JPH0728745B2 - 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 - Google Patents

原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法

Info

Publication number
JPH0728745B2
JPH0728745B2 JP61505882A JP50588286A JPH0728745B2 JP H0728745 B2 JPH0728745 B2 JP H0728745B2 JP 61505882 A JP61505882 A JP 61505882A JP 50588286 A JP50588286 A JP 50588286A JP H0728745 B2 JPH0728745 B2 JP H0728745B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mol
protein
mmol
denaturing
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61505882A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62502895A (ja
Inventor
フイツシヤー，シユテフアン
マツテス，ラルフ
ルードルフ，ライナー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Boehringer Mannheim GmbH
Publication of JPS62502895A publication Critical patent/JPS62502895A/ja
Publication of JPH0728745B2 publication Critical patent/JPH0728745B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子工学的に製造した、ジスルフイド結合
を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化す
る方法に関する。
異種蛋白質を原核において発現する際に、しばしばこれ
らの蛋白質ほ宿主細胞中で不活性難溶性凝集体（所謂
“屈折小体:refractile bodies"）を形成し、更に該凝
集体は宿主細胞の蛋白質により不純化されている。その
ような“屈折小体”の形成は、発現の際に発生する細胞
中の高い蛋白質濃度の結果であると推測される。細胞中
で大量の酵素を形成する際に、酵素の集合により不溶性
で高分子の、たいていの場合不活性な粒子になることは
知られている。それ故、そのような蛋白質を例えば治療
の目的に使用できるようにする前に、それを精製しかつ
その活性形に変換しなければならない。
公知方法によれば、凝集体として存在するこのような蛋
白質の再活性化は数工程で行なうことができる〔例えば
R.Jaenicke著、“Federation of Biochemical Societie
s"、Vol.52（1979）、187〜198;R.Rudolph et al.、“B
iochemistry"、18（1979）、5572〜5575参照〕： 第一工程では、可溶化を、強力な変性剤、例えばグアニ
ジン−ヒドロクロリド又は尿素を高濃度で添加するか又
は強酸性因子、例えばグリシン／リン酸混合物の添加に
より達成する。他の助剤として、還元性SH−試薬（例え
ばジチオエリトリトール、DTE）及びEDTAが例えばLDHの
復元の際に有用であることが判明した。蛋白質が宿主細
胞の蛋白質により不純化されている場合、次の工程とし
て公知の常法で、例えばゲル−又はイオン交換クロマト
グラフイにより精製を行なう。引続いて、強く稀釈し
て、変性剤の濃度を低くする。その際に、グアニジン−
ヒドロクロリドを使用する場合には、0.5モル／を下
廻る数値に稀釈する。遊離SH−基を有する酵素の場合、
SH−基を保護する因子の添加が有利であると明らかにな
つた〔例えばR.Jaenicke、“Journal Polymer Scienc
e"、Part C16（1967）、2143〜2160参照〕。
ヨーロツパ公開特許第0114506号明細書には、細菌培養
物からの数種の異種発現産物を単離、精製及び再活性化
する方法が記載され、再活性化に当つては、強力な変性
剤中の“屈折小体”の溶液をａ）直接弱い変性剤中の溶
液に変換し、その後ジスルフイド結合を再形成するため
の酸化作用をする条件にもたらすか、ｂ）蛋白質をスル
ホン化し、その後弱い変性剤中の溶液に変換しかつＳ−
スルホネート基をスルフヒドリル試薬でその還元型及び
酸化型で、例えばGSH/GSSGを用いて−Ｓ−Ｓ−基に変換
するかあるいはｃ）弱い変性剤中の溶液を直接スルフヒ
ドリル試薬、例えばGSH/GSSGを用いて処理する。前記の
問題が起る代表的な例はｔ−PAである。
凝固した血液の蛋白質基質の主成分は重合体のフイブリ
ンである。この蛋白質基質は、所謂プラスミノゲンアク
チベーター、例えばｔ−PA（組織プラスミノゲンアクチ
ベーター）による活性化を介してプラスミノゲンから形
成されるプラスミンにより溶解される。天然産又は真核
から遺伝子工学的に得られるｔ−PA（プラスミノゲンを
プラスミンに接触的に活性化する）の酵素活性は、フイ
ブリン又はフイブリン分解生成物（FSP）の不存在では
非常に低いが、これらの刺激物質の存在においては著し
く高まり得る（10倍以上）。所謂この活性の刺激可能性
は、ウロキナーゼ又はストレプトキナーゼのような他の
公知のプラスミノゲンアクチベーターに比べてｔ−PAの
決定的な利点である〔例えばM.Hoylaerts et al.“J.Bi
ol.Chem."、257（1982）、2912〜2019;Nieuwenhiuzen e
t al.,“Biochemica et Biophysica Acta"、755（198
3）、531〜533参照〕。それ故、BrCN分解生成物による
刺激可能性の係数は文献にいくつか挙げられており、35
倍までである。
糖付加されていないｔ−PA様生成物は、遺伝子操作した
原核（ｃ−DNAの導入後）でも形成されるが、そのよう
