DK175091B1

DK175091B1 - Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler

Info

Publication number: DK175091B1
Application number: DK198703203A
Authority: DK
Inventors: Rainer Rudolph; Stephan Fischer; Ralf Mattes
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1985-10-23
Filing date: 1987-06-23
Publication date: 2004-05-24
Also published as: JPS62502895A; CA1329157C; FI872753A; EP0219874A2; FI94050B; SK752686A3; FI933868A; WO1987002673A2; DK320387D0; ES2020498T3; IE62634B1; AU590029B2; AU4132189A; HK153496A; UA6023A1; EP0393725A1; AU607083B2; FI94050C; YU179686A; DD260517A5

Description

DK 175091 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler.

Ved ekspressionen af heterologe proteiner i prokaryote celler danner disse proteiner i værtscellerne ofte inaktive, tungtopløselige aggregater (såkaldte "refractile bodies”), som 5 desuden er forurenede med værtscellernes proteiner. Man antager, at dannelsen af sådanne "refractile bodies" er en følge af den ved ekspressionen opståede høje proteinkoncentration i cellen; Det vides, at dannelsen af store enzymmængder i cellen fører til enzymernes sammenklumpning til uopløselige, højmolekylære, for det meste inaktive partikler. Før sådanne proteiner kan anvendes til f.eks. terapeutiske formål, skal disse 10 derfor oprenses og overføres til deres aktive form.

Ifølge kendte fremgangsmåder kan en reaktivering af sådanne, som aggregater foreliggende proteiner gennemføres i flere trin (sammenlign f.eks. R. Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, bind 52 (1979) 187 til 198; R. Rudolph et al., Biochemistry 18 (1979) 5572 til 5575): 15 I det første trin opnås en solubilisering ved tilsætning af kraftigt virkende denatureringsmidler, eksempelsvis guanidin- hydrochlorid eller urinstof i høj koncentration eller ved tilsætning af stærkt sure agentier, eksempelvis glycin/phosphor- syre-rblandinger. Som yderligere hjælpestoffer har reducerende SH-reagentier (f.eks. dithioerythritol, DTE) og EDTA vist sig som egnede, f.eks. ved renaturering af LDH. Såfremt proteinet er forure-20 net med proteiner fra værtscellen følger som næste trin en oprensning ved i og for sig kendte og gængse metoder, f.eks. gel- eller ionudbytterchromatografi. Derefter fortyndes kraftigt, for at nedsætte denatureringsmidlets koncentration. Ved anvendelse af guanidin-hydrochlorid fortyndes herved til koncentrationer under 0,5 mol/1. Ved enzymer med frie SH-grupper viste det sig at være fordelagtigt at tilsætte 25 SH-gruppebeskyttende agentier (sammenlign f.eks. R. Jaenicke, Journal Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143 til 2160).

UK Ί /5Uyi bl 2 I den europæiske patentansøgning EP-A-0114506 beskrives fremgangsmåder til isolering, oprensning og reaktivering af nogle heterologe ekspressionsprodukter fra bakteriekulturer; til reaktiveringen overføres opløsninger af "refractile bodies" i et kraftigt virkende denatureringsmiddel a) direkte til en opløsning i et svagere denatureringsmid-5 del, som herefter udsættes for oxiderende betingelser for at gendanne disulfidbroer; b) proteinet sulfoneres, overføres herefter til en opløsning i et svagere denatureringsmiddel, og S-sulfonatgruppeme omdannes ved behandling med et sulfhydrylreagens i dets reducerede og oxiderede form, f.eks. med GSH/GSSG, til -S-S-grupper; eller c) opløsningen behandles i et svagt denatureringsmiddel direkte med sulfhydryl-reagenset, f.eks. med 10 GSH/GSSG. Et typisk eksempel, hvorved de oven for anførte problemer forekommer, er t-PA.

Proteinmatrixens hovedkomponent i koaguleret blod er polymert fibrin. Denne protein-matrix opløses ved hjælp af plasmin, som dannes ud fra plasminogen via aktivering gennem de såkaldte plasminogen-aktivatorer, f.eks. gennem t-PA (vævs-plasminogen-15 aktivator, tissue-type plasminogenaktivator). Den enzymatiske aktivitet af naturligt eller ud fra højkaryotiske celler genteknologisk indvundet t-PA (katalytisk aktivering af plasminogen til plasmin) er ved fraværelse af fibrin eller fibrinspaltningsprodukter (FSP) særdeles ringe, men kan ved disse stimulatorers tilstedeværelse forøges væsentligt (mere end faktoren 10). Denne såkaldte aktivitetstimulerbarhed er en afgørende fordel af t-PA 20 i forhold til andre kendte plasminogenaktivatorer, såsom urokinase eller streptokinase (sammenlign f.eks. M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem. 257 (1982) 2912 til 2919; Nieuwenhiuzen et al., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 til 533). Stimuler-barhedsfaktoren med BrCN-spaltningsprodukter angives derfor i litteraturen forskelligt, og der nævnes tal op til 35.

