬에 무작위로 결합한다. 특정 실시형태에서, PEG 는 특이 결합제에 대한 치료학적 능력을 향상시키기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, PEG 는 인간화 항체에 대한 치료학적 능력을 향상시키기 위해 사용된다. 이러한 특정 방법은 본원에 인용문헌으로 인용하고 있는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,133,426 호에 논의되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드 단편" 은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시형태에서, 단편의 길이는 적어도 5 내지 478 개의 아미노산을 갖는다. 특정 실시형태에서, 단편의 길이는 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450 개의 아미노산을 가짐이 명백해질 것이다.

펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 지니는 비-펩티드 약물로서 약학 산업 분야에 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 유사체" 또는 "펩티도유사체" 라고 명명한다. 모든 목적으로 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29(1986) ; Veber 및 Freidinger TINS p.392 (1985) ; 및 Evans 등의 J. Med. Chem. 30:1229(1987) 를 참조하라. 이러한 화합물은 종종 컴퓨터 분자 모델링의 도움으로 형상화된다. 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 유사체는 유사한 치료 효과나 예방 효과를 나타내기 위해 사용할 수 있다. 일반적으로, 펩티도유사체는 인간 항체와 같은 전형적인 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 본 분야에 널리 공지되어 있는 방법으로 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(시스 및 트란스), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- 및 --CH₂SO- 중에서 선택한 결합으로 임의로 치환된 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 동일한 유형의 D-아미노산(예를 들어, L-리신 대신 D-리신)을 갖는 공통서열(consensus sequence)의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 체계적인 치환은 특정 실시형태에서 더 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 본 분야에 공지되어 있는 방법[모든 목적으로 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Rizo 및 Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1982) 참조], 예를 들어, 펩티드가 고리형이 되도록 하는 분자간 이황화물 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 공통서열 또는 실질적으로 동일한 공통서열 변이체를 포함하는 제한된 펩티드를 생성할 수 있다.

"항체" 또는 "항체 펩티드(류)" 는 완전한 항체 또는 특이적으로 결합하는 완전한 항체와 경쟁하는 이의 결합 단편을 의미한다. 특정 실시형태에서, 결합 단편은 재조합 DNA 기술로 제조한다. 특정 실시형태에서, 결합 단편은 완전한 항체를 효소학적 또는 화학적으로 절단하여 제조한다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단쇄 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "중쇄" 는 표적에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "경쇄" 는 표적에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 모든 폴리펩티드를 포함한다. 전장의 중쇄는 가변 영역 도메인인 V_H 및 세 개의 불변 영역 도메인인 C_H1, C_H2 와 C_H3 을 포함한다. V_H 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재하며, C_H3 도메인은 카르복시-말단에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄" 는 전장의 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장의 경쇄는 가변 영역 도메인인 V_L 및 불변 영역 도메인인 C_L 을 포함한다. 중쇄와 마찬가지로, 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 존재한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "경쇄" 는 전장의 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. Fab 단편은 하나의 경쇄와 C_H1 및 하나의 중쇄의 가변 영역으로 이루어져 있다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화물 결합을 형성할 수 없다. Fab' 단편은 하나의 경쇄 및 부가적인 불변 영역인 C_H1 및 C_H2 둘 다를 포함하는 하나의 중쇄를 포함하며, F(ab')2 분자를 형성하는 사슬 간의 이황화물 결합이 두 중쇄 사이에 형성될 수 있다. Fv 영역은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 포함하지만 불변 영역은 포함하지 않는다. 단쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 항원-결합 영역을 형성하는 단쇄 폴리펩티드를 형성하기 위해 가요성 링커(flexible linker)로 연결된 Fv 분자이다. 단쇄 항체는 예를 들어, 제 WO 88/01649 호 및 미국 특허 번호 제 4,946,778 호와 제 5,260,203 호에 상세하게 논의되어 있다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 일반적으로 대략 아미노-말단이 120 내지 130 개의 아미노산으로 이루어진 중쇄 및 아미노 말단이 약 100 내지 110 개의 아미노산으로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 의미한다. 특정 실시형태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체의 아미노산 서열에서 광범위하게 다르다. 항체의 가변 영역은 일반적으로 이의 표적에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다.

용어 "면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편" 은 적어도 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 특정 실시형태에서, 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 리간드에 결합할 수 있으며, 리간드와 이의 수용체와의 결합을 방해할 수 있고, 이로 인해 수용체에 결합하는 리간드에 의한 생물학적 반응을 방해할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 수용체에 결합할 수 있고, 리간드와 이의 수용체의 결합을 방해할 수 있으며, 이로 인해 수용체에 결합하는 리간드에 의한 생물학적 반응을 방해할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편은 수용체에 결합하여 상기 수용체를 활성화시키거나 불활성화시킬 수 있다.

특정 실시형태에서, "다중특이성" 또는 "다기능성" 항체와 다른 "2 가 항체" 는 일반적으로 각각의 동일한 결합 부위를 갖는다고 이해된다.

과량의 특이 결합제가 적어도 약 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % 또는 그 이상(생체외 경쟁적 결합 검정으로 측정하였음)으로 카운터리셉터(counterreceptor)에 결합된 수용체의 양을 감소시킬 경우에 특이 결합제는 실질적으로 수용체와 리간드의 결합을 저해한다.

용어 "표적" 은 특이 결합제에 의해 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 의미한다. 특정 실시형태에서, 표적은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 갖는다. 특정 실시형태에서, 표적은 항원이다.

용어 "에피토프" 는 면역글로블린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 폴리펩티드 결정기를 포함한다. 특정 실시형태에서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당 곁사슬, 포스포릴 또는 술포닐과 같은 화학적으로 활성인 표면기들을 포함하고, 특정 실시형태에서, 에피토프 결정기는 3 차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 나타낸다. 에피토프는 항체가 결합하는 항원의 영역이다. 특정 실시형태에서, 항체가 단백질 및/또는 고분자의 복합적인 혼합물 내의 표적 항원을 선택적으로 인지할 경우에 항체는 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤ 1 μM 이고, 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤ 100 nM 이며, 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤ 10 nM 인 경우에, 항체는 항원에 특이적으로 결합한다.

용어 "제제" 는 화합물, 화합물의 혼합물, 생물학적 고분자 또는 생물학적 물질로 제조한 추출물을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "표지" 또는 "표지된" 은 예를 들어, 방사선표지된 아미노산을 혼합하거나 또는 표적 아비딘(예를 들어, 광학적 방법이나 비색 방법으로 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소학적 활성을 포함하는 스트렙타비딘)으로 검출할 수 있는 비오틴 성분의 폴리펩티드에 결합시킴으로써 검출가능한 마커를 결합시킴을 의미한다. 특정 실시형태에서, 표지 또는 마커는 또한 치료학적이다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법은 본 분야에 공지되어 있으며 사용할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어, 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 111 In, 125 I, 131 I), 형광 표지[예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인), 효소학적 표지(예를 들어, 고추냉이 퍼록시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 표지, 비오티닐기 및 2 차 수용체에 의해 인지되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 루이신 지퍼 쌍 서열, 2 차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 표식). 특정 실시형태에서, 표지는 잠재적인 입체장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arm)으로 결합된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "생물학적 시료" 는 생물 또는 살아있던 생물로부터 수득한 모든 양의 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 생물은 사람, 마우스, 원숭이, 랫, 토끼 및 이외의 다른 동물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 물질은 혈액, 혈청, 요, 세포, 기관, 조직, 골, 골수, 림프절 및 피부를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "암" 은 충실성 종양 및 혈액 악성종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 암의 예로 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암.

용어 "HGF 활성" 은 HGF 의 모든 생물학적 효과를 포함한다. 특정 실시형태에서, HGF 활성은 Met-HGF 활성이다. 특정 실시형태에서, HGF 활성은 Met 독립성 HGF 활성이다.

용어 "Met-HGF 신호전달" 은 Met 수용체와 HGF 의 상호작용을 포함한다.

용어 "Met-HGF 활성" 은 Met-HGF 신호전달로 인한 모든 생물학적 활성을 포함한다. 전형적인 활성은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 신경 유도, 간 재생, 창상 치료, 성장, 발병, 형태학적 분화, 발생학적 발달, 분산, 증식, 아포토시스, 세포 운동성, 전이, 유주, 세포 유착, 인테그린(integrin) 클리스터화, 팍실린(paxillin)의 인산화, 국소 유착의 형성 및 비정상적인(aberrant) Met-HGF 신호전달에 의한 암.

용어 "비정상적인 Met-HGF 신호전달" 은 일반적으로 신호전달이 Met-HGF 활성을 유발시키는 경우에 Met-HGF 신호전달이 모든 Met-HGF 활성을 자극하지 못하는 모든 상황을 포함한다. 비정상적인 Met-HGF 신호전달은 또한 Met-HGF 신호전달이 정상적인 신호전달로 발생하는 Met-HGF 활성보다 약한 Met-HGF 활성을 유발시키는 모든 상황을 포함한다. 비정상적인 Met-HGF 활성은 또한 정상적인 신호전달로 발생하는 Met-HGF 활성보다 강한 Met-HGF 활성을 유발시키는 모든 상황을 포함한다. 비정상적인 Met-HGF 신호전달은 예를 들어, 특정 암을 유발시킬 수 있다.

용어 "Met 독립성 HGF 활성" 은 HGF 와 Met 수용체의 결합에 의존하지 않는 HGF 에 의해 영향을 받는 모든 생물학적 활성을 의미한다. 이러한 활성은 다른 수용체와의 HGF 상호작용에 의해 영향을 받은 생물학적 활성 및 다른 경로 예를 들어, Ron 또는 Met/ron 이종2량체를 통해 HGF 에 의해 영향을 받은 생물학적 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "비정상적인 HGF 활성" 은 HGF 활성이 일반적으로 나타내야 하는 정도보다 높거나 낮은 모든 상황을 의미한다. 특정 상황에서, 비정상적인 HGF 활성은 비정상적인 HGF 신호전달에 의해 유발된다. 특정 상황에서, 비정상적인 HGF 활성은 일반적인 HGF 농도보다 높은 HGF 농도에 의해 유발된다. 특정 상황에서, 비정상적인 HGF 활성은 일반적인 HGF 농도보다 낮은 HGF 농도에 의해 유발된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약학적 제제 또는 약물" 은 환자에게 바람직하게 투여하였을 경우 바람직한 치료학적 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절인자" 는 분자의 활성 또는 기능을 변화시키는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 조절인자는 조절인자가 없을 때 관찰되는 활성 또는 기능의 정도에 비해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 조절인자는 분자의 적어도 하나의 활성 또는 기능의 정도를 감소시키는 저해제이다. 특정의 전형적인 분자의 활성 및 기능은 결합 친화도, 효소학적 활성 및 신호전달을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정의 전형적인 저해제는 단백질, 펩티드, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 소형 유기 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 펩티바디는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,660,843 호(PCT 출원 번호 제 WO 01/83525 호에 대응됨)에 기재되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 순수한" 은 목적으로 하는 종이 존재하는 우세한 종임을 의미한다(즉, 조성물 내의 다른 개별적인 종들보다 몰에 기초하여 더 풍부하게 존재함). 특정 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 목적으로 하는 종이 존재하는 모든 고분자 종의 적어도 약 50 %(몰에 기초함)를 포함하는 조성물이다. 특정 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 고분자 종의 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 % 이상을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, 목적으로 하는 종은 실질적인 균질성(오염된 종은 통상적인 검출 방법으로 조성물 내에서 검출될 수 없음)으로 정제하며, 여기에서 조성물은 실질적으로 단일 고분자 종으로 이루어져 있다.

용어 환자는 사람 및 동물 피실험자를 포함한다.

특정의 전형적인 특이 결합제

특정 경우에서, HGF 는 Met 인산화를 유도하기 위해 Met 수용체에 결합한다. 특정 경우에서, 정상적인 HGF-유도 Met 인산화는 다양한 세포 과정을 조절한다. 특정 경우에서, 비정상적인 Met-HGF 활성은 다수의 인체 질환 상태와 관련된다. 예를 들어, 특정 경우에서, 과도한 HGF 활성은 특정 암과 관련된다. 따라서, 특정 경우에서, HGF 활성을 조절하는 것은 치료학적으로 유용하다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 비정상적으로 높은 수준의 HGF 활성을 감소시키는데 사용된다. 특정 실시형태에서, 비정상적으로 높은 수준의 HGF 활성을 감소시키는 것은 종양발생 활성을 감소시키고 암의 심각성을 완화시킨다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 암을 치료하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 암을 예방하기 위해 사용된다.

특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 HGF 활성이 정상적인 암을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이러한 암인 경우에, 정상 수준 이하로 HGF 활성을 감소시키는 것은 치료학적 효과를 제공한다.

특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 적어도 하나의 Met-HGF 활성을 조절하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 적어도 하나의 Met 독립성 HGF 활성을 조절하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 하나 이상의 특이 결합제는 HGF 활성을 조절하기 위해 사용된다.

특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 특이 결합제는 완전 인간 모노클로날 항체이다. 특정 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 코드하는 누클레오티드 서열 및 상기 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 아미노산 서열, 특히 가변 영역에 대응되는 서열을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상보성 결정영역(CDR's), 특히 CDR1 내지 CDR3 에 대응되는 서열을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 면역글로불린 분자를 발현하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 특정 실시형태에서, 하이브리도마 세포주는 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1 중에서 적어도 하나를 선택한 것이다. 특정 실시형태에서, 인체 HGF 에 결합하는 정제된 인간 모노클로날 항체를 제공한다.

인공적인 효모 염색체(YACs)의 백만단위-크기의 인체 좌를 클로닝하고 재구성하며 마우스 생식세포 내로 인공적인 효모 염색체를 도입시키는 능력은 인체 질환에 걸린 유용한 모델을 만들어낼 뿐만 아니라 매우 크거나 천연 그대로 맵핑된 좌의 기능적인 성분을 밝히는 방법을 제공한다. 더욱이, 마우스 좌를 인체 등가물로 치환시키는 기술의 사용은 발생하는 동안의 인체 유전자 산물의 발현 및 조절, 다른 시스템과의 교류, 및 질환 발병 및 진행에 있어서의 관련성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.

이러한 전략의 중요한 실질적인 방법은 마우스 체액성 면역계의 "인간화" 이다. 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내로의 인체 면역글로불린(Ig) 좌의 도입은 B-세포 발생에 있어서의 항체의 역할 뿐만 아니라 항체의 프로그램된 발현 및 합성의 기초가 되는 메카니즘을 연구할 기회를 제공한다. 또한, 이러한 전략은 완전 인간 모노클로날 항체(MAbs)를 생성하는 원을 제공한다. 특정 실시형태에서, 완전 인간 항체는 마우스 또는 마우스-유도 Mabs 에 대한 면역원성 반응 및 알러지 반응을 최소화하고, 따라서 특정 실시형태에서, 투여된 항체의 효능 및 안정성을 향상시킨다. 특정 실시형태에서, 완전 인간 항체는 반복적인 항체 투여와 관련되는, 암, 말라리아 또는 증식성 당뇨병 망막병증과 같은 만성 및 재발성 인체 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.

본 분야의 숙련자들은 마우스 항체가 생성되지 않는 큰 단편의 인체 Ig 좌를 갖는 마우스 스트레인(mouse strain)을 유전 공학적으로 조작할 수 있으며, 이러한 마우스가 마우스 항체를 생성하지 않으면서 인간 항체를 생성한다는 것을 예상할 수 있다. 큰 인체 Ig 단편은 항체 생산 및 발현을 적당히 조절할 뿐만 아니라 다양한 거대 유전자 다양성을 보존시킬 수도 있다. 항체 다양화와 선별 및 인체 단백질에 대한 면역학적 내성의 결핍에 대하여 마우스류를 이용함으로써, 이러한 마우스 스트레인에서 재생성된 인간 항체류는 인체 항원을 포함하는 목적으로 하는 모든 항원에 결합하는 높은 활성의 완전 인간 항체를 산출할 수 있다. 하이브리도마 기술을 사용하여, 바람직한 특이성을 갖는 항원-특이성 인간 MAbs 를 생성하여 선별할 수 있다. 특정의 전형적인 방법은 제 WO 98/24893 호, 미국 특허 번호 제 5,545,807 호, 제 EP 546073B1 호 및 제 EP 546073A1 호에 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 숙련자들은 인체 가변 영역을 수반하는 인체와 다른 종으로부터 수득한 불변 영역을 사용할 수 있다.

자연 발생적인 항체 구조

자연 발생적인 항체 구조 단위는 일반적으로 4 량체를 포함한다. 각각의 4 량체는 일반적으로 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬의 쌍을 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 전장의 "경"쇄(특정 실시형태에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장의 "중"쇄(특정 실시형태에서, 약 50-70 kDa)로 이루어져 있다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 일반적으로 항원을 인지하는, 일반적으로 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 일반적으로 작동인자로 기능할 수 있는 불변 영역으로 특정된다. 인체 경쇄는 일반적으로 κ 및 λ 경쇄로 분류된다. 중쇄는 일반적으로 μ, σ, γ, α 또는 ε 으로 분류되며, 이들 각각은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 와 같은 항체 이소타입으로 정의된다. IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 서브클래스를 갖는다. IgM 은 IgM1 및 IgM2 를 포함하나 이에 한정되지 않는 서브클래스를 갖는다. IgA 는 IgA1 및 IgA2 를 포함하나 이에 한정되지 않는 서브클래스로 유사하게 분류된다. 일반적으로 전장의 경쇄 및 중쇄에서, 불변 영역 및 가변 영역은 약 12 개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되며, 또한 약 10 개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함하는 중쇄와 연결된다. 예를 들어, Fundamental Immunology Ch. 7[Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989)](본원에 참고문헌으로 인용하고 있음)을 참조하라. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 일반적으로 항원-결합 부위를 형성한다.

가변 영역은 일반적으로 상보성 결정영역 또는 CDRs 로 불리는 3 개의 초가변 영역과 결합하는 상대적으로 보존된 외곽 구조 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 두 사슬의 CDRs 는 외곽 구조 영역으로 결합되며, 특정 에피토프와 결합가능하다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 일반적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산 배열은 일반적으로 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest[National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 및 1991)] 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987) ; Chothia 등의 Nature 342:878-883(1989) 에 정의되어 있는 바에 따른다.

특정 실시형태에서, 항체 중쇄는 항체 경쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 항체 경쇄는 항체 중쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 항체 결합 영역은 항체 경쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 항체 결합 영역은 항체 중쇄 없이 항원에 결합한다. 특정 실시형태에서, 개별적인 가변 영역은 다른 가변 영역 없이 항원에 특이적으로 결합한다.

특정 실시형태에서, 항체 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인 및 CDR 의 결정적인 윤곽묘사는 항체의 구조를 설명하고/설명하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 설명함으로써 수행한다. 특정 실시형태에서, 이는 X-선 결정학과 같은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 다양한 모든 기술로 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 다양한 분석 방법은 CDR 영역을 확인하거나 예측하기 위해 수행할 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, AbM 정의 및 접촉 정의를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

카바트 정의는 항체의 잔기에 번호를 매기기 위한 표준이며 일반적으로 CDR 영역을 확인하기 위해 사용된다. 예를 들어, Johnson 및 Wu, Nucleic Acids Res, 28:214-8(2000) 을 참조하라. 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다. 예를 들어, Chothia 등의 J Mol Biol, 196:901-17(1986) ; Chothia 등의 Nature, 342:877-83(1989) 를 참조하라. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 Oxford Molecular Group 에 의해 개발된 컴퓨터 프로그램을 사용한다. 예를 들어, Martin 등의 Proc Natl Acad Sci(USA) 86:9268-9272(1989) ; 영국 옥스퍼드에 소재하는 Oxford Molecular, Ltd 에서 입수한 항체의 가변 영역을 모델링하기 위한 컴퓨터 프로그램인 AbM™ 을 참조하라. AbM 정의는 Samudrala 등의 Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach, PROTEINS, Structure, Function and Genetics 상기문헌 3:194-198(1999) 에 기재되어 있는 바와 같이, 지식 데이터베이스 및 최초의 방법을 조합하여 1 차 서열로부터 항체의 3 차 구조를 모델링한다. 접촉 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 예를 들어, MacCallum 등의 J Mol Biol, 5:732-45(1996) 을 참조하라.

관례에 의해, 중쇄의 CDR 영역은 일반적으로 H1, H2 및 H3 로 언급되며 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 순서대로 번호를 매긴다. 경쇄의 CDR 영역은 일반적으로 L1, L2 및 L3 로 언급되며 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 순서대로 번호를 매긴다.

이중특이성 또는 이작용기성 항체

이중특이성 또는 이작용기성 항체는 일반적으로 2 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2 개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적인 혼성 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마를 융합시키거나 Fab' 단편을 결합시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 생성할 수 있다. 예를 들어, Songsivilai 등의 Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990) ; Kostelny 등의 J. Immunol. 148:1547-1553(1992) 를 참조하라.

항체의 제조

특정 실시형태에서, HGF 에 특이적으로 결합하는 특정 항체는 본 발명에 포함된다. 특정 실시형태에서, 항체는 항원으로 면역화시켜 생성한다. 용어 "항원" 은 항원 및/또는 다른 표적에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 동물에 사용된 분자를 의미한다. 특정 실시형태에서, 항체는 전장의 HGF, HGF 의 수용성 형태, HGF 의 스플라이스 변이체 형태 또는 이의 단편으로 면역화시켜 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이고/항체이거나 재조합 항체이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 인간 항체를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물을 면역화시켜 제조한 인간 항체이다(예를 들어, PCT 공개 출원 번호 제 WO 93/12227 호를 참조하라).

특정 실시형태에서, 항체의 표적에 대한 항체의 친화도와 같은 항체의 고유의 특성을 조정하기 위해 특정 전략을 사용할 수 있다. 이러한 전략은 항체 변이체를 생성하기 위한 항체를 코드하는 폴리누클레오티드 분자의 부위-특이적 또는 무작위 돌연변이를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기와 같이 생성한 다음 예를 들어, 친화도를 증가시키거나 감소시키는, 바람직한 변화를 나타내는 항체 변이체를 스크리닝한다.

특정 실시형태에서, 돌연변이 전략으로 표적화된 아미노산 잔기는 CDRs 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 가변 영역의 외곽구조 영역 내 아미노산이 표적화된다. 특정 실시형태에서, 상기 외곽구조 영역은 특정 항체의 표적 결합 특성에 기여하는 것으로 밝혀져 왔다. 예를 들어, Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402(1999) 및 본원의 참고문헌을 참조하라.

특정 실시형태에서, 항체 변이체의 보다 적고 좀 더 효과적으로 스크리닝된 라이브러리는 CDRs 내의 과-돌연변이 부위에 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발을 제한시킴으로써 생성하며, 상기 CDRs 내의 과-돌연변이 부위는 체세포 친화성 돌연변이 과정 동안 돌연변이되기 쉬운 영역을 의미한다. 예를 들어, Chowdhury 및 Paston, Nature Biotech, 17:568-572(1999) 및 본원의 참고문헌을 참조하라. 특정 실시형태에서, 특정 유형의 DNA 요소는 특정의 동방향 및 역방향 반복, 특정 공통서열, 특정 2 차 구조 및 특정 회문구조(palindrome)를 포함하나 이에 한정되지 않는 과-돌연변이 부위를 확인하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 과-돌연변이 부위를 확인하기 위해 사용할 수 있는 DNA 요소는 순서대로 퓨린(A 또는 G), 구아닌(G), 피리미딘(C 또는 T), 아데노신이나 티로신(A 또는 T)(즉, A/G-G-C/T-A/T)을 포함하는 4 가 염기 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 과-돌연변이 영역을 확인하기 위해 사용할 수 있는 DNA 요소의 또다른 예는 세린 코돈 ; A-G-C/T 이다.

특정 실시형태에서, 항체는 인간화된다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 실질적으로 인체에서 비-면역원성이다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 실질적으로 인간화 항체가 유도된 다른 종에서 수득한 항체로서 표적에 대한 동일한 친화도를 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,530,101 호, 미국 특허 제 5,693,761 호 ; 미국 특허 제 5,693,762 호 ; 미국 특허 제 5,585,089 호를 참조하라.

특정 실시형태에서, 항체의 면역원성은 감소시키고 항원 결합 도메인의 천연의 친화도는 감소시키지 않으면서 변이시킬 수 있는 항체 가변 영역의 아미노산을 확인하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,766,886 호 및 제 5,869,619 호를 참조하라.

특정 실시형태에서, 본 분야에 공지되어 있는 방법에 의한 항체의 변이는 일반적으로 표적에 대한 결합 친화도가 증가되도록 설계하고/설계하거나 수용자의 항체의 면역원성이 감소되도록 설계한다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 동원 항원(cognate antigen)에 대한 항체의 친화도를 향상시키기 위해 글리코실화 부위를 제거하여 변이시킨다. 예를 들어, Co 등의 Mol Immunol 30:1361-1367(1993) 을 참조하라. 특정 실시형태에서, "재성형", "과키메라화" 또는 "베니어링(veneering)/재표면화(resurfacing)" 과 같은 기술은 인간화 항체를 생성하기 위해 사용한다. 예를 들어, Vaswami 등의 Annals of Allergy, Asthma, & Immunol 81:105(1998) ; Roguska 등의 Prot Engineer 9:895-904(1996) ; 및 미국 특허 번호 제 6,072,035 호를 참조하라. 특정 실시형태에서, 상기 기술은 일반적으로 외부 잔기의 수를 감소시킴으로써 항체 면역원성을 감소시키지만 항체의 반복되는 투여로 인한 항-유전성 반응 및 항-이인자성 반응은 방해하지 않는다. 면역원성을 감소시키기 위한 이외의 특정 방법은 예를 들어, Gilliland 등의 J Immunol 62(6):3663-71(1999) 에 기재되어 있다.

특정 경우에서, 인간화시킨 항체(humanizing antibody)는 항원 결합 능력이 손실된다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 "복귀 돌연변이" 된다. 특정 실시형태에서, 인간화 항체는 공여 항체에서 발견되는 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 포함하도록 돌연변이시킨다. 예를 들어, Saldanha 등의 Mol Immunol 36:709-19(1999) 를 참조하라.

