JP3288720B2 - 変性タンパク質の活性化方法 - Google Patents
変性タンパク質の活性化方法Info
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、変性タンパク質、特に組換え製造された変
性タンパク質の簡単な、可溶化及び再生方法に関する。
性タンパク質の簡単な、可溶化及び再生方法に関する。
難溶性不活性タンパク質凝集体（封入体）は、原核生
物、例えば大腸菌（E.coli）内でタンパク質が製造され
るときに、しばしば形成される。これらのタンパク質を
それらの活性形態に変換するために、これらのタンパク
質を可溶化し、そして再生させることが必要である。こ
のような方法は、知られており、そして例えばEP−A 0
361 475,EP−A 0 114 506,EP−A 0 093 619,EP−A 0 25
3 823,WO 87/02673,EP−A 0 364 926及びEP−A 0 241 0
22中に記載されている。再生タンパク質の収量を制限す
る活性化における重要な因子は、再生タンパク質の、正
しく折り畳まれた中間体への変換といくつかのタンパク
質分子の凝集との間の競合反応である。この理由のため
に、再生溶液中の再生タンパク質の濃度は、その再生方
法の収量のための重要なパラメーターである。凝集は、
再生タンパク質の濃度を高めることにより味方され、そ
して生来のタンパク質のコンホメーションをもつ再生タ
ンパク質の相対収量が減少する（臨界濃度）。
物、例えば大腸菌（E.coli）内でタンパク質が製造され
るときに、しばしば形成される。これらのタンパク質を
それらの活性形態に変換するために、これらのタンパク
質を可溶化し、そして再生させることが必要である。こ
のような方法は、知られており、そして例えばEP−A 0
361 475,EP−A 0 114 506,EP−A 0 093 619,EP−A 0 25
3 823,WO 87/02673,EP−A 0 364 926及びEP−A 0 241 0
22中に記載されている。再生タンパク質の収量を制限す
る活性化における重要な因子は、再生タンパク質の、正
しく折り畳まれた中間体への変換といくつかのタンパク
質分子の凝集との間の競合反応である。この理由のため
に、再生溶液中の再生タンパク質の濃度は、その再生方
法の収量のための重要なパラメーターである。凝集は、
再生タンパク質の濃度を高めることにより味方され、そ
して生来のタンパク質のコンホメーションをもつ再生タ
ンパク質の相対収量が減少する（臨界濃度）。
組換えタンパク質の大規模製造においては、再生され
るべきタンパク質の量は、通常、上記臨界濃度よりもか
なり高い。タンパク質は、使用される活性化バッファー
中でしばしば低い溶解度をもつので、これは、それ故、
かなりの欠点、例えば、低収率、長時間の要求及び大容
量のバッファーをもたらす。
るべきタンパク質の量は、通常、上記臨界濃度よりもか
なり高い。タンパク質は、使用される活性化バッファー
中でしばしば低い溶解度をもつので、これは、それ故、
かなりの欠点、例えば、低収率、長時間の要求及び大容
量のバッファーをもたらす。
不活性可溶性タンパク質が変性剤及び還元剤で可溶化
され、その後その還元剤が分離され、そして次に、タン
パク質と例えばグルタチオンとの間の異種構造の混合さ
れたジスルフィドが可溶化されたタンパク質が調製され
る。方法がWO 87/02673から知られている。このような
混合されたジスルフィドはさらなる精製及び再生のため
に有利である。なぜなら、チオール基の修飾後、そのタ
ンパク質は空気酸化に対して保護され、そしてこれ故そ
れはより大きなpH範囲内で安定であるからである。正味
電荷における変化もその精製を容易にする。なぜなら、
それは、非修飾タンパク質がイオン交換クロマトグラフ
ィーにより分離されることを可能にするからである。
され、その後その還元剤が分離され、そして次に、タン
パク質と例えばグルタチオンとの間の異種構造の混合さ
れたジスルフィドが可溶化されたタンパク質が調製され
る。方法がWO 87/02673から知られている。このような
混合されたジスルフィドはさらなる精製及び再生のため
に有利である。なぜなら、チオール基の修飾後、そのタ
ンパク質は空気酸化に対して保護され、そしてこれ故そ
れはより大きなpH範囲内で安定であるからである。正味
電荷における変化もその精製を容易にする。なぜなら、
それは、非修飾タンパク質がイオン交換クロマトグラフ
ィーにより分離されることを可能にするからである。
上記混合ジスルフィドを形成するために、還元剤を精
製されている可溶化され、透析され、そして還元された
タンパク質は、その誘導体化のための変性剤及びジスル
フィド成分（例えば、GSSG、システイン、シスタミン）
を含む溶液と共にインキュベートされる。再生は、ジス
ルフィド成分の分離後に通常のやり方で行われる。この
方法は効率的であるけれども、それは、特に、誘導体化
の前の還元剤の分離のために、多くの別個の方法工程を
要求する。
製されている可溶化され、透析され、そして還元された
タンパク質は、その誘導体化のための変性剤及びジスル
フィド成分（例えば、GSSG、システイン、シスタミン）
を含む溶液と共にインキュベートされる。再生は、ジス
ルフィド成分の分離後に通常のやり方で行われる。この
方法は効率的であるけれども、それは、特に、誘導体化
の前の還元剤の分離のために、多くの別個の方法工程を
要求する。
インスリン様成長因子Ｉを折り畳み、そして精製する
ための方法は、WO 93/19084から知られている。これに
よれば、封入体が還元条件下に溶解され、その後、過剰
の酸化剤が、その還元剤を分離せずに添加される。再生
は、（透析によらない）その後の希釈及び（酸化還元系
を構築するための）還元剤の新たな添加により開始され
る。WO 91/08762は、生物学的に活性な血小板由来成長
因子の調製について記載している。この方法において
は、可溶化は、まず、還元剤を伴わずにpH3において行
われ、そしてその後、変性条件下で精製される。その
後、誘導体を製造するために酸化剤が添加されるだけで
ある。EP−A 0 450 386によれば、封入体（変性溶解NGF
タンパク質）の抽出は、その後の遠心分離を伴う可溶化
バッファーの添加により調製される。次に抽出物は、還
元剤により処理され、インキュベートされ、そして事前
の透析を伴わずに酸化剤の添加により酸化される。その
後、それは希釈され、そしてさらなる成分が変性のため
に添加される。従って、この方法においては、可溶化
が、最初に、酸化還元活性物質の添加によらず、単一の
分離方法工程として行われる。これらの方法のいずれ
も、米国特許第4,933,434号に従ったパルス再生のため
に好適ではない。
ための方法は、WO 93/19084から知られている。これに
よれば、封入体が還元条件下に溶解され、その後、過剰
の酸化剤が、その還元剤を分離せずに添加される。再生
は、（透析によらない）その後の希釈及び（酸化還元系
を構築するための）還元剤の新たな添加により開始され
る。WO 91/08762は、生物学的に活性な血小板由来成長
因子の調製について記載している。この方法において
は、可溶化は、まず、還元剤を伴わずにpH3において行
われ、そしてその後、変性条件下で精製される。その
後、誘導体を製造するために酸化剤が添加されるだけで
ある。EP−A 0 450 386によれば、封入体（変性溶解NGF
タンパク質）の抽出は、その後の遠心分離を伴う可溶化
バッファーの添加により調製される。次に抽出物は、還
元剤により処理され、インキュベートされ、そして事前
の透析を伴わずに酸化剤の添加により酸化される。その
後、それは希釈され、そしてさらなる成分が変性のため
に添加される。従って、この方法においては、可溶化
が、最初に、酸化還元活性物質の添加によらず、単一の
分離方法工程として行われる。これらの方法のいずれ
も、米国特許第4,933,434号に従ったパルス再生のため
に好適ではない。
さらに、可溶化の間に誘導体化を既に可能にしている
方法が知られている。亜硫酸分解法（The method of su
lfitolysis）は、長い間知られてきた（例えば、Baile
y,J.L.,Cole,R.D.,1959,J.Biol.Chem.234,1733−1739;C
ole,R.D.,1967,In:Meth.Enzymol.11,206−208;EP 0 114
507）。この方法においては、タンパク質内のジスルフ
ィド橋が亜硫酸の塩で処理され、反応生成物として50％
チオ−スルホン化（RS−SO3 -）と50％遊離（RS-）タン
パク質−SH基の混合物が形成される。後者の遊離のSH基
は、次に（例えば、銅イオン、ヨードゾベンゾエート又
は好ましくはテトラチオネートによる）再酸化によりジ
スルフィドに変換され、これは、その方法の繰り返しの
サイクルによりそのチオスルホネートにほとんど完全に
変換されることができる。この方法は比較的簡単であ
り、そして温やかな境界条件下（例えば、中性pH値で）
行われることができる。J.Biol.Chem.234,1733中で既に
延べられたように、欠点は、形成されるチオスルホネー
トが化学的に不安定であるということであり、その変換
の完結をチェックすることができず、そしてとりわけ、
そのトリプトファン残基が再酸化剤により部分的に破壊
される。さらなる欠点は、チオスルホン化タンパク質−
SH基及び酸化剤を含む副生成物、例えば最終生成物中の
上記ヨードゾベンゾエートを完全に分離することがひじ
ょうに難しく、そしてこれを分析的に検出することは極
めて骨の折れることである。しかしながら、このこと
は、上記の非生理学的なやり方で化学的に修飾されてい
る治療剤の可能性のある副作用を排除するために、治療
的適用を意図されたタンパク質のために、絶対に必要な
ことである。
方法が知られている。亜硫酸分解法（The method of su
lfitolysis）は、長い間知られてきた（例えば、Baile
y,J.L.,Cole,R.D.,1959,J.Biol.Chem.234,1733−1739;C
ole,R.D.,1967,In:Meth.Enzymol.11,206−208;EP 0 114
507）。この方法においては、タンパク質内のジスルフ
ィド橋が亜硫酸の塩で処理され、反応生成物として50％
チオ−スルホン化（RS−SO3 -）と50％遊離（RS-）タン
パク質−SH基の混合物が形成される。後者の遊離のSH基
は、次に（例えば、銅イオン、ヨードゾベンゾエート又
は好ましくはテトラチオネートによる）再酸化によりジ
スルフィドに変換され、これは、その方法の繰り返しの
サイクルによりそのチオスルホネートにほとんど完全に
変換されることができる。この方法は比較的簡単であ
り、そして温やかな境界条件下（例えば、中性pH値で）
行われることができる。J.Biol.Chem.234,1733中で既に
延べられたように、欠点は、形成されるチオスルホネー
トが化学的に不安定であるということであり、その変換
の完結をチェックすることができず、そしてとりわけ、
そのトリプトファン残基が再酸化剤により部分的に破壊
される。さらなる欠点は、チオスルホン化タンパク質−
SH基及び酸化剤を含む副生成物、例えば最終生成物中の
上記ヨードゾベンゾエートを完全に分離することがひじ
ょうに難しく、そしてこれを分析的に検出することは極
めて骨の折れることである。しかしながら、このこと
は、上記の非生理学的なやり方で化学的に修飾されてい
る治療剤の可能性のある副作用を排除するために、治療
的適用を意図されたタンパク質のために、絶対に必要な
ことである。
WO 95/30686も、NGF/BDNFファミリーの神経栄養因子
を再生するための上記の亜硫酸分解について記載してい
る。同様の方法が、R.Wetzel et al.,Gene.16（1981）6
3−71並びにW.F.Heath et al.,J.Biol.Chem.267（199
2）419−425によりヒト・プロインスリンの再生につい
