CN103755807A - 肝细胞生长因子的特异性结合物 - Google Patents

肝细胞生长因子的特异性结合物 Download PDF

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Abstract

本发明描述与肝细胞生长因子(HGF)相互作用的特异性结合物。本发明还描述通过给予药物有效量的HGF特异性结合物治疗癌症的方法。本发明描述还描述用HGf特异性结合物检测样品中HGF的量的方法。

Description

肝细胞生长因子的特异性结合物
本申请是申请日为2004年7月16日，申请号为200480026298.8(PCT／US2004／018936)，发明名称为“肝细胞生长因子的特异性结合物”的发明专利申请的分案申请。 
本申请要求2003年7月18日提交的美国临时申请号60／488,681的权利，对于任何目的其通过引用结合到本文中。 
发明领域
本发明涉及结合肝细胞生长因子(HGF)的特异性结合物。本发明还描述了组合物、所述组合物的生产方法以及治疗各种病症的方法，所述病症例如某些类型的癌症，包括但不限于实体瘤和血液恶性癌症(hematologic malignancies)。 
发明背景 
肝细胞生长因子(HGF)已被鉴定为肝细胞的有效促分裂原。HGF还被鉴定为成纤维细胞和平滑肌的分泌性蛋白，其诱导上皮细胞的运动性。HGF在文献中也称为分散因子(SF)。 
HGF是主要由间充质细胞产生的多功能异源二聚体多肽，其充当Met受体酪氨酸激酶(Met)的配体。人Met受体也称为“c-met”。已显示通过Met受体酪氨酸激酶-HGF(Met-HGF)途径的信号转导导致一系列细胞应答，包括但不限于增殖(有丝分裂)、分散(运动性)、通过基质刺激细胞运动(侵袭)和分支形态发生。体内Met-HGF信号转导途径(Met-HGF)在例如神经诱生、肝再生、伤口愈合、血管生成、生长、侵袭、形态分化和正常胚胎发育中起到作用。除这些功能之外， Met-HGF对在人类癌症中也起到作用。已显示异常Met-HGF信号转导参与肿瘤发生，特别是参与侵袭性和转移性表型的发展。已发现某些病原体如疟疾利用异常Met-HGF信号转导。参见Carrolo等，Nat Med.20039(11)：1363-9(2003年10月12日)，对于任何目的其内容通过引用结合到本文中。 
此外，一些研究小组报告说，HGF在血管生成和在血管生成相关疾病(如增殖性糖尿病性视网膜病)中起到作用。参见例如Grant，D.S.等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.90(5)1937-41(1993)；Bussolino等，J.Cell Biol.，119(3)：629-641(1992)；Montesano等，Cell，67：901-908(1991)；Canon等，Br.J.Ophthalmol.84(7)：732-5(2000)。HGF在凋亡或者说程序性细胞死亡中也可能起到作用。当正常调节机制未能维持增殖和凋亡之间的平衡，从而导致细胞过量积累时，即可产生肿瘤。取决于生物背景，HGF不但可实现增殖，而且可实现凋亡。 
因为HGF参与许多生理过程，在某些情况下，拥有能调节其活性的分子是有益的。例如，在某些情况下，这种分子可用于治疗各种不同类型的癌症。 
发明概述 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的分离多肽。 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、 天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR)的分离多肽 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸； 氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸n选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
在某些实施方案中，本发明提供分离的特异性结合物，其中所述特异性结合物包含： 
(i)包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的第一多肽 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述第一多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)； 
(ii)包含至少一个选自CDR1b、CDR2b或CDR3b的互补决定区(CDR)的第二多肽 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不 存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述第二多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一种选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列的分离多肽。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一种选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列的分离多肽。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一种选自SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17和19的核苷酸序列的分离核酸分子。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一种选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18和20的核苷酸序列的分离核酸分子。 
在某些实施方案中，本发明提供编码包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的多肽的分离核酸分子 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选 自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸、氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。 
在某些实施方案中，本发明提供编码包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR)的多肽的分离核酸分子 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸； 氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸1′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
在某些实施方案中，本发明提供产生选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体 的分离细胞系。 
在某些实施方案中，本发明提供抑制HGF结合Met的方法，所述方法包括给予HGF特异性结合物。 
在某些实施方案中，本发明提供包含至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的多肽。 
在某些实施方案中，本发明提供基本由至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列组成的多肽。 
在某些实施方案中，本发明提供能够结合至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的特异性结合物。 
在某些实施方案中，本发明提供能够结合至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的抗体或抗原结合域。 
在某些实施方案中，本发明提供获得能够结合肝细胞生长因子(HGF)的抗体的方法，所述方法包括将至少一种选自SEQ ID NO：164和165的多肽给予动物和从动物获得能够结合HGF的抗体。 
在某些实施方案中，本发明提供通过给予包含至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的多肽，来降低或防止特异性结合物结合肝细胞生长因子(HGF)的方法。 
在某些实施方案中，本发明提供通过给予由至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列组成的多肽，来降低或防止特异性结合物结合肝细胞生长因子(HGF)的方法。 
由本文提供的公开内容，本发明的其他实施方案将显而易见。 
本发明还涉及以下实施方案： 
1.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR) 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、 甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。 
2.实施方案1的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列。 
3.实施方案1的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：60，61，62，63，64，65，66，67，68和69的氨基酸序列。 
4.实施方案1的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：70，71，72，73，74，75，76，77，78和79的氨基酸序列。 
5.实施方案1的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：80，81，82，83，84，85，86，87，88和89的氨基酸序列。 
6.实施方案1-5中任一项的多肽，其中所述多肽是特异性结合物。 
7.实施方案1-5中任一项的多肽，其中所述多肽是抗体。 
8.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR) 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸 或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
9.实施方案8的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列。 
10.实施方案8的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：90，91，92，93，94，95，96，97，98和99的氨基酸序列。 
11.实施方案8的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：100，101，102，103，104，105，106，107，108和109的氨基酸序列。 
12.实施方案8的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：110，111，112，113，114，115，116，117，118和119的氨基酸序列。 
13.实施方案8-12中任一项的多肽，其中所述多肽是特异性结合物。 
14.实施方案8-12中任一项的多肽，其中所述多肽是抗体。 
15.一种分离的特异性结合物，其中所述特异性结合物包含： 
(i)包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的第一多肽 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨 基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸、氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述第一多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)； 
(ii)包含至少一个选自CDR1b、CDR2b或CDR3b的互补决定区(CDR)的第二多肽 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸 或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨 酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述第二多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
16.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列。 
17.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列。 
18.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：24和25的氨基酸序列。 
19.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：26和27的氨基酸序列。 
20.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：28和29的氨基酸序列。 
21.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：30和31的氨基酸序列。 
22.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：32和33的氨基酸序列。 
23.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：34和35的氨基酸序列。 
24.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：36和37的氨基酸序列。 
25.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：38和39的氨基酸序列。 
26.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：40和41的氨基酸序列。 
27.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含SEQ ID NO：42和43的氨基酸序列。 
28.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：60，61，62，63，64，65，66，67，68和69的氨基酸序列。 
29.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：70，71，72，73，74，75，76，77，78和79的氨基酸序列。 
30.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：80，81，82，83，84，85，86，87，88和89的氨基酸序列。 
31.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：90，91，92，93，94，95，96，97，98和99的氨基酸序列。 
32.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：100，101，102，103，104，105，106，107，108和109的氨基酸序列。 
33.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：110，111，112，113，114，115，116，117，118和119的氨基酸序列。 
34.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含 
包含第一可变区的重链，所述第一可变区包含选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列； 
包含第二可变区的轻链，所述第二可变区包含选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列。 
35.实施方案34的特异性结合物，其中所述特异性结合物具有至少一种选自以下的性质：a)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体竞争与HGF的结合；b)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体结合相同的HGF表位；和c)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体结合相同的抗原。 
36.实施方案15的特异性结合物，所述结合物包含 
包含第一可变区的重链，所述第一可变区包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列有至少90％、95％或99％的一致性； 
包含第二可变区的轻链，所述第二可变区包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列有至少90％、95％或99％的一致性。 
37.实施方案36的特异性结合物，其中所述特异性结合物具有至少一种选自以下的性质：a)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体竞争与HGF的结合；b)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体结合相同的HGF表位；和c)与至少一种选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体结合相同的抗原。 
38.实施方案15-37中任一项的特异性结合物，其中所述特异性结合物是抗体。 
39.实施方案38的抗体，其中重链和轻链通过连接基团连接。 
40.实施方案38的抗体，所述抗体为单Fv抗体。 
41.实施方案38的抗体，所述抗体为免疫功能性免疫球蛋白片段。 
42.实施方案38的抗体，所述抗体为Fab抗体。 
43.实施方案38的抗体，所述抗体为Fab'抗体。 
44.实施方案38的抗体，所述抗体为(Fab’)2抗体。 
45.实施方案38的抗体，所述抗体为完全人抗体。 
46.实施方案38的抗体，所述抗体为人源化抗体。 
47.实施方案38的抗体，所述抗体为嵌合抗体。 
48.实施方案38的抗体，其中所述抗体抑制HGF与c-Met受体的结合。 
49.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：24， 26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列。 
50.一种分离的多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列。 
51.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含至少一种选自SEQID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17和19的核苷酸序列。 
52.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含至少一种选自SEQID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18和20的核苷酸序列。 
53.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的多肽 
其中CDR1a包含氨基酸序列abcdefghijklmnopq，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺，苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺，异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺； 
其中CDR2a包含氨基酸序列rstuvwx，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸、氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸； 
其中CDR3a包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙 氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺； 
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。 
54.实施方案53的核酸分子，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，13，15，17和19的核苷酸序列。 
55.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR)的多肽 
其中CDR1b包含氨基酸序列abcdefg，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸； 
其中CDR2b包含氨基酸序列hijklmnopqrstuvwx，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺，丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸； 
其中CDR3b包含氨基酸序列yza′b′c′d′e′f′g′h′i′j′k′l′m′n′o′p′ q′r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺，甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f′是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸； 
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。 
56.实施方案55的核酸分子，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，18和20的核苷酸序列。 
57.一种宿主细胞，所述细胞包含实施方案53的核酸分子。 
58.一种宿主细胞，所述细胞包含实施方案55的核酸分子。 
59.一种分离的细胞系，所述细胞系产生实施方案34或36的特异性结合物。 
60.实施方案59的分离的细胞系，其中所述特异性结合物是抗体。 
61.一种分离的细胞系，所述细胞系产生选自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1的抗体。 
62.一种组合物，所述组合物包含实施方案34或36的特异性结合物及药物可接受载体。 
63.实施方案62的组合物，其中所述特异性结合物是抗体。 
64.一种组合物，所述组合物包含实施方案34或36的特异性结合物及至少一种选自以下的药物：安莎霉素抗生素的格尔德霉素家族的成员；Grb2Src同源物2的拮抗剂；Gab1调节剂；显性负性Src；von-Hippel-Landau抑制剂；非类固醇抗炎药物(NSAID)；COX-2抑制剂；CelebrexTM(塞来考昔)；VioxxTM(罗非考昔)；血管内皮生长因子(VEGF)；VEGF调节剂；成纤维细胞生长因子(FGF)调节剂；表皮生长因子(EGF)调节剂；角质形成细胞生长因子(KGF)；KGF相关分子；KGF调节剂；基质金属蛋白质酶(MMP)调节剂；IL-2；Proleukin；Herceptin；Rituxan；Zevalin；Erbitux；依帕珠单抗；抗OPGL抗体；Ang-2抑制剂；抗VEGF-2抗体；Avastin；抗肿瘤剂；抗有丝分裂剂；抗代谢物和磺酸烷基酯。 
65.实施方案64的组合物，其中所述特异性结合物是抗体。 
66.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案62的组合物。 
67.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案63的组合物。 
68.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案64的组合物。 
69.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案65的组合物。 
70.一种治疗患者的实体瘤的方法，所述方法包括给予实施方案62的组合物。 
71.一种治疗患者的实体瘤的方法，所述方法包括给予实施方案63的组合物。 
72.一种治疗患者的实体瘤的方法，所述方法包括给予实施方案64的组合物。 
73.一种治疗患者的实体瘤的方法，所述方法包括给予实施方案 65的组合物。 
74.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案34或36的特异性结合物及至少一种化疗治疗。 
75.实施方案74的方法，其中所述特异性结合物在给予化疗治疗之前给予。 
76.实施方案74的方法，其中所述特异性结合物在给予化疗治疗的同时给予。 
77.实施方案74的方法，其中所述特异性结合物在给予化疗治疗之后给予。 
78.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括给予实施方案34或36的特异性结合物及放疗。 
79.实施方案78的方法，其中所述特异性结合物在给予放疗之前给予。 
80.实施方案78的方法，其中所述特异性结合物在给予放疗的同时给予。 
81.实施方案78的方法，其中所述特异性结合物在给予放疗之后给予。 
82.一种检测样品中肝细胞生长因子(HGF)水平的方法，所述方法包括将样品与实施方案34或36的特异性结合物接触。 
83.实施方案82的方法，其中所述特异性结合物是抗体。 
84.一种抑制HGF与Met结合的方法，所述方法包括给予HGF特异性结合物。 
85.实施方案84的方法，其中所述特异性结合物是抗体。 
86.实施方案84的方法，其中所述特异性结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列。 
87.实施方案84的方法，其中所述特异性结合物包含至少一种选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列。 
88.一种多肽，所述多肽包含至少一种选自SEQ ID NO：164和 165的氨基酸序列。 
89.一种多肽，所述多肽基本由至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列组成。 
90.一种特异性结合物，所述结合物能够结合至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列。 
91.一种抗体或抗原结合域，其能够结合至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列。 
92.一种获得能够结合肝细胞生长因子(HGF)的抗体的方法，所述方法包括给予动物至少一种选自SEQ ID NO：164和165的多肽，并从该动物获得能够结合HGF的抗体。 
93.一种降低或防止任何一种实施方案18-27的特异性结合物与肝细胞生长因子(HGF)结合的方法，所述方法通过给予包含至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的多肽来进行。 
94.一种降低或防止任何一种实施方案18-27的多肽与肝细胞生长因子(HGF)结合的方法，所述方法通过给予由至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列组成的多肽来进行。 
95.一种降低或防止特异性结合物与肝细胞生长因子(HGF)结合的方法，所述方法通过给予包含至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列的多肽来进行。 
96.一种降低或防止特异性结合物与肝细胞生长因子(HGF)结合的方法，所述方法通过给予由至少一种选自SEQ ID NO：164和165的氨基酸序列组成的多肽来进行。 
附图简述 
图1A显示某些抗HGF抗体的κ轻链的进化系统树，说明它们的种系关系。种系基因标识标在抗体名称的右边。图1B显示某些抗HGF抗体的κ轻链可变区的氨基酸序列比对。种系基因标识标在左边。比对序列上的粗线表示CDR区。 
图2A显示某些抗HGF抗体的γ重链的进化系统树，说明它们的种系关系。种系基因标识标在抗体名称的右边。图2B显示某些抗HGF抗体的γ重链可变区的氨基酸序列比对。种系基因标识标在左边。比对序列上的粗线表示CDR区。 
图3显示编码某些抗HGF抗体的轻链和重链的可变区的DNA序列。对于每个序列，均标出抗体名称、种系标识和序列ID。下划线为天然信号肽序列。还显示人κ、IgG1和IgG2恒定区的DNA序列。 
图4显示某些抗HGF抗体的轻链和重链的可变区的氨基酸序列。对于每个序列，均标出抗体名称、种系标识和序列ID。下划线为天然信号肽序列。还显示人κ、IgG1和IgG2恒定区的氨基酸序列。 
图5显示某些抗HGF抗体的轻链和重链的互补决定区(CDR)的氨基酸序列。对于每个序列，均标出抗体名称和序列ID。图5A显示某些抗HGF抗体的轻链CDR的氨基酸序列，其中在图5A中： 
轻链CDR1共有序列(CDR1a)(SEQ ID NO：166)：a b c d e f g h i j k l m n o p q，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺 
轻链CDR2共有序列(CDR2a)(SEQ ID NO：167)：r s t u v w x，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸 