25 Et t-PA-agtigt, ikke-glycosyleret produkt dannes også i genetisk manipuleret prokaryotiske celler (efter indslusning af cDNA); et sådant produkt virker imidlertid ikke stimulerende på aktiviteten af en t-PA fra eukaryotiske celler. Dette kan eventuelt skyldes, at reaktionsbetingelseme i den prokaryotiske celle på en sådan måde er forskellige fra det — DK 175091 B1 3 i den eukaryotiske celle, hvorfra genet stammer, at der allerede fra begyndelse af ikke dannes et aktivt produkt, som eksempelvis kunne skyldes, at de talrige SS-broer, som det naturlige aktive molekyle indeholder, på forkert måde er knyttet sammen eller slet ikke dannes. Ved den terapeutiske anvendelse af t-PA er imidlertid ikke kun alene den 5 enzymatiske aktivitet nødvendig, men desuden også dens stimulerbarhed. Til den kendsgerning, at den prokaryotiske celle formodentlig ikke skaber de rigtige betingelser for at tilvejebringe aktiviteten af eukaryotiske proteiner på en rigtig måde, henvises i sammenhæng med andre stoffer i EMBO Journal 4, nr. 3 (1985) 775 til 780.

Ifølge den europæiske patentansøgning EP-A-0093639 bliver de fra E. coli opnåede 10 cellepellets til reaktiveringen af t-PA opslæmt i 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid, behandlet med ultralyd, inkuberet og herefter dialyseret i 4 timer mod en opløsning af Tris-HCl (pH = 8,0), natriumchlorid, EDTA og Tween 80. Efter dialyse centrifugeres, hvorhos plasminogenaktivatoraktiviteten findes i overstanden. Den på denne måde renaturerede t-PA er ganske vist proteolytisk aktiv, men udviser imidlertid ingen målelig stimulerbar-15 hed gennem BrCN-spaltningsprodukter (BrCN-FSP) af fibrin, ifølge den i J. H. Verhei-jen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 260-269 (1982) beskrevne fremgangsmåde.

Orsini og Goldberg (J. Biol. Chem. 253 (1978), 3453-3458) beskriver renatureringen af reduceret chymotrypsinogen A ved overførsel af de denaturerede proteiner i en rena-tureringspuffer, som indeholder GSH, GSSG og et ikke-denaturerende koncentration af 20 · guanidin-HCI eller urinstof.

4

Fra Proc. Nacl. Acad. Sci. USA, bind 81: side 3273-3277 (1984) kendes en fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant protein i E.coli. Celieekstraktet med det opløste, denaturerede og reducerede antistof centrifugeres og dialyseres, og dialysatet reaktiveres under en række dialyser ved pH-værdi 10,8 med 1 mM GSH og 0,1 mM GSSG og 25 urinstof, hvor sidstnævnte dialyseres til en slutkoncentration på 1M. Under rekonstitueringen af antistof sker der blandt andet en omdannelse af de denaturerede, disulfid-frie kæder til protein-S-sulfonat ved hjælp af natriumsulfid og natriumtetrathionat. I frem- DK 175091 B1 4 gangsmåden ifølge opfindelsen undgås imidlertid en række af mellemtrinnene, som ifølge ovenstående artikel skal gennemføres efter dannelse af disulfid og før rena-turering.

Til reaktiveringen af denaturerede proteiner findes der ifølge kendt teknik ingen generelt 5 anvendelig fremgangsmåde; dette gælder især t-PA, idet det naturlige protein besidder en særdeles kompleks struktur; det indeholder en fri thiolgruppe og 17 SS-broer, som teoretisk kan sammenknyttes på 2,2 x 1020 forskellige måder, og kun en struktur svarer til den naturlige tilstand. Fremgangsmåder ifølge kendt teknik til reaktivering af t-PA fører godt nok til en proteolytisk aktiv t-PA, men udviser ingen målelig stimulerbarhed.