て記載されている。
を再生するための上記の亜硫酸分解について記載してい
る。同様の方法が、R.Wetzel et al.,Gene.16（1981）6
3−71並びにW.F.Heath et al.,J.Biol.Chem.267（199
2）419−425によりヒト・プロインスリンの再生につい
て記載されている。
側鎖を傷つける再酸化条件の使用を回避する同様の方
法も知られている（Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Sche
raga,H.A.,1984,Analyt.Biochem.138,181−188;Thannha
user,T.W.,Scheraga,H.A.,1985,Biochemistry,24,7681
−7688）：この場合には、再酸化の代わりに、そのジス
ルフィド橋が還元されるときに得られるシステインが２
−ニトロ−５−（スルホチオ）−ベンゾエートとの反応
により直接的に誘導体化され;2−ニトロ−５−チオベン
ゾエートがこのプロセスにおいて放出され、これが、光
度計により計測されることができ、そしてこれ故、変換
されたSH基の定量化を可能にする。この方法の欠点は、
最終生成物からのその完全な分離がひじょうに時間がか
かり、そしてチェックするのが難しい複雑な化学物質が
導入されるということである。さらに、その著者らは
（Biochemistry 24,7681）、得られたチオスルホネート
が、チオール基が全く存在しないときにのみ安定である
ということを観察した。さらに、側鎖の修飾もこの場合
に観察されている（アスパラギンの脱アミノ化）。
法も知られている（Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Sche
raga,H.A.,1984,Analyt.Biochem.138,181−188;Thannha
user,T.W.,Scheraga,H.A.,1985,Biochemistry,24,7681
−7688）：この場合には、再酸化の代わりに、そのジス
ルフィド橋が還元されるときに得られるシステインが２
−ニトロ−５−（スルホチオ）−ベンゾエートとの反応
により直接的に誘導体化され;2−ニトロ−５−チオベン
ゾエートがこのプロセスにおいて放出され、これが、光
度計により計測されることができ、そしてこれ故、変換
されたSH基の定量化を可能にする。この方法の欠点は、
最終生成物からのその完全な分離がひじょうに時間がか
かり、そしてチェックするのが難しい複雑な化学物質が
導入されるということである。さらに、その著者らは
（Biochemistry 24,7681）、得られたチオスルホネート
が、チオール基が全く存在しないときにのみ安定である
ということを観察した。さらに、側鎖の修飾もこの場合
に観察されている（アスパラギンの脱アミノ化）。
本発明の目的は、上記の方法を単純化し、そして改良
し、そしてそのSH基が誘導体化されており、そして高収
率で再生されることができる安定性の保存可能なタンパ
ク質を提供することである。
し、そしてそのSH基が誘導体化されており、そして高収
率で再生されることができる安定性の保存可能なタンパ
ク質を提供することである。
驚ろくべきことに、本発明に係る方法は、事前に還元
する必要性を伴わずに、単一工程において可溶化及び誘
導体化が行われることを許容するということを発見し
た。誘導体化が、好ましくはニューロトロフィン、例え
ばNGFのための酸性条件（7.0未満のpH値、好ましくはpH
3〜6.5）下も生じることができること、そしてこれが、
約７〜10の通常pH範囲内でのチオール成分との反応に比
較して、反応の速度論及び完結性に本質的に影響を及ぼ
さずに達成されるということは、特に驚ろくべきことで
ある。このような反応は遊離のチオレート・アニオンの
存在下でのみ進行することができ；これが、約９のチオ
レート・アニオンの高いpK値のために、約７を上廻るpH
値における有効な濃度においてのみ生じるということ
が、通常推定される。
する必要性を伴わずに、単一工程において可溶化及び誘
導体化が行われることを許容するということを発見し
た。誘導体化が、好ましくはニューロトロフィン、例え
ばNGFのための酸性条件（7.0未満のpH値、好ましくはpH
3〜6.5）下も生じることができること、そしてこれが、
約７〜10の通常pH範囲内でのチオール成分との反応に比
較して、反応の速度論及び完結性に本質的に影響を及ぼ
さずに達成されるということは、特に驚ろくべきことで
ある。このような反応は遊離のチオレート・アニオンの
存在下でのみ進行することができ；これが、約９のチオ
レート・アニオンの高いpK値のために、約７を上廻るpH
値における有効な濃度においてのみ生じるということ
が、通常推定される。
それ故、本発明は、タンパク質とジスルフィド成分か
ら成る混合ジスルフィドの製法であって、不活性の難溶
性形態のタンパク質（封入体）が、変性濃度で、かつ、
ジスルフィド成分の存在下で変性剤の溶液と共にインキ
ュベートされ、溶解され、そして誘導体化され（タンパ
ク質：ジスルフィド成分のモル比1:1〜1:10,000、好ま
しくは1:1,000）、そしてその後、そのジスルフィド成
分が場合により除去されることを特徴とする製法に関す
る。このジスルフィド成分は、次に、首尾よく、米国特
許第4,933,434号中に記載されたようなパルス再生（ren
aturation）をその後に行うことにより除去されること
ができる。本発明に係る誘導体化されたタンパク質は安
定性であり、そしてさらなるプロセッシング前に保存さ
れることができる。これは特に有利である。なぜなら、
誘導体化されたタンパク質は、再生と独立して本発明に
係る方法により製造されることができる。これ故、誘導
体化されたタンパク質は、多くの再生及び精製プロセス
及び／又は調製物のための単離された中間体生成物とし
て入手可能である。
ら成る混合ジスルフィドの製法であって、不活性の難溶
性形態のタンパク質（封入体）が、変性濃度で、かつ、
ジスルフィド成分の存在下で変性剤の溶液と共にインキ
ュベートされ、溶解され、そして誘導体化され（タンパ
ク質：ジスルフィド成分のモル比1:1〜1:10,000、好ま
しくは1:1,000）、そしてその後、そのジスルフィド成
分が場合により除去されることを特徴とする製法に関す
る。このジスルフィド成分は、次に、首尾よく、米国特
許第4,933,434号中に記載されたようなパルス再生（ren
aturation）をその後に行うことにより除去されること
ができる。本発明に係る誘導体化されたタンパク質は安
定性であり、そしてさらなるプロセッシング前に保存さ
れることができる。これは特に有利である。なぜなら、
誘導体化されたタンパク質は、再生と独立して本発明に
係る方法により製造されることができる。これ故、誘導
体化されたタンパク質は、多くの再生及び精製プロセス
及び／又は調製物のための単離された中間体生成物とし
て入手可能である。
あるいは、タンパク質を誘導体化するためのインキュ
ベーションは、還元剤（例えば、DTT,DTE,GSH、システ
イン、システアミン、亜硫酸の塩）の存在下で行われ
る。これは、誘導体化収率を改善することができる。こ
の場合、ジスルフィド成分の有効性が制限されないか又
は僅かな程度に制限されるようにその還元剤の濃度を選
ぶことが好都合であり;20モル・パーセントまでの還元
剤の濃度、好ましくは、10％までのジスルフィド成分の
濃度が好ましいことが判明している。
ベーションは、還元剤（例えば、DTT,DTE,GSH、システ
イン、システアミン、亜硫酸の塩）の存在下で行われ
る。これは、誘導体化収率を改善することができる。こ
の場合、ジスルフィド成分の有効性が制限されないか又
は僅かな程度に制限されるようにその還元剤の濃度を選
ぶことが好都合であり;20モル・パーセントまでの還元
剤の濃度、好ましくは、10％までのジスルフィド成分の
濃度が好ましいことが判明している。
追加の試薬は、好ましくは、重金属、ラジカル又は活
性酸素種による上記SH基のブロッキング又は破壊を部分
的に又は完全に防ぐことができる遊離のSH基を保護する
ために、添加されることができる。
性酸素種による上記SH基のブロッキング又は破壊を部分
的に又は完全に防ぐことができる遊離のSH基を保護する
ために、添加されることができる。
このクラスの保護試薬は、例えば0.1〜100mmol/lの濃
度におけるEDTA又は１〜1,000mmol/lの濃度におけるマ
ンニトールを含む。
度におけるEDTA又は１〜1,000mmol/lの濃度におけるマ
ンニトールを含む。
ジスルフィド成分は、ジスルフィド・クラスからの物
質、例えばGSSG、シスタミン又はシスチンと理解され
る。ジスルフィド成分は、ジスルフィド橋の解裂後にタ
ンパク質内のSH基を誘導体化することができる。ジスル
フィド成分は、好ましくは、少なくとも1mmol/l又はそ
れより高い濃度で、好ましくは１〜1,000mmol/l、特に
好ましくは10〜200mmol/lの濃度で使用される。
質、例えばGSSG、シスタミン又はシスチンと理解され
る。ジスルフィド成分は、ジスルフィド橋の解裂後にタ
ンパク質内のSH基を誘導体化することができる。ジスル
フィド成分は、好ましくは、少なくとも1mmol/l又はそ
れより高い濃度で、好ましくは１〜1,000mmol/l、特に
好ましくは10〜200mmol/lの濃度で使用される。
変性剤として酸化条件下、変性タンパク質を可溶化す
るために通常使用される変性剤を使用することが好都合
である。塩酸グアニジウム又は他のグアニジウム塩、例
えばスルフェート、ホスフェート又はチオシアネート並
びにウレア又はそれらの誘導体を使用することが好まし
い。これらの変性剤の混合物を使用することもできる。
るために通常使用される変性剤を使用することが好都合
である。塩酸グアニジウム又は他のグアニジウム塩、例
えばスルフェート、ホスフェート又はチオシアネート並
びにウレア又はそれらの誘導体を使用することが好まし
い。これらの変性剤の混合物を使用することもできる。
変性剤の濃度は、その変性剤のタイプに依存し、そし
て当業者により容易に決定されることができる。変性し
た難溶性タンパク質の完全な溶解が達成されることがで
きる場合の、変性剤の濃度が適当である。塩酸グアニジ
ンの場合、これらの濃度は、通常３〜8mol/l、好ましく
は６〜8mol/lである。ウレアの場合、その濃度は通常６
〜10mol/lである。
て当業者により容易に決定されることができる。変性し
た難溶性タンパク質の完全な溶解が達成されることがで
きる場合の、変性剤の濃度が適当である。塩酸グアニジ
ンの場合、これらの濃度は、通常３〜8mol/l、好ましく
は６〜8mol/lである。ウレアの場合、その濃度は通常６
〜10mol/lである。
“不活性の難溶性形態のタンパク質”は、例えば、原
核生物内の組換え生産により形成されるタンパク質とし
て理解される。このようなタンパク質は、真核タンパク
質が原核生物内で過剰発現されるときに、通常形成さ
れ、そしてそのタンパク質は、細胞周辺腔内又は細胞上
清中に活性形態で輸送されない。この場合、組換え生産
されたタンパク質は、不溶性の、かつ、凝集した形態で
細胞質又は細胞周辺腔内に残る。このような凝集、それ
らの単離及び精製は、例えばMarston F.A.O.,Biochem.
J.214（1986）１−12中に記載されている。原核細胞
は、封入体を単離するために発酵後に溶解される。
核生物内の組換え生産により形成されるタンパク質とし
て理解される。このようなタンパク質は、真核タンパク
質が原核生物内で過剰発現されるときに、通常形成さ
れ、そしてそのタンパク質は、細胞周辺腔内又は細胞上
清中に活性形態で輸送されない。この場合、組換え生産
されたタンパク質は、不溶性の、かつ、凝集した形態で
細胞質又は細胞周辺腔内に残る。このような凝集、それ
らの単離及び精製は、例えばMarston F.A.O.,Biochem.
