DK175109B1

DK175109B1 - Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfidbroer indeholdende eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler

Info

Publication number: DK175109B1
Application number: DK200001897A
Authority: DK
Inventors: Stephan Fischer; Ralf Mattes; Rudolph Rainer
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1985-10-23
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2004-06-07
Also published as: KR870700601A; FI933868A0; DK175091B1; PT83609A; SK752686A3; WO1987002673A2; CZ752686A3; DE3537708C2; YU47185B; HRP921075A2; IL80325A; DE3537708A1; EP0393725A1; ES2020498A4; IE62634B1; EP0219874A3; SI8611796A; FI872753A0; AU590029B2; JPH0728745B2

Description

DK 175109 B1 i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, disulfidbroer indeholdende eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler.

e

Ved ekspressionen af heterologe proteiner i prokaryote celler danner disse proteiner i 5 værtscellerne ofte inaktive, tungtopløselige aggregater (såkaldte "refractile bodies"), som desuden er forurenede med værtscellernes proteiner. Man antager, at dannelsen af sådanne "refractile bodies" er en følge af den ved ekspressionen opståede høje proteinkoncentration i cellen. Det vides, at dannelsen af store enzymmængder i cellen fører til enzymernes sammenklumpning til uopløselige, højmolekylære, for det meste inaktive 10 partikler. Før sådanne proteiner kan anvendes til f.eks. terapeutiske formål, skal disse derfor oprenses og overføres til deres aktive form.

Ifølge kendte fremgangsmåder kan en reaktivering af sådanne, som aggregater foreliggende proteiner gennemføres i flere trin (sammenlign f.eks. R. Jaenicke, FEBS Federation of European Biochemical Societies, bind 52 (1979) 187 til 198; R. Rudolph et al., 15 Biochemistry 18 (1979) 5572 til 5575); I det første trin opnås en solubilisering ved tilsætning af kraftigt virkende denatureringsmidler, eksempelsvis guanidin- hydrochlorid eller urinstof i høj koncentration eller ved til- sætning af stærkt sure agentier, eksempelvis glycin/phosphor- syre-blandinger. Som yderligere hjælpestoffer har reducerende SH-reagentier (f.eks. dithioerythritol, DTE) og ’ 20 EDTA vist sig som egnede, f.eks. ved renaturering af LDH. Såfremt proteinet er forure net med proteiner fra værtscellen følger som næste trin en oprensning ved i og for sig , kendte og gængse metoder, f.eks. gel- eller ionudbytterchromatografi. Derefter fortyndes kraftigt, for at nedsætte denatureringsmidlets koncentration. Ved anvendelse af guanidin-hydrochlorid fortyndes herved til koncentrationer under 0,5 mol/1. Ved enzy-25 mer med frie SH-grupper viste det sig at være fordelagtigt at tilsætte SH-gruppe- beskyttende agentier (sammenlign f.eks. R. Jaenicke, Journal Polymer Science, Part C 16 (1967) 2143 til 2160).

2 DK 175109 B1 I den europæiske patentansøgning EP-A-0114506 beskrives fremgangsmåder til isolering, oprensning og reaktivering af nogle heterologe ekspressionsprodukter fra bakteriekulturer; til reaktiveringen overføres opløsninger af "refractile bodies" i et kraftigt virkende denatureringsmiddel a) direkte til en opløsning i et svagere denatureringsmid-5 del, som herefter udsættes for oxiderende betingelser for at gendanne disulfidbroer; b) proteinet sulfoneres, overføres herefter til en opløsning i et svagere denatureringsmiddel, og S-sulfonatgrupperne omdannes ved behandling med et sulfhydrylreagens i dets reducerede og oxiderede form, f.eks. med GSH/GSSG, til -S-S-grupper; eller c) opløsningen behandles i et svagt denatureringsmiddel direkte med sulfhydryl-reagenset, f.eks. med 10 GSH/GSSG. Et typisk eksempel, hvorved de oven for anførte problemer forekommer, er t-PA.

Proteinmatrixens hovedkomponent i koaguleret blod er polymert fibrin. Denne protein-matrix opløses ved hjælp af plasmin, som dannes ud fra plasminogen via aktivering gennem de såkaldte plasminogen-aktivatorer, f.eks. gennem t-PA (vævs-plasminogen-15 aktivator, tissue-type plasminogenaktivator). Den enzymatiske aktivitet af naturligt eller ud fra højkaryotiske celler genteknologisk indvundet t-PA (katalytisk aktivering af plasminogen til plasmin) er ved fraværelse af fibrin eller fibrinspaltningsprodukter (FSP) særdeles ringe, men kan ved disse stimulatorers tilstedeværelse forøges væsentligt (mere end faktoren 10). Denne såkaldte aktivitetstimulerbarhed er en af- gørende fordel af t-PA 20 i forhold til andre kendte plasminogenaktivatorer, såsom urokinase eller streptokinase (sammenlign f.eks. M. Hoylaerts et al., J. Biol. Chem. 257 (1982) 2912 til 2919; Nieuwenhiuzenetal., Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983)531 til 533). Stimuler-barhedsfaktoren med BrCN-spaltningsprodukter angives derfor i litteraturen forskelligt, og der nævnes tal op til 35. 1