특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정영역(CDRs)을 동일하거나 또는 다른 종의 외곽 구조 영역(FRs)에 이식할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDRs 를 공통 인체 FRs 에 이식할 수 있다. 공통 인체 FRs 를 생성하기 위해서, 특정 실시형태에서 몇몇의 인체 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 FRs 를 공통 아미노산 서열을 확인하기 위해 배열하였다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 FRs 를 다른 중쇄 또는 경쇄의 FRs 로 치환할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄 FRs 의 미량 아미노산은 치환하지 않았으나 나머지 FR 아미노산은 치환하였다. 미량 아미노산은 FRs 에서는 일반적으로 발견되지 않는 위치에서의 특이적인 아미노산이다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체에서의 이식된 가변 영역은 HGF 에 결합하는 항체의 불변 영역과는 상이한 불변 영역과 함께 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식된 가변 영역은 단쇄 Fv 항체의 부분이다. CDR 이식은 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 번호 제 6,180,370 호, 제 6,054,297 호, 제 5,693,762 호, 제 5,859,205 호, 제 5,693,761 호, 제 5,565,332 호, 제 5,585,089 호와 제 5,530,101 호 및 Jones 등의 Nature 321:522-525(1986) ; Riechman 등의 Nature, 332:323-327(1988) ; Verhoeyen 등의 Science 239:1534-1536(1988), Winter, FEBS Letts 430:92-94(1988) 에 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 파지 디스플레이 기술은 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용한다. 특정 실시형태에서, 이러한 기술로 완전 인간 모노클로날 항체를 생성한다. 특정 실시형태에서, 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 코드하는 폴리누클레오티드는 파지 입자의 표면에서 발현된다. 예를 들어, Hoogenboom 등의 J Mol Biol 227:381(1991) ; Marks 등의 J Mol Biol 222:581(1991) ; 미국 특허 번호 제 5,885,793 호를 참조하라. 특정 실시형태에서, 파지는 표적에 대한 친화도를 갖는 항체 단편을 확인하기 위해 "스크리닝" 한다. 따라서, 상기의 특정 방법은 사상 박테리오파지 표면상에 항체 단편 레퍼토리를 나타내는 면역 선별 및 표적에 결합시킴으로써 파지를 후속 선별하는 방법과 유사하다. 이러한 특정 방법에서, 고 친화도로 작용하는 작동성 항체 단편을 분리하였다. 특정 실시형태에서, 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리는 말초혈 림프구의 자연적으로 재배열된 인체 V 유전자를 클로닝함으로써 생성한다. 예를 들어, Mullinax 등의 Proc Natl Acad Sci(USA) 87:8095-8099(1990) 를 참조하라.

특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 삽입된 게놈을 생성하는 인간 항체의 실질적인 부분을 갖지만, 내인성 마우스의 항체를 생성하지 못하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 제조한다. 이러한 마우스는 인체 면역글로불린 분자 및 항체를 생성할 수 있으며 마우스의 면역글로불린 분자 및 항체는 생성하지 않는다. 이러한 결과를 얻기 위해 사용된 기술은 특허, 출원 및 본원의 명세서에 기재된 참고문헌에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 숙련자들은 본원에 참고문헌으로 인용된 PCT 공개 출원 번호 제 WO 98/24893 호 또는 Mendez 등의 Nature Genetics 15:146-156(1997) 에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, HGF 에 특이적인 완전 인간 모노클로날 항체를 다음과 같이 제조하였다. 인체 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 목적으로 하는 항원 예를 들어, HGF 로 면역시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프 세포(예를 들어, B-세포)를 수득하였다. 불사화된 하이브리도마 세포주를 생성하기 위해 회수한 이러한 세포를 골수-유형 세포주와 융합시키고, 목적으로 하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하였다. 특정 실시형태에서, HGF 에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 생성하였다.

특정 실시형태에서, 숙주 세포에서 재조합 DNA 의 발현 또는 하이브리도마 세포의 발현에 의해 완전한 인간 항체를 생산하였다. 특정 실시형태에서, 상기에 기재된 파지 표시 기술을 사용하여 항체를 생산하였다.

특정 실시형태에서, 생체외에서 항원을 인체 비세포(B 또는 T 세포)에 노출시키고 난 다음에 면역타협 마우스 예를 들어, SCID 또는 nod/SCID 에서 노출된 세포를 재구성하여 완전한 인간 항체를 생산하였다. 예를 들어, Brams 등의 J Immunol, 160:2051-2058(1998) ; Carballido 등의 Nat Med, 6:103-106(2000)을 참조하라. 특정 이러한 연구에서, 인체 태아 조직을 SCID 마우스(SCID-hu)로의 생착(engraftment)은 장기 조혈 및 인체 T-세포 발생을 결과로서 나타낸다. 예를 들어, McCune 등의 Science 241:1532-1639(1988) ; Ifversen 등의 Sem Immunol 8:243-248(1996)을 참조하라. 특정 예에서, 이러한 키메라 마우스에서 체액성 면역 반응은 동물에서 인체 T-세포의 공동 발생에 의존한다. 예를 들어, Martensson 등의 Immunol 83:1271-179(1994)를 참조하라. 특정 연구에서, 인체 말초혈 림프구를 SCID 마우스에 이식하였다. 예를 들어, Mosier 등의 Nature 335:256-259(1988)을 참조하라. 특정 이러한 실시형태에서, 포도구균장독소 A(SEA)와 같은 초회항원자극 제제 또는 항-인체 CD40 단일클론 항체로 상기의 이식 세포를 처리하였을 때, 높은 수준의 B 세포 생산이 관찰되었다. 예를 들어, Martensson 등의 Immunol 84:224-230(1995) ; Murphy 등의 Blood 86:1946-1953(1995)를 참조하라.

특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 적어도 하나의 다음의 하이브리도마에 의해 생산하였다 : 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 10^-8, 10^-9 또는 10^-10M 의 K_D 를 갖는 HGF 에 결합한다. 특정 실시형태에서, 반응속도 방법(Kinetic method)으로 측정(도 6A)함으로써 특이 결합제는 대략 0.099 내지 0.79 nM 사이의 해리 상수(K_D)를 갖는 HGF 에 결합한다. 특정 실시형태에서, 평형/용액 방법으로 측정(도 6B)함으로써 특이 결합제는 10 pM 내지 대략 54 pM 이하의 K_D 를 갖는 HGF 에 결합한다.

특정 실시형태에서, 특이 결합제는 적어도 하나의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 및 IgM 동형의 면역글로블린 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 인체 카파 경쇄 및/또는 인체 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 동형이다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제를 포유동물의 세포에서 발현하기 위해 클로닝하였다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 및 IgM 동형의 모든 불변 영역 이외의 불변 영역을 포함한다.

특정 실시형태에서, 특이 결합제는 인체 카파 경쇄 및 인체 IgG1 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 인체 카파 경쇄 및 인체 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 인체 카파 경쇄 및 인체 IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD 또는 IgM 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제는 IgG1 동형의 불변 영역 또는 IgG2 동형의 불변 영역 둘 다가 아닌 불변 영역에 결합한 항체의 가변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 특이 결합제를 포유동물의 세포에서 발현하기 위해 클로닝하였다.

특정 실시형태에서, 적어도 하나의 하이브리도마 주(1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1)로부터 항체의 중쇄 및 경쇄의 보존적 변형(및 코딩 누클레오티드에 대응하는 변형)은 하이브리도마 주(1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.1, 1.74.1, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1)로부터 이러한 항체와 비슷한 기능적인 특성 및 화학적인 특성을 갖는 HGF 에 대한 항체를 생산할 수 있다. 대조적으로, 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 항체의 기능적인 특성 및/또는 화학적인 특성에서 실질적인 변형은 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에서 선택된 치환에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에서 선택된 치환은 (a) 치환영역에서 분자 골격의 구조[예를 들어, 시트(sheet) 입체구조 또는 나선 입체구조], (b) 목표 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는데 있어서 이들 효과는 매우 상이하다.

예를 들어, “보존적 아미노산 치환”은 천연 아미노산 잔기가 그 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향을 거의 미치지 않거나 영향을 미치지 않는 비천연 잔기로 치환됨을 포함한다. 게다가, 폴리펩티드에서 모든 천연 잔기는 알라닌으로 또한 치환될 수 있으며, 이는 “alanine scanning mutagenesis”에 이미 상세히 기재되어 있다.

이러한 치환이 요구되는 경우에, 요구되는 아미노산 치환(보존적 또는 비-보존적인 치환에 상관없이)은 본 분야에서 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환은 본원에 기재된 HGF 에 대한 항체의 중요한 잔기를 확인하거나 HGF 에 대한 항체의 친화력을 증가시키거나 감소시키기 위해 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 특정 항체를 코딩하는 서열을 적절한 포유동물의 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 특정 실시형태에 따라, 미국 특허 번호 제 4,399,216 호, 제 4,912,040 호, 제 4,740,461 호 및 제 4,959,455 호(본원에서 참조문헌으로 인용된 특허)에 예시된 바와 같이, 예를 들어 바이러스(또는 바이러스성 벡터)로의 폴리누클레오티드 팩케이징 및 바이러스(또는 벡터)와 함께 숙주 세포의 형질도입을 포함하는 숙주 세포로의 폴리누클레오티드 도입을 위한 모든 공지된 방법 또는 본 분야에서 공지된 트랜스펙션 방법에 의해 형질전환을 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 사용된 형질전환 방법은 형질전환시킬 숙주에 따라 결정된다. 이종의 폴리누클레오티드의 포유동물의 세포로의 도입 방법은 본 분야에서 공지되어 있으며 다음의 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 덱스트린-매개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 트랜스펙션, 원형질 융합, 일렉트로포레이션, 리포좀에서 폴리누클레오티드의 캡슐화 및 DNA 를 핵으로의 직접 미량주입.

발현을 위한 숙주로서의 입수가능한 포유동물의 세포주는 본 분야에서 잘 알려져 있으며, 다음을 포함하는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불사화된 세포주를 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인체 간세포성의 암종 세포(예를 들어, Hep G2) 및 다른 많은 세포주. 특정 실시형태에서, 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 구성적인 HGF 결합 특성을 수반하는 항체를 생산하는지에 의해 세포주를 선택할 수 있다. 포유동물의 숙주 세포를 위한 적절한 발현 벡터는 널리 공지되어 있다.

특정 실시형태에서, 특이 결합제는 하나 또는 그 이상의 폴리누클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드 분자를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 이용할 수 있다. 이러한 시스템은 다음을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다 : 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아와 같은 미생물 ; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모 ; 바이러스 발현 벡터(예를 들어 바큐로바이러스)를 감염시킨 곤충 세포 시스템 ; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 트랜스펙션시키거나 세균성 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템 ; 또는 동물 세포 시스템.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 효모에서 재조합적으로 발현시켰다. 특정 이러한 실시형태는 제조자 지시에 따라 상업적으로 입수가능한 발현 시스템, 예를 들어 Pichia 발현 시스템(미국 캘리포니아 샌디에이고에 소재하는 Invitrogen 에서 입수)을 사용하였다. 특정 실시형태에서, 이러한 시스템은 직접적인 분비를 위해 전-전구-알파 서열에 의존한다. 특정 실시형태에서, 메탄올에 의한 유도시 알콜 산화효소(AOX1) 프로모터에 의해 삽입물이 전사되었다.

특정 실시형태에서, 효모 증식 배지로부터 분비된 폴리펩티드를 정제하였다. 특정 실시형태에서, 효모 증식 배지로부터 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용된 방법은 박테리아 및 포유동물의 세포 상청액으로부터 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용된 방법과 동일하다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 pVL 1393(미국 캘리포니아 샌디에이고에 소재하는 PharMingen 에서 입수)와 같은 바큐로바이러스 발현 벡터로 클로닝하였다. 특정 실시형태에서, sF9 단백질 없는 배지에서 스포도테라 프루지페르다 세포(Spodoptera frugiperda cells)를 감염시키고 재조합 폴리펩티드를 생산하기 위해 제조자 지시(PharMingen에서 입수)에 따라 상기 벡터를 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴피펩티드를 정제하고 헤파린-세파로즈(heparin-sepharose) 컬럼(Pharmacia 에서 입수)을 사용하여 이러한 배지로부터 농축시켰다.

특정 실시형태에서, 곤충 시스템에서 폴리펩티드를 발현시켰다. 폴리펩티드 발현을 위한 특정 곤충 시스템은 본 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 하나의 이러한 시스템에서, 오토그라파 캘리포니카 핵 폴리헤드론형성 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)를 스포도테라 프루지페르다 세포 또는 트리코플러시아 라베(Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 벡터로서 사용하였다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 예를 들어, 폴리헤드린 유전자 내의 바이러스의 비필수적인 유전자에 삽입할 수 있고 이러한 유전자에 대해 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다. 특성 실시형태에서, 핵산 분자의 성공적인 삽입은 비필수적인 유전자의 불활성을 제공할 것이다. 특정 실시형태에서, 이러한 불활성화는 검출할 수 있는 특징을 결과로서 나타낸다. 예를 들어, 폴리헤드린 유전자의 불활성화는 코트 단백질이 결핍된 바이러스의 생산을 결과로서 나타낸다.

특정 실시형태에서, 에스. 프루지페르다 세포 또는 트리코플러시아 라베에 감염시키기 위해 재조합 바이러스를 사용할 수 있다. 예를 들어, Smith 등의 J Virol 46:584(1983) ; Engelhard 등의 Proc Nat Acad Sci(USA) 91:3224-7(1994)를 참조하라.

특정 실시형태에서, 박테리아 세포에서 생성된 폴리펩티드류를 박테리아에서 불용성 봉입체로서 생산하였다. 특정 실시형태에서, 이러한 봉입체를 포함하는 숙주 세포를 원심분리법으로 수집하고 ; 0.15 M NaCl, 10mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA 로 세척하였으며 ; 실온에서 15 분 동안 0.1 mg/ml 리소자임(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수)으로 처리하였다. 특정 실시형태에서, 용해질을 음파처리에 의해 깨끗하게 하고 세포 단편을 12,000×g 에서 10 분 동안 원심분리법에 의해 펠렛화시켰다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드-함유 펠렛을 50 mM Tris, pH 8 및 10 mM EDTA 에서 재현탁시키고 ; 50 % 글리세롤 상에서 층을 이루게 하고 ; 6000×g 에서 30 분 동안 원심분리하였다. 특정 실시형태에서, 펠렛을 Mg⁺⁺ 및 Ca⁺⁺ 가 없는 표준 인산완충식염수 용액(PBS)에서 재현탁시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 재현탁시킨 펠렛을 분별증류하여 폴리펩티드를 추가로 정제하였다(예를 들어, Sambrook 등의 상기 문헌을 참조하라). 특정 실시형태에서, SDS 가 결핍된 겔-러닝(running) 완충액에서 절단될 수 있고 전기용리될 수 있는 단백질을 시각적으로 보이게 하기 위해 이러한 겔에 0.4 M KCl 을 스며들게 할 수 있다. 특정 실시형태에 따라, 가용성 단백질로서 박테리아에서 글루타티온-에스-트랜스퍼라아제(GST) 융합 단백질을 생산하였다. 특정 실시형태에서, 이러한 GST 융합 단백질을 GST 정제 모듈(Pharmacia 에서 입수)을 이용하여 정제하였다.

특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드가 “재접힘되는 것(refold)”은 바람직하다. 특정 실시형태에서, 이러한 폴리펩티드를 본원에 기재되어 있는 특정 재조합 시스템을 사용하여 생산하였다. 특정 실시형태에서, 바람직한 삼차구조를 형성하고/형성하거나 이황화물 결합을 형성하기 위해 폴리펩티드를 "재접히게 하고/재접히게 하거나" 산화시켰다. 특정 실시형태에서, 이러한 구조 및/또는 결합은 폴리펩티드의 특정 생물학적 활성과 관련되어 있다. 특정 실시형태에서, 재접힘은 본 분야에서 널리 공지된 수많은 방법을 사용하여 수행하였다. 전형적인 방법은 카오트로픽 제제(chaotropic agent)의 존재 하에서 일반적으로 pH 7 이상에서 용해시킨 폴리펩티드 제제를 노출시키는 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 전형적인 카오트로픽 제제는 구아니딘이다. 특정 실시형태에서, 재접힘/산화 용액은 또한 환원제 및 환원제의 산화 형태를 함유한다. 특정 실시형태에서, 환원제 및 이의 산화 형태는 이황화물 셔플링(shuffling)이 일어날 수 있는 특정 산화환원 전위를 일으킬 수 있는 비율로 존재한다. 특정 실시형태에서, 이러한 셔플링은 시스테인 다리(bridge)를 형성하게 한다. 전형적인 산화환원 쌍은 시스테인/시스타민, 클루타티온/디티오비스 GSH, 염화 제이구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT 및 2-머갑토에탄놀(bME)/디티오-bME 를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 공동-용매(co-solvent)를 재접힘 효율을 증가시키기 위해 사용하였다. 전형적인 공동용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 아르기닌을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

특정 실시형태에서, 실질적으로 하나는 폴리펩티드를 정제하였다. 특정 단백질 정제 기술은 본 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 정제는 비-폴리펩티드 분획으로부터 폴리펩티드 분별증류의 가공하지 않은 분별증류를 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 크로마토그래피 기술 및/또는 전기영동 기술을 이용하여 정제하였다. 전형적인 정제 방법은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 황산암모늄 침강 ; PEG 침강 ; 면역침강반응 ; 열변성 후에 원심분리법 ; 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질-A-세파로즈), 이온교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함하지만 이로 제한되지 않는 크로마토그래피 ; 겔 여과법 ; 히드록실 인화석 크로마토그래피 ; 등전 집중 ; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ; 및 이러한 기술 및 다른 기술의 병용. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 고속 단백질 액체 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다. 특정 실시형태에서, 정제 단계를 변화시키거나 특정 단계를 생략할 수 있고 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 적절한 제조 방법을 결과로서 나타낸다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드 제조의 정제 정도를 측정하였다. 정제 정도를 측정하기 위한 특정 방법은 본 분야의 숙련자에서 공지되어 있다. 특정 전형적인 방법은 제조의 특이적인 결합 활성을 측정하는 방법 및 SDS/PAGE 분석에 의한 제조 내에서 폴리펩티드의 양을 측정하는 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 폴리펩티드 제조의 정제의 양을 측정하기 위한 특정 전형적인 방법은 제조의 결합활성을 계산하고 초기 추출물의 결합 활성과 이를 비교하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 계산의 결과를 “정제도(fold purification)”로서 표현하였다. 결합활성의 양을 나타내기 위해 사용된 단위는 실행된 특정 검정에 따른다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드를 부분적으로 정제하였다. 특정 실시형태에서, 부분적인 정제는 보다 적은 정제 단계를 사용하거나 동일한 일반적인 정제 계획의 상이한 형태를 사용하여 수행하였다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 HPLC 장치를 이용하여 실행한 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용한 동일한 기술 보다 일반적으로 보다 큰 “정제도”를 결과로서 나타내었다. 특정 실시형태에서, 보다 낮은 정도의 정제를 결과로서 나타내는 방법은 폴리펩티드의 총 회수율 또는 폴리펩티드의 결합활성을 유지하는 장점이 있다.

특정 예에서, 폴리펩티드의 전기영동 이동은 SDS/PAGE 의 상이한 조건과 함께 때때로 상당히 다양할 수 있다. 예를 들어, Capaldi 등의 Biochem Biophys＼Res Comm, 76:425(1977)을 참조하라. 상이한 전기영동 조건 하에서, 정제된 폴리펩티드 또는 부분적으로 정제된 폴리펩티드의 명백한 분자량이 상이할 수 있음을 인지할 수 있다.

특정 전형적인 에피토프

특정 실시형태에서, 항-HGF 항체 결합에 대한 에피토프를 제공한다(예를 들어, 실시예 8, 도 10 및 11 및 SEQ ID NO : 164 및 165 를 참조하라). 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 항-HGF 항체 또는 특이 결합제의 결합을 저해하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 항-HGF 항체 또는 특이 결합제의 결합을 감소시키기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 항-HGF 항체 또는 특이 결합제의 결합을 실질적으로 저해하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 과량의 에피토프가 HGF 에 결합하는 항-HGF 항체 또는 특이 결합제의 양을 적어도 약 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % 또는 그 이상으로 감소시킬 때, 에피토프는 HGF 에 대한 항-HGF 항체 또는 특이 결합제의 결합을 실질적으로 저해한다. 특정 실시형태에서, 항-HGF 항체 또는 특이 결합제에 결합시키기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체 또는 특이 결합제를 확인하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체 또는 특이 결합제를 분리하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체 또는 특이 결합제를 생성하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 결합하는 항체 또는 특이 결합제를 생성하기 위해 면역원으로서 HGF 에피토프를 이용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에피토프를 동물에 투여할 수 있고 그 후에 HGF 에 결합하는 항체를 동물로부터 수득할 수 있다. 특정 실시형태에서, 정상 HGF-Met 신호를 방해하기 위해 HGF 에피토프를 이용할 수 있다.

특정 치료학적 용도

특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제 및 다른 치료학적 제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 말라리아를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제 및 다른 치료학적 제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 말라리아를 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 증식성 당뇨성 망막병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 결합제 및 다른 치료학적 제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는 증식성 당뇨성 망막병증을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 단독으로 투여하였다. 특정 실시형태에서, 적어도 또다른 하나의 치료학적 제제의 투여 전에 HGF 에 대한 특이 결합제를 투여하였다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 적어도 또다른 하나의 치료학적 제제의 투여와 함께 동시에 투여하였다. 특정 실시형태에서, 적어도 또다른 하나의 치료학적 제제를 투여한 다음에 HGF 에 대한 특이 결합제를 투여하였다. 치료학적 제제는 적어도 또다른 하나의 암 치료 제제를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 전형적인 암 치료 제제는 방사선 치료 및 화학요법을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물을 병용치료(즉, 다른 제제와 병용됨)하여 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 병용 치료는 적어도 하나의 항-맥관형성성 제제와 병용하여 HGF 와 결합할 수 있는 특이 결합제를 포함한다. 제제는 생체외에서 합성적으로 제조된 화학적 조성물, 항체, 항원 결합 영역, 방사선 핵종 및 이의 복합물 및 결합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 제제는 작용물질, 길항물질, 알로스테릭 조절인자 또는 독소로서 작용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제제는 이의 표적(예를 들어, 수용체 또는 효소 활성화 또는 저해)을 저해하거나 자극하여 이에 의해서 세포 사멸을 촉진시키거나 세포 성장을 억제하도록 작용할 수 있다.

화학요법 치료는 다음의 알킬화제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 항-종양제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실과 같은 머스터드 질소 ; 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(메틸-CCNU)과 같은 나이트로소우레아 ; Temodal^™(테모졸아미드), 트리에틸렌멜라민(TEM), 트리에틸렌, 티오포스포르아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민)과 같은 에틸린이민/메틸멜라민 ; 부설판과 같은 술폰산 알킬 ; 다카르바진(DTIC)과 같은 트리아진 ; 메토트렉세이트 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체, 5-플루오로우라실(5FU), 플루오로데옥시우리딘, 젬시타빈, 사이토신 아라비노사이드(AraC, 사이타라빈), 5-아자사이티딘, 및 2,2'-디플루오로데옥시사이티딘과 같은 피리미딘 유사체 및 6-머캅토퓨린, 6-티이오구아닌, 아자타이오프린, 2'-데옥시코포르마이신(펜토스타틴), 에리트로히드록시노닐아데닌(EHNA), 인산플루다리빈 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)과 같은 퓨린 유사체 ; 파클리탁셀, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함하는 빈카 알칼로이드, 탁소텔, 에스트라무스틴 및 인산 에스트라무스틴과 같은 항유사분열 약물을 포함하는 천연 산물 ; 에토포사이드 및 테니포사이드와 같은 피포도필로톡신(ppipodophylotoxins); 악티모마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 독소루비신, 마이토잔트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 마이토마이신 C 및 악티노마이신과 같은 항생제 ; L-아스파라지네이스와 같은 효소 ; 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF 와 같은 생체반응조절물질 ; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 플레티니움(platinium) 배위결합 복합체, 마이토잔트란과 같은 안드라센디온, 히드록시우레아와 같은 치환된 우레아, N-메틸히드라진(MIH) 및 프로카르바진을 포함하는 메틸히드라진 유도체, 마이토테인(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티마이드와 같은 부신피질 억제제를 포함하는 이종 혼합제제 ; 프레드니손 및 등가물과 같은 부신피질자극호르몬 길항물질, 덱사메타손 및 아미노글루테티마이드를 포함하는 호르몬 및 길항물질 ; Gemzar™(젬시타빈), 카프론산 히드록시프로제스테론, 초산메드록시프로제스테론 및 초산메제스트롤과 같은 프로제스틴 ; 다이에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라다이올 등가물과 같은 에스트로젠 ; 타목시펜과 같은 항에스트로젠 ; 프로피온산테스토스테론 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로젠 ; 플루타마이드, 생식선자극호르몬-방출 호르몬 유사체 및 류프롤라이드와 같은 항안드로젠 ; 및 플루타미드와 같은 비-스테로이드성 항안드로젠.

HGF 에 대한 특이 결합제와 함께 투여될 수 있는 암치료는 표적 치료를 또한 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표적 치료의 예는 치료학적 항체를 사용하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 전형적인 치료학적 항체는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 마우스 항체, 마우스-인체 키메라 항체, CDR-이식 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체 및 스크리닝 항체 라이브러리에 의해 선별된 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 합성 항체. 전형적인 항체는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 세포 표면 단백질 Her2 에 결합하는 항체, CDC20, CDC33, 점액-유사 당단백질, 및 종양 세포에 존재해 있고 이러한 단백질이 나타난 종양 세포에서 세포증식억제성 및/또는 세포독성 효과를 임의로 유도하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR). 전형적인 항체는 유방암 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용할 수 있는 HERCEPTIN^™(트라스투주맵) 및 비-호지킨 림프종 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용할 수 있는 RITUXAN^™(리툭시맵), ZEVALIN^TM(이브리투모맵 티우세탄), GLEEVEC^TM 및 LYMPHOCIDE^™(에프라투주맵)을 또한 포함한다. 특정 전형적인 항체는 또한 다음을 포함한다 : ERBITUX™(IMC-C225) ; 에르티놀리브(lressa) ; BEXXAR™(요드 131 토시투모맵) ; KDR(키나제 도메인 수용체) 저해제 ; 항 VEGF 항체 및 길항물질(예를 들어, Avastin^™ 및 VEGAF-TRAP) ; 항 VEGF 수용체 항체 및 항원 결합 영역 ; 항-Ang-1 및 Ang-2 항체 및 항원 결합 영역 ; Tie-2 및 다른 Ang-1 및 Ang-2 수용체에 대한 항체 ; Tie-2 리간드 ; Tie-2 키나제 저해제에 대한 항체 ; 및 Campath^?(알렘투주맵). 특정 실시형태에서, 암 치료제는 TNF-관련 폴리펩티드 TRAIL 을 포함하지만 이로 제한되지 않는 종양 세포에서 선택적인 아포토시스를 유도하는 폴리펩티드이다.