な生成物には、真核からのｔ−PAの活性の刺激可能性は
付与されない。このことは、原核細胞中のレドツクス条
件が遺伝子が由来する真核細胞とは、初めから不活性生
成物が形成される（このことは例えば、天然活性分子が
含有する多数のＳ−Ｓ結合が誤つて接合しているかある
いは全く形成されていないということに帰因し得るよう
である）というように異なつていることに帰因すると考
えられる。しかしｔ−PAを治療で使用するには酵素活性
それ自体が必要であるばかりでなく、その刺激可能性も
必要である。真核蛋白質の活性を正しく形成するよう
に、原核細胞が好適な条件を調節しないのであろうとい
う事実が他の物質に関して“The EMBO Journal"、４、N
o.3（1985）775〜780で指摘されている。
ヨーロツパ公開特許第0093639号明細書ではｔ−PAの再
活性化のために、E.コリ（Coli）から得られた細胞ペレ
ツトをグアニジン−ヒドロクロリド６モル／中に懸濁
させ、超音波で処理し、恒温保持し、引続いてトリス−
Hcl（pH＝8.0）、塩化ナトリウム、ETDA及びツイーン
（Twwen）80からの溶液に対して４時間透析する。透析
後に遠心分離すると、その上澄み中にプラスミノゲンア
クチベーター活性が認められる。このように復元したｔ
−PAは蛋白質、分解作用において活性であるが、J.H.Ve
rheijen著、“Thromb.Haemostas."48、（３）、260〜26
9（1982年）に記載の方法による、フイブリンのBrCN−
分解生成物（BrCN−FSP）による測定可能な刺激可能性
を示さない。
変性蛋白質の再活性化に関しては、技術水準から一般的
に適用し得る方法は公知ではなく、このことは特にｔ−
PAに該当する。それというのこもの天然蛋白質は非常に
複雑な構造を有するからであり、これは１個の遊離チオ
ール基と17個のＳ−Ｓ結合を有し、これは理論的に2.2
×1020種類の異なる方法で結合可能であり、その際にた
つた１個の構造が天然の状態に相当する。ｔ−PAを再活
性化するための技術水準から公知の方法は蛋白質分解作
用を有するｔ−PAに案内するが、測定可能な刺激可能性
はもたらさない。刺激可能なｔ−PAを生ぜしめる活性法
は公知ではない。
それ故本発明の課題は、遺伝子工学的に製造した、異種
の、ジスルフイド結合を有する真核蛋白質を原核におい
て発現後に完全に活性化する方法を開示することであ
り、この課題は本発明の目的により解決される。
本発明の目的は、請求の範囲第１項により、 ａ）原核細胞を砕解し、 ｂ）変性−及び還元条件下に真核蛋白質を可溶化し、 ｃ）還元−／変性剤を分離し、 ｄ）変性条件下にGSSGの添加により可溶化した蛋白質の
チオール基を蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフィ
ド（以下ｔ−PASSGと略記）に変換し、 ｅ）酸化条件下にｐ値７〜10.5、 GSH濃度0.5〜５ミリモル／でかつ変性作用をしない濃
度の変性剤の存在において混合ジスルフィドを再活性化
することを特徴とする。
この方法の優れた実施例は請求の範囲の従属請求項の目
的である。
一般に変性剤としては、酸化条件下に活性化するのに常
用の変性剤又はアルギニンを使用することができ、公知
の変性剤のうちグアニジン／ヒドロクロリド又は一般
式:R2−CO−NRR1（Ｉ）［式中、Ｒ及びR1はＨ又はＣ原
子１〜４個を有するアルキルを表わし、かつR2はＨ又は
−NHR1又はＣ原子１〜３個を有するアルキルを表わす］
で表される尿素もしくはその誘導体並びに脂肪族アミド
を使用すると優れている。更に、アルギニンが好適であ
ることが明らかになつた。更に、これらの変性剤の混合
物を使用することができる。またこの活性化工程を異種
蛋白質の存在において実施すると有利であり、一般に、
そのようなものとしては蛋白質分解作用をしない各異種
蛋白質が好適であり、殊に牛血清アルブミン（BSA）を
例えば１〜3mg/mlの量で使用する。BSAの添加は蛋白質
の収率及び安定性を僅かに高める（これは恐らく表面変
性及び／又は蛋白質分解から保護されることにより）。
他の方法条件は、再活性化工程に関して技術水準から公
知のかつ常用の条件に相応してよい。活性化（恒温保
持）時間は殊に室温で20〜48時間である。活性の半減期
は還元型（GSH）及び酸化型（GSSG）グルタチオン0.5ミ
リモル／の存在において20℃で約10〜15時間である。
一般に、再酸化条件下により長く恒温保持する際に（48
時間）、CNBr−FSPによる刺激可能性は低減する。活性
化工程をEDTAの存在において実施すると有利であり、そ
の際に最も有利な濃度はEDTA約１ミリモル／である。
活性化工程（再酸化／活性化）の前後の方法工程、例え
ば細胞の砕解、可溶化（可溶化／還元）及び場合により
活性化工程に先立つ及び／又は後続の１回又は数回の精
製操作は技術水術、例えばヨーロツパ公開特許第011450
6号明細書、同第0093619号明細書からこの種の方法に関
して知られていて常用の方法により実施することができ
るが、収率及び活性化について最適である結果のために
は、本明細書で詳説する方法実施形１個又は数個を考慮
して個々のあるいはすべての方法工程を実施すると有利
であり得る。特に、本発明による活性化工程を砕解後に
得られた混合物中で予め変性及び／又は還元をせずに実
施することも可能であるが、収率は低い。発現は原核中
で、殊にP.プチダ（putida）、特にE.コリ（coli）中で
実施する。しかし本発明方法は、他の原核（例えばバチ
リ:Bacilli）で発現する場合にも同様に好適である。
例えば、細胞の砕解は、常法で、例えば超音波、高圧分
散又はリゾチームにより実施することができ、殊に例え
ば0.1モル／トリス−HClのような、懸濁媒体として中
性乃至弱酸性のpH値の調節に好適な緩衝液中で実施す
る。細胞の砕解後に、不溶成分（“屈折小体”）を任意
の方法で、殊により高いｇ値とより長い遠心時間で遠心
分離するか又は濾過することにより分離する。ｔ−PAを
妨害しないが、異種の細胞蛋白質をできる限り溶解する
剤、例えば水、リン酸塩緩衝液を用いて、場合によりト
リトンのような穏やかな界面活性剤の添加下に洗浄した
後で、沈殿（ペレツト）を可溶化（可溶化／還元）にも
たらす。殊に、可溶化はアルカリ性pH範囲で、特にpH8.