Et t-PA-agtigt, ikke-glycosyleret produkt dannes også i genetisk manipuleret prokaryoti-ske celler (efter indslusning af cDNA); et sådant produkt virker imidlertid ikke stimulerende på aktiviteten af en t-PA fra eukaryotiske celler. Dette kan eventuelt skyldes, at reaktionsbetingelserne i den prokaryotiske celle på en sådan måde er forskellige fra det DK 175109 B1 3 i den eukaryotiske celle, hvorfra genet stammer, at der allerede fra begyndelse af ikke dannes et aktivt produkt, som eksempelvis kunne skyldes, at de talrige SS-broer, som det naturlige aktive molekyle indeholder, på forkert måde er knyttet sammen eller slet ikke dannes. Ved den terapeutiske anvendelse af t-PA er imidlertid ikke kun alene den 5 enzymatiske aktivitet nødvendig, men desuden også dens stimulerbarhed. Til den kendsgerning, at den prokaryotiske celle formodentlig ikke skaber de rigtige betingelser for at tilvejebringe aktiviteten af eukaryotiske proteiner på en rigtig måde, henvises i sammenhæng med andre stoffer i EMBO Journal 4, nr. 3 (1985) 775 til 780.

Ifølge den europæiske patentansøgning EP-A-0093639 bliver de fra E. coli opnåede 10 cellepellets til reaktiveringen af t-PA opslæmt i 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid, med ultralyd behandlet, inkuberet og herefter dialyseret i 4 timer mod en opløsning af Tris-HCl (pH = 8,0), natriumchlorid, EDTA og Tween 80. Efter dialyse centrifugeres, hvorhos plasminogenaktivatoraktiviteten findes i overstanden. Den på denne måde renaturerede t-PA er ganske vist proteolytisk aktiv, men udviser imidlertid ingen målelig 15 stimulerbarhed gennem BrCN-spaltningsprodukter (BrCN-FSP) af fibrin, ifølge den i J. H. Verheijen, Thromb. Haemostas., 48, (3), 260-269(1982)beskrevne fremgangsmåde.

Til reaktiveringen af denaturerede proteiner findes der ifølge kendt teknik ingen generelt anvendelig fremgangsmåde; dette gælder især t-PA, idet det naturlige protein besidder 20 en særdeles kompleks struktur; det indeholder en fri diolgruppe og 17 SS-broer, som teoretisk kan sammenknyttes på 2,2 x 1020 forskellige måder, og kun en struktur svarer til den naturlige tilstand. Fremgangsmåder ifølge kendt teknik til reaktivering af t-PA fører godt nok til en proteolytisk aktiv t-PA, men udviser ingen målelig stimulerbarhed.

En aktiveringsfremgangsmåde, som fører til stimulerbart t-PA, kendes ikke. Den forelig-25 gende opfindelses formål er derfor at tilvejebringe en fremgangsmåde til fuldstændig aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfide broer indeholdende eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler.

DK 175109 B1 4

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfide broer indeholdende eukaryotiske proteiner efter ekspression i prokaryotiske celler, som opnås i patentkrav 1 ved hjælp af celleoplukning, solubilise-ring under denaturerende og reducerende betingelser og aktivering (renaturering) under 5 oxiderende betingelser ved tilstedeværelse af GSH/GSSG. Det ejendommelige ved fremgangsmåden er, at man i aktiveringstrinnet arbejder ved en pH-værdi på 9 til 12, en GSH-koncentration på 0,1 til 20 mmol/1, en GSSG-koncentration på 0,01 til 3 mmol per liter og med en ikke-denaturerende koncentration af denatureringsmidlet.

Foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden anføres i underkravene.

10 Som denatureringsmiddel kan i reglen anvendes et til aktiveringen under oxiderende betingelser sædvanligvis anvendt denatureringsmiddel eller arginin; af de kendte denatureringsmidler foretrækkes guanidin-hydrochlorid eller urinstof eller derivater deraf.

Desuden har arginin vist sig som egnet. Endvidere kan blandinger af disse denatureringsmidler anvendes. Fortrinsvis udføres dette aktiveringstrin også ved tilstedeværelse af et 15 fremmed protein; som et sådant egner sig i reglen et hvilket som helst fremmedprotein, så længe dette ikke virker proteolytisk; fortrinsvis anvendes okseserumalbumin (BSA), f.eks. i en mængde på 1 til 3 mg/ml. BSA-tilsætningen tilvejebringer et let forhøjet udbytte og stabilisering af proteinet (dette skyldes sandsynligvis beskyttelse mod overfladedenaturering og/eller proteolytisk nedbrydning). 1 2 3 4 5 6

De øvrige fremgangsmådebetingelser kan svare til de for reaktiveringstrin fra teknikkens 2 stade kendte og sædvanlige betingelser. Aktiveringsvarighed (inkubation) andrager 3 fortrinsvis 20 til 48 timer ved stuetemperatur. Halveringstiden for aktiveringen ligger 4 ved tilstedeværelse af 0,5 mmol/1 reduceret (GSH) og oxideret (GSSG) glutathion ved 5 ca. 10 til 15 timer ved 20°C. Ved en længere inkubation (48 timer) under reoxidations- 6 betingelser aftager i reglen stimulerbarheden gennem CNBr-FSP. Aktiveringstrinnet gennemføres fortrinsvis ved tilstedeværelse af EDTA, hvorhos den mest egnede koncentration er ca. 1 mmol/1 EDTA.