J.214（1986）１−12中に記載されている。原核細胞
は、封入体を単離するために発酵後に溶解される。
細胞溶解は、通常の方法に従って、例えば超音波、高
圧分散又はリソザイムにより、行われることができる。
それは、好ましくは、懸濁培地、例えば0.1mol/l Tris
−HClとして中性〜弱酸性pH値に調整するために好適な
バッファー溶液中で行われる。細胞溶解後、不溶性成分
（封入体）は、いずれかの望ましいやり方で、好ましく
は遠心分離により又は濾過により、上記タンパク質を妨
害しないが外来細胞タンパク質をできるだけ完全に溶解
する剤、例えば水又はホスフェート・バッファーで、場
合により温やかな洗剤、例えばBrij の添加を伴って、
洗浄した後に、分離される。その後、沈殿物（ペレッ
ト）を、可溶化及び誘導体化のために本発明に係る方法
に供する。
圧分散又はリソザイムにより、行われることができる。
それは、好ましくは、懸濁培地、例えば0.1mol/l Tris
−HClとして中性〜弱酸性pH値に調整するために好適な
バッファー溶液中で行われる。細胞溶解後、不溶性成分
（封入体）は、いずれかの望ましいやり方で、好ましく
は遠心分離により又は濾過により、上記タンパク質を妨
害しないが外来細胞タンパク質をできるだけ完全に溶解
する剤、例えば水又はホスフェート・バッファーで、場
合により温やかな洗剤、例えばBrij の添加を伴って、
洗浄した後に、分離される。その後、沈殿物（ペレッ
ト）を、可溶化及び誘導体化のために本発明に係る方法
に供する。
本発明に係る方法は、中性〜アルカリ性pH範囲内で、
好ましくはpH6〜10の間で、特に好ましくは、７〜８の
間のpH範囲内で行われる。一般的なバッファーの全てが
バッファー溶液として好適である；塩酸グアニジウムが
変性剤として使用されるとき、その緩衝作用のためにバ
ッファーを添加することは必要でない。当業者に知られ
たバッファー、例えばTris又はホスフェートが好ましく
は使用される。驚ろくべきことに、本発明に係る方法
は、酸性条件（pH3〜6.5）下でさえ、ニュートロフィン
のために特に有利に使用されることもできる。
好ましくはpH6〜10の間で、特に好ましくは、７〜８の
間のpH範囲内で行われる。一般的なバッファーの全てが
バッファー溶液として好適である；塩酸グアニジウムが
変性剤として使用されるとき、その緩衝作用のためにバ
ッファーを添加することは必要でない。当業者に知られ
たバッファー、例えばTris又はホスフェートが好ましく
は使用される。驚ろくべきことに、本発明に係る方法
は、酸性条件（pH3〜6.5）下でさえ、ニュートロフィン
のために特に有利に使用されることもできる。
本発明に係る方法は、ジスルフィド成分の添加により
行われる。好ましいジスルフィド成分は、例えばGSSG、
シスタミン及びシスチンである。誘導体化反応は、チオ
ール形態におけるタンパク質とジスルフィド成分との間
の、又はタンパク質から成る混合ジスルフィドと、一方
においてジスルフィド成分との、そして他方において、
遊離のチオール成分、すなわち残存タンパク質のチオー
ル基との間の、平衡反応であり、ここでチオール形態の
タンパク質との反応により上記ジスルフィド成分からチ
オール成分が放出されるので、望ましい誘導体化反応
は、高過剰のジスルフィド成分により駆動されなければ
ならない。このために必要な条件は、タンパク質からタ
ンパク質までひじょうに異なっている。10mmol/lからそ
の飽和限界までのジスルフィド成分の濃度範囲（例え
ば、その調製物のpH値に依存してGSSGの場合、約200〜3
00mmol/l、シスタミンについて約700mmol/l）を使用す
ることが好ましい。その濃度範囲は、特に好ましくは、
そのジスルフィド成分の飽和濃度の50〜100％である。
行われる。好ましいジスルフィド成分は、例えばGSSG、
シスタミン及びシスチンである。誘導体化反応は、チオ
ール形態におけるタンパク質とジスルフィド成分との間
の、又はタンパク質から成る混合ジスルフィドと、一方
においてジスルフィド成分との、そして他方において、
遊離のチオール成分、すなわち残存タンパク質のチオー
ル基との間の、平衡反応であり、ここでチオール形態の
タンパク質との反応により上記ジスルフィド成分からチ
オール成分が放出されるので、望ましい誘導体化反応
は、高過剰のジスルフィド成分により駆動されなければ
ならない。このために必要な条件は、タンパク質からタ
ンパク質までひじょうに異なっている。10mmol/lからそ
の飽和限界までのジスルフィド成分の濃度範囲（例え
ば、その調製物のpH値に依存してGSSGの場合、約200〜3
00mmol/l、シスタミンについて約700mmol/l）を使用す
ることが好ましい。その濃度範囲は、特に好ましくは、
そのジスルフィド成分の飽和濃度の50〜100％である。
本発明に係る方法において還元剤を添加することも好
ましい。メルカプタン基からの還元剤、例えば、0.01〜
50mmol/l、好ましくは0.1〜10mmol/lの濃度における、
還元グルタチオン（GSH）又は２−メルカプトエタノー
ル、ジチオエリスリトール（DTE）又はジチオトレイト
ール（DTT）が特に好ましい。還元剤、例えば亜硫酸の
塩、例えば亜硫酸ナトリウムがさらに好ましい。これら
の還元剤の中の１の添加はその反応を首尾よく実施する
ための必要条件ではないけれども、この添加は、タンパ
ク質が処理されたタンパク質に依存して再活性化される
ときに、改善された収率を導くことができる。
ましい。メルカプタン基からの還元剤、例えば、0.01〜
50mmol/l、好ましくは0.1〜10mmol/lの濃度における、
還元グルタチオン（GSH）又は２−メルカプトエタノー
ル、ジチオエリスリトール（DTE）又はジチオトレイト
ール（DTT）が特に好ましい。還元剤、例えば亜硫酸の
塩、例えば亜硫酸ナトリウムがさらに好ましい。これら
の還元剤の中の１の添加はその反応を首尾よく実施する
ための必要条件ではないけれども、この添加は、タンパ
ク質が処理されたタンパク質に依存して再活性化される
ときに、改善された収率を導くことができる。
本発明に係る方法は、好ましくは、0.1〜100時間、好
ましくは１〜24時間、特に好ましくは２〜４時間の期
間、室温で行われる。他の条件、例えば約60℃までの加
熱又は約０℃への冷却を伴うプロセスも、しかしながら
好適である。大気中の酸素による還元剤の酸化を防止
し、そして遊離のSH基を保護するために、好ましくは１
〜100mmol/lの量において、特に好ましくは約10mmol/l
の量においてEDTAを添加することが好都合である。例え
ば、特に、比較的高いpH値においてチオールを含有する
溶液中で生じることができるラジカル副反応を抑制する
ために、そのタンパク質の再生及び／又はプロセッシン
グの間、１〜1,000mmol/lの濃度において、好ましくは2
0〜200mmol/lの濃度において、特に好ましくは50mmol/l
の濃度においてラジカル・インターセプター（クエンチ
ャー）を添加することも好都合である。
ましくは１〜24時間、特に好ましくは２〜４時間の期
間、室温で行われる。他の条件、例えば約60℃までの加
熱又は約０℃への冷却を伴うプロセスも、しかしながら
好適である。大気中の酸素による還元剤の酸化を防止
し、そして遊離のSH基を保護するために、好ましくは１
〜100mmol/lの量において、特に好ましくは約10mmol/l
の量においてEDTAを添加することが好都合である。例え
ば、特に、比較的高いpH値においてチオールを含有する
溶液中で生じることができるラジカル副反応を抑制する
ために、そのタンパク質の再生及び／又はプロセッシン
グの間、１〜1,000mmol/lの濃度において、好ましくは2
0〜200mmol/lの濃度において、特に好ましくは50mmol/l
の濃度においてラジカル・インターセプター（クエンチ
ャー）を添加することも好都合である。
可溶化／誘導体化の後、ジスルフィド成分及び場合に
より添加された還元剤を除去するために、変性濃度にお
いて変性剤を含む溶液に対して透析することが好まし
い。この透析溶液は、有利には、変性／誘導体化溶液中
と同じ濃度で変性剤を含む。同一モル濃度における他の
変性剤に対して、例えば約1mmol/lのHCl又は希酢酸に対
して透析することも好ましい。さらに、上記ジスルフィ
ド成分を完全に分離しないことも好都合であることが判
明している；既に説明したように、上記誘導体化反応
は、遊離のチオール成分と（場合により混合された）ジ
スルフィド成分との間の平衡反応である。タンパク質チ
オール基の全てが完全に誘導体化されていない場合、そ
のジスルフィド成分の分離後に、残存する遊離のチオー
ル成分が、存在している場合ジスルフィドに対して還元
効果をもつであろうというリスク、そしてこれ故、その
誘導体収率が、その誘導体化されたタンパク質の保存の
間に、その後に減少するであろうというリスクが存在す
る。処理されたタンパク質の誘導体化の程度は、それ
故、酸化に対して及び同様の破壊的副反応に対して、タ
ンパク質チオール基を保護するために、誘導体化の所期
の目的に関して、できるだけ高く、かつ、安定性でなけ
ればならない。これは、ジスルフィド成分の濃度が好適
な濃度未満に低下する前にか又は要求濃度においてジス
ルフィド成分を含む透析バッファーに対する透析におけ
る透析のいずれかにより、その通席を未完結で終了させ
ることにより、達成されることができる。誘導体化され
たタンパク質の保存の間の誘導体化の程度を維持するた
めに必要な濃度は、それぞれの処理されたタンパク質
に、そして特にその処理されたタンパク質のシステイン
含量に依存し、そして０〜100mmol/lの濃度範囲内にあ
ることができる。再活性化反応のための誘導体化タンパ
ク質のさらなる使用に関しては、再活性化プロセスにお
けるジスルフィド成分の導入は、分子間又は分子内ジス
ルフィド橋の所望の酸化的連結のための、この場合に使
用される条件に対して効果をもたないか又はほんの僅か
な効果をもつ。この理由のために、約１〜10mmol/lの誘
導体化タンパク質内のジスルフィド成分の残存濃度が好
ましいと証明されている。
より添加された還元剤を除去するために、変性濃度にお
いて変性剤を含む溶液に対して透析することが好まし
い。この透析溶液は、有利には、変性／誘導体化溶液中
と同じ濃度で変性剤を含む。同一モル濃度における他の
変性剤に対して、例えば約1mmol/lのHCl又は希酢酸に対
して透析することも好ましい。さらに、上記ジスルフィ
ド成分を完全に分離しないことも好都合であることが判
明している；既に説明したように、上記誘導体化反応
は、遊離のチオール成分と（場合により混合された）ジ
スルフィド成分との間の平衡反応である。タンパク質チ
オール基の全てが完全に誘導体化されていない場合、そ
のジスルフィド成分の分離後に、残存する遊離のチオー
ル成分が、存在している場合ジスルフィドに対して還元
効果をもつであろうというリスク、そしてこれ故、その
誘導体収率が、その誘導体化されたタンパク質の保存の
間に、その後に減少するであろうというリスクが存在す
る。処理されたタンパク質の誘導体化の程度は、それ
故、酸化に対して及び同様の破壊的副反応に対して、タ
ンパク質チオール基を保護するために、誘導体化の所期
の目的に関して、できるだけ高く、かつ、安定性でなけ
ればならない。これは、ジスルフィド成分の濃度が好適
な濃度未満に低下する前にか又は要求濃度においてジス
ルフィド成分を含む透析バッファーに対する透析におけ
る透析のいずれかにより、その通席を未完結で終了させ
ることにより、達成されることができる。誘導体化され
たタンパク質の保存の間の誘導体化の程度を維持するた
めに必要な濃度は、それぞれの処理されたタンパク質
に、そして特にその処理されたタンパク質のシステイン
含量に依存し、そして０〜100mmol/lの濃度範囲内にあ
ることができる。再活性化反応のための誘導体化タンパ
ク質のさらなる使用に関しては、再活性化プロセスにお
けるジスルフィド成分の導入は、分子間又は分子内ジス
ルフィド橋の所望の酸化的連結のための、この場合に使
用される条件に対して効果をもたないか又はほんの僅か
な効果をもつ。この理由のために、約１〜10mmol/lの誘
導体化タンパク質内のジスルフィド成分の残存濃度が好
ましいと証明されている。
本発明のさらなる主題は、原核生物における組換え生
産後に得られることができるその不活性難溶性形態から