6±0.4でかつメルカプタン基から成る還元剤と変性剤の
存在において行なう。
変性剤としては、可溶化に関して技術水準、例えばヨー
ロツパ公開特許第0114506号明細書から公知の常用の変
性剤、特にグアニジン−ヒドロクロリド又は尿素を使用
することができる。グアニジン−ヒドロクロリドの濃度
は有利に約６モル／、尿素のそれは約８モル／であ
る。一般式Ｉの化合物も同様に使用することができる。
メルカプタン基からの還元剤としては、例えば還元型グ
ルタチオン（GSH）又は２−メルカプトエタノールを例
えば濃度約50〜400ミリモル／で及び／又は特にDTE
（ジチオエリトリトール）もしくはDTT（ジチオトレイ
トール）を例えば濃度約80〜400ミリモル／で使用す
ることができる。可溶化は室温で１〜３時間、殊に２時
間（恒温保持）行なうと有利である。還元剤の空中酸素
による酸化を回避するためには、EDTAを添加すると有利
である。可溶化／還元と共に、可溶化工程は精製化効果
をも有している。それというのもｔ−PAと免疫学的に交
叉反応をしない物質（異種蛋白質）の大部分は溶解しな
いからである。
可溶化の後かつ活性化工程の前に、公知で常用の精製工
程を導入することができ、精製法としては、例えば滅菌
溶離クロマトグラフイ（SEC:Sterische Ausschluβchro
matographie）（グアニジン−ヒドロクロリド又は尿素
の存在において）又はイオン交換体（尿素又はその誘導
体の存在において）が該当し、非特異的な再酸化は還元
剤（例えば２−メルカプトエタノール）の添加により又
はpH4.5により回避することができる〔例えばR.Rudolp
h,“Biochem.Soc.Transactions"、13（1985）、308〜31
1〕。先行する可溶化工程でDTEを使用する場合には、DT
Eを精製工程で分離しなければならない。その精製は、
例えばセフアデツクス（Sephadex）G100を介してグアニ
ジン−ヒドロクロリド及び還元剤、例えばGSHの存在に
おいてpH1〜４でSECにより行なうかあるいは0.01モル／
HCl又は0.1モル／酢酸中セフアデツクスG25を介し
て脱塩して分離することにより行なうことができる。変
性剤／還元剤の分離は場合により同じ溶液に対して透析
することによつても可能である。
もう１つの精製工程は再活性化工程に続いて行なうこと
ができる。一般にそのような精製は透析により行なうか
あるいは活性化されたｔ−PAの単離に引続いて例えばLy
s−セフアロースを介してアフイニテイークロマトグラ
フイにより行なう。
本発明は、遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフ
イド結合を含有する真核蛋白質とグルタチオンとの混合
ジスルフイド（以下ｔ−PASSGと略記）の形成をベース
とする。これは、変性状態で異種蛋白質の分離も、また
天然蛋白質の精製も簡単にする。チオール基を変性した
後の精製は、蛋白質が空中酸化から保護され、それ故よ
り広いpH範囲で安定であり、かつ実負荷（Nettoladun
g）の変化が精製を簡便化するという利点を有する。特
に、イオン交換体処理により未変性の蛋白質の分離を有
利に行なうことができる。
混合ジスルフイドの形成に当つて、透析し、還元し、変
性−及び還元剤から精製された蛋白質を、変性剤を含有
する、稀釈した（例えば0.2モル／）GSSGの溶液と一
緒に恒温保持する。活性化は、変性−及び酸化剤の分離
後、GHS濃度0.5〜５ミリモル／のpH7〜10.5でかつ変
性作用をしない濃度の変性剤を用いて行なう。
他のすべての反応工程では、GSSGと一緒の混合ジスルフ
イドの形成を介して行なう蛋白質の活性化は本発明の前
記の部分の活性化に関する実施形に一致する。この実施
形では至適pHは8.5であり、収率は約２倍高くかつ活性
化された蛋白質は復元緩衝液中で長時間安定である。
本発明により、原核からのｔ−PAを活性化することがで
き、通常の生物学的活性の活性化ばかりでなく、更に刺
激可能性も前記の意味で達成され、この刺激可能性は天
然ｔ−PAのそれを著しく上廻り、10倍よりも高く、50倍
上廻ることもある。
本発明により原核において発現後に活性化することので
きる他の真核蛋白質はβ−インターフエロンである。
次の実施例により本発明を詳説するが、これに限定され
るものではない。特に記載のない限り、パーセントは重
量パーセントに関しかつ温度はセツ氏である。
例 １ ａ）“屈折小体”の調製 0.1モル／トリス/HCl（pH6.5）及び20ミリモル／ED
TA1.5中に取つたE.コリ細胞湿潤物質100gを均質化し
（Ultra−Turrax、10秒間）かつ0.25mg/mlリゾチームを
添加した。30分間室温で恒温保持後、再び均質化しかつ
３℃に冷却した。細胞の溶解は高圧分散（550kg/cm2）
により達成した。引続いて、0.1モル／トリス/HCl（p
H6.5）及び20ミリモル／EDTA300mlで後洗浄した。遠
心分離（27000g、４℃で２時間）後、ペレツトを0.1モ
ル／トリス/HCl（pH6.5）、20ミリモル／EDTA及び
2.5％トリトン−ｘ−100 1.3中に取りかつ均質化し
た。再び遠心分離（27000g、４℃で30分間）した後で、
ペレツトを0.1モル／トリス/HCl（pH6.5）、20ミリモ
ル／EDTA及び0.5％トリトン−ｘ−100 1.3中に取
りかつ均質化した。ペレツトの遠心分離（27000g、４℃
で30分間）と0.1モル／トリス/HCl（pH6.5）及び20ミ
リモル／EDTA1中で均質化を交互に３回を行なつ
た。
“屈折小体”調製物のｔ−PA含量はSDS−PAGE、ｔ−PA
バンドを“ウエスタン・ブロツテイング（Western−blo
tting）”により同定及びデンシトメータ分析により定
量化した。“屈折小体”はSDS−PAGE及び“ウエスタン
・ブロツテイング”で分子量約60kDaの強力なｔ−PAバ
ンドを示す。“屈折小体”の全蛋白質含量に対するｔ−
PAの割合は約21％である。
ｂ）“屈折小体”の可溶化／還元 “屈折小体”を、0.1モル／トリス/HCl（pH8.6）、６
モル／グアニジン−ヒドロクロリド、0.15〜0.4モル
／DTE及び１ミリモル／EDTA中の蛋白質濃度１〜5mg
/で２〜３時間室温で恒温保持した。その後、不溶物
質（細胞壁フラグメント等）を遠心分離した（例えば35
000〜50000g、４℃で30分間）。上澄みのpH値を濃HClで
pH3に調節した。変性−及び還元剤を0.01モル／HClに
対して４℃に透析することにより分離した。
ｃ）再酸化／活性化 再酸化／活性化は、0.1モル／トリス/HCl（pH10.