DK 175109 B1 5

De af aktiveringstrinnet (reoxidation/aktivering) forudgående og efterfølgende fremgangsmådetrin, såsom celleoplukning, solubilisering (solubilisering/reduktion) og eventuelt et eller flere af de af aktiveringstrinnet forudgående og/eller efter- følgende oprensningsoperationer, kan ifølge kendt teknik, f.eks. EP-A-0114506 og EP-A-0093619, 5 gennemføres ved for sådanne fremgangsmåder kendte og gængse metoder; med henblik på et med hensyn til udbytte og aktivering optimalt resultat kan det imidlertid være nyttigt, at gennemføre enkelte eller alle fremgangstrin i overensstemmelse med en eller flere af de heri angivne udførelsesformer. Navnlig er det muligt at gennemføre trinnene til aktivering ifølge opfindelsen ved den efter oplukningen opnåede blanding uden forud-10 gående denaturering og/eller reduktion, dog med lavere udbytte. Ekspressionen gennemføres i prokaryote celler, fortrinsvis i P. putida, og især i E. coli. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er imidlertid lige så egnet, når ekspressionen foregår i andre prokaryote celler (f.eks. Bacilli).

Celleoplukningen kan gennemføres ved dertil gængse metoder, f.eks. ved hjælp af 15 ultralyd, højtryksdispersion eller lysozym; oplukningen sker fortrinsvis i en til indstilling afen neutral til svag sur pH-værdi egnet pufferopløsning som sus- pensionsmedium, som f.eks. i 0,1 mol/l Tris-HCl. Efter celle- oplukningen fraskilles de uopløselige bestanddele ("refractile bodies") på en hvilken som helst måde, fortrinsvis ved afcentr i fugering ved højere g-tal og længere centrifugeringstider eller ved filtrering. Efter vask med 20 agentier, som ikke indvirker på t-PA, men som så vidt muligt opløser fremmede celleproteiner, f.eks. vand, phosphat-pufferopløsning, underkastes bundfaldet (pellet) eventuelt under tilsætning af milde detergenter, såsom Triton, solubiliseringen (solubilisering/reduktion). Solubiliseringen sker fortrinsvis i alkalisk pH-område, navnlig ved pH = 8,6 ± 0,4 og ved tilstedeværelse af et reduktionsmiddel af mercaptangruppen og I

25 et denatureringsmiddel.

Som denatureringsmiddel kan anvendes de for solubiliseringen fra teknikkens stade, f.eks. fra den europæiske patentansøgning EP-A-0114506, kendte og sædvanlige denatureringsmidler anvendes, navnlig guanidin-hydrochlorid eller urinstof. Koncentrationen DK 175109 B1 6 af guanidin-hydrochlorid andrager hensigtsmæssigt ca. 6 mol/l og for urinstof ca. 8 mol/I. Ligeledes kan forbindelser med den almene formel I anvendes.

Som reduktionsmiddel af mercaptangruppen kan f.eks. anvendes reduceret glutathion (GSH) eller 2-mercaptoethanol, f.eks. i en koncentration på ca. 50 til 400 mmol per liter 5 og/eller navnlig DTE (dithioerythritol) eller DTT (dithiothreitol), f.eks. i en koncentration på ca. 80 til 400 mmol/l. Solubiliseringen sker passende ved stuetemperatur i løbet af en eller flere timer (inkubation), fortrinsvis i løbet af to timer. Til forhindring af reduktionsmidlets oxidation gennem luftens oxygen kan det desuden være nyttigt at tilsætte EDTA. Ved siden af solubilisering/reduktion har solubiliseringstrinnet også en 10 rensningseffekt, idet en stor del af det med t-PA immunologisk ikke-krydsreagerende materiale (fremmedprotein) ikke går i opløsning.

Efter solubiliseringen og før aktiveringstrinnet kan de på i og for sig kendte og gængse rensningstrin skubbes ind; som rensningsmetoder kommer f.eks. sterisk udelukkelses-chromatografi (SEC) (ved tilstedeværelse af guanidin-hydrochlorid eller urinstof) eller 15 ionbytter (f.eks. ved tilstedeværelse af urinstof eller derivater deraf) i betragtning; en uspecifik reoxidation kan forhindres ved tilsætning af et reduktionsmiddel (f.eks. 2-mercaptoethanol) eller ved pH-værdi 4,5 (sammenlign f.eks. R. Rudolph, Biochem.