轻链CDR3共有序列(CDR3a)(SEQ ID NO：168)：y z a′ b′ c′ d′ e′ f′ g′ h′，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a′选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b′选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c′选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d′选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e′是脯氨酸；氨基酸f′是脯氨酸或者不存在；氨基酸g′是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h′是苏氨酸或天冬酰胺。 
图5B显示某些抗HGF抗体的重链CDR的氨基酸序列，其中在图5B中： 
重链cDR1共有序列(cDR1b)(SEQ ID NO：169)：a b c d e f g，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸 
重链cDR2共有序列(cDR2b)(SEQ ID NO：170)：h i j k l m n o p q r s t u v w x、其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸 
重链cDR3共有序列(cDR3b)(SEQ ID NO：171)：y z a′ b′ c′ d′ e′ f′ g′ h′ i′ j′ k′ l′ m′ n′ o′ p′ q′ r′，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a′选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b′选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸，组氨酸，酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c′选自精氨酸，丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d′是甘氨酸或者不存在；氨基酸e′选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g′选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h′是丝氨酸或者不存在；氨基酸i′选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j′选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k′选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l′选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m′选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n′选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o′选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p′选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q′是天冬氨酸；氨基酸r′选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸。 
图6显示实施例8中讨论的某些抗HGF抗体的KD测定结果。图6A显示动力学法所得数据。图6B显示平衡／溶液(equilibrium／solution)法所得数据。 
图7显示实施例8中讨论的蛋白质印迹的放射自显影图，所述蛋白质印迹测试某些抗体结合人HGF和结合小鼠HGF的能力。左边的图片(1-4道)显示在非还原条件下进行实验所得的放射自显影图。右边的图片(5-8道)显示在还原条件下进行实验所得的放射自显影图。 
图8显示实施例8中讨论的实验所得的荧光激活细胞分选仪(FACS)数据，所述实验评估某些抗体与某些靶标的结合。图8的上部显示无特异性结合物的对照样品FACS数据。图片1和2(左起)显示分别与FITC和PE孵育的无靶标的对照样品的数据。图片3和4显示分别包含FITC和PE标记的d5HGF、但无特异性结合物的对照样品 的数据。实线下面的图片显示测试五种抗HGF抗体的实验的FACS数据。对于每种抗体，第一个图片(左起)显示无靶标的对照样品的数据，第二至第四个图片显示其中靶标分别为人HGF、小鼠HGF和人d5HGF的实验的数据。 
图9A显示编码邻近多克隆位点的亲和素的质粒的示意图，如在实施例8中讨论，所述质粒用以产生包含亲和素和靶蛋白的融合蛋白。图9B显示鸡亲和素的序列。 
图10A和10B显示某些融合蛋白的示意图及实施例8C和8D讨论的使用这些融合蛋白的结合测定的结果。图10C显示某些含点突变、插入或缺失的融合蛋白的示意图。图10D显示人和小鼠HGF在氨基酸451-731区域中的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO.120和121)，同时标出相应的共有序列(SEQ ID NO.122)。 
图11A和11B显示实施例8E中讨论的人HGF的蛋白酶保护实验的HPLC分析结果。图11C显示该实验中通过结合抗体2.12.1而被保护免受蛋白酶解消化的肽的氨基酸序列。 
图12A-12D显示实施例8中讨论的竞争性结合测定的结果。 
图13显示实施例9中讨论的中和测定的IC50数据。 
图14显示实施例10中讨论的PC3细胞中和测定的数据。 
图15显示实施例10中讨论的U-87细胞抑制测定的数据。 
图16显示实施例11中讨论的实验的结果，所述实验评估某些抗HGF抗体对小鼠中U-87MG异种移植肿瘤的作用。图16A显示微量残留疾病(minimal residual disease)模型中抗体2.4.4对U-87MG异种移植肿瘤生长的剂量反应数据。图16B显示确立的疾病模型中抗体2.4.4对U-87异种移植肿瘤生长的剂量反应数据。图16C、16D、16E和16F显示U-87微量残留疾病模型(16C和16D)中或U-87确立的疾病模型(16E和16F)中检测抗HGF抗体的直接比较(head-to-head)实验的数据。 
某些示例性实施方案详述 
应当理解，以上概述和以下详述只是示例性和说明性的，并不是对要求保护的本发明进行限制。在本申请中，除非另有具体规定，使用单数形式包含复数含义。在本申请中，除非另有规定，使用“或(或者)”表示“和／或”。此外，使用术语“包括”及其其他形式如“包括的”并不表示限制意义。还有，除非另有具体规定，术语如“元件”或“组分”不但涵括包含一个单位的元件和组分，而且涵括包含不只一个亚单位的元件和组分。同样，使用术语“部分(portion)”可包括部分(moiety)的一部分(part)或者整个部分(moiety)。 
本文使用的段落标题只是为了组织目的，不能解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，对于任何目的通过引用整体清楚地结合到本文中。 
定义
重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)可使用标准技术。酶反应和纯化技术可按照厂商说明书，或者按照本领域的常规，或者按照本文的描述来进行。前述技术和方法通常可按照本领域公知的常规方法，或者按照本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体参考文献的描述来进行。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，对于任何目的其通过引用结合到本文中。除非提供了具体的定义，本文描述的涉及分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的所用术语以及实验室方法和技术是本领域公知和常用的。化学合成、化学分析、药物制备、制剂和传递以及患者治疗可使用标准技术。 
按照本发明公开内容进行使用的以下术语，除非另有指明，应理解为具有以下含义： 
术语“肝细胞生长因子”或“HGF”指Nakamura等，Nature342：440-443(1989)中提出的多肽或其片断以及相关多肽，包括但不限于等位变体、剪接变体、衍生变体、置换变体、缺失变体和／或插入变体、融合多肽和种间同源物。在某些实施方案中，HGF多肽包括末端残基，例如但不限于前导序列残基、靶向残基、氨基末端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、tag残基和／或融合蛋白残基。 
术语“特异性结合物”指特异性结合靶标的天然或非天然分子。特异性结合物的实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物。在某些实施方案中，特异性结合物是抗体。在某些实施方案中，特异性结合物是抗原结合区。 
术语“HGF特异性结合物”指特异性结合HGF的任何部分的特异性结合物。在某些实施方案中，HGF特异性结合物是抗HGF抗体。在某些实施方案中，特异性结合物是抗原结合区。 
术语“多克隆抗体”指结合同一抗原的不同表位的抗体的异质混合物。 
术语“单克隆抗体”指由同一核酸分子编码的一组抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体由单一杂交瘤或其他细胞系产生，或者由转基因哺乳动物产生。单克隆抗体通常识别同一表位。术语“单克隆”不限于任何具体的抗体产生方法。 
术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中抗体的一部分与具体物种或具体抗体类别的序列同源，但抗体的另一部分与不同物种或抗体类别的序列同源。参见例如美国专利第4,816,567号和Morrison等，Proc NatlAcadSci(USA)，81：6851-6855(1985)。 
术语“CDR移植抗体”指其中来自一种抗体的CDR插入到另一种抗体的构架中的抗体。在某些实施方案中，CDR的来源抗体和构架的来源抗体属不同的种。在某些实施方案中，CDR的来源抗体和构架的来源抗体属不同的同种型。 
术语“多特异性抗体”指其中两个或更多个可变区结合不 同表位的抗体。表位可以在相同或不同的靶标上。在某些实施方案中，多特异性抗体是识别相同或不同抗原上的两种不同表位的“双特异性抗体”。 
术语“催化抗体”指其中连接有一个或多个催化部分的抗体。在某些实施方案中，催化抗体是包含细胞毒部分的细胞毒抗体。 
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中抗体构架区的全部或部分来源于人，但一个或多个CDR区的全部或部分来源于另一物种，如小鼠。 
术语“完全人抗体”指其中CDR和构架均基本包含人序列的抗体。在某些实施方案中，完全人抗体在非人哺乳动物中产生，包括但不限于小鼠、大鼠和兔形目动物。在某些实施方案中，完全人抗体在杂交瘤细胞中产生。在某些实施方案中，完全人抗体重组产生。 
术语“抗独特型抗体”指特异性结合另一种抗体的抗体。 
术语“特异性结合”指特异性结合物以比其结合非靶标更大的亲和力结合靶标的能力。在某些实施方案中，特异性结合指结合靶标的亲和力是对非靶标的亲和力的至少10、50、100、250、500或1000倍大。在某些实施方案中，亲和力通过亲和ELISA测定来检测。在某些实施方案中，亲和力通过BIAcore测定来检测。在某些实施方案中，亲和力通过动力学法来检测。在某些实施方案中，亲和力通过平衡／溶液法来检测。 
术语“表位”指能够被特异性结合物结合的分子部分。在某些实施方案中，表位通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或碳水化合物侧链，且具有特异性三维结构特征以及特异性电荷特征。表位可以是连续的或者非连续的。在某些实施方案中，表位可以是模拟的，因为它们包含与用以产生抗体的表位相似的三维结构，但不包含或者只包含一些见于用以产生抗体的表位的氨基酸残基。 
术语“抑制和／或中和表位”指这样的表位，其当被特异性结合物结合时，导致体内、体外和／或原位生物活性下降。在某些实施 方案中，中和表位位于或者涉及靶标的生物活性区域。 
术语“激活表位”指这样的表位，其当被特异性结合物结合时，导致体内、体外和／或原位生物活性激活或维持。在某些实施方案中，激活表位位于或者涉及靶标的生物活性区域。 
本文所用的术语“分离多核苷酸”意指基因组、cDNA的多核苷酸，或者合成起源的多核苷酸，或者它们的某些组合，由于其来源，“分离多核苷酸”(1)与其中天然发现该分离多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分无关，(2)与其天然不相连的多核苷酸相连，或者(3)没有作为更大序列的一部分天然出现。 
本文所指的术语“分离蛋白”意指由cDNA、重组RNA编码或者合成来源的蛋白质，或者它们的某些组合，其(1)没有至少某些其通常发现与其伴随的蛋白质，(2)基本没有相同来源(例如相同物种)的其他蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，(4)在自然界中不出现。 
术语“多肽”在本文中用作普通术语，指天然蛋白质或这种蛋白质缺失、插入和／或置换天然序列的一个或多个氨基酸的修饰。在某些实施方案中，多肽缺失、插入和／或置换至少一个但不超过50、30、20、15、10、8、5或3个天然序列的氨基酸。 
本文所用的应用于某个对象的术语“天然”指该对象可在自然界中找到。例如，存在于可从自然界来源分离到的生物体(包括病毒)、且未被人们在实验室中或者以其他方式有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。 
本文所用的术语“有效连接”指组分处于允许它们以其预定方式发挥功能的关系之中。例如，与编码序列“有效连接”的控制序列如此连接，使得在与控制序列相容的条件下，编码序列的表达得以实现。 
本文所用的术语“控制序列”指可实现它们所连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。取决于宿主生物体，这种控制序列的种类可能不同。根据某些实施方案，原核生物的控制序列可包括 启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。根据某些实施方案，真核生物的控制序列可包括启动子、一种或多种增强子和转录终止序列。在某些实施方案中，“控制序列”可包括前导序列和／或融合伴侣序列(fusion partner sequence)。 
本文所指的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸。在某些实施方案中，碱基可为核糖核酸或脱氧核糖核酸或任何一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。 
本文所指术语“寡核苷酸”包括通过天然和／或非天然寡核苷酸键连接在一起的天然的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，通常包含200个碱基或更少碱基的长度。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为10-60个碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基。寡核苷酸可以是单链或双链，例如用于构建基因突变体。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。 
术语“天然核苷酸”包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“修饰核苷酸”包括带有修饰或取代糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)、氨基磷酸酯等。参见例如LaPlanche等，Nucl.Acids Res.，14：9081(1986)；Stec等，J.Am.Chem.Soc.，106：6077(1984)；Stein等，Nucl.Acids Res.，16：3209(1988)；Zon等，Anti-Cancer Drug Design，6：539(1991)；Zon等，Oligonucleotides and Analogs：A Practical Approach，第87-108页(F.Eckstein编辑，Oxford University Press，Oxford England(1991))；Stec等，美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman，Chemical Reviews，90：543(1990)，对于任何目的这些文献的公开内容通过引用结合到本文中。在某些实施方案中，寡核苷酸可包括用于检测的标记。 
可通过公知的方法容易地计算相关多肽的一致性和相似 性。这种方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.(编辑)，Oxford University Press，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.(编辑)，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of sequence Data，Part1，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.(编辑)，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.(编辑)，M.Stockton Press，New York(1991)；及Carillo等，SIAM J.AppliedMath.，48：1073(1988)。 
某些一致性测定方法被设计成在受试序列之间产生最大配对。一致性测定方法在可公开获得的计算机程序中有描述。测定两个序列之间一致性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.，12：387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))。BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源(BLAST手册，Altschul等NCB／NLM／NIH Bethesda，MD20894；Altschul等，出处同上(1990))公开获得。也可用著名的Smith Waterman算法测定一致性。 
某些用以比对两个氨基酸序列的比对方案可能导致两个序列中只有较短一段区域配对，而这个小的比对区域可具有非常高的序列一致性，尽管两个全长序列之间并没有显著的关系。因此，在某些实施方案中，选定的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。 
例如，使用GAP计算机算法(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，比对两个待测定序列一致性百分率的多肽，以对它们各自的氨基酸进行最佳配对(“配对范围”，由算法确定)。在某些实施方案中，空位开放罚分(计算为3乘以平均对角 线；“平均对角线”是所用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由具体比较矩阵分配给各个完全氨基酸配对的分数或数值)和空位拓展罚分(其通常为空位开放罚分的十分之一)，以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM62与算法一起使用。在某些实施方案中，算法中也使用标准的比较矩阵(PAM250比较矩阵参见Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，5(3)(1978)；BLOSUM62比较矩阵参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci美国，89：10915-10919(1992))。 
在某些实施方案中，用于多肽序列比较的参数包括以下： 
算法：Needleman等，J.Mol.Biol.，48：443-453(1970)； 
比较矩阵：Henikoff等，出处同上(1992)的BLOSUM62； 
空位罚分：12 
空位长度罚分：4 
相似性阈值：0 
GAP程序可使用以上参数。在某些实施方案中，上述参数是使用GAP算法进行多肽比较的默认参数(末端空位无罚分)。 
在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的重链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列有至少90％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的重链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列有至少95％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的重链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：25，27，29，31，33，35，37，39，41和43的氨基酸序列有至少99％一致性的氨基酸序列。 
在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的轻链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列有至少90％一致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的轻链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列有至少95％一 致性的氨基酸序列。在某些实施方案中，特异性结合物包含这样的轻链，其包含的可变区包含与选自SEQ ID NO：24，26，28，30，32，34，36，38，40和42的氨基酸序列有至少99％一致性的氨基酸序列。 
本文所用的二十种常见氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology--A Synthesis，(第2版，E.S.Golub和D.R.Gren(编辑)，Sinauer Associates，Sunderland，Mass，(1991))，对于任何目的其通过引用结合到本文中。二十种常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非常见氨基酸也可以作为本发明多肽的合适组分。非常见氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。依据标准用法和惯例，在本文所用的多肽符号中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。 
类似地，除非另有指定，单链多核苷酸序列的左手末端是5′末端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录物的5′至3′添加方向称为转录方向；DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物的5′末端的5′的序列区域称为“上游序列”；DNA链上具有与RNA相同的序列且位于RNA转录物的3′末端的3′的序列区域称为“下游序列”。 
保守氨基酸置换可包括非天然氨基酸残基，其通过化学肽合成而不是通过在生物体系中合成而掺入。这些保守氨基酸置换包括肽模拟物和氨基酸部分的其他颠倒或反向形式。 
根据共同的侧链性质，可将天然残基分类如下： 
1)疏水性残基：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； 
2)中性亲水性残基：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； 
3)酸性残基：Asp，Glu； 
4)碱性残基：His，Lys，Arg； 
5)影响链方向的残基：Gly，Pro； 
6)芳族残基：Trp，Tyr，Phe。 
例如，非保守置换可包括这些类别中的某一类别的成员与另一类别的成员互换。这种置换残基可被引入到人抗体中与非人抗体同源的区域，或者被引入到分子中的非同源区域。 
根据某些实施方案，在造成这种变化时，可考虑氨基酸的亲水性指数。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，给予其亲水性指数。它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸／胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。 
亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质活性生物功能方面的重要性为本领域所认识。Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)。已知可用某些氨基酸置换具有类似亲水性指数或分数的其他氨基酸，且仍保持类似的生物活性。在根据亲水性指数造成这种变化时，在某些实施方案中，包括其亲水性指数在±2之内的氨基酸置换。在某些实施方案中，包括其亲水性指数在±1之内的氨基酸置换，还在某些实施方案中，包括其亲水性指数在±0.5之内的氨基酸置换。 
本领域还认识到，可根据亲水性有效地造成相似氨基酸的置换，特别是在所创建的生物功能性蛋白质或肽意在用于免疫学实施方案中的情况下，犹如本发明的情况。在某些实施方案中，蛋白质的由其邻近氨基酸的亲水性所决定的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与该蛋白质的生物性质相关。 
已给这些氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬 氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在根据类似的亲水性值造成变化时，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2之内的氨基酸置换，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±1之内的氨基酸置换，还在某些实施方案中，包括其亲水性值在±0.5之内的氨基酸置换。还可根据亲水性从一级氨基酸序列鉴别表位。这些区域也称为“表位核心区”。 
示例性的氨基酸置换在表I中显示。 
表I
氨基酸置换
原始氨基酸 示例性置换 优选置换
Ala Val，Leu，Ile Val
Arg Lys，Gln，Asn Lvs
Asn Gln Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser，Ala Ser
Gln Asn Asn
Glu Asp Asp
Gly Pro，Ala Ala
His Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸 Leu
Leu 正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys Arg，1，4二氨基丁酸，Gln，Asn Arg
Met Leu，Phe，Ile Leu
Phe Leu，Val，Ile，Ala，Tyr Leu
Pro Ala Gly
Ser Thr，Ala，Cys Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr，Phe Tyr
Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸 Leu
技术人员使用公知的技术，将能够确定本文提出的多肽的合适变体。在某些实施方案中，本领域技术人员可通过以认为对活性不重要的区域为目标，鉴别可改变而又不破坏活性的合适分子区域。在某些实施方案中，能够鉴别在类似多肽中保守的残基和分子部分。在某些实施方案中，甚至对于生物活性或对于结构具有重要性的区域 也可进行保守氨基酸置换，而又不破坏生物活性或者对多肽的结构产生不利影响。 
另外，本领域技术人员可检阅有关鉴别类似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。根据这种比较研究，能够预测出蛋白质中氨基酸残基的重要性，其对应于类似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可为这种预测重要的氨基酸残基选择在化学上类似的氨基酸置换。 
本领域技术人员还能够参照类似多肽中的三维结构，对三维结构和氨基酸序列进行分析。根据这种信息，本领域技术人员可以参照抗体的三维结构预测其氨基酸残基的排列。在某些实施方案中，本领域技术人员可选择不对预测位于蛋白质表面的氨基酸残基造成基团变化，因为这种残基可能参与与其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生出在各期望氨基酸残基处包含单个氨基酸置换的试验变体。然后可以使用本领域技术人员公知的活性测定法对变体进行筛选。可以用这种变体来收集有关合适变体的信息。例如，如果发现特定氨基酸残基的变化导致活性破坏、不合乎需要的降低或者不合适的活性，则可以避免带有这种变化的变体。换句话说，根据从这种常规实验收集到的信息，本领域技术人员能够容易地确定应避免单独或者与其他突变一起出现进一步置换的氨基酸。 