5）、１ミリモル／EDTA、1mg/BSA、0.5モル／Ｌ
−アルギニン、２ミリモル／GSH、0.2ミリモル／GS
SG中で1:50〜1:200に稀釈することにより行なつた。約2
0℃で17〜24時間活性化後、活性と、真核からの天然グ
リコシル化ｔ−PAの活性に比較して収率とを測定した。
“屈折小体”の全蛋白質含量に対する収率： 2.5＋／−0.5％ 刺激可能性:10＋／−５ “屈折小体”のｔ−PAに対する収率： 約12％ ｄ）変性−／還元剤を分離せずに再酸化／活性化 “屈折小体”を0.1モル／トリス/HCl（pH8.6）、６モ
ル／グアニジン−ヒドロクロリド、0.2モル／DTE及
び１ミリモル／EDTA中で蛋白質濃度1.25mg/mlで室温
で２時間恒温保持した。その後直ちに再酸化を、0.1モ
ル／トリス/HCl（pH10.5）、１ミリモル／EDTA、1m
g/ml BSA、0.3モル／Ｌ−アルギニン及び表に記載し
た量のGSSG中で1:100に稀釈して開始した。付加的に、
活性化バツチ中に0.06モル／グアニジン−ヒドロクロ
リド及び２ミリモル／DTEの残留濃度が存在した。
変性−／還元剤を分離せずに活性化する際の、GSSG濃度
に対する活性収率の依存性 例 ２ RB（“屈折小体”）−調製物（約5mg）を0.1モル／ト
リス/HCl（pH8.6）、６モル／グアニジン−ヒドロク
ロリド及び0.15〜0.2モル／DTE1ml中で２〜３時間室
温で恒温保持した。その後、不溶性物質（細胞壁フラグ
メント等）を遠心（17000gで20分間）により分離した。
変性−及び還元剤は0.01モル／HCl中のセフアデツク
スG25（超精密）を介してゲル濾過を行なうことにより
除去した。その際に、試料は約５〜10倍稀釈した。0.01
モル／HCl中の還元物質を−20℃で貯蔵した。
例 ３ 次表に種々の本発明によるパラメータの、ｔ−PAの活性
及び刺激可能性に対する作用を総括した。これらの再酸
化実験のために、例２により可溶化し、還元した蛋白質
を予備精製しなかつた。
還元蛋白質（0.01モル／HCl中）を“再酸化緩衝剤”
中で1:10〜1:500に稀釈することにより活性化した。活
性化は室温で22〜48時間恒温保持した後で測定した。再
酸化蛋白質の活性は、 0.1モル／トリス/HCl（pH＝10.5）＋ １ミリモル／EDTA ＋0.5モル／Ｌ−アルギニン ＋1mg/ml BSA ＋0.5ミリモル／GSH（還元型グルタチオン） ＋0.5ミリモル／GSSG（グルタチオンジスルフイド） 中の“標準再酸化”（＝100％）に対する。
刺激可能性は△Ｅ＋CNBrFSP/△Ｅ−CNBrFSPから計算す
る〔W.Nieuwenhuizen et al.、“Biochemica et Biophy
sica Acta"、755（1983）、531〜533参照〕。活性
（％）及び刺激可能性（係数）はJ.H.Verheijen、“Thr
omb.Haemostas."、48（３）、266〜269（1982）により
測定した。
次の結果が得られた： 1.L−アルギニン又はグアニジン−ヒドロクロリドの添
加に対する活性収率の依存性 再酸化:0.1モル／トリス/HCl（pH10.5） ＋１ミリモル／EDTA ＋1mg/ml BSA ＋0.5ミリモル／GSH ＋0.5ミリモル／GSSG中 ａ）Ｌ−アルギニン この実験では、ｔ−PAがＬ−アルギニンにより阻害され
ると考えられる。それ故、高いＬ−アルギニン濃度での
活性収率の低下は阻害に関して補正すべきである。
ｂ）グアニジン−ヒドロクロリド（Gdn/HCl） 2.尿素及び尿素誘導体の添加に対する活性収率の依存性 再酸化:0.1モル／トリス（pH10.5）、 １ミリモル／EDTA、1mg/ml BSA、 ５ミリモル／GSH、0.2ミリモル／GSS中 ａ）尿素 ｂ）メチル尿素 ｃ）エチル尿素 ｄ）ジメチル尿素 3.脂肪酸アミド添加に対する活性収率の依存性： 再酸化:0.1モル／トリス（pH10.5）、 １ミリモル／EDTA、1mg/ml BSA、 ５ミリモル／GSH、0.2ミリモル／GSSG中 ａ）ホルムアミド ｂ）メチルホルムアミド ｃ）アセタミド ｄ）プロピオナミド ｅ）ブチラミド 4.活性収率のpH値に対する依存性 再酸化:0.1モル／トリス/HCl＋１ミリモル／EDTA ＋0.5モル／Ｌ−アルギニン中 ＋1mg/ml BSA ＋0.5ミリモル／GSH ＋0.5ミリモル／GSSG 5.活性収率のGSH/GSSG濃度に対する依存性 再酸化:0.1モル／トリス/HCl、pH10.5、 ＋１ミリモル／EDTA ＋0.5モル／Ｌ−アルギニン ＋1mg/ml BSA ａ）＋１ミリモル／GSH ｂ）＋0.2ミリモル／GSSG 6.再酸化する際に活性収率の蛋白質濃度（稀釈1:20〜1:
500）に対する依存性 再酸化:0.1モル／トリス/HCl（pH10.5） ＋１ミリモル／EDTA ＋0.5モル／Ｌ−アルギニン ＋1mg/ml BSA ＋0.5ミリモル／GSH ＋0.5ミリモル／GSSG 7.活性収率のBSA添加に対する依存性 再酸化:0.1モル／トリス/HCl（pH10.5） ＋１ミリモル／EDTA ＋0.5モルＬ−アルギニン ＋0.5ミリモル／GSH ＋0.5ミリモル／GSSG 第１図及び第２図は、標準試験において0.1モル／ト
リス/HCl（pH＝10.5）＋１ミリモル／EDTA＋0.5モル
Ｌ−アルギニン＋1mg/ml BSA＋0.5ミリモル／GSH＋0.