Soc. Transactions 13 (1985) 308 til 311). Anvendes i det forudgående solubiliseringstrin DTE, skal dette fraskilles i et rensningstrin. Rensningen kan f.eks. udføres ved SEC 20 over Sephadex G 100 ved tilstedeværelse af guanidin-hydrochlorid og et reduktionsmiddel, f.eks. GSH ved en pH på 1 til 4 (i dette trin kan en stor mængde fremmed- protein fraskilles); eller via fraskillelse af denaturerings/ reduktionsmidlet ved afsaltning over Sephadex G 25 i 0,01 mol/l HC1 eller 0,1 mol/l eddikesyre. Denaturerings-/reduk-tionsmidlets fraskillelse kan alternativt opnås ved dialyse mod de samme opløsninger. 1

Et yderligere rensningstrin kan følge reaktiveringstrinnet; en sådan rensning sker i reglen ved hjælp af dialyse, eller også ved en efterfølgende isolering af den aktiverede tPA, eksempelvis ved hjælp af affinitetschromatografi, f.eks. over Lyssepharose. En anden DK 175109 B1 7 udførelsesform for opfindelsen beror på dannelsen af blandede disulfider ud fra genteknologisk fremstillede, heterologe, disulfidbroer indeholdende eukaryotiske proteiner og glutathion (i det følgende forkortet t-PASSG). Dette kan lette både adskillelsen af frem-medproteiner i denatureret tilstand og den videre rensning af de naturlige proteiner. En 5 rensning efter thiolgruppernes modificering har den fordel, at proteinet er beskyttet mod luftoxidation og hermed stabil et større pH-område, og at en forandring af nettoladnin-gen letter rensningen. Navnlig kan en adskillelse fra det ikke-modificerede protein fordelagtigt gennemføres ved ionbytterbehandling.

Til de blandede disulfiders dannelse blev det dialyserede, reducerede, fra denaturerings- 10 og reduktionsmidlet rensede protein inkuberet med fortyndede, f.eks. 0,2 mol/l GSSG-opløsninger, som indeholder et denatureringsmiddel. Aktiveringen skete efter fraskillelsen af denaturerings- og oxidationsmidlet ved en pH-værdi på 7 til 10,5, en GSH-koncentration på 0,5 til 5 mmol/1, og ved en ikke-denaturerende koncentration af denatureringsmidlet.

15 I alle andre reaktionstrin svarer proteinets aktivering via dannelsen af de blandede disulfider med GSSG til udførelsesformerne for aktiveringen ifølge den førnævnte del af opfindelsen. Ved denne udførelsesform ligger pH-optimumet ved 8,5, udbyttet er ca. dobbelt så højt, og det aktiverede protein er stabilt over længere tid i natureringspufferen.

20 Ifølge opfindelsen er det muligt at aktivere t-PA, der stammer fra prokaryote celler, således at man ikke kun opnår en aktivering af den normale biologiske aktivitet, men derudover også en stimulerbarhed, som defineret ovenfor, der i stort omfang overgår stimulerbarheden af den naturlige t-PA, og som kan være større end faktor 10, endog faktor 50. 1

Et yderligere eukaryotisk protein, som kan aktiveres ifølge opfindelsen efter ekspression i prokaryote celler, er B-interferon.

DK 175109 B1 8

Opfindelsen belyses ved hjælp af de efterfølgende eksempler, uden dog at være begrænset dertil. Nåpr der ikke er anført andet, henviser procentangivelser til vægt% og temperaturangivelser til aC.

EKSEMPEL 1 5 a) Fremstilling af "refractile bodies" 100 g E. coli fugtig cellemasse, optaget i 1,5 1, 0,1 mol/I Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/l EDTA homogeniseredes (Ultra- Turrax, 10 sek.), og der tilsattes 0,25 mg/ml lysozym. Efter 30 minuttes inkubation ved stuetemperatur homogeniseredes påny og nedkøledes til 3°C. Celleoplukningen opnåedes ved hjælp af højtryksdispersion (550 10 kg/cm2). Herefter efterspuledes med 300 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/l EDTA. Efter centrifugering (2 timer ved 27.000 g, 4CC) optoges pelleten i 1,3 I 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/l EDTA og 2,5 % Triton-x-100 og homogeniseredes.

Efter fornyet centrifugering (30 minutter ved 27.000 g, 4°C) optoges pelleten i 1,3 10,1 mol/I Tris/HCl (pH 6,5), 20 mmol/l EDTA og 0,5 % Triton-x-100 og homogeniseredes.

15 Skiftevis centrifugering (30 minutter ved 27.000 g, 4°C) og homogenisering af pelleten i 1 1 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 6,5) og 20 mmol/l EDTA gennemførtes endnu tre gange.

"Refractile bodies"-præparaternes t-PA-indhold kvantificeredes ved SDS-PAGE, identificering af t-PA-båndene ved "Western blotting" og ved densiometrisk analyse. De "refractile bodies" udviste ved SDS-PAGE og "Western blotting" et kraftigt t-PA-bånd med 20 en molekylvægt på ca. 60 kDa. t-PA-andelen af det totale proteinindhold i "refractile bodies" udgør ca. 21 %.

b) Solubilisering/reduktion af "refractile bodies" "Refractile bodies" inkuberedes ved en proteinkoncentration på 1 til 5 mg/ml i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 8,6), 5 mol/1 guanidin- hydrochlorid, 0,15 til 0,4 mol/1 DTE og 1 mmol/l DK 175109 B1 9 EDTA i 2 til 3 timer ved stuetemperatur. Herefter fracentrifugeredes uopløseligt materiale (cellevægfragmenter osv.), f.eks. 30 minutter ved 35.000 til 50.000 g, 4°C. Overstandens pH-værdi indstilledes med kone. HC1 til pH 3. Denaturerings- og reduktionsmidlet fraskiltes derpå ved dialyse mod 0,01 mol/1 HC1 ved 4CC.