특정 실시형태에서, 암 치료제는 맥관형성을 감소시키는 항-맥관형성 제제이다. 특정 이러한 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : IL-8 ; 캠페스(Campath), B-FGF ; FGF 길항물질 ; Tek 길항물질(모든 목적에 대해 각각이 본원의 참고문헌으로 인용된 Cerretti 등의., 미국 공개 번호 제 2003/0162712 호 ; Cerretti 등의 미국 특허 번호 제 6,413,932 호 및 Cerretti 등의 미국 특허 번호 제 6,521,424 호) ; 항-TWEAK 제제(항체 및 항원 결합 영역을 포함하지만 이로 제한되지 않음) ; 가용성 TWEAK 수용체 길항물질(Wiley, 미국 특허 번호 제 6,727,225 호) ; 이의 리간드에 대한 인테그린의 결합을 중화시키기 위한 ADAM 디스인테그린(distintegrin) 도메인(Fanslow 등의 미국 공개 번호 제 2002/0042368 호) ; 항-eph 수용체 및 항-에프린(ephrin) 항체 ; 항원 결합 영역 또는 길항물질(미국 특허 번호 제 5,981,245 호 ; 제 5,728,813 호 ; 제 5,969,110 호 ; 제 6,596,852 호 ; 제 6,232,447 호 ; 제 6,057,124 호 및 이의 관련 특허 ) ; Avastin^™ 또는 VEGF-TRAP^™ 와 같은 항-VEGF 제제(예를 들어, VEGF 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역, 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 이의 리간드 결합 영역) 및 항-VEGF 수용체 제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 패니투무맵(panitumumab), IRESSA^™ [게피티니브(gefitinib)], TARCEVA^™[에르로티니브(erlotinib)], 항-Ang-1 및 항-Ang-2 제제(예를 들어, 이에 또는 이의 수용체, 예를 들어 Tie-2/TEK 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역)와 같은 EGFR 저해성 제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역) 및 간세포 성장 인자의 길항물질(HGF, 분산 인자로 또한 널리 공지됨)와 같은 항-Tie-2-키나제 저해성 제제(예를 들어, 성장 인자에 특이적으로 결합하고 성장 인자의 활성을 저해하는 항체 또는 항원 결합 영역), 및 이의 수용체 “c-met”에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역 ; 항-PDGF-BB 길항물질 ; PDGF-BB 리간드에 대한 항체 및 항원 결합 영역 ; 및 PDGFR 키나제 저해제.

특정 실시형태에서, 암치료제는 맥관형성 저해제이다. 특정 이러한 저해제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : SD-7784(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; 실렌지타이드(독일에 소재하는 Merck KGaA 에서 입수, 제 EPO 770622 호) ; 페캡타니브 옥타소듐(미국에 소재하는 Gilead Sciences 에서 입수) ; 알파스타틴(영국에 소재하는 BioActa 에서 입수) ; M-PGA(미국에 소재하는 Celgene 에서 입수, 미국 제 5712291 호) ; 일로마스타트(ilomastate)(미국에 소재하는 Arriva 에서 입수, 미국 제 5892112 호) ; 세마사니브(semaxanib)(미국에 소재하는 Pfiza 에서 입수, 미국 제 5792783 호) ; 바타라니브(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; TLC ELL-12(아일랜드에 소재하는 Elan 에서 입수) ; 아네코르타브 아세테이트(미국에 소재하는 Alcon 에서 입수) ; 알파-D148 Mab(미국에 소재하는 Amgen 에서 입수) ; CEP-7055(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수) ; 항-Vn Mab(네덜란드에 소재하는 Crucell 에서 입수) DAC:항맥관형성(캐나다에 소재하는 ConjuChem 에서 입수) ; 안지오시딘(Angiocidin)(미국에 소재하는 InKine Pharmaceutical 에서 입수) ; KM-2550(일본에 소재하는 Kyowa Hakko 에서 입수) ; SU-0879(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; CGP-79787(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수, 유럽 제 970070 호) ; ARGENT 테크놀로지(미국에 소재하는 Ariad 에서 입수) ; YIGSR-스텔스(Stealth)(미국에 소재하는 Johnson & Johnson 에서 입수) ; 피브리노겐-E 단편(영국에 소재하는 BioActa 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(영국에 소재하는 Trigen 에서 입수) ; TBC-1635(미국에 소재하는 Encysive Pharmaceuticals 에서 입수) ; SC-236(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; ABT-567(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; 메타스타틴(Metastatin)(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(스웨덴에 소재하는 Tripep 에서 입수) ; 마스핀(일본에 소재하는 Sosei 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 Oncology Sciences Corporations 에서 입수) ; ER-68203-00(미국에 소재하는 IVAX 에서 입수) ; 베네핀(미국에 소재하는 Lane Labs 에서 입수) ; Tz-93(일본에 소재하는 Tsumura 에서 입수) ; TAN-1120(일본에 소재하는 Takeda 에서 입수) ; FR-111142(일본에 소재하는 Fujisawa 에서 입수, 일본 제 02233610 호) ; 혈소판 인자 4(미국에 소재하는 RepliGen 에서 입수, 유럽 제 407122 호) ; 혈관 내피 성장 인자 길항물질(덴마크에 소재하는 Borean 에서 입수) ; 암 치료(미국에 소재하는 University of South Carolina 에서 입수) ; 베바시주맵(plNN)(미국에 소재하는 Genentech 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; XL 784(미국에 소재하는 Exelixis 에서 입수) ; XL 647(미국에 소재하는 Exelixis 에서 입수) ; MAb, 알파5베타3 인테그린, 제 2 의 발생(미국에 소재하는 Applied Molecular Evolution 에서 입수 및 미국에 소재하는 Medlmmune 에서 입수) ; 유전자 치료 망막병증(영국에 소재하는 Oxford BioMedica 에서 입수) ; 엔자스타우린 히드로클로라이드(USAN) (미국에 소재하는 Lilly 에서 입수) ; CEP 7055(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수 및 프랑스에 소재하는 Sanofi-Synthelabo 에서 입수) ; BC 1(이탈리아에 소재하는 Genoa Institute of Cancer Research 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(오스트레일리아에 소재하는 Alchemia 에서 입수) ; VEGF 길항물질(미국에 소재하는 Regeneron 에서 입수) ; rBPI 21 및 BPI-유도 항맥관형성(미국에 소재하는 XOMA 에서 입수) ; PI 88(오스트레일리아에 소재하는 Progen 에서 입수) ; 실렌지타이드(plNN)(독일에 소재하는 Merck KGaA 에서 입수, 독일에 소재하는 Munich Technical University 에서 입수, 미국에 소재하는 Scripps Clinic 및 Research Foundation 에서 입수) ; 세툭시맵(INN)(프랑스에 소재하는 Aventis 에서 입수) ; AVE 8062(일본에 소재하는 Ajinomoto 에서 입수) ; AS 1404(뉴질랜드에 소재하는 Cancer Research Laboratory 에서 입수) ; SG 292(미국에 소재하는 Telios 에서 입수) ; 엔도스타딘(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; ATN 161(미국에 소재하는 Attenuon 에서 입수) ; 안지오스타틴(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; ZD 6474(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; ZD 6126(영국에 소재하는 Angiogene Pharmaceuticals 에서 입수) ; PPI 2458(미국에 소재하는 Praecis 에 입수) ; AZD 9935(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; AZD 2171(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; 바타라니브(plNN)(뉴질랜드에 소재하는 Novartis 에서 입수 및 독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; 조직 인자 경로 저해제(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 페캡타니브(Pinn)(미국에 소재하는 Gilead Sciences 에서 입수) ; 잔토리졸(한국에 소재하는 Yonsei University 에서 입수) ; 백신, 유전자-기저, VEGF-2(미국에 소재하는 Scripps Clinic 및 Research Foundation 에서 입수) ; SPV5.2(캐나다에 소재하는 Supratek 에서 입수) ; SDX 103(미국 산디에이고에 소재하는 University of California 에서 입수) ; PX 478(미국에 소재하는 ProlX 에서 입수) ; 메타스타틴(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 트로포닌 I(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수) ; SU 6668(미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; OXI 4503(미국에 소재하는 OXiGENE 에서 입수) ; o-구아니딘(미국에 소재하는 Dimensional Pharmaceuticals 에서 입수) ; 모투포라민 C(motuporamine C)(캐나다에 소재하는 British Columbia University 에서 입수) ; CDP 791(영국에 소재하는 Celltech Group 에서 입수) ; 아티프리모드(atiprimod)(plNN)(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; E 7820(일본에 소재하는 Eisai 에서 입수) ; CYC 381(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수) ; AE 941(캐나다에 소재하는 Aeterna 에서 입수) ; 백신, 맥관형성(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 유로키나제 플라스미노겐 활성화 저해제(미국에 소재하는 Dendreon 에서 입수) ; 오글루파니드(oglufanide)(plNN)(미국에 소재하는 Melmotte 에서 입수) ; HIF-1 알파(alfa) 저해제(영국에 소재하는 Xenova 에서 입수) ; CEP 5214(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수) ; BAY RES 2622(독일에 소재하는 Bayer 에서 입수) ; 안지오시딘(미국에 소재하는 InKine 에서 입수) ; A6(미국에 소재하는 Angstrom 에서 입수) ; KR 31372(한국에 소재하는 Korea Research Institute of Chemical Technology 에서 입수) ; GW 2286(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; EHT 0101(프랑스에 소재하는 ExonHit 에서 입수) ; CP 868596(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; CP 564959(미국에 OSI 에서 입수) ; CP 547632(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; 786034(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; KRN 633(일본에 소재하는 Kirin Brewery 에서 입수) ; 안내(intraocular)의 약물 전달 시스템, 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 안지네스(anginex)(네덜란드에 소재하는 Maastricht University 에서 입수 및 미국에 소재하는 Minnesota University 에서 입수) ; ABT 510(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; AAL 993(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수) ; VEGI(미국에 소재하는 ProteomTech 에서 입수) ; 종양 괴사 인자-알파 저해제(미국에 소재하는 National Institute on Aging 에서 입수) ; SU 11248(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수 및 미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; ABT 518(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; YH16(중국에 소재하는 Yantai Rongchang 에서 입수) ; S-3APG(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수 및 미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; MAb, KDR(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; MAb, 알파5베타1(미국에 소재하는 Protein Design 에서 입수) ; KDR 키나제 저해제(영국에 소재하는 Celltech Group 에서 입수 및 미국에 소재하는 Johnson & Johnson 에서 입수) ; GFB 116(미국에 소재하는 South Florida University 및 Yale University 에서 입수) ; CS 706(일본에 소재하는 Sankyo 에서 입수) ; 컴브레타스타틴 A4 약물전구체(미국에 소재하는 Arizona State University 에서 입수) ; 콘드로이티나제 AC(캐나다에 소재하는 IBEX 에서 입수) ; BAY RES 2690(독일에 소재하는 Bayer 에서 입수) ; AGM 1470(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수, 일본에 소재하는 Takeda 에서 입수 및 미국에 소재하는 TAP 에서 입수) ; AG 13925(미국에 소재하는 Agouron 에서 입수) ; 테트라티오몰리브데이트(미국에 소재하는 University of Michigan 에서 입수) ; GCS 100(미국에 소재하는 Wayne State University 에서 입수), CV 247(영국에 소재하는 Ivy Medical 에서 입수) ; CKD 732(한국에 소재하는 Chong Kun Dang 에서 입수) ; MAb, 혈관 내피 성장 인자(영국에 소재하는 Xenova 에서 입수) ; 이소글라딘(irsogladine)(INN)(일본에 소재하는 Nippon Shinyaku 에서 입수) ; RG 13577(프랑스에 소재하는 Aventis 에서 입수) ; WX 360(독일에 소재하는 Wilex 에서 입수) ; 스쿠알라민(plNN)(미국에 소재하는 Genaera 에서 입수) ; RPI 4610(미국에 소재하는 Sirna 에서 입수) ; 암 치료(오스트레일리아에 소재하는 Marinova 에서 입수) ; 헤파라나제 저해제(이스라엘에 소재하는 InSight 에서 입수) ; KL 3106(한국에 소재하는 Kolon 에서 입수) ; 호노키올(미국에 소재하는 Emory University 에서 입수) ; ZK CDK(독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; ZK 안지오(독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; ZK 229561(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수 및 독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; XMP 300(미국에 소재하는 XOMA 에서 입수) ; VGA 1102(일본에 소재하는 Taisho 에서 입수) ; VEGF 수용체 조절인자(미국에 소재하는 Pharmacopeia 에서 입수) ; VE-카드헤린-2 길항물질(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; 바소스타틴(Vasostatin)(미국에 소재하는 National Institutes of Health 에서 입수) ; 백신, Flk-1(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; TZ 93(일본에 소재하는 Tsumura 에서 입수) ; 툼스타틴(미국에 소재하는 Beth lsrael Hospital 에서 입수) ; 절두된 가용성 FLT 1(혈관 내피 성장 인자 수용체 1)(미국에 소재하는 Merck & Co 에서 입수) ; Tie-2 리간드(미국에 소재하는 Regeneron 에서 입수) ; 트롬보스폰딘 1 저해제(미국에 소재하는 Allegheny Health, Education and Research Foundation 에서 입수) ; 2-벤젠술폰아미드, 4-(5-(4-클로로페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일)-; 아라바 ; 및 C-Met. AVE 8062 ((2S)-2-아미노-3-히드록시-N-[2-메톡시-5-[(1Z)-2-(3,4,5,-트리메톡시페닐)에테닐]페닐]프로판아미드 모노히드로클로라이드) ; 메텔리무맵(metelimumab)(plNN)(면역글로불린 G4, 항-(인체 형질전환 성장 인체 베타-1(인체 모노클로날 CAT 192. 감마.4-쇄)), 인체모노클로날 CAT 192 카파.-쇄 이량체를 갖는 이황화물) ; Flt3 리간드 ; CD40 리간드 ; 인터루킨-2 ; 인터루킨-12 ; 4-1BB 리간드 ; 항-4-1BB 항체 ; TNF 길항물질 및 TNFR/FC 를 포함하는 TNF 수용체 길항물질, TWEAK 길항물질 및 TWEAK-R/Fc 를 포함하는 TWEAK-R 길항물질 ; TRAIL ; 항-VEGF 항체를 포함하는 VEGF 길항물질 ; VEGF 수용체(VEGF-R1 및 VEGF-R2, 또한 공지된 Flt1 및 Flk 1 또는 KDR 를 포함) 길항물질 ; CD148(DEP-1, ECRTP, 및 PTPRJ 로서 또한 언급됨, 본원의 참조문헌으로 인용된 Takahashi 등의, J. Am, Soc. Nephrol. 10:2135-45(1999)를 참조하라)작용물질 ; 트롬보스폰딘 1 저해제 및 하나 또는 둘다의 Tie-2 또는 Tie-2 리간드의 저해제(예를 들어, Ang-2). 본 분야에서 널리 공지된 항-Ang-2 항체를 포함하는 수많은 Ang-2 의 저해제는 전체가 본원의 참고문헌으로 인용된 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030124129 호(PCT 출원 번호 제 WO 03/030833 호에 해당함) 및 미국 특허 번호 제 6,166,185 호에 기재되어 있다. 게다가, Ang-2 펩티바디(peptibodies)는 본 분야에 또한 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 전체가 본원의 참고문헌으로 인용된 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030229023 호(PCT 출원 번호 제 WO03/057134 호에 해당함) 및 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030236193 호에서 찾을 수 있다.

특정 암 치료제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 탈리도미드 및 탈리도미드 유사체 (N-(2,6-디옥소-3-피페리딜)프탈이미드) ; 테코갈란 소듐(tecogalan sodium)(황산화한 다당류 펩티도글리칸) ; TAN 1120 (8-아세틸-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-10-[[옥타히드로-5-히드록시-2-(2-히드록시프로필)-4,10-디메틸피라노[3,4-d]-1,3,6-디옥사조신-8-일]옥시]-5,12-나프타세네디온) ; 수라디스타(suradista) (7,7'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3-나프탈렌디술폰산 테트라소듐 염) ; SU 302 ; SU 301 ; SU 1498((E)-2-시아노-3-[4-히드록시-3,5-비스(1-메틸에틸)페닐]-N-(3-페닐프로필)-2-프로펜아미드) ; SU 1433 (4-(6,7-디메틸-2-퀴녹살리닐)-1,2-벤젠디올) ; ST 1514 ; SR 25989 ; 가용성 Tie-2 ; SERM 유사체, 팜모스(Pharmos) ; 세마사니브(plNN)(3-[(3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌]-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온) ; S 836 ; RG 8803 ; RESTIN ; R 440 (3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-4-(1-메틸-6-니트로-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온) ; R 123942 (1-[6-(1,2,4-티아디아졸-5-일)-3-피리다진일]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-4-피페리딘아민) ; 프롤릴 히드록시화 효소 저해제 ; 진행 향상된 유전자(progression elevated gene) ; 프리노마스타트(prinomastat)(INN)((S)-2,2-디메틸-4-[[p-(4-피리딜옥시)페닐]술포닐]-3-티오모르폴린카르보히드록삼산 ; NV 1030 ; NM 3 (8-히드록시-6-메톡시-알파-메틸-1-옥소-1H-2-벤조피란-3-아세트산) ; NF 681 ; NF 050 ; MIG ; METH 2 ; METH 1 ; 마나스산틴(manassantin) B (알파-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-디메톡시페닐)-2-히드록시-1-메틸에톡시]-3-메톡시페닐]테트라히드로-3,4-디메틸-2-푸란일]-2-메톡시페녹시]에틸]-1,3-벤조디옥소레-5-메탄올) ; KDR 모노클로날 항체 ; 알파5베타3 인테그린 모노클로날 항체 ; LY 290293 (2-아미노-4-(3-피리딘일)-4H-나프토[1,2-b]피란-3-카르보니트릴) ; KP 0201448 ; KM 2550 ; 인테그린 특이적인 펩티드류 ; INGN 401 ; GYKI 66475 ; GYKI 66462 ; 그린스타틴(101-354-플라즈미노겐(인체)) ; 류마티스성 관절염, 전립선암, 난소암, 신경교종, 엔도스타틴, 결장직장암, ATF BTPI, 항맥관형성 유전자, 맥관형성 저해제 또는 맥관형성에 대한 유전자 치료 ; 겔라티나제 저해제, FR 111142 (4,5-디히드록시-2-헥사노익산-5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부텐일)옥시란일]-1-옥사스피로[2.5]옥트-6-일-에스테르) ; 포르페니멕스(forfenimex)(plNN) (S)-알파-아미노-3-히드록시-4-(히드록시메틸)벤젠아세트산) ; 섬유결합소 길항물질 (1-아세틸-L-프롤릴-L-히스티딜-L-세릴-L-시스텐인일-L-아스파르트아미드) ; 섬유아세포 성장 인자 수용체 저해제 ; 섬유아세포 성장 인자 길항물질 ; FCE 27164 (7,7'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3,5-나프탈렌트리술폰산 헥사소듐 염) ; FCE 26752 (8,8'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3,6-나프탈렌트리술폰산) ; 내피성 단핵백혈구 활성화 폴리펩티드 Ⅱ ; VEGFR 안티센스 올리고누클레오티드 ; 항-맥관형성 및 영양(trophic) 인자 ; ANCHOR 혈관생성억제제 ; 엔도스타틴 ; Del-1 맥관형성 단백질 ; CT 3577 ; 콘토르트로스타틴(contortrostatin) ; CM 101 ; 콘드로이티나아제 AC ; CDP 845 ; 칸스타틴 ; BST 2002 ; BST 2001 ; BLS 0597 ; BIBF 1000 ; ARRESTIN ; 아포미그렌(apomigren)(1304-1388-유형-XV 콜라겐 (인체 유전자 COL15A1 알파1-쇄 전구물질)) ; 안지오인히빈(angioinhibin) ; aaATlll ; A 36 ; 9 알파-플루오로메드록시프로게스테론 아세테이트 ((6-알파)-17-(아세틸옥시)-9-플루오로-6-메틸-프레근-4-엔-3,20-디온) ; 2-메틸-2-프탈리미디노-글루타르산 (2-(1,3-디히드로-1-옥소-2H-이소인돌-2-일)-2-메틸펜탄이산) ; 이트륨 90 표지된 모노클로날 항체 BC-1 ; 세막사니브(Semaxanib) (3-(4,5-디메틸피롤-2-일메틸렌)인돌린-2-온)(C15 H14 N2 O) ; PI 88 [포스포만노펜타오스(phosphomannopentaose)설페이트] ; 알보시디브(Alvocidib) (4H-1-벤조피란-4-온, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-(3-히드록시-1-메틸-4-피페리딘일)-시스-(-)-)(C21 H20 ClN 05) ; E 7820 ; SU 11248 (5-[3-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로인돌-(3Z)-일이덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시산(2-디에틸아미노에틸)아미드) (C22 H27 F N4 O2) ; 스쿠알라민 (콜레스테인-7,24-디올, 3-[[3-[(4-아미노부틸)아미노프로필]아미노]-, 24-(황산 수소염)(3.베타., 5.알파., 7.알파.)-) (C34 H65 N3 O5 S) ; 에리오크롬 블랙 T ; AGM 1470 (카르밤산, (클로로아세틸)-, 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부텐일)옥시란일]-1-옥사스피로[2,5]옥트-6-일 에스테르, [3R-[3알파, 4알파(2R, 3R), 5베타, 6베타]]) (C19 H28 Cl N O6) ; AZD 9935 ; BIBF 1000 ; AZD 2171 ; ABT 828 ; KS-인터루킨-2 ; 유테로글로빈 ; A 6 ; NSC 639366 (1-[3-(디에틸아미노)-2-히드록시프로필아미노]-4-(옥시란-2-일메틸아미노)안트라퀴논 퓨마레이트)(C24 H29 N3 O4. C4 H4 O4) ; ISV 616 ; 항-ED-B 융합 단백질 ; HUI 77 ; 트로포닌 I ; BC-1 모노클로날 항체 ; SPV 5.2 ; ER 68203 ; CKD 731 (3-(3,4,5-트리메톡시페닐)-2(E)-프로페녹산 (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-메틸-3(R)-3(R)-(3-메틸-2-부텐일)옥시란-2-일]-5-메톡시-1-옥사스피로[2.5]옥트-6-일-에스테르) (C28 H38 O8) ; IMC-1C11 ; aaATlll ; SC 7 ; CM 101 ; 안지오콜(Angiocol) ; 크링글 5 ; CKD 732 (3-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2(E)-프로페녹산)(C29 H41 N O6) ; U 995 ; 칸스타틴 ; SQ 885 ; CT 2584 (1-[11-(도데실아미노)-10-히드록시운데실]-3,7-디메틸크산틴)(C30 H55 N5 O3) ; 살모신 ; EMAP ll ; TX 1920 (1-(4-메틸피페라지노)-2-(2-니트로-1H-1-이미다조일)-1-에탄온) (C10 H15 N5 O3) ; 알파-v 베타-x 저해제 ; CHIR 11509 (N-(1-프로핀일)글리실-[N-(2-나프틸)]글리실-[N-(카르바모일메틸)]글리신 비스(4-메톡시페닐)메틸아미드)(C36 H37 N5 O6) ; BST 2002 ; BST 2001 ; B 0829 ; FR 111142 ; 4,5-디히드록시-2(E)-헥산산 (3R, 4S, 5S, 6R)-4-[1(R),2(R)-에폭시-1,5-디메틸-4-헥센일]-5-메톡시-1-옥사스피로[2.5]옥탄-6-일 에스테르 (C22 H34 O7) ; 및 키나제 저해제는 다음을 포함하나 이로 제한되지 않는다 : N-(4-클로로페닐)-4-(4-피리딘일메틸)-1-프탈라진아민 ; 4-[4-[[[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]아미노]카르보닐]아미노]페녹시]-N-메틸-2-피리딘카르복시아미드 ; N-[2-(디에틸아미노)에틸]-5-[(5-플루오로-1,2-디히드로-2-옥소-3H-인돌-3-일이덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시아미드 ; 3-[(4-브로모-2,6-디플루오로페닐)메톡시]-5-[[[[4-(1-피롤리딘일)부틸]아미노]카르보닐]아미노]-4-이소티아졸카르복시이미드 ; N-(4-브로모-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[(1-메틸-4-피페리딘일)메톡시]-4-퀴나졸린아민 ; 3-[5,6,7,13-테트라히드로-9-[(1-메틸메톡시)메틸]-5-옥소-12H-인데노[2,1-a]피롤[3,4-c]카르바졸-12-일]프로필 에스테르 N,N-디메틸-글리신 ; N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸일]메틸]티오]-2-티아졸일]-4-피페리딘카르복시아미드 ; N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6-[5-[[[2-(메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸란일]-4-퀴나졸린아민 ; 4-[(4-메틸-1-피페라진일)메틸]-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리딘일)-2-피리미딘일]아미노]-페닐]벤즈아미드 ; N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴린일)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 ; N-(3-에틴일페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 ; N-(3-((((2R)-1-메틸-2-피롤리딘일)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((3-(1,3-옥사졸-5-일)페닐)아미노)-3-피리딘카르복시이미드 ; 2-(((4-플루오로페닐)메틸)아미노)-N-(3-((((2R)-1-메틸-2-피롤리딘일)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복시이미드 ; N-[3-(아제티딘-3-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-2-(4-플루오로-벤질아미노)-니코틴아미드 ; 6-플루오로-N-(4-(1-메틸에틸)페닐)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; 2-((4-피리딘일메틸)아미노)-N-(3-(((2S)-2-피롤리딘일메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3-(1,1-디메틸에틸)-1H-피라졸-5-일)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3,3-디메틸-2,3-디히드로-1-벤조푸란-6-일)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3-((((2S)-1-메틸-2-피롤리딘일)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; 2-((4-피리딘일메틸)아미노)-N-(3-((2-(1-피롤리딘일)에틸)옥시)-4-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(4-(펜타플루오로에틸)-3-(((2S)-2-피롤리딘일메틸)옥시)페닐)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3-((3-아제티딘일메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((4-피리딘일메틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(3-(4-피페리딘일옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((2-(3-피리딘일)에틸)아미노)-3-피리딘카르복시아미드 ; N-(4,4-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-7-일)-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; 2-(1H-인다졸-6-일아미노)-N-[3-(1-메틸피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-니코틴아미드 ; N-[1-(2-디메틸아미노-아세틸)-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일]-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; 2-(1H-인다졸-6-일아미노)-N-[3-(피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-니코틴아미드 ; N-(1-아세틸-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일)-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; N-(4,4-디메틸-1-옥소-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-7-일)-2-(1H-인디졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; N-(4-(3차-부틸)-3-(3-피페리딜프로필)페닐][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복시아미드 ; N-[5-(3차-부틸)이소옥사졸-3-일][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복시아미드 ; 및 N-[4-(3차-부틸)페닐][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복시아미드 및 각각 본원에 참고문헌 인용된 미국 특허 번호 제 6,258,812 호 ; 제 6,235,764 호 ; 제 6,630,500 호 ; 제 6,515,004 호 ; 제 6,713,485 호 ; 제 5,521,184 호 ; 제 5,770,599 호 ; 제 5,747,498 호 ; 제 5,990,141 호 ; 미국 공개 번호 제 US20030105091 호; 및 특허 협력 조약 공개 번호 제 WO01/37820 호 ; 제 WO01/32651 호 ; 제 WO02/68406 호 ; 제 WO02/66470 호 ; 제 WO02/55501 호 ; 제 WO04/05279 호 ; 제 WO04/07481 호 ; 제 WO04/07458 호 ; 제 WO04/09784 호 ; 제 WO02/59110 호 ; 제 WO99/45009 호 ; 제 WO98/35958 호 ; 제 WO00/59509 호 ; 제 WO99/61422 호 ; 제 WO00/12089 호 ; 및 제 WO00/02871 호에 나타낸 키나제 저해제.