10 En aktiveringsfremgangsmåde, som fører til stimulerbart t-PA, kendes ikke.

Den foreliggende opfindelses formål er derfor at tilvejebringe en fremgangsmåde til fuldstændig aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, 15 heterologe, disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler, som opnås i patentkrav 1 ved hjælp af celleoplukning, solubilisering under denaturerende og reducerende betingelser og aktivering (renaturering) under oxiderende betingelser ved tilstedeværelse af GSH/GSSG. Det ejendommelige ved fremgangsmåden er, at man i aktiveringstrinnet arbejder ved en pH-værdi på 8 til 12, en 20 GSH-koncentration på 0,1 til 20 mmol/1, en GSSG-koncentration på 0,01 til 3 mmol per liter og med en ikke-denaturerende koncentration af denatureringsmidlet, og at man i reaktiveringstrinnet som denatureringsmiddel anvender arginin og/eller mindst én forbindelse med den almene formel R2-CO-NRR, (I), hvor R og R, betyder H eller alkyl med 1 til 4 C-atomer og R2 betyder H eller NHR, eller alkyl med 1 til 3 C-atomer, med det 25 forbehold, at R og R, ikke samtidigt er H.

Foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden anføres i underkravene.

DK 175091 B1 5

Som denatureringsmiddel anvendes arginin eller urinstofderivater ifølge formel (I).

Endvidere kan blandinger af disse denatureringsmidler anvendes. Fortrinsvis udføres dette aktiveringstrin også ved tilstedeværelse af et fremmed protein; som et sådant egner sig i reglen et hvilket som helst fremmedprotein, så længe dette ikke virker proteolytisk; 5 fortrinsvis anvendes okseserumalbumin (BSA), f.eks. i en mængde på 1 til 3 mg/ml. BSA-tilsætningen tilvejebringer et let forhøjet udbytte og stabilisering af proteinet (dette skyldes sandsynligvis beskyttelse mod overfladedenaturering og/eller proteolytisk nedbrydning).

De øvrige fremgangsmådebetingelser kan svare til de for reaktiveringstrin fra teknikkens 10 stade kendte og sædvanlige betingelser. Aktiveringsvarighed (inkubation) andrager fortrinsvis 20 til 48 timer ved stuetemperatur. Halveringstiden for aktiveringen ligger ved tilstedeværelse af 0,5 mmol/1 reduceret (GSH) og oxideret (GSSG) glutathion ved ca. 10 til 15 timer ved 20°C. Ved en længere inkubation (48 timer) under reoxidations-betingelser aftager i reglen stimulerbarheden gennem CNBr-FSP. Aktiveringstrinnet 15 gennemføres fortrinsvis ved tilstedeværelse af EDTA, hvorhos den mest egnede koncentration er ca. 1 mmol/1 EDTA.

De af aktiveringstrinnet (reoxidation/aktivering) forudgående og efterfølgende fremgangsmådetrin, såsom celleoplukning, solubilisering (solubilisering/reduktion) og eventuelt et eller flere af de af aktiveringstrinnet forudgående og/eller efterfølgende oprens-20 ningsoperationer, kan ifølge kendt teknik, f.eks. EP-A-0114506 og EP-A-0093619, gennemføres ved for sådanne fremgangsmåder kendte og gængse metoder; med henblik på et med hensyn til udbytte og aktivering optimalt resultat kan det imidlertid være nyttigt, at gennemføre enkelte eller alle fremgangstrin i overensstemmelse med en eller flere af de heri angivne udførelsesformer. Navnlig er det muligt at gennemføre trinnene 25 til aktivering ifølge opfindelsen ved den efter oplukningen opnåede blanding uden forudgående denaturering og/eller reduktion, dog med lavere udbytte. Ekspressionen gennemføres i prokaryote celler, fortrinsvis i P. putida, og især i E. coli. Fremgangsmåden vi\ i ( vvs u i 6 ifølge opfindelsen er imidlertid lige så egnet, når ekspressionen foregår i andre prokaryote celler (f.eks. Bacilli).

Celleoplukningen kan gennemføres ved dertil gængse metoder, f.eks. ved hjælp af ultralyd, højtryksdispersion eller lysozym; oplukningen sker fortrinsvis i en til indstilling 5 af en neutral til svag sur pH-værdi egnet pufferopløsning som suspensionsmedium, som f.eks. i 0,1 mol/1 Tris-HCl. Efter celleoplukningen fraskilles de uopløselige bestanddele ("refractile bodies") på en hvilken som helst måde, fortrinsvis ved afcentrifugering ved højere g-tal og længere centrifugeringstider eller ved filtrering. Efter vask med agentier, som ikke indvirker på t-PA, men som så vidt muligt opløser fremmede celleproteiner, 10 f.eks. vand, phosphat-pufferopløsning, underkastes bundfaldet (pellet) eventuelt under tilsætning af milde detergenter, såsom Triton, solubiliseringen (solubilisering/reduktion). Solubiliseringen sker fortrinsvis i alkalisk pH-område, navnlig ved pH = 8,6 ± 0,4 og ved tilstedeværelse af et reduktionsmiddel af mercaptangruppenog et denatureringsmiddel.