5 c) Reoxidation/aktivering

Reoxidation/aktivering gennemførtes ved en 1:50 til 1:200 fortynding i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 mol/1 L-arginin, 2 mmol/l GSH, 0,2 mmol/1 GSSG. Efter 17 til 24 timers aktivering ved ca. 20°C bestemtes aktiviteten, og udbyttet ved sammenligning med aktiviteten af naturlig glycosyleret t-PA, 10 der stammer fra eukaryote celler.

Udbytte beregnet på det totale proteinindhold af "refractile bodies": 2,5 ± 0,5% stimulerbarhed: 10 ±5

Udbytte beregnet på t-PA-andelen af 15 "refractile bodies": ca. 12% d) Reoxidation/aktivering uden denaturerings-/reduktionsmidlets fraskillelse "Refractile bodies" inkuberedes ved en proteinkoncentration på 1,25 mg/ml i 0,1 mol/1 Tris/HCl (9H 8,6), 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid, 0,2 mol/1 DTE og 1 mmol/1 EDTA i 2 timer ved stuetemperatur. Herefter påbegyndtes straks reoxidation ved en 1:100 20 fortynding i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mol/1 L-arginin, og de i tabellen an- førte mængder af GSSG. Derudover fandtes i aktiveringsportionen en restkoncentration på 0,06 mol/1 guanidin/hydrochlorid og 2 mmol/1 DTE.

Aktiveringsudbyttets afhængighed af GSSG-koncentrationen ved aktivering uden dena-turerings-/reduktionsmidlets fraskillelse.

DK 175109 B1 10 GSSG Udbytte' Stimulerbarhed (mmol/1)__(Faktor) 0,2 0 1 0,13 4,0 5 5 1,49 7,4 6 1,28 5,4 7 1,04 5,8 9 0,98 5,2 10 1,77 10,0 10 15 0 20 0 ’ = Udbytte af aktiv t-PA beregnet på det totale proteinindhold i "refractile bodies”.

EKSEMPEL 2 15 Et RB ("refractile bodies")-præparat (ca. 5 mg) inkuberedes i 1 ml 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 8,6), 6 mol/1 guanidin-hydrochlorid og 0,15 - 0,2 mol/1 i DTE i 2 til 3 timer ved stuetemperatur. Uopløseligt materiale (cellevægfragmenter) fraskiltes herefter ved centrifugering (20 minutter ved 17.000 g). Dena- turerings- og reduktionsmidlet fjernedes ved gelfiltrering gennem Sephadex 25 (superfine) i 0,01 mol/1 HC1. Derved for-20 tyndedes prøven ca. med faktor 5 til 10. Det reducerede materiale opbevaredes i 0,01 mol/1 HC1 ved -20°C.

EKSEMPEL 3 I de efterfølgende tabeller vises indflydelsen af forskellige parametre ifølge opfindelsen på t-PA's aktivering og stimulerbarhed. Ved denne reduktionsundersøgelse blev det 25 ifølge eksempel 2 solubiliserede, reducerede protein ikke yderligere foroprenset.

DK 175109 B1 11

Det reducerede protein (i 0,01 mol/1 HC1) aktiveredes ved fortynding til ffa 1:10 til 1:500 i "reoxidationspuffer". Aktive- ringen bestemtes efter 22 til 48 timers inkubation ved stuetemperatur. Det reoxiderede proteins aktivitet baseredes på en "stan-dard-reoxidation" (=100%) i:

5 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDTA

+ 0,5 mol/I L-arginin + 1 mg/ml BSA

+ 0,5 mmol/1 GSH (reduceret glutathion) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutathiondisulfid).

10 Stimulerbarheden beregnes ud fra AE+CNBrFSP/AE-CNBrFSP (sam- menlign W. Nieuwenhuizen et al., Biochimica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 til 533). Aktiviteten (i procent) og stimulerbarheden (faktor) bestemtes ifølge J. H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269, (1982).

De følgende resultater opnåedes: 15 1. Aktiveringsudbyttets afhængighed af L-arginin eller guanidin-hydrochloridtilsætning.

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5)

+ 1 mmol/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH 20 + 0,5 mmol/1 GSSG

DK 175109 B1 12 a) L-arginin L-arginin Aktivitet Stimulerbarhed (mol/l) (%) (Faktor) 5 _ 0 4 2,5 0,25 98 7,5 0,5 100 21,9 0,75 27 16,3 10 1,0 23 3,5

Det skal bemærkes, at t-PA ved denne undersøgelse inhiberes af L-arginin. Nedgang i aktiveringsudbyttet ved højere L-argininkoncentrationer skal derfor korrigeres med 15 hensyn til inhiberingen.

b) Guanidin-hydrochlorid (Gdn/HCl) (Gdn/HCl) Aktivitet (mol/I) (%) 20 _ 0 11 0,25 22 0,5 53 0,75 58 25 1,0 12 DK 175109 B1 13 2. Aktiveringsudbyttets afhængighed af urinstof og urinstofderivaters tilsætning.