특정 실시형태에서, 암 치료제와 함께 치료를 동반하기 전에 및 치료한 다음에 HGF 에 대한 특이 결합제를 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 전이성 암에 의한 뼈 손실의 발현을 예방하거나 완화시키기 위해 예방적으로 HGF 에 대한 특이 결합제를 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 전이에 기인한 뼈 손실의 현존하는 조건을 치료하기 위해 HGF 에 대한 특이 결합제를 투여할 수 있다.

전형적인 암은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군, 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암.

특정 실시형태에서, 암 치료를 위해 HGF 에 대한 특이 결합제를 단독으로 사용하거나 또는 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 치료학적 유효량의 부가적인 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. HGF 에 대한 특이 결합제와 함께 투여할 수 있는 전형적인 치료학적 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 아니사마이신(anisamycin) 항생제의 겔다나마이신류(geldanamycin family)의 물질 ; Pro-HGF ; NK2 ; c-Met 펩티드 저해제 ; Grb2 Src 상동성 2 의 길항물질 ; Gab1 조절인자 ; 우성-음성 Src ; 위트만닌(wortmannin)을 포함하지만 이로 제한하지 않는 본-히펠-란다우(von-Hippel-Landau) 저해제 ; P13 키나제 저해제, 다른 항-수용체 치료, 항 EGFR, COX-2 저해제, Celebrex^™ ; Vioxx^™ ; 맥관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 조절인자, 섬유아세포 성장 인자(FGF), FGF 조절인자, 표피 성장 인자(EGF) ; EGF 조절인자 ; 케라틴세포 성장 인자(KGF), KGF-관련 분자, KGF 조절인자 ; 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP) 조절인자.

특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 다양한 암을 치료하기 위해 특정한 치료학적 제제와 함께 사용하였다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 말라리아를 치료하거나 예방하기 위해 특정한 치료학적 제제와 함께 사용하였다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 증식성 당뇨성 망막병증을 치료하거나 예방하기 위해 특정한 치료학적 제제와 함께 사용하였다. 특정 실시형태에서, 치료의 증상 및 요구되는 수준을 고려하여, 두 종류, 세 종류 또는 그 이상의 제제를 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제를 동일한 제형에 봉입하여 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 이러한 제제 및 특이 결합제를 동일한 제형에 봉입하여 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제를 분리하여 제형화시킬 수 있고 치료 키트에서 봉입하여 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 이러한 제제 및 특이 결합제를 분리하여 제형화시킬 수 있고 치료 키트에서 봉입하여 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제를 분리하여 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 유전자 치료에 의해 투여할 때, 유전자 코딩 단백질 제제 및/또는 HGF 에 대한 특이 결합제를 동일한 벡터에 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 유전자 코딩 단백질 제제 및/또는 HGF 에 대한 특이 결합제는 동일한 프로모터 영역의 조절 하에 있다. 특정 실시형태에서, 유전자 코딩 단백질 제제 및/또는 HGF 에 대한 특이 결합제는 분리된 벡터에 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 용해보조제, 에멀젼제, 보존제 및/또는 아쥬반트와 함께 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 용해보조제, 에멀젼제, 보존제 및/또는 아쥬반트와 함께 HGF 에 대한 특이 결합제 및 치료학적으로 유효량의 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 HGF 에 대한 특이 결합제 및 적어도 하나의 세린 프로테아제 저해제를 포함하는 직접적인 치료 및 이러한 치료를 사용한 치료 방법이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 치료는 HGF 에 대한 특이 결합제, 세린 프로테아제 저해제 및 본원에 기재된 적어도 하나의 부가적인 분자를 포함한다.

특정 예에서, 프로테아제/프로테아제 저해제 평형의 장애는 전이를 유도하는 정상 조직의 종양 침입를 포함하지만 이로 제한되지 않는 프로테아제-매개 조직 파괴를 유도할 수 있다.

특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 염증에 대한 적어도 하나의 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제를 면역 장애에 대한 적어도 하나의 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. 염증 및 면역 장애에 대한 전형적인 치료학적 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 38 kDa 미토겐-활성 단백질 키나제(p38-MAPK)의 사이클로옥시지네이스 유형 1(COX-1) 및 사이클로옥시지네이스 유형 2(COX-2) 저해제 소(small) 분자 조절인자 ; 염증 경로에서 포함되는 세포내 분자의 소 분자 조절인자, 여기에서 이러한 세포내 분자는 jnk, IKK, NF-kB, ZAP 70 및 lck 를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 염증에 대한 특정 전형적인 치료학적 제제는 예를 들어, 미국 캘리포니아 사우전드 오크스에 소재하는 Amgen Inc. 로부터 입수한 C.A. Dinarello 및 L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis : A Primer for Clinicians Third Edition(2001)에 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 HGF 에 대한 하나 이상의 상이한 특이 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 에피토프에 결합하는 HGF 에 대한 하나 이상의 특이 결합제를 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 용인가능한 제형화 물질은 바람직하게 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투몰농도, 점도, 정화도, 색, 등장, 향, 살균, 안정성, 용해나 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 적합한 제형화 물질로는 다음을 포함하나 이로 제한되지는 않는다 : 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신) ; 항미생물제 ; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 황화수소나트륨) ; 완충용액(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산) ; 부피 조절제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신) ; 킬레이트제[예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) ; 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스틴 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린) ; 충전제 ; 단당류 ; 이당류 ; 및 그외 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린) ; 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린) ; 색소, 항미제 및 희석제 ; 유화제 ; 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) ; 저 분자량 폴리펩티드 ; 염-형성 대이온(예를 들어, 나트륨) ; 방부제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 치메로살, 페네틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소) ; 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜) ; 당알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) ; 현탁화제 ; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들어, 플루로닉, PEG, 소르비탄에스텔류, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 과 같은 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤 및 틸옥사팔) ; 안정성 증강제(예를 들어, 수크로스 또는 소르비톨) ; 장도 증강제(예를 들어, 알칼리 금속 할로겐 화합물, 바람직하게, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 소르비톨) ; 수송 부형제 ; 희석제 ; 보형약 및/또는 약학적 아쥬반트. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company(1990)을 참조하라.

특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제 및/또는 치료학적 분자는 본 분야에 알려진 반감기 연장 부형제와 관련되어 있다. 이러한 부형제는 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트린을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 이러한 부형제는 예를 들어, 본원의 참조문헌으로 인용된 미국 출원 연속 번호 제 09/428,082 호 및 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 99/25044 호에 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 최적의 약학적 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 수송 형식 및 요구되는 투여량에 따라 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기의 Remington's Pharmaceutical Sciences 을 참조하라. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 본 발명의 항체의 생체내 제거 속도, 생체내 방출 속도, 안정성 및 물리적 상태에 영향을 미칠 수 있다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물 내의 원발성 부형제 또는 담체는 자연 상태에서 수성이거나 비-수성이다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 적합한 부형제 또는 담체는 비경구적으로 투여하기 위한 조성물에 일반적으로 다른 물질을 보충하는 것이 가능한 주사용 물, 생리식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 특정 실시형태에서, 중성인 완충생리식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수는 부형제의 부가적인 예이다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5 의 트리스 완충용액 또는 약 pH 4.0-5.5 의 아세트산염 완충용액을 포함하며, 이는 추가로 소르비톨 또는 적합한 이의 치환체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 조성물을 바람직한 순도를 갖는 선택 조성물과 최적의 제형화 제제를 혼합하여(상기 참조문헌으로 인용한 Remington's Pharmaceutical Sciences 을 참조) 동결건조시킨 케이크 또는 수용액 형태로 저장하기 위해 제조할 수 있다. 더욱이, 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 조성물을 수크로스와 같은 적합한 보형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적 투여를 위해 선택할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물을 경구와 같은 소화관을 통한 수송이나 또는 흡입을 위해 선택할 수 있다. 이러한 약학적으로 용인가능한 조성물의 제조는 본 분야의 기술에 속한다.

특정 실시형태에서, 제형화 성분은 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 생리학적 pH 또는 약간 낮은 pH, 일반적으로 약 pH 5 내지 약 pH 8 의 범위로 조성물을 유지하기 위해서 완충용액을 사용하였다.

특정 실시형태에서, 비경구적 투여를 의도할 경우, 치료학적 조성물은 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 요구되는 특이 결합제를 포함하는 피로겐이 없는 비경구적으로 용인가능한 수용액 형태를 제공한다. 특정 실시형태에서, 비경구적인 주사용 부형제는 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 멸균 등장액으로서 제형화하는 멸균증류수이며, 이는 적당하게 보존된다. 특정 실시형태에서, 제제는 데포제 주사를 통해 수송될 수 있는 조절방출 또는 서방성 산물을 제공하는 주사가능한 미소립자, 생-부식(erodible) 입자, 고분자 화합물(폴리락트산 및 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜과 같은 제제와 함께 요구되는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 히알루론산 또한 사용할 수 있으며, 이는 순환시 지속시간을 증가시키는 효과를 가진다. 특정 실시형태에서, 또한 요구되는 분자를 투입하기 위해 이식가능한 약물 수송장치를 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물을 흡입을 위해 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 흡입을 위한 건조 분말로 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 흡입 용액을 또한 에어로졸 수송을 위한 분사제로 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용액을 분무할 수 있다. 폐의 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐수송에 대해 기재한 PCT 출원 번호 제 PCT/US94/001875 호에 추가로 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 제형을 경구적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 방식으로 투여되는 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 정제 및 캡술과 같은 고체 약제학적 제형의 조제시에 일반적으로 사용되는 이러한 담체와 함께 또는 담체없이 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡슐은 생체내이용효율이 최대화되고 예비-전신성의(pre-systemic) 분해가 최소화되는 위장관 위치에서 제형의 유효 부분이 방출되도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 제제를 HGF 에 대한 특이 결합제 및/또는 모든 부가적인 치료학적 제제의 흡수를 용이하게 하기 위해 적어도 하나의 부가적인 제제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 희석제, 향미료, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활유, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제 또한 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 정제의 제조에 적절한 비-독성 부형제와의 혼합물에서 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제의 유효량을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 부형제에 용해시킴으로써, 용액을 단위 약제학적 제형으로 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적절한 부형제는 다음을 포함하지만 이로 제한하지 않는다 : 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 비활성 희석제 ; 또는 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제.

서방성 수송 또는 조절 수송 제형에서의 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 제형을 포함하는 부가적인 약학적 조성물은 본 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 특정 실시형태에서, 리포솜 담체, 생-부식 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포제 주사와 같은 다른 다양한 서방성 수송 또는 조절 수송 수단의 제형화 기술은 또한 본 분야의 숙련자에 의해 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적 조성물의 수송을 위한 다공성 고분자 미세입자의 서방성 방출에 대해 기재되어 있는 PCT 출원 번호 제 PCT/US93/00829 호를 참조하라. 특정 실시형태에서, 서방성-방출 제제는 형태가 있는 약품(예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 형태에서 반투과성의 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 서방성 방출 매트릭스는 다음을 포함할 수 있다 : 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(미국 특허 번호 제 3,773,919 호 및 유럽 특허 출원 번호 제 EP 058,481 호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman 등의, Biopolymers 22:547-556(1983)], 폴리(2-히드록시에틸-메틸아크릴레이트)[Langer 등의, J. Biomed. Mater, Res. 15:167-277(1981) 및 Langer, chem, Tech., 12:98-105(1982)], 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer 등의 상기 문헌) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 번호 제 EP 133,988 호). 특정 실시형태에서, 서방성 방출 조성물은 또한 본 분야에서 알려진 여러 가지 방법에 의해 제조될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어 Eppstein 등의 Proc. Nat1. Acad. Sci, USA 82:3688-3692(1985) ; 유럽 특허 번호 제 EP 036,676 호 ; 제 EP 088,046 호 및 제 EP 143,949 호를 참조하라.

일반적으로 생체내로 투여하기 위해 사용되는 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 제제이다. 특정 실시형태에서, 이는 멸균 여과막을 통하여 여과시킴으로써 멸균할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물을 동결건조시킬 경우, 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 상기 방법을 이용하여 멸균처리하였다. 특정 실시형태에서, 비경구 투여용 조성물을 동결건조된 형태나 용제로 저장하였다. 특정 실시형태에서, 일반적으로 비경구용 조성물을 멸균 접근 구명(sterile access port)을 구비한 용기, 예를 들어 피하 주사바늘로 찔러 넣을 수 있는 스토퍼(stopper)를 구비한 바이알 또는 정맥내 용액백 내에 보관하였다.

특정 실시형태에서, 일단 약학적 조성물이 제형화되면, 용제, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고형제 또는 탈수소화되었거나 동결건조된 분말의 형태로 멸균 바이알에 저장하였다. 특정 실시형태에서, 이러한 제형을 사용하기 쉬운 형태로 저장하거나 또는 투여하기에 전에 재구성이 요구되는 형태(예를 들어, 동결건조됨)로 저장하였다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 또한 단일-투여량 투여 단위를 제공하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시형태에서, 키트는 각각 건조된 단백질을 함유하는 1 차 용기 및 수성의 제형을 함유하는 2 차 용기 둘 다를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 단실 및 다실 프리필드 주사기[예를 들어, 액체 주사기 및 라이오주사기(lyosyringes)]를 함유하는 키트를 포함한다.

특정 실시형태에서, 치료학적으로 이용되는 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 약학적 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료 상황 및 대상에 좌우된다. 그러므로, 특정 실시형태에 따라, 본 분야에 숙련자들은 치료에 적합한 투여량 수준이 부분적으로 수송 분자, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제 없이 HGF 에 대한 특이 결합제가 사용되는 징후, 투여 경로와 크기(체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및/또는 환자의 증상(연령 및 총체적인 건강 상태)에 따라 다양하다는 것을 인지할 것이다. 특정 실시형태에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 특정 실시형태에서, 일반적인 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 0.1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg 또는 그 이상이다. 특정 실시형태에 있어서, 투여량 범위는 0.1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg ; 또는 1 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg ; 또는 5 ㎍/kg 내지 최대 약 100 mg/kg 이다.

특정 실시형태에서, 투여 횟수는 사용된 제형의 HGF 에 대한 특이 결합제 및/또는 모든 부가적인 치료제의 약물동력학 파라미터를 고려해야 할 것이다. 특정 실시형태에서, 임상의는 투여량이 바람직한 효과를 달성할 때까지 조성물을 투여할 것이다. 특정 실시형태에서, 조성물을 단일 투여 또는 시간에 따라 두 번 또는 그 이상의 투여(원하는 분자의 동일양을 포함하거나 포함하지 않는) 또는 삽입 장치 또는 카테터를 통해 지속적으로 주입함으로써 투여하였다. 더욱이, 적합한 투여량의 정련은 본 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 만들어지며 숙련자에 의해 행해지는 통상적인 일의 영역이다. 특정 실시형태에서, 적합한 투여량을 적절한 투여-반응 데이터를 이용하여 확인하였다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물의 투여 경로는 예를 들어 다음을 포함하는 공지된 방법에 따른 것이다 : 경구 ; 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 병변내 경로으로 주사 ; 서방성 시스템 ; 또는 삽입장치를 이용한 주사. 특정 실시형태에서, 조성물을 농축뇌 주사하거나 연속적으로 주입 또는 삽입 장치로 투여할 수 있다.

특정 실시형태에서, 요구되는 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화된 요구되는 분자에 멤브레인, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 삽입을 통하여 조성물을 국소적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 삽입 장치를 사용할 경우, 장치를 적절한 조직 또는 기관 내로 삽입하였으며, 요구되는 분자를 확산, 지효성 농축괴 또는 연속 투여함으로써 수송하였다.

특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 약학적 조성물을 탈체(ex vivo) 방법에서 사용하는 것 또한 바람직할 것이다. 이러한 예에서, 환자로부터 제거한 세포, 조직 및/또는 기관을 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 또는 이러한 제제없이 HGF 에 대한 특이 결합제를 포함하는 약학적 조성물에 노출시킨 후에 다시 환자에게 이식하였다.

특정 실시형태에서, HGF 에 대한 특이 결합제 및/또는 모든 부가적인 치료제를 본원에 기재되어 있는 방법을 사용하여 폴라펩티드 발현 및 분비를 위해 유전적으로 조작한 특정 세포를 이식하여 수송할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 세포는 동물 또는 인체 세포이며 자가 세포, 이종성 세포 또는 이종발생성 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 불사화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 반응의 기회를 줄이기 위해, 세포를 둘러싼 조직의 침윤을 피하기 위해 캡슐화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡슐화된 물질은 일반적으로 단백질 산물을 방출하기 위한 생체적합적인 반-투과성 중합체 엔클로저(enclosures) 또는 멤브레인이지만 이는 환자의 면역 시스템 또는 주위의 조직으로부터 다른 유해한 인자에 의한 세포의 파괴를 예방할 수 있다.

실험을 실행하고 결과를 얻어냄을 포함하는 하기 실시예는 단지 설명하려는 목적으로만 제공되며 본 발명을 한정하려는 것은 아니다.

실시예 1

항-HGF 하이브리도마의 생성

HGF 에 대한 항체를 인체 면역글로불린 유전자를 포함하는 마우스인 XenoMouse^? 마우스(캘리포니아 프레몬트에 소재하는 Abgenix 에서 입수)에서 생성하였다. 1a, 1b 및 2 의 세 그룹의 XenoMouse^? 마우스를 HGF 에 대한 항체를 제조하기 위해 사용하였으며 이를 표 1 에 나타내었다. 1a 그룹은 완전 인간 IgG2_κ 항체를 생산하는 XenoMouse^? 스트레인 XMG2 의 마우스로 구성되었다. 1a 그룹의 마우스를 HGF 로 면역화시켰다. HGF 를 Nakamura 등의 Nature 342:440-443(1989)의 서열을 사용하여 표준 재조합 기술을 사용하여 제조하였다.

1b 그룹 또한 XenoMouse^? 스트레인 XMG2 의 마우스로 구성되었으나 1b 그룹의 마우스를 서열 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Cys(SEQ ID NO. 47)을 갖는 T-세포 에피토프(TCE)에 화학적으로 결합된 HGF 로 면역화시켰다. TCE 를 Sulpho-SMCC(Pierce 에서 입수, 카탈로그 번호 제 22322 호) 및 디티오트레이오톨(Fisher Scientific 에서 입수)을 사용하여 TCE 의 C-말단 시스테인을 통해 HGF 의 N-말단에 결합시켰다. 결과적으로 생성된 결합된 TCE-HGF 를 Centricon^? 컬럼(Amicon 에서 입수)을 사용하여 결합되지 않은 펩티드로부터 분리하였다.

2 그룹은 완전 인간 IgG1_κ 항체를 생산하는 XenoMouse^? 스트레인 XMG1 의 마우스로 구성되었다. 2 그룹의 마우스를 상기 기재한 결합된 TCE-HGF 로 면역화시켰다.

세 그룹의 모든 마우스에게 표 1 의 계획에 따라 항원(HGF 또는 TCE-HGF 중 하나)을 8 회 주사하였다. 첫 번째 면역화에서, 각각의 마우스의 뒷다리 발바닥에 총 10 ㎍ 의 항원(발바닥 당 5 ㎍)을 주사한다. 이러한 주사는 아쥬반트 TiterMax^? Gold(Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 T2684 호)를 함유한다. 2 내지 7 번째 주사에서, 각 마우스에게 아쥬반트 백반 겔(인산알루미늄 겔 아쥬반트 ; Superfos Biosector a/s, 뉴저지 클리프톤에 소재하는 E.M. Sargent Pulp and Chemical CO. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 1452-250 호) 내의 총 5 ㎍ 의 항원을 주사하였다. 최종 주사는 마우스 당 총 10 ㎍ 의 항원을 포함하지만 아쥬반트는 포함하지 않았다.

6 번째 주사 후 2 일째에 각 마우스로부터 채혈하였다. 채혈한 혈액 시료를 HGF 에 대한 항체의 역가를 측정하기 위해 ELISA 로 검정하였다. ELISA 검정에서, 96-웰 플레이트(Fisher Scientific 에서 입수, 카탈로그 번호 제 12-565-136 호)를 0.1 M 의 탄산염 완충용액(pH 9.6)에 용해시킨 HGF 로 코팅하였다. 혈액 시료를 첨가하고 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 항온시켰다. 항온한 후, 플레이트를 세척 용액(PBS 에 용해된 0.05 % Tween 20)으로 3 회 세척하고 100 ㎍/웰의 2 차 항체를 첨가하였다. 2 차 항체는 고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 염소 항-인체 IgGFc 항체(Southern Biotech 에서 입수, 카탈로그 번호 제 9060-05 호)이다. 실온에서 1 시간 동안 항온시킨 후, 플레이트를 세척하고 100 ㎍/웰의 TMB 현상액(BioFX Lab 에서 입수, 카탈로그 번호 제 TMSK-0100-01 호)를 첨가하였다. 10 분 후, TMB 정지액(BioFX Lab 에서 입수, 카탈로그 번호 제 STPR-0100-01 호)을 첨가하였다. 플레이트를 450 nm 의 파장에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하였다.

최종 주사 후 4 일째에, 마우스를 희생시켜 배액 림프절(draining lymph node)을 수득하고 림프구를 회수하였다. 세 그룹의 각 마우스로부터의 림프구를 각각 풀링(pooled)하였다. B-세포에 대한 림프구 시료를 풍부하게 하기 위해, 항-CD90 마그네틱 비드(Miltenyi Biotech 에서 입수, 카탈로그 번호 제 491-01 호)를 첨가한 후 림프구를 LS⁺ 컬럼(Miltenyi Biotech 에서 입수, 카탈로그 번호 제 424-01 호)에 통과시켜 T-세포를 고갈시켰다.

그런 다음 B-세포가 풍부한 림프구의 3 가지 시료 각각을 하이브리도마를 생성하기 위해 전기세포(electrocell) 융합 장치(Genetronic, Inc. 에서 입수, Model ECM 2001)를 사용하여 P3 골수종 세포(ATCC 기탁 번호 제 TIB-18 호)와 융합시켰다. 그런 다음 세 그룹의 융합된 하이브리도마 세포주를 히포잔티닌-아자세린(Sigma 에서 입수)을 함유하는 하이브리도마 배지(성분은 표 2 를 참고하라) 내의 웰 당 1×10⁶ 유입 B-세포가 풍부한 림프구의 밀도로 96-웰 플레이트에 평판하였다. 하이브리도마 세포주를 15 % CO₂, 37 ℃ 에서 14 일간 배양하였다.

14 일 후, HGF 에 대한 인간 IgG 항체의 존재를 검출하기 위해 배양 상청액을 상기 기재된 혈액 시료 검정에 사용된 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 ELISA 로 검정하였다. ELISA 에서 양성으로 나온 배양 상청액을 2 차 ELISA 로 인체 카파쇄의 존재 여부를 시험하였다. 2 차 ELISA 에서, 조건은 2 차 항체가 고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 염소 항-인체 카파쇄 항체인 것을 제외하고는 1 차 ELISA 와 동일하다. 두 ELISA 검정 둘 다에서 양성으로 나온 하이브리도마를 실시예 8 및 9 에 기술된 생체외 기능성 시험을 위한 5 ㎖ 상청액을 생산하기 위해 더 증가시켰다. 1a 그룹의 마우스에 해당하는 82 개의 클론, 1b 그룹의 마우스에 해당하는 42 개의 클론 및 2 그룹의 마우스에 해당하는 176 개의 클론으로부터의 상청액을 시험하였다.

기능성 검정의 결과에 기초하여, 여러 하이브리도마 세포주가 HGF 에 대한 항체를 생산함을 확인하였다. 각 세포주로부터 3 내지 6 개의 클론을 분리하기 위해 한계 희석을 사용하였다. 클론을 하이브리도마 세포주 번호(예를 들어 1.24) 및 클론 번호(예를 들어 1.24.1)로 명명하였다. 실시예 8 및 9 에 기술된 기능성 시험에 의해 특정 세포주의 상이한 클론 사이의 차이점은 검출되지 않았다. 분리된 클론을 50-100 ㎖ 의 하이브리도마 배지에서 각각 증가시켰으며 점차 고갈(즉, 약 10 % 미만의 세포 생존율)되도록 하였다. 이러한 배지의 상청액 내의 HGF 에 대한 항체의 농도 및 효능을 ELISA 및 실시예 8 및 9 에 기술한 바와 같은 생체외 기능성 시험으로 측정하였다. HGF 에 대한 가장 높은 역가의 항체를 갖는 10 개의 하이브리도마를 확인하였다. 이 하이브리도마를 1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1 이라고 명명하였다.

실시예 2

하이브리도마로부터의 항체의 생산

항체를 상이한 두 시스템 중 하나를 사용하여 실시예 1 에 기재된 10 개의 하이브리도마로부터 제조하였다 : 인테그라 플라스크 및 살포 스피너(sparged spinner).

인테그라 플라스크

7 개의 하이브리도마 세포주 2.12.1, 1.24.2, 1.29.1, 1.74.1, 1.75.1, 1.60.2 및 2.40.1 을 각각 T75 플라스크에서 20 ㎖ 의 HSFM 배지(배지 성분은 표 2 를 참조하라) 내에 성장시켰다. 하이브리도마가 T75 플라스크에서 거의 포화될만큼 성장했을 때, 이를 인테그라 플라스크(Integra Biosciences 에서 입수, Integra CL1000, 카탈로그 번호 제 90 005 호)로 옮겼다.

인테그라 플라스크는 막에 의해 작은 챔버 및 큰 챔버의 2 개의 챔버로 나누어진 세포 배양 플라스크이다. 7 개의 각 하이브리도마 세포주로부터 ㎖ 당 1×10⁶ 의 최소 세포 밀도로 20-30 ㎖ 부피의 하이브리도마 세포를 7 개 인테그라 플라스크의 작은 챔버의 인테그라 배지(인테그라 배지 성분은 표 2 를 참조하라) 내에 넣었다. 인테그라 배지만(1L) 인테그라 플라스크의 큰 챔버에 넣었다. 두 챔버를 분리하고 있는 막은 저분자량의 영양분은 통과시키나 하이브리도마 세포 및 이 세포에 의해 생산되는 항체는 통과시키지 않는다. 게다가, 하이브리도마 세포 및 이 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항체는 작은 챔버 내에서 계속 유지된다.

일주일 후, 각각의 7 개 인테그라 플라스크의 두 챔버 모두에서 배지를 제거하고 새로운 인테그라 배지로 교체하였다. 7 개의 작은 챔버로부터 수득한 배지를 개별적으로 보존하였다. 성장의 두 번째 주 후에, 작은 챔버의 배지를 다시 수집하였다. 각 하이브리도마 세포주로부터 첫 번째 주에 수득한 배지를 동일 하이브리도마 세포주로부터 두 번째 주에 수득한 배지와 혼합하였다. 결과적으로 생성된 7 개의 하이브리도마 세포주로부터 수득한 7 개의 배지 시료를 세포 및 잔해를 제거하기 위해 회전시키고(3000 rpm 에서 15 분) 결과적으로 생성된 상청액을 여과시켰다(0.22 um).