15 Som denatureringsmiddel kan anvendes de for solubiliseringen fra teknikkens stade, f.eks. fra den europæiske patentansøgning EP-A-0114506, kendte og sædvanlige denatureringsmidler anvendes, navnlig guanidin-hydrochlorid eller urinstof. Koncentrationen af guanidin-hydrochlorid andrager hensigtsmæssigt ca. 6 mol/1 og for urinstof ca. 8 mol/1. Ligeledes kan forbindelser med den almene formel I anvendes.

20 Som reduktionsmiddel af mercaptangruppen kan f.eks. anvendes reduceret glutathion (GSH) eller 2-mercaptoethanol, f.eks. i en koncentration på ca. 50 til 400 mmol per liter og/eller navnlig DTE (dithioerythritol) eller DTT (dithiothreitol), f.eks. i en koncentration på ca. 80 til 400 mmol/1. Solubiliseringen sker passende ved stuetemperatur i løbet af en eller flere timer (inkubation), fortrinsvis i løbet af to timer. Til forhindring af 25 reduktionsmidlets oxidation gennem luftens oxygen kan det desuden være nyttigt at tilsætte EDTA. Ved siden af solubilisering/reduktion har solubiliseringstrinnet også en DK 175091 B1 7 rensningseffekt, idet en stor del af det med t-PA immunologisk ikke-krydsreagerende materiale (fremmedprotein) ikke går i opløsning.

Efter solubiliseringen og før aktiveringstrinnet kan de på i og for sig kendte og gængse rensningstrin skubbes ind; som rensningsmetoder kommer f.eks. sterisk udelukkelses-5 chromatografi (SEC) (ved tilstedeværelse af guanidin-hydrochlorid eller urinstof) eller ionbytter (f.eks. ved tilstedeværelse af urinstof eller derivater deraf) i betragtning; en uspecifik reoxidation kan forhindres ved tilsætning af et reduktionsmiddel (f.eks.

2-mercaptoethanoI) eller ved pH-værdi 4,5 (sammenlign f.eks. R. Rudolph, Biochem.

Soc. Transactions 13 (1985) 308 til 311). Anvendes i det forudgående solubiliseringstrin 10 DTE, skal dette fraskilles i et rensningstrin. Rensningen kan f.eks. udføres ved SEC over Sephadex G 100 ved tilstedeværelse af guanidin-hydrochlorid og et reduktionsmiddel, f.eks. GSH ved en pH på 1 til 4 (i dette trin kan en stor mængde fremmedprotein fraskilles); eller via fraskillelse af denaturerings/ reduktionsmidlet ved afsaltning over Sephadex G 25 i 0,01 mol/1 HC1 eller 0,1 mol/1 eddikesyre. Denaturerings-/reduktions-15 midlets fraskillelse kan alternativt opnås ved dialyse mod de samme opløsninger.

Et yderligere rensningstrin kan følge reaktiveringstrinnet; en sådan rensning sker i reglen ved hjælp af dialyse, eller også ved en efterfølgende isolering af den aktiverede tPA, eksempelvis ved hjælp af affmitetschromatografi, f.eks. over Lyssepharose.

Ifølge opfindelsen er det muligt at aktivere t-PA, der stammer fra prokaryote celler, 20 således at man ikke kun opnår en aktivering af den normale biologiske aktivitet, men derudover også en stimulerbarhed, som defineret ovenfor, der i stort omfang overgår stimulerbarheden af den naturlige t-PA, og som kan være større end faktor 10, endog faktor 50.

Et yderligere eukaryotisk protein, som kan aktiveres ifølge opfindelsen efter ekspression 25 i prokaryote celler, er B-interferon.

8 DK 175091 Bl

Opfindelsen belyses ved hjælp af de efterfølgende eksempler, uden dog at være begrænset dertil. Når der ikke er anført andet, henviser procentangivelser til vægt% og temperaturangivelser til °C.