有许多科学出版物已致力于预测二级结构。参见Moult，Curr.Op.in Biotech.7：422-427(1996)；Chou等，Biochemistry13(2)：222-245(1974)；Chou等，Biochemistry113(2)：211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.47：251-276(1979)及Chou等，Biophys.J.26：367-384(1979)。此外，目前也有计算机程序可帮助预测二级结构。一种预测二级结构的方法基于同源性建模。例如，序列一致性大于30％或者相似性大于40％的两种多肽或蛋白质通常具有类似的拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB)的近期发展已使二级结构(包括多肽或蛋白质 结构内部的潜在折叠数目)的预测性提高。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.27(1)：244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.7(3)：369-376(1997))，在指定的多肽或蛋白质中，折叠的数目有限，且一旦解析了临界数量的结构，结构预测将明显变得更加准确。 
另外的二级结构预测方法包括“串线算法(threading)”(Jones，Curr.Opin.Struct.Biol.7(3)：377-87(1997)；Sippl等，Structure4(1)：15-19(1996))、“序型分析”(Bowie等，Science253：164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.183：146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.84(13)：4355-4358(1987))和“进化连锁”(参见Holm，出处同上(1999)；及Brenner，出处同上(1997))。 
在某些实施方案中，特异性结合物变体包括糖基化变体，与亲本多肽的氨基酸序列相比，其中的糖基化位点数目和／或类型已改变。在某些实施方案中，比起天然蛋白质，蛋白质变体包含的N-连接糖基化位点的数目更多或更少。N-连接糖基化位点特征为以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中标记为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。产生这种序列的氨基酸残基置换为N-连接碳水化合物链的添加提供潜在的新位点。或者，消除该序列的置换将会除去现有的N-连接碳水化合物链。还提供了N-连接碳水化合物链的重排，其中除去一个或多个N-连接糖基化位点(通常为天然N-连接糖基化位点)，且创建一个或多个新的N-连接位点。另外的优选抗体变体包括半胱氨酸变体，比起亲本氨基酸序列，其中有一个或多个半胱氨酸残基缺失或被另一种氨基酸(例如丝氨酸)置换。当抗体必须重折叠成生物活性构象时(比如在不可溶包涵体分离之后)，半胱氨酸变体可能有用。半胱氨酸变体具有的半胱氨酸残基通常比天然蛋白质要少，且通常为偶数个，以使由非配对半胱氨酸产生的相互作用减到最少。 
根据某些实施方案，氨基酸置换为如下：(1)降低对蛋白酶解的易感性，(2)降低对氧化作用的易感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性和／或(5)赋予或修饰这种多肽的 其他生理化学或功能性质。根据某些实施方案，在天然序列中(在某些实施方案中，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分)，可以造成单个或多个氨基酸置换(在某些实施方案中，保守氨基酸置换)。在优选的实施方案中，保守氨基酸置换通常并不实质上改变亲本序列的结构特征(例如置换氨基酸不应倾向于使亲本序列中出现的螺旋断裂，或者使表征亲本序列的其他类型的二级结构破坏)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton(编辑)，W.H.Freeman和Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze(编辑)，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991)；及Thornton等，Nature354：105(1991)，以上各文献通过引用结合到本文中。 
术语“衍生物”指包括除氨基酸插入、缺失或置换之外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或者其他有机或无机部分化学成键。在某些实施方案中，化学修饰的特异性结合物的循环半寿期比不经化学修饰的特异性结合物更长。在某些实施方案中，化学修饰的特异性结合物对期望细胞、组织和／或器官的靶向能力提高。在某些实施方案中，衍生的特异性结合物被共价修饰，以包含一种或多种水溶性聚合物附属物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192和第4,179,337号。在某些实施方案中，衍生的特异性结合物包含一种或多种聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他碳水化合物基聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、环氧丙烷／环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇，以及这种聚合物的混合物。 
在某些实施方案中，衍生物用聚乙二醇(PEG)亚单位共价修饰。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物连接在衍生物的一个或多个特定位置(例如氨基末端)。在某些实施方案中，一种或多种 水溶性聚合物随机连接到衍生物的一个或多个侧链。在某些实施方案中，用PEG改进特异性结合物的治疗能力。在某些实施方案中，用PEG改进人源化抗体的治疗能力。某些这种方法在例如美国专利第6,133,426号中有讨论，对于任何目的该专利通过引用结合到本文中。 
本文所用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和／或羧基末端缺失的多肽。在某些实施方案中，片段为至少5-478个氨基酸长。可以理解，在某些实施方案中，片段为至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。 
肽类似物常作为性质与模板肽类似的非肽药物用于制药工业中。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”。Fauchere，J.Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger，TINS第392页(1985)；及Evans等，J.Med.Chem.30：1229(1987)，对于任何目的它们通过引用结合到本文中。这种化合物通常是借助于计算机分子建模而被开发出来的。在结构上与治疗有用肽类似的肽模拟物可用以产生类似的治疗或预防效果。一般的说，肽模拟物在结构上与模式多肽(即具有某种生化性质或药理活性的多肽)如人抗体相类似，但具有一个或多个肽键通过本领域公知的方法任选由选自以下的键替换：--CH2-NH--、--CH2-S--、--CH2-CH2--、--CH=CH-(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。用同一类型的D-氨基酸对共有序列的一个或者多个氨基酸进行系统性置换(例如D-赖氨酸置换L-赖氨酸)，在某些实施方案中可用以产生更稳定的肽。另外，包含共有序列或基本相同的共有序列变体的约束(constrained)肽可用本领域公知的方法来产生(Rizo和Gierasch，Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，对于任何目的其通过引用结合到本文中)；例如，通过添加能够形成分子内二硫桥而使肽环化的内部半胱氨酸残基来产生。 
“抗体”或“抗体肽”指完整抗体或其结合片段，后者与完整抗体竞争特异性结合。在某些实施方案中，结合片段由重组DNA技术产生。在另外的实施方案中，结合片段通过对完整抗体进行酶法 或化学法切割来产生。结合片段包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体。 
术语“重链”包括具有足够的可变区序列以带来靶标特异性的任何多肽。术语“轻链”包括具有足够的可变区序列以带来靶标特异性的任何多肽。全长重链包括一个可变区结构域VH及三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH3结构域位于羧基末端。本文所用的术语“重链”涵括全长重链及其片段。全长轻链包括一个可变区结构域VL和一个恒定区结构域CL。如同重链一样，轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。本文所用的术语“轻链”涵括全长轻链及其片段。Fab片段由一条轻链及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。Fab’片段含有一条轻链和一条重链，所述重链含有CH1和CH2结构域之间的更多恒定区，这样在两条重链之间可形成链间二硫键，从而形成F(ab')2分子。Fv区包含源自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。单链抗体是其中重链和轻链可变区已由柔性连接基团连接而形成单一多肽链的Fv分子，所述单一多肽链形成抗体结合区。在国际专利申请公开WO88／01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号中对单链抗体有更详细的描述。 
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体轻链和／或重链的一部分，通常包括重链中的大约120-130个氨基末端氨基酸和轻链中的约100-110个氨基末端氨基酸。在某些实施方案中，不同抗体的可变区在氨基酸序列方面差别甚大，甚至在同一物种的抗体中也是如此。抗体的可变区通常决定具体抗体对其靶标的特异性。 
术语“免疫功能性免疫球蛋白片段”指包含至少免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的可变结构域的多肽片段。在某些实施方案中，免疫功能性免疫球蛋白片段能够结合配体，防止配体与其受体结合，从而中断由配体结合受体产生的生物响应。在某些实施方案中，免疫功能性免疫球蛋白片段能够结合受体，防止配体与其受体结合， 从而中断由配体结合受体产生的生物响应。在某些实施方案中，免疫功能性免疫球蛋白片段能够结合受体，并使该受体活化或灭活。 
在某些实施方案中，“多特异性”或“多功能性”抗体之外的二价抗体通常理解为其各个结合位点均相同。 
当过量的特异性结合物降低结合到反受体的受体量达至少约20％、40％、60％、80％、85％或更高(在体外竞争性结合测定中测出)时，则特异性结合物基本抑制配体对受体的吸附。 
术语“靶标”指能够被特异性结合物结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标是抗原。 
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，而且在某些实施方案中，可具有特异性三维结构特征和／或特异性电荷特征。表位是抗原的被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和／或大分子的复合混合物中优先识别其靶抗原时，则说它特异性结合抗原。在某些实施方案中当解离常数≤1μM时，在某些实施方案中当解离常数≤100nM时，在某些实施方案中当解离常数≤10nM时，则说抗体特异性结合抗原。 
术语“作用物”在本文中用以表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物材料获得的提取物。 
本文所用的术语“标记”或“标记的”指将可检测标记的掺入，例如通过掺入放射性标记氨基酸或者将可被标记亲和素(例如链霉亲和素，其包含荧光标记或者可通过光学或比色方法检测的酶活性)检测到的生物素部分连接到多肽来掺入。在某些实施方案中，标记还具有治疗性。各种标记多肽和糖蛋白的方法为本领域所公知且可使用。多肽标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标 记(例如FITC、罗丹明、磷化镧系(lanthanide phosphors))、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基团、由第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间位阻。 
本文所用的术语“生物样品”包括但不限于来自生命体或以前的生命体的任何数量的物质。这种生物体包括但不限于人类、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。这种物质包括但不限于血液、血清、尿、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴结和皮肤。 
术语“癌症”包括但不限于实体瘤和血液恶性癌症。示例性的癌症包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、头和颈鳞状细胞癌、遗传性和散发性乳头状肾癌、白血病、淋巴瘤、里-费综合征、恶性胸膜间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞性肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞性肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌和膀胱移行细胞癌。 
术语“HGF活性”包括HGF的任何生物效应。在某些实施方案中，HGF活性是Met-HGF活性。在某些实施方案中，HGF活性是Met非依赖性HGF活性。 
术语“Met-HGF信号转导”包括HGF与Met受体的相互作用。 
术语“Met-HGF活性”包括由Met-HGF信号转导产生的任何生物活性。示例性的活性包括但不限于神经诱生、肝再生、伤口愈合、生长、侵袭、形态分化、胚胎发育、分散、增殖、凋亡、细胞运动性、转移(metastisis)、移动、细胞黏着、整联蛋白成簇、桩蛋白的磷酸化、黏着斑的形成及异常Met-HGF信号转导导致的癌症。 
术语“异常Met-HGF信号转导”包括其中Met-HGF信号转导未能刺激任何Met-HGF活性的任何情形(要是正常地进行信号转 导，则会导致这种活性)。异常Met-HGF信号转导也包括其中Met-HGF信号转导导致的Met-HGF活性小于正常信号转导出现的活性的任何情形。异常活性也包括其中Met-HGF信号转导导致的Met-HGF活性大于正常信号转导出现的活性的任何情形。异常Met-HGF信号转导可导致例如某些癌症。 
术语“Met非依赖性HGF活性”指受HGF影响、但不依赖于HGF与Met受体结合的生物活性。这种活性包括但不限于受HGF与其他受体的相互作用影响的生物活性和受HGF通过其他途径(例如Ron或met／ron异源二聚体)影响的生物活性。 
术语“异常HGF活性”指其中HGF活性高于或低于其本来应有活性的任何情形。在某些情形中，异常HGF活性由异常HGF信号转导导致。在某些情形中，异常HGF活性由高于其本来应有浓度的HGF浓度导致。在某些实施方案中，异常HGF活性由低于其本来应有浓度的HGF浓度导致。 
本文所用的术语“药物”指当将其正确给予患者时，能够诱导期望的治疗效果的化学化合物或组合物。 
本文所用的术语“调节剂”是改变或更改分子的活性或功能的化合物。例如，比起不存在调节剂时观测到的活性或功能的大小，调节剂可引起分子的某些活性或功能的大小提高或降低。在某些实施方案中，调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能的大小。某些示例性的分子活性和功能包括但不限于结合亲和力、酶活性和信号转导。某些示例性的抑制剂包括但不限于蛋白质、肽、抗体、peptibody、碳水化合物或有机小分子。Peptibody描述于例如美国专利第6,660,843号(对应于PCT申请WO01／83525)。 
本文所用的“基本纯净的”意指作为主要种类而存在的对象种类(即以摩尔计，它比组合物中任何其他单独种类都丰富得多)。在某些实施方案中，基本纯化的部分是其中对象种类占所有存在的大分子种类的至少约50％(以摩尔计)的组合物。在某些实施方案中，基 本纯净的组合物占组合物中存在的所有大分子种类的超过约80％、85％、90％、95％或99％。在某些实施方案中，对象种类被纯化至基本均一(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染种类)，其中组合物基本由单一大分子种类组成。 
术语“患者”包括人类和动物对象。 
某些示例性的特异性结合物
在某些情况下，HGF结合Met受体，诱导Met磷酸化。在某些情况下，正常HGF-诱导的Met磷酸化调节多种细胞过程。在某些情况下，异常Met-HGF活性与许多人类疾病状况相关。例如，在某些情况下，过多的HGF活性与某些癌症相关。因此，在某些情况下，调节HGF活性在治疗上可能有用。在某些实施方案中，用HGF特异性结合物使HGF活性量从不正常的高水平降下来。在某些实施方案中，将HGF活性从不正常的高水平降下来降低致瘤活性和减低癌症的严重性。根据某些实施方案，用HGF特异性结合物治疗癌症。在某些实施方案中，用HGF特异性结合物预防癌症。 
在某些实施方案中，用HGF特异性结合物治疗其中HGF活性正常的癌症。在这种癌症中，例如将HGF活性降至正常水平以下可提供治疗效果。 
在某些实施方案中，用HGF特异性结合物调节至少一种Met-HGF活性。在某些实施方案中，用HGF特异性结合物调节至少一种Met非依赖性HGF活性。在某些实施方案中，用不只一种HGF特异性结合物调节HGF活性。 
在某些实施方案中，HGF特异性结合物是完全人单克隆抗体。在某些实施方案中，提供编码重链和轻链免疫球蛋白分子的核苷酸序列及组成该分子的氨基酸序列，特别是对应于可变区的序列。在某些实施方案中，提供对应于互补决定区(CDR)的序列，具体是从CDR1到CDR3。根据某些实施方案，提供表达这种免疫球蛋白分子的 杂交瘤细胞系。根据某些实施方案，提供表达这种单克隆抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，杂交瘤细胞系选自至少1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1中的一种。在某些实施方案中，提供纯化的抗人HGF人单克隆抗体。 
在酵母人工染色体(YAC)中，克隆和重建兆碱基大小的人基因座并将它们引入到小鼠种系的能力，为阐明非常大的或粗略作图的基因座的功能成分以及产生有用的人类疾病模型提供有利的方法。此外，应用这种技术用人的等价物置换小鼠基因座，对发育过程中人基因产物的表达和调节、其与其他系统的联系以及其在疾病引发和发展中的参与情况提供了深入了解。 
这种策略的一种重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源Ig基因已失活的小鼠，为研究抗体的程序表达和装配的基础机制以及抗体在B细胞发育中的作用提供了机会。此外，这种策略可为完全人单克隆抗体(MAb)的生产提供来源。在某些实施方案中，预期完全人抗体将小鼠Mab或小鼠衍生Mab所固有的免疫原性反应和变应性反应减至最少，并因此在某些实施方案中，提高所给予的抗体的效力和安全性。在某些实施方案中，完全人抗体可用于治疗慢性或复发性人类疾病，如癌症、疟疾或增殖性糖尿病性视网膜病，所述疾病的治疗可能涉及反复给予抗体。 
可以用大的人Ig基因座片段工程改造小鼠抗体生产缺陷的小鼠品系，使该小鼠不产生小鼠抗体而产生人抗体。大的人Ig片段可保持较大的可变基因多样性以及抗体生产和表达的正确调节。通过充分利用小鼠抗体多样化和选择的机制及对人蛋白质的免疫耐受性的缺乏，这些小鼠品系中再现的人抗体库可产生对任何目的抗原(包括人抗原)具有高度亲和性的完全人抗体。用杂交瘤技术可生产和选择出具有期望特异性的抗原特异性人MAb。某些示例性的方法描述于WO98／24893、美国专利第5,545,807号、EP546073B1和EP546073A1。 
在某些实施方案中，可将来自人类以外物种的恒定区与人可变区一起使用。 
天然抗体的结构 
天然抗体的结构单元通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由完全相同的两对多肽链组成，每对链具有一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约为25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方案中，约为50-75kDa)。每条链的氨基末端部分通常包括含约100-110个或者更多个氨基酸、通常负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端通常确定负责效应子功能的恒定区。人轻链通常分为κ轻链和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε重链，并分别确定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM的亚类包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地可细分成亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。通常在全长轻链和重链内部，可变区和恒定区通过含约12个或者更多个氨基酸的“J”区连接，重链同时还包括含约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology，第7章(Paul，W.(编辑)，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))(对于任何目的其通过引用整体结合到本文中)。每个轻／重链对的可变区通常形成抗原结合位点。 
可变区通常展示相同的一般结构，即相对保守的框架区(FR)与三个高变区(也称互补决定区或CDR)连接。每一对的两条链的CDR通常通过框架区排列，这使与特定表位的结合成为可能。轻链和重链的可变区从N端到C端通常包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。每个结构域的氨基酸排布通常是按照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987和1991))或者Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等，Nature342：878-883(1989)的定义来进行的。 
在某些实施方案中，抗体重链在抗体轻链不存在的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体轻链在抗体重链不存在的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在抗体轻链不存在的情况下结合抗原。在某些实施方案中，抗体结合区在抗体重链不存在的情况下结合抗原。在某些实施方案中，个别的可变区在其他可变区不存在的情况下特异性结合抗原。 
在某些实施方案中，通过解析抗体的结构和／或解析抗体-配体复合物的结构，来实现CDR的明确描绘和包含抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施方案中，这可通过本领域技术人员公知的多种技术的任何一种(如X射线晶体学)来实现。在某些实施方案中，可采用各种分析方法鉴定或模拟CDR区。这种方法的实例包括但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和接触定义。 
Kabat定义是抗体中的残基的编号标准，通常用来鉴定CDR区。参见例如Johnson和Wu，Nucleic AcidsRes，28：214-8(2000)。Chothia定义是类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区的位置。参见例如Chothia等，J Mol Biol，196：901-17(1986)；Chothia等，Nature，342：877-83(1989)。AbM定义使用Oxford Molecular Group开发的模拟抗体结构的一整套计算机程序。参见例如Martin等，Proc Natl Acad Sci(美国)86：9268-9272(1989)；AbMTM，a computer program for modeling Variable Regions of Antibodies，Oxford，英国；Oxford Molecular，Ltd。AbM定义使用知识数据库和从头(ab initio)方法的组合，从抗体的一级结构模拟其三级结构，所述从头方法例如描述于Samudrala等，Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach，PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.3：194-198(1999)。接触定义基于对现有的复杂晶体结构的分析。参见例如MacCallum等，J Mol Biol，5：732-45(1996)。 
按惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2和H3，并按从氨基末端到羧基末端的方向连续编号。轻链中的CDR区通常称为 L1、L2和L3，并按从氨基末端到羧基末端的方向连续编号。 
双特异性或双功能性抗体
双特异性或双功能性抗体通常是具有两个不同的重链／轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法来生产，包括但不限于杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如Songsivilai等，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol148：1547-1553(1992)。 
抗体的制备
根据某些实施方案，本发明涵括某些特异性结合HGF的抗体。在某些实施方案中，通过用抗原免疫来生产抗体。术语“抗原”指用于动物中以产生能够结合该抗原和／或另一种靶标的抗体的分子。在某些实施方案中，可用全长HGF、HGF的可溶形式、HGF的剪接变体形式或它们的片段进行免疫来生产抗体。在某些实施方案中，本发明抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体，和／或可以是重组抗体。在某些实施方案中，本发明抗体是例如通过免疫能够产生人抗体的转基因动物而制备的人抗体(参见例如PCT申请公开WO93／12227)。 
在某些实施方案中，可采用某些策略控制抗体的固有性质，如抗体对其靶标的亲和力。这种策略包括但不限于使用编码抗体的多核苷酸分子的位点特异性诱变或随机诱变来产生抗体变体。在某些实施方案中，抗体产生后，筛选显示期望变化(例如亲和力提高或下降)的抗体变体。 
在某些实施方案中，在诱变策略中作为目标的氨基酸残基是CDR中的氨基酸残基。在某些实施方案中，强可变结构域的构架区中的氨基酸作为目标。在某些实施方案中，已显示这种构架区促成某些抗体的靶标结合性质。参见例如Hudson，Curr Opin Biotech，9：395-402(1999)及其中的参考文献。 
在某些实施方案中，通过使随机诱变或位点特异性诱变局限于CDR中的高变位点，来产生更小的和更有效地得到筛选的抗体变体文库，所述高变位点是对应于易于在体细胞亲和成熟过程中易于发生突变的区域的位点。参见例如Chowdhury和Pastan，Nature Biotech，17：568-572(1999)及其中的参考文献。在某些实施方案中，可用某些类型的DNA元件鉴定高变位点，包括但不限于某些直接和反向重复序列、某些共有序列、某些二级结构和某些回文序列。例如，这种可用来鉴定高变位点的DNA元件包括但不限于四碱基序列，其包含嘌呤(A或G)，接着是鸟嘌呤(G)，接着是嘧啶(C或T)，再接着是腺苷或酪氨酸(A或T)(即A/G-G-C／T-A/T)。可用来鉴定高变位点的DNA元件的另一个实例是丝氨酸密码子；A-G-C／T。 
在某些实施方案中，抗体是人源化的。在某些实施方案中，人源化抗体在人类中基本上是非免疫原性的。在某些实施方案中，人源化抗体的对靶标的亲和力与其来源物种的抗体基本相同。参见例如美国专利第5,530,101号、美国专利第5,693,761号；美国专利第5,693,762号；美国专利第5,585,089号。 
在某些实施方案中，鉴定了抗体可变结构域的氨基酸，所述氨基酸可加以修饰，而不减少抗原结合结构域的天然亲和力，同时又降低其免疫原性。参见例如美国专利第5,766,886号和第5,869,619号。 
在某些实施方案中，通常通过本领域公知的方法设计抗体的修饰，以实现抗体对靶标的结合亲和力提高和／或降低抗体在接受者中的免疫原性。在某些实施方案中，人源化抗体经修饰除去糖基化位点，以提高抗体对其关联抗原的亲和力。参见例如Co等，Mol Immunol30：1361-1367(1993)。在某些实施方案中，用例如“改形(reshaping)”、“超嵌合(hyperchimerization)”或“镶嵌(veneering)／改面(resurfacing)”的技术产生人源化抗体。参见例如Vaswami等，Annals of Allergy，Asthma，＆Immunol81：105(1998)；Roguska等，Prot Engineer9：895-904 (1996)；及美国专利第6,072,035号。在某些这种实施方案中，这种技术通常通过减少外来残基的数目来降低抗体的免疫原性，但并不妨碍反复给予抗体后出现抗独特型和抗同种异型反应。某些其他用以降低免疫原性的方法描述于例如Gilliland等，J Immunol62(6)：3663-71(1999)。 
在某些情况下，人源化抗体导致抗原结合能力损失。在某些实施方案中，人源化抗体发生“回复突变”。在某些这种实施方案中，人源化抗体发生突变，将一个或多个见于供体抗体的氨基酸残基包括在其中。参见例如Saldanha等，Mol Immunol36：709-19(1999)。 