살포 스피너 플라스크(3 L)

세 하이브리도마 세포주 3.10.1, 2.4.4 및 2.12.1 을 T75 플라스크에서 20 ㎖ 의 HSFM 배지 내에 각각 성장시켰다. 하이브리도마가 적절한 세포 밀도를 나타내면 이를 T175 플라스크로 옮겼다. 마찬가지로, T175 플라스크 내에서 하이브리도마가 적절한 세포 밀도를 나타내게 되면, 이를 100 ㎖ 스피너 플라스크로 옮긴 후 500 ㎖ 스피너 플라스크로 옮기고 이를 다시 1 L 스피너 플라스크로 옮겼다. 1 L 스피너 플라스크 내에서 세포가 적절한 세포 밀도를 나타내면 이를 3 L 살포 스피너 플라스크(Bellco Biotechnology 에서 입수, 카탈로그 번호 제 1965-300 호, 옆가지 장치를 수반함, 카탈로그 번호 제 1965-30003)로 옮겼다.

3 L 살포 스피너 플라스크는 배지가 마그네틱 플랫폼에 의해 조절되는 임펠러에 의해 혼합되는 유리 병이다. 스피너는 5 % CO₂ 및 공기를 제공하기 위해 가스선과 연결되어 있다.

하이브리도마 3.10.1

2 개의 3 L 살포 스피너 플라스크에 표 3(2 개의 살포 플라스크의 성장 조건을 나타냄)에 기재된 첨가물을 포함하는 HSFM 배지 내의 하이브리도마 세포주 3.10.1 로부터의 하이브리도마 세포를 접종하였다.

배지를 15 일간 배양하고 트리판 블루 배제(exclusion)에 의해 결정되는 바와 같이 생존율이 20 % 미만일 때 이를 수확하였다. 배지를 7000 rpm 에서 15 분간 원심분리한 후 결과적으로 생성된 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여 수확하였다. 단백질 A HPLC 로 최종 수확한 시료에 존재하는 단백질 양을 측정함으로써 생산성을 결정하였으며 이를 표 3 에 나타내었다.

하이브리도마 2.4.4

표 4(5 개의 살포 스피너 플라스크의 성장 조건을 나타냄)에 기재된 첨가물을 포함하는 HSFM 배지 내의 하이브리도마 세포주 2.4.4 로부터의 하이브리도마 세포를 5 개의 3 L 살포 스피너 플라스크에 접종하였다.

표 4 에 기재된 바와 같이 7, 8 또는 10 일 동안 배지를 배양한 후 상기 기재한 바와 같이 세포 생존율이 20 % 미만일 때 이를 수확하였다.

하이브리도마 2.12.1

표 5(6 개의 살포 스피너 플라스크의 성장 조건을 나타냄)에 기재된 첨가물을 포함하는 HSFM 배지 내의 하이브리도마 세포주 2.12.1 로부터의 하이브리도마 세포를 6 개의 3 L 살포 스피너 플라스크에 접종하였다.

표 5 에 기재한 바와 같이 7 또는 11 일 동안 배지를 배양한 후 상기 기재한 바와 같이 생존율이 20 % 미만일 때 수확하였다.

실시예 3

항체 중쇄 및 경쇄의 클로닝 및 서열 분석

A. 경쇄의 클로닝

10 개의 하이브리도마(1.24.1, 1.29.1, 1.60.1, 1.61.3, 1.74.3, 1.75.1, 2.4.4, 2.12.1, 2.40.1 및 3.10.1)가 실시예 1 에 기재된 바와 같이 HGF 에 대한 모노클로날 항체를 발현하는지를 확인하였다. TRIzol^? 시약(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수)을 사용하여 10 개의 하이브리도마 각각으로부터 총 RNA 를 분리하였다. 10 개의 총 RNA 제제의 5'-말단을 GeneRacer^? 키트(Invitrogen 에서 입수)를 사용하여 cDNA 말단의 5' 급성 증폭(5' Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)을 위해 변형시켰다. 그런 다음 10 개의 5'-변형 RNA 제제를 10 개의 cNDA 분자를 생성하기 위해 각각 연장 연결자(5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3')(SEQ ID NO:48)를 갖는 무작위 프라이머를 사용하여 10 번의 개별적인 RACE 반응에 사용하였다.

그런 다음 10 개의 증폭된 카파쇄 서열을 생성하기 위해 개별적인 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 10 개의 cDNA 분자를 증폭시켰다. 이러한 각 반응에서, 전진(forward) 프라이머는 전진 GeneRace™ 내포(nested) 프라이머(5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3')(SEQ ID NO:49)이다. 역 프라이머(5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3')(SEQ ID NO:50)는 카파 경쇄에 상보적인 서열에 결합하도록 설계되었다.

그런 다음 각각의 10 개의 증폭된 카파 경쇄 서열을 개별적인 pCR4-TOPO 플라스미드(Invitrogen 에서 입수)에 각각 결합시켰다. 그런 다음 10 개의 카파 경쇄 서열 중 각각 하나씩을 포함하고 있는, 결과적으로 생성된 10 개의 플라스미드를 박테리아에서 각각 증폭시키고 여러 클론을 서열결정하였다. 하기와 같은 클로닝된 플라스미드로부터 10 개의 카파 경쇄 전사 해독 프레임(open reading frame) 서열을 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 설계하는데 이 서열을 사용하였다.

10 회의 PCR 각각에서 사용된 프라이머 세트는 5'-프라이머 및 3'-프라이머를 포함한다. 각 5'-프라이머는 특정 카파 경쇄 서열의 아미노산 말단의 서열에 상보적인 부분, 최적화된 코작(Kozak) 서열 및 하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 플라스미드와의 반응에서 사용되는 5'-프라이머의 서열은 다음과 같다 :

각 PCR 에서 사용된 3'-프라이머는 종결 코돈 및 제한 부위를 포함하는, 특정 카파 경쇄 서열의 카르복시 말단 서열에 상보적인 부분을 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 플라스미드와의 반응에서 사용되는 3'-프라이머의 서열은 다음과 같다 :

각각의 프라이머 세트를 10 개의 카파 경쇄 코딩 영역 서열을 증폭시키기 위해 상응하는 클로닝된 플라스미드와의 PCR 반응에 사용하였다. 이러한 반응으로부터의 10 개의 증폭 산물을 각각 겔 분리시키고 QIAquick^?Gel Extraction 키트(카탈로그 번호 제 28704 호, 캘리포니아 발렌시아에 소재하는 Qiagen 에서 입수)를 사용하여 정제하였다. 그런 다음 정제된 산물을 플라스미드로부터 떨어져 나온 카파 경쇄 코딩 영역 서열을 수득하기 위해 적절한 제한 효소로 각각 절단하였다. 예를 들어, 하이브리도마 3.10.1 에 상응하는 정제 산물에서 상기 기술한 바와 같이 클로닝된 플라스미드의 PCR 증폭 동안 프라이머에 의해 도입된 부위인 xbaI 및 SalI 를 절단하였다. 결과적으로 생성된 제한 절단된 카파 경쇄 코딩 영역 서열을 다시 개별적으로 겔 분리하고 QIAquick^? Gel Extraction 키트(카탈로그 번호 제 28704 호, 캘리포니아 발렌시아에 소재하는 Qiagen 에서 입수)를 사용하여 정제하였다.

그런 다음 10 개의 정제된 제한 절단된 카파 경쇄 코딩 영역 서열을 각각 개별적으로 포유동물 발현 벡터인 pDSRα20(제 WO 90/14363 호를 참조하라)에 결합시켜 10 개의 원 하이브리도마에 상응하는 10 개의 개별적인 카파 경쇄 발현 벡터를 생성하였다. 그런 다음 10 개의 카파 경쇄 발현 벡터를 서열결정하였다. 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 카파 경쇄 코딩 영역을 포함하는 pDSRα20 발현 벡터(pDSRα20:3.10.1)가 3.10.1 카파 경쇄의 235 개 아미노산 잔기(20 개의 아미노산 카파쇄 신호 서열 포함)를 코드하는 719 bp 의 PCR 단편을 포함하는 5473 bp 를 포함함을 확인하였다. 발현 벡터는 표 6 에 기술한 바와 같은 7 개의 기능 영역을 포함한다.

B. 중쇄의 클로닝

10 개의 하이브리도마로부터의 HGF 에 대한 항체의 중쇄 가변 영역을 실시예 3A 에 기재된 경쇄에 사용한 것과 동일한 방법을 사용하여 클로닝하였다. 10 개의 하이브리도마 각각으로부터의 총 RNA 를 실시예 3A 에 기재된 바와 같이 분리하고 RACE 를 위해 5'-변형시키고 cDNA 분자를 생성하는데 사용하였다.

역 프라이머[5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3'(SEQ ID NO:53)]가 중쇄 가변 영역의 상보 서열에 결합되도록 설계된 것을 제외하고는 실시예 3A 의 경쇄에 대해 기재된 PCR 반응으로 10 개의 cDNA 분자를 각각 증폭시켰다. 전진 프라이머는 또한 전진 GeneRacer™ 내포 프라이머(5' GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3')(SEQ ID NO:49)이다.

10 개의 증폭된 중쇄 가변 영역 각각을 pCR4-TOPO 플라스미드에 결합시켰다. 10 개의 중쇄 가변 영역 서열 중 하나씩을 각각 포함하는, 결과적으로 생성된 10 개의 플라스미드를 각각 박테리아 내에서 증폭시키고 이들 각각의 여러 클론을 실시예 3A 의 경쇄에 대해 기재된 바와 같이 서열결정하였다. 이들 서열을 하기와 같이 클로닝된 플라스미드로부터 중쇄 가변 영역 각각을 증폭시키기 위한 PCR 프라이머를 설계하는데 사용하였다.

10 회의 PCR 각각을 위한 프라이머 세트는 상기 실시예 3A 에 기재된 경쇄에 대해 사용된 것과 동일한 전략을 사용하여 설계하였다. 각 5'-프라이머는 특정 중쇄 가변 영역 서열의 아미노 말단 서열에 상응하는 부분, 최적화된 코작 서열 및 하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해 사용되는 5'-프라이머의 서열은 다음과 같다 :

10 회의 PCR 각각에서 사용하는 3'-프라이머는 종결 코돈 및 제한 부위를 포함하는, 특정 중쇄 가변 영역 서열의 공통 서열의 카르복시 말단에 상보적인 부분을 포함한다. 예를 들어, 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 가변 영역을 증폭시키기 위해 사용하는 3'-프라이머의 서열은 다음과 같다 :

개별적인 프라이머 세트를 10 개의 중쇄 가변 영역 서열을 증폭시키기 위해 상응하는 클로닝된 플라스미드와의 개별적인 PCR 반응에 사용하였다. 이러한 반응으로부터의 10 개의 증폭 산물을 실시예 3A 의 경쇄에 대해 기재된 바와 같이 각각 겔 분리하고 QIAquick Gel Extraction 키트를 사용하여 정제한 후 적절한 제한 효소로 절단하였다. 결과적으로 생성된 제한 절단 중쇄 가변 영역 서열을 실시예 3A 에 기술된 바와 같이 다시 겔 분리하고 QIAquick Gel Extraction 키트를 사용하여 정제하였다.

그런 다음 10 개의 정제된 제한 절단된 중쇄 가변 영역 서열 중 3 개(하이브리도마 3.10.1, 1.24.1 및 2.4.4 로부터 궁극적으로 유래된 것임)를 포유동물 발현 벡터 pDSRα20:hIgGC_H 에 각각 결합시켜 3 개의 중쇄 IgG1 발현 벡터를 생성하였다. pDSRα20:hIgGC_H 발현 벡터는 IgG1 불변 영역 서열도 포함하는 것을 제외하고는 pDSRα20 과 동일하다. pDSRα20:hIgGC_H 발현 벡터를 표 7A 및 7B 에 나타내었다.

3 개의 IgG1 발현 벡터 삽입물의 중쇄 가변 영역을 서열결정하였다. 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 가변 영역을 포함한 pDSRα20:hIgGC_H 발현 벡터(pDSRα20:hIgGC_H:3.10.1)을 표 8 에 나타내었다.

10 개의 정제된 중쇄 가변 영역 서열 각각을 IgG2 불변 영역을 코드하는 서열과 함께 pDSRα20 포유동물 발현 벡터에 결합시켜 10 개의 IgG2 발현 벡터를 생성하였다. 결과적으로 생성된 10 개의 IgG2 발현 벡터(pDSRα20:hIgG2:하이브리도마 번호로 명명함) 각각은 IgG2 의 불변 영역 및 10 개의 중쇄 가변 영역 서열 중 하나를 코드하는 서열을 포함한다. 10 개의 중쇄 가변 영역 서열 삽입물을 서열결정하여 이들이 pCR4-TOPO 클론으로부터의 클로닝된 플라스미드에서 확인된 동일한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는지를 확인하였다. 하이브리도마 2.12.1 로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는 pDSRα20:hIgG2 발현 벡터(pDSRα20:hIgG2:2.12.1)을 표 9 에 나타내었다.

카파 경쇄 가변 영역의 cDNA 서열(SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19), 카파 경쇄 불변 영역의 cDNA 서열(SEQ ID NO:21), 중쇄 가변 영역의 cDNA 서열(SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20) 및 IgG1 및 IgG2 중쇄 불변 영역의 cDNA 서열(SEQ ID NO:22 및 23)을 도 3 에 나타내었다.

이러한 각각의 cDNA 서열로부터 예상되는 폴리펩티드 서열을 결정하였다. 카파 경쇄 가변 영역에 대한 예상된 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 및 42), 카파 경쇄 불변 영역에 대한 예상된 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:44), 중쇄 가변 영역에 대한 예상된 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 및 43) 및 IgG1 및 IgG2 중쇄 불변 영역에 대한 예상된 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:45 및 46)을 도 4 에 나타내었다.

서열 데이터에 기초하여, 각각의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 유래된 생식 계열 유전자를 결정하였다. 생식 계열 유전자의 확인은 도 1, 2, 3 및 4 의 상응하는 하이브리도마 세포주 다음에 나타내었다. 서열에 관련된 추가적인 분석(도 1B 및 2B)으로 도 1A(카파 경쇄 가변 영역) 및 도 2A(중쇄 가변 영역)에 나타낸 계통수를 나타내었다.

실시예 4

293T 세포에서의 일시적 발현

10 개의 각각의 공동-트랜스펙션에서, 293T 세포에 실시예 3A 에 기재된 카파 경쇄 서열을 포함하는 pDSRα20 발현 벡터(경쇄 벡터) 및 실시예 3B 에 기재된 중쇄 서열을 포함하는 pDSRα20 발현 벡터(중쇄 벡터)를 공동-트랜스펙션시켰다. 이러한 10 개의 각각의 공동-트랜스펙션에서, 293T 세포에 실시예 1 에 기재된 하이브리도마 중 하나로부터 궁극적으로 유래된 경쇄 벡터 및 중쇄 벡터 둘 다를 공동-트랜스펙션시켰다. 특히, 하이브리도마 3.10.1 로부터 궁극적으로 유래된 벡터의 공동-트랜스펙션에서, IgG1 을 포함하는 중쇄 벡터(pDSRα20:hIgG1C_H:3.10.1)를 사용하였다. 나머지 9 개의 하이브리도마로부터 궁극적으로 유래된 벡터의 공동-트랜스펙션에서, IgG2 를 포함하는 중쇄(pDSRα20:hIgG2:하이브리도마 번호)를 사용하였다. 동동-트랜스펙션은 제조업자에 의해 제공되는 지침에 따라 Fugene 6 또는 X-TremeGene RO-1539(둘 다 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 Roche Molecular Biochemicals 에서 입수) 중 하나를 사용하여 수행하였다.

표준 회전병(roller bottles) 내에 점착성 293T 세포를 사용하여 첫 번째로 공동-트랜스펙션을 수행하였다. 5 % 우태아혈청(FBS)(Hyclone 에서 입수, 카탈로그 번호 제 SH 30070.03 호), 1X 비-필수 아미노산(Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 M 7145 호) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신(Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 P7539 호)(10,000 U/ml 페니실린/스트렙토마이신) 및 1X 피루브산나트륨(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수)을 함유하는 DMEM 내에서 회전병 당 4 x 10⁷ 내지 5 x 10⁷ 개의 세포로 회전병에 접종하였다. 세포가 60-70 % 세포포화도(confluency)를 나타낼 때, 배지를 혈청이 결핍된 배지로 바꾼 후에 특정 하이브리도마로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 24 시간 동안 세포 내로 공동-트랜스펙션시켰다. 무혈청 배지를 수집하고 트랜스펙션 후 48 및 96 시에 새로운 무혈청 배지로 두 번 교체하여 총 1.25 L 의 무혈청 배지를 수득하였다.

10 번의 공동-트랜스펙션을 각각 상기 기술한 것과 동일한 혈청이 결핍된 배지 내에서 현탁액 상태의 무혈청에 적합한 293T 세포를 사용하여 반복하였다. 특정 하이브리도마에 상응하는 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 500 mL 부피의 배지 내의 세포로 공동-트랜스펙션시켰다. 무혈청 조정 배지를 수집한 후 트랜스펙션된 세포를 7 일간 배양하였다.

실시예 5

CHO 세포의 항체 발현 및 클로닝

DHFR 결핍 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHOd^-)를 HGF 에 대한 재조합 항체를 안정적으로 발현시키기 위해 사용하였다. 10 번의 각 공동-트랜스펙션에서, CHOd^- 세포에 실시예 1 에 기재된 하이브리도마 중 하나로부터 궁극적으로 유래된 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터 둘 다를 실시예 4 에서 기술한 바와 같이 공동-트랜스펙션시켰다. 표준 인산칼슘 방법을 사용하여 공동-트랜스펙션을 수행하였다.

10 번의 공동-트랜스펙션 각각으로부터의 트랜스펙션된 세포를 5 % 희석된 우태아혈청을 포함하는 히폭산틴-티미딘 결핍 고 글루코스 DMEM(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Gibco/BRL에서 입수, 카탈로그 번호 제 11965 호)을 함유하는 선택 배지에서 각각 배양하였다. 이러한 히폭산틴-티미딘 결핍 배지는 재조합 DHFR 효소를 발현하는 세포의 성장을 위해 선택한 것이다. 배양한 트랜스펙션체 각각으로부터의 배지를 표준 ELISA 검정을 사용하여 스크리닝하여 인체 항체의 존재를 측정하였다.

실시예 6

CHOd ^- 클론에서의 HGF 에 대한 항체의 발현

실시예 5 에 기재된 10 개의 상이한 CHOd^- 클론 각각의 6 개 시료(HGF 에 대한 10 개의 상이한 항체 중 하나를 발현하는 각각 상이한 클론)를 성장 배지에 개별적으로 배양하였다. 성장 배지는 5 % 희석된 FBS, 비필수 아미노산 및 L-글루코스(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Life Technologies 에서 입수)를 보충한 고 글루코스를 함유하는 DMEM(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Gibco/BRL에서 입수, 카탈로그 번호 제 11965 호)이다. 세포를 5 % CO₂, 37 ℃ 에서 성장시켰다.

CHOd^- 클론이 성장의 6-웰 단계(6-well stage)에 이르면, 항체 발현을 증폭시키기 위해 성장 배지에 10 nM 의 메토트렉세이트를 첨가하였다. 세포가 포화될만큼 성장한 후, 이를 100 mm 접시로 옮겼다. 메토트렉세이트 농도를 10 nM 에서 20 nM 으로, 50 nM 으로, 100 nM 으로, 250 nM 으로, 500 nM 으로, 1 μM 으로, 2 μM 으로, 4 μM 으로 및 최종적으로 10 μM 으로 상향 조절하였다. 세포를 각 농도에서 최소한 일주일 동안 유지시켰으며 세포가 주어진 메토트렉세이트의 농도에 대해 충분히 적응되어 시각적으로 측정가능하게 될 때까지 유지하였다.

각 클론으로부터의 조정 배지를 HGF 에 대한 각 항체의 발현 수준을 측정하기 위해 각 메토트렉세이트 농도에서 검정하였다. 인체 HGF-코팅 플레이트에서 HGF 에 대한 항체의 결합을 반(semi)-정량적으로 분석하기 위해 배지를 표준 ELISA 및 시간-분해 형광(time-resolved fluorescence, TRF) 샌드위치 검정으로 검정하였다.

가장 높은 항체 발현 수준을 나타내는 메토트렉세이트 증폭 클론이 하기와 같은 무혈청 생산 배지에서 성장시키는데 적합하다. 클론을 배지 용기로부터 트립신화시키고 원심분리한 후 250 ml 고형 캡(solid cap) 진탕 플라스크에서 4 x 10⁵ 세포/ml 로 50 ml 의 무혈청 생산 배지 내로 재현탁시켰다. 배지를 37 ℃ 의 따뜻한 방에서 항온하고 대략 125 RPM 에서 교반시켰다. 3-4 일마다, 세포를 탈수시키고 새로운 무혈청 생산 배지로 4 x 10⁵ 세포/ml 로 희석시켰다. 새로운 무혈청 생산 배지를 각 배지마다 대략 10 회 첨가하여 적합한 상을 완성하였다.

실시예 7

재조합 세포 조정 배지로부터의 항체 정제

실시예 1 에 기재된 하이브리도마, 실시예 4 에 기재된 일시적 발현 293T 세포, 실시예 5 에 기재된 안정한 트랜스펙션체 및 실시예 6 에 기재된 메토트렉세이트 증폭 클론으로부터 배지를 수집하였다. 각 원으로부터의 배지를 각각 YM30 나선형(spiral wound) 카트리지(메사츄세츠 베드퍼드에 소재하는 Milipore 에서 입수, 카탈로그 번호 제 S10Y30 호)를 제조업자에 의해 제공되는 지시에 따라 사용하여 약 10 배 농축시켰다. 각 농축된 배지 시료에 존재하는 항체의 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정하였다.

항체를 재조합 단백질 A 세파로스(rProA)(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Amersham 에서 입수, 카탈로그 번호 제 17-1279-03 호)를 사용하는 친화성 수지 정제로 농축된 배지 시료로부터 정제하였다. rProA 를 우선 인산염 완충 식염수(PBS)로 4 번 세척하였다. 마지막 세척 후, 세척된 PBS 내의 rProA 의 슬러리를 동일 부피의 rProA 및 PBS 를 혼합하여 제조하였다. 이 rProA 슬러리를 배지 시료의 5 ㎕ 항체에 대해 대략 1 ㎕ 의 rProA 슬러리의 양으로 각 농축된 배지 시료에 첨가하지만 어떤 배지 시료에 대해서도 50 ㎕ 미만의 rProA 슬러리를 첨가하지는 않았다. 결과적으로 생성된 배지/슬러리 시료를 진탕하면서 4 ℃ 에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 배지/슬러리 시료를 원심분리하여 rProA 를 펠릿화시켰다. 결합되지 않은 단백질을 함유하는 상청액을 버렸다. rProA 펠릿을 각각 0.5 ㎖ PBS 에 재현탁시켰다. 그런 다음 재현탁시킨 rProA 시료를 0.45 ㎛ Spin-X 튜브(뉴욕 코닝에 소재하는 CoStar 에서 입수, 카탈로그 번호 제 8162 호)로 옮기고 PBS 를 제거하기 위해 탈수시켰다. 그런 다음 Spin-X 튜브 내의 rProA 를 세척시마다 0.5 ㎖ 의 PBS 로 3 회 세척하였다.

항체 분획을 1.5 부피의 0.1 M 글리신, pH 2.7 을 첨가하고 실온에서 10 분간 항온하여 Spin-X 튜브 내의 rProA 로부터 용리시켰다. 그런 다음 Spin-X 튜브를 원심분리하고 각 Spin-X 튜브로부터의 용리액을 각각 수집하였다. 용리를 반복하고 각 Spin-X 튜브로부터의 두 용리액을 풀링하였다. 풀링된 용리액의 pH 를 1/25 부피의 1.0 M 트리스, pH 9.2 로 중화시켰다. 그런 다음 각 시료를 새로운 Spin-X 튜브를 통해 여과시켜 입자를 제거하였다.

최종 제제의 단백질 농도를 표준으로서 인체 IgG 를 사용하는 브래드퍼드 검정으로 측정하였다. 순도를 측정하기 위해, 각각의 최종 제제 시료를 쿠마시로 염색된 SDS-PAGE 겔의 개별적인 레인(lane)으로 전기영동시켰으며 시각적으로 검사하였다.

실시예 8

HGF 에 대한 항체의 결합 특성화

A. 친화도 측정

BIAcore^? 3000(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)을 사용하여 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 항체 중 6 개(하이브리도마 3.10.1, 2.4.4, 2.12.1, 1.29.1, 1.75.1 및 1.74.3 으로부터 궁극적으로 유래한 것임)의 친화도 분석을 제조업자의 지시에 따라 실행하였다. 분석에 사용하는 러닝 완충용액(running buffer)은 0.005 % P20 계면활성제를 갖는 PBS(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)이다. Amine Coupling Kit(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 일차 아민기를 통해 재조합 단백질 G(일리노이 록포드에 소재하는 Pierce 에서 입수)를 조사 등급(research grade) CM5 센서 칩(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)에 고정시켰다.

6 개의 개별 시료에서, 약 200 공명 유닛(resonance units, RU)의 6 개의 HGF 에 대한 항체 각각을 제조업자의 지시에 따라 고정화된 단백질 G 에 각각 부착시켰다. 다양한 농도(0-100 nM)의 인체 HGF 를 포함하는 시료를 3 분간 50 ㎕/분의 유속으로 결합된 항체 표면에 주사하였다. k_a(결합 속도 상수), k_d(해리 속도 상수) 및 K_D(해리 평형 상수)를 포함하는 항체 결합 운동성 파라미터를 BIA evaluation 3.1 컴퓨터 프로그램(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)을 사용하여 결정하였다. 낮은 해리 평형 상수는 HGF 에 대해 항체가 높은 친화도를 가짐을 나타낸다. 데이타는 도 6A 에 나타내었다.

4 개의 HGF 에 대한 항체(하이브리도마 2.4.4, 1.29.1, 1.74.2 및 2.12.1 로부터 궁극적으로 유래된 것임) 각각의 K_D 값 또한 평형 결합 방법을 사용하여 측정하였다. 러닝 완충용액으로 0.005 % P20 계면활성제를 갖는 PBS(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)를 사용하여 BIAcore^? 3000(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)으로 상기 방법을 실행하였다. Amine Couping Kit(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 일차 아민기를 통해 4 개의 HGF 에 대한 항체를 각각 조사 등급 CM5 센서 칩(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Biacore, Inc. 에서 입수)에 고정시켰다.

각각의 분석에서, 다양한 농도 범위(0.01 nM 내지 50 nM)의 4 개의 HGF 에 대한 항체 각각을 0.005 % P-20 및 0.1 ㎎/mL BSA 를 갖는 PBS 내의 2 가지 상이한 농도(0.05 nM 및 1 nM)의 인체 HGF 와 함께 항체 실온에서 적어도 6 시간 동안 각각 항온하였다. 그런 다음 이 시료들 각각을 HGF 에 대한 동일 항체가 고정된 CM5 센서 칩 표면에 주사하였다. 얻어진 결합 신호는 용액 내 유리 HGF 에 비례한다. 해리 평형 상수(K_D)를 이중-곡선 한-부위 동종 결합 모델(dual-curve one-site homogeneous binding model ; KinExA 소프트웨어, 아이다호 보이스에 소재하는 Sapidyne Instruments Inc. 에서 입수)을 사용하여 경쟁 곡선의 비직선 회귀 분석으로 수득하였다. 이러한 해리 평형 상수값을 도 6B 에 나타내었다.

