JPH02240100A - 新規ポリペプチド - Google Patents
新規ポリペプチドInfo
- Publication number
- JPH02240100A JPH02240100A JP6072489A JP6072489A JPH02240100A JP H02240100 A JPH02240100 A JP H02240100A JP 6072489 A JP6072489 A JP 6072489A JP 6072489 A JP6072489 A JP 6072489A JP H02240100 A JPH02240100 A JP H02240100A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cys
- chain
- cysteine residue
- supernatant
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 20
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 20
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 abstract description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 abstract description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 abstract description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 abstract description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical compound NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 arginine ester Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- DIOSHTLNZVXJOF-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-oxobutanoylamino)benzenesulfonic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)NC1=CC=C(NC(=O)CC(C)=O)C(S(O)(=O)=O)=C1 DIOSHTLNZVXJOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 235000006205 Balanites Nutrition 0.000 description 1
- 241000935123 Balanites Species 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100426732 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は動物組織中より単離された新規構造を有するポ
リベブチド、詳しくは上皮成長因子（ＢＧＦ ）結合蛋
白質及びアルギニン残基特異的蛋白質加水分解酵素とし
ての機能を有するポリベプチドに関する。
リベブチド、詳しくは上皮成長因子（ＢＧＦ ）結合蛋
白質及びアルギニン残基特異的蛋白質加水分解酵素とし
ての機能を有するポリベプチドに関する。
ＥＧＦの成熟に関与する［３ＧＦ結合蛋白“質は、ＢＧ
Ｆ前駆体（プロＢＧＦ ）からＢＧＦを生成させ、生成
したＢＧＦと結合する活性を有する蛋白質である。ＢＧ
Ｆ結合蛋白質としてはこれまでに３種類報告されており
、ｃＤＮ八の塩基配列が決定されている。これらのポリ
ベプチドはカリクＩノインファミＩＪ−と称される一連
の蛋白質加水分解酵素と高い相同性を有することが報告
されており、また、アルギニン残基特異的蛋白質加水分
解酵素もカリクレインファミリーの１つである。
Ｆ前駆体（プロＢＧＦ ）からＢＧＦを生成させ、生成
したＢＧＦと結合する活性を有する蛋白質である。ＢＧ
Ｆ結合蛋白質としてはこれまでに３種類報告されており
、ｃＤＮ八の塩基配列が決定されている。これらのポリ
ベプチドはカリクＩノインファミＩＪ−と称される一連
の蛋白質加水分解酵素と高い相同性を有することが報告
されており、また、アルギニン残基特異的蛋白質加水分
解酵素もカリクレインファミリーの１つである。
本発明の目的はＢＧＦ結合蛋白質及びアルギニン残基特
異的蛋白質加水分解酵素としての機能を有する新規のポ
リベプチド（以下八ＢＰと略称する）を提供することに
ある。
異的蛋白質加水分解酵素としての機能を有する新規のポ
リベプチド（以下八ＢＰと略称する）を提供することに
ある。
本発明を概説すれば、本発明はポリベプチドに関する発
明であって、下記式■、■、■：Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−６ １ ｎ−１ｔ ＋ ｓ−Ａｒｇ−Ｌｓｕ−Ｖ