在某些实施方案中，抗HGF抗体的轻链可变区和重链可变区的互补决定区(CDR)可移植到来自同一物种或另一物种的构架区(FR)。在某些实施方案中，抗HGF抗体的轻链可变区和重链可变区的互补决定区(CDR)可移植到共有人FR。为创建共有人FR，在某些实施方案中，比对来自几种人重链或轻链氨基酸序列的FR，以鉴定共有氨基酸序列。在某些实施方案中，用来自不同重链或轻链的FR置换抗HGF抗体重链或轻链的FR。在某些实施方案中，HGF抗体重链和轻链的FR中的稀有氨基酸不被置换，其余的FR氨基酸则被置换。稀有氨基酸是特殊的氨基酸，其通常在FR中不能找到它们的位置。在某些实施方案中，抗HGF抗体的移植可变区可与不同于抗HGF抗体恒定区的恒定区一起使用。在某些实施方案中，移植可变区是单链Fv抗体的一部分。CDR移植描述于例如美国专利第6,180,370号、第6,054,297号、第5,693,762号、第5,859,205号、第5,693,761号、第5,565,332号、第5,585,089号和第5,530,101号，及Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534-1536(1988)，Winter，FEBS Letts430：92-94(1998)，它们对于任何目的通过引用结合到本文中。 
在某些实施方案中，用噬菌体呈现技术产生单克隆抗体。在某些实施方案中，这种技术产生完全人单克隆抗体。在某些实施方 案中，编码单一Fab或Fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体颗粒的表面上表达。参见例如Hoogenboom等，JMol Biol227：381(1991)；Marks等，JMol Biol222：581(1991)；美国专利第5,885,793号。在某些实施方案中，筛选噬菌体，以鉴定对靶标具有亲和力的抗体片段。因此，某些这种方法通过将抗体片段库(repertoire)呈现于丝状噬菌体的表面上，随后通过它们对靶标的结合来选择噬菌体，从而模拟免疫选择。在某些这种程序中，分离出高亲和力功能性激动性抗体片段。在某些这种实施方案中，通过从外周血淋巴细胞克隆天然重排的人V基因，创建人抗体基因的完全库。参见例如Mullinax等，Proc Natl Acad Sci(美国)87：8095-8099(1990)。 
根据某些实施方案，通过利用转基因小鼠制备本发明抗体，所述转基因小鼠插入了很大一部分的人抗体产生基因组，但被造成在产生内源鼠抗体方面出现缺陷。因而这种小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，而在产生鼠免疫球蛋白分子和抗体方面出现缺陷。用以获得这种结果的技术在本说明书中公开的专利、专利申请和参考文献中有公开。在某些实施方案中，可采用如在PCT申请公开WO98／24893中或者在Mendez等，Nature Genetics15：146-156(1997)中公开的方法，以上文献对于任何目的通过引用结合到本文中。 
根据某些实施方案，如下生产对HGF有特异性的完全人单克隆抗体。用目的抗原如HGF免疫含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，从小鼠获得表达抗体的淋巴细胞(如B细胞)。将这种回收细胞与髓样细胞系融合，制备无限增殖化杂交瘤细胞系，筛选和选择这种杂交瘤细胞系，以鉴定生产对目的抗原有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。在某些实施方案中，提供生产对HGF有特异性的抗体的杂交瘤细胞系的生产。 
在某些实施方案中，通过在宿主细胞中表达重组DNA，或者通过在杂交瘤细胞中表达，来生产完全人抗体。在某些实施方案中，用上述噬菌体展示技术生产抗体。 
在某些实施方案中，通过在体外将人脾细胞(B细胞或T细胞)暴露于抗原，然后将已暴露细胞重建于免疫削弱的小鼠(例如SCID或nod／SCID)，来生产完全人抗体。参见例如Brams等，J Immunol，160：2051-2058(1998)；Carballido等，Nat Med，6：103-106(2000)。在某些这种方法中，将人胚胎组织移植到SCID小鼠(SCID-hu)中导致长期血细胞生成和人T-细胞发育。参见例如McCune等，Science241：1532-1639(1988)；Ifversen等，Sem Immunol8：243-248(1996)。在某些情况下，这种嵌合小鼠中的体液免疫应答依赖于人T-细胞在动物中的共发育。参见例如Martensson等，Immunol83：1271-179(1994)。在某些方法中，将人外周血淋巴细胞移植到SCID小鼠中。参见例如Mosier等，Nature335：256-259(1988)。在某些这种实施方案中，当这种移植细胞用致敏剂如葡萄球菌肠毒素A(SEA)处理，或者用抗人CD40单克隆抗体处理时，检测出高水平的B细胞生产。参见例如Martensson等，Immunol84：224-230(1995)；Murphy等，Blood86：1946-1953(1995)。 
在某些实施方案中，通过以下杂交瘤的至少之一生产本发明抗体：1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.1、1.74.1、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1。在某些实施方案中，特异性结合物以10-8、10-9或10-10M的KD结合HGF。在某些实施方案中，特异性结合物以大约0.099-0.79nM的解离常数(KD)(动力学法测定)结合HGF(图6A)。在某些实施方案中，特异性结合物以低于10pM至大约54pM的KD(平衡／溶液法测定)结合HGF(图6B)。 
在某些实施方案中，特异性结合物包含至少IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型之一的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，特异性结合物包含人κ轻链和／或人重链。在某些实施方案中，重链是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM同种型。在某些实施方案中，特异性结合物在哺乳动物细胞中得到克隆表达。在某些实施方案中，特异性结合物包含不同于任何IgG1、 IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM同种型恒定区的恒定区。 
在某些实施方案中，特异性结合物包含人κ轻链和人IgG1重链。在某些实施方案中，特异性结合物包含人κ轻链和a人IgG2重链。在某些实施方案中，特异性结合物包含人κ轻链和人IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD或IgM重链。在某些实施方案中，特异性结合物包含连接到既非IgG1同种型恒定区也非IgG2同种型恒定区的恒定区的抗体可变区。在某些实施方案中，特异性结合物在哺乳动物细胞中得到克隆表达。 
在某些实施方案中，对来自至少一种1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.1、1.74.1、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1杂交瘤细胞系的抗体的重链和轻链的保守修饰(及对编码核苷酸的相应修饰)，将产生具有与来自1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.1、1.74.1、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1杂交瘤细胞系的抗体类似的功能特征和化学特征的抗HGF抗体。相反，在某些实施方案中，可通过选择如下重链和轻链的氨基酸序列中的置换，实现抗HGF抗体的功能特征和／或化学特征的实质修饰，所述重链和轻链在保持(a)置换部位的分子骨架结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处的分子电荷或疏水性，或者(c)侧链的大小这三方面的差异明显。 
例如，“保守氨基酸置换”可能涉及用非天然氨基酸残基置换天然氨基酸残基，结果对该位置的氨基酸残基的极性或电荷有极少或没有影响。此外，如以前对“丙氨酸扫描诱变”所述，多肽中的任何天然残基也可用丙氨酸置换。 
期望的氨基酸置换(无论是保守置换还是非保守置换)可由本领域技术人员在需要这种置换的时候进行确定。在某些实施方案中，可用氨基酸置换来鉴别抗HGF抗体的重要残基，或者提高或降低本文描述的抗HGF抗体的亲和力。 
在某些实施方案中，可在杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达本发明抗体。在某些实施方案中，可用编码具体抗体的序列转化合 适的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，可用任何已知的用以将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法来实现转化，包括例如将多核苷酸包装在病毒中(或包装到病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或者通过本领域公知的转染方法来实现，如美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号(所有这些专利对于任何目的通过引用结合到本文中)所例示的转染方法。在某些实施方案中，所用的转化方法可取决于待转化的宿主。用以将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的，包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔法、多核苷酸包入脂质体中及DNA直接显微注射到细胞核中。 
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，包括但不限于可获自美国典型培养物中心(ATCC)的无限增殖化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其他细胞系。在某些实施方案中，可通过确定哪种细胞系具有高表达水平且产生具有组成性HGF结合性质的抗体，来选择细胞系。适宜的哺乳动物宿主细胞表达载体是公知的。 
在某些实施方案中，特异性结合物包括一种或多种多肽。在某些实施方案中，可利用多种表达载体／宿主系统之任何一种来表达编码多肽的多核苷酸分子。这种宿主系统包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒或黏粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)传染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV))转染或者用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。 
在某些实施方案中，多肽在酵母中重组表达。某些这种实施方案使用市售表达系统，例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen，San Diego，CA)，按厂商说明书进行操作。在某些实施方案中，这种系统依 靠pre-pro-alpha序列来指导分泌。在某些实施方案中，插入片段的转录在用甲醇诱导时由乙醇氧化酶(AOX1)启动子驱动。 
在某些实施方案中，分泌多肽从酵母生长培养基纯化。在某些实施方案中，用以从酵母生长培养基纯化多肽的方法与用以从细菌上清液和哺乳动物细胞上清液纯化多肽的方法相同。 
在某些实施方案中，将编码多肽的核酸克隆到杆状病毒表达载体中，如pVL1393(PharMingen，San Diego，CA)。在某些实施方案中，可按照厂商说明书(PharMingen)使用这种载体，来传染无sF9蛋白培养基中的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，产生重组多肽。在某些实施方案中，用肝素-琼脂糖柱(Pharmacia)从这种培养基中纯化和浓缩多肽。 
在某些实施方案中，多肽在昆虫系统中表达。某些用于多肽表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这种系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体，在草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外来基因。在某些实施方案中，编码多肽的核酸分子可插入到病毒的非必需基因中，例如插入到多角体蛋白基因中，并置于该基因的启动子的控制之下。在某些实施方案中，成功插入核酸分子将使非必需基因失活。在某些实施方案中，所述失活导致出现可检测的特征。例如，多角体蛋白基因的失活导致产生缺乏外被蛋白的病毒。 
在某些实施方案中，可用重组病毒传染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫。参见例如Smith等，J Virol46：584(1983)；Engelhard等，Proc Nat Acad Sci(USA)91：3224-7(1994)。 
在某些实施方案中，制备于细菌细胞中的多肽作为细菌中的不可溶包涵体而生产。在某些实施方案中，离心收集包含这种包涵体的宿主细胞；在0.15M NaCl，10mM Tris，pH8，1mM EDTA中洗涤；并在室温下用0.1mg／ml溶菌酶(Sigma，St.Louis，MO)处理15分钟。在某些实施方案中，超声澄清裂解液，以12,000X g离心沉淀细胞碎片 10分钟。在某些实施方案中，将含多肽的沉淀重新悬浮于50mM Tris，pH8和10mM EDTA；在50％甘油中分层；并以6000X g离心30分钟。在某些实施方案中，所述沉淀可重新悬浮于标准的无Mg++和Ca++磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在某些实施方案中，通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离重新悬浮的沉淀，进一步纯化多肽(参见例如Sambrook等，出处同上)。在某些实施方案中，可将这种凝胶浸泡于0.4M KCl中，以使蛋白质显现，可在无SDS的电泳用缓冲液中切除和电洗脱蛋白质。根据某些实施方案，在细菌中生产谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白，其为可溶性蛋白质。在某些实施方案中，用GST纯化模块(Pharmacia)纯化这种GST融合蛋白。 
在某些实施方案中，需要使某些多肽“重折叠”。在某些实施方案中，这种多肽用本文讨论的某些重组系统来生产。在某些实施方案中，多肽被“重折叠”和／或氧化，以形成所需的三级结构和／或产生二硫键。在某些实施方案中，这种结构和／或键与多肽的某些生物活性有关。在某些实施方案中，用本领域公知的多种方法的任何一种来实现重折叠。示例性的方法包括但不限于在离液剂存在下使溶解的多肽物质暴露于通常高于7的pH。示例性的离液剂是胍。在某些实施方案中，重折叠／氧化溶液还含有还原剂和该还原剂的氧化形式。在某些实施方案中，还原剂及其氧化形式以能产生允许二硫化物改组发生的特定氧化还原电势的比例存在。在某些实施方案中，这种改组允许形成半胱氨酸桥。示例性的氧化还原偶包括但不限于半胱氨酸／胱胺、谷胱甘肽／二硫双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT／二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)／二硫-bME。在某些实施方案中，用共溶剂提高重折叠的效率。示例性的共溶剂包括但不限于甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。 
在某些实施方案中，可充分纯化多肽。某些蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。在某些实施方案中，蛋白质纯化涉及将多肽级份与非多肽级份进行粗略的分级分离。在某些实施方案中，用 色谱技术和／或电泳技术纯化多肽。示例性的纯化方法包括但不限于用硫酸铵沉淀；用PEG沉淀；免疫沉淀；热变性后再离心；色谱法，包括但不限于亲和色谱(例如蛋白质-A-琼脂糖)、离子交换色谱、排阻色谱和反相色谱；凝胶过滤；羟磷灰石色谱；等电聚焦；聚丙烯酰胺凝胶电泳；以及这种技术和其他技术的组合。在某些实施方案中，通过快速蛋白质液相色谱或通过高压液相色谱(HPLC)纯化多肽。在某些实施方案中，可改变纯化步骤或者可省略某些步骤，且仍成为制备相当纯多肽的合适方法。 
在某些实施方案中，对多肽制剂的纯化程度进行定量。某些用以定量纯化程度的方法是本领域技术人员公知的。某些示例性的方法包括但不限于测定制剂的特异性结合活性和通过SDS／PAGE分析来估算制剂中多肽的量。某些示例性的用以估算多肽制剂的纯化量的方法包括计算制剂的结合活性和将其与初始提取物的结合活性进行比较。在某些实施方案中，这种计算的结果以“纯化倍数”表示。用来表示结合活性量的单位取决于所进行的具体测定。 
在某些实施方案中，多肽进行部分纯化。在某些实施方案中，可通过使用更少的纯化步骤或者通过利用相同的一般纯化方案的不同形式实现部分纯化。例如，在某些实施方案中，采用HPLC仪进行的阳离子交换柱色谱较之采用低压色谱系统的相同技术，通常会导致更高的“纯化倍数”。在某些实施方案中，导致较低纯化程度的方法在多肽的总回收率或者在保持多肽的结合活性方面可能有优势。 
在某些情况下，多肽的电泳迁移可能会随SDS／PAGE的不同条件而变化，有时变化显著。参见例如Capaldi等，Biochem Biophys\Res Comm，76：425(1977)。可以理解，在不同的电泳条件下，纯化的或者部分纯化的多肽的表观分子量可能不同。 
某些示例性的表位
在某些实施方案中，提供抗-HGF抗体结合的表位(参见例 如实施例8、图10和11以及SEQ ID NO.164和165)。在某些实施方案中，可利用HGF表位防止抗-HGF抗体或特异性结合物与HGF的结合。在某些实施方案中，可利用HGF表位降低抗-HGF抗体或特异性结合物与HGF的结合。可利用HGF表位基本抑制抗-HGF抗体或特异性结合物与HGF的结合。当过量的表位降低结合HGF的抗-HGF抗体或特异性结合物的量达至少约20％、40％、60％、80％、85％或更高时，则表位基本抑制抗-HGF抗体或特异性结合物与HGF的结合。在某些实施方案中，可利用HGF表位结合抗-HGF抗体或特异性结合物。在某些实施方案中，可利用HGF表位鉴定结合HGF的抗体或特异性结合物。在某些实施方案中，可利用HGF表位分离结合HGF的抗体或特异性结合物。在某些实施方案中，可利用HGF表位产生结合HGF的抗体或特异性结合物。在某些实施方案中，可利用HGF表位作为免疫原，产生结合HGF的抗体或特异性结合物。在某些实施方案中，可将HGF表位给予动物，随后可从该动物获得结合HGF的抗体。在某些实施方案中，可利用HGF表位干扰正常的HGF-Met信号转导。 
某些治疗性用途
在某些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物。在某些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物和另一种治疗物。 
在某些实施方案中，提供治疗或预防疟疾的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物。在某些实施方案中，提供治疗或预防疟疾的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物和另一种治疗物。 
在某些实施方案中，提供治疗或预防增殖性糖尿病性视网膜病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物。在某些实施方案中，提供治疗或预防增殖性糖尿病性视网膜 病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的一种或多种HGF特异性结合物和另一种治疗物。 
在某些实施方案中，单独给予HGF特异性结合物。在某些实施方案中，在给予至少一种其他治疗物之前先给予HGF特异性结合物。在某些实施方案中，在给予至少一种其他治疗物的同时给予HGF特异性结合物。在某些实施方案中，在给予至少一种其他治疗物之后再给予HGF特异性结合物。治疗物包括但不限于至少一种其他的癌症治疗物。示例性的癌症治疗物包括但不限于放疗和化疗。 
本发明药物组合物可在组合疗法中给予，即与其他治疗物组合给予。在某些实施方案中，组合疗法包含能够结合HGF的特异性结合物与至少一种抗血管生成剂的组合。治疗物包括但不限于体外合成法制备的化学组合物、抗体、抗原结合区、放射性核素及它们的组合和缀合物。在某些实施方案中，治疗物可用作激动剂、拮抗剂、变构调节剂或毒素。在某些实施方案中，治疗物可起到抑制或刺激其靶标的作用(例如受体或酶的激活或抑制)，从而促进细胞死亡或阻止细胞生长。 
化疗治疗包括但不限于抗肿瘤剂，包括但不限于烷化剂，包括：氮芥类如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝脲如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU)；TemodalTM(temozolamide)、氮丙啶／甲基蜜胺如三亚乙基蜜胺(TEM)、三亚乙基硫代磷酰胺(塞替派)、六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸烷基酯如白消安；三嗪如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物，包括叶酸类似物如甲氨喋呤和三甲曲沙，嘧啶类似物如5-氟脲嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-阿扎胞苷、2,2′-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2′-脱氧考福霉素(喷司他丁)、赤羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；天然产物，包括抗有丝分裂药物如紫杉醇，长春花生物碱，包括长春碱(VLB)、长春新碱和长 春瑞滨、泰索帝、雌莫司汀和雌莫司汀磷酸酯；表鬼臼毒素(ppipodophylotoxins)如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节物如α干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；miscellaneous agent，包括铂配位化合物如顺铂和卡铂，蒽二酮如米托蒽醌，取代尿素如羟基脲，甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼，肾上腺皮质抑制药如米托坦(o,p′-DDD)和氨基格鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂如泼尼松及等价物、地塞米松和氨基格鲁米特；GemzarTM(吉西他滨)，孕酮如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素如二乙基己烯雌酚和炔雌醇等价物；抗雌激素如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮／等价物；抗雄激素如氟他胺、促性腺素释放激素类似物和亮丙立德；以及非类固醇抗雄激素如氟他胺。 
可与HGF特异性结合物一起给予的癌症疗法还包括但不限于靶向疗法。靶向疗法的实例包括但不限于使用治疗性抗体。示例性的治疗性抗体包括但不限于小鼠抗体、小鼠-人嵌合抗体、CDR-移植抗体、人源化抗体和完全人抗体，以及合成抗体，包括但不限于通过筛选抗体文库选择的抗体。示例性的抗体包括但不限于如下的抗体，其结合肿瘤细胞上存在的细胞表面蛋白Her2、CDC20、CDC33、黏蛋白样糖蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)，且任选对呈现这些蛋白质的肿瘤细胞诱导细胞静止和／或细胞毒效应。示例性的抗体还包括HERCEPTINTM(曲妥单抗)(其可用来治疗乳腺癌和其他形式的癌症)、RITUXANTM(利妥昔单抗)、ZEVALINTM(替伊莫单抗)、GLEEVECTM和LYMPHOCIDETM(依帕珠单抗)(其可用来治疗非何杰金氏淋巴瘤和其他形式的癌症)。某些示例性的抗体还包括ERBITUXTM(IMC-C225)；ertinolib(Iressa)；BEXXARTM(碘131托西莫单抗)；KDR(激酶结构域受体)抑制剂；抗VEGF抗体和拮抗剂(例如AvastinTM和 VEGAF-TRAP)；抗VEGF受体抗体和抗原结合区；抗-Ang-1和Ang-2抗体和抗原结合区；抗Tie-2和其他Ang-1和Ang-2受体的抗体；Tie-2配体；抗Tie-2激酶抑制剂的抗体；以及
Figure BDA0000414386170000631
(阿仑单抗)。在某些实施方案中，癌症治疗物是选择性诱导肿瘤细胞凋亡的多肽，包括但不限于TNF-相关多肽TRAIL。 
在某些实施方案中，癌症治疗物是减少血管生成的抗血管生成剂。某些这种治疗物包括但不限于IL-8；Campath，B-FGF；FGF拮抗剂；Tek拮抗剂(Cerretti等，美国申请第2003／0162712号；Cerretti等，美国专利第6,413,932号和Cerretti等，美国专利第6,521,424号，以上各文献对于任何目的通过引用结合到本文中)；抗-TWEAK剂(其包括但不限于抗体和抗原结合区)；可溶性TWEAK受体拮抗剂(Wiley，美国专利第6,727,225号)；拮抗整联蛋白与其配体结合的ADAM解联蛋白结构域(Fanslow等，美国申请第2002／0042368号)；抗-eph受体和抗-肝配蛋白抗体；抗原结合区或拮抗剂(美国专利第5,981,245号；第5,728,813号；第5,969,110号；第6,596,852号；第6,232,447号；第6,057,124及其专利族成员)；抗-VEGF剂(例如特异性结合VEGF或可溶性VEGF受体或其配体结合区的抗体或抗原结合区)如AvastinTM或VEGF-TRAPTM，抗-VEGF受体剂(例如特异性结合VEGF受体的抗体或抗原结合区)，EGFR抑制剂(例如特异性结合EGFR的抗体或抗原结合区)如panitumumab、TRESSATM(gefitinib)、TARCEVATM(erlotinib)，抗-Ang-1和抗-Ang-2剂(例如特异性结合Ang-1和Ang-2或它们的受体的抗体或抗原结合区，例如Tie-2／TEK)，抗-Tie-2激酶抑制剂(例如特异性结合和抑制生长因子活性的抗体或抗原结合区，如肝细胞生长因子(HGF，也称为分散因子)的拮抗剂，以及特异性结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区)；抗-PDGF-BB拮抗剂；PDGF-BB配体的抗体和抗原结合区；以及PDGFR激酶抑制剂。 