5ミリモル／GSSG中、室温で17時間再酸化した後のCNB
r−FSPを含有する場合と含有しない場合の活性を図示し
たものである。第１図及び第２図において、曲線（Ａ）
がCNBr−FSPの存在における活性であり、曲線（Ｂ）がC
NBr−FSPの不存在における活性である。
例 ４ ｔ−PAとグルタチオンとの混合ジスルフイドを介するｔ
−PAの活性 使用する“屈折小体”は前記の例の１つにより得た。
“屈折小体”の還元は、0.1モル／トリス/HCl（pH8.
6）、１ミリモル／EDTA、６モル／Gdn/HCl、0.2モ
ル／DTE中、蛋白質濃度約1mg/mlで室温で２時間恒温
保持することにより行なつた。
0.01モル／HClに対して透析し、還元した蛋白質を0.1
モル／トリス（pH9.3）、９モル／尿素及び0.2モル
／GSSGにより比1:1で稀釈しかつ室温で５時間恒温保
持した。
濃HClでpH3の酸性にした後で、透析を0.01モル／HCl
に対して４℃で行なつた。透析後に全蛋白質濃度は0.33
mg/mlであつた。このように調製したｔ−PASSGを用いて
至適再活性化条件を測定した。
ａ）ｔ−PASSGの活性化の至適pH 次の最適化実験にあるように、（１）GSSGを使わずかつ
（２）活性を室温で17時間恒温保持した後で測定した。
活性化は、0.1モル／トリス、１ミリモル／EDTA、
0.5モル／Ｌ−アルギニン、1mg/ml BSA及び２ミリモ
ル／GSH中で1:100に稀釈することによりpH値を変えて
行なつた。 pH 収 率（％） 刺激可能性 6 0.04 3.3 6.5 0.37 9.5 7 1.35 11.4 7.5 5.66 7.1 8 7.32 8.2 8.5 8.65 7.0 9 8.59 8.7 9.5 8.32 11.7 10 6.15 12.5 10.5 3.07 11.2 収率は使用した蛋白質量に対する活性ｔ−PAの％であ
る。
ｂ）ｔ−PASSGの活性化結果の再現性 同一の活性化条件では、測定列が異なると、とりわけ標
準ｔ−PAの変動により惹起される種々の収率が認められ
る。この誤差範囲を明瞭にするために、0.1モル／ト
リス/HCl（pH8.5）、１ミリモル／EDTA、0.5モル／
Ｌ−アルギニン、1mg/ml BSA及び２ミリモル／GSH中
で1:100ないしは1:200に稀釈した後のすべての活性化デ
ータを総括した。
ｃ）活性化された蛋白質の安定性 活性化は、本例で0.1モル／トリス/HCl、１ミリモル
／EDTA、0.5モル／Ｌ−アルギニン、1mg/ml BSA及
び２ミリモル／GSH中で1:200に稀釈することにより行
なつた。
例 ５ 遺伝子工学的に製造したインターフエロン−βの活性化 “屈折小体”を前記の方法により生成した。“屈折小
体”の還元／可溶化は次のように行なつた：ペレツトを
9.1モル／トリス/HCl（pH8.6）、６モル／Gdn・HC
l、１ミリモル／EDTA及び0.2モル／DTE10ml中25℃
で３時間恒温保持しかつ４℃、48000gで30分間遠心した
後で上澄みのpHを濃HClで約３に調節した。引続いて、
0.01モル／HCl中セフアデツクスG25Fを介してゲル濾
過を行なつた。
溶出液を導電性、蛋白質濃度及び際活性能について試験
した。
再酸化蛋白質の活性は、0.1モル／トリス/HCl（pH10.