ａ ］−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＨＥ Ｉｔ ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉ ｕ−Ｔｙｒ−Δｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−＾Ｓｌ）−Ｌｅｕ−１ １ｅ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａ Ｉ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
１ １ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−〔■〕 Ｐｈｅ−Ｇ Ｉｎ−Ａｓｎ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ ｌ−Ｖａ Ｉ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−’Ａｓｐ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− １ １ ｅ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓａｒ−Ｔｒｐ− １ １ｅ−Ｌｙｓ−
ＣＩ［Ｉ］ で表される一次構造を有する３種頚のポリペブチド鎮Ａ
ＳＢＳＣが、３本の分子内ジスルフィド結合、すなわち
Ａ鎮の２６番目のシスティン残基とＡ ｉＪの４２番目
のシスティン残基との間、Ｃ鎮の２０番目のシスティン
残基とＣ鎮の３４番目のシスティン残基との間、Ｃ鎮の
４５番目のシスティン残基とＣ鎮の７０番目のシスティ
ン残基との間、及び２本の分子間ジスルフィド結合、す
なわちＡ鎮の７番目のシスティン残基とＣ鎮の９番目の
システィン残基との間、Ｂ鎮の４１番目のシスティン残
基とＣ鎮の５５番目のシスティン残基との間、で連なっ
た構造を有していることを特徴とする。
明であって、下記式■、■、■：Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−６ １ ｎ−１ｔ ＋ ｓ−Ａｒｇ−Ｌｓｕ−Ｖ
ａ ］−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＨＥ Ｉｔ ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉ ｕ−Ｔｙｒ−Δｓｐ−Ｔ
ｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−＾Ｓｌ）−Ｌｅｕ−１ １ｅ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａ Ｉ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
１ １ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
ＧＩｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−〔■〕 Ｐｈｅ−Ｇ Ｉｎ−Ａｓｎ−＾１ａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ ｌ−Ｖａ Ｉ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−’Ａｓｐ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ− １ １ ｅ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓａｒ−Ｔｒｐ− １ １ｅ−Ｌｙｓ−
ＣＩ［Ｉ］ で表される一次構造を有する３種頚のポリペブチド鎮Ａ
ＳＢＳＣが、３本の分子内ジスルフィド結合、すなわち
Ａ鎮の２６番目のシスティン残基とＡ ｉＪの４２番目
のシスティン残基との間、Ｃ鎮の２０番目のシスティン
残基とＣ鎮の３４番目のシスティン残基との間、Ｃ鎮の
４５番目のシスティン残基とＣ鎮の７０番目のシスティ
ン残基との間、及び２本の分子間ジスルフィド結合、す
なわちＡ鎮の７番目のシスティン残基とＣ鎮の９番目の
システィン残基との間、Ｂ鎮の４１番目のシスティン残
基とＣ鎮の５５番目のシスティン残基との間、で連なっ
た構造を有していることを特徴とする。
本発明者らは動物組織内に存在することが知られている
、蛋白質中のアルギニン残基を特異的に認識し、そのカ
ルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する活性を有
し、また、ＩＥＧＦ前駆体に作用してそのアルギニン残
基特異的ペブチド結合切断活性によりＥｉＧＦを生成さ
せ、更に生成した１３ＧＦを結合するという活性を有す
るボリペプチドは、その特異的な活性発現に帰因する特
異的な構造を有するポリベプチドではないかと考えた。
、蛋白質中のアルギニン残基を特異的に認識し、そのカ
ルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する活性を有
し、また、ＩＥＧＦ前駆体に作用してそのアルギニン残
基特異的ペブチド結合切断活性によりＥｉＧＦを生成さ