在某些实施方案中，癌症治疗物是血管生成抑制剂。某些这种抑制剂包括但不限于SD-7784(Pfizer，美国)；西仑吉肽(Merck  KGaA，德国，EPO770622)；pegaptanib八钠，(Gilead Sciences，美国)；Alphastatin，(BioActa，英国)；M-PGA，(Celgene，美国，US5712291)；伊洛马司他，(Arriva，美国，US5892112)；semaxanib，(Pfizer，美国，US5792783)；vatalanib，(Novartis，瑞士)；2-甲氧基雌二醇，(EntreMed，美国)；TLC ELL-12，(Elan，爱尔兰)；阿奈可他乙酸盐，(Alcon，美国)；alpha-D148Mab，(Amgen，美国)；CEP-7055，(Cephalon，美国)；抗-Vn Mab，(Crucell，荷兰)DAC：抗血管生成剂，(ConjuChem，加拿大)；Angiocidin，(InKine Pharmaceutical，美国)；KM-2550，(Kyowa Hakko，日本)；SU-0879，(Pfizer，美国)；CGP-79787，(Novartis，瑞士，EP970070)；ARGENT技术，(Ariad，美国)；YIGSR-Stealth，(Johnson&Johnson，美国)；血纤蛋白原-E片段，(BioActa，英国)；血管生成抑制剂，(Trigen，英国)；TBC-1635，(Encysive Pharmaceutical，美国)；SC-236，(Pfizer，美国)；ABT-567，(Abbott，美国)；Metastatin，(EntreMed，美国)；血管生成抑制剂，(Tripep，瑞典)；maspin，(Sosei，日本)；2-甲氧基雌二醇，(Oncology Sciences Corporation，美国)；ER-68203-00，(IVAX，美国)；Benefin，(Lane Labs，美国)；Tz-93，(Tsumura，日本)；TAN-1120，(Takeda，日本)；FR-111142，(Fujisawa，日本，JP02233610)；血小板因子4，(RepliGen，美国，EP407122)；血管内皮生长因子拮抗剂，(Borean，丹麦)；癌症疗法，(南卡罗来纳大学，美国)；贝伐单抗(pINN)，(Genentech，美国)；血管生成抑制剂，(SUGEN，美国)；XL784，(Exelixis，美国)；XL647，(Exelixis，美国)；MAb，α5β3整联蛋白，第二代，(Applied Molecular Evolution，美国和Medimmune，美国)；基因疗法，视网膜病，(Oxford BioMedica，英国)；enzastaurin盐酸盐(USAN)，(Lilly，美国)；CEP7055，(Cephalon，美国和Sanofi-Synthelabo，法国)；BC1，(热那亚癌症研究院，意大利)；血管生成抑制剂，(Alchemia，澳大利亚)；VEGF拮抗剂，(Regeneron，美国)；rBPI21和BPI-衍生的抗血管生成剂，(XOMA，美国)；PI88，(Progen，澳大利亚)；西仑吉肽(pINN)，(Merck KGaA，德国；慕尼黑技术大学，德国，Scripps临床研究基金会，美国)； 西妥昔单抗(INN)，(Aventis，法国)；AVE8062，(Ajinomoto，日本)；AS1404，(癌症研究实验室，新西兰)；SG292，(Telios，美国)；内皮抑制素，(波士顿儿童医院，美国)；ATN161，(Attenuon，美国)；血管生长抑素，(波士顿儿童医院，美国)；2-甲氧基雌二醇，(波士顿儿童医院，美国)；ZD6474，(AstraZeneca，英国)；ZD6126，(Angiogene Pharmaceuticals，英国)；PPI2458，(Praecis，美国)；AZD9935，(AstraZeneca，英国)；AZD2171，(AstraZeneca，英国)；vatalanib(pINN)，(Novartis，瑞士和Schering AG，德国)；组织因子途径抑制剂，(EntreMed，美国)；pegaptanib(Pinn)，(Gilead Sciences，美国)；xanthorrhizol，(延世大学，韩国)；疫苗，基于基因，VEGF-2，(Scripps临床研究基金会，美国)；SPV5.2，(Supratek，加拿大)；SDX103，(加州大学圣地亚哥分校，美国)；PX478，(ProIX，美国)；METASTATIN，(EntreMed，美国)；肌钙蛋白1，(哈佛大学，美国)；SU6668，(SUGEN，美国)；OXI4503，(OXiGENE，美国)；o-胍，(Dimensional Pharmaceuticals，美国)；motuporamine C，(不列颠哥伦比亚大学，加拿大)；CDP791，(Celltech Group，英国)；阿替莫德(pINN)，(GlaxoSmithKline，英国)；E7820，(Eisai，日本)；CYC381，(哈佛大学，美国)；AE941，(Aeterna，加拿大)；疫苗，血管生成，(EntreMed，美国)；尿激酶纤溶酶原激活物抑制剂，(Dendreon，美国)；oglufanide(plNN)，(Melmotte，美国)；HIF-1α抑制剂，(Xenova，英国)；CEP5214，(Cephalon，美国)；BAY RES2622，(Bayer，德国)；Angiocidin，(InKine，美国)；A6，(Angstrom，美国)；KR31372，(韩国化学技术研究院，韩国)；GW2286，(GlaxoSmithKline，英国)；EHT0101，(ExonHit，法国)；CP868596，(Pfizer，美国)；CP564959，(OSI，美国)；CP547632，(Pfizer，美国)；786034，(GlaxoSmithKline，英国)；KRN633，(Kirin Brewery，日本)；药物传递系统，眼内，2-甲氧基雌二醇，(EntreMed，美国)；anginex，(马斯特里赫特大学，荷兰和明尼苏达大学，美国)；ABT510，(Abbott，美国)；AAL993，(Novartis，瑞士)；VEGI，(ProteomTech，美国)；肿瘤坏死因子-α抑制剂，(国家老年研究所，美国)；SU11248，(Pfizer，美国和 SUGEN美国)；ABT518，(Abbott，美国)；YH16，(荣昌制药，中国)；S-3APG，(波士顿儿童医院，美国和EntreMed，美国)；MAb，KDR，(ImClone Systems，美国)；MAb，α5β1，(Protein Design，美国)；KDR激酶抑制剂，(Celltech Group，英国和Johnson&Johnson，美国)；GFB116，(南佛罗里达大学，美国和耶鲁，美国)；CS706，(Sankyo，日本)；考布他汀A4药物前体，(亚利桑那州立大学，美国)；软骨素酶AC，(IBEX，加拿大)；BAY RES2690，(Bayer，德国)；AGM1470，(哈佛大学，美国，Takeda，日本和TAP，美国)；AG13925，(Agouron，美国)；四硫代钼酸盐，(密歇根大学，美国)；GCS100，(韦恩州立大学，美国)CV247，(Ivy Medical，英国)；CKD732，(Chong Kun Dang，韩国)；MAb，血管内皮生长因子，(Xenova，英国)；伊索拉定(INN)，(日本新药制药株式会社，日本)；RG13577，(Aventis，法国)；WX360，(Wilex，德国)；角鲨胺(pINN)，(Genaera，美国)；RPI4610，(Sirna，美国)；癌症疗法，(Marinova，澳大利亚)；乙酰肝素酶抑制剂，(InSight，以色列)；KL3106，(Kolon，韩国)；和厚朴酚，(艾莫雷大学，美国)；ZK CDK，(Schering AG，德国)；ZK Angio，(Schering AG，德国)；ZK229561，(Novartis，瑞士和Schering AG，德国)；XMP300，(XOMA，美国)；VGA1102，(Taisho，日本)；VEGF受体调节剂，(美国药典)；VE-钙黏着蛋白-2拮抗剂，(ImClone Systems，美国)；血管抑制素，(国立卫生研究院，美国)；疫苗，Flk-1，(ImClone Systems，美国)；TZ93，(Tsumura，日本)；TumStatin，(Beth Israel Hospital，美国)；截短的可溶性FLT1(血管内皮生长因子受体1)，(Merck&Co，美国)；Tie-2配体，(Regeneron，美国)；血小板反应蛋白1抑制剂，(Allegheny Health，Education and Research Foundation，美国)；2-苯磺酰胺，4-(5-(4-氯苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)-；Arriva；和C-Met.AVE8062(一盐酸(2S)-2-氨基-3-羟基-N-[2-甲氧基-5-[(1Z)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯基]丙酰胺)；metelimumab(pINN)(免疫球蛋白G4，抗-(人转化生长因子.β.1(人单克隆CAT192.γ.4-链))，与人单克隆CAT192.κ链二聚体)的二硫化物；Flt3配体；CD40 配体；白介素-2；白介素-12；4-1BB配体；抗-4-1BB抗体；TNF拮抗剂和TNF受体拮抗剂，包括TNFR／Fc，TWEAK拮抗剂和TWEAK-R拮抗剂，包括TWEAK-R／Fc；TRAIL；VEGF拮抗剂，包括抗-VEGF抗体；VEGF受体(包括VEGF-R1和VEGF-R2，也称为Flt1和Flk1或KDR)拮抗剂；CD148(也称为DEP-1、ECRTP和PTPRJ，参见Takahashi等，J.Am.Soc.Nephrol.10：2135-45(1999)，其对于任何目的通过引用结合到本文中)激动剂；血小板反应蛋白1抑制剂和Tie-2或Tie-2配体(如Ang-2)之一或两者的抑制剂。多种Ang-2抑制剂是本领域公知的，包括抗-Ang-2抗体，其描述于公开的美国专利申请第20030124129号(对应于PCT申请WO03／030833)和美国专利第6，166,185号，上述专利的内容通过引用整体结合到本文中。另外，Ang-2peptibody也是本领域公知的，可在例如公开的美国专利申请第20030229023号(对应于PCT申请WO03／057134)和公开的美国专利申请第20030236193号中找到，上述专利申请的内容通过引用整体结合到本文中。 
某些癌症治疗物包括但不限于：沙利度胺和沙利度胺类似物(N-(2，6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺)；替可加兰钠(硫酸化多糖肽聚糖)；TAN1120(8-乙酰-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-10-[[八氢-5-羟基-2-2-(羟丙基)]-4，10-二甲基吡喃并[3，4-d]-1，3，6-二氧杂氮杂辛英-8-基]氧基)-5，12-并四苯二酮)；suradista(7，7′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3-萘二磺酸四钠盐)；SU302；SU301；SU1498((E)-2-氰基-3-[4-羟基-3，5-双(1-甲基乙基)苯基]-N-(3-苯基丙基)-2-丙烯酰胺)；SU1433(4-(6，7-二甲基-2-喹喔啉基)-1，2-苯二醇)；ST1514；SR25989；可溶性Tie-2；SERM衍生物，Pharmos；semaxanib(pINN)(3-[(3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮)；S836；RG8803；RESTIN；R440(3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-4-(1-甲基-6-硝基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮)；R123942(1-[6-(1，2，4-噻二唑-5-基)-3-哒嗪基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-4-哌啶胺)；脯氨酸羟化酶抑制剂；渐进提高 (progression elevated)基因；普啉司他(INN)((S)-2，2-二甲基-4-[[p-(4-吡啶氧基)苯基]磺酰基]-3-硫代吗啉甲羟肟酸)；NV1030；NM3(8-羟基-6-甲氧基-α-甲基-1-氧代-1H-2-苯并吡喃-3-乙酸)；NF681；NF050；MIG；METH2；METH1；manassantin B(α-[1-[4-[5-[4-[2-(3，4-二甲氧基苯基)-2-羟基-1-甲基乙氧基]-3-甲氧基苯基]四氢-3，4-二甲基-2-呋喃基]-2-甲氧基苯氧基]乙基]-1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-甲醇)；KDR单克隆抗体；α5β3整联蛋白单克隆抗体；LY290293(2-氨基-4-(3-吡啶基)-4H-萘并[1，2-b]吡喃-3-甲腈)；KP0201448；KM2550；整联蛋白特异性肽；INGN401；GYKI66475；GYKI66462；greenstatin(101-354-纤溶酶原(人))；类风湿性关节炎、前列腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、内皮抑制素、结肠直肠癌的基因疗法，ATF BTPI，抗血管生成基因，血管生成抑制剂或血管生成；明胶酶抑制剂，FR111142(4，5-二羟基-2-己烯酸5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯)；福酚美克(plNN)(S)-α-氨基-3-羟基-4-(羟基甲基)苯乙酸)；纤连蛋白拮抗剂(1-乙酰-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-丝氨酰-L-半胱氨酰-L-天冬酰胺)；成纤维细胞生长因子受体抑制剂；成纤维细胞生长因子拮抗剂；FCE27164(7，7′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3，5-萘三磺酸六钠盐)；FCE26752(8，8′-[羰基双[亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基(1-甲基-1H-吡咯-4，2-二基)羰基亚氨基]]双-1，3，6-萘三磺酸)；内皮单核细胞活化多肽II；VEGFR反义寡核苷酸；抗血管生成因子和抗营养因子；ANCHOR血管抑制素；内皮抑制素；Del-1血管生成蛋白；CT3577；contortrostatin；CM101；软骨素酶AC；CDP845；CanStatin；BST2002；BST2001；BLS0597；BIBF1000；ARRESTIN；apomigren(1304-1388-型XV胶原(人基因COL15A1α1-链前体))；血管抑制素(angioinhibin)；aaATIII；A36；9α-氟甲羟孕酮乙酸盐((6-α)-17-(乙酰氧基)-9-氟-6-甲基-孕-4-烯-3，20-二酮)；2-甲基-2-邻苯二甲酰亚氨基戊二酸(2-(1，3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚-2-基)-2-甲基戊二酸)；钇90标记的单 克隆抗体BC-1；Semaxanib(3-(4，5-二甲基吡咯-2-基亚甲基)吲哚满-2-酮)(C15H14N2O)；PI88(磷酸甘露戊糖硫酸盐)；Alvocidib(4H-1-苯并吡喃-4-酮，2-(2-氯苯基)-5，7-二羟基-8-(3-羟基-1-甲基-4-哌啶基)-顺-(-)-)(C21H20Cl N O5)；E7820；SU11248(5-[3-氟-2-氧代-1，2-二氢亚吲哚-(3Z)-基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺)(C22H27F N4O2)；角鲨胺(胆甾烷-7，24-二醇，3-[[3-[(4-氨基丁基)氨基丙基]氨基]-，24-(硫酸氢)，(3.β，5.α，7.α)-](C34H65N3O5S)；酸性媒介黑T；AGM1470(氨基甲酸，(氯乙酰)-，5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷基]-1-氧杂螺[2，5]辛-6-基酯，[3R-[3α，4α(2R，3R)，5β，6β]])(C19H28Cl N O6)；AZD9935；BIBF1000；AZD2171；ABT828；KS-白介素-2；子宫珠蛋白；A6；NSC639366(1-[3-(二乙基氨基)-2-羟丙基氨基]-4-(环氧乙烷-2-基甲基氨基)蒽醌fumerate)(C24H29N3O4.C4H4O4)；ISV616；抗-ED-B融合蛋白；HUI77；肌原蛋白1；BC-1单克隆抗体；SPV5.2；ER68203；CKD731(3-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2(E)-丙烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[2(R)-甲基-3(R)-3(R)-(3-甲基-2-丁烯基)环氧乙烷-2-基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[2.5]辛-6-基酯)(C28H38O8)；IMC-1C11；aaATIII；SC7；CM101；Angiocol；Kringle5；CKD732(3-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-2(E)-丙烯酸)(C29H41N O6)；U995；Canstatin；SQ885；CT2584(1-[11-(十二烷基氨基)-10-羟基十一烷基-3，7-二甲基黄嘌呤](C30H55N5O3)；Salmosin；EMAP II；TX1920(1-(4-甲基哌嗪)-2-(2-硝基-1H-1-咪唑基)-1-乙烷酮)(C10H15N5O3)；α-vβ-x抑制剂；CHIR11509(N-(1-丙炔基)甘氨酰-[N-(2-萘基)]甘氨酰-[N-(氨基甲酰基甲基)]甘氨酸双(4-甲氧基苯基)甲酰胺)(C36H37N5O6)；BST2002；BST2001；B0829；FR111142；4，5-二羟基-2(E)-己烯酸(3R，4S，5S，6R)-4-[1(R)，2(R)-环氧-1，5-二甲基-4-己烯基]-5-甲氧基-1-氧杂螺[2.5]辛烷-6-基酯(C22H34O7)；以及激酶抑制剂，包括但不限于N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺(phthalazinamine)；4-[4-[[[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基]羰 基]氨基]苯氧基]-N-甲基-2-吡啶甲酰胺；N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(5-氟-1，2-二氢-2-氧代-3H-二氢亚吲哚-3-基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺；3-[(4-溴-2，6-二氟苯基)甲氧基]-5-[[[[4-(1-吡咯烷基)丁基]氨基]羰基]氨基]-4-异噻唑甲酰胺；N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基-4-哌啶)甲氧基]-4-喹喔啉胺；3-[5，6，7，13-四氢-9-[(1-甲基乙氧基)甲基]-5-氧代-12H-茚并[2，1-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-12-基]丙酯N，N-二甲基甘氨酸；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-
Figure BDA0000414386170000701
唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺；N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[[[2-(甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹喔啉胺；4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-苯基]苯甲酰胺；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-4-喹喔啉胺；N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-喹喔啉胺；N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((3-(1，3-
Figure BDA0000414386170000702
唑-5-基)苯基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；2-(((4-氟苯基)甲基)氨基)-N-(3-((((2R)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶甲酰胺；N-[3-(氮杂环丁烷-3-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-2-(4-氟-苄基氨基)-烟酰胺；6-氟-N-(4-(1-甲基乙基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；2-((4-吡啶基甲基)氨基)-N-(3-(((2S)-2-吡咯烷基甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3-(1，1-二甲基乙基)-1H-吡唑-5-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-6-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3-((((2S)-1-甲基-2-吡咯烷基)甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；2-((4-吡啶基甲基)氨基)-N-(3-((2-(1-吡咯烷基)乙基)氧基)-4-(三氟甲基)苯基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；N-(4-(五氟乙基)-3-(((2S)-2-吡咯烷基甲基)氧基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3-((3-氮杂环丁烷基甲基)氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((4-吡啶基甲基)氨基)-3-吡啶甲酰胺；N-(3-(4-哌啶氧基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-((2-(3-吡啶基)乙基)氨基)-3-吡 啶甲酰胺；N-(4，4-二甲基-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲唑-6-基氨基)-N-[3-(1-甲基吡咯啉-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-[1-(2-二甲基氨基-乙酰)-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基]-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；2-(1H-吲唑-6-基氨基)-N-[3-(吡咯啉-2-基甲氧基)-5-三氟甲基-苯基]-烟酰胺；N-(1-乙酰-3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-(4，4-二甲基-1-氧代-1，2，3，4-四氢-异喹啉-7-基)-2-(1H-吲唑-6-基氨基)-烟酰胺；N-[4-(叔丁基)-3-(3-哌啶基丙基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]甲酰胺；N-[5-(叔丁基)异e唑-3-基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]甲酰胺；和N-[4-(叔丁基)苯基][2-(1H-吲唑-6-基氨基)(3-吡啶基)]甲酰胺，以及在以下专利中公开的激酶抑制剂：美国专利第6,258,812号；第6,235,764号；第6,630,500号；第6,515,004号；第6,713,485号；第5,521,184号；第5,770,599号；第5,747,498号；第5,990,141；美国公开US20030105091；以及专利合作条约公开WO01／37820；WO01／32651；WO02／68406；WO02／66470；WO02／55501；WO04／05279；WO04／07481；WO04／07458；WO04／09784；WO02／59110；WO99／45009；WO98／35958；WO00／59509；WO99／61422；WO00／12089；和WO00／02871，各专利公开对于任何目的通过引用结合到本文中。 
在某些实施方案中，可在用癌症治疗物治疗之前、同时或之后给予HGF特异性结合物。在某些实施方案中，可预防性地给予HGF特异性结合物，以防止或减轻因转移癌而发作的骨损失。在某些实施方案中，可给予HGF特异性结合物，以治疗因转移导致的骨损失的现有症状。 
示例性的癌症包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、头和颈鳞状细胞癌、遗传性和散发性乳头状肾癌、白血病、淋巴瘤、里-费综合征、恶性胸膜间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞性肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小细胞性肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌和膀胱移行细胞癌。 
在某些实施方案中，HGF特异性结合物可单独使用或者与至少一种用于治疗癌症的另外治疗物一起使用。在某些实施方案中，HGF特异性结合物与治疗有效量的另外治疗物一起使用。可与HGF特异性结合物一起给予的示例性治疗物包括但不限于安莎霉素(anisamycin)抗生素的格尔德霉素家族的成员；Pro-HGF；NK2；c-Met肽抑制剂；Grb2Src同源物2的拮抗剂；Gab1调节剂；显性负性Src；von-Hippel-Landau抑制剂，包括但不限于渥曼青霉素；P13激酶抑制剂，其他抗受体疗法，抗EGFR，COX-2抑制剂，CelebrexTM，VioxxTM；血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF调节剂、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF调节剂、表皮生长因子(EGF)；EGF调节剂；角质形成细胞生长因子(KGF)、KGF相关分子、KGF调节剂；基质金属蛋白质酶(MMP)调节剂。 
在某些实施方案中，HGF特异性结合物与特定的治疗物一起使用，以治疗各种癌症。在某些实施方案中，HGF特异性结合物与特定的治疗物一起使用，以治疗或预防疟疾。在某些实施方案中，HGF特异性结合物与特定的治疗物一起使用，以治疗或预防增殖性糖尿病性视网膜病。在某些实施方案中，考虑到病况和期望的治疗水平，可给予两种、三种或更多种治疗物。在某些实施方案中，可通过将这些治疗物包含在同一制剂中来一起提供。在某些实施方案中，可通过将这种治疗物和HGF特异性结合物包含在同一制剂中来一起提供。在某些实施方案中，可单独配制这些治疗物，并通过包含在治疗药盒中来一起提供。在某些实施方案中，可单独配制这种治疗物和HGF特异性结合物，并通过包含在治疗药盒中来一起提供。在某些实施方案中，这种治疗物可单独提供。在某些实施方案中，当通过基因疗法给药时，可将编码蛋白质药物和／或HGF特异性结合物的基因包含在同一载体中。在某些实施方案中，编码蛋白质药物和／或HGF特异性结合物的基因可在同一启动子区的控制之下。在某些实施方案中，编码蛋白质药物和／或HGF特异性结合物的基因可在单独的载体中。 
在某些实施方案中，本发明提供包含HGF特异性结合物 以及药物可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和／或佐剂的药物组合物。 
在某些实施方案中，本发明提供包含HGF特异性结合物和治疗有效量的至少一种另外的治疗物以及药物可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和／或佐剂的药物组合物。 
在某些实施方案中，本发明涉及包含HGF特异性结合物和至少一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的疗法及使用这种疗法的治疗方法。在某些实施方案中，疗法包含HGF特异性结合物和丝氨酸蛋白酶抑制剂及至少一种本文描述的另外分子。 
在某些情况下，蛋白酶／蛋白酶抑制剂平衡的失调会导致蛋白酶介导的组织破坏，包括但不限于肿瘤侵入正常组织，导致转移。 
在某些实施方案中，HGF特异性结合物可与至少一种炎症治疗物一起使用。在某些实施方案中，HGF特异性结合物可与至少一种免疫疾病治疗物一起使用。示例性的炎症和免疫疾病治疗物包括但不限于1型环加氧酶(COX-1)和2型环加氧酶(COX-2)抑制剂；38kDa促分裂原活化蛋白质激酶(p38-MAPK)的小分子调节剂；参与炎症途径的胞内分子的小分子调节剂，其中这种胞内分子包括但不限于jnk、IKK、NF-κB、ZAP70和Ick。某些示例性的炎症治疗物描述于例如C.A.Dinarello和L.L.Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis：A primer for Clinicians第三版(2001)Amgen Inc.Thousnd Oaks，CA。 
在某些实施方案中，药物组合物包含不只一种不同的HGF特异性结合物。在某些实施方案中，药物组合物包含不只一种HGF特异性结合物，其中所述HGF特异性结合物结合不只一个表位。 
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。 
在某些实施方案中，药物组合物可含有用以调节、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗 性、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透速率的制剂材料。在某些实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂、抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环状糊精或羟丙基-β-环状糊精)；填充剂；单糖；二糖；及其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反荷离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如泊洛沙姆、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露糖醇、山梨糖醇)；传递介质；稀释剂；赋形剂和／或药物佐剂。(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro(编辑)，Mack Publishing Company(1990)。 
在某些实施方案中，HGF特异性结合物和／或治疗性分子连接到本领域公知的半寿期延长介质。这种介质包括但不限于聚乙二醇和葡聚糖。这种介质描述于例如美国申请系列号09／428,082和PCT申请公开WO99／25044，它们对于任何目的通过引用结合到本文中。 
在某些实施方案中，最佳的药物组合物由本领域技术人员根据例如预定的给药途径、传递形式和期望的剂量来决定。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，出处同上。在某些实施方案中，这种组合物可能影响本发明抗体的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。 
在某些实施方案中，药物组合物中的主要介质或载体在本质上可以是含水载体或非水载体。例如，在某些实施方案中，合适的介质或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有常用于胃肠外给药组合物的其他材料。在某些实施方案中，中性缓冲盐水或者混合有血清白蛋白的盐水是另外的示例性载体。在某些实施方案中，药物组合物包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲液，或者pH约4.0-5.5的乙酸缓冲液，且可进一步包含山梨醇或其合适的替代物。在某些实施方案中，可通过将选定的具有期望纯度的组合物与任选的配制物(Remington′s Pharmaceutical Sciences，出处同上)混合成冻干饼或水溶液的形式，制备包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外治疗物的组合物，以供保存。此外，在某些实施方案中，可用适当的赋形剂如蔗糖，将包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外治疗物的组合物配制成冻干物。 
在某些实施方案中，可以选择本发明药物组合物，以供胃肠外传递。在某些实施方案中，也可选择组合物，以供吸入，或者供通过消化道传递，如口服传递。这种药物可接受的组合物的制备在本领域的技术范围之内。 
在某些实施方案中，制剂成分以给药部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，用缓冲剂将组合物维持在生理pH或者稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。 