の再生タンパク質の製法であって、その不活性の難溶性
形態のタンパク質が、変性濃度における変性剤の溶液と
共に、そしてジスルフィド成分の存在下（モル比タンパ
ク質：ジスルフィド成分1:1〜1:10,000、好ましくは1:
1,000）で、インキュベートされ、溶解され、そして誘
導体化され、そしてその中で、そのジスルフィド成分と
のジスルフィド結合が、酸化還元系の添加により破壊さ
れそしてこのやり方で、そのタンパク質がその特徴的な
生物学的活性をもつところのコンホメーションを採用す
るような方法でそのタンパク質内で分子内で新たに形成
される、ところの弱い又は非変性溶液に、上記の強い変
性溶液を変更することにより生物学的に活性なコンホメ
ーションを呈する。
産後に得られることができるその不活性難溶性形態から
の再生タンパク質の製法であって、その不活性の難溶性
形態のタンパク質が、変性濃度における変性剤の溶液と
共に、そしてジスルフィド成分の存在下（モル比タンパ
ク質：ジスルフィド成分1:1〜1:10,000、好ましくは1:
1,000）で、インキュベートされ、溶解され、そして誘
導体化され、そしてその中で、そのジスルフィド成分と
のジスルフィド結合が、酸化還元系の添加により破壊さ
れそしてこのやり方で、そのタンパク質がその特徴的な
生物学的活性をもつところのコンホメーションを採用す
るような方法でそのタンパク質内で分子内で新たに形成
される、ところの弱い又は非変性溶液に、上記の強い変
性溶液を変更することにより生物学的に活性なコンホメ
ーションを呈する。
このような弱い変性条件は、例えば、好ましくは還元
剤の存在中、希釈又は透析により達成されることができ
る。弱い変性条件は、強い変性条件とは対照的に、その
下で、タンパク質がその活性コンホメーションを採用す
ることができ、そしてこのコンホメーションにおいて安
定性であるところの条件である。強い変性条件下では、
タンパク質はこの形態で不安定であり、そして変性する
傾向があり、すなわち、その安定した３次元構造を、そ
してエネルギー的に好ましいジスルフィド結合を失う傾
向がある。強い変性条件は、例えば、４〜9mol/lの塩酸
グアニジンの溶液中で存在する。弱い変性条件は、例え
ば、0.1〜2mol/lの間の塩酸グアニジンにおいて存在す
る。再生の間、0.1〜1mol/lの間の濃度でアルギニンを
添加することも好都合である。
剤の存在中、希釈又は透析により達成されることができ
る。弱い変性条件は、強い変性条件とは対照的に、その
下で、タンパク質がその活性コンホメーションを採用す
ることができ、そしてこのコンホメーションにおいて安
定性であるところの条件である。強い変性条件下では、
タンパク質はこの形態で不安定であり、そして変性する
傾向があり、すなわち、その安定した３次元構造を、そ
してエネルギー的に好ましいジスルフィド結合を失う傾
向がある。強い変性条件は、例えば、４〜9mol/lの塩酸
グアニジンの溶液中で存在する。弱い変性条件は、例え
ば、0.1〜2mol/lの間の塩酸グアニジンにおいて存在す
る。再生の間、0.1〜1mol/lの間の濃度でアルギニンを
添加することも好都合である。
タンパク質の活性は、タンパク質の生物学的な活性と
して理解される。それが天然のタンパク質又は天然タン
パク質の誘導体である場合、その生物学的活性は、その
タンパク質の免疫学的、細胞生物学的又は触媒特性によ
り決定されることができる。
して理解される。それが天然のタンパク質又は天然タン
パク質の誘導体である場合、その生物学的活性は、その
タンパク質の免疫学的、細胞生物学的又は触媒特性によ
り決定されることができる。
活性化（再生）は、好ましくは、変性剤を伴わずに、
0.1〜20mmol/lのGSH濃度において、0.01〜10mmol/lのGS
SG濃度において、又は変性剤の非変性濃度において行わ
れ、そして再活性化は、好ましくは１〜300時間の期間
にわたり行われる。この場合、GSHの濃度は、好ましく
は0.5〜10mmol/lであり、そして／又はそのGSSG濃度
は、好ましくは0.1〜10mmol/lである。
0.1〜20mmol/lのGSH濃度において、0.01〜10mmol/lのGS
SG濃度において、又は変性剤の非変性濃度において行わ
れ、そして再活性化は、好ましくは１〜300時間の期間
にわたり行われる。この場合、GSHの濃度は、好ましく
は0.5〜10mmol/lであり、そして／又はそのGSSG濃度
は、好ましくは0.1〜10mmol/lである。
本発明に係る方法は、多くの変性タンパク質そして特
に組換え生産された変性タンパク質のために好適であ
る。このようなタンパク質は、例えばプロテアーゼ、成
長因子、タンパク質ホルモン、サイトカイン、プラスミ
ノーゲン・アクチベーター、第X a因子及び特にニュー
ロトロフィンである。ニューロトロフィンは、特に神経
細胞内に在り、そして神経細胞の分化及び生存を支援す
るタンパク質である。それ故、ニュートロフィン（例え
ば、NGP、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニュートロフ
ィン3,4/5,6）は、神経変性疾患、例えばポリニューロ
パシー、アルツハイマー病、又は脳及び脊髄の損傷の治
療のための貴重な細胞治療剤である。
に組換え生産された変性タンパク質のために好適であ
る。このようなタンパク質は、例えばプロテアーゼ、成
長因子、タンパク質ホルモン、サイトカイン、プラスミ
ノーゲン・アクチベーター、第X a因子及び特にニュー
ロトロフィンである。ニューロトロフィンは、特に神経
細胞内に在り、そして神経細胞の分化及び生存を支援す
るタンパク質である。それ故、ニュートロフィン（例え
ば、NGP、脳由来神経成長因子（BDNF）、ニュートロフ
ィン3,4/5,6）は、神経変性疾患、例えばポリニューロ
パシー、アルツハイマー病、又は脳及び脊髄の損傷の治
療のための貴重な細胞治療剤である。
ヒト神経成長因子（Human nerve growth factor（NG
F））は、２つのサブユニットから成るタンパク質（ホ
モダイマー）である。そのβユニットは、感覚神経及び
交感神経の成長に影響を及ぼす能力をもつことが判明し
ている。成熟NGFは118アミノ酸から成り、３つのジスル
フィド橋を含み、そしてグリコシル化されていない。生
物学的に活性なNGFは、ダイマーとして存在する。NGFの
DNAとアミノ酸配列は、EP−B 0 121 338（USP 5,169,76
2）中に記載されている。しかしながら、この方法によ
り活性タンパク質を得ることはできない。活性組換えNG
Fの生産は、例えばEP−A 0 329 175,EP−A 0 370 171,B
iochem.Biophys.Res.Commun.171（1990）116−122,EP−
A 0 414 151,Gene 70（1988）57−65,EP−A 0 450 386
及びGene 85（1989）,109−114中に記載されている。
F））は、２つのサブユニットから成るタンパク質（ホ
モダイマー）である。そのβユニットは、感覚神経及び
交感神経の成長に影響を及ぼす能力をもつことが判明し
ている。成熟NGFは118アミノ酸から成り、３つのジスル
フィド橋を含み、そしてグリコシル化されていない。生
物学的に活性なNGFは、ダイマーとして存在する。NGFの
DNAとアミノ酸配列は、EP−B 0 121 338（USP 5,169,76
2）中に記載されている。しかしながら、この方法によ
り活性タンパク質を得ることはできない。活性組換えNG
Fの生産は、例えばEP−A 0 329 175,EP−A 0 370 171,B
iochem.Biophys.Res.Commun.171（1990）116−122,EP−
A 0 414 151,Gene 70（1988）57−65,EP−A 0 450 386
及びGene 85（1989）,109−114中に記載されている。
脳由来神経栄養因子（BDNF）は、Leibrock et al.,Na
ture 341（1989）149−152により記載された。BDNFは、
中枢神経系内の感覚神経の生存を支援し、そしてパーキ
ンソン病の治療において成功しているようである。組換
えBDNFは、例えばCHO細胞においてWO 91/03568に従っ
て、そして原核生物においてWO 92/22665に従って製造
されることができる。
ture 341（1989）149−152により記載された。BDNFは、
中枢神経系内の感覚神経の生存を支援し、そしてパーキ
ンソン病の治療において成功しているようである。組換
えBDNFは、例えばCHO細胞においてWO 91/03568に従っ
て、そして原核生物においてWO 92/22665に従って製造
されることができる。
以下の実施例、刊行物及び配列プロトコールは、本発
明をさらに明らかにし、その保護範囲は添付の請求の範
囲から生じる。記載の方法は、例として理解されるべき
であり、これは、修飾後でさえ本発明の主題をさらに説
明する。
明をさらに明らかにし、その保護範囲は添付の請求の範
囲から生じる。記載の方法は、例として理解されるべき
であり、これは、修飾後でさえ本発明の主題をさらに説
明する。
実施例１ 大腸菌（E.coli）におけるNGFの発現 ａ）発現プラスミド その成熟部分をコードするNGF遺伝子を、Ullrich et
al.（Nature 303:821,1983）により公表された配列に基
づいて、そして特にその５′部分内にいくらかの修飾を
取り込むことにより合成した（配列番号:4）。Beattie
and Fowle（1991,Nature 352:548−549）の方法を、こ
のために使用した。クローニングを容易にするために、
制限酵素EcoR Iのための解裂部位はその５′末端におい
て挿入され、そして制限酵素Hind IIIのための解裂部位
はその３′末端において挿入された。合成された核酸
は、酵素EcoR IとHind IIIにより解裂され、そしてEcoR
Iで事前に消化され、そしてHind IIIで部分的に消化さ
れた（EP−A 0 382 174中に記載された）発現ベクターp
A27fdでライゲートされた。このライゲーション調製物
を、ヘルパー・プラスミドpUBS520（Brinkmann et al.,
Gene 85（1989）,109−114）と共にE.coli内で形質転換
した。
al.（Nature 303:821,1983）により公表された配列に基
づいて、そして特にその５′部分内にいくらかの修飾を
取り込むことにより合成した（配列番号:4）。Beattie
and Fowle（1991,Nature 352:548−549）の方法を、こ
のために使用した。クローニングを容易にするために、
制限酵素EcoR Iのための解裂部位はその５′末端におい
て挿入され、そして制限酵素Hind IIIのための解裂部位
はその３′末端において挿入された。合成された核酸
は、酵素EcoR IとHind IIIにより解裂され、そしてEcoR
Iで事前に消化され、そしてHind IIIで部分的に消化さ
れた（EP−A 0 382 174中に記載された）発現ベクターp
A27fdでライゲートされた。このライゲーション調製物
を、ヘルパー・プラスミドpUBS520（Brinkmann et al.,
Gene 85（1989）,109−114）と共にE.coli内で形質転換
した。
これらのクローンを、プラスミド仲介アンピシリン及
びカナマイシン耐性により選択した。得られたプラスミ
ドpNGF23fdは、約400bpのサイズをもつ出発プラスミドp
A27fdよりも小さなEcoR I/Hind III断片を含む。
びカナマイシン耐性により選択した。得られたプラスミ
ドpNGF23fdは、約400bpのサイズをもつ出発プラスミドp
A27fdよりも小さなEcoR I/Hind III断片を含む。
ｂ）E.coliにおける発現 発現アウトプットを調べるために、プラスミドpNGF23
fdとpUBS520で形質転換したE.coli株を、550nmのODまで
（各々、50μg/μｌの最終濃度における）アンピシリン
とカナマイシンの存在下、LB培地（Sambrook et al.,19
89,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor）中で培養
した。発現を5mM IPTGの添加により開始した。この培養
物をさらに４時間インキュベートした。その後、このE.