EKSEMPEL 1 5 a) Fremstilling af "refractile bodies" 100 g E. coli fugtig cellemasse, optaget i 1,5 1, 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/1 EDTA homogeniseredes (Ultra-Turrax, 10 sek.), og der tilsattes 0,25 mg/ml lysozym. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur homogeniseredes påny og nedkøledes til 3°C. Celleoplukningen opnåedes ved hjælp af højtryksdispersion (550 10 kg/cm2). Herefter efterspuledes med 300 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/1 EDTA. Efter centrifugering (2 timer ved 27.000 g, 4°C) optoges pelleten i 1,3 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/1 EDTA og 2,5% Triton-x-100og homogeniseredes.

Efter fornyet centrifugering (30 minutter ved 27.000 g, 4°C) optoges pelleten i 1,310,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/1 EDTA og 0,5% Triton-x-100 og homogeniseredes.

15 Skiftevis centrifugering (30 minutter ved 27.000 g, 4°C) og homogenisering af pelleten i 1 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/1 EDTA gennemførtes endnu tre gange.

"Refractile bodies "-præparaternes t-PA-indhold kvantificeredes ved SDS-PAGE, identificering af t-PA-båndene ved "Western blotting" og ved densiometrisk analyse. De "refractile bodies" udviste ved SDS-PAGE og "Western blotting" et kraftigt t-PA- bånd 20 med en molekylvægt på ca. 60 kDa. t-PA-andelen af det totale proteinindhold i "refractile bodies" udgør ca. 21%.

b) Solubilisering/reduktion af "refractile bodies" "Refractile bodies" inkuberedes ved en proteinkoncentration på 1 til 5 mg/ml i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 8,6), 5 mol/1 guanidinhydrochlorid, 0,15 til 0,4 mol/1 DTE og 1 mmol/1 DK 175091 B1 9 EDTA i 2 til 3 timer ved stuetemperatur. Herefter fracentrifugeredes uopløseligt materiale (cellevægfragmenter osv.), f.eks. 30 minutter ved 35.000 til 50.000 g, 4°C. Overstandens pH-værdi indstilledes med kone. HC1 til pH 3. Denaturerings- og reduktionsmidlet fraskiltes derpå ved dialyse mod 0,01 mol/1 HC1 ved 4°C.

5 c) Reoxidation/aktivering

Reoxidation/aktivering gennemførtes ved en 1:50 til 1:200 fortynding i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 mol/1 L-arginin, 2 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG. Efter 17 til 24 timers aktivering ved ca. 20°C bestemtes aktiviteten, og udbyttet ved sammenligning med aktiviteten af naturlig glycosyleret t-PA, 10 der stammer fra eukaryote celler.

Udbytte beregnet på det totale proteinindhold af "refractile bodies”: 2,5 ± 0,5% stimulerbarhed: 10 ± 5

Udbytte beregnet på t-PA-andelen af 15 "refractile bodies": ca. 12% d) Reoxidation/aktivering uden denaturerings-/reduktionsmidlets fraskillelse "Refractile bodies” inkuberedes ved en proteinkoncentration på 1,25 mg/ml i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 8,6), 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid, 0,2 mol/1 DTE og 1 mmol/1 EDTA i 2 timer ved stuetemperatur. Herefter påbegyndtes straks reoxidation ved en 1:100 20 fortynding i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mol/1 L-arginin, og de i tabellen anførte mængder af GSSG. Derudover fandtes i aktiveringsportionen en restkoncentration på 0,06 mol/1 guanidin/hydrochlorid og 2 mmol/1 DTE.

10 υιν i/ου»i di

Aktiveringsudbyttets afhængighed af GSSG-koncentrationen ved aktivering uden dena-turerings-/reduktionsmidIets fraskillelse.

GSSG Udbytte' Stimulerbarhed (mmol/1)__(Faktor)_ 5 0,2 0 1 0,13 4,0 5 1,49 7,4 6 1,28 5,4 7 1,04 5,8 10 9 0,98 5,2 10 1,77 10,0 15 0 20 0 ' = Udbytte af aktiv t-PA beregnet på det totale proteinindhold i "refractile bodies".

15 EKSEMPEL 2

Et RB ("refractile bodies")-præparat (ca. 5 mg) inkuberedes i 1 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 8,6), 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid og 0,15 - 0,2 mol/1 i DTE i 2 til 3 timer ved stuetemperatur. Uopløseligt materiale (cellevægfragmenter) fraskiltes herefter ved centrifugering (20 minutter ved 17.000 g). Denaturerings- og reduktionsmidlet fjernedes 20 ved gelfiltrering gennem Sephadex 25 (superfine) i 0,01 mol/1 HC1. Derved fortyndedes prøven ca. med faktor 5 til 10. Det reducerede materiale opbevaredes i 0,01 mol/1 HC1 ved -20°C.