5）、１ミリモル／EDTA、５ミリモル／GSH、0.5ミ
リモル／GSSG及び0.25モル／Ｌ−アルギニン中の
“標準活性化”（＝100％）に対する。
ａ）活性収率のＬ−アルギニン添加に対する依存性溶出
液を0.1モル／トリス/HCl（pH8.5）、１ミリモル／
EDTA、５ミリモル／GSH、0.5ミリモル／GSSGにより
1:50に稀釈しかつ０℃で20時間活性化した。
活性のＬ−アルギニン−依存性Ｌ−アルギニン（モル／） 活 性（％） 0 8 0.25 8 0.5 15 0.75 15 ｂ）活性収率の尿素添加に対する依存性 活性化溶液は前記のａ）に相当するが、０℃で17時間活
性化した。
活性の尿素依存性尿素（モル／） 活 性（％） ０ 13 0.5 100 １ 200 1.5 100 ｃ）ホルムアミド添加に対する活性収率の依存性ａ）と
同様に活性化し、試料を０℃で17時間活性化した後で試
験した。
活性化のホルムアミド依存性ホルムアミド（モル／） 活 性 ０ 13 １ 13 ２ 13 ３ 0 ４ 0 ｄ）レドツクス緩衝剤に対する活性収率の依存性溶出液
を0.1モル／トリス/HCl（pH8.5）、１ミリモル／ED
TA及び0.25モル／Ｌ−アルギニン中で1:50に稀釈しか
つ試料を０℃で17時間活性化後に試験した。
活性のGSH/GSSG依存性 ｅ）BSA添加に対する活性収率の依存性 溶出液を0.1モル／トリス/HCl（pH8.5）、１ミリモル
／EDTA、５ミリモル／GSH、0.5ミリモル／GSSG及
び0.25モル／Ｌ−アルギニン中で1:50に稀釈しかつ０
℃で17時間活性化後に試験した。
活性のBSA依存性 BSA（mg/ml） 活 性（％） ０ 13 １ 13 ２ 25 ５ 13 ｆ）pHに対する活性収率の依存性 溶出液を0.1モル／トリス/HCl、１ミリモル／EDT
A、５ミリモル／GSH、0.5ミリモル／GSSG及び0.25
モル／Ｌ−アルギニン中で1:50に稀釈しかつ０℃で17
時間活性化後に試験した。
活性のpH依存性 pH 活性（％） 6.5 ０ 7.5 ６ 8.5 13 9.5 50 10.5 100
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/565 14/745 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:40） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 ルードルフ，ライナー ドイツ連邦共和国 Ｄ−8400 レーゲンス ブルク ウンテリスリンガー ヴエーク 21 (56)参考文献 特開 昭59−161321（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開122080（ＥＰ，Ａ) Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．364Ｐ. 813−820（1983) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．21 Ｐ．4734−4740（1982) Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ Ｖｏｌ．107Ｐ．305−329（1984)

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】原核生物中で発現させることにより、遺伝
    子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の
    真核蛋白質を活性化する方法において、 ａ）原核細胞を砕解し、 ｂ）変性−及び還元条件下に真核蛋白質を可溶化し、 ｃ）還元−／変性剤を分離し、 ｄ）変性条件下にGSSGの添加により可溶化した蛋白質の
    チオール基を蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフィ
    ドに変換し、 ｅ）酸化条件下にpH値７〜10.5、GSH濃度0.5〜５ミリモ
    ル／でかつ変性作用をしない濃度の変性剤の存在にお
    いて混合ジスルフィドを再活性化することを特徴とする
    方法。
  2. 【請求項２】発現をE.コリ又はP.プチダで行なうことを
    特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】再活性化工程において変性剤としてアルギ
    ニン、グアニジン−ヒドロクロリド及び／又は一般式:R
    2−CO−NRR1（Ｉ）［式中Ｒ及びR1はＨ又はＣ原子１〜
    ４個を有するアルキルを表わしかつR2はＨ又はNHR1又は
    Ｃ原子１〜３個を有するアルキルを表わす］の化合物少
    なくとも１種を使用することを特徴とする特許請求の範
    囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】アルギニン及び／又はグアニジンヒドロク
    ロリドの濃度が0.1〜1.0モル／であることを特徴とす
    る請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】一般式Ｉの化合物の濃度が0.5〜４モル／
    であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方
    法。
  6. 【請求項６】再活性化工程において蛋白質分解作用をし
    ない蛋白質の存在において作業することを特徴とする請
    求の範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方
    法。
  7. 【請求項７】細胞の砕解を超音波、高圧分散又はリゾチ
    ームを用いて行なうことを特徴とする請求の範囲第１項
    から第６項までのいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】砕解を稀水性緩衝液中、中性乃至弱酸性の
    pH値で行なうことを特徴とする請求の範囲第７項記載の
    方法。
  9. 【請求項９】細胞の砕解後に不溶性成分を分離すること
    を特徴とする請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    か１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】可溶化工程において、アルカリ性pH値で
    メルカプト基から成る還元剤の存在において及び変性剤
    の存在において作業することを特徴とする請求の範囲第
    １項から第９項までのいずれか１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】変性剤としてグアニジンヒドロクロリド
    及び／又は一般式Ｉの化合物の存在において作業するこ
    とを特徴とする請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】グアニジンヒドロクロリドの濃度が６モ
    ル／であり、一般式Ｉの化合物の濃度が８モル／で
    あることを特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】DTE、β−メルカプトエタノール、シス
    テムイン又はGSHの存在において作業することを特徴と
    する請求の範囲第10項から第12項までのいずれか１項記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】精製及び還元剤、酸化剤又は変性剤の分
    離は滅菌溶離クロマトグラフィ又は透析により行なうこ
    とを特徴とする請求の範囲第１項から第13項までのいず
    れか１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】再活性化工程の後で透析による精製工程
    を行なうことを特徴とする請求の範囲第１項から第14項
    までのいずれか１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】遺伝子工学的に製造した真核蛋白質とし
    てｔ−PAを使用することを特徴とする請求の範囲第１項
    から第15項までのいずれか１項記載の方法。
  17. 【請求項１７】遺伝子工学的に製造した真核蛋白質とし
    てインターフエロンβを使用することを特徴とする請求
    の範囲第１項から第15項までのいずれか１項記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】蛋白質とグルタチオンとの混合ジスルフ
    ィドをイオン交換体処理により変性されていない蛋白質
    から分離することを特徴とする請求の範囲第１項記載の
    方法。
JP61505882A 1985-10-23 1986-10-23 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 Expired - Lifetime JPH0728745B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853537708 DE3537708A1 (de) 1985-10-23 1985-10-23 Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
DE3537708.9 1985-10-23
PCT/EP1986/000610 WO1987002673A2 (en) 1985-10-23 1986-10-23 Process for activating heterologous, eucaryotic proteins genetically engineered and presenting disulphide bridges after their expression in procaryotic cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3079762A Division JPH0824594B2 (ja) 1985-10-23 1991-04-12 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62502895A JPS62502895A (ja) 1987-11-19
JPH0728745B2 true JPH0728745B2 (ja) 1995-04-05

Family

ID=6284269

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61505882A Expired - Lifetime JPH0728745B2 (ja) 1985-10-23 1986-10-23 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法
JP3079762A Expired - Lifetime JPH0824594B2 (ja) 1985-10-23 1991-04-12 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3079762A Expired - Lifetime JPH0824594B2 (ja) 1985-10-23 1991-04-12 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法

Country Status (26)