coliを遠心分離により集め、そしてバッファー（50mM T
ris−HCl pH8,50mM EDTA）中に再懸濁させ；このE.coli
を音波処理により溶解した。不溶性のタンパク質画分を
遠心分離により再び集め、そして音波処理により上述の
バッファー中に再懸濁させた。1/4容量の適用バッファ
ー（250mM Tris−HCl pH6.8,0.01M EDTA,5％SDS,5％メ
ルカプトエタノール、50％グリセロール及び0.005％ブ
ロモフェノール・ブルー）を、上記懸濁液に添加し、そ
して12.5％SDSポリアクリルアミド・ゲルの助けを借り
て分析した。IPTGがそれに添加されていないE.coliの培
養物（pNGF23fd,pUBS520）を使用した同一の調製を、対
照として行い、そしてポリアクリルアミド・ゲルに適用
した。IPTGに誘導された培養の調製物においては、約14
kDの（Biorad“Ｈ＋L"の標準タンパク質混合物に比較し
て）分子量をもつ透明のバンドが、（30％メタノールと
10％酢酸中に溶解された）0.2％Coomassie blue R250で
上記ゲルを染色した後に見られる。このバンドは、上記
の非誘導E.coli細胞の調製物中には見られなかった。
fdとpUBS520で形質転換したE.coli株を、550nmのODまで
（各々、50μg/μｌの最終濃度における）アンピシリン
とカナマイシンの存在下、LB培地（Sambrook et al.,19
89,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor）中で培養
した。発現を5mM IPTGの添加により開始した。この培養
物をさらに４時間インキュベートした。その後、このE.
coliを遠心分離により集め、そしてバッファー（50mM T
ris−HCl pH8,50mM EDTA）中に再懸濁させ；このE.coli
を音波処理により溶解した。不溶性のタンパク質画分を
遠心分離により再び集め、そして音波処理により上述の
バッファー中に再懸濁させた。1/4容量の適用バッファ
ー（250mM Tris−HCl pH6.8,0.01M EDTA,5％SDS,5％メ
ルカプトエタノール、50％グリセロール及び0.005％ブ
ロモフェノール・ブルー）を、上記懸濁液に添加し、そ
して12.5％SDSポリアクリルアミド・ゲルの助けを借り
て分析した。IPTGがそれに添加されていないE.coliの培
養物（pNGF23fd,pUBS520）を使用した同一の調製を、対
照として行い、そしてポリアクリルアミド・ゲルに適用
した。IPTGに誘導された培養の調製物においては、約14
kDの（Biorad“Ｈ＋L"の標準タンパク質混合物に比較し
て）分子量をもつ透明のバンドが、（30％メタノールと
10％酢酸中に溶解された）0.2％Coomassie blue R250で
上記ゲルを染色した後に見られる。このバンドは、上記
の非誘導E.coli細胞の調製物中には見られなかった。
実施例２ 封入体（inclusion bodies（＝IBs））の調製 組換えNGFを含むIBsを調製するために、実施例１に記
載したE.coli発現株を、10lファーメンター内で８時間
発酵させた。NGF発現を、発酵開始後約４時間目に対数
増殖期内でIPTGを添加することにより誘導した。
載したE.coli発現株を、10lファーメンター内で８時間
発酵させた。NGF発現を、発酵開始後約４時間目に対数
増殖期内でIPTGを添加することにより誘導した。
690gのバイオマスを、８時間の発酵後の遠心分離によ
り収穫した。バイオマスを、0.7gのリソザイム、７μｇ
のDNase及び0.4mmol/lのMgSO4の添加後に、そして3.51
の0.1mol/lのTris−HCl pH7中に懸濁させ、それを０℃
で20分間インキュベートした。完全な細胞溶解を、その
後に、1,000barにおいて高圧分散により行った。DNase
を再び0.1mg/mlの最終濃度まで上記溶解溶液に添加し、
そして2mmol/lの最終濃度までMgSO4を添加し、そしてこ
の溶液を20℃で30分間インキュベートした。DNase処理
後に、この溶液を、1/2容量の0.6％Brij 35,1.5mol/l N
aCl,60mmol/l EDTA,pH7.0で希釈し、そして氷浴内で20
分間インキュベートした。不溶性成分（Insoluble comp
onents（IBs））をその後に遠心分離により分離した。
この沈殿物を、３倍容量の0.1mol/l Tris−HCl,20mmol/
l EDTA,pH6.5（TEバッファー）中に懸濁させた。20℃で
30分間のインキュベーションの後、上記IBsを遠心分離
により再び収穫した。この沈殿物のその後の再懸濁を、
３倍容量のTEバッファー中で行った。20℃で30分間のイ
ンキュベーションの後、このIBsを、追加の遠心分離に
より上記沈殿物中で得た。
り収穫した。バイオマスを、0.7gのリソザイム、７μｇ
のDNase及び0.4mmol/lのMgSO4の添加後に、そして3.51
の0.1mol/lのTris−HCl pH7中に懸濁させ、それを０℃
で20分間インキュベートした。完全な細胞溶解を、その
後に、1,000barにおいて高圧分散により行った。DNase
を再び0.1mg/mlの最終濃度まで上記溶解溶液に添加し、
そして2mmol/lの最終濃度までMgSO4を添加し、そしてこ
の溶液を20℃で30分間インキュベートした。DNase処理
後に、この溶液を、1/2容量の0.6％Brij 35,1.5mol/l N
aCl,60mmol/l EDTA,pH7.0で希釈し、そして氷浴内で20
分間インキュベートした。不溶性成分（Insoluble comp
onents（IBs））をその後に遠心分離により分離した。
この沈殿物を、３倍容量の0.1mol/l Tris−HCl,20mmol/
l EDTA,pH6.5（TEバッファー）中に懸濁させた。20℃で
30分間のインキュベーションの後、上記IBsを遠心分離
により再び収穫した。この沈殿物のその後の再懸濁を、
３倍容量のTEバッファー中で行った。20℃で30分間のイ
ンキュベーションの後、このIBsを、追加の遠心分離に
より上記沈殿物中で得た。
IBs中のrh−NGFの量を測定するために、500mgのIBs
（湿重量）を、7.5mol/lグアニジウム−HCl（GdmHCl）
と10mmol/l EDTA,pH6.0の溶液で10mlまで調製し、そし
て２時間懸濁させた。この溶液のタンパク質含量を、ビ
ウレット・タンパク質測定（Boehringer Mannheim,Orde
r No.124281）により測定した。SDSキャピラリー電気泳
動による溶解IBs中でSDSで変性され、そしてDTEで還元
されたタンパク質の分離後、全タンパク質含量に対する
rh−NGFの量を、そのピーク面積と標準NGF（例えば、Bo
ehringer Mannheim,order No.1457614）の面積と比較す
ることにより、又はSDSゲル電気泳動による上記タンパ
ク質の分離後のそのサンプル・レーンの濃度計測によ
り、測定した。10lの発酵ブロスから単離されたIBsは、
約6gのrh−NGFを含んでいた。
（湿重量）を、7.5mol/lグアニジウム−HCl（GdmHCl）
と10mmol/l EDTA,pH6.0の溶液で10mlまで調製し、そし
て２時間懸濁させた。この溶液のタンパク質含量を、ビ
ウレット・タンパク質測定（Boehringer Mannheim,Orde
r No.124281）により測定した。SDSキャピラリー電気泳
動による溶解IBs中でSDSで変性され、そしてDTEで還元
されたタンパク質の分離後、全タンパク質含量に対する
rh−NGFの量を、そのピーク面積と標準NGF（例えば、Bo
ehringer Mannheim,order No.1457614）の面積と比較す
ることにより、又はSDSゲル電気泳動による上記タンパ
ク質の分離後のそのサンプル・レーンの濃度計測によ
り、測定した。10lの発酵ブロスから単離されたIBsは、
約6gのrh−NGFを含んでいた。
実施例３ rh−NGFの可溶化及び誘導体化 ａ）溶解産物（solubilisate）の調製 IBsを、20〜200g IBs/lの濃度において、7.5mol/l Gd
mHCl,0.1mol/l Tris−HCl,10mmol/l EDTA及び0.1mol/l
DTT,pH8.5の溶液中に懸濁させ、そして20〜25℃におい
て２時間撹拌した。その後、この溶液を25％HClでpH3に
調整し、そして約４℃に冷却した。このやり方で得られ
た溶解産物を、６〜10容量の7.5mol/l GdmHCl,10mmol/l
EDTA,pH3に対して10kDaの排除限界をもつ限外濾過膜を
通して向流濾過装置内で約４℃でダイアフィルトレート
し、又は上記透析チューブ内で同一バッファーに対して
数回透析した。
mHCl,0.1mol/l Tris−HCl,10mmol/l EDTA及び0.1mol/l
DTT,pH8.5の溶液中に懸濁させ、そして20〜25℃におい
て２時間撹拌した。その後、この溶液を25％HClでpH3に
調整し、そして約４℃に冷却した。このやり方で得られ
た溶解産物を、６〜10容量の7.5mol/l GdmHCl,10mmol/l
EDTA,pH3に対して10kDaの排除限界をもつ限外濾過膜を
通して向流濾過装置内で約４℃でダイアフィルトレート
し、又は上記透析チューブ内で同一バッファーに対して
数回透析した。
ｂ）溶解産物からの誘導体の調製（技術の現状） 実施例3aにおいて得られたDTTを含まない透析された
溶解産物を、20mmol/l GSSGと混合し、そして1mol/l Tr
isの溶液での滴定によりpH7.5に調整した。得られた混
合物を、約20〜25℃で２時間インキュベートし、そして
次に25％HClでpH6に調整し、そして約４℃に冷却した。
このやり方で得られた誘導体を、６〜10容量の7.5mol/l
GdmHCl,10mmol/l EDTA,pH6に対して10kDaの排除限界を
もつ限外濾過膜を横切る向流濾過装置内で約４℃におい
てダイアフィルトレートし、又は上記透析チューブ内で
同一バッファーに対して数回透析した。
溶解産物を、20mmol/l GSSGと混合し、そして1mol/l Tr
isの溶液での滴定によりpH7.5に調整した。得られた混
合物を、約20〜25℃で２時間インキュベートし、そして
次に25％HClでpH6に調整し、そして約４℃に冷却した。
このやり方で得られた誘導体を、６〜10容量の7.5mol/l
GdmHCl,10mmol/l EDTA,pH6に対して10kDaの排除限界を
もつ限外濾過膜を横切る向流濾過装置内で約４℃におい
てダイアフィルトレートし、又は上記透析チューブ内で
同一バッファーに対して数回透析した。
ｃ）IBsからの直接的な誘導体の調製 （本発明に係る方法） IBsを、20〜200gのIBs/lの濃度において7.5mol/l Gdm
HCl,0.1mol/l Tris−HCl,10〜200mmol/l GSSG,10mmol/l
EDTA,pH6の溶液中で懸濁させ、そして20〜25℃で３時
間撹拌した。その後、このやり方で得られた誘導体を、
６〜10容量の7.5mol/l GdmHCl,10mmol/l EDTA,pH6に対
して10kDaの排除限界をもつ限外濾過膜を横切る向流濾
過装置内で約４℃においてダイアフィルトレートし、又
は上記透析チューブ内で同一バッファーに対して数回透
析した。
HCl,0.1mol/l Tris−HCl,10〜200mmol/l GSSG,10mmol/l
EDTA,pH6の溶液中で懸濁させ、そして20〜25℃で３時
間撹拌した。その後、このやり方で得られた誘導体を、
６〜10容量の7.5mol/l GdmHCl,10mmol/l EDTA,pH6に対
して10kDaの排除限界をもつ限外濾過膜を横切る向流濾
過装置内で約４℃においてダイアフィルトレートし、又
は上記透析チューブ内で同一バッファーに対して数回透
析した。
IBsの直接的な誘導体化を、上記誘導体化の間３〜10
のpH値において、そしてダイアフィルトレーションの間
pH6において同様のやり方で行い、そのpH値を、透析前
６にNaOH又はHClで調整した。６未満のpHの場合、GSSG
濃度を300mmol/lに高めた。存在するかもしれない未溶
解GSSGを、上記誘導体化の開始前に遠心分離により除去
した。
のpH値において、そしてダイアフィルトレーションの間
pH6において同様のやり方で行い、そのpH値を、透析前
６にNaOH又はHClで調整した。６未満のpHの場合、GSSG
濃度を300mmol/lに高めた。存在するかもしれない未溶
解GSSGを、上記誘導体化の開始前に遠心分離により除去