B. HGF 에 대한 항체의 결합 특성화

인체 HGF 를 CHO 세포에서 발현시키거나 R & D Systems(미네소타 미네아폴리스에 소재하는 R & D Systems 에서 입수, 카탈로그 번호 제 294-HG-005 호)로부터 수득하였다. 재조합 마우스 HGF 를 Liu 등의 Molecular cloning and characterization of cDNA encoding mouse hepatocyte growth factor, Biochim Biophys Acta. 16:1216(2):299-300(1993)에 기재된 서열을 사용하여 제조하였다. 재조합 마우스 HGF 를 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 발현시키거나 293T 세포에서 발현시켰다. 상기와 같이 발현시킨 마우스 HGF 를 황산헤파린 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.

인체 및 마우스 HGF 의 제제 각각을 생물학적으로 활성을 나타내도록 하였다. 인체 HGF 는 인체 PC3 세포(버지니아 머내서스에 소재하는 ATCC 에서 입수, 기탁 번호 제 CRL 1435 호) 및 마우스 4T1 세포(버지니아 머내서스에 소재하는 ATCC 에서 입수, 기탁 번호 제 CRL 2531 호)에서 투여량-의존 인체 Met 인산화를 유도하였다. 마우스 HGF 는 마우스 4T1 세포에서 Met 인산화를 유도하였으나 인체 PC3 세포에서는 유도하지 않았다.

인체 HGF 및 마우스 HGF 를 SDS PAGE 겔의 각 레인에 전기영동시켰다. 인체 HGF 및 마우스 HGF 를 각각 100 ng/레인 및 10 ng/레인으로 전기영동시켰다. 몇몇 겔은 비-환원 조건 하에서 전기영동되었으며 그외 각 겔은 베타-머캅토에탄올을 사용하여 환원 조건 하에서 전기영동되었다. SDS PAGE 겔 상의 인체 HGF 및 마우스 HGF 를 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 막들을 각각 실시예 6 에 기재된 10 개의 HGF 에 대한 항체 중 하나와 함께 항온시켰다. 10 개의 HGF 에 대한 항체 각각을 환원 조건 하에서의 인체 HGF 및 마우스 HGF 를 포함하는 겔로부터의 니트로셀룰로스 막 및 비-환원 조건 하에서의 인체 HGF 및 마우스 HGF 를 포함하는 겔로부터의 니트로셀룰로스 막과 함께 각각 항온하였다. 그런 다음 막을 HRP 와 결합된 염소 항-인체 IgG 항체(일리노이 록포드에 소재하는 Pierce 에서 입수, 카탈로그 번호 제 31412 호)와 함께 항온시켰다. HRP 와 결합된 염소 항-인체 IgG 항체로부터의 신호를 제조업자의 지시에 따라 전기화학발광(ECL™ ; 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Amersham Pharmacia Biotech 에서 입수, 카탈로그 번호 제 RPN2106 호)으로 검출하였다.

도 7A 및 7B 는 실시예 6 에 기재된 10 개의 HGF 에 대한 항체 각각을 시험한 겔 사진을 나타낸 것이다. 도면 왼쪽편의 사진들은 비-환원 조건 하에서의 100 ng 의 인체 HGF(1 레인), 10 ng 의 인체 HGF(2 레인), 100 ng 의 마우스 HGF 및 10 ng 의 마우스 HGF(4 레인)에 대한 각 항체를 시험한 겔을 나타낸다. 도면 오른쪽편의 사진들은 환원 조건 하에서의 100 ng 의 인체 HGF(5 레인), 10 ng 의 인체 HGF(6 레인), 100 ng 의 마우스 HGF(7 레인) 및 10 ng 의 마우스 HGF(8 레인)에 대한 각 항체를 시험한 겔을 나타낸다. 시험한 HGF 에 대한 항체 각각은 비-환원 조건 하에서의 인체 HGF(1 레인 및 2 레인)에 결합하였다. 시험한 HGF 에 대한 항체는 비-환원 조건 하에서의 마우스 HGF(3 및 4 레인) 또는 환원 조건 하에서의 인체 HGF(5 및 6 레인) 또는 마우스 HGF(7 및 8 레인)에 거의 결합하지 않았다.

C. 융합 단밸질을 이용한 에피토프 맵핑

벡터 pCEP4(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수, 카탈로그 번호 제 VO44-50 호)의 다중 클로닝 부위에 인접한 닭 아비딘을 코드하는 cDNA 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터를 표준 분자 기술을 사용하여 구성하였다(도 9A 참조). 이 벡터는 발현될 융합 단백질을 분비하기 위해 닭 아비딘 신호 서열(도 9B 참조)을 포함한다. 융합 단백질 발현 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 특정 표적 단백질을 코드하는 서열을 삽입하여 발현 벡터를 구성하였다. 결과적으로 생성된 융합 구성물 각각은 표적 단백질의 N-말단에서 아비딘 단백질을 코드한다.

이러한 기술을 이용하여, 하기 표적 단백질에 융합되는 아비딘을 포함하는 융합 단백질을 제조하였다 : 전장의 인체 HGF ; 인체 HGF 의 자연발생적인 스플라이스 변이제인 d5 HGF[Rubin, J. 등의 PNAS 88:415-419(1991)] ; 전장의 마우스 HGF ; 인체 HGF 의 N-말단 부분(아미노산 32-505) 및 마우스 HGF 의 C-말단 부분(아미노산 508-728)을 포함하는 키메라 # 1 ; 마우스 HGF 의 N-말단 부분(아미노산 33-506) 및 인체 HGF 의 C-말단 부분(아미노산 506-728)을 포함하는 키메라 # 2 ; 및 인체 HGF 의 N-말단 부분(아미노산 32-582) 및 마우스 HGF 의 C-말단 부분(아미노산 583-728)을 포함하는 키메라 # 3.

융합 단백질의 도식적인 대표도를 도 10 에 나타내었다. HGF 의 N-말단 도메인은 K1-K4 로 표시된 박스 모양으로 나타낸 4 개의 크링글(kringle) 도메인을 포함한다. HGF 의 C-말단 도메인은 세린 프로테아제와 상동성을 공유한다. 이 도메인을 막대 모양으로 나타내었다. 개방된 박스 모양 및 검은 막대 모양은 인체 HGF 서열을 나타낸다. 색이 있는 박스 모양 및 격자무늬 막대 모양은 마우스 서열을 나타낸다.

각각의 융합 단백질을 Lipofectamine(캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Gibco BRL 에서 입수, 카탈로그 번호 제 18324 호)을 제조업자의 지침에 따라 사용하여 각 융합 단백질 발현 벡터 중 하나를 개별적으로 트랜스펙션시켜 293T 세포에서 각각의 융합 단백질을 일시적으로 발현시켰다. 트랜스펙션시킨 후 대략 48 시간 후에, 조정 배지를 수집하여 분석하였다.

각각의 시료에서, 실시예 6 에 기재된 10 개의 HGF 에 대한 항체 중 5 개(하이브리도마 2.4.4, 1.74.1, 1.75.1, 3.10.1 및 2.12.1 로부터 궁극적으로 유래된 것임)를 각각 하기 표적 단백질 중 하나를 포함하는 융합 단백질과 함께 항온시켰다 : 전장의 인체 HGF, d5 HGF 및 마우스 HGF. 항온한 후에, 각 시료에서의 융합 단백질을 비오틴-코팅 비드(일리노이 리버티빌에 소재하는 Spherotech Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 TP-60-5 호)를 사용하여 개별적으로 포획하였다. 결과적으로 생성된 비드-단백질 복합체를 FITC 표지된 항-아비딘 항체(캘리포니아 벌링게임에 소재하는 Vector Lab 에서 입수, 카탈로그 번호 제 SP-2040 호)를 첨가하여 표지하였다. HGF 에 대한 항체의 존재를 피코에리트린(PE) 표지된 염소 항-인체 F(ab')2 항체(앨라배마 버밍엄에 소재하는 Southern Biotech Associates, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 2043-09 호)를 첨가하여 측정하였다.

그런 다음 시료를 형광 발색 세포 소터(FACS) 분석하였다. FITC(아비딘의 존재를 나타냄) 및/또는 PE(HGF 에 대한 항체의 존재를 나타냄)로 표지된 비드 복합체를 Becton Dickinson Bioscience FACScan(뉴저지 프랭클린 레이크스에 소재하는 BD 에서 입수)으로 검출하였다. 시험한 5 개의 HGF 에 대한 항체의 FACS 산점도를 도 8A 및 도 8B 에 나타내었다.

개별적인 시료에서, 실시예 6 에 기재된 10 개의 HGF 에 대한 항체 중 2 개(하이브리도마 2.12.1 및 2.4.4 로부터 궁극적으로 유래된 것임)를 하기 표적 단백질을 각각 포함하는 융합 단백질과 함께 개별적으로 항온하였다 : 전장의 인체 HGF, d5 HGF 및 마우스 HGF, 키메라 # 1, 키메라 # 2 및 키메라 # 3. 이러한 시료들을 상기 기술한 바와 같이 FACS 분석하였다.

이러한 결합 실험의 결과를 도 10A 의 도식 오른쪽에 나타내었다. 항체 2.12.1 과 2.4.4 둘 다 키메라 # 1 에 결합하지 않았다. 항체 2.12.1 및 항체 2.4.4 둘 다 키메라 # 2 에 결합하였다. 항체 2.4.4 는 키메라 # 3 에 결합하였다. 항체 2.12.1 은 키메라 # 3 에 결합하지 않았다.

D. 융합 단백질을 이용한 추가 에피토프 맵핑

항체 2.4.4 및 2.12.1 이 결합하는 HGF 의 에피토프에 관한 부가적인 정보를 제공하기 위해, 추가적인 인체/마우스 키메라를 구성하여 실시예 8C 에 기재된 바와 같이 검정하였다(도 10B 참조). 키메라를 생성하기 위해 사용한 프라이머는 10A, 10B 및 10C 에 나타내었다.

도 10B 는 연구를 위해 생성시킨 마우스 및 인체 HGF 키메라 분자의 도면을 나타낸 것이며 이 도면의 오른쪽에는 각 키메라에 대한 항체 2.12.1 및 2.4.4 의 결합 결과를 나타내었다. 이 연구에서 키메라 # 1 내지 3 은 실시예 8C 및 도 10A 에 나타낸 키메라 # 1 내지 3 과 동일하다. 키메라 # 4 내지 6 은 다른 완전 인체 HGF 분자 내로 마우스 HGF 의 N-말단의 증가량을 도입시킨 것이다. 키메라 # 7 은 다른 인체 HGF 분자 내에 마우스 HGF 의 아미노산 507-585 를 포함한 것이며 키메라 # 8 은 다른 마우스 HGF 분자 내에 인체 HGF 의 아미노산 507-585 를 포함한 것이다. 키메라 # 9 는 마우스 HGF 의 아미노산 1-585 및 인체 HGF 의 아미노산 586-731 로 구성되었다.

키메라 단백질에 대한 항체 2.4.4 및 2.12.1 의 결합을 실시예 8C 에 기재된 바와 같이 검정하였다. 융합 단백질 중 하나와 함께 항체 2.4.4 또는 항체 2.12.1 을 항온한 후에, 각 시료 내의 융합 단백질을 비오틴-코팅 비드(일리노이 리버티빌에 소재하는 Spherotech Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 TP-60-5 호)를 사용하여 각각 포획하였다. 결과적으로 생성된 비드-단백질 복합체를 FITC 표지된 항-아비딘 항체(캘리포니아 벌링게임에 소재하는 Vector Lab 에서 입수, 카탈로그 번호 제 SP-2040 호)를 첨가하여 표지하였다. HGF 에 대한 항체의 존재를 피코에리트린(PE) 표지된 염소 항-인체 F(ab')2 항체(앨라배마 버밍엄에 소재하는 Southern Biotech Associates, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 2043-09 호)를 첨가하여 측정하였다. 그런 다음 시료를 형광 발색 세포 소터(FACS) 분석하였다. FITC(아비딘의 존재를 나타냄) 및/또는 PE(HGF 에 대한 항체의 존재를 나타냄)로 표지된 비드 복합체를 Becton Dickinson Bioscience FACScan(뉴저지 프랭클린 레이크스에 소재하는 BD 에서 입수)로 검출하였다. 몇몇 경우에서, FITC 를 사용한 발현 표준화 후에, 단색 FACS 분석을 PE 표지에 의한 항체 결합 후에 수행하였다. 이 방법은 검정의 감도를 증가시키며 매우 높은 수준으로 발현되지 않는 구성물과의 결합을 측정하는데 도움을 준다.

도 10B 에 나타낸 바와 같이, 항체 2.4.4 및 2.12.1 둘 다 인체 HGF 의 아미노산 507-585 를 포함하는 키메라 # 8(도 10B)에 결합한다. 이러한 결과는 이 영역이 HGF 에 대한 항체 2.4.4 및 2.12.1 의 결합에 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 잔기를 포함함을 제시한다. 이런 동일한 507-585 영역을 갖는 마우스 서열을 포함하는 키메라(키메라 7 및 9)는 항체 2.12.1 또는 2.4.4 에 결합하지 않는다. 키메라 3 은 인체 HGF 의 아미노산 507-585 가 존재함에도 불구하고 항체 2.12.1 에는 결합하지 않지만 항체 2.4.4 에는 결합한다.

인체 HGF 의 아미노산 507-585(GWMVSLRYRNKHICGGSIIKESWVLTARQCFPSR- -DLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLM(SEQ ID NO:123)(도 10D 를 참조하라)에 대한 추가 정보를 얻기 위해, 표 10A, 10B 및 10C 에 기재된 프라이머를 사용하여 아미노산 507-585 의 영역 내에서 인체 잔기를 마우스 잔기로 치환한 특정 점 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 HGF 를 생성하였다(도 10C). 인체 HGF 서열로부터 마우스 HGF 서열(각각 Genbank 기탁 번호 제 NM_000601 호 및 제 NM_010427 호)로의 5 개의 단일 비-보존 아미노산 치환을 포함하는 인체 HGF-아비딘 융합 단백질을 구성하였다. 인체 HGF 서열 내로 2 개의 아미노산이 삽입된 구성물 및 마우스 서열로부터 2 개의 아미노산을 결실시킨 구성물인 2 개의 추가적인 구성물을 또한 생성하였다(도 10C).

이러한 구성물들을 발현시킨 후 실시예 8C 및 8D 에 기재된 바와 같이 결합 분석을 실시하였다. 돌연변이된 단백질 중 하나와 함께 항체 2.4.4 또는 항체 2.12.1 을 항온한 후에, 각 시료 내의 돌연변이된 단백질을 비오틴-코팅 비드(일리노이 리버티빌에 소재하는 Spherotech Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 TP-60-5 호)를 사용하여 각각 포획하였다. 결과적으로 생성된 비드-단백질 복합체를 FITC 표지된 항-아비딘 항체(캘리포니아 벌링게임에 소재하는 Vector Lab 에서 입수, 카탈로그 번호 제 SP-2040 호)를 첨가하여 표지하였다. HGF 에 대한 항체의 존재를 피코에리트린(PE) 표지된 염소 항-인체 F(ab')2 항체(앨라배마 버밍엄에 소재하는 Southern Biotech Associates, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 2043-09 호)를 첨가하여 측정하였다. 그런 다음 시료를 형광 발색 세포 소터(FACS) 분석하였다. FITC(아비딘의 존재를 나타냄) 및/또는 PE(HGF 에 대한 항체의 존재를 나타냄)로 표지된 비드 복합체를 Becton Dickinson Bioscience FACScan(뉴저지 프랭클린 레이크스에 소재하는 BD 에서 입수)으로 검출하였다. 몇몇 경우에서, FITC 를 사용한 발현 표준화 후에, 단색 FACS 분석을 PE 표지에 의한 항체 결합 후에 수행하였다. 이 방법은 검정의 감도를 증가시키며 매우 높은 수준으로 발현되지 않는 구성물과의 결합을 측정하는데 도움을 준다.

아미노산 592, 601 또는 647 에서가 아닌 아미노산 561 에서의 돌연변이가 돌연변이된 인체 HGF 및 항체 2.4.4 사이의 결합 뿐만 아니라 돌연변이된 인체 HGF 및 항체 2.12.1 사이의 결합을 파괴함을 발견하였다. 아미노산 555 에서의 돌연변이는 항체 2.12.1 결합을 파괴하나 항체 2.4.4 결합을 방해하지는 않는다. 인체 서열(도 10D 를 참조하라)에서는 나타나지 않는, 두 마우스 아미노산 54ON 및 541K 의 삽입도 항체에 대한 결합을 파괴한다. 마우스 HGF 서열로부터의 이러한 2 개의 아미노산의 결실은 마우스 HGF 에 대한 항체의 결합을 야기하지 않는다.

E. 프로테아제 보호 검정에 의한 에피토프 맵핑

상보적인 전형적 프로테아제 보호 검정을 항체 2.12.1 에 의해 결합되는 HGF 에피토프를 확인하기 위해 또한 실행하였다. Yi 및 Skalka, Mapping Epitopes of Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Integrase with Limited Proteolysis and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, Biopolymers(Peptide Science)55:308-318 (2000)을 참고하라. 인체 HGF(30 ug/10 ug)를 200 ul 의 0.1 M 트리스 완충용액(pH 7.5) 내에서 항체 2.12.1(40 ug/4 ug)과 혼합하고 얼음 상에서 30 분간 항온시켰다. 이를 37 ℃ 에서 1 시간 동안 트립신(1 ㎍)으로 절단하였다. 펩티드 분리를 위해 절단된 물질에 역상 HPLC 를 실행하였다. 항체 2.12.1 없이, 인체 HGF 에만 동시에 유사 트립신 절단을 실시하였다. HPLC 컬럼(Vydac C18, 2.1×150 ㎜, 캘리포니아 헤스페리아에 소재하는 Vydac Inc. 에서 입수)을 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA)에 용해된 2-35 % 아세토니트릴의 용출 기울기를 갖는 0.1 % TFA 로 전개시켰다. 용출된 펩티드의 UV 흔적을 HP 1090 HPLC 장치(팔로 알토에 소재하는 Hewlett Packard 에서 입수)로 기록하였다. 2 개의 HPLC 맵을 항체 2.12.1 과 결합함에 의해 보호되는 펩티드를 연구하기 위해 비교하였다(도 11A).

그런 다음 특정 보호 펩티드를 확인하기 위해 N-말단 서열결정 및 질량 분석을 실시하였다. N-말단 펩티드 서열결정을 ABI-Procise 단백질 서열결정기(캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 Applied Biosystems 에서 입수)로 에드만 분해에 의해 실시하였다. 각 사이클에서 아미노산을 연결된 HPLC 장치에서의 체류 시간 및 아미노산 표준과의 비교로 확인하였다. 보호 단편의 질량 분석을 Perceptive Voyager 질량 분석기(메사추세츠 프레이밍햄에 소재하는 Applied Biosystems 에서 입수)에서 실행하였다. 메트릭스에 의한 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 매트릭스, 4-히드록시시아노신남산(HCCA) 또는 시나핀산을 사용하여 수행하였다. 공지된 표준(산화된 인슐린 베타쇄 및 시토크롬 C)에 관련된 교정으로 분자량을 측정하였다.

인체 HGF 의 α 서브유닛은 아미노산 32-494 를 가지며 β 서브유닛은 아미노산 495-728 을 갖는다(인체 HGF 에 대한 스위스-Prot 등록 P14210 를 참조하라). 인체 HGF 에 대한 항체 2.12.1 의 결합은 T33 및 T38.6 의 두 피크를 보호한다(도 11A). 피크 T38.6 은 두 개의 펩티드를 포함하며 두 펩티드 둘 다는 성숙 HGF 의 β 서브유닛[도 10D 의 굵고 밑줄이 쳐진 문자에서 시작하는 서열(VVNGIPTRTN(SEQ ID NO:172)) 및 도 11C 를 참조하라]의 시작 부위 또는 그 근처에서의 서열에 상응한다. T33 은 α 서브유닛으로부터 유래한 것이다(도 11C). 질량 분석에 근거하여, 피크 T38.6 에서의 두 펩티드의 관찰된 질량은 각각 7165 및 6840 Da 으로 측정되었다. HGF 서열에 존재하는 가능한 트립신 절단 부위(예를 들어, 도 10D 의 인체 HGF 의 아미노산 559 에서의 굵고 밑줄이 쳐진 아르기닌 잔기를 참고하라)를 기초로 하여, 아르기닌 잔기 번호 559 가 보호 펩티드의 C-말단을 규정함이 예상되었다.

다른 상보성 실험을 또한 항체-결합 펩티드를 연구하기 위해 설계하였다. 상기 기술한 바와 같은 HGF 와 항체 2.12.1 의 혼합물을 1 시간 동안 트립신으로 절단시키고 결합하지 않은 펩티드를 제거하기 위해 Microcon^? 10(메사추세츠 베드포드에 소재하는 Millipore Corp. 에서 입수)으로 여과하였다. 결합한 펩티드는 항체 2.12.1 과 함께 막에 포획될 것으로 예상된다. 복합체로부터 결합 펩티드를 용리시키기 위해 순수한 인체 HGF(15 ㎍)를 펩티드-항체 2.12.1 혼합물에 첨가하였다. 시료를 4 ℃ 에서 밤새 항온한 뒤 항체 및 순수한 HGF 로부터 HGF-용리 펩티드를 분리하기 위해 다시 Microcon^? 으로 여과하였다. 두 시료(결합 펩티드 및 결합하지 않은 펩티드)를 역상 HPLC 로 분석하였다(도 11B). 결합 펩티드를 HPLC 로 분리하고 상기 기술한 바와 같이 N-말단 서열결정 및 질량 분석을 실시하였다.

결합 펩티드를 용리시키기 위해 HGF 를 사용했을 때, 큰 펩티드 피크(도 11B 의 T48)가 항체-HGF 복합체로부터 용리되는데에서 관찰되었으며 상기 T38.6 에서 발견된 동일한 2 개의 β 서브유닛 서열을 포함하는지를 N-말단 펩티드 서열결정으로 확인하였다. 피크 T48 에서의 펩티드의 크기는 질량 분석을 근거로 했을 때 불균질하므로 정확한 C-말단을 이 데이타로부터 예상할 수 없다. 3 개의 다른 피크(도 11B 에서 "#" 으로 표시됨)는 펩티드를 포함하지 않거나 HGF 와 관련되지 않은 알려지지 않은 기원의 펩티드를 포함한다.

동시에, 이러한 두 실험은 HGF 의 β 서브유닛의 N-말단 영역이 항체 2.12.1 에 대한 에피토프의 일부임을 나타낸다. 이 데이타는 결합에 관련된 에피토프가 인체 HGF 의 아미노산 507-585 내에 위치함을 발견한 실시예 8D 의 데이타를 보완한다. 돌연변이 분석 및 보호 펩티드의 분자 질량은 인체 HGF 의 항체-결합 에피토프가 인체 HGF 의 아미노산 495-556 내에 위치함을 나타낸다.

F. 항체의 경쟁적 결합

하이브리도마 2.4.4 로부터 궁극적으로 유래된 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 항체(항체 2.4.4) 및 하이브리도마 2.12.1 로부터 궁극적으로 유래된 HGF 에 대한 항체(항체 2.12.1)를 하기와 같은 경쟁 검정에 사용하기 위해 FITC 표지하였다. 항체 2.4.4 및 2.12.1 을 각각 pH 8.5 의 PBS 에 희석시켰다. FITC 표지([6-플루오레세인-5-(및 -6)-카르복사미도] 헥산산, 숙신이미딜 에스테르(5(6)-SFX) 혼합 이성질체)(Molecular Prbes 에서 입수, 카탈로그 번호 제 F-2181 호)를 DMSO 내의 5 ㎎/㎖ 의 FITC 표지의 원액으로부터 5:1(표지:항체)의 몰비로 2 개의 희석된 항체 각각에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온(20-22 ℃)에서 밤새 어두운 곳에서 항온하였다. 그런 다음 혼합물을 PBS 로 평형화시킨 Pharmacia PD-10 컬럼(뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 Amersham 에서 입수)을 통해 각각 개별적으로 전개시켰다. 결과적으로 생성된 제제를 280 nM 및 495 nM 에서 분석광도계로 판독하였다. 이 제제들의 항체 농도를 280 nm 에서의 흡광도를 사용하여 계산하였다. 표지되지 않은 항체에 대한 표지된 항체의 비를 다음 식을 사용하여 계산하였다 :

여기에서 Ax 는 495 nm 에서의 표지 흡광도이고 E 는 표지의 흡광 계수로 77500 이다. 전형적으로, 항체는 약 3:1(FITC-표지된 항체:표지되지 않은 항체)로 표지되었다.

9 개의 HGF 에 대한 항체 각각과의 결합에 있어서 경쟁하는 2 개의 표지된 항체 각각의 능력을 평가하였다. HGF 에 대한 2 개의 표지된 항체 각각을 HGF 와 함께 항온하고 HGF 에 대한 2 개의 표지된 항체 각각을 표지되지 않은 다른 9 개의 항체 중 하나가 50 배의 몰 과량으로 존재시에 HGF 와 함께 개별적으로 항온하였다. 그러므로, 9 개의 개별적인 시료에서, 표지된 항체 2.4.4 를 표지되지 않은 다른 9 개의 HGF 에 대한 항체 각각과 HGF 와 함께 항온하였다. 마찬가지로, 9 개의 개별적인 시료에서, 표지된 항체 2.12.1 을 표지되지 않은 다른 9 개의 HGF 에 대한 항체 각각과 HGF 와 함께 항온하였다. 이러한 결합을 전장의 HGF 대신 HGF 의 d5 스플라이스 변이체를 사용하여 다시 반복하였다.

이러한 경쟁 검정에 대한 양성 경쟁 대조군은 표지되지 않은 50-배 몰 과량의 동일한 항체와 함께 각각 표지된 항체를 배양하였다. 그러므로, FITC 표지된 항체 2.12.1 을 50-배 몰 과량의 표지되지 않은 항체 2.12.1 의 존재 하에서 배양하고, 표지되지 않은 항체 2.12.1 의 부재 하에서 분리하여 배양하였다. 마찬가지로 FITC 표지된 항체 2.4.4 를 50-배 몰 과량의 표지되지 않은 항체 2.4.4 의 존재 하에서 배양하고, 표지되지 않은 항체 2.4.4 의 부재 하에서 분리하여 배양하였다. 예측한 바와 같이, 50-배 몰 과량의 표지되지 않은 항체의 존재 하에서 시료로부터의 형광 신호는 표지되지 않은 항체를 첨가하지 않은 시료로부터의 형광 신호보다 상당히 낮았다.