せ、更に生成した１３ＧＦを結合するという活性を有す
るボリペプチドは、その特異的な活性発現に帰因する特
異的な構造を有するポリベプチドではないかと考えた。
本課題を解明するための研究を行い、動物組織より上記
活性を有する、３種類のポリペプチド鎖が２本のジスル
フィド結合で連なった構造を有するポリペブチドを単離
し本発明を完成させるに至った。
活性を有する、３種類のポリペプチド鎖が２本のジスル
フィド結合で連なった構造を有するポリペブチドを単離
し本発明を完成させるに至った。
以下、本発明を具体的に説明する。
マウス顎下腺よりペンズアミジンーセファロース６Ｂ（
ファルマシア社製）により精製された、ベンゾイルーロ
し−アルギニンバラニトロアニリド分解活性を有するＡ
ＲＰは、種々のベプチド、蛋白質を基質として反応した
場合、極めて高い確率でアルギニンペプチド結合のみを
加水分解することが明らかになった。更にＡＲＰは中性
付近において８６Ｆをセファロース４Ｂ（ファ゛ルマシ
ア社製）に固定化したアフィニテイカラムにも吸着する
ことが明らかになった。精製したＡＲＰは等電点５．６
５のポリペプチドで、電気泳動的に単一バンドを与える
が、２−メルカブトエタノール等の還元試薬の存在下で
ＳＯＳ電気泳動を行ったところ、還元試薬非存在下での
バンドが消失し、低分子量側に複数のバンドが出現した
。そこでＡＢＰを完全に還元し、カルボキシメチル化し
た後、逆相系力ラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーで分離したところ、３本のピークが検出された。３本
のピークをそれぞれ分取し、酵素的、化学的手段で断片
化を行い、エドマン分解法によりそれぞれのペプチドの
一次構造を明らかにした。更にジスルフィド結合の位置
は還元力ルボキシメチル化を行っていないＡＲＰを酵素
的に断片化し、アミノ酸分析、過ギ酸酸化エドマン分解
法により決定した。このようにしてアルギニン残基特異
的蛋白質加水分解活性及びＢＧＦ結合蛋白質としての機
能を有するＡＲＰの構造が決定され、本発明を完成する
に至゛った。
ファルマシア社製）により精製された、ベンゾイルーロ
し−アルギニンバラニトロアニリド分解活性を有するＡ
ＲＰは、種々のベプチド、蛋白質を基質として反応した
場合、極めて高い確率でアルギニンペプチド結合のみを
加水分解することが明らかになった。更にＡＲＰは中性
付近において８６Ｆをセファロース４Ｂ（ファ゛ルマシ
ア社製）に固定化したアフィニテイカラムにも吸着する
ことが明らかになった。精製したＡＲＰは等電点５．６
５のポリペプチドで、電気泳動的に単一バンドを与える
が、２−メルカブトエタノール等の還元試薬の存在下で
ＳＯＳ電気泳動を行ったところ、還元試薬非存在下での
バンドが消失し、低分子量側に複数のバンドが出現した
。そこでＡＢＰを完全に還元し、カルボキシメチル化し
た後、逆相系力ラムを用いた高速液体クロマトグラフィ
ーで分離したところ、３本のピークが検出された。３本
のピークをそれぞれ分取し、酵素的、化学的手段で断片
化を行い、エドマン分解法によりそれぞれのペプチドの
一次構造を明らかにした。更にジスルフィド結合の位置
は還元力ルボキシメチル化を行っていないＡＲＰを酵素
的に断片化し、アミノ酸分析、過ギ酸酸化エドマン分解
法により決定した。このようにしてアルギニン残基特異
的蛋白質加水分解活性及びＢＧＦ結合蛋白質としての機
能を有するＡＲＰの構造が決定され、本発明を完成する
に至゛った。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されない。
本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１
（製法）
９週令、オスのＩＣＲマウス５０匹から顎下腺を採取し
、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＢＤＴＡ）を含むｐ
Ｈ７．４の０．１ＭＩＪン酸ナ｝ ＩＪウム緩衝液中で
ホモジナイザーにより均一化した後、３０分間遠心分離
（１００００ｇ） シ上澄液を得た。上澄液をｐｉ｛７
。４の０．ＩＭＵン酸ナトリウム緩衝液に対し透析し、
同緩衝液であらかじめ平衡化したペンズアミジンーセフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させ、同緩衝
液で十分に洗浄後、１ｍＭ ｆｌｃ１により溶出した。
、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＢＤＴＡ）を含むｐ
Ｈ７．４の０．１ＭＩＪン酸ナ｝ ＩＪウム緩衝液中で
ホモジナイザーにより均一化した後、３０分間遠心分離
（１００００ｇ） シ上澄液を得た。上澄液をｐｉ｛７
。４の０．ＩＭＵン酸ナトリウム緩衝液に対し透析し、
同緩衝液であらかじめ平衡化したペンズアミジンーセフ
ァロース６Ｂ（ファルマシア社製）に吸着させ、同緩衝
液で十分に洗浄後、１ｍＭ ｆｌｃ１により溶出した。
溶出画分に電気泳動的に単一な約５ ０ ｍｇのＡＢＰ
が得られた。
が得られた。
（構造決定）
上記方法で調製したＡＲＰを、６Ｍ塩酸グアニジン、２
ｍＭ ＢＤＴＡを含むｐｔｌ８．０の０． ５Ｍ ｝り
゜スー塩酸緩衝液中でＡＢＰ中のシスティン残基の５０
０倍（モル比）のジチオスレイトールと３７℃、２４時