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG

a) Urinstof 5 _

Urinstof Aktivitet (mol/1) (%) 0 1 10 0,5 20 1 59 1.5 126 2 162 2.5 141 15 3 72 4 12 5 0 DK 175109 B1 14 b) Methylurinstof

Methylurinstof Aktivitet (mol/1) (%) 5 ___ 0,5 22 1 174 1.5 313 2 375 10 2,5 332 3 215 4 12 5 0 15 c) Ethylurinstof

Ethylurinstof Aktivitet (mol/1) (%) 1 2 3 4 5 6 0,5 46 2 1 212 3 1.5 323 4 2 300 5 2.5 107 6 3 19 4 0 5 0 DK 175109 B1 15 d) Dimethylurinstof

Dimethylurinstof Aktivitet Stimulerbarhed (mol/I) (%) (Faktor) 5 _ 0,5 167 8,8 1 256 8,9 1,5 283 9,4 2 177 7,7 10 2,5 78 8,9 3 23 9,9 4 4 8,6 5 2 3,5 1 i 3. Aktiveringsudbyttets afhængighed af fedtsyreamiders tilsætning:

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris (pH 10,5), 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, 0,2 mmol/1 GSSG.

DK 175109 B1 16 a) Formamid

Formamid Aktivitet (mol/1) (%) 5 0 42 0,5 59 1 175 1.5 245 2 325 10 2,5 423 3 444 4 416 5 341 15 b) Methylformamid

Methylformamid Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 100 20 1 135 1.5 304 2 389 2.5 466 3 452 25 4 425 5 121 DK 175109 B1 17 c) Acetamid

Acetamid Aktivitet (mol/I) (%) 5 0,5 72 1 134 1.5 207 2 261 2.5 204 10 3 237 4 198 5 141 d) Propionamid 15 Propionamid Aktivitet (mol/1) (%) 0,5 95 1 99 20 1,5 197 2 150 2.5 101 3 39 4 2 25 5 0 DK 175109 B1 18 e) Butyramid

Butyramid Aktivitet (mol/1) (%) 5 0,5 55 1 52 1,5 17 2 0 10 4. Aktiveringsudbyttes afhængighed af pH-værdien

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 L-arginin + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH 15 + 0,5 mmol/1 GSSG

pH Aktivitet Stimulerbarhed (%) (Faktor) 1 2 3 4 5 6 7 1 - 2 8 22 3,0 3 9 89 13,6 4 10 105 20,3 5 11 95 21,3 6 _ DK 175109 B1 19 5. Aktiveringsudbyttets afhængighed af GSH/GSSG-koncentratio-nen

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5, + 1 mmol/1 EDTA 5 +0,5 mol/1 L-arginin

+ 1 mg/ml BSA

a) + 1 mmol/1 GSH

(GSSG) Aktivitet Stimulerbarhed 10 (mmol/I) (%) (Faktor) 0,1 239 14,9 0,2 273 15,3 0,5 193 13,3 15 1 198 12,5 5 17 2,1 10 0 20 0 DK 175109 B1 20

b) + 0,2 mmol/l GSSG

(GSH) Aktivitet Stimulerbarhed (mmol/l) (%) (Faktor) 5___ 0,05 15 2,2 0,1 40 3,8 0,2 112 6,8 0,5 142 7,4 10 1 273 6,8 5 260 7,9 10 143 6,3 20 55 5,1 15 6. Aktiveringsudbyttets afhængighed af protein-koncentrationen ved reoxidationen (fortynding 1:20 - 1:500)

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5)

+ 1 mmol/l EDTA + 0,5 mol/1 L-arginin 20 + 1 mg/ml BSA

+ 0,5 mmol/l GSH + 0,5 mmol/I GSSG

DK 175109 B1 21

Fortynding Aktivitet Stimulerbarhed (%) (Faktor) 5 1:10 29 15,3 1:20 45 25,4 1:50 69 37,9 1:100 100 37,9 1:200 79 52,7 10 1:500 29 28,7 7. Aktiveringsudbyttets afhængighed af BSA-tilsætning

Reoxidation i 0,1 mol/1 Tris/HCl (pH 10,5) + 1 mmol/1 EDTA 15 + 0,5 mol/1 L-arginin

+ 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

BSA Aktivitet 20 (mg/ml) (%) 0 47 0,5 83 1 100 25 3 102 5 52 DK 175109 B1 22

Figurerne 1 og 2 viser aktiviteten med og uden CNBr-FSP ved standardundersøgelsen efter 17 timers reoxidation ved stuetemperatur i 0,1 mol/l Tris/HCl (pH = 10,5) + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/I L-arginin + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG. I figurerne 1 og 2 henviser kurven (A) til aktiviteten ved tilstedeværelse 5 af CNBr-FSP, kurven (B) til aktiviteten uden CNBr-FSP.