した。
完結した誘導体化の検出を、SDSゲル電気泳動及び質
量分析（MALDI−MS）により行った。これは、実施例3c
により得られた誘導体化の程度は、上記誘導体化の間、
そのpH値から独立して、従来技術に従って行われた誘導
体化（実施例3b）よりもかなり高かった。
量分析（MALDI−MS）により行った。これは、実施例3c
により得られた誘導体化の程度は、上記誘導体化の間、
そのpH値から独立して、従来技術に従って行われた誘導
体化（実施例3b）よりもかなり高かった。
上記誘導体及び溶解産物の再生挙動を、新鮮材料及び
４℃で保存された材料を用いて調べた（詳細については
実施例４を参照のこと）。実施例3cに従って調製された
誘導体は、生産の間、そのpH値に独立して４週間後、変
更されていない再生挙動を示したけれども（初期値の約
100％の収率）、溶解産物（3a）の再生収率は約60％ま
で減少し、そして従来技術に従って調製された誘導体
（3b）は約80％まで減少した。これは、上記MALDI−MS
データに対応し、すなわち、予測されるように、上記誘
導体の安定性は誘導体の程度に依存する。
４℃で保存された材料を用いて調べた（詳細については
実施例４を参照のこと）。実施例3cに従って調製された
誘導体は、生産の間、そのpH値に独立して４週間後、変
更されていない再生挙動を示したけれども（初期値の約
100％の収率）、溶解産物（3a）の再生収率は約60％ま
で減少し、そして従来技術に従って調製された誘導体
（3b）は約80％まで減少した。これは、上記MALDI−MS
データに対応し、すなわち、予測されるように、上記誘
導体の安定性は誘導体の程度に依存する。
実施例４ rh−NGFの再生 実施例３において調製した溶解産物／誘導体から生物
学的に活性なrh−NGFを調製するために、不活性な可溶
性形態のrh−NGFを含む溶液を、1mol/l Tris−HCl,0.5m
ol/lアルギニン、1mmol/l EDTA,1mmol/l GSH,pH9.1から
成る再生バッファー中約４℃において20−〜500−倍に
希釈した。
学的に活性なrh−NGFを調製するために、不活性な可溶
性形態のrh−NGFを含む溶液を、1mol/l Tris−HCl,0.5m
ol/lアルギニン、1mmol/l EDTA,1mmol/l GSH,pH9.1から
成る再生バッファー中約４℃において20−〜500−倍に
希釈した。
再生rh−NGFを検出するために、上記混合物を、POROS
RI/Hカラム（2.1×100mm,Perseptive Biosystems,Frei
burg,Germany）上で逆相クロマトグラフィーにより24時
間のインキュベーション期間の後に定量した。H2O（0.1
％TFA）中の５％アセトニトリルは出発バッファーとし
て役立ち、その溶離を、1ml/分の流速において20分間、
H2O（0.1％TFA）中の80％アセトニトリルまでのグラジ
エントを用いて行った。生来のNGFを、バイオアッセイ
において上記溶出画分を評価することにより同定した
（以下、参照）。
RI/Hカラム（2.1×100mm,Perseptive Biosystems,Frei
burg,Germany）上で逆相クロマトグラフィーにより24時
間のインキュベーション期間の後に定量した。H2O（0.1
％TFA）中の５％アセトニトリルは出発バッファーとし
て役立ち、その溶離を、1ml/分の流速において20分間、
H2O（0.1％TFA）中の80％アセトニトリルまでのグラジ
エントを用いて行った。生来のNGFを、バイオアッセイ
において上記溶出画分を評価することにより同定した
（以下、参照）。
ニワトリの胚（胚第８日目）の解離した背面根神経節
（dissociated dorsal root ganglia）からの感覚神経
を刺激し樹状突起を作り出すrh−NGFの能力（＝DRGテス
ト＝背面根神経節アッセイ、Levi−Montalcini,R.,Meye
r,H.and Hamburger,V.1954,Cancer Res.14,49−57;Varo
n,S.,Nomura,J.,Perez−Palo,J.R.and Shooter,E.M.,19
72,Meth.in Neurochemistry 3,203−229;EP−A 033567
3,p 14−15,example C）を、上記HPLC画分中で又は再生
溶液中で直接的に、再生された生物学的に活性なrh−NG
Fの濃度を測定するために使用した。
（dissociated dorsal root ganglia）からの感覚神経
を刺激し樹状突起を作り出すrh−NGFの能力（＝DRGテス
ト＝背面根神経節アッセイ、Levi−Montalcini,R.,Meye
r,H.and Hamburger,V.1954,Cancer Res.14,49−57;Varo
n,S.,Nomura,J.,Perez−Palo,J.R.and Shooter,E.M.,19
72,Meth.in Neurochemistry 3,203−229;EP−A 033567
3,p 14−15,example C）を、上記HPLC画分中で又は再生
溶液中で直接的に、再生された生物学的に活性なrh−NG
Fの濃度を測定するために使用した。
HPLC画分を、48ウェル・プレート内で1:2希釈段階に
おいて、Ｃ＝100ng/ml〜Ｃ＝100pg/mlの濃度における一
連の希釈においてテストした。この方法において、300
μｌの培地（F14培地;Coon,M.G.and Weiβ,M.G.,1969,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 62,852−859）及び100μｌ細胞
懸濁液、プラス100μｌの上述の希釈物（＝最終濃度Ｃ
＝20ng/ml〜Ｃ＝20pg/ml）を、Falcon Co.からの細胞培
養プレート内で混合し、そして37℃及び3.5％CO2におい
て48時間インキュベートした。樹状突起を形成していた
細胞数を、生物学的活性の尺度として定量した。マウス
の上顎下腺（submaxillaris glands）からの2.5s NGFの
既知濃度の溶液（Boehringer Mannheim Co.）を、参照
として使用した。再生調製物を、遠心分離そして場合に
よりF14培地による事前希釈後に、同様に調べた。
おいて、Ｃ＝100ng/ml〜Ｃ＝100pg/mlの濃度における一
連の希釈においてテストした。この方法において、300
μｌの培地（F14培地;Coon,M.G.and Weiβ,M.G.,1969,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 62,852−859）及び100μｌ細胞
懸濁液、プラス100μｌの上述の希釈物（＝最終濃度Ｃ
＝20ng/ml〜Ｃ＝20pg/ml）を、Falcon Co.からの細胞培
養プレート内で混合し、そして37℃及び3.5％CO2におい
て48時間インキュベートした。樹状突起を形成していた
細胞数を、生物学的活性の尺度として定量した。マウス
の上顎下腺（submaxillaris glands）からの2.5s NGFの
既知濃度の溶液（Boehringer Mannheim Co.）を、参照
として使用した。再生調製物を、遠心分離そして場合に
よりF14培地による事前希釈後に、同様に調べた。
実施例５ FXプロテアーゼ遺伝子の触媒ドメインのクローニング
（プラスミド:pFX−CD） 方 法 組換えDNA技術 Sambrook,J.et al.（1989）In:Molecular cloning:A
Laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,Cold Spring Harbor,New York中に記載されたよう
な標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。こ
れらの分子生物学の試薬を、製造者に指示書に従って使
用した。
（プラスミド:pFX−CD） 方 法 組換えDNA技術 Sambrook,J.et al.（1989）In:Molecular cloning:A
Laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess,Cold Spring Harbor,New York中に記載されたよう
な標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。こ
れらの分子生物学の試薬を、製造者に指示書に従って使
用した。
タンパク質の測定 プロテアーゼ変異体fFX−EGF2−AP−CDのタンパク質
濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算したモル消光
係数（ε＝43480cm2/mol）を使用して280nmにおいて吸
光度（OD）を測定することにより測定した。
濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算したモル消光
係数（ε＝43480cm2/mol）を使用して280nmにおいて吸
光度（OD）を測定することにより測定した。
発現ベクター 血液凝固プロテアーゼ変異体の発現のためのベクター
は、コアーストレプトアビジンのための発現ベクターpS
AM−COREに基づく。このプラスミドｐ−SAM−COREの調
製及び説明は、WO 93/09144中Kopetzki,E.et al.,によ
り記載されている。
は、コアーストレプトアビジンのための発現ベクターpS
AM−COREに基づく。このプラスミドｐ−SAM−COREの調
製及び説明は、WO 93/09144中Kopetzki,E.et al.,によ
り記載されている。
コアーストレプトアビジン遺伝子は、pSAM−COREベク
ター内の所望のプロテアーゼ変異体遺伝子により置き替
えられた。
ター内の所望のプロテアーゼ変異体遺伝子により置き替
えられた。
クローニング アミノ酸217〜454位のFXプロテアーゼ・ドメインをコ
ードする649〜1362位のFX cDNA（Kaul,R.K.et al.,（Ge
ne 41（1986）311−314の公表に従ったcDNA配列及びア
ミノ酸配列の番号付け）を、以下のPCRプライマーN1
（配列番号:1）とN2（配列番号:2）： 及び鋳型DNAとしてStratagene Company（La Jolla,CA,
U.S.A.）から商業的に入手可能なヒト肝臓cDNA遺伝子バ
ンク（ベクター：ラムダZAP II）を使用して、Mullis,
K.B.and Faloona,F.A.,（Methods Enzymol.155,（198
7）350−355）の方法に従うポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）において増幅した。これらのPCRプライマーは、その
コーティング領域の５′末端において単一のBspH I解裂
部位及びATG開始コドンを、そしてそのコーディング領
域の３′末端において単一のHind III解裂部位を導入し
た。
ードする649〜1362位のFX cDNA（Kaul,R.K.et al.,（Ge
ne 41（1986）311−314の公表に従ったcDNA配列及びア
ミノ酸配列の番号付け）を、以下のPCRプライマーN1
（配列番号:1）とN2（配列番号:2）： 及び鋳型DNAとしてStratagene Company（La Jolla,CA,
U.S.A.）から商業的に入手可能なヒト肝臓cDNA遺伝子バ
ンク（ベクター：ラムダZAP II）を使用して、Mullis,
K.B.and Faloona,F.A.,（Methods Enzymol.155,（198
7）350−355）の方法に従うポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）において増幅した。これらのPCRプライマーは、その
コーティング領域の５′末端において単一のBspH I解裂
部位及びATG開始コドンを、そしてそのコーディング領
域の３′末端において単一のHind III解裂部位を導入し
た。
約740bp長のPCR産物を、制限エンドヌクレアーゼBspH
IとHind IIIで消化し、そして約725bp長のBspH I/Hind
III−FX断片を、アガロース・ゲル電気泳動による精製
後に約2.55kbp長のNco I/Hind III−pSAM−COREベクタ
ー断片にライゲートした。望ましいプラスミドpFX−CD
を、制限マッピングにより同定し、そしてPCRにより単
離されたFX cDNA配列を、DNA配列決定によりチェックし
た。
IとHind IIIで消化し、そして約725bp長のBspH I/Hind