Country Link
EP (3) EP0393725B1 (ja)
JP (2) JPH0728745B2 (ja)
KR (1) KR900009139B1 (ja)
AT (2) ATE131489T1 (ja)
AU (2) AU590029B2 (ja)
CA (1) CA1329157C (ja)
CZ (1) CZ280727B6 (ja)
DD (1) DD260517A5 (ja)
DE (3) DE3537708A1 (ja)
DK (2) DK175091B1 (ja)
ES (2) ES2020498T3 (ja)
FI (2) FI94050C (ja)
GR (2) GR920300062T1 (ja)
HK (2) HK153596A (ja)
HR (1) HRP921075B1 (ja)
HU (2) HUT43643A (ja)
IE (1) IE62634B1 (ja)
IL (1) IL80325A (ja)
PT (1) PT83609B (ja)
SI (1) SI8611796B (ja)
SK (1) SK278317B6 (ja)
SU (1) SU1607689A3 (ja)
UA (1) UA6023A1 (ja)
WO (1) WO1987002673A2 (ja)
YU (1) YU47185B (ja)
ZA (1) ZA868012B (ja)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
US4777043A (en) * 1985-12-17 1988-10-11 Genentech, Inc. Stabilized human tissue plasminogen activator compositions
WO1988008428A1 (en) * 1987-04-28 1988-11-03 Amgen Inc. Method for purifying granulocyte/macrophage colony stimulating factor
DE3722082A1 (de) * 1987-07-03 1989-01-12 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von serinproteasen oder serinproteaseinhibitoren
CA1340586C (en) * 1988-09-23 1999-06-08 Cetus Corporation Process for recovering microbially produced interferon-beta
DE3832898A1 (de) * 1988-09-28 1990-04-12 Boehringer Mannheim Gmbh Praeparat von in prokaryonten exprimiertem plasminogenaktivator
DE3835350A1 (de) * 1988-10-17 1990-04-19 Boehringer Mannheim Gmbh Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
DE3942143A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh T-pa pro stabilisierung
ATE154073T1 (de) * 1990-08-20 1997-06-15 Novo Nordisk As Prozess für die herstellung von biologisch aktivem igf-1 durch verwendung von amino-terminal verlängertem igf-1
ES2119779T3 (es) * 1990-09-05 1998-10-16 Southern Cross Biotech Pty Ltd Solubilizacion de proteinas en formas activas.
DE4037196A1 (de) * 1990-11-22 1992-05-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein
DE4113750A1 (de) 1991-04-26 1992-10-29 Boehringer Mannheim Gmbh Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen
DE4139000A1 (de) * 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur gentechnologischen herstellung von biologisch aktivem ss-ngf
US5212091A (en) * 1992-03-02 1993-05-18 Monsanto Company Method of producing tissue factor pathway inhibitor
EP0586667A1 (en) * 1992-03-24 1994-03-16 Synergen, Inc. Refolding and purification of insulin-like growth factor i
EP0600372B1 (de) 1992-12-02 1997-02-05 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
FR2729972B1 (fr) * 1995-01-31 1997-04-18 Sanofi Sa Procede d'extraction de proteines periplasmiques de microorganismes procaryotes en presence d'arginine
US5714371A (en) * 1995-05-12 1998-02-03 Schering Corporation Method for refolding insoluble aggregates of hepatitis C virus protease
US5728804A (en) * 1995-06-02 1998-03-17 Research Corporation Technologies, Inc. Use of cyclodextrins for protein renaturation
CA2257122C (en) * 1996-06-11 2004-04-06 Boehringer Mannheim Gmbh Method of activating denatured protein
US7153943B2 (en) 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US6653098B1 (en) * 1998-02-23 2003-11-25 G. D. Searle & Co. Method of producing mouse and human endostatin
DE19850429A1 (de) * 1998-10-27 2000-05-04 Andre Schrattenholz Fragmente
EP1048732A1 (de) 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
EP1077263A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
DE10105912A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Proteinase K
DE10105911A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Roche Diagnostics Gmbh Expression der rekombinanten Proteinase K aus Tritirachium album in Hefe
DE102005033250A1 (de) 2005-07-15 2007-01-18 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von G-CSF
DE202006020194U1 (de) 2006-03-01 2007-12-06 Bioceuticals Arzneimittel Ag G-CSF-Flüssigformulierung
RU2439076C2 (ru) 2006-07-14 2012-01-10 Дженентек, Инк. Способ выделения повторно свернутого рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток (варианты)
US8617531B2 (en) 2006-12-14 2013-12-31 Bolder Biotechnology, Inc. Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine
CN102892780B (zh) 2010-03-17 2015-07-29 通益制药有限公司 获得生物活性的重组人g-csf的方法
CA2815342A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Medimmune, Llc Methods for processing inclusion bodies
HUP1200171A1 (hu) 2012-03-19 2013-09-30 Richter Gedeon Nyrt Módszerek polipeptidek elõállítására
HUP1200172A2 (en) 2012-03-19 2013-10-28 Richter Gedeon Nyrt Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
CN103852527B (zh) * 2012-12-05 2015-05-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种高通量蛋白质样品预处理装置
US10457716B2 (en) 2014-08-06 2019-10-29 University Of Notre Dame Du Lac Protein folding and methods of using same
JP6629488B2 (ja) 2016-12-30 2020-01-15 バイオジェンド セラピューティクス カンパニー リミテッド 組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法
CA3200462A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Sebastian Damerow Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59161321A (ja) * 1982-12-22 1984-09-12 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法
EP0122080A1 (en) * 1983-03-25 1984-10-17 Celltech Limited A process for the production of a protein