DK 175091 B1 11 EKSEMPEL 3 I de efterfølgende tabeller vises indflydelsen af forskellige parametre ifølge opfindelsen på t-PA's aktivering og stimulerbarhed. Ved denne reduktionsundersøgelse blev det ifølge eksempel 2 solubiliserede, reducerede protein ikke yderligere foroprenset.

5 Det reducerede protein (i 0,01 mol/1 HC1) aktiveredes ved fortynding til fra 1:10 til 1:500 i "reoxidationspuffer". Aktiveringen bestemtes efter 22 til 48 timers inkubation ved stuetemperatur. Det reoxiderede proteins aktivitet baseredes på en "standard-reoxi-dation" (=100%) i: 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDT A 10 + 0,5 mol/1 L-arginin

+ 1 mg/ml BSA

+ 0,5 mmol/1 GSH (reduceret glutathion) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutathiondisulfid).

Stimulerbarheden beregnes ud fra ΔΕ+CNBrFSP/AE-CNBrFSP (sammenlign W.

15 Nieuwenhuizen et al., Biochimica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 til 533). Aktiviteten (i procent) og stimulerbarheden (faktor) bestemtes ifølge J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269, (1982).

De følgende resultater opnåedes: 1. Aktiveringsudbyttets afhængighed af L-arginin eller guanidin-hydrochloridtilsæt-20 ning.

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5)

+ 1 mmol/1 EDT A + 1 mg/ml BSA

w m · www 12

+ 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

a) L-arginin L-arginin Aktivitet Stimulerbarhed 5 (mol/1) (%) (faktor) 0 4 Ϊ3 0,25 98 7,5 0,5 100 21,9 0,75 27 16,3 10 1,0 23 3,5

Det skal bemærkes, at t-PA ved denne undersøgelse inhiberes af L-arginin. Nedgang i aktiveringsudbyttet ved højere L-argininkoncentrationer skal derfor korrigeres med hensyn til inhiberingen.

15 b) Guanidin-hydrochlorid (Gdn/HCl) (Gdn/HCl) Aktivitet (mol/1) (%) 0 11 0,25 22 20 0,5 53 0,75 58 1,0 12 DK 175091 B1 13 2. Aktiveringsudbyttets afhængighed af urinstof og urinstofderivaters tilsætning.

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH,

0,2 mmol/1 GSSG

a) Urinstof 5 Urinstof Aktivitet (mol/1) (%) 0 1 0,5 20 1 59 10 1,5 126 2 162 2.5 141 3 72 4 12 15 5 0 b) Methylurinstof

Methylurinstof Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 22 20 1 174 1.5 313 2 375 2.5 332 3 215 25 4 12 5 0 L^IX I f I U1 14 c) Hthylurinstof

Ethylurinstof Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 46 5 1 212 1.5 323 2 300 2.5 107 3 19 10 4 0 i 5 0 d) Dimethylurinstof

Dimethylurinstof Aktivitet Stimulerbarhed (mol/1) (%) (Faktor) 15 0,5 167 8,8 1 256 8,9 1.5 283 9,4 2 177 7,7 2.5 78 8,9 20 3 23 9,9 4 4 8,6 5 2 3,5 3. Aktiveringsudbyttets afhængighed af fedtsyreamiders tilsætning: DK 175091 B1 15

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Formamid

Formamid Aktivitet 5 (mol/1) (%) 0 42 0,5 59 1 175 1.5 245 10 2 325 2.5 423 3 444 4 416 5 341 15 b) Methylformamid

Methylformamid Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 100 1 135 20 1,5 304 2 389 2.5 466 3 452 4 425 25 5 121 DK 175091 B1 16 c) Acetamid

Acetamid Aktivitet (mol/I) (%) 0,5 72 5 1 134 1.5 207 2 261 2.5 204 3 237 10 4 198 5 141 d) Propionamid

Propionamid Aktivitet (mol/1) (%) 15 0,5 95 1 99 1.5 197 2 150 2.5 101 20 3 39 4 2 5 0 DK 175091 B1 17 e) Butyramid

Butyramid Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 55 5 1 52 1,5 17 2 0 4. Aktiveringsudbyttes afhængighed af pH-værdien

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl + 1 mmol/1 EDTA 10 + 0,5 mol/1 L-arginin