III−FX断片を、アガロース・ゲル電気泳動による精製
後に約2.55kbp長のNco I/Hind III−pSAM−COREベクタ
ー断片にライゲートした。望ましいプラスミドpFX−CD
を、制限マッピングにより同定し、そしてPCRにより単
離されたFX cDNA配列を、DNA配列決定によりチェックし
た。
実施例６ EGF2ドメイン、活性化ペプチド及び触媒的ドメインを
もつFXプロテアーゼ遺伝子のクローニング（プラスミ
ド:pFX−EGF2−AP−CD） アミノ酸108〜454位の、EGF2ドメイン、活性化ペプチ
ド及び触媒的プロテアーゼ・ドメインをコードする、bp
位322〜1362のFX cDNAを、以下のPCRプライマーN3（配
列番号:3）： 及び鋳型DNAとしてStratagen Companyからの商業的に入
手可能なヒト肝臓cDNA遺伝子バンク（ベクター：ラムダ
ZAP II）を使用して、PCRにより増幅した。これらのPC
Rプライマーは、そのコーディング領域の５′末端にお
いてATG開始コドン及び単一のEcoR I解裂部位及び、そ
してそのコーディング領域の３′末端において単一のHi
nd III解裂部位を導入した。
もつFXプロテアーゼ遺伝子のクローニング（プラスミ
ド:pFX−EGF2−AP−CD） アミノ酸108〜454位の、EGF2ドメイン、活性化ペプチ
ド及び触媒的プロテアーゼ・ドメインをコードする、bp
位322〜1362のFX cDNAを、以下のPCRプライマーN3（配
列番号:3）： 及び鋳型DNAとしてStratagen Companyからの商業的に入
手可能なヒト肝臓cDNA遺伝子バンク（ベクター：ラムダ
ZAP II）を使用して、PCRにより増幅した。これらのPC
Rプライマーは、そのコーディング領域の５′末端にお
いてATG開始コドン及び単一のEcoR I解裂部位及び、そ
してそのコーディング領域の３′末端において単一のHi
nd III解裂部位を導入した。
約1.09kbp長のPCR産物を、制限エンドヌクレアーゼEc
oR IとHind IIIで消化し、そして約1.02kbp長のEcoR I/
BstE II−FX断片を、アガロース・ゲル電気泳動による
精製後に約2.58kbp長のEcoR I/BstE II−pFX−CDベクタ
ー断片にライゲートした。望ましいプラスミドpFX−EGF
2−AP−CDを、制限マッピングにより同定し、そしてPCR
により単離されたFX cDNA配列を、DNA配列決定によりチ
ェックした。
oR IとHind IIIで消化し、そして約1.02kbp長のEcoR I/
BstE II−FX断片を、アガロース・ゲル電気泳動による
精製後に約2.58kbp長のEcoR I/BstE II−pFX−CDベクタ
ー断片にライゲートした。望ましいプラスミドpFX−EGF
2−AP−CDを、制限マッピングにより同定し、そしてPCR
により単離されたFX cDNA配列を、DNA配列決定によりチ
ェックした。
実施例７ ａ）E.coliにおけるプロテアーゼ遺伝子の発現 上記プロテアーゼ遺伝子を発現させるために、E.coli
K12株（例えば、UT5600 Grodberg,J.and Dunn,J.J.Bac
teriol.170（1988）1245−1253）を、発現プラスミドpF
X−EGF2−AP−CD（実施例６において記載されたもの、
アンピシリン耐性）により、そしてlacIqレプレッサー
・プラスミドpUBS520（カナマイシン耐性、調製及び説
明については、Brinkmann,U.et al.,Gene 85（1989）10
9−114を参照のこと）により、形質転換した。
K12株（例えば、UT5600 Grodberg,J.and Dunn,J.J.Bac
teriol.170（1988）1245−1253）を、発現プラスミドpF
X−EGF2−AP−CD（実施例６において記載されたもの、
アンピシリン耐性）により、そしてlacIqレプレッサー
・プラスミドpUBS520（カナマイシン耐性、調製及び説
明については、Brinkmann,U.et al.,Gene 85（1989）10
9−114を参照のこと）により、形質転換した。
形質転換されたUT5600/pUBS520/pFX−EGF2−AP−CD細
胞を、0.6〜0.9の、550nmにおける吸光度（OD550）まで
37℃において、50〜100mg/lのアンピシリン及び50mg/l
のカナマイシンを含むDYT培地（１％（w/v）酵母エキ
ス、１％（w/v）Bacto Tryptone,Difco及び0.5％NaCl）
中、振とう培養において培養し、そしてその後IPTG（最
終濃度１〜5mmol/l）により誘導した。37℃において４
〜８時間（ｈ）の導入期の後、これらの細胞を、遠心分
離により収穫し（Sorvall RC−5B遠心分離機、GS 3ロー
ター、6000rpm、15分間）、50mmol/l Tris−HClバッフ
ァーpH7.2で洗浄し、そしてさらなるプロセッシングま
で−20℃で保存した。1l振とう培養からの細胞収率は４
〜5g（湿重量）であった。
胞を、0.6〜0.9の、550nmにおける吸光度（OD550）まで
37℃において、50〜100mg/lのアンピシリン及び50mg/l
のカナマイシンを含むDYT培地（１％（w/v）酵母エキ
ス、１％（w/v）Bacto Tryptone,Difco及び0.5％NaCl）
中、振とう培養において培養し、そしてその後IPTG（最
終濃度１〜5mmol/l）により誘導した。37℃において４
〜８時間（ｈ）の導入期の後、これらの細胞を、遠心分
離により収穫し（Sorvall RC−5B遠心分離機、GS 3ロー
ター、6000rpm、15分間）、50mmol/l Tris−HClバッフ
ァーpH7.2で洗浄し、そしてさらなるプロセッシングま
で−20℃で保存した。1l振とう培養からの細胞収率は４
〜5g（湿重量）であった。
ｂ）発現分析 各ケースにおいて1mlの遠心分離された培養基からの
細胞ペレット（UT5600/pUBS520/pFX−EGF2−AP−CD細
胞）を、0.25mlの10mmol/l Tris−HCl,pH7.2中に再懸濁
し、そしてこれらの細胞を、Branson Company（Heusens
tamm,Germany）からのSonifier Cell Disruptor B15を
使用した超音波処理（50％強度において30秒間の２パル
ス）により溶解した。不溶性の細胞成分を、沈殿させ
（Eppendorf 5415遠心分離機、14000rpm、５分間）、そ
して1/5容量（vol）の５×SDSサンプル・バッファー
（１×SDSサンプル・バッファー:50mmol/l Tris−HCl,p
H6.8,1％SDS,1％メルカプトエタノール、10％グリセロ
ール、0.001％ブロモフェノール・ブルー）を、その上
清に添加した。この不溶性の細胞死骸画分（ペレット）
を、６〜8Mウレアを含む0.3ml 1×SDSサンプル・バッフ
ァー中に再懸濁させ、そのサンプルを95℃において５分
間インキュベートし、そして再び遠心分離した。その
後、これらのタンプク質をSDSポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.K.,Nature 227（197
0）680−685）により分離し、そしてCoomassie Brillia
nt Blue R染料で染色した。
細胞ペレット（UT5600/pUBS520/pFX−EGF2−AP−CD細
胞）を、0.25mlの10mmol/l Tris−HCl,pH7.2中に再懸濁
し、そしてこれらの細胞を、Branson Company（Heusens
tamm,Germany）からのSonifier Cell Disruptor B15を
使用した超音波処理（50％強度において30秒間の２パル
ス）により溶解した。不溶性の細胞成分を、沈殿させ
（Eppendorf 5415遠心分離機、14000rpm、５分間）、そ
して1/5容量（vol）の５×SDSサンプル・バッファー
（１×SDSサンプル・バッファー:50mmol/l Tris−HCl,p
H6.8,1％SDS,1％メルカプトエタノール、10％グリセロ
ール、0.001％ブロモフェノール・ブルー）を、その上
清に添加した。この不溶性の細胞死骸画分（ペレット）
を、６〜8Mウレアを含む0.3ml 1×SDSサンプル・バッフ
ァー中に再懸濁させ、そのサンプルを95℃において５分
間インキュベートし、そして再び遠心分離した。その
後、これらのタンプク質をSDSポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動（PAGE）（Laemmli,U.K.,Nature 227（197
0）680−685）により分離し、そしてCoomassie Brillia
nt Blue R染料で染色した。
E.coli内で合成されたFX−EGF2−AP−CDプロテアーゼ
変異体は同質であり、そして上記不溶性細胞死骸画分
（封入体、IBs）中にのみ存在した。この発現収率は、
全E.coliタンパク質に対して約50％であった。
変異体は同質であり、そして上記不溶性細胞死骸画分
（封入体、IBs）中にのみ存在した。この発現収率は、
全E.coliタンパク質に対して約50％であった。
実施例８ 細胞溶解、可溶化、及び封入体（IBs）の調製 3l振とう培養からの細胞ペレット約（15g湿重量）を7
5mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2中に再懸濁させた。こ
の懸濁液を0.25mg/mlリソゲイムと混合し、そしてそれ
を０℃で30分間インキュベートした。2mmol/l MgCl2と1
0μg/ml DNase I（Boehringer Mannheim GmbH、カタロ
グNo.104159）の添加後、これらの細胞を、SLM Amico C
ompany（Urbana,IL,USA）からのfrench Press中での高
圧分散により機械的に破壊した。その後、このDNAを室
温（RT）で30分間消化した。37.5mlの50mmol/l Tris−H
Cl pH7.2,60mmol/l EDTA,1.5mol/l NaCl,6％Brij X−10
0をこの調製物に添加し、それをRTでさらに30分間イン
キュベートし、そしてSorvall RC−5B遠心分離機内で遠
心分離した（GSA Roter,12000rpm、15分間）。この上清
を捨て、100mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2,20mmol/l E
DTAをこのペレットに添加し、それを、撹拌しながら４
℃において30分間インキュベートし、そして再び沈殿さ
せた。最後の洗浄工程を繰り返した。精製されたIBs
（1.5〜2.0g湿重量、20〜30％乾燥質量、100〜150mgプ
ロテアーゼ）をさらなるプロセッシングまで−20℃で保
存した。
5mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2中に再懸濁させた。こ
の懸濁液を0.25mg/mlリソゲイムと混合し、そしてそれ
を０℃で30分間インキュベートした。2mmol/l MgCl2と1
0μg/ml DNase I（Boehringer Mannheim GmbH、カタロ
グNo.104159）の添加後、これらの細胞を、SLM Amico C
ompany（Urbana,IL,USA）からのfrench Press中での高
圧分散により機械的に破壊した。その後、このDNAを室
温（RT）で30分間消化した。37.5mlの50mmol/l Tris−H
Cl pH7.2,60mmol/l EDTA,1.5mol/l NaCl,6％Brij X−10
0をこの調製物に添加し、それをRTでさらに30分間イン
キュベートし、そしてSorvall RC−5B遠心分離機内で遠
心分離した（GSA Roter,12000rpm、15分間）。この上清
を捨て、100mlの50mmol/l Tris−HCl,pH7.2,20mmol/l E
DTAをこのペレットに添加し、それを、撹拌しながら４
℃において30分間インキュベートし、そして再び沈殿さ
せた。最後の洗浄工程を繰り返した。精製されたIBs
（1.5〜2.0g湿重量、20〜30％乾燥質量、100〜150mgプ
ロテアーゼ）をさらなるプロセッシングまで−20℃で保
存した。
実施例９ IBsの溶解及び還元／誘導体化及び透析 精製されたIBsを、6mol/lグアニジニウム−HCl,100mm
ol/l Tris−HCl,20mmol/l EDTA,pH8.0中の５〜10mg/ml
タンパク質に一致する100mg IBペレット（湿重量）の濃