在某些实施方案中，当设想胃肠外给药时，用于本发明的治疗性组合物可以以药物可接受载体中的无热原的胃肠外可接受水溶液形式提供，所述水溶液包含期望的HGF特异性结合物，并含有或不含有另外的治疗物。在某些实施方案中，胃肠外注射用载体是无菌蒸馏水，HGF特异性结合物与或不与至少一种另外的治疗物一起在其中配制成无菌的等渗溶液，并被适当地保存。在某些实施方案中，制剂可能涉及将期望的分子与可为产品提供控释或缓释的物质一起配制，所述物质如可注射微球体、生物可腐蚀颗粒、聚合物(如聚乳酸或聚乙 醇酸)、珠或脂质体，所述产品然后可通过长效制剂注射来传递。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有提高在体循环中持续保留时间的作用。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置，以引入期望的分子。 
在某些实施方案中，可配制本发明药物组合物，以供吸入。在某些实施方案中，HGF特异性结合物与或不与至少一种另外的治疗物一起，可配制成干粉，以供吸入。在某些实施方案中，可用推进剂配制包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外的治疗物的吸入溶液，供作气雾剂传递。在某些实施方案中，可将溶液雾化。肺部给药在PCT申请PCT／US94／001875中有进一步的描述，其描述了化学修饰蛋白质的肺部传递法。 
在某些实施方案中，设想制剂可口服给予。在某些实施方案中，与或不与至少一种另外的治疗物一起以这种方式给予的HGF特异性结合物，可用或不用常用于调配固体剂型(如片剂和胶囊剂)的载体配制。在某些实施方案中，可设计胶囊剂，以在胃肠道中当生物利用度最大和体循环前降解最小时释放出制剂的活性部分。在某些实施方案中，可包括至少一种另外的介质，以促进HGF特异性结合物和／或任何另外治疗物的吸收。在某些实施方案中，也可采用稀释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。 
在某些实施方案中，药物组合物可包含有效量的HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外的治疗物，其与适合于制造片剂的无毒赋形剂混合。在某些实施方案中，通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当的载体中，可配制单位剂量形式的溶液。在某些实施方案中，合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或者粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或者润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。 
另外的药物组合物对本领域技术人员来说是显然的，包括涉及HGF特异性结合物、与或不与至少一种另外的治疗物一起在缓释 或控释传递制剂中的制剂。在某些实施方案中，用以配制各种其他缓释或控释传递方式，如脂质体载体、生物可腐蚀微粒或多孔珠和长效注射剂的技术，对本领域技术人员也是公知的。参见例如PCT申请PCT／US93／00829，其描述了用以传递药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。在某些实施方案中，缓释制剂可包括定型制件形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利第3,773,919号和EP058481)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers22：547-556(1983))、聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，出处同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。在某些实施方案中，缓释组合物还可包括可通过任何本领域公知的几种方法制备的脂质体。参见例如Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688-3692(1985)；EP036,676；EP088,046和EP143,949。 
用于体内给药的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可通过滤过无菌过滤膜来实现。在某些实施方案中，当组合物冻干时，可在冻干和再生之前或之后用这种方法进行灭菌。在某些实施方案中，供胃肠外给药的组合物可以冻干形式保藏，或者以溶液形式保藏。在某些实施方案中，胃肠外组合物通常装入具有无菌入口的容器，例如具有可用皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。 
在某些实施方案中，一旦配制好药物组合物，其可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体的形式，或者作为脱水或冻干粉末保藏于无菌小瓶中。在某些实施方案中，这种制剂可以以现成可用的形式或者以给药前再生的形式(例如冻干形式)进行保藏。 
在某些实施方案中，本发明涉及用以产生单剂量给药单位的药盒。在某些实施方案中，每个本发明药盒可装有含有干燥蛋白质的第一容器和含有含水制剂的第二容器。在本发明的某些实施方案中，包括装有单室和多室预灌装注射器(例如液体注射器和lyosyringe)的药 盒。 
在某些实施方案中，待进行治疗性应用的、包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外治疗物的药物组合物，其有效量取决于例如治疗内容和目标。本领域技术人员会认识到，根据某些实施方案，用于治疗的适当剂量水平部分根据所传递的分子、HGF特异性结合物与或不与至少一种另外治疗物一起所应用的适应症、给药途径以及患者的大小(体重、体表面积或器官大小)和／或状态(年龄和总体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量和修改给药途径，以获得最佳治疗效果。在某些实施方案中，取决于上述因素，典型的剂量可在约0.1μg／kg至最高达约100mg／kg或更高的范围内。在某些实施方案中，剂量可在0.1μg／kg至约100mg／kg的范围内；或者在1μg／kg至约100mg／kg的范围内；或者在5μg／kg至约100mg／kg的范围内。 
在某些实施方案中，给药频率要考虑所用制剂中HGF特异性结合物和／或任何另外治疗物的药物动力学参数。在某些实施方案中，临床医生给予组合物，直到达到实现期望效果的剂量。因此，在某些实施方案中，组合物可以单剂量给予，或者以两个或更多个剂量(可含有或不含有相同量的期望分子)随时间推移来给予，或者通过植入装置或插管进行连续输液来给予。适当剂量的进一步改进可由本领域普通技术人员常规进行，这在他们日常执行的任务范围内。在某些实施方案中，可通过使用适当的剂量-反应数据来确定适当剂量。 
在某些实施方案中，药物组合物的给药途径与已知的方法相一致，例如口服给药；通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内(intraporal)或病灶内(intralesional)途径注射给药；通过缓释系统或通过植入装置给药。在某些实施方案中，可通过大剂量注射或连续输液给予组合物，或者通过植入装置给予组合物。 
在某些实施方案中，可通过植入已吸收有或包入了期望分 子的薄膜、海绵或其他适当材料，局部给予组合物。在使用植入装置的某些实施方案中，植入装置可植入到任何合适的组织和器官中，期望分子的传递可通过扩散、定时释放大剂量或连续给予来进行。 
在某些实施方案中，还可期望以活体外的方式使用包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外治疗物的药物组合物。在这种情况下，使从患者中取出的细胞、组织或器官暴露于包含HGF特异性结合物并含有或不含有至少一种另外治疗物的药物组合物，随后将细胞、组织和／或器官植回患者体内。 
在某些实施方案中，可通过植入细胞来传递HGF特异性结合物和／或任何另外治疗物，所述细胞用本文所述方法基因工程改造以表达和分泌多肽。在某些实施方案中，这种细胞可以是动物细胞或人类细胞，且可以是自体同源细胞、异源细胞或异种细胞。在某些实施方案中，细胞可以是无限增殖化细胞。在某些实施方案中，为降低出现免疫反应的可能性，可使细胞包囊化，以避免周围组织的浸润。在某些实施方案中，包囊材料通常是生物相容性、半透性高分子包裹物或膜，其允许蛋白质产物释放，但防止细胞被患者的免疫系统或者被来自周围组织的其他有害因素破坏。 
实施例
以下实施例，包括所进行的实验和所得到的结果，只供说明目的，不能被理解为限制本发明。 
实施例1 
抗-HGF杂交瘤的产生
在
Figure BDA0000414386170000791
小鼠(Abgenix，Fremont，CA)中产生抗HGF抗体，所述小鼠携有人免疫球蛋白基因。用三组
Figure BDA0000414386170000792
小鼠——1a组、1b组和2组来产生抗HGF抗体，在表1中作总结。1a组由 XMG2品系小鼠组成，产生完全人IgG2κ抗体。1a组用 HGF免疫。使用Nakamura等，Nature342：440-443(1989)中的序列，用标准的重组技术制备HGF。 
1b组也是由
Figure BDA0000414386170000801
XMG2品系小鼠组成，但是1b组小鼠用已化学缀合到具有以下序列的T-细胞表位(TCE)的HGF免疫：Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Cys(SEQ ID NO.47)。使用Sulpho-SMCC(Pierce，目录号22322)和二硫苏糖醇(Fisher Scientific)，通过由TCE的C端半胱氨酸交联到HGF的N端，将TCE缀合到HGF。用
Figure BDA0000414386170000802
柱(Amicon)将所得的缀合TCE-HGF与未缀合的肽分离。 
2组由
Figure BDA0000414386170000803
XMG1品系小鼠组成，产生完全人IgG1κ抗体。2组小鼠用上述缀合TCE-HGF免疫。 
按照表1的时间表给所有三组小鼠注射抗原(HGF或TCE-HGF)八次。在第一次免疫，每只小鼠在后足垫注射共10μg抗原(每个足垫5μg)。这些注射剂含有
Figure BDA0000414386170000804
Gold(Sigma，目录号T2684)佐剂。在第2次到第7次注射，每只小鼠注射共5μg抗原，所述抗原在alum gel(磷酸铝凝胶佐剂；Superfos Biosector a／s，由E.M.Sargent Pulp and Chemical Co.，Clifton NJ供应，目录号1452-250)佐剂中。最后一次注射每只小鼠注射共10μg，注射剂不含佐剂。 
表1.小鼠的免疫
Figure BDA0000414386170000811
每只小鼠在第六次注射后两天放血。通过ELISA测定放血得到的血液样品，以确定抗HGF抗体的滴度。在这些ELISA测定中，用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的HGF涂布96-孔板(Fisher Scientific目录号12-565-136)。加入血液样品，在室温下孵育各板2小时。孵育后，用洗涤溶液(0.05％Tween20于PBS中)洗涤各板三次，加入100ul／孔的第二抗体。该第二抗体是缀合辣根过氧化物酶(Southern Biotech目录号9060-05)的山羊抗人IgGFc抗体。在室温下孵育1小时后，洗涤各板，加入100μl／孔的TMB显影液(BioFX Lab目录号 TMSK-0100-01)。10分钟后，加入50μl／孔的TMB终止液(BioFX Lab目录号STPR-0100-01)。各板在ELISA板读数器中于450nm波长处读数。 
最后一次注射后四天，处死小鼠，收获其引流(draining)淋巴结，回收淋巴细胞。分别集中得自所述三组的每组小鼠的淋巴细胞。为使淋巴细胞样品富集B细胞，通过加入抗-CD90磁珠(MiltenyiBiotech目录号491-01)，然后使淋巴细胞通过LS+柱(Miltenyi Biotech目录号424-01)，耗尽T细胞。 
然后用electrocell融合装置(Genetronic，Inc.，ECM2001型)，将三个B细胞富集的淋巴细胞样品各自与P3骨髓瘤细胞融合，创建杂交瘤。然后将三组融合杂交瘤系平板接种于96-孔板中含次黄嘌呤-重氮丝氨酸(Sigma)的杂交瘤培养基(成分见表2)中，接种密度为每孔1x106个B细胞富集的淋巴细胞。杂交瘤系在37℃、15％CO2下培养14天。 
14天后，用上述用以测定血液样品的相同方案，通过ELISA测定培养物上清液，以检测抗HGF人IgG抗体的存在。在该ELISA中检测为阳性的培养物上清液，在第二ELISA中检测人κ链的存在。在该第二ELISA中，除了第二抗体为缀合到辣根过氧化物酶的山羊抗人κ链抗体之外，其他条件与第一ELISA的完全相同。进一步使在两次ELISA测定中检测为阳性的杂交瘤增大，以产生5ml上清液，供体外功能试验，该试验在实施例8和9中讨论。测试了来自对应于1a组小鼠的82个克隆的上清液、来自对应于1b组小鼠的42个克隆的上清液和来自对应于2组小鼠的176个克隆的上清液。 
根据这些功能试验的结果，鉴定出几个杂交瘤系产生抗HGF抗体。用有限稀释从每个杂交瘤系中分离三至六个克隆。这些克隆用杂交瘤系编号(例如1.24)和克隆编号(例如1.24.1)标识。通过实施例8和9中讨论的功能试验，没有检测出具体杂交瘤系的不同克隆之间的差别。使这些分离克隆各自在50-100ml杂交瘤培养基中增大，并 让其生长至衰竭(即低于约10％细胞生存力)。通过ELISA和通过实施例8和9中讨论的体外功能试验，测定这些培养物上清液中的抗HGF抗体的浓度和效力。鉴定出10个具有最高滴度的抗HGF抗体的杂交瘤。这些杂交瘤标识为1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1。 
表2.培养基的组成
Figure BDA0000414386170000841
实施例2 
从杂交瘤产生抗体
用两个不同的系统——Integra烧瓶和充气旋动瓶之一，从实施例1中讨论的十个杂交瘤制备抗体。 
Integra烧瓶
七个杂交瘤系——2.12.1、1.24.2、1.29.1、1.74.1、1.75.1、1.60.2和2.40.1各自分别生长于T75烧瓶中的20ml HSFM培养基(培养基成分见表2)。当杂交瘤几乎铺满T75烧瓶时，将它们转移到Integra烧瓶(Integra Biosciences，Integra CL1000，目录号90005)。 
Integra烧瓶是用膜隔成小室和大室两个室的细胞培养烧瓶。将七个杂交瘤系各自20-30ml体积的杂交瘤细胞以1×106个细胞／ml的最小细胞密度置于七个Integra烧瓶的小室中的Integra培养基(Integra培养基成分见表2)。在Integra烧瓶的大室中只装入Integra培养基(1L)。分隔两室的膜能透过小分子量营养物，但不能透过杂交瘤细胞及其产生的抗体。因此，杂交瘤细胞及其产生的抗体被保留在小室中。 
一周后，除去七个Integra烧瓶各自的两室中的培养基，用新鲜的Integra培养基置换。分别保留从七个小室收集的培养基。再生长一个周后，再次从小室收集培养基。将从各杂交瘤系收集的第1周培养基与从相同杂交瘤系收集的第2周培养基合并。离心(15分钟，3000rpm)从七个杂交瘤系所得的七个收集培养基样品，除去细胞和碎片，过滤所得的上清液(0.22um)。 
充气旋动瓶(3L)
将3.10.1、2.4.4和2.12.1这三个杂交瘤系分别培养于T75烧瓶中的20ml HSFM培养基。当杂交瘤达到足够的细胞密度时，将它们转移到T175烧瓶。同样，当杂交瘤在T175烧瓶中达到足够的细 胞密度时，将它们转移到100ml旋动瓶，然后转移到500ml旋动瓶，再然后转移到1L旋动瓶。当细胞在1L旋动瓶中达到足够的细胞密度时，将它们转移到3L充气旋动瓶(Bellco Biotechnology，目录号1965-300，带侧臂配件(sidearm fitting)，目录号1965-30003)。 
该3L充气旋动瓶是玻璃容器，其中培养物用磁力平台控制的叶轮混合。所述旋动瓶连接到供气线路，以提供5％CO2和空气。 
杂交瘤3.10.1
用杂交瘤系3.10.1的杂交瘤细胞接种两个3L充气旋动瓶中的HSFM培养基，培养基中的加入物见表3，表3总结了所述两个充气旋动瓶的生长条件。 
表3.杂交瘤3.10.1的生长条件
条件 旋动瓶1 旋动瓶2
接种密度(10E6细胞／ml) 0.46 0.46
HSFM(Gibco目录号12045-076) X X
Ultra low IgG血清(Gibco目录号16250-078) 5％ 5％
L谷氨酰胺(JRH目录号59202-500M) 8mmol／L 2mmol／L
P／S(Gemini目录号400-109) 1％ 1％
NEAA(JRH目录号58572-77P) 1％ 1％
蛋白胨(Difco，目录号211693) 1g/L 1g/L
2M葡萄糖(JT Baker，目录号1920-07) 8g/L 2g/L
消泡剂C(Sigma目录号A-8011) 2ml／L 2ml／L
产量(μg／ml) 24 34
培养物生长15天，当通过台盼蓝排斥试验测出的生存力低于20％时进行收获。收获包括以7000rpm离心15分钟，随后将所得上清液滤过0.22μm过滤器。通过用蛋白质A HPLC测量最终收获样 品中存在的蛋白质的量，测定产量，报告于表3中。 
杂交瘤2.4.4
用杂交瘤系2.4.4的杂交瘤细胞接种五个3L充气旋动瓶中的HSFM培养基，培养基中的加入物见表4，表4总结了所述五个充气旋动瓶的生长条件。 
表4.杂交瘤2.4.4的生长条件
Figure BDA0000414386170000871
培养物按表4所示生长7、8或10天，如上所述，当细胞生存力低于20％时，收获培养物。 
杂交瘤2.12.1
用杂交瘤系2.12.1的杂交瘤细胞接种六个3L充气旋动瓶中的HSFM培养基，培养基中的加入物见表5，表5总结了所述六个 充气旋动瓶的生长条件。 
表5.杂交瘤2.12.1的生长条件
Figure BDA0000414386170000881
培养物按表5所示生长7或11天，如上所述，当细胞生存力低于20％时，收获培养物。 
实施例3 
抗体重链和轻链的克隆和序列分析
A.轻链的克隆
如实施例1所讨论，鉴定出十个表达抗HGF单克隆抗体的杂交瘤(1.24.1、1.29.1、1.60.1、1.61.3、1.74.3、1.75.1、2.4.4、2.12.1、2.40.1和3.10.1)。用
Figure BDA0000414386170000882
试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从这十个杂交瘤的每一个分离总RNA。用
Figure BDA0000414386170000883
试剂盒(Invitrogen)使这十个 总RNA制品的5′-末端适应5′cDNA末端快速扩增(RACE)。然后将这十个5′-修饰的RNA制品用于十个单独的RACE反应中，各反应使用具有延伸衔接头的随机引物(5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3′)(SEQ ID NO：48)，产生十种cDNA分子。 
然后在单独的聚合酶链反应(PCR)中扩增这十种cDNA分子，产生十种扩增的κ轻链序列。对于这些反应的每一个，正向引物是正向GeneRacerTM嵌套引物(5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3′)(SEQ ID NO：49)。设计反向引物(5′-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3′)(SEQ ID NO50)，以结合与κ轻链互补的序列。 
然后将这十种扩增的κ轻链序列的每一种分别连接到单独的pCR4-TOPO质粒(Invitrogen)。然后将各含十种κ轻链序列之一的十种所得质粒分别在细菌中扩增，各质粒各取几个克隆进行测序。用这些序列设计PCR引物，以如下所述从克隆的质粒扩增十种κ轻链开放阅读框序列。 
十个PCR的每一个的引物组包括5′-引物和3′-引物。每种5′-引物包含与具体κ轻链序列的氨基末端序列互补的部分、最优化的Kozak序列及一个或多个限制位点。例如，与最终衍自杂交瘤3.10.1的质粒一起用于反应的5′-引物的序列是： 
5′-ACA ACA AAG CTT CTA GAC CAC CATGGA AGC CCC AGC TCA 
                   XbaI    Kozak 
GCT TCT CTT-3′(SEQ ID：51) 
每个PCR的3′-引物包含与具体κ轻链序列的羧基末端序列互补的部分，包括终止密码子和限制位点。例如，与最终衍自杂交瘤3.10.1的质粒一起用于反应的3′-引物的序列是： 
5′-CTTGTC GACTCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT 
        SalI    ＊ 
C-3′(SEQ ID NO：52) 
单独的引物组与相应克隆的质粒一起用于单独的PCR反 应中，以扩增十种κ轻链编码区序列。使从这些反应获得的十种扩增产物分别进行凝胶分离，并用
Figure BDA0000414386170000901
凝胶提取试剂盒(目录号28704，Qiagen，Valencia，CA)纯化。然后这些纯化产物各自用合适的限制酶切割，获得与质粒分开的κ轻链编码区序列。例如，用XbaI和SalI切割对应于杂交瘤3.10.1的纯化产物，所述酶的位点如上所述在该克隆质粒的PCR扩增过程中由引物引入。所得的限制酶消化κ轻链编码区序列再分别进行凝胶分离，并用
Figure BDA0000414386170000902
凝胶提取试剂盒(目录号28704，Qiagen，Valencia，CA)纯化。 
然后将这十种纯化的限制酶消化κ轻链编码区序列各自分别连接到哺乳动物表达载体pDSRα20(WO90／14363)，以创建对应于十个原始杂交瘤的的十种单独的κ轻链表达载体。然后对这十种κ轻链表达载体插入片段进行测序。确认含有最终衍自杂交瘤3.10.1的κ轻链编码区的pDSRα20表达载体(pDSRα20：3.10.1)包含5473个碱基对，其中包括719个碱基对PCR片段，后者编码3.10.1κ轻链的235个氨基酸残基(包括20个氨基酸的κ链信号序列)。如表6所示，该表达载体包含七个功能区。 
表6表达载体pDSRα20：3.10.1κ 
质粒碱基对号： 
Figure BDA0000414386170000911
B.重链的克隆
用与以上实施例3A中讨论的用于克隆轻链的相同方法，从十个杂交瘤克隆抗HGF抗体重链的可变区。如以上实施例3A所述，分离得自十个杂交瘤的每一个的总RNA，进行RACE5′-修饰，并用以产生cDNA分子。 
如实施例3A中对轻链所讨论的，在单独的PCR反应中扩增这十种cDNA分子，例外的是设计反向引物(5′-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3′(SEQ ID NO：53))，以结合重链可变区的互补序列。正向引物还是正向GeneRacerTM嵌套引物(5′GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA-3′)(SEQ ID NO：49)。 
将十种扩增重链可变区序列的每一种分别连接到pCR4-TOPO质粒。然后将所得的十种各含有十种重链可变区序列之一的质粒分别在细菌中扩增，并如以上实施例3A中对轻链所述，各质粒各取几个克隆进行测序。用这些序列设计PCR引物，以如下所述从克隆的质粒扩增每一种重链可变区。 
使用以上实施例3A中讨论的用于轻链的相同策略，设计十个PCR的每一个的引物组。每种5′-引物包含与具体重链可变区序列的氨基末端序列互补的部分、最优化的Kozak序列及一个或多个限制位点。例如，用以扩增最终衍自杂交瘤3.10.1的重链可变区的5′-引物的序列是： 
5′-AGC AGA AGC TTC TAG ACC ACC ATG AAA CAC CTG TGG TTC 
                 XbaI    Kozak 
TTC CTC CTC-3′(SEQ ID NO：54) 
十个PCR的每一个的3′-引物包含与具体重链可变区序列的共有序列的羧基末端互补的部分，包括终止密码子和限制位点。例如，用以扩增最终衍自杂交瘤3.10.1的重链可变区的3′-引物的序列是： 
5′-GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG GTT CC-3′ 
                     BsmBI 
(SEQ ID NO：55) 
单独的引物组与相应克隆的质粒一起用于单独的PCR反应中，以扩增十种重链可变区序列。使从这些反应获得的十种扩增产物分别进行凝胶分离，用QUIAquick凝胶提取试剂盒纯化，并如实施例3A中对轻链所述用合适的限制酶切割。如实施例3A中所述，所得的限制酶消化重链可变区序列再分别进行凝胶分离，并用QUIAquick凝胶提取试剂盒纯化。 
然后将这十种纯化的限制酶消化重链可变区序列的三种——最终衍自杂交瘤3.10.1、1.24.1和2.4.4的重链可变区序列分别连接到哺乳动物表达载体pDSRα20：hIgGCH中，以创建三种重链IgG1表达载体。pDSRα20：hIgGCH表达载体与pDSRα20相同，例外的是它 还含有IgG1恒定区序列。pDSRα20：hIgGCH表达载体在表7中总结。 
表7.pDSRα20：hIgGCH表达载体 
质粒碱基对数： 
Figure BDA0000414386170000941
对三个IgG表达载体插入序列的重链可变区进行测序。含有最终源自杂交瘤3.10.1的重链可变区的pDSRα20：hIgGCH表达载体(pDSRα20：hIgGCH：3.10.1)在表8中总结。 
表8.pDSRα20：hIgGCH：3.10.1表达载体 
质粒碱基对数目： 
Figure BDA0000414386170000951
将十种纯化的重链可变区序列的每一种分别与编码IgG2恒定区的序列一起连接到pDSRα20哺乳动物表达载体，创建十种IgG2表达载体。所得的十种IgG2表达载体的每一种(标识为pDSRα20：hIgG2：杂交瘤#)包含编码IgG2恒定区的序列和十种重链可变区序列之一。对这十种重链可变区序列插入序列进行测序，以确认它们包含来自pCR4-TOPO克隆的克隆质粒中鉴定出的相同重链可变区序列。含有最终源自杂交瘤2.12.1(pDSRα20：hIgG2：2.12.1)的重链可变区的pDSRα20：hIgG2表达载体在表9中总结。 
表9.pDSRα20：hIgG2：2.12.1表达载体 
质粒碱基对数： 
Figure BDA0000414386170000961
κ轻链可变区的cDNA序列(SEQ ID NO.：1，3，5，7，9，11，13，15，17和19)、κ轻链恒定区的cDNA序列(SEQ ID NO：21)、重链可变区的cDNA序列(SEQ ID NO.：2，4，6，8，10，12，14，16，18和20)以及IgG1和IgG2重链恒定区的cDNA序列(SEQ ID NO：22和23)在图3中显示。 
对从这些cDNA序列的每一种预测的多肽序列进行确定。κ轻链可变区的预测多肽序列(SEQ ID NO：.24，26，28，30，32，34，36，38，40和42)、κ轻链恒定区的预测多肽序列(SEQ ID NO44)、重链可变区的预测多肽序列(SEQ.ID NO.25，27，29，31，33，35，37，39，41和43)以及IgG1和IgG2重链恒定区的预测多肽序列(SEQ ID NO：45和46) 在图4中显示。 
根据序列数据，确定衍生每种重链可变区或轻链可变区的种系基因。图1、2、3或4中种系基因的标记紧接标示在相应的杂交瘤系之后。对序列的相关性作进一步分析(图1B和2B)，得出图1A(κ轻链可变区)和图2A(重链可变区)表示的进化系统树。 
实施例4 
在293T细胞中的瞬时表达
在十个单独的共转染中，用包含实施例3A所述的κ轻链序列的pDSRα20表达载体(轻链载体)和包含实施例3B所述的重链序列的pDSRα20表达载体(重链载体)共转染293T细胞。在这十个单独的共转染中，用最终衍自实施例1中讨论的杂交瘤之一的轻链载体和重链载体共转染293T细胞。具体地说，对于最终衍自杂交瘤3.10.1的载体的共转染，使用包含IgG1(pDSRα20：hIgGCH：3.10.1)的重链载体。对于最终衍自其他九个杂交瘤的载体的共转染，使用包含IgG2(pDSRα20：hIgG2：杂交瘤#)的重链载体。使用Fugene6或X-TremeGene RO-1539(均来自Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)，按照厂商提供的说明书进行共转染。 
首先使用黏着293T细胞在标准的滚瓶中进行共转染。以每滚瓶4x107-5x107个细胞接种滚瓶中的DMEM，所述DMEM含有5％胎牛血清(FBS)(Hyclone，目录号SH30070.03)、1X非必需氨基酸(Sigma，目录号M7145)、1X青霉素／链霉素(Sigma，目录号P7539(10,000U／ml青霉素／链霉素))和1X丙酮酸钠(Invitrogen，Carlsbad，CA)。当细胞铺满滚瓶的60-70％时，将最终源自特定杂交瘤的重链载体和轻链载体共转染到细胞中，持续24小时，随后将培养基改成不含血清的相同培养基。在转染后48小时和96小时两次收集无血清培养基，并用新鲜的无血清培养基置换，共收集到1.25L体积的无血清培养基。 
使用无血清适应的293T细胞在上述无血清的相同培养基 中的悬浮液，重复进行十个单独的共转染。将对应于特定杂交瘤的重链载体和轻链载体共转染到培养体积为500mL的细胞中。转染细胞培养7天后，收集无血清条件培养基。 
实施例5 
CHO细胞的抗体表达和克隆
用DHFR缺陷的中国仓鼠卵巢细胞(CHOd-)产生重组抗HGF抗体的稳定表达。如实施例4所讨论，在十个单独的共转染中，用最终衍自实施例1讨论的杂交瘤之一的重链载体和轻链载体共转染CHOd-细胞。用标准的磷酸钙方法实现共转染。 
使十个共转染的每一个的转染细胞分别生长于选择性培养基中，所述选择性培养基无次黄嘌呤-胸苷(Gibco／BRL，Carlsbad，CA目录号11965)，含有高葡萄糖DMEM及5％透析过的胎牛血清。这种无次黄嘌呤-胸苷的培养基选择表达重组DHFR酶的细胞的生长。用标准的ELISA测定筛选各生长转染子的培养基，以检测人抗体的存在。 
实施例6 
CHOd-克隆中抗HGF抗体的表达