EKSEMPEL 4 t-PA-aktivering via de blandede disulfider af t-PA og gluta- thion.De anvendte "refracti-le bodies" opnåedes ifølge et af de førnævnte eksempler. Reduktionen af de "refractile bodies" gennemførtes ved 2 timers inkubation ved stuetemperatur i 0,1 mol/l Tris/HCl, 10 pH 8,6, 1 mmol/1 EDTA, 6 mol/l Gdn-HCl, 0,2 mol/l DTE ved en proteinkoncentration på ca. 1 mg/ml.

Det mod 0,01 mol/l HC1 dialyserede, reducerede protein fortyn- dedes i forholdet 1:1 med 0,1 mol/l Tris, pH 9,3, 9 mol/l urinstof og 0,2 mol/l GSSG og inkuberedes i 5 timer ved stuetemperatur. 1 2 3 4 5 6

Efter syrning med kone. HC1 til pH 3 fulgte dialyse mod 0,01 mol/l HC1 ved 4SC. Efter 2 dialysen androg den totale proteinkoncentration 0,33 mg/ml. Ved hjælp af den på denne 3 måde fremstillede t-PASSG bestemtes de optimale reaktiveringsbetingel- ser.

4

a) pH-optimum ved aktivering af t-PASSG

5

Her, som i de følgende optimeringsundersøgelser, anvendtes (1) ikke GSSG, og (2) 6 aktiveringen bestemtes efter 17 timers inkubation ved stuetemperatur. Aktiveringen gennemførtes ved en 1:100 fortynding i 0,1 mol/l Tris, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/l L-arginin, 1 mg/ml BSA og 2 mmol/1 GSH ved forskellige pH-værdi- er.

DK 175109 B1 23 pH Udbytte (%) Stimulerbarhed 6 0,04 3,3 6.5 0,37 9,5 5 7 1,35 11,4 7.5 5,66 7,1 8 7,32 8,2 8.5 8,65 7,0 9 8,59 8,7 10 9,5 8,32 11,7 10 6,15 12,5 10.5 3,07 11,2

Udbyttet bestemtes i % aktiv t-PA baseret på anvendt protein- mængde.

15 b) resultaternes reproducerhed ved aktiveringen af t-PASSG

Ved identiske aktiveringsbetingelser observeredes ved forskellige målinger divergerende udbytter, som blandt andet skyldes standard-t-PA's svingninger. For at tydeliggøre denne fejlbredde er alle aktiveringsdata sammenfattet efter fortynding til 1:100 eller 1:200 i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/1 L-arginin, 1 mg/ml 20 BSA og 2 mmol/1 GSH.

DK 175109 B1 24

Forsøg Udbytte (%) Stimulerbarhed 1 8,65 7,0 2 4,47 9,3 5 3 4,49 9,7 4 8,50 6,5 5 3,45 17,2 6 4,32 8,3 7 3,29 14,0 10 8 3,54 13,4 9 5,07 16,4

Middelværdi 5,1 ± 1,9 11,3 ± 3,8 15 c) Det aktiverede proteins stabilitet

Aktiveringen gennemføres i det nævnte eksempel ved en 1:200 fortynding i 0,1 mol/1 Tris/HCl, 1 mmol/1 EDTA, 0,5 mol/1 L- arginin, 1 mg/ml BSA og 2 mmol/1 GSH.

Tid pH 9,5 (h) Udbytte Stim.

20 (%) 1 0 - 6 0,89 15,5 23 2,43 23,1 25 47 2,83 23,6 71 2,62 21,5 DK 175109 B1 25 215 2,21 22,6 239 2,28 14,3 EKSEMPEL 5 5 Aktivering af genteknologisk fremstillet Interferon-fi.

"Refractile bodies" fremstilledes i overensstemmelse med de førnævnte metoder. Reduk-tionen/solubiliseringen af de "refractile bodies” gennemførtes som følger: Pelleten inkuberedes i 3 timer ved 25=C i 10 ml 9,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,6, 6 mol/1 Gdn-HCl, 1 mmol/1 EDTA og 0,2 mol/1 DTE og efter 30 minutters centrifugering ved 4°C og 10 48.000 g indstilledes overstandens pH til ca. 3 med kone. HC1. Herefter gennemførtes en gelfiltrering over Sephadex G25 F i 0,01 mol/1 HC1.

Eluatets ledningsevne, proteinkoncentration og reaktiverbarhed undersøgtes.

Det reoxiderede proteins aktivitet baseres på en "standardak- tivering" (=100%) i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG og 0,25 15 mol/1 L-arginin.

a) Aktiveringsudbyttes afhængighed af L-arginintilsætning

Eluatet fortyndedes 1:50 med 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/I EDTA, 5 mmol/1 GSH, 9,5 mmol/1 GSSG og inkuberedes i 20 timer ved 0°C.

Aktiveringens L-arginin-afhængighed DK 175109 B1 26 L-arginin (mol/l) Aktivitet (7c) O 8 0,25 8 5 0,5 15 0,75 15 b) Aktiveringsudbyttets afhængig af urinstoftilsætning

Aktiveringsopløsningen svarer til den fra punkt a); dog aktiveredes i 17 timer ved 0°C.