도 12 는 결합 프로파일을 제공하였다. 도 12A 및 도 12B 는 표지된 항체 2.12.1 을 사용한 실험을 보여준다. 도 12A 및 12B 의 모든 패널에서의 곡선은 다음과 같다 : A:음성 대조군(HGF 없이 FITC-표지된 항체 2.12.1) ; B:양성 대조군(HGF 와 함께 FITC 표지된 항체 2.12.1) ; C:항체 1.74.1 ; D:항체 1.75.1 ; E:항체 1.29.1 ; F:항체 3.10.1 ; G:항체 1.61.3 ; H:항체 1.24.1 ; I:항체 1.60.1 ; J:항체 2.40.1 ; K:항체 2.12.1 ; L:항체 2.4.4. 도 12A 는 d5 HGF 스플라이스 변이 표적 단백질과 함께 형광 항체 2.12.1 을 사용한 경쟁 결합 검정으로부터의 결과를 보여준다. 도 12B 는 전장 HGF 표적 단백질과 함께 형광 항체 2.12.1 을 사용한 경쟁 결합 검정으로부터의 결과를 보여준다. 도 12C 및 12D 는 표지된 항체 2.4.4 를 사용한 실험을 보여준다. 도 12C 및 12D 의 모든 패널에서의 곡선은 다음과 같다 : A:음성 대조군(HGF 없이 FITC-표지된 항체 2.4.4) ; B:양성 대조군(HGF 와 함께 FITC 표지된 항체 2.4.4) ; C:항체 1.74.1 ; D:항체 1.75.1 ; E:항체 1.29.1 ; F:항체 3.10.1 ; G:항체 1.61.3 ; H:항체 1.24.1 ; I:항체 1.60.1 ; J:항체 2.40.1 ; K:항체 2.12.1 ; L:항체 2.4.4. 도 12C 는 d5 HGF 스플라이스 변이 표적 단백질과 함께 형광 항체 2.4.4 를 이용한 경쟁 결합 검정으로부터의 결과를 보여준다. 도 12D 는 전장 HGF 표적 단백질과 함께 형광 항체 2.4.4 를 이용한 경쟁 결합 검정으로부터의 결과를 보여준다.

데이터는 HGF 에 대한 각각의 10 가지 항체가 전장 또는 d5 HGF 에 결합하기 위한 각각의 두 가지 표지된 항체와 함께 경쟁함을 나타낸다. 몇몇의 항체는 표지된 항체와 함께 완전 경쟁을 나타낸다(예를 들어, 항체 2.12.1, 1.24.1 및 2.4.4 는 FITC-표지된 항체 2.12.1 과 함께 완전하게 경쟁함, 도 12A 및 12B, 각각 피크 H, K 및 L). 다른 항체는 결합을 위해 부분적으로만 경쟁한다(예를 들어, 항체 2.12.1, 2.40.1 및 1.61.3 은 FITC-표지된 2.4.4 와 함께 부분적으로 경쟁함, 도 12C 및 12D, 각각 피크 K, J 및 G).

실시예 9

중화 ELISA 검정

실시예 6 에서 기재되어 있는 항체가 Met-HGF 결합을 방해할 수 있는지를 평가하기 위해 중화 ELISA 검정을 실시하였다. Delphia 96-웰 플레이트(카탈로그 번호 : 제 AAAND-0001 호, 미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 Wallac Inc. 에서 입수)에 각 웰당 6.25 ㎍/ml 로 100 ㎕ 의 HGF 를 첨가하여 HGF 로 코팅시켰다. 플레이트를 1 시간 동안 37 ℃ 또는 밤새 4 ℃ 에서 배양하였다. 그리고 난 다음에 0.1 % Tween 20 을 함유하는 PBS 에 용해시킨 5 % BSA(카탈로그 번호 : 제 50-61-00 호, 미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 KPL 에서 입수)로 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안 차단하였다.

테스트된 HGF 에 대한 상이한 농도의 특정한 항체와 함께 가용성 Met(2nM, 0.256 ㎍/ml)를 분리하여 혼합함으로써 테스트 시료를 제조하였다. 테스트된 농도는 667 nM, 223 nM, 74.1 nM, 24.7 nM, 8.2 nM, 2.7 nM, 0.91 nM, 0.30 nM, 0.10 nM 및 0.034 nM 이다. 100 ㎕ 부피의 테스트 시료를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃ 에서 밤새 배양하고 난 다음에 0.1 % Tween 20 을 함유하는 PBS 로 4 번 세척하였다. 그 다음에, 각 웰당 2 ㎍/ml 로 100 ㎕ 의 비오틴화시킨 항-cMetR 항체(카탈로그 번호 : 제 BAF358 호, 미국 미네소타 미니애폴리스에 소재하는 R&D Systems Inc. 에서 입수)를 첨가하였다. 플레이트에서 항체가 Met-HGF 복합체에 결합하였으나 플레이트에서 HGF 에 결합하는 항-HGF 항체에는 결합하지 않았다. 플레이트를 2 시간 동안 진탕하면서 배양하고 난 다음에 이를 0.1 % Tween 20 을 함유하는 PBS 로 4 번 세척하였다. Eu-스트렙타비딘(검정 완충액에서 1:1000 희석)(카탈로그 번호 : 제 1244-360 호, 미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 Wallac Inc. 에서 입수)을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 진탕시켰다. 그리고 난 다음 플레이트를 0.1 % Tween 20 을 함유하는 PBS 로 4 번 세척하였다. 그 다음에, 100 ㎕ 의 인핸스먼트(enhancement) 완충액(카탈로그 번호 : 제 1244-105 호, 미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 Wallac Inc. 에서 입수)을 첨가하였다. 적어도 5 분 후에, Victor 2(1420 다중표지 카운터, 미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 Wallac Inc. 에서 입수)에서 유로피움 방법을 사용하여 플레이트를 읽었다.

HGF 에 대한 Met 결합의 저해 퍼센트(즉, 중화)를 계산하고 4 가지 파라미터 적합 방정식(4 prameter fit equation) Excelfit 버전 2.0.6(미국 워싱턴 시애틀에 소재하는 Microsoft Inc 에서 입수)을 사용하여 IC₅₀ 값을 측정하였다. 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 항체의 존재 하에서, HGF 에 결합하는 Met 를 중화시켰다. 두 실험의 데이터를 도 13 에 나타내었다.

실시예 10

세포에서의 중화

A. Met 인산화 반응

PC-3 세포(미국 버지니아 머내서스에 소재하는 ATCC 에서 입수, 기탁번호 제 CRL 1435 호)에서 HGF 는 Met 인산화 반응을 유도한다. PC-3 세포를 5 % 우태아 혈청(미국 유타 로건에 소재하는 Hyclone 에서 입수, 카탈로그 번호 제 SH 30070.03 호) 및 1× 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민(미국 캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수, 카탈로그 번호 제 10378-016 호)을 함유하는 100 ㎕ RPMI 1640(미국 캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수, 카탈로그 번호 제 11875-093 호)을 각 웰당 1×10⁴ PC-3 세포에 첨가함으로써 96-웰 Falcon 조직 배양 플레이트(미국 캘리포니아 산디에이고에 소재하는 VWR 에서 입수, 카탈로그 번호 제 62740-081 호)에서 PC-3 세포를 성장시켰다. 5 % CO₂ 하에서 37 ℃ 에서 24 시간 성장시킨 후에, 세포를 0.1 % 소 혈청 알부민(미국 미주리 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 A-3156 호)을 함유하는 DMEM-저 글루코스(미국 캘리포니아 칼즈배드에 소재하는 Invitrogen 에서 입수, 카탈로그 번호 제 11885-084 호)로 한번 세척하고 0.1 % 소 혈청 알부민(미국 미주리 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 A-3156 호)을 함유하는 100 ㎕ DMEM-저 글루코스 배지로 18 내지 20 시간 동안 배양하였다.

실시예 6 으로부터 HGF 에 대한 각각의 10 가지 항체의 8 가지 상이한 희석액을 200 ng/ml HGF 를 함유하는 배지(0.1 % 소 혈청 알부민과 함께 DMEM-저 글루코스)에서 계열 희석법에 의해 분리하여 제조하였다. 분리 희석액에 용해시킨 HGF 에 대한 항체의 농도는 HGF 에 대한 특정 항체의 200 nM, 67 nM, 22 nM, 7 nM, 2.5 nM, 1 nM, 0.3 nM, 및 0.1 nM 이다. 이러한 항체/HGF 희석액을 37 ℃ 에서 30 분 동안 배양하였다.

0.1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 100 ㎕ DMEM-저 글루코스로 PC-3 세포를 한번 세척하였다. 100 ㎕ 의 각각의 항체/HGF 희석액을 PC-3 세포의 분리된 웰에 분리하여 첨가하였다. 5 % CO₂ 하에서 37 ℃ 에서 10 분 동안 배양한 후에, 항체/HGF 희석액을 웰로부터 흡인시키고, 플레이트를 얼음에서 1-2 분 동안 두었다. 0.3 mM 소듐-오르토 바나데이트(sodium-ortho vanadate)(미국 미주리 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 S-6508 호)를 함유하는 100 ㎕ 얼음-냉각된 PBS 로 세포를 한번 세척하였다. 1 % Triton X-100(미국 일리노이 록퍼드에 소재하는 Pierce 에서 입수, 카탈로그 번호 제 28314 호), 50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 0.3 mM 소듐-오르토 바나데이트(미국 미주리 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 S-6508 호) 및 1× 프로테아제 저해 반응혼합액(Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 P-8340 호)을 함유하는 60 ㎕ 용해 완충액에서 세척한 세포를 얼음에서 15-30 분 동안 배양하였다.

1 % 소 혈청 알부민(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 A-7888 호) 및 0.1 % Tween 20(미국 캘리포니아 헤라클레스에 소재하는 Biorad 에서 입수, 카탈로그 번호 제 170-6531 호)을 함유하는 PBS 에 용해시킨 4 ㎕/ml 의 염소-항 Met-비오틴(미국 메릴렌드 미니애플리스에 소재하는 R&D Systems Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 BAF 358 호)과 함께 Dynabeads M-280 스트렙타비딘(미국 매릴랜드 게이더스버그에 소재하는 IGEN International 에서 입수, 카탈로그 번호 제 110029 호)을 30 분 동안 실온에서 배양함으로써 항-Met 항체 코팅된 비드를 제조하였다. 각 웰당 25 ㎕ 부피의 항-Met 항체 코팅된 비드를 96-웰 Costar 검정 플레이트(미국 뉴욕에 소재하는 Corning 에서 입수, 카탈로그 번호 제 3365 호)에 두었다.

25 ㎕ 부피의 각각의 상이한 PC-3 세포 용해질을 항-Met 항체 코팅된 비드를 함유하는 각각의 웰에 분리하여 첨가하였다. 플레이트를 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 1 % 소 혈청 알부민(미국 미주리 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 A-7888 호), 0.1 % Tween 20(미국 캘리포니아 헤라클레스에 소재하는 Biorad 에서 입수, 카탈로그 번호 제 170-6531 호) 및 0.04 ㎍ 의 항-포스포티로신 항체 4G10(미국 뉴욕 레이크 플래시드에 소재하는 Upstate Biotechnology 에서 입수, 카탈로그 번호 제 05-321 호)을 함유하는 12.5 ㎕ 부피의 PBS 를 각각의 웰에 첨가하고 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % Tween 20 및 8 ㎍/ml 의 항-마우스 ORI-TAG-표지(미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 IGEN International 에서 입수, 카탈로그 번호 제 110087 호)를 함유하는 12.5 ㎕ 부피의 PBS 를 첨가하고 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 신호(IGEN counts 에서 발현됨)를 IGEN M8 리더기(미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 IGEN International 에서 입수)에서 측정하였다. 4 가지 파라미터 적합 방정식 및 Excelfit software package 버전 2.0.6(미국 워싱턴 시애틀에 소재하는 Microsoft Inc. 에서 입수)을 사용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. IGEN 형식을 사용한 두 실험의 데이터를 도 14 에 나타내었다. HGF 에 대한 각각의 10 가지 항체에 대해, IC₅₀ 값은 낮은 나노몰 내지 서브 나노몰 범위에 있다.

B. U-87 MG 성장/생존의 중화

U-87 MG 세포(ATCC 에서 입수, 기탁번호 제 HTB-14 호)는 Met 및 HGF 둘 다 발현되는 인체 신경교아세포계이다. 배양에서 이러한 세포의 성장/생존은 외인성 HGF 에 의해 증진되지 않는다. 그러나, 내인성 Met 는 성장 조건 하에서 내인성 HGF 에 의해 활성화되는 것처럼 보인다. 내인성 Met 에 대한 내인성 HGF 의 결합의 방해는 감소된 성장 및/또는 생존을 결과로서 나타낸 것이다.

5 % FBS 를 함유하는 IMEM 배지(미국 메릴랜드 록빌에 소재하는 Gibco BRL 에서 입수, 카탈로그 번호 제 11125-028 호)에서 각 웰당 800 세포를 첨가함으로써 U-87 MG 세포를 96-웰 Costar 검정 플레이트(미국 뉴욕에서 소재하는 Corning 에서 입수, 카탈로그 번호 제 3365 호)에서 성장시켰다. 대략 24 시간 후에, 실시예 6 으로부터의 HGF 에 대한 각각의 10 가지 항체의 각각의 11 가지 상이한 농도를 U-87 MG 세포의 분리된 웰에 첨가하였다. 분리된 희석액에 용해시킨 HGF 에 대한 농도는 HGF 에 대한 특정 항체의 100 ㎍/ml, 33.3 ㎍/ml, 11.1 ㎍/ml, 3.7 ㎍/ml, 1.2 ㎍/ml, 0.4 ㎍/ml, 0.14 ㎍/ml, 0.05 ㎍/ml, 0.015 ㎍/ml, 5.1 ng/ml 및 1.7 ng/ml 이다.

HGF 에 대한 항체의 첨가하고 7 일 후에, 배지를 플레이트로부터 제거하고 세포를 각 웰당 100 ㎕ 의 10 % 트리클로로아세트산(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 T-9159 호)으로 고정시키고 1-2 시간 동안 4 ℃ 에서 배양하였다. 웰을 수도물로 5 번 세척하였다. 1 % 아세트산(미국 펜실베이니아 피츠버그에 소재하는 Fisher 에서 입수, 카탈로그 번호 제 UN2789 호)에 용해시킨 100 ㎕ 의 0.4 % 설포르호다민 B(sulforhodamine B)(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 S-9012 호)로 고정시킨 세포를 실온에서 10 분 동안 배양함으로써 착색시켰다. 착색시킨 다음에, 세포를 1 % 아세트산으로 5 번 세척하고 공기 중에서 건조시켰다. 540 nm 에서 플레이트의 광학밀도를 마이크로 플레이트 리더기(SpectraMax PLUS, 미국 캘리포니아 서니베일에 소재하는 Molecular Devices 에서 입수)에서 읽었다. 광학 밀도는 세포 단층에 존재하는 단백질 총량에 비례하고, 따라서 이는 7 일 검정 기간 동안 세포 생존/증식의 측정이다. IC₅₀ 값을 계산하기 위해, 저해 퍼센트를 동형 대조군 항체 또는 항체 없이 배양된 세포와 비교하여 계산하였다. IC₅₀ 값을 4 가지 파라미터 적합 방정식 및 Excelfit software package 버전 2.0.6(미국 워싱턴 시애틀에 소재하는 Microsoft Inc. 에서 입수)을 사용하여 계산하였다.

두 실험에 대한 데이터를 도 15 에 나타내었다. 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 모든 10 가지 항체는 U-87 MG 세포의 성장/생존을 저해하였다. 각 항체의 IC₅₀ 값은 일반적으로 100 nM 이하이다.

실시예 11

이종이식 종양에서 중화

A. U-87 MG 이종이식 최소 잔여 질병 모델

U-87 MG 세포를 배양기 바닥 전체에 세포로 거의 덮히게 성장시키고 난 다음 이를 25×10⁶ 세포/ml 농도에서 무혈청 배지에 현탁시켰다. 트리판 블루 배제에 의해 측정함으로써, 세포를 98.5 % 이상이 생존할 수 있음을 시각적으로 평가하였다. HGF 에 대한 단일 항체를 테스트하기 위해, 무혈청 배지에서 5×10⁶ U-87 MG 세포를 50 마리의 암컷 누드 마우스(CD 1 Nu/Nu, 미국 매사추세츠 윌밍턴에 소재하는 Charles River Laboratories 에서 입수)의 오른쪽 옆구리 피하에 주사하였다. 50 마리의 마우스를 각각 10 마리씩 5 그룹으로 나누어 두었다.

10 마리 마우스의 특정 그룹 내의 각각의 마우스에 실시예 7 에 기재되어 있는 HGF 에 대한 동일 투여량의 동일 항체 또는 IgG1 불변 영역(동형 대조군)을 복강내 주사하였다. 테스트된 항체는 주사 당 1 ㎍, 3 ㎍, 10 ㎍ 및 30 ㎍ 이다. U-87 MG 세포를 주사한 후에 2 일 부터 시작하여 4 주 동안 일주일에 2 번씩 항체 주사하였다. 종양 측정 및 몸무게를 30 일 동안 일주일에 2 번씩 기록하였고 종양 부피를 공식:길이×폭×높이를 이용하여 계산하였다. 결과를 반복된 측정 ANOVA 후에 쉬프 사후 검증 시험을 사용하여 StatView^? 통계 프로그램(미국 노스캐롤라이나 케리에 소재하는 SAS Institute Inc. 에서 입수)으로 분석하였다.

분리 실험에서, 실시예 6 에 기재되어 있는 HGF 에 대한 각각의 10 가지 항체를 이러한 모델에서 시험하였다. 항체 2.4.4 에 대한 투여-반응 실험을 도 16A 에 나타내었다. 화살표는 투여 시점을 나타내고 투여량을 설명(legend)에 나타내었다. 각각의 투여량에서 측정된 종양이 없는 동물의 수(10 마리 중에서)를 괄호에 나타내었다. 테스트된 2 가지 매우 높은 투여량, 일주일에 2 번 투여된 10 ㎍ 및 일주일에 2 번 투여된 30 ㎍ 에 대해, 일주일에 30 ㎍ 을 2 번 동형 대조군을 투여한 대조군 동물과 비교할 때 종양 성장의 저해는 통계적으로 중요하다(human IgG2 기탁번호 제 PK 16.3.1 호, 미국 캘리포니아 프리몬트에 소재하는 Abgenix Inc. 에서 입수). 그러나, 2.4.4 의 2 가지 낮은 투여량(일주일에 2 번 1 및 3 ㎍)을 투여하였을 때 성장 저해는 통계적으로 중요하지 않았다. 데이터를 평균 ± 표준 오차로서 나타내었고 ; 그룹 당 n=10 동물 및 p<0.05 는 통계적으로 중요하게 고려되었다. 실시예 6 으로부터의 HGF 에 대한 그 밖의 9 가지 항체를 테스트한 실험은 높은 투여량에서 종양 성장의 완전한 저해를 유사하게 보여주었다.

B. U-87 MG 이종이식 확립된 질환 모델

상기 실시예 11A 에 기재되어 있는 방법 다음에 무혈청 배지에서 U-87 MG 세포를 누드 마우스에 주사하였다. HGF 에 대한 항체를 복강내에 투여를 시작하기 전에, 종양이 ∼200 mm³ 의 부피가 될 때까지 대략 2 주 동안 종양을 성장시켰다. 도 16B 에 화살표로 나타낸 바와 같이, 16 일 부터 시작하여 일주일에 2 번 200 ㎍, 100 ㎍ 또는 30 ㎍ 으로 항체 2.4.4 를 마우스에 일주일에 2 번 투여하였다. 상기에 기재한 바와 같이 종양 부피를 측정하고 평가하였다. 30 일에 측정된 종양이 없는 동물의 수(10 마리 중에서)를 괄호에 나타내었다. U-87 MG 종양 성장의 완전한 저해가 모든 투여량에서 관찰되었다. 확립된 종양의 통계적으로 중요한 퇴화는 29 일에 성취되었다. 분리 실험에서, 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 각각의 10 마리 항체를 이러한 모델에서 테스트하였고 높은 투여량의 각각의 항체에서 완전한 저해가 관찰되었다.

C. U-87 MG 최소 잔여 질병 모델에서 항체 순위

실시예 11 A 에 기재된 U-87 MG 종양 모델에서 실시예 6 에 기재된 HGF 에 대한 10 가지 항체의 상대적인 효능을 측정하기 위해, 최소 잔여 질병 모델에서 종양 성장을 부분적으로 저해하는 낮은 투여량을 선택하였다. 예비 투여-반응 연구(도 16A)에서 일주일에 2 번 5 ㎍ 은 HGF 에 대한 항체에 의해 부분적으로 저해됨을 제시하였다. HGF 에 대한 최대 5 가지의 상이한 항체와 비교한 연속 대접전 실험을 실시하였다. 이러한 실험 중 2 가지로부터의 결과를 도 16C 및 16D 에 나타내었다. ^** 는 PBS 및 동형 대조군 IgG2 항체(p<0.0001)와 비교하여 중요하게 종양 성장을 저해시킨 HGF 에 대한 이러한 항체를 나타내었다.