間、窒素気流下で反応させ、ジスルフィド結合を還元し
た。次にジチオスレイトールの２倍量（モル比）のモノ
ヨード酢酸を加え、室温で遮光し２０〜３０分間反応さ
せ、Ｓ一カルボキシメチル化を行った。Ｏ． ＩＭギ酸
に対し透析し、脱塩したあと凍結乾燥した。この様にし
て得られた還元力ルボキシメチル化ＡＢＰをμ［］ＯＮ
ＯＡＳＰＨＢＲＢ Ｃ４−３００Ａカラム（ウォーター
ズ社製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分離し、３本のポリペプチド鎮、八〇Ｐ−Ａ鎖、Ａ８
Ｐ−８鎖、八〇Ｐ−Ｃ Ｉｎを得た。次にそれぞれのべ
ブチド鎮について酸加水分解によるアミノ酸組成分析、
また気相式ペブチドシークエンサーを用いたエドマン分
解法によりＮ末端アミノ酸配列分析を行った。更にそれ
ぞれ３本のベプチド鎮についてアク口モバクタープロテ
アーゼＩ （和光純薬社製）及び八ｓｐ−１’ｌエンド
ペプチダーゼ（ベーリンガー社製）を用いた酵素分解に
よる断片化を行い、断片化したそれぞれのべプチドフラ
グメントについてエドマン分解法によりアミノ酸配列分
析を行い、ＡＲＰ−Ａ鎖、ＡＢＰ−８鎖、ＡＲＰ−Ｃ鎖
の一次構造式を前記式Ｉ１■、■に示す構造であると決
定した。
ｍＭ ＢＤＴＡを含むｐｔｌ８．０の０． ５Ｍ ｝り
゜スー塩酸緩衝液中でＡＢＰ中のシスティン残基の５０
０倍（モル比）のジチオスレイトールと３７℃、２４時
間、窒素気流下で反応させ、ジスルフィド結合を還元し
た。次にジチオスレイトールの２倍量（モル比）のモノ
ヨード酢酸を加え、室温で遮光し２０〜３０分間反応さ
せ、Ｓ一カルボキシメチル化を行った。Ｏ． ＩＭギ酸
に対し透析し、脱塩したあと凍結乾燥した。この様にし
て得られた還元力ルボキシメチル化ＡＢＰをμ［］ＯＮ
ＯＡＳＰＨＢＲＢ Ｃ４−３００Ａカラム（ウォーター
ズ社製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによ
り分離し、３本のポリペプチド鎮、八〇Ｐ−Ａ鎖、Ａ８
Ｐ−８鎖、八〇Ｐ−Ｃ Ｉｎを得た。次にそれぞれのべ
ブチド鎮について酸加水分解によるアミノ酸組成分析、
また気相式ペブチドシークエンサーを用いたエドマン分
解法によりＮ末端アミノ酸配列分析を行った。更にそれ
ぞれ３本のベプチド鎮についてアク口モバクタープロテ
アーゼＩ （和光純薬社製）及び八ｓｐ−１’ｌエンド
ペプチダーゼ（ベーリンガー社製）を用いた酵素分解に
よる断片化を行い、断片化したそれぞれのべプチドフラ
グメントについてエドマン分解法によりアミノ酸配列分
析を行い、ＡＲＰ−Ａ鎖、ＡＢＰ−８鎖、ＡＲＰ−Ｃ鎖
の一次構造式を前記式Ｉ１■、■に示す構造であると決
定した。
次にジスルフィド結合の位置決定は、まず、未加工の八
〇Ｐをトリブシン及びアク口モバクタープロテアーゼエ
を用いて酵素分解し、得られた酵素消化物からμＢＯＮ
ＯＡＳＰＨＢＲＢ Ｃ１８−３００Ａカラム（ウォータ
ーズ社製）を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー
により各フラグメントを分離し、アミノ酸組成分析によ
りジズルフィド結合を有すると推定されるフラグメント
を選び出した。分取した各々のジスルフィド結合を含む
フラグメントを過ギ酸酸化後気相式ペブチドシークエン
サーを用いたエドマン分解法によりそれぞれ構造を決定
し、ジスルフィド結合の位置をＡ鎮のＣｙｓ−２６とＣ
ｙｓ−４２との間、ｃ ｉ，ｍのＣｙｓ−２０とＣｙｓ
−３４との間、Ｃ鎮のＣ）＋ｓ−４５とＣｙｓ−７０と
の間、Ａ鎮のＣｙｓ− ７とＣ鎮のＣｙｓ− ９とσ間
、Ｂ鎮のＣｙｓ−４１とＣ ＭｉのＣｙｓ−５５との間
であることを決定した。
〇Ｐをトリブシン及びアク口モバクタープロテアーゼエ
を用いて酵素分解し、得られた酵素消化物からμＢＯＮ
ＯＡＳＰＨＢＲＢ Ｃ１８−３００Ａカラム（ウォータ
ーズ社製）を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー
により各フラグメントを分離し、アミノ酸組成分析によ
りジズルフィド結合を有すると推定されるフラグメント
を選び出した。分取した各々のジスルフィド結合を含む
フラグメントを過ギ酸酸化後気相式ペブチドシークエン
サーを用いたエドマン分解法によりそれぞれ構造を決定
し、ジスルフィド結合の位置をＡ鎮のＣｙｓ−２６とＣ
ｙｓ−４２との間、ｃ ｉ，ｍのＣｙｓ−２０とＣｙｓ
−３４との間、Ｃ鎮のＣ）＋ｓ−４５とＣｙｓ−７０と
の間、Ａ鎮のＣｙｓ− ７とＣ鎮のＣｙｓ− ９とσ間
、Ｂ鎮のＣｙｓ−４１とＣ ＭｉのＣｙｓ−５５との間
であることを決定した。
（アルギニン残基特異的蛋白質加水分解活性〕八８Ｐの
ベンソ゛イノレーＤしーアノレギニンバラニト？７二Ｉ
Ｊ ｌ−” （ＢＡＰＡ）分解活性はペンゾイル−ＯＬ
−ＩＪジンバラニトロアニリド（ＢＬＰＡ）分解活性に
比べ約５００倍高い活性を示した。またアルギニンエス
テル分解活性もリジンエステル分解活性の約２００倍で
あった。また酸化インシュリンＢ １１等の種々のベプ
チドを基質とした場合、−ＡｒｇｐＸ−のペプチド結合
のみが加水分解された。
ベンソ゛イノレーＤしーアノレギニンバラニト？７二Ｉ
Ｊ ｌ−” （ＢＡＰＡ）分解活性はペンゾイル−ＯＬ
−ＩＪジンバラニトロアニリド（ＢＬＰＡ）分解活性に