10 Urinstof-afhængighed af aktiveringen Urinstof (mol/l) Aktivitet (%) 0 13 0,5 100 15 1 200 1,5 100 c) Aktiveringsudbyttets afhængighed af formamidtilsætning

Aktiveringen som i a); prøverne undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

20 Formamid-afhængighed af aktiveringen DK 175109 B1 27

Formamid (mol/I) Aktivitet 0 13 1 13 5 2 13 3 0 4 0 d) Aktiveringsudbyttets afhængighed af redoxpufferen 10 Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA og 0,25 mol/1 L-arginin, og prøverne undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

GSH/GSSG-afhængighed af aktiveringen GSH (mmol/1) GSSG (mmol/I) Aktivitet (%) 15 1 0,5 6 5 0,5 13 10 0,5 25 20 0,5 25 1 5 0,1 13 5 0,5 13 5 1,0 13 5 5 6 DK 175109 B1 28 e) Aktiveringsudbyttets afhængighed af BSA-tilsætningen

Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/1 Tris/HCl, pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG og 0,25 mol/1 L- arginin og undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

5 BSA-afhængighed af aktiveringen BSA (mg/ml) Aktivitet (%) 0 13 1 13 10 2 25 5 13

f) Aktiveringsudbyttets afhængighed af pH

Eluatet fortyndedes 1:50 i 0,1 mol/1 Tris/HCl, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/l GSH, 0,5 15 mmol/GSSG og 0,25 mol/1 L-arginin og undersøgtes efter 17 timers aktivering ved 0°C.

pH-afhængighed af aktiveringen pH Aktivet (%) 6.5 0 20 7,5 6 8.5 13 9.5 50 10.5 100

Claims

1. Fremgangsmåde til aktivering af heterologe, disulfidbro-holdigeeukaryotiske proteiner, fremstillet genteknologisk ved ekspression i prokaryotiske celler ved 5 a) oplukning af de prokaryotiske celler, b) opløsning af de eukaryotiske proteiner under denaturerende og reducerende betingelser, c) fraskillelse af de reducerende/denaturerende midler, d) reaktivering under oxiderende betingelser ved 10 e) omdannelse af de solubiliserede proteiners thiol-grupper til de blandede disulfider af protein og glutation ved tilsætning af GSSG under denaturerende betingelser, f) dannelse af aktivt protein ud fra de blandede disulfider ved en GSH-koncentration på 0,5 til 5 mmol/1, en pH-værdi på 7 til 10,5 og i nærværelse af en ikke-dena-turerende koncentration af et denatueringsmiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man gennemfører eks pressionen i E. coli eller P. putida.

3. Fremgangmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man i reaktiveringstrinnet som denatureringsmiddel anvender arginin, guanidin-hydrochlorid og/eller mindst en forbindelse med den almene formel R2-CO-NRRj (I), hvor R og R, er H eller alkyl 20 med 1 til 4 C-atomer, og R, er H eller NHR, eller alkyl med 1 til 3 C-atomer. DK 175109 B1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koncentrationen af arginin og/eller guanidin-hydrochlorid andrager 0,1 til 1,0 mol/1, navnlig 0,25 til 0,8 mol/1.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koncentrationen af forbin-5 delsen med den almene formel I andrager 0,5 til 4 mol/1, navnlig 1 til 3,5 mol/1.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at der ved reaktiveringstrinnet arbejdes ved tilstedeværelse af et ikke-proteolytisk virksomt protein, navnlig ved tilstedeværelse af okseserumalbumin.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at 10 man gennemfører celleoplukningen ved hjælp af ultralyd, højttryksdispersion eller lysozym.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at man gennemfører oplukningen i en fortyndet vandig pufferopløsning, navnlig i 0,1 mol/I Tris, ved en neutral til svagt sur pH-værdi.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man efter celleoplukningen fraskiller de uopløselige bestanddele.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører solubiliseringstrinnet ved alkalisk pH-værdi i nærværelse af et reduktionsmiddel fra mercaptogruppen og i nærværelse af et denatureringsmiddel. 1

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at man arbejder i nær værelse af guanidin-hydrochlorid og/eller forbindelser med den almene formel I som denatureringsmiddel. DK 175109 B1

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at koncentrationen af guanidindhydrochlorid andrager 6 mol/1, koncentration af forbindelser med den almene formel I andrager 8 mol/1. i·

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 10 til 12,kendetegnet ved, at man 5 arbejder ved tilstedeværelse af DTE, B-mercaptoethanol, cystein eller GSH.

14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man gennemfører rensning og fraskillelse af reduktions-, oxidations- eller denatureringsmidler ved hjælp af sterisk udelukkelseschromatografi eller dialyse.

15. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at 10 man efter reaktiveringstrinnet gennemfører et rensningstrin ved hjælp af dialyse.

16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 15, kendetegnet ved, at man som genteknologisk fremstillet eukaryotisk protein anvender t-PA.

17. Stimulerbar, ikke-glycosyleret tPA, opnået i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 til 16. 1

18. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man ved hjælp af ionbyt- terbehandling fraskiller det blandede disulfid af protein og glutathion fra ik-ke-modificeret protein.