실시예 11 B 에 기재되어 있는 확립된 U-87 질병 모델을 사용하여 비슷한 순위 실험을 실시하였다. 이러한 실험에서, 일주일에 10 ㎍, 2× 의 투여량을 사용하였다. 두 가지의 이러한 실험로부터의 결과를 도 16E 및 16F 에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. ABGENIX, INC. BURGESS, TERESA L. COXON, ANGELA GREEN, LARRY L. ZHANG, KE <120> SPECIFIC BINDING AGENTS TO HEPATOCYTE GROWTH FACTOR <130> 6843.51-304 <140> <141> <150> US 60/488,681 <151> 2003-07-18 <160> 194 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.24.1 Light chain V region (Vk, 1-L15) <400> 1 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggttcc 60 agatgcgaca tccagatgac ccagtctcca tcttccgtgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa cctcctgatc tatgaagcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcggcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttactattgt caacaggcta acggtttccc gtggacgttc 360 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa 387 <210> 2 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.24.1 Heavy chain V region (Vh, H3-11)-huIgG2 C region) <400> 2 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gttgctatta taaaaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtcaagcctg gagggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac cttcagtgac tactacatga gctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt ttcatacatt agtagtagtg gtagtaccat atactacgca 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg ccaagaactc actgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatgagtat 360 aacagtggct ggtacgtcct ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctct 420 agt 423 <210> 3 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.29.1 Light chain V region (Vk, 4-B3) <400> 3 atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctga tgcctacgga 60 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120 atcaactgca agtccagcca gagtattttt tacagctcca ccaataagaa ctacttagct 180 tggtatcaga agaaaccggg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 240 gaatccgggg tccctgaccg gttcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 360 ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 399 <210> 4 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.29.1 Heavy chain V region (Vh, 3-33)- huIgG2 C region <400> 4 atggagtttg ggctgaactg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg ccaggctccg 180 ggcaagggac tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtgataa atactatgca 240 gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaggactac 360 ggcgagggtt ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctctag t 411 <210> 5 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.60.1 Light chain V region (Vk, 1-A20) <400> 5 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg ggactcctgc tgctctggct cccagatacc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgtatctgt cggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc attagcagtt atttagcctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagttcctaa gctcctgatc tatgttgcat ccactttgca atcaggggtc 240 ccgtctcggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atgttgcaac ttattactgt caaaactata acagtgaccc gctcactttc 360 ggcggcggga ccaaggtgga gatcaaa 387 <210> 6 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.60.1 Heavy chain V region (Vh, H1-02)- huIgG2 C region <400> 6 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatataa actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcaccac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagagc tgacgacacg gccgtgtact actgtgcgag agaactggaa 360 ctacgctact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctctagt 417 <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.61.3 Light chain V region (Vk, 1-018/08) <400> 7 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccaggc gagtcaggac attagcaact atttaaattg gtatcagcag 180 aaaccaggga cagcccctaa actcctgatc tacggtgcat ccgatttgga aacgggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggaag tggatctggg acagatttta ctttcgccat cagcagcctg 300 cagcctgaag atattgcaac atattactgt caacagtatg ataatctccc gtacaatttt 360 ggccagggga ccaagctgga gatcaaa 387 <210> 8 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.61.3 Heavy chain V region (Vh, 4-31)- huIgG2 C region <400> 8 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt gatggttact actggagctg gatccgccag 180 cacccaggga agggcctgga gtggattggg tacatctatt acagtgggag cacctactac 240 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga gctctgtgac tgccgcggac acggccgtct attactgtgc gagatcccac 360 cttcattact atgatagtag tggttattac tacggcggtg cttttgatat ctggggccaa 420 gggacaatgg tcaccgtctc tagt 444 <210> 9 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.74.3 Light chain V region (Vk, 1-012/02) <400> 9 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagcg atttaaattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagtccctaa gctcctgatc tatgttgcat ccagtttgca aaatggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacggagtt acagtacccc tcccactttc 360 ggccctggga ccaaagtgga tatcaaa 387 <210> 10 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.74.3 Heavy chain V region (Vh, VG1-02)- huIgG2 C region <400> 10 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatac actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca 240 cagaagtttc agggcagggt caccatgacc agggacacgt ccatcagcac agcctacatg 300 gagctgagca ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agaactggaa 360 ctacgctact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctctagt 417 <210> 11 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.75.1 Light chain V region (Vk, 1-A30) <400> 11 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtttcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacagcatg atagttaccc gctcactttc 360 ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaa 387 <210> 12 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.75.1 Heavy chain V region (Vh, VG4-31)- huIgG2 C region <400> 12 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtggttact actggagctg gatccgccag 180 cacccaggga agggcctgga gtggattggg tacatctatt acagtgggag cacctactac 240 aacccgtccc tcaagagtcg agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300 ctgaaggtga gctctgtgac tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagaccca 360 ctatggttcg gggagttcga ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 accgtctcta gt 432 <210> 13 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.4.4 Light chain V region (Vk, 4-B3) <400> 13 atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg tgcctacggg 60 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 120 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta ttcagctcca acaataagaa ttacttagct 180 tggtatcagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca tttactgggc atctacccgg 240 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttagtcct 360 ccgtggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 399 <210> 14 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.4.4 Heavy chain V region (Vh, VG 4-31)- huIgG2 C region <400> 14 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatggat cctgtcccag 60 gtgcagctga aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtgtttact actggagctg gatccgccag 180 cacccaggga agggcctgga gtggattggg tacttctatt atagtgggaa cacctaccac 240 aacccgtccc tcaagagtcg agtgaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga gctctgtgac tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgt 360 agtggctacg atcaccctga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 420 tctagt 426 <210> 15 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.12.1 Light chain V region (Vk, 3-L2/L16) <400> 15 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttgac agcaacttag cctggtaccg gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggactgag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatattaact ggcctccgat caccttcggc 360 caagggacac gactggagat taaa 384 <210> 16 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.12.1 Heavy chain V region (Vh4-59)- huIgG2 C region <400> 16 atgaaacacc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagtatt tactactgga gctggatccg gcagccccca 180 gggaagggac tggagtggat tgggtatgtc tattacagtg ggagcaccaa ttacaacccc 240 tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgaactctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgagagg gggatacgat 360 ttttggagtg gttattttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagt 417 <210> 17 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.40.1 Light chain V region (Vk, 1A20) <400> 17 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagggc attagaaatg atttaggctg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa gcgcctgatc tatgttgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagaattca ctctcacaat cagcagcctg 300 cagcctgaag attttgcaac ttattactgt ctacaacata atagttaccc gctcactttc 360 ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaa 387 <210> 18 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.40.1 Heavy chain V region (Vh, VG 4-31)- huIgG2 C region <400> 18 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt ggtggttact actggagctg gatccgtcag 180 cacccaggga agggcctgga gtggattggg aacatctatt acagtgggat cacctactac 240 aacccgtccc tcaagagtcg agttaccatg tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc 300 ctgaagctga gttctgtgac tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatccc 360 ctctacggtg actacgggtt cgacccctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctctagt 420 <210> 19 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 3.10.1 Light chain V region (Vk, 3-L2/L16) <400> 19 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccactgga 60 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctcctgggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catgtatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctccgat caccttcggc 360 caagggacac gactggagat taaa 384 <210> 20 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 3.10.1 Heavy chain V region (Vh, VG 4-34)- huIgG1 C region <400> 20 atgaaacacc tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctac agcagtgggg cgcaggactg ttgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcgctgtct atggtgggtc cttcagtact tactactgga gctggatccg ccagccccca 180 gggaaggggc tggagtggat tggggaaatc aatcatagtg gaagcaccaa ctacaacccg 240 tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagctctg tgaccgccgc ggacacggct gtgtattact gtgcgagagg ggggtacgat 360 ttttggagtg gttattatga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctctagt 417 <210> 21 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human Kappa Constant Region <400> 21 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttga 324 <210> 22 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human IgG1 Constant Region <400> 22 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 23 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human IgG2 Constant Region <400> 23 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaatg a 981 <210> 24 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.24.1 Light chain V region (Vk, 1-L15) <400> 24 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Ala Asn Gly Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 25 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.24.1 Heavy chain V region (Vh, H3-11)-huIgG2 C region <400> 25 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Glu Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Val Leu Phe 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 26 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.29.1 Light chain V region (Vk, 4-B3) <400> 26 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Asp Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Phe Tyr Ser Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys 130 <210> 27 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.29.1 Heavy chain V region (Vh, 3-33)- huIgG2 C region <400> 27 Met Glu Phe Gly Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 28 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.60.1 Light chain V region (Vk, 1-A20) <400> 28 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Val Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn 100 105 110 Tyr Asn Ser Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 29 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.60.1 Heavy chain V region (Vh, H1-02)- huIgG2 C region <400> 29 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 30 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.61.3 Light chain V region (Vk, 1-018/08) <400> 30 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 31 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.61.3. Heavy chain V region (Vg, 4-31)- huIgG2 C region <400> 31 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His Leu His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly 115 120 125 Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 130 135 140 Thr Val Ser Ser 145 <210> 32 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.74.3 Light chain V region (Vk, 1-012/02) <400> 32 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Asn Ser Asp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg 100 105 110 Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 115 120 125 Lys <210> 33 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.74.3 Heavy chain V region(Vh, VG1-02)-huIgG2 C region <400> 33 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 34 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.75.1 Light chain V region (Vk, 1-A30) <400> 34 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 35 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 1.75.1 Heavy chain V region (Vh, VG4-31)-huIgG2 C region <400> 35 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Val Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Trp Phe Gly Glu Phe Asp Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 36 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.4.4 Light chain V region (Vk, 4-B3) <400> 36 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Leu Phe Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Ser Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys 130 <210> 37 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.4.4 Heavy chain V region (Vh, VG 4-31)-huIgG2 C region <400> 37 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Val Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Phe Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr His 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Gly Tyr Asp His Pro Asp Ala 115 120 125 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 38 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.12.1 Light chain V region (Vk, 3-L2/L16) <400> 38 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Asp Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 39 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.12.1 Heavy chain V region (Vg, 4-59)- huIgG2 C region <400> 39 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ile Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 40 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.40.1 Light chain V region (Vk, 1A20) <400> 40 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys <210> 41 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 2.40.1 Heavy chain V region (Vh, VG 4-31)-huIgG2 C region <400> 41 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Leu Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Asp 115 120 125 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 42 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 3.10.1 Light chain V region (Vk, 3-L2/L16) <400> 42 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn 100 105 110 Asn Trp Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 43 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic HGF 3.10.1 Heavy chain V region (Vh, VG 4-34)-huIgG1 C region <400> 43 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human Kappa Constant Region <400> 44 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 45 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human IgG1 Constant Region <400> 45 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Human IgG2 Constant Region <400> 46 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic t-cell epitope peptide <400> 47 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys 1 5 10 15 Lys Cys <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(23) <223> a, t, c or g <400> 48 ggccggatag gcctccannn nnnt 24 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 ggacactgac atggactgaa ggagta 26 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ggggtcaggc tggaactgag g 21 <210> 51 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 acaacaaagc ttctagacca ccatggaagc cccagctcag cttctctt 48 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ggacactgac atggactgaa ggagta 26 <210> 54 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 agcagaagct tctagaccac catgaaacac ctgtggttct tcctcctc 48 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gtggaggcac tagagacggt gaccagggtt cc 32 <210> 56 <211> 1043 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic pI/hCh1 heavy chain nucleotide sequence <400> 56 tctagaccac cgccatgggt gaaaattgaa tcgtctctag tgcctccacc aagggcccat 60 cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct 120 gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga 180 ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca 240 gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc 300 acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc 360 acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc 420 ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg 480 tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 540 tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca 600 gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct 660 ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc 720 gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca 780 gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 840 atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 900 tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 960 catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt 1020 ctccgggtaa atgataagtc gac 1043 <210> 57 <211> 540 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (2)..(520) <400> 57 c ccc acc atg gtg cac gca acc tcc ccg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctc 49 Pro Thr Met Val His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 agc ctg gct ctg gtg gct ccc ggc ctc tct gcc aga aag tgc tcg ctg 97 Ser Leu Ala Leu Val Ala Pro Gly Leu Ser Ala Arg Lys Cys Ser Leu 20 25 30 act ggg aaa tgg acc aac gat ctg ggc tcc aac atg acc atc ggg gct 145 Thr Gly Lys Trp Thr Asn Asp Leu Gly Ser Asn Met Thr Ile Gly Ala 35 40 45 gtg aac agc aaa ggt gaa ttc aca ggc acc tac acc aca gcc gta aca 193 Val Asn Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Thr Tyr Thr Thr Ala Val Thr 50 55 60 gcc aca tca aat gag atc aaa gag tca cca ctg cat ggg aca caa aac 241 Ala Thr Ser Asn Glu Ile Lys Glu Ser Pro Leu His Gly Thr Gln Asn 65 70 75 80 acc atc aac aag agg acc cag ccc acc ttt ggc ttc act gtc aat tgg 289 Thr Ile Asn Lys Arg Thr Gln Pro Thr Phe Gly Phe Thr Val Asn Trp 85 90 95 aag ttt tca gag tcc acc act gtc ttc acg ggc cag tgc ttc ata gac 337 Lys Phe Ser Glu Ser Thr Thr Val Phe Thr Gly Gln Cys Phe Ile Asp 100 105 110 agg aac ggg aag gag gtc ctg aag acc atg tgg ctg ctg cgg tca agt 385 Arg Asn Gly Lys Glu Val Leu Lys Thr Met Trp Leu Leu Arg Ser Ser 115 120 125 gtt aat gac att ggt gat gac tgg aaa gct acc agg gtc ggc atc aac 433 Val Asn Asp Ile Gly Asp Asp Trp Lys Ala Thr Arg Val Gly Ile Asn 130 135 140 atc ttc act cgc ctg cgc aca cag aag gag cag ctg cta gca agc ttg 481 Ile Phe Thr Arg Leu Arg Thr Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ala Ser Leu 145 150 155 160 cta gcg gcc gct cga ggc cgg caa ggc cgg atc cag aca tgataagata 530 Leu Ala Ala Ala Arg Gly Arg Gln Gly Arg Ile Gln Thr 165 170 cattgatgag 540 <210> 58 <211> 540 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 58 ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc cggccttgcc ggcctcgagc ggccgctagc 60 aagcttgcta gcagctgctc cttctgtgtg cgcaggcgag tgaagatgtt gatgccgacc 120 ctggtagctt tccagtcatc accaatgtca ttaacacttg accgcagcag ccacatggtc 180 ttcaggacct ccttcccgtt cctgtctatg aagcactggc ccgtgaagac agtggtggac 240 tctgaaaact tccaattgac agtgaagcca aaggtgggct gggtcctctt gttgatggtg 300 ttttgtgtcc catgcagtgg tgactctttg atctcatttg atgtggctgt tacggctgtg 360 gtgtaggtgc ctgtgaattc acctttgctg ttcacagccc cgatggtcat gttggagccc 420 agatcgttgg tccatttccc agtcagcgag cactttctgg cagagaggcc gggagccacc 480 agagccaggc tgagcagcag cagcagcagc agcggggagg ttgcgtgcac catggtgggg 540 <210> 59 <211> 173 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 59 Pro Thr Met Val His Ala Thr Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 61 Lys Ser Ser Gln Ser Ile Phe Tyr Ser Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 62 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 62 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 63 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 64 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 65 Arg Ala 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Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 70 Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 71 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 72 Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 73 Gly Ala Ser Asp Leu Glu Thr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 74 Val Ala Ser Ser Leu Gln Asn 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 75 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 76 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 77 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 78 Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 79 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 80 Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 81 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 82 Gln Asn Tyr Asn Ser Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 83 Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr Asn 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 84 Gln Arg Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 85 Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 86 Gln Gln Tyr Phe Ser Pro Pro Trp Thr 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 87 Gln Gln Tyr Ile Asn Trp Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 88 Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic light chain variable region CDR peptide <400> 89 Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 90 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 91 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 92 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 92 Gly Tyr Tyr Ile Asn 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 93 Ser Asp Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 94 Gly Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 95 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 96 Ser Gly Val Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 97 Ile Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 98 Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 99 Thr Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 100 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 100 Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 101 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 102 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 103 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 103 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 104 Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 105 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 105 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 106 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 106 Tyr Phe Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr His Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 107 Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 108 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 108 Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 109 Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 110 Asp Glu Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Val Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 111 Glu Asp Tyr Gly Glu Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 112 Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 113 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 113 Ser His Leu His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ala 1 5 10 15 Phe Asp Ile <210> 114 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 114 Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 115 Asp Pro Leu Trp Phe Gly Glu Phe Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 116 Asp Arg Ser Gly Tyr Asp His Pro Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 117 Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 118 Asp Pro Leu Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 119 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic heavy chain variable region CDR peptide <400> 119 Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 120 <211> 279 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp 20 25 30 His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn 35 40 45 Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr 50 55 60 Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val 65 70 75 80 Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu 85 90 95 Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys 100 105 110 Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser 115 120 125 Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe 130 135 140 Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys 145 150 155 160 Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr 165 170 175 Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys 180 185 190 Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile 195 200 205 Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr 210 215 220 Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly 225 230 235 240 Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile 245 250 255 Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu 260 265 270 Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 275 <210> 121 <211> 278 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 121 Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp 20 25 30 His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn 35 40 45 Gly Ile Pro Thr Gln Thr Thr Val Gly Trp Met Val Ser Leu Lys Tyr 50 55 60 Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val 65 70 75 80 Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ala Arg Asn Lys Asp Leu Lys Asp 85 90 95 Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Glu Arg Gly Glu Glu 100 105 110 Lys Arg Lys Gln Ile Leu Asn Ile Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu 115 120 125 Gly Ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro Ala Ile Leu Asp 130 135 140 Asn Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Ser Tyr Gly Cys Thr Ile Pro 145 150 155 160 Glu Lys Thr Thr Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile 165 170 175 Asn Ala Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn 180 185 190 Glu Lys Cys Ser Gln His His Gln Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser 195 200 205 Glu Leu Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly 210 215 220 Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Ile Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val 225 230 235 240 Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro 245 250 255 Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Val 260 265 270 Ile Leu Thr Tyr Lys Leu 275 <210> 122 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (55)..(55) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(92) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (108)..(108) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(114) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(145) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (154)..(154) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (178)..(178) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (200)..(200) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <400> 122 Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro 1 5 10 15 Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp 20 25 30 His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn 35 40 45 Gly Ile Pro Thr Xaa Thr Xaa Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Lys Tyr 50 55 60 Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val 65 70 75 80 Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ala Arg Xaa Xaa Asp Leu Lys Asp 85 90 95 Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Xaa Arg Gly Asp Glu 100 105 110 Lys Xaa Lys Gln Ile Leu Asn Ile Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu 115 120 125 Gly Ser Asp Leu Val Leu Leu Lys Leu Ala Arg Pro Ala Ile Leu Asp 130 135 140 Xaa Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Xaa Tyr Gly Cys Thr Ile Pro 145 150 155 160 Glu Lys Thr Ser Cys Ser Ile Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile 165 170 175 Asn Xaa Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn 180 185 190 Glu 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 atgcgtctcg cgtttctcat ctcctcttcc gt 32 <210> 131 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 atgcgtctca aacgcaaaca ggttctcaat gttt 34 <210> 132 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 atgcgtctcc tttcgtggac atcatgaatt ccaa 34 <210> 133 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 atgcgtctcc gaaagaggag atgagaaatg caaa 34 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gagcagctgc tagcaagctt gcta 24 <210> 135 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 atgcgtctca gagacttgaa agactatgaa gcttg 35 <210> 136 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 atgcgtctcg tctctggctg gaaaacattg tctt 34 <210> 137 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 atgcgtctca acaaagactt gaaagattat gaagcttg 38 <210> 138 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 atgcgtctct ttgtttcgag aagggaaaca ctgtcg 36 <210> 139 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 atgcgtctca agcttgccag gcctgctgt 29 <210> 140 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 atgcgtctca agcttcagta aaaccaagtc tga 33 <210> 141 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 atgcgtctca agcttgctcg acctgcaatc 30 <210> 142 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 atgcgtctca agcttcatta aaaccagatc tga 33 <210> 143 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 atgcgtctca agcttgccag gcctgctgt 29 <210> 144 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 atgcgtctca agcttcagta aaaccaagtc tga 33 <210> 145 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 atgcgtctca agcttgctcg acctgcaatc 30 <210> 146 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 atgcgtctca agcttcatta aaaccagatc tga 33 <210> 147 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 atgcgtctct aggatggatg gttagtttga gat 33 <210> 148 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 atgcgtctca tcctactgtt gtttgtgttg gaat 34 <210> 149 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 atgcgtctct aggatggatg gttagtttga aata 34 <210> 150 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 atgcgtctca tcctatgttt gttcgtgttg g 31 <210> 151 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 atgcgtctca tgcatccaag gtcaaggaga ag 32 <210> 152 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 atgcgtctca tgcattcagt tgtttccata gg 32 <210> 153 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 atgcgtctca tgcatgacct gcaatgggga g 31 <210> 154 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 atgcgtctca tgcattcaac ttctgaacac tga 33 <210> 155 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 atgcgtctca tgcatcattg gtaaaggacg c 31 <210> 156 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 atgcgtctca tgcagtttct aatatagtct ttgttttc 38 <210> 157 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 atgggatccc tatgactgtg gtaccttata tg 32 <210> 158 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 atgcggccgc acaaaggaaa agaagaaata caattc 36 <210> 159 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 cgggatcctt acaacttgta tgtcaaaatt ac 32 <210> 160 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 atgatggcgg ccgctcagaa gaaaagaaga aatacacttc 40 <210> 161 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg His Gly Arg 1 5 10 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Gly Ile Pro Thr Arg Thr His Gly Arg 1 5 <210> 163 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Val Asn Thr Leu Asp Gln 1 5 <210> 164 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser 1 5 10 15 Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu 20 25 30 Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg 50 55 60 <210> 165 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr 1 5 10 15 Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val 20 25 30 Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu 35 40 45 Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg 50 55 <210> 166 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Light chain CDR1 consensus sequence (CDR1a) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> lysine, arginine, or glutamine <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> serine or alanine <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> serine, glycine, or aspartic acid <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> valine or isoleucine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> leucine or phenylalanine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> phenylalanine, tyrosine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> serine or not present <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> asparagine, threonine, or not present <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> asparagine, isoleucine, or valine <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> lysine, arginine, asparagine, or aspartic acid <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> asparagine or serine <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> tyrosine, aspartic acid, tryptophan, or asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> alanine, glycine, or asparagine <400> 166 Xaa Xaa Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Xaa <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Light chain CDR2 consensus sequence (CDR2a) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> tryptophan, alanine, valine, glutamic acid, or glycine <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> threonine, serine, or aspartic acid <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> arginine or leucine <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> glutamic acid, glutamine, or alanine <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> serine, asparagine, or threonine <400> 167 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Light chain CDR3 consensus sequence (CDR3a) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> glutamine or leucine <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> glutamine, asparagine, or arginine <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> tyrosine, histidine, alanine, or serine <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> phenylalanine, tyrosine, aspartic acid, asparagine, or isoleucine <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> serine, glycine, or asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> proline, tyrosine, threonine, phenylalanine, aspartic acid, leucine, or tryptophan <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> proline or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> tryptophan, leucine, proline, tyrosine, or isoleucine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> threonine or asparagine <400> 168 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Heavy chain CDR1 consensus sequence (CDR1b) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> serine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> aspartic acid or glycine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> aspartic acid, glycine, serine, valine, threonine, or isoleucine <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> tyrosine or glycine <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> isoleucine, methionine, or tryptophan <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> histidine, asparagine, or serine <400> 169 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 170 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Heavy chain CDR2 consensus sequence (CDR2b) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> tryptophan, tyrosine, valine, asparagine, or glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> isoleucine, phenylalanine, or valine <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> asparagine, serine, tryptophan, or tyrosine <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> proline, serine, tyrosine, or histidine <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> asparagine, serine, or aspartic acid <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> serine or glycine <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> glycine or serine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> glycine, threonine, aspartic acid, serine, isoleucine, or asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> threonine, isoleucine, or lysine <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> asparagine or tyrosine <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> tyrosine or histidine <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> alanine or asparagine <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> glutamine, aspartic acid, or proline <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> lysine or serine <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> phenylalanine, valine, or leucine <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> glutamine or lysine <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> glycine or serine <400> 170 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 171 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Heavy chain CDR3 consensus sequence (CDR3b) <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> glutamic acid, aspartic acid, serine, or glycine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> leucine, glutamic acid, aspartic acid, histidine, proline, or glycine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> glutamic acid, tyrosine, or leucine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> leucine, asparagine, glycine, histidine, tyrosine, or tryptophan, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> arginine, serine, glutamic acid, tyrosine, glycine, or phenylalanine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> glycine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> tryptophan or tyrosine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> aspartic acid or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> serine or arginine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> serine or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> glycine or tyrosine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> tyrosine, glutamic acid, or aspartic acid, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> tyrosine, phenylalanine, or aspartic acid, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> tyrosine, aspartic acid, histidine, or tryptophan, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> tyrosine, glycine, aspartic acid, proline, or serine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (16) <223> glycine, valine, tyrosine, or aspartic acid, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> leucine, alanine, glycine, or tyrosine, or is not present <220> <221> MOD_RES <222> (18) <223> methionine, phenylalanine, or tyrosine <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> valine, tyrosine, isoleucine, or proline <400> 171 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Asp Xaa 20 <210> 172 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn 1 5 10 <210> 173 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 173 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Phe Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 174 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 174 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Phe Tyr Ser 20 25 30 Ser Thr Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 175 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 175 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asp Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 176 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 176 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 177 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 177 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gly Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 178 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 178 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn Ser Asp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 179 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 179 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Asp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 180 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 180 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Asp Gln Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 181 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 181 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 182 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain protein sequence <400> 182 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 183 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic kappa light chain consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(34) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(38) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (100)..(100) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(103) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <400> 183 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Xaa Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Xaa Ser Xaa Pro Xaa Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 Ile Lys <210> 184 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 184 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 185 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 185 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Glu Leu Arg Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val 115 <210> 186 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 186 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Glu Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Val Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 <210> 187 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val 115 <210> 188 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 188 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser His Leu His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 115 120 125 <210> 189 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 189 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Pro Leu Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 <210> 190 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 190 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Val Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Pro Leu Trp Phe Gly Glu Phe Asp Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 <210> 191 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 191 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Val Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Phe Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr His Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Ser Gly Tyr Asp His Pro Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 115 120 <210> 192 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 192 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val 115 <210> 193 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain protein sequence <400> 193 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val 115 <210> 194 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic gamma heavy chain consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(32) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(58) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (102)..(112) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (114)..(114) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> Undetermined consensus residue; variable amino acid <400> 194 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Xaa 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Xaa Xaa 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Xaa Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Tyr Xaa Gly Xaa Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125

Claims (107)

1. 삭제
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15. 다음의 (a) 내지 (j) 중에서 선택한, 간세포 성장인자(HGF)와 결합할 수 있는 분리된 항체

    (a) SEQ ID NO: 60 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 70 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 80 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 90 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 100 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 110 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (b) SEQ ID NO: 61 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 71 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 81 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 91 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 101 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 111 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (c) SEQ ID NO: 62 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 72 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 82 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 92 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 102 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 112 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (d) SEQ ID NO: 63 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 73 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 83 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 93 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 103 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 113 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (e) SEQ ID NO: 64 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 74 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 84 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 94 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 104 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 114 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (f) SEQ ID NO: 65 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 75 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 85 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 95 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 105 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 115 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (g) SEQ ID NO: 66 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 76 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 86 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 96 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 106 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 116 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (h) SEQ ID NO: 67 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 77 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 87 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 97 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 107 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 117 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;

    (i) SEQ ID NO: 68 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 78 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 88 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 98 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 108 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 118 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체; 및

    (j) SEQ ID NO: 69 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, SEQ ID NO: 79 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 89 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3 을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 99 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, SEQ ID NO: 109 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 SEQ ID NO: 119 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3 을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
16. 삭제
17. 삭제
18. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 141 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
19. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 133 으로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 137 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
20. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 29 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
21. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 30 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 31 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 148 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
22. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 33 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
23. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 144 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
24. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 36 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 133 으로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 37 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 142 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
25. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 38 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 128 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 39 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
26. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 40 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 41 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 140 으로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
27. 제 15 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 42 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 128 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 43 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
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33. 삭제
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39. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄는 링커에 의해 연결됨을 특징으로 하는 항체.
40. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-Fv 항체임을 특징으로 하는 항체.
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42. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 항체임을 특징으로 하는 항체.
43. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, Fab’항체임을 특징으로 하는 항체.
44. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, (Fab’)² 항체임을 특징으로 하는 항체.
45. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 완전 인간 항체임을 특징으로 하는 항체.
46. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체임을 특징으로 하는 항체.
47. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체임을 특징으로 하는 항체.
48. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 HGF 가 c-Met 수용체에 결합하는 것을 저해함을 특징으로 하는 항체.
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53. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 항체를 코드하는 분리된 핵산 분자.
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57. 제 53 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
58. 삭제
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61. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 분리된 세포주.
62. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 용인가능한 담체를 포함하는 암을 치료하기 위한 조성물이되, 암은 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암 중에서 선택한 조성물.
63. 삭제
64. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 항체 및 다음 중에서 선택한 적어도 하나의 제제를 포함하는 암을 치료하기 위한 조성물이되, 암은 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암 중에서 선택한 조성물

    아니사마이신(anisamycin) 항생물질의 겔다나마이신(geldanamycin) 군의 구성요소(member) ; Grb2 Src 상동성 2 의 길항물질 ; Gab1 조절인자 ; 우성(dominant)-음성 Src ; 폰-힙펠-린도우(Von-Hippel-Landau) 저해제 ; 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAID) ; COX-2 저해제 ; Celebrex™ (셀레콕시브) ; Vioxx™ (로페콕시브) ; 혈관 내피 성장인자(VEGF) ; VEGF 조절인자 ; 섬유아세포 성장인자(FGF) 조절인자 ; 표피 성장인자(EGF) 조절인자 ; 케라티노사이트 성장인자(KGF) ; KGF-관련 분자 ; KGF 조절인자 ; 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP) 조절인자 ; IL-2 ; 프로루킨(Proluekin) ; 허셉틴(Herceptin) ; 리툭산(Rituxan) ; 제발린(Zevalin) ; 에르비툭스(Erbitux) ; 에프라투주맵(epratuzumab) ; OPGL 에 결합하는 항체 ; Ang-2 의 저해제 ; VEGF-2 에 결합하는 항체 ; 아바스틴(avastin) ; 항종양제 ; 항유사분열제 ; 항대사물질 ; 및 알킬 술포네이트.
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82. 제 15 항 및 제 18 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 항체와 시료를 접촉시킴을 포함하는, 상기 시료에서 간세포 성장인자(HGF)의 수준을 검출하는 방법.
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97. 다음의 (a) 내지 (j) 중에서 선택한 적어도 하나의 항체와 HGF 에 결합하는 것에 대해 경쟁하며, HGF 가 c-Met 에 결합하는 것을 중화할 수 있는 분리된 항체

    (a) SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 141 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (b) SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 133 으로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 137 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (c) SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 29 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (d) SEQ ID NO: 30 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 31 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 148 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (e) SEQ ID NO: 32 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 33 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (f) SEQ ID NO: 34 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 35 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 144 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (g) SEQ ID NO: 36 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 133 으로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 37 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 142 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (h) SEQ ID NO: 38 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 128 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 39 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;

    (i) SEQ ID NO: 40 의 아미노산 서열 잔기 23 내지 잔기 129 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 41 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 140 으로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및

    (j) SEQ ID NO: 42 의 아미노산 서열 잔기 21 내지 잔기 128 로 이루어진 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 43 의 아미노산 서열 잔기 20 내지 잔기 139 로 이루어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
98. 삭제
99. 제 15 항, 제 18 항 내지 제 27 항 및 제 97 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 환자의 암을 치료하기 위한 약학적 조성물이되, 조성물은 적어도 하나의 화학요법 치료와 병용하여 환자에게 투여되며 암은 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암 중에서 선택한 약학적 조성물.
100. 제 99 항에 있어서, 조성물은 화학요법 치료를 투여하기 전에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
101. 제 99 항에 있어서, 조성물은 화학요법 치료 투여와 동시에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
102. 제 99 항에 있어서, 조성물은 화학요법 치료 투여 후에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
103. 제 15 항, 제 18 항 내지 제 27 항 및 제 97 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 환자의 암을 치료하기 위한 약학적 조성물이되, 조성물은 방사선 치료와 병용하여 환자에게 투여되며 암은 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상선 암종 및 방광의 이행상피암 중에서 선택한 약학적 조성물.
104. 제 103 항에 있어서, 조성물은 방사선 치료 투여 전에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
105. 제 103 항에 있어서, 조성물은 방사선 치료 투여와 동시에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
106. 제 103 항에 있어서, 조성물은 방사선 치료 투여 후에 투여함을 특징으로 하는 조성물.
107. 제 15 항, 제 18 항 내지 제 27 항 및 제 97 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, Met 수용체 티로신 키나제(Met)에 HGF 가 결합하는 것을 저해하는 조성물.

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