比べ約５００倍高い活性を示した。またアルギニンエス
テル分解活性もリジンエステル分解活性の約２００倍で
あった。また酸化インシュリンＢ １１等の種々のベプ
チドを基質とした場合、−ＡｒｇｐＸ−のペプチド結合
のみが加水分解された。
（１３０Ｆ結合活性）
ＢＧＦをセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）ニプロ
ムシアン法により固定化したカラムを、１）｝Ｉ？，２
の１０ｍＭＵン酸緩衝液で十分に平衡化し、八〇Ｐの同
緩衝液溶液を該カラムに流したところ、ＡＢＦがカラム
に吸着した。更に１ｍＭ ＨＣＩを用いた溶出によりＡ
ＢＰがｍ離回収された。
ムシアン法により固定化したカラムを、１）｝Ｉ？，２
の１０ｍＭＵン酸緩衝液で十分に平衡化し、八〇Ｐの同
緩衝液溶液を該カラムに流したところ、ＡＢＦがカラム
に吸着した。更に１ｍＭ ＨＣＩを用いた溶出によりＡ
ＢＰがｍ離回収された。
以上詳細に説明したように、本発明・にょり、８６Ｆ結
合及びアル■ギニン残基特異的蛋白質加水分解酵素の両
方の活性を有する新規ポリベブチドが提供された。
合及びアル■ギニン残基特異的蛋白質加水分解酵素の両
方の活性を有する新規ポリベブチドが提供された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記式 I 、II、III： 【遺伝子配列があります】・・・〔 I 〕 【遺伝子配列があります】・・・〔II〕 【遺伝子配列があります】・・・〔III〕 で表される一次構造を有する３種類のポリペプチド鎖Ａ
、Ｂ、Ｃが、３本の分子内ジスルフィド結合、すなわち
Ａ鎖の２６番目のシステイン残基とＡ鎖の４２番目のシ
ステイン残基との間、Ｃ鎖の２０番目のシステイン残基
とＣ鎖の３４番目のシステイン残基との間、Ｃ鎖の４５
番目のシステイン残基とＣ鎖の ７０番目のシステイン残基との間、及び２本の分子間ジ
スルフィド結合、すなわちＡ鎖の７番目のシステイン残
基とＣ鎖の９番目のシステイン残基との間、Ｂ鎖の４１
番目のシステイン残基とＣ鎖の５５番目のシステイン残
基との間、で連なった構造を有していることを特徴とす
るポリペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6072489A JPH02240100A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | 新規ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6072489A JPH02240100A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | 新規ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02240100A true JPH02240100A (ja) | 1990-09-25 |
Family
ID=13150512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6072489A Pending JPH02240100A (ja) | 1989-03-15 | 1989-03-15 | 新規ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02240100A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8609090B2 (en) * | 2003-07-18 | 2013-12-17 | Amgen Inc. | Specific binding agents to hepatocyte growth factor |
-
1989
- 1989-03-15 JP JP6072489A patent/JPH02240100A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8609090B2 (en) * | 2003-07-18 | 2013-12-17 | Amgen Inc. | Specific binding agents to hepatocyte growth factor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kawata et al. | Amino‐acid sequence of ribonuclease T2 from Aspergillus oryzae | |
| Hillson et al. | Formation and isomerization of disulfide bonds in proteins: protein disulfide-isomerase | |
| Engström et al. | Isolation and characterization of calf liver thioredoxin | |
| Shapira et al. | Encephalitogenic fragment of myelin basic protein: amino acid sequence of bovine, rabbit, guinea pig, monkey, and human fragments | |