实施例5所述的十个不同稳定CHOd-克隆(每个不同的克隆表达十种不同的抗HGF抗体之一)的每一个取六个样品，分别生长于生长培养基中。所述生长培养基是高葡萄糖DMEM(Gibco／BRL，Carlsbad，CA目录号11965)，补充有5％透析过的FBS、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺(Life Technologies，Carlsbad，CA)。细胞在37℃、5％CO2下生长。 
当CHOd-克隆达到六孔(six-well)生长阶段时，向生长培养基中加入10nM甲氨喋呤，增强抗体的表达。细胞铺满之后，将其转移到100mm平皿。甲氨喋呤的浓度从10nM逐步提高至20nM、至50nM、至100nM、至250nm、至500nM、至1μM、至2μM、至4μM， 最后至10μM。使细胞在每种浓度下最少保持1周，直到据目测确定它们已充分适应给定的甲氨喋呤浓度。 
检测每种甲氨喋呤浓度下各克隆的条件培养基，以测定每种抗HGF抗体的表达水平。通过标准的ELISA和时间分辨荧光(TRF)夹心测定法，半定量地测量抗HGF抗体与涂布人HGF的平板的结合，来检测培养基。 
如下所述使抗体表达水平最高的甲氨喋呤增强克隆适应在无血清生产培养基中生长。用胰蛋白酶处理培养容器中的克隆，离心，并在250ml紧固盖(solid cap)摇瓶中以4x105个细胞／ml重新悬浮于50ml无血清生产培养基中。培养物在37℃温室中孵育，搅拌速度大约125RPM。每隔3-4天，离心收集细胞，用新鲜的无血清生产培养基稀释至4x105个细胞／ml。对于每种培养物，大约加入十倍新鲜的无血清生产培养基，以完成此适应期。 
实施例7 
从重组细胞条件培养基纯化抗体
收集实施例1所述的杂交瘤、实施例4所述的瞬时表达293T细胞、实施例5所述的稳定转染子和实施例6所述的甲氨喋呤增强克隆的培养基。用YM30spiral wound cartridge(Milipore，Bedford，MA目录号S10Y30)，按照厂商提供的说明书，将来自这些来源的各培养基分别浓缩约10倍。通过高效液相色谱(HPLC)估算各浓缩培养基样品中的抗体浓度。 
用重组蛋白质A琼脂糖(rProA)(Amersham，Piscataway，NJ，目录号17-1279-03)，通过亲和树脂纯化从浓缩培养基样品纯化抗体。首先用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤rProA四次。最后一次洗涤之后，通过混合等体积的rProA和PBS，制备洗涤rProA在PBS中的淤浆。将该rProA淤浆加入到各浓缩培养基中，加入量大约为各培养基样品中5μg抗体加入1μlrProA淤浆，但对于任何培养基样品，加入量均不低于 50μl rProA淤浆。所得培养基／淤浆样品在4℃搅拌下孵育过夜。然后离心培养基／淤浆样品，使rProA沉淀。弃去含有未结合蛋白质的上清液级份。将rProA沉淀分别重新悬浮于各0.5ml PBS中。然后将重新悬浮的rProA样品转移到0.45μm Spin-X管(CoStar，Corning NY，目录号8162)，离心除去PBS。然后每次用0.5ml PBS洗涤Spin-X管中的rProA三次。 
通过加入1.5体积的0.1M甘氨酸，pH2.7并在室温下孵育10分钟，从Spin-X管中的rProA洗脱抗体级份。然后离心Spin-X-管，分别收集各Spin-X管的洗脱液。重复洗脱，集中得自各Spin-X-管的两份洗脱液。用二十五分之一体积的1.0M Tris，pH9.2中和集中洗脱液的pH。然后使各样品滤过新的Spin-X管，除去颗粒物。 
用人IgG为标准，通过Bradford测定法检测最终制品的蛋白质浓度。将各最终制品的样品分别在SDS-PAGE凝胶的不同道上跑胶，用考马斯蓝染色并进行目测检查，以评估纯度。 
实施例8 
抗体结合HGF的特征
A.亲和力测定 
按照厂商说明书使用
Figure BDA0000414386170001001
3000(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)，对实施例6所述的六种抗HGF抗体(最终衍自杂交瘤3.10.1、2.4.4、2.12.1、1.29.1、1.75.1和1.74.3)进行亲和力分析。用于这些分析的操作缓冲液是含0.005％P20表面活性剂(BIAcore，Inc.Piscataway，NJ)的PBS。按照厂商说明书使用胺偶联试剂盒(Biacore，Inc.Piscataway，NJ)，通过伯胺基团将重组G蛋白(Pierce，Rockford，IL)固定化到研究级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.Piscataway，NJ)。 
在这六个单独的样品中，按照厂商说明书将约200共振单位(RU)的六种抗HGF抗体的每一种分别连接到固定化G蛋白。以50μl／min的流速将包含各种浓度(0-100nM)的人HGF的样品注射经过结 合抗体表面，持续3分钟。用BIA评估版3.1计算机程序(BlAcore，Inc.Piscataway，NJ)测定抗体结合动力学参数，包括ka(缔合速率常数)、kd(解离速率常数)和KD(解离平衡常数)。较低的解离平衡常数表明抗体对HGF的亲和力较强。数据在图6A中显示。 
还用平衡结合法测定四种抗HGF抗体(最终衍自杂交瘤2.4.4、1.29.1、1.74.2和2.12.1)的每一种的KD值。该法是使用含0.005％P20表面活性剂(BIAcore，Inc.Piscataway，NJ)的PBS作为操作缓冲液，用
Figure BDA0000414386170001011
3000(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)来进行的。按照厂商说明书使用胺偶联试剂盒(Biacore，Inc.Piscataway，NJ)，通过伯胺基团将这四种抗HGF抗体分别固定化到研究级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.Piscataway，NJ)。 
在单独的测定中，在室温下，将浓度范围(0.01nM-50nM)内的这四种抗HGF抗体的每一种分别与两种不同浓度(0.05nM和1nM)的人HGF(于含0.005％P-20和0.1mg／mL BSA的PBS中)的每一种孵育至少六小时。然后将这些样品的每一种注射经过已固定化有相同抗HGF抗体的CM5传感器芯片的表面。所获得的结合信号与溶液中的游离HGF成比例。用双曲线单点同质结合模型(dual-curve one-sitehomogeneous binding model)(KinExA软件，Sapidyne Instruments Inc.，Boise ID)对竞争曲线进行非线性回归分析，获得解离平衡常数(KD)。这些解离平衡常数值在图6B中显示。 
B.抗体结合HGF的特异性 
人HGF在CHO细胞中表达，或者购自R&D Systems(R&D Systems，Minneapolis MN，目录号294-HG-005)。用Liu等，Molecular cloning and characterization of cDNA encoding mouse hepatocyte growth factor，Biochim Biophys Acta.16：1216(2)：299-300(1993)中所述的序列，制备重组小鼠HGF。通过用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达，或者通过在293T细胞中表达，获得重组小鼠HGF。在任一种情况下，均通 过硫酸肝素亲和色谱纯化小鼠HGF。 
各人HGF制品和小鼠HGF制品均显示生物活性。人HGF在人PC3细胞(ATCC Manassas，VA#CRL1435)和在小鼠4T1细胞(ATCC Manassas，VA#CRL2531)中诱导剂量依赖性人Met磷酸化。小鼠HGF在小鼠4T1细胞中诱导Met磷酸化，但不能在人PC3细胞中诱导。 
将人HGF和小鼠HGF在SDS PAGE凝胶的单独道上跑胶。人HGF和小鼠HGF分别以100ng／道和10ng／道各自进行。某些凝胶在非还原条件下进行，其他单独的凝胶在还原条件下(使用β-巯基乙醇)进行。将SDS PAGE凝胶中的人HGF和小鼠HGF转移到硝基纤维膜上。将这些膜分别与实施例6所述的十种抗HGF抗体之一孵育。这十种抗HGF抗体的每一种分别与硝酸纤维膜一起孵育，该硝酸纤维膜得自还原条件下含人HGF和小鼠HGF的凝胶和非还原条件下含人HGF和小鼠HGF的凝胶。然后将硝酸纤维膜与连接到HR的山羊抗人IgG抗体(Pierce，Rockford，IL，目录号31412)一起孵育。按照厂商说明书使用电化学发光仪(ECLTM；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ，目录号RPN2106)检测该连接到HR的山羊抗人IgG抗体的信号。 
图7显示检测实施例6所述的十种抗HGF抗体的每一种的凝胶照片。左边的图片显示在非还原条件下检测抗100ng的人HGF(道1)、10ng的人HGF(道2)、100ng的小鼠HGF和10ng的小鼠HGF(道4)的每种抗体的凝胶。右边的图片显示在还原条件下检测抗100ng的人HGF(道5)、10ng的人HGF(道6)、100ng的小鼠HGF(道7)和10ng的小鼠HGF(道8)的每种抗体的凝胶。受测的各抗HGF抗体在非还原条件下均结合人HGF(道1和2)。受测的抗HGF抗体在非还原条件下均不明显结合小鼠HGF(道3和4)，在还原条件下均不明显结合人HGF(道5和6)或小鼠HGF(道7和8)。 
C.用融合蛋白进行表位作图 
用标准的分子技术构建哺乳动物表达载体(图9A)，所述表 达载体包含编码鸡亲和素的cDNA序列，后者邻近pCEP4载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号V044-50)的多克隆位点。该载体中包括鸡亲和素信号序列(图9B)，使随后表达的融合蛋白能够分泌。通过将编码特定靶蛋白的序列插入到融合蛋白表达载体的多克隆位点，构建表达载体。所得融合构建物各自在靶蛋白的N端编码亲和素蛋白。 
使用这种技术，制备融合到以下靶蛋白的包含亲和素的融合蛋白：全长人HGF；d5HGF，其为人HGF的天然剪接变体(Rubin，J.等PNAS88：415-419(1991))；全长小鼠HGF；包含人HGF的N-端部分(氨基酸32-505)和小鼠HGF的C-端部分(氨基酸508-728)的嵌合体#1；包含小鼠HGF的N-端部分(氨基酸33-506)和人HGF的C-端部分(氨基酸506-728)的嵌合体#2；及包含人HGF的N-端部分(氨基酸32-582)和小鼠HGF的C-端部分(氨基酸583-728)的嵌合体#3。 
融合蛋白的示意图在图10中显示。HGF的N端结构域含有四个kringle结构域，由标记为K1-K4的方框表示。HGF的C端结构域与丝氨酸蛋白酶享有同源性。该结构域由横条表示。空心的方框和实心的横条表示人HGF序列。带阴影的方框和带条纹的横条表示小鼠的序列。 
通过按照厂商说明书使用Lipofectamine(Gibco BRL，Carlsbad，CA，目录号18324)，用单独的融合蛋白表达载体之一分别转染293T细胞，使单独的融合蛋白在细胞中瞬时表达。转染约48小时后，收集条件培养基并进行检测。 
在单独的样品中，将实施例6所述的十种抗HGF抗体的五种(最终衍自杂交瘤2.4.4、1.74.1、1.75.1、3.10.1和2.12.1)分别与包含每种以下靶蛋白的融合蛋白一起孵育：全长人HGF、d5HGF和小鼠HGF。孵育后，用涂布生物素的珠(Spherotech Inc.，Libertyville，IL，目录号TP-60-5)分别捕捉各样品中的融合蛋白。通过加入FITC标记的抗亲和素抗体(Vector Lab，Burlingame，CA，目录号SP-2040)，标记所得珠-蛋白质复合物。通过加入藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人F(ab′)2抗体 (Southern Biotech Associates，Inc，Birmingham，AL，目录号2043-09)，测定抗HGF抗体的存在。 
然后用荧光激活细胞分选仪(FACS)对这些样品进行分析。在Becton Dickinson Bioscience FACScan(BD，Franklin Lakes，NJ)上检测FITC(其显示亲和素的存在)和／或PE(其显示抗HGF抗体的存在)标记的珠复合物。受测的五种抗HGF抗体的FACS散点图在图8中显示。 
在单独的样品中，将实施例6所述的十种抗HGF抗体的两种(最终衍自杂交瘤2.12.1和2.4.4)分别与包含每种以下靶蛋白的融合蛋白一起孵育：全长人HGF、d5HGF和小鼠HGF，嵌合体#1、嵌合体#2和嵌合体#3。如上所述对这些样品进行FACS分析。 
这些结合实验的结果总结于图10A示意图的右边。抗体2.12.1和抗体2.4.4均不结合嵌合体#1。抗体2.12.1和抗体2.4.4均结合嵌合体#2。抗体2.4.4结合嵌合体#3，抗体2.12.1不结合嵌合体#3。D.用融合蛋白进一步进行表位作图 
为提供更多的有关抗体2.4.4和抗体2.12.1所结合的HGF表位的信息，构建另外的人／小鼠嵌合体，并如以上实施例8C所述进行检测(图10B)。用以产生嵌合体的引物在表10中显示。 
表10用以产生人／小鼠HGF嵌合体及点突变、插入和缺失的寡核苷酸
Figure BDA0000414386170001051
Figure BDA0000414386170001061
图10B显示为研究而构建的小鼠HGF嵌合分子和人HGF嵌合分子的示意图，抗体2.12.1和抗体2.4.4对各嵌合体的结合特性在图的右手边标出。本研究的嵌合体#1-3与实施例8C和图10A所述的嵌合体#1-3完全相同。嵌合体#4-6将更多的小鼠HGF N端掺入到在其他方面完全属于人的HGF分子。嵌合体#7将小鼠HGF的氨基酸507-585应用到在其他方面属于人的HGF分子，嵌合体#8将人HGF的氨基酸507-585应用到在其他方面属于小鼠的HGF分子。嵌合体#9从小鼠HGF的氨基酸1-585和人HGF的氨基酸586-731构建。 
按实施例8C所述测定抗体2.4.4和抗体2.12.1与嵌合蛋白的结合。抗体2.4.4或抗体2.12.1与一种融合蛋白孵育后，用涂布有生物素的珠(Spherotech Inc.，Libertyville，IL，目录号TP-60-5)分别捕捉各样品中的融合蛋白。通过加入FITC标记的抗亲和素抗体(Vector Lab，Burlingame，CA，目录号SP-2040)，标记所得珠-蛋白质复合物。通过加入藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人F(ab′)2抗体(Southern Biotech Associates，Inc，Birmingham，AL，目录号2043-09)，测定抗HGF抗体的存在。然后用荧光激活细胞分选仪(FACS)对这些样品进行分析。在Becton Dickinson Bioscience FACScan(BD，Franklin Lakes，NJ)上检测FITC(其显示亲和素的存在)和／或PE(其显示抗HGF抗体的存在)标记的珠复合物。在一些情况下，使用FITC待表达归一化之后，抗体由PE标记结合，然后进行单色FACS分析。这种方法提高测定的灵敏度，并有助于测量与不以很高水平表达的构建物的结合。 
如图10B所示，抗体2.4.4和抗体2.12.1均结合嵌合体#8(图10B)，所述嵌合体含有人HGF的氨基酸507-585。这些结果提示该区域含有直接或间接参与抗体2.4.4和抗体2.12.1与HGF结合的残基。在该相同507-585区域含有小鼠序列的嵌合体(嵌合体7和9)不结合抗 体2.12.1或抗体2.4.4。嵌合体3不结合抗体2.12.1，但尽管存在人HGF的氨基酸507-585，但其确实结合抗体2.4.4。 
为获得更多的有关人HGF的氨基酸507-585(GWMVSLRYRNKHICGGSLIKESWVLTARQCFPSR--DLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLM(SEQ ID NO：123)(参见图10D))的信息，用表10给出的引物创建含有特定点突变的突变HGF，所述点突变在氨基酸507-585区域将人残基改变成小鼠残基(图10C)。构建了含有五个单独的非保守氨基酸变化(人HGF序列变成小鼠HGF序列，Genbank检索号分别为NM_000601和NM_010427)的人HGF-亲和素融合蛋白。还创建了两个另外的构建物，其中一个在人HGF序列中含有两个氨基酸插入，另一个在小鼠序列中含有两个氨基酸缺失(图10C)。 
如实施例8C和8D所述使这些构建物表达并进行结合分析。抗体2.4.4或抗体2.12.1与一种突变蛋白孵育后，用涂布有生物素的珠(Spherotech Inc.，Libertyville，IL，目录号TP-60-5)分别捕捉各样品中的突变蛋白。通过加入FITC标记的抗亲和素抗体(Vector Lab，Burlingame，CA，目录号SP-2040)，标记所得珠-蛋白质复合物。通过加入藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人F(ab′)2抗体(Southern Biotech Associates，Inc，Birmingham，AL，目录号2043-09)，测定抗HGF抗体的存在。然后用荧光激活细胞分选仪(FACS)对这些样品进行分析。在Becton Dickinson Bioscience FACScan(BD，Franklin Lakes，NJ)上检测FITC(其显示亲和素的存在)和／或PE(其显示抗HGF抗体的存在)标记的珠复合物。在一些情况下，使用FITC待表达归一化之后，抗体由PE标记结合，然后进行单色FACS分析。这种方法提高测定的灵敏度，并有助于测量与不以很高水平表达的构建物的结合。 
发现在氨基酸561而不是氨基酸592、601或647的突变破坏突变的人HGF与抗体2.12.1之间的结合，以及突变的人HGF与抗体2.4.4之间的结合。在氨基酸555的突变破坏与抗体2.12.1的结 合，但不干扰与抗体2.4.4的结合。插入540N和541K这两个小鼠氨基酸(在人序列中不存在，参见图10D)破坏与两种抗体的结合。小鼠HGF序列中缺失这两个氨基酸并不导致两种抗体结合小鼠HGF。 
E.通过蛋白酶保护测定进行表位作图 
还补充进行经典的蛋白酶保护测定，以鉴定被抗体2.12.1结合的HGF表位。参见Yi和Skalka，Mapping Epitopes of Monoclonal Antibodies Against HIV-l Integrase with Limited Proteolysis and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，Biopolymers(Peptide Science)55：308-318(2000)。将人HGF(30ug/10ul)与抗体2.12.1(40μg/4ul)一起在200ul的0.1M Tris缓冲液，pH7.5中混合，在冰上孵育30分钟。用胰蛋白酶(1μg)在37℃消化1小时。使消化物进行反相HPLC，以分离肽。同时用胰蛋白酶进行无抗体2.12.1、只有人HGF的类似消化。HPLC柱(Vydac C18，2.1x150mm，Vydac Inc.，Hesperia CA)用0.1％三氟乙酸(TFA)洗脱，洗脱梯度为2-35％乙腈于0.1％TFA中。通过HP1090HPLC仪(Hewlett Packard，Palo Alto)记录洗脱出的肽的UV迹线。比较两张HPLC图，以查出因与抗体2.12.1结合而被保护的肽(图11A)。 
随后进行N端测序和质谱分析，以鉴定出具体的被保护肽。通过在ABI-Procise蛋白质测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)中进行Edman降解，来进行N端肽测序。通过氨基酸在连接的HPLC仪中的保留时间以及与氨基酸标准的比较，鉴定出每个循环中的氨基酸。在Perceptive Voyager质谱仪(Applied Biosystems，Framingham，MA)上进行保护片段的质谱分析。用4-羟基氰基肉桂酸(HCCA)或芥子酸基质进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)。通过与已知的标准(氧化胰岛素β链和细胞色素c)校准测定分子量。 
人HGF的α亚单位跨越氨基酸32-494，β亚单位跨越氨基酸495-728(参见Swiss-Prot涉及人HGF的条目P14210)。结合人HGF 的抗体2.12.1保护T33和T38.6这两个峰(图11A)。T38.6峰含有两种肽，它们均对应于位于或靠近成熟HGF的β亚单位的开头部分的序列(参见图10D，以粗体下划线文本开头的序列(VVNGIPTRTN(SEQ ID NO：172))，以及参见图11C)。T33衍自α亚单位(图11C)。根据质谱，分别测出T38.6峰的两种肽的观测质量为7165和6840道尔顿。根据HGF序列中可能存在的胰蛋白酶切割位点(参见例如图10D中人HGF的氨基酸559处的粗体下划线精氨酸残基)，预测559号精氨酸限定了被保护的肽的C端。 
还设计了另一个补充实验，以研究抗体结合肽。如上所述用胰蛋白酶消化HGF和抗体2.12.1的混合物1小时，然后通过 10(Millipore Corp.，Bedford，MA)过滤，除去未结合肽。预期结合肽与抗体2.12.1一起被膜捕捉。将完整的人HGF(15μg)加入到肽-抗体2.12.1混合物中，以使结合肽从复合物中洗脱出来。将样品在4℃下孵育过夜，然后再次通过
Figure BDA0000414386170001102
10过滤，使被HGF洗脱的肽与抗体和完整HGF分离。两种样品(结合肽和未结合肽)均通过反相HPLC进行分析(图11B)。如上所述通过HPLC分离结合肽，并进行N端测序和质谱分析。 
当用HGF洗脱结合肽时，观察到有大的肽峰(图11B中的T48)从抗体-HGF复合物从洗脱出来，经N端肽测序鉴定其含有上述T38.6所见的相同两种β亚单位序列。基于质谱，T48峰中的肽的大小不尽相同，因此不能从这些数据预测出精确的C端。其他三个峰(在图11B中以#标记)要么不含有肽，要么含有与HGF无关的未知来源的肽。 
这两个实验共同表明，HGF的β亚单位的N端区域是抗体2.12.1的表位的一部分。这些数据是对实施例8D中的数据的补充，实施例8D发现参与结合的表位位于人HGF的氨基酸507-585中。对被保护的肽的突变分析及其分子质量显示，人HGF的抗体结合表位位于人HGF的氨基酸495-556中。 
F.抗体的竞争性结合 
用FITC标记实施例6所述的最终衍自杂交瘤杂交瘤2.4.4的抗HGF抗体(抗体2.4.4)和最终衍自杂交瘤2.12.1的抗HGF抗体(抗体2.12.1)，供用于如下进行的竞争性测定。抗体2.4.4和抗体2.12.1分别在pH8.5的PBS中透析。将FITC标记([6-荧光素-5-(和-6)-酰胺基]己酸，琥珀酰亚胺酯(5(6)-SFX)混合异构体)(Molecular Probes.目录号F-2181)以5：1(标记：抗体)的摩尔比从DMSO中5mg／ml FITC标记的贮存液加入到两种透析抗体的每一种中。将这些混合物在室温下(20-22℃)暗处孵育过夜。然后使混合物各自分别流过已用PBS平衡的Pharmacia PD-10柱(Amersham，Piscataway，NJ)。所得制品在分光光度计中于280nM和495nM处读数。用280nm处的吸光度计算这些制品中的抗体浓度。用以下公式计算标记抗体与未标记抗体之比： 
Figure BDA0000414386170001111
其中Ax=495nm处的标记吸光度，E=标记的消光系数=77500。通常抗体的标记比例为约3：1(FITC-标记抗体：未标记抗体)。 
对两种标记抗体的每一种与其他九种抗HGF抗体的每一种一起竞争结合的能力进行评估。将两种标记的抗HGF抗体的每一种分别与HGF一起孵育，同时还在其他九种未标记的抗HGF抗体的每一种过量存在50倍(以摩尔计)下，将两种标记的抗HGF抗体的每一种分别与HGF一起孵育。因此，在九个单独的样品中，标记抗体2.4.4分别连同其他九种未标记的抗HGF抗体的每一种与HGF一起孵育。同样，在九个单独的样品中，标记抗体2.12.1分别连同其他九种未标记的抗HGF抗体的每一种与HGF一起孵育。还用HGF的d5剪接变体取代全长HGF重复这些组合的每一种。 
这些竞争性测定的阳性竞争对照是将每一种标记抗体与过量50倍(以摩尔计)的未标记的相同抗体一起孵育。因此，将FITC标记抗体2.12.1在未标记的抗体2.12.1过量存在50倍(以摩尔计)下孵育，另外在不存在未标记的抗体2.12.1下孵育。同样，将FITC标记抗 体2.4.4在未标记的抗体2.4.4过量存在50倍(以摩尔计)下孵育，及在不存在未标记的抗体2.4.4下孵育。不出所料，比起其中不加入未标记抗体的样品的荧光信号，在未标记抗体过量存在50倍(以摩尔计)下样品的荧光信号明显要低。 
图12提供了结合曲线。图12A和12B显示用标记抗体2.12.1进行的实验。12A和12B的所有图片中的曲线的标示：A：阴性对照(FITC-标记抗体2.12.1，无HGF)；B：阳性对照(FITC标记抗体2.12.1，有HGF)；C：抗体1.74.1；D：抗体1.75.1；E：抗体1.29.1；F：抗体3.10.1；G：抗体1.61.3；H：抗体1.24.1；I：抗体1.60.1；J：抗体2.40.1；K：抗体2.12.1；L：抗体2.4.4。图12A显示用荧光抗体2.12.1与d5HGF剪接变体靶蛋白一起进行的竞争性结合测定的结果。图12B显示用荧光抗体2.12.1与全长HGF靶蛋白一起进行的竞争性结合测定的结果。图12C和12D显示用标记抗体2.4.4进行的实验。12C和12D的所有图片中的曲线的标示：A：阴性对照(FITC-标记抗体2.4.4，无HGF)；B：阳性对照(FITC标记抗体2.4.4，有HGF)；C：抗体1.74.1；D：抗体1.75.1；E：抗体1.29.1；F：抗体3.10.1；G：抗体1.61.3；H：抗体1.24.1；I：抗体1.60.1；J：抗体2.40.1；K：抗体2.12.1；L：抗体2.4.4。图12C显示用荧光抗体2.4.4与d5HGF剪接变体靶蛋白一起进行的竞争性结合测定的结果。图12D显示用荧光抗体2.4.4与全长HGF靶蛋白一起进行的竞争性结合测定的结果。 
数据显示，十种抗HGF抗体的每一种与两种标记抗体的每一种竞争与全长HGF或d5HGF的结合。一些抗体表现出与标记抗体发生完全竞争。(例如抗体2.12.1、1.24.1和2.4.4与FITC-标记抗体2.12.1发生完全竞争，分别见图12A和12B的峰H、K和L)。其他抗体只是部分竞争结合(例如抗体2.12.1、2.40.1和1.61.3与FITC-标记2.4.4发生部分竞争，分别见图12C和12D的K，J和G)。 
实施例9 
中和ELISA测定
开发出中和ELISA测定，以评估实施例6所讨论的抗体是否能阻断Met-HGF结合。通过以6.25μg／ml向每孔加入100μl HGF，用HGF涂布Delphia96孔板(目录号：AAAND-0001，Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)。将板在37℃下孵育1小时或者在4℃下孵育过夜。然后在室温下用5％BSA(目录号50-6-00，KPL，Gaithersburg，MD)于含0.1％Tween20的PBS中振摇封闭1小时。 
通过将可溶性Met(2nM，0.256μg／ml)分别与不同浓度的具体待测抗HGF抗体混合，制备测试样品。受测浓度为：667nM、223nM、74.1nM、24.7nM、8.2nM、2.7nM、0.91nM、0.30nM、0.10nM和0.034nM。将100μl体积的测试样品加入到板中的每个孔。然后将板在4℃下孵育过夜，然后再用含0.1％Tween20的PBS洗涤4次。接着以2μg／ml每孔加入100μl生物素化抗cMetR抗体(目录号：BAF358，R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)。该抗体结合板上的Met-HGF复合物，但不结合板上与HGF结合的抗-HGF抗体。然后将板振摇孵育2小时，用含0.1％Tween20的PBS洗涤4次。加入Eu-链霉亲和素(1：1000稀释于测定缓冲液)(目录号1244-360，Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)，在室温下将板振摇1小时。然后用含0.1％Tween20的PBS将板洗涤4次。接着，加入100μl增强缓冲液(Wallac Inc.，目录号：1244-105，Gaithersburg，MD)。过了至少5分钟后，在Victor2(1420Multilabel Counter，Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)上用铕方法读板。 
用4参数拟合方程Excelfit，版本2.0.6，(Microsoft Inc，Seattle，WA)计算对Met结合HGF的抑制(即中和)百分率，确定IC50值。在实施例6所讨论的抗HGF抗体存在下，Met与HGF的结合被中和。两个实验的数据在图13中显示。 
实施例10 
细胞中的中和作用
A.Met磷酸化 
HGF诱导PC-3细胞(ATCC，Manassas，VA#CRL1435)中的Met磷酸化。通过向每孔的100μl RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号11875-093)中加入1x104个PC-3细胞，使PC-3细胞生长于96孔Falcon组织培养板(VWR，San Diego，CA，目录号62740-081)，所述RPMI1640含有5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT，目录号SH30070.03)和1x青霉素、链霉素、谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号10378-016)。细胞在37℃、5％CO2下生长24小时后，用含0.1％牛血清清蛋白(Sigma，Louis，MO，目录号A-3156)的低葡萄糖DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，目录号11885-084)漂洗一次，用100μl含0.1％牛血清清蛋白(Sigma，Louis，MO，目录号A-3156)的低葡萄糖DMEM培养基孵育18-20小时。 
通过用含200ng／ml HGF的培养基(含0.1％牛血清清蛋白的低葡萄糖DMEM)进行连续稀释，分别制备实施例6的十种抗HGF抗体的每一种的八种不同稀释物。各单独稀释物中抗HGF抗体的浓度为：200nM、67nM、22nM、7nM、2.5nM、1nM、0.3nM和0.1nM的具体抗HGF抗体。将这些抗体／HGF稀释物在37℃下孵育30分钟。 