+ 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

pH Aktivitet Stimulerbarhed 15 (%) (Faktor) 7 1 8 22 3,0 9 89 13,6 10 105 20,3 20 11 95 21,3

1^1¾ I VVV I W I

5. Aktiveringsudbyttets afhængighed af GSH/GSSG-koncentrationen 18

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5,

+ 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-arginin 5 + 1 mg/ml BSA

a) + 1 mmol/1 GSH

(GSSG) Aktivitet Stimulerbarhed (mmol/1) (%) (Faktor) 0,1 239 14,9 10 0,2 273 15,3 0,5 193 13,3 1 198 12,5 5 17 2,1 10 0 15 20 0

b) + 0,2 mmol/l GSSG

DK 175091 B1 19 (GSH) Aktivitet Stimulerbarhed (mmol/l) (%) (Faktor) 0,05 15 2,2 5 0,1 40 3,8 0,2 112 6,8 0,5 142 7,4 1 273 6,8 5 260 7,9 10 10 143 6,3 / 20 55 5,1 6. Aktiveringsudbyttets afhængighed af protein-koncentrationen ved reoxidationen (fortynding 1:20 - 1:500)

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5)

15 +1 mmol/l EDT A

+ 0,5 mol/1 L-arginin + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/l GSH + 0,5 mmol/l GSSG

20 Fortynding Aktivitet Stimulerbarhed (%) (Faktor) 1:10 29 15,3 1:20 45 25,4 1:50 69 37,9 25 1:100 100 37,9 1:200 79 52,7 1:500___29__28,7 -__

Ul\ I «IV? I Dl 7. Aktiveringsudbyttets afhængighed af BSA-tilsætning 20

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5)

+ 1 mmol/1 EDT A + 0,5 mol/1 L-arginin 5 +0,5 mmol/1 GSH

+ 0,5 mmol/1 GSSG

BSA Aktivitet (mg/ml) (%) 0 47 10 0,5 83 1 100 3 102 5 52

Figurerne 1 og 2 viser aktiviteten med og uden CNBr-FSP ved standardundersøgelsen 15 efter 17 timers reoxidation ved stuetemperatur i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-arginin + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG. I figurerne 1 og 2 henviser kurven (A) til aktiviteten ved tilstedeværelse af CNBr-FSP, kurven (B) til aktiviteten uden CNBr-FSP.

EKSEMPEL 4 20 Aktivering af genteknologisk fremstillet Interferon-β.

"Refractile bodies" fremstilledes i overensstemmelse med de førnævnte metoder. Reduk-tionen/solubiliseringen af de "refractile bodies" gennemførtes som følger: Pelleten inkuberedes i 3 timer ved 25 °C i 10 ml 9,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,6, 6 mol/1 Gdn-HCl, DK 175091 B1 21 1 mmol/1 EDTA og 0,2 mol/1 DTE og efter 30 minutters centrifugering ved 4°C og 48.000 g indstilledes overstandens pH til ca. 3 med kone. HC1. Herefter gennemførtes en gelfiltrering over Sephadex G25 F i 0,01 mol/1 HC1.

Eluatets ledningsevne, proteinkoncentration og reaktiverbarhed undersøgtes.

5 Det reoxiderede proteins aktivitet baseres på en "standardaktivering" (=100%) i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG og 0,25 mol/1 L-arginin.

a) Aktiveringsudbyttes afhængighed af L-arginintilsætning

Eluatet fortyndedes 1:50 med 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 10 GSH, 9,5 mmol/1 GSSG og inkuberedes i 20 timer ved 0°C.

Aktiveringens L-arginin-afhængighed L-arginin (mol/1) Aktivitet (%) 0 8 0,25 8 15 0,5 15 0,75 15 b) Aktiveringsudbyttets afhængig af urinstoftilsætning

Aktiveringsopløsningen svarer til den fra punkt a); dog aktiveredes i 17 timer ved 0°C.

I « WWW I w I

Urinstof-afhængighed af aktiveringen 22

Urinstof (mol/I) Aktivitet (%) 0 13 0,5 100 5 1 200 1,5 100 c) Aktiveringsudbyttets afhængighed af formamidtilsætning

Aktiveringen som i a); prøverne undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C. Formamid-afhængighed af aktiveringen 10 Formamid (mol/I) Aktivitet 0 13 1 13 2 13 3 0 15 4 0 d) Aktiveringsudbyttets afhængighed af redoxpufferen

Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA og 0,25 mol/1 L-arginin, og prøverne undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