| Wunderer et al. | Amino‐acid sequence of toxin I from Anemonia sulcata | |
| Camargo et al. | Brain endo‐oligopeptidase A, a putative enkephalin converting enzyme | |
| JPH0728745B2 (ja) | 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 | |
| Tschesche et al. | The Structure of the Porcine Pancreatic Secretory Trypsin Inhibitor I: A Sequence Determination by Edman Degradation and Mass Spectral Identification of the p‐Bromophenyl‐thiohydantoins | |
| Van Heijenoort et al. | Structure of the meso-diaminopimelic acid containing peptidoglycans in Escherichia coli B and Bacillus megaterium KM | |
| CA1175372A (en) | Process for enzymatic replacement of the b-30 amino acid in insulins | |
| Kageyama et al. | Isolation of an activation intermediate and determination of the amino acid sequence of the activation segment of human pepsinogen A | |
| Louvard et al. | On bovine and porcine anionic trypsinogens | |
| JPS62171699A (ja) | 蛋白質の製造法 | |
| Ninjoor et al. | Purification and characterization of rat liver lysosomal cathepsin B2 | |
| Walz et al. | Amino acid sequence of human thrombin A chain | |
| Gilles et al. | Cleavage of β‐casein by collagenases from Achromobacter iophagus and Clostridium histolyticum | |
| Nishida et al. | Amino acid sequences of phospholipases A2 from the venom of an Australian elapid snake (king brown snake, Pseudechis australis) | |
| Hosoi et al. | A new esteroproteinase (proteinase F) from the submandibular glands of female mice | |
| JPH02240100A (ja) | 新規ポリペプチド | |
| Romero et al. | Purification and amino acid sequence of aminopeptidase P from pig kidney | |
| D'Aniello et al. | Hatching enzyme from the sea-squirt Ciona intestinalis: purification and properties | |
| Seidah et al. | Structural and immunological homology of human and porcine pituitary and plasma IRCM-serine protease 1 to plasma kallikrein: marked selectivity for pairs of basic residues suggests a widespread role in pro-hormone and pro-enzyme processing | |
| Maeda et al. | Correction of partial amino acid sequence of erabutoxins. | |
| Kondo et al. | Purification and characterization of phospholipase A from Bungarus multicinctus venom | |
| Samuelsson et al. | The disulfide bonds of viscotoxin A3 from the European mistletoe (Viscum album L., Loranthaceae) |