度で懸濁し、そしてアリコートを、室温で１〜３時間以
内に200mmol/l GSSG又は200mmol/l GSHの存在中撹拌し
ながら溶解した。その後そのpHをpH5.0に調整し、そし
て不溶性成分を遠心分離により分離し（Sorvall RC−5B
遠心分離機、SS34ローター、16000rpm、15分間）により
分離し、そして6mol/lグアニジニウム−HCl pH5.0に対
して４℃で24時間透析した。この誘導体化をSDS−PAGE
により検出した。
ol/l Tris−HCl,20mmol/l EDTA,pH8.0中の５〜10mg/ml
タンパク質に一致する100mg IBペレット（湿重量）の濃
度で懸濁し、そしてアリコートを、室温で１〜３時間以
内に200mmol/l GSSG又は200mmol/l GSHの存在中撹拌し
ながら溶解した。その後そのpHをpH5.0に調整し、そし
て不溶性成分を遠心分離により分離し（Sorvall RC−5B
遠心分離機、SS34ローター、16000rpm、15分間）により
分離し、そして6mol/lグアニジニウム−HCl pH5.0に対
して４℃で24時間透析した。この誘導体化をSDS−PAGE
により検出した。
実施例10 還元／誘導体化に対するFX−EGF2−AP−CDの再生の独立
性 6mol/lのグアニジニウムHCl中に可溶化され、そして1
00mmol/l DTEで還元され、又はさまざまな濃度のGSSG/G
SHで誘導体化されたFX−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異
体を、各ケースにおいて5ml再生バッファー（50mmol/l
Tris−HCl、0.6mol/lアルギニン/10mmol/l CaCl2/2mmol
/l EDTA/2mmol/l GSH/0.5mmol/l GSSG,pH8.5）に50μl
IB溶解産物／誘導体を一回添加することにより４℃で
再生した。
性 6mol/lのグアニジニウムHCl中に可溶化され、そして1
00mmol/l DTEで還元され、又はさまざまな濃度のGSSG/G
SHで誘導体化されたFX−EGF2−AP−CDプロテアーゼ変異
体を、各ケースにおいて5ml再生バッファー（50mmol/l
Tris−HCl、0.6mol/lアルギニン/10mmol/l CaCl2/2mmol
/l EDTA/2mmol/l GSH/0.5mmol/l GSSG,pH8.5）に50μl
IB溶解産物／誘導体を一回添加することにより４℃で
再生した。
再生されたタンパク質を、４℃で８〜16時間、100容
量の50mmol/l Tris−HCl,150mmol/l NaCl,5mmol/lのCaC
l2,0.1％ポリエチレン・グリコール8000（PEG 8000）、
pH8.0に対して２回透析した。沈殿したタンパク質を遠
心分離により分離し（Eppendorf 5415遠心分離機、1400
0rpm、５分間）、そして透明な上清をその活性化のため
に使用した。
量の50mmol/l Tris−HCl,150mmol/l NaCl,5mmol/lのCaC
l2,0.1％ポリエチレン・グリコール8000（PEG 8000）、
pH8.0に対して２回透析した。沈殿したタンパク質を遠
心分離により分離し（Eppendorf 5415遠心分離機、1400
0rpm、５分間）、そして透明な上清をその活性化のため
に使用した。
実施例11 RVV−ＸによるrFX−EGF2−AP−CDプロテアーゼの活性化 各ケースにおいて、上記の再生され、そして透析され
たrFIX−EGF2−AP−CDサンプル1mlを、Sigma Aldrich C
hemie GmbH Co.（Deisenhofen,GFR）からの10μｌのRus
sel'sヘビ独（Rsssel's viper renom（RVV））溶液（20
mmol/l Tris−HCl,pH7.6中に溶解された1mg/ml溶解産
物）と混合し、そして１〜２日間37℃でインキュベート
した。この酵素的rFX−EGF2−AP−CD活性化の時間経過
を、その消化の完了（プラトー、最大活性化）まで発色
性ペプチド基質Chromozym X（実施例12参照）を使用し
てモニターした。このためにサンプル（20μｌ）を４〜
６時間の間隔で反応混合物から採取し、そして生成した
FXa活性を測定した。
たrFIX−EGF2−AP−CDサンプル1mlを、Sigma Aldrich C
hemie GmbH Co.（Deisenhofen,GFR）からの10μｌのRus
sel'sヘビ独（Rsssel's viper renom（RVV））溶液（20
mmol/l Tris−HCl,pH7.6中に溶解された1mg/ml溶解産
物）と混合し、そして１〜２日間37℃でインキュベート
した。この酵素的rFX−EGF2−AP−CD活性化の時間経過
を、その消化の完了（プラトー、最大活性化）まで発色
性ペプチド基質Chromozym X（実施例12参照）を使用し
てモニターした。このためにサンプル（20μｌ）を４〜
６時間の間隔で反応混合物から採取し、そして生成した
FXa活性を測定した。
実施例12 FXa活性テスト 再生され、そして活性化されたrFXa−EGF2−AP−CDの
活性を、Boehringer Mannheim GmbH（Mannheim,GFR、カ
タログNo.789763）からの発色性基質Chromozym Xを使用
して測定した。20μｌサンプルを、マイクロタイター・
プレート内でRTにおいて、180μｌの50mmol/l Tris−HC
l,150mmol/l NaCl,5mmol/l CaCl2,0.1％PEG 8000,pH8.0
及び20μｌの4mmol/l Chromozym Xと混合し、そして線
形初期勾配（ΔA/分）を、ELISAリーダー内で405nmの波
長における吸光計測により測定した。
活性を、Boehringer Mannheim GmbH（Mannheim,GFR、カ
タログNo.789763）からの発色性基質Chromozym Xを使用
して測定した。20μｌサンプルを、マイクロタイター・
プレート内でRTにおいて、180μｌの50mmol/l Tris−HC
l,150mmol/l NaCl,5mmol/l CaCl2,0.1％PEG 8000,pH8.0
及び20μｌの4mmol/l Chromozym Xと混合し、そして線
形初期勾配（ΔA/分）を、ELISAリーダー内で405nmの波
長における吸光計測により測定した。
テスト原理： 計測シグナル:pNA（ｐ−ニトロアニリン） FXa基質:MOC−Ｄ−NleGlyArg−pNA（Chromozym X） テスト混合物:180μｌバッファー ＋ 20μｌ基質（Chromozym X,4mmol/l） ＋ 20μl rFXa−EGF2−AP−CDサンプル 実施例13 再生効率の測定 生成したrFXa−EGF2−AP−CD活性（プラトー値）を再
生効率を計算するために使用した。一連の計測における
最高値は、100％に設定した参照として役立つ。
生効率を計算するために使用した。一連の計測における
最高値は、100％に設定した参照として役立つ。
還元されたタンパク質は、誘導体化されたタンパク質
に比較して約60％の再生収率をもたらす。
に比較して約60％の再生収率をもたらす。
文献一覧 Bailey,J.L.,Cole,R.D.,J.Biol.Chem.234（1959）1733
−1739 Beattie and Fowle,Nature 352（1991）548−549 Biochem.Biophys.Res.Commun.171（1990）116−122 Brinkmann et al.,Gene 85（1989）109−114 Cole,R.D.,Meth.Enzymol.11（1967）206−208 Coon,M.G.and Weiβ,M.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62
（1969）852−859 EP−A 0 093 619 EP−A 0 114 506 EP−A 0 114 507 EP−A 0 241 022 EP−A 0 253 823 EP−A 0 329 175 EP−A 0 335 673 EP−A 0 361 475 EP−A 0 364 926 EP−A 0 370 171 EP−A 0 382 174 EP−A 0 414 151 EP−A 0 450 386 EP−B 0 121 338（USP 5,169,762） Gene 70（1988）57−65 Grodberg,J.;Dunn,J.J.:J.Bacteriol.170（1988）1245
−1253 Heath,W.F.et al.,J.Biol.Chem.267（1992）419−425 Kaul,R.K.,Hildebrand,B.;Roberts,S.;Jagadeeswaran,
P.,Gene 41（1986）311−314 Laemmli,U.K.,Nature 227（1970）680−685 Leibrock et al.,Nature 341（1989）149−152 Levi−M
ontalcini,R.,Meyer,H.and Hamburger,V.,Cancer Res.1
4（1954）49−57 Marston F.A.O.,Biochem.J.214（1986）１−12 Mullis,K.B.;Faloona,F.A.,Methods Enzymol.155（198
7）350−355 Sambrook,J.;Fritsch,E.F.;Maniatis,T.:Molecular Clo
ning:A Laboratory manual.Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor,New York,（1989） Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Sheraga,H.A.,Analyt.Bi
ochem 138（1984）181−188 Thannhauser,T.W.,Scheraga,H.A.,Biochemistry 24（19
85）7681−7688 Ullrich et al.,Nature 303（1983）821−825 US Patent 4,933,434 Varon,S.,Nomura,J.,Perez−Polo,J.R.and Shooter,E.
M.,Meth.in Neurochemistry 3（1972）203−229 Wetzel,R.et al.,Gene 16（1981）63−71 WO 87/02673 WO 91/03568 WO 91/08762 WO 92/22665 WO 93/09144 WO 93/19084 WO 95/30686
−1739 Beattie and Fowle,Nature 352（1991）548−549 Biochem.Biophys.Res.Commun.171（1990）116−122 Brinkmann et al.,Gene 85（1989）109−114 Cole,R.D.,Meth.Enzymol.11（1967）206−208 Coon,M.G.and Weiβ,M.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 62
（1969）852−859 EP−A 0 093 619 EP−A 0 114 506 EP−A 0 114 507 EP−A 0 241 022 EP−A 0 253 823 EP−A 0 329 175 EP−A 0 335 673 EP−A 0 361 475 EP−A 0 364 926 EP−A 0 370 171 EP−A 0 382 174 EP−A 0 414 151 EP−A 0 450 386 EP−B 0 121 338（USP 5,169,762） Gene 70（1988）57−65 Grodberg,J.;Dunn,J.J.:J.Bacteriol.170（1988）1245
−1253 Heath,W.F.et al.,J.Biol.Chem.267（1992）419−425 Kaul,R.K.,Hildebrand,B.;Roberts,S.;Jagadeeswaran,
P.,Gene 41（1986）311−314 Laemmli,U.K.,Nature 227（1970）680−685 Leibrock et al.,Nature 341（1989）149−152 Levi−M
ontalcini,R.,Meyer,H.and Hamburger,V.,Cancer Res.1
4（1954）49−57 Marston F.A.O