GSH/GSSG-afhængighed af aktiveringen DK 175091 B1 23 GSH (mmol/l) GSSG (mmol/l) Aktivitet (%) 1 0,5 6 5 0,5 13 10 0,5 25 5 20 0,5 25 5 0,1 13 5 0,5 13 5 1,0 13 5 5 6 10 e) Aktiveringsudbyttets afhængighed af BSA-tilsætningen

Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/l Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/l EDTA, 5 mmol/l GSH, 0,5 mmol/l GSSG og 0,25 mol/l L- arginin og undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

BSA-afhængighed af aktiveringen 15 BSA (mg/ml) Aktivitet (%) 0 13 1 13 2 25 5 13 DK 175091 B1 24

f) Aktiveringsudbyttets afhængighed af pH

Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/1 Tris/HCI, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/GSSG og 0,25 mol/1 L-arginin og undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

pH-afhængighed af aktiveringen 5 pH Aktivitet (%) 6.5 0 7.5 6 8.5 13 9.5 50 10 10,5 100

Claims

1. Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe disulfidbro-holdige eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler ved celleopluk- 5 ning, solubilisering under denaturerende og reducerende betingelser og reaktivering under oxiderende betingelser ved tilstedeværelse af GSH/GSSG, kendetegnet ved, at der ved reaktiveringstrinnet arbejdes med en pH-værdi på 8 til 12, en GSH-koncentration på 0,1 til 20 mtnol/1, en GSSG-koncentration på 0,01 til 3 mmol/1 og ved en ikke-denaturerende koncentration af denatureringsmidlet og ved, at der i reakti-10 veringstrinnet som denatureringsmiddel anvendes arginin og/eller mindst én forbindelse med den almene formel R2-CO-NR-R, (I), hvor R og R, betyder H eller alkyl med 1 til 4 C-atomer og R2 betyder H eller NHR, eller alkyl med 1 til 3 C-atomer, med det forbehold, at R og R, ikke samtidigt er H.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH-værdien i reakti-15 veringstrinnet andrager 9,5 til 11.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at GSH-koncentrationen andrager 0,2 til 10 mmol/1 og/eller GSSG-koncentrationen 0,05 til 1 mmol/1 i reaktiveringstrinnet.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at 20 man efter solubilisering og før reaktivering gennemfører et rensningstrin.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at reaktiveringen gennemføres uden forudgående fraskillelse af denaturerings-/reduktions-midlerne, hvorhos reaktionsopløsningen fortyndes efter denaturering/reduktion med reaktiveringspuffer, og at GSSG-koncentration ved den efterfølgende reaktivering over- 25 stiger den forblivende restkoncentration af DTE. " "" ^mmmtm DK 175091 B1 26

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at man gennemfører ekspressionen i E. coli eller P. putida.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at koncentrationen af arginin andrager 0,1 til 1,0 mol/1, navnlig 0,25 til 0,8 mol/l.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at koncentra tionen af forbindelser med den almene formel I andrager 0,5 til 4 mol/1, navnlig 1 til 3,5 mol/1.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der ved reaktiveringstrinnet arbejdes ved tilstedeværelse af et ikke-proteolytisk virksomt 10 protein, navnlig ved tilstedeværelse af okseserumalbumin.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører celleoplukningen ved hjælp af ultralyd, højttryksdispersion eller lysozym.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at man gennemfører 15 oplukningen i en fortyndet vandig pufferopløsning, navnlig i 0,1 mol/1 Tris, ved en neutral til svag sur pH-værdi.

12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man efter celleoplukningen fraskiller de uopløselige bestanddele.

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at 20 man gennemfører solubiliseringstrinnet ved alkalisk pH-værdi i nærværelse af et reduktionsmiddel fra mercaptogruppen og i nærværelse af et denatureringsmiddel. DK 175091 B1 27

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at man arbejder i nærværelse af forbindelser med den almene formel I som denatureringsmiddel.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at koncentration af forbindelser med den almene formel I andrager 8 mol/1.

16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13 til 15, k e n d e t e g n e t ved, at man arbejder ved tilstedeværelse af DTE, β-mercaptoethanol, cystein eller GSH.

17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører rensning og fraskillelse af reduktions-, oxidations- eller denatureringsmidler ved hjælp af sterisk udelukkelseschomatografi eller dialyse.

18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man efter reaktiveringstrinnet gennemfører et rensningstrin ved hjælp af dialyse.

19. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 18, kendetegnet ved, at man som genteknologisk fremstillet eukaryotisk protein anvender t-PA.

20. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 19, kendetegnet ved, at man 15 som genteknologisk fremstillet eukaryotisk protein anvender Interferon-β.