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5135481A (ja) * 1974-09-18 1976-03-25 Fujiwa Kako Kk Kojundohitorokinaaze no seiho
US4468633A (en) 1982-04-28 1984-08-28 The Bendix Corporation Adjustable microwave power combiner for a plurality of coaxially mounted impatt diodes
AR241654A1 (es) 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
JPS6051119A (ja) * 1983-08-30 1985-03-22 Green Cross Corp:The ウロキナ−ゼ乾燥製剤
US4530787A (en) * 1984-03-28 1985-07-23 Cetus Corporation Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins
US4748234A (en) * 1985-06-26 1988-05-31 Cetus Corporation Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts
US4766205A (en) * 1985-11-13 1988-08-23 Beatrice Companies, Inc. Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms
FR2596360B1 (fr) * 1986-04-01 1989-02-17 Sotralentz Sa Conteneur sur palette avec dispositif de protection en treillis plie et renforce
JPH0651119A (ja) * 1992-07-28 1994-02-25 Sekisui Chem Co Ltd 位相差板の製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59161321A (ja) * 1982-12-22 1984-09-12 ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法
EP0122080A1 (en) * 1983-03-25 1984-10-17 Celltech Limited A process for the production of a protein

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ．２１Ｐ．４７３４−４７４０（１９８２）
Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．３６４Ｐ．８１３−８２０（１９８３）
ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ．１０７Ｐ．３０５−３２９（１９８４）

Also Published As

Publication number Publication date
KR870700601A (ko) 1987-12-30
FI933868A0 (fi) 1993-09-03
DK175091B1 (da) 2004-05-24
PT83609A (de) 1986-11-01
SK752686A3 (en) 1996-10-01
WO1987002673A2 (en) 1987-05-07
DK175109B1 (da) 2004-06-07
CZ752686A3 (en) 1996-01-17
DE3537708C2 (ja) 1993-07-08
YU47185B (sh) 1995-01-31
HRP921075A2 (en) 1995-06-30
IL80325A (en) 1992-06-21
DE3537708A1 (de) 1987-04-23
EP0393725A1 (de) 1990-10-24
ES2020498A4 (es) 1991-08-16
IE62634B1 (en) 1995-02-22
EP0219874A3 (en) 1988-02-10
SI8611796A (sl) 1996-10-31
FI872753A0 (fi) 1987-06-22
AU590029B2 (en) 1989-10-26
SK278317B6 (en) 1996-10-02
ZA868012B (en) 1987-06-24
UA6023A1 (uk) 1994-12-29
EP0253823A1 (de) 1988-01-27
EP0219874B1 (de) 1993-12-15
CZ280727B6 (cs) 1996-04-17
FI94050B (fi) 1995-03-31
KR900009139B1 (ko) 1990-12-22
HUT43643A (en) 1987-11-30
ES2061434T3 (es) 1994-12-16
FI872753A (fi) 1987-06-22
DK320387D0 (da) 1987-06-23
AU607083B2 (en) 1991-02-21
HK153496A (en) 1996-08-16
AU4132189A (en) 1990-01-04
DE3689404D1 (de) 1994-01-27
CA1329157C (en) 1994-05-03
IE862683L (en) 1987-04-23
JPH04218387A (ja) 1992-08-07
FI95578B (fi) 1995-11-15
FI95578C (fi) 1996-02-26
YU179686A (en) 1988-06-30
DD260517A5 (de) 1988-09-28
EP0393725B1 (de) 1995-12-13
SI8611796B (sl) 1998-06-30
DK200001897A (da) 2000-12-18
JPH0824594B2 (ja) 1996-03-13
JPS62502895A (ja) 1987-11-19
ES2020498T3 (es) 1996-04-01
HK153596A (en) 1996-08-16
AU6599386A (en) 1987-05-19
EP0219874A2 (de) 1987-04-29
GR3018410T3 (en) 1996-03-31
IL80325A0 (en) 1987-01-30
DE3650449D1 (de) 1996-01-25
FI933868A (fi) 1993-09-03
HU204855B (en) 1992-02-28
SU1607689A3 (ru) 1990-11-15
WO1987002673A3 (fr) 1987-10-22
HRP921075B1 (en) 1999-02-28
DK320387A (da) 1987-06-23
FI94050C (fi) 1995-07-10
GR920300062T1 (en) 1992-08-31
ATE98648T1 (de) 1994-01-15
ATE131489T1 (de) 1995-12-15
PT83609B (pt) 1988-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0728745B2 (ja) 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法
Lilja A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein.
Hillson et al. Formation and isomerization of disulfide bonds in proteins: protein disulfide-isomerase
US5593865A (en) Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulphide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes
EP1893632B1 (en) Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
KR920010873B1 (ko) 유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 항체의 활성화 방법
Geus et al. Expression of porcine pancreatic phospholipase A 2. Generation of active enzyme by sequence-specific cleavage of a hybrid protein from Escherichia coli
Joly et al. Protein folding activities of Escherichia coli protein disulfide isomerase
Nagler et al. Subunit structure of bovine milk xanthine oxidase. Effect of limited cleavage by proteolytic enzymes on activity and structure
Gan et al. Preparation of homogeneous pig liver thioltransferase by a thiol: disulfide mediated pI shift
EP0208539A2 (en) Folding disulfide-cross-linkable proteins
Owen et al. Evidence for an ester bond between thrombin and heparin cofactor
AU620927B2 (en) A preparation of plasminogen activator expressed in prokaryotes
JP3070935B2 (ja) 変性組換え融合蛋白質のバイオ触媒的な正確な鎖フオールデイングのための方法
CZ280848B6 (cs) Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech
Bhatt et al. Heterologous expression, purification and single step efficient refolding of recombinant tissue plasminogen activator (Reteplase) from E. coli
JPS6226298A (ja) ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法
Tikhonov et al. Methods of Preparation of Recombinant Cytokines: IV. Renaturation of Recombinant Human Interleukin-3
JPS61268181A (ja) Ｓ−置換アルキル化還元リゾチ−ムおよびその製造方法
Żbikowska et al. Vertebrate plasminogen
JPS63145297A (ja) タンパク質の精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term