用100μl含0.1％牛血清清蛋白的低葡萄糖DMEM漂洗PC-3细胞一次。然后将100μl的每种抗体／HGF稀释物分别加入到各PC-3细胞的单独孔中。在37℃、5％CO2下孵育10分钟后，从孔中吸出抗体／HGF稀释物，然后将板置于冰上1-2分钟。用100μl用冰预冷的含0.3mM原钒酸钠(Sigma，Louis，MO，目录号S-6508)的PBS漂洗细胞一次。将洗涤细胞在60μl裂解缓冲液中冰上孵育15-30分钟，所述裂解缓冲液含有1％Triton X-100(Pierce，Rockford，IL，目录号28314)，50mM Tris pH8，100mM NaCl，0.3mM原钒酸钠(Sigma，Louis，MO，目录号S-6508)和1X蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Sigma目录号 P-8340)。 
通过在室温下使Dynabeads M-280链霉亲和素(IGEN International，Gaithersburgh，MD，目录号110029)与4μg／ml的山羊抗Met-生物素(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN，目录号BAF358)一起，在含有1％牛血清清蛋白(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-7888)、0.1％Tween20(Biorad，Hercules，CA，目录号170-6531)的PBS中孵育30分钟，制备涂布抗Met抗体的珠。以每孔25μl的体积将涂布抗Met抗体的珠置于96孔Costar测定板(Corning，NY，目录号3365)中。 
将25μl体积的每种不同PC-3细胞裂解液分别加入到含有涂布抗Met抗体的珠的各孔。在室温下将板振摇孵育1小时。每孔加入12.5μl体积的含1％牛血清清蛋白(Sigma，Louis，MO，目录号A-7888)、0.1％Tween20(Biorad，Hercules，CA，目录号170-6531)和0.04μg抗磷酸酪氨酸抗体4G10(Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY，目录号05-321)的PBS，在室温下振摇孵育1小时。加入12.5μl体积的含1％牛血清清蛋白、0.1％Tween20和8μg／ml抗小鼠ORI-TAG-标记(IGEN International，Gaithersburgh，MD，目录号110087)的PBS，将板在室温下振摇孵育30分钟。在IGEN M8读数器(IGEN International，Gaithersburgh，MD)中测定信号(以IGEN计数表示)。用四参数拟合方程和Excelfit软件包，版本2.0.6，(Microsoft Inc.，Seattle WA)计算IC50值。使用IGEN格式的两个实验的数据在图14中显示。对于十种抗HGF抗体的每一种，IC50值在低纳摩尔至亚纳摩尔的范围内。B.对U-87MG生长／存活的中和作用 
U-87MG细胞(ATCC#HTB-14)是表达Met和HGF的人成神经胶质细胞瘤系。培养物中这些细胞的生长／存活不被外源HGF增强。但是在生长条件下内源Met似乎被内源HGF激活。破坏内源HGF与内源Met的结合可能导致生长和／或存活减少。 
通过向每孔的含5％FBS的IMEM培养基(Gibco BRL， Rockville，MD，目录号11125-028)中加入800个细胞，使U-87MG细胞生长于96孔Costar测定板(Corning，NY，目录号3365)。大约24小时后，将十一种不同浓度的每种浓度下的实施例6的十种抗HGF抗体的每一种加入到U-87MG细胞的各单独孔中。各单独稀释物中抗HGF抗体的浓度为：100μg／ml、33.3μg／ml、11.1μg／ml、3.7μg／ml、1.2μg／ml、0.4μg／ml、0.14μg／ml、0.05μg／ml、0.015μg／ml、5.1ng／ml和1.7ng／ml的具体抗HGF抗体。 
加入抗HGF抗体七天后，除去板中的培养基，用每孔100μl10％三氟乙酸(Sigma Inc.，St Louis，MO目录号：T-9159)固定细胞，并将细胞在4℃下孵育1-2小时。用自来水漂洗各孔5次。通过在室温下用0.4％磺酰罗丹明B(Sigma，St Louis，MO目录号：S-9012)于100μl的1％乙酸(Fisher，Pittsburgh，PA目录号：UN2789)中孵育10分钟，使固定细胞染色。染色后，用1％乙酸洗涤细胞5次，风干。在微量滴定板读数器(SpectraMax PLUS，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上在540nm处读取板的光密度。光密度与细胞单层中存在的蛋白质总量成比例，因此是7天测定周期的细胞存活／增殖的量度。为计算IC50值，通过比较与同种型对照抗体一起或不与抗体一起孵育的细胞，计算抑制百分率。用4参数拟合方程和Excelfit软件包，版本2.0.6，(Microsoft Inc.，Seattle WA)计算IC40值。 
两个实验的数据在图15中显示。所有十种实施例6所述的抗HGF抗体抑制U-87MG细胞的生长／存活。每种抗体的IC40值通常小于100nM。 
实施例11 
异种移植肿瘤中的中和作用
A.U-87MG异种移植微量残留疾病模型 
使U-87MG细胞生长至几乎铺满，然后以25x106个细胞／ml的浓度悬浮于无血清培养基中。通过台盼蓝排斥试验，目视估算细 胞达>98.5％生存。为检测单种抗HGF抗体，将无血清培养基中的5x106个U-87MG细胞皮下注射至50只雌性裸鼠(CD1Nu／Nu，Charles RiverLaboratories，Wilmington，Mass.)的右胁腹。这50只小鼠分成5组，每组10只。 
通过用相同剂量的实施例7所讨论的相同抗HGF抗体，或者用IgG1恒定区(同种型对照)，进行腹膜内注射，处理特定组(10只)中的每只小鼠。测试的抗体剂量为：每次注射1μg、3μg、10μg和30μg。自注射U-87MG细胞后第2天起，每周注射抗体两次，持续四周。每周记录肿瘤测量值和体重两次，持续30天，用公式：长度x宽度x高度计算肿瘤体积。用
Figure BDA0000414386170001171
统计程序(SAS Institute，Inc.，Cary，N.C.)，使用重复测定的ANOVA，然后是Scheffe事后(post hoc)检验，对结果进行分析。 
在单独的试验中，用这种模型测试实施例6所讨论的十种抗HGF抗体的每一种。抗体2.4.4的剂量-反应实验在图16A显示。箭头表示给药时间，剂量在图例中显示。括号中表示每种剂量下(十只动物中)没有可测量肿瘤的动物的数量。对于两种最高的测试剂量——每周给予10μg两次和每周给予30μg两次，当与每周两次接受30μg同种型对照(人IgG2#PK16.3.1，Abgenix Inc.Fremont，CA)的对照动物相比时，肿瘤生长的抑制在统计学上显著。对于2种较低剂量(1和3μg，每周两次)的2.4.4，观察到轻微的生长抑制，但在统计学上不显著。数据以平均值±标准误差表示；认为每组n=10只动物和p<0.05在统计学上显著。检测实施例6的其他九种抗HGF抗体的实验显示，在较高剂量下有类似的肿瘤生长完全抑制作用。 
B.U-87MG异种移植的已确立疾病模型 
按照上述实施例11A所讨论的方法，将无血清培养基中的U-87MG细胞注射到裸鼠中。让肿瘤生长大约两周，直到它们达到～200mm3的体积后，开始腹膜内给予抗HGF抗体。如图16B中的箭头所示， 自第16天起，每周两次给予小鼠200μg、100μg或30μg抗体2.4.4，处理小鼠。如上所述测量和评估肿瘤体积。括号中表示在第30天(十只动物中)没有可测量肿瘤的动物的数量。在所有的剂量下均观察到U-87MG肿瘤生长被完全抑制。在不迟于第29天实现已确立肿瘤的统计学显著消退。在单独的试验中，用这种模型测试实施例6所讨论的十种抗HGF抗体的每—种，在每种抗体的较高剂量下均观察到完全抑制作用。 
C.在U-87MG微量残留疾病模型中对抗体分级 
为确定实施例6所讨论的十种抗HGF抗体在实施例11A所讨论的U-87MG肿瘤模型中的相对效力，选择只部分抑制微量残留疾病模型中的肿瘤生长的低剂量。初步的剂量-反应研究(图16A)提示，每周给予5μg抗HGF抗体两次会产生部分抑制作用。进行了一系列的直接比较实验，对多达5种不同的抗HGF抗体进行比较。这些实验中的两个的结果在图16C和16D中显示。**表示与PBS和同种型对照IgG2抗体相比显著抑制肿瘤生长的抗HGF抗体(p<0.0001)。 
用实施例11B所讨论的已确立U-87疾病模型，进行类似的分级排序实验。在这些实验中，使用每周10μg，2X的剂量。这些实验中的两个的结果在图16E和16F中显示。 
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Claims (10)

1. 一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)
其中CDR1a包含氨基酸序列a b c d e f g h i j k l m n o p q，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
其中CDR2a 包含氨基酸序列r s t u v w x，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
其中CDR3a包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h'，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a'选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b'选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c'选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d'选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e'是脯氨酸；氨基酸f'是脯氨酸或者不存在；氨基酸g'是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h'是苏氨酸或天冬酰胺；和
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。
2. 一种分离的多肽，所述多肽包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR)
其中CDR1b包含氨基酸序列a b c d e f g，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸；  
其中CDR2b包含氨基酸序列h i j k l m n o p q r s t u v w x，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸；
其中CDR3b包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r'，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a'选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b'选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c'选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d'是甘氨酸或者不存在；氨基酸e'选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f'是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g'选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h'是丝氨酸或者不存在；氨基酸i'选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j'选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k'选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l'选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m'选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n'选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o'选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p'选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q'是天冬氨酸；氨基酸r'选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；和
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。
3.一种分离的特异性结合物，其中所述特异性结合物包含：
(i) 包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的第一多肽
其中CDR1a包含氨基酸序列a b c d e f g h i j k l m n o p q，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸、氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺、苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺、异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
其中CDR2a包含氨基酸序列r s t u v w x，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
其中CDR3a包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h'，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a'选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b'选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c'选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d'选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e'是脯氨酸；氨基酸f'是脯氨酸或者不存在；氨基酸g'是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h'是苏氨酸或天冬酰胺；和
其中所述第一多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)；
(ii) 包含至少一个选自CDR1b、CDR2b或CDR3b的互补决定区(CDR)的第二多肽
其中CDR1b包含氨基酸序列a b c d e f g，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸；
其中CDR2b包含氨基酸序列h i j k l m n o p q r s t u v w x，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸；
其中CDR3b包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r'，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a'选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b'选自亮氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c'选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d'是甘氨酸或者不存在；氨基酸e'选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f'是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g'选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h'是丝氨酸或者不存在；氨基酸i'选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j'选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k'选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸l'选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m'选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n'选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o'选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p'选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q'是天冬氨酸；氨基酸r'选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；和
其中所述第二多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。
4. 能够结合至少一种由选自SEQ ID NO: 123、164和165的氨基酸序列组成的多肽的抗体，其中所述抗体能够中和HGF与Met的结合。
5. 能够结合HGF的β亚单位的抗体，其中所述抗体能够中和HGF与Met的结合。
6. 能够结合人/小鼠嵌合HGF多肽的抗体，其中所述嵌合多肽包含具有代替同源小鼠序列的人HGF氨基酸507-585的小鼠HGF分子，其中所述抗体不显著结合小鼠HGF，并且其中所述抗体能够中和HGF与Met的结合。
7. 能够中和HGF与c-Met结合的分离的抗体，所述抗体与至少一种选自以下的抗体竞争结合HGF：
a. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 24的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 25的残基20-残基141的氨基酸序列；
b. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 26的残基21-残基133的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 27的残基20-残基137的氨基酸序列；
c. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 28的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 29的残基20-残基139的氨基酸序列；
d. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 30的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 31的残基20-残基148的氨基酸序列；
e. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 32的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 33的残基20-残基139的氨基酸序列；
f. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 34的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 35的残基20-残基144的氨基酸序列；
g. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 36的残基21-残基133的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 37的残基20-残基142的氨基酸序列；
h. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 38的残基21-残基128的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 39的残基20-残基139的氨基酸序列；
i. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 40的残基23-残基129的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 41的残基20-残基140的氨基酸序列；和
j. 包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含SEQ ID NO: 42的残基21-残基128的氨基酸序列和所述重链包含SEQ ID NO: 43的残基20-残基139的氨基酸序列。
8. 一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含至少一个选自CDR1a、CDR2a和CDR3a的互补决定区(CDR)的多肽
其中CDR1a包含氨基酸序列a b c d e f g h i j k l m n o p q，其中氨基酸a选自赖氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；氨基酸b选自丝氨酸或丙氨酸；氨基酸c是丝氨酸；氨基酸d是谷氨酰胺；氨基酸e选自丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸；氨基酸f选自缬氨酸或异亮氨酸或者不存在；氨基酸g选自亮氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸h选自苯丙氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸i是丝氨酸或者不存在；氨基酸j是丝氨酸或者不存在；氨基酸k选自天冬酰胺, 苏氨酸或者不存在；氨基酸l选自天冬酰胺, 异亮氨酸或缬氨酸；氨基酸m选自赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；氨基酸n选自天冬酰胺或丝氨酸；氨基酸o选自酪氨酸、天冬氨酸、色氨酸或天冬酰胺；氨基酸p是亮氨酸；氨基酸q选自丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
其中CDR2a包含氨基酸序列r s t u v w x，其中氨基酸r选自色氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或甘氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t是丝氨酸、氨基酸u选自苏氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸v选自精氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸；氨基酸x选自丝氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
其中CDR3a包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h'，其中氨基酸y选自谷氨酰胺或亮氨酸；氨基酸z选自谷氨酰胺、天冬酰胺或精氨酸；氨基酸a'选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸或丝氨酸；氨基酸b'选自苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺或异亮氨酸；氨基酸c'选自丝氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；氨基酸d'选自脯氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或色氨酸；氨基酸e'是脯氨酸；氨基酸f'是脯氨酸或者不存在；氨基酸g'是色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；氨基酸h'是苏氨酸或天冬酰胺；和
其中所述多肽与抗体重链联合，能够结合肝细胞生长因子(HGF)。
9.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码包含至少一个选自CDR1b、CDR2b和CDR3b的互补决定区(CDR)的多肽
其中CDR1b包含氨基酸序列a b c d e f g，其中氨基酸a是丝氨酸或者不存在；氨基酸b选自天冬氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸c选自天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸或异亮氨酸；氨基酸d是酪氨酸；氨基酸e选自酪氨酸或甘氨酸；氨基酸f选自异亮氨酸、甲硫氨酸或色氨酸；氨基酸g选自组氨酸、天冬酰胺或丝氨酸；
其中CDR2b包含氨基酸序列h i j k l m n o p q r s t u v w x，其中氨基酸h选自色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸；氨基酸j选自天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸；氨基酸k选自脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸；氨基酸l选自天冬酰胺, 丝氨酸或天冬氨酸；氨基酸m选自丝氨酸或甘氨酸；氨基酸n选自甘氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸o选自甘氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或天冬酰胺；氨基酸p选自苏氨酸、异亮氨酸或赖氨酸；氨基酸q选自天冬酰胺或酪氨酸；氨基酸r选自酪氨酸或组氨酸；氨基酸s选自丙氨酸或天冬酰胺；氨基酸t选自谷氨酰胺、天冬氨酸或脯氨酸；氨基酸u选自赖氨酸或丝氨酸；氨基酸v选自苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸；氨基酸w选自谷氨酰胺或赖氨酸；氨基酸x选自甘氨酸或丝氨酸；
其中CDR3b包含氨基酸序列y z a' b' c' d' e' f' g' h' i' j' k' l' m' n' o' p' q' r'，其中氨基酸y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸z选自亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸、脯氨酸或甘氨酸或者不存在；氨基酸a'选自谷氨酸、酪氨酸或亮氨酸或者不存在；氨基酸b'选自亮氨酸、天冬酰胺, 甘氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸c'选自精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、酪氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸或者不存在；氨基酸d'是甘氨酸或者不存在；氨基酸e'选自色氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸f'是天冬氨酸或者不存在；氨基酸g'选自丝氨酸或精氨酸或者不存在；氨基酸h'是丝氨酸或者不存在；氨基酸i'选自甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸j'选自酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸k'选自酪氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸1'选自酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸或色氨酸或者不存在；氨基酸m'选自酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸或丝氨酸或者不存在；氨基酸n'选自甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸或天冬氨酸或者不存在；氨基酸o'选自亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸或者不存在；氨基酸p'选自甲硫氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；氨基酸q'是天冬氨酸；氨基酸r'选自缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；和
其中所述多肽与抗体轻链联合，能够结合HGF。
10. 一种组合物，所述组合物包含权利要求1或2的分离的多肽、权利要求3的分离的特异性结合物或权利要求4-7中任一项的抗体，以及药物可接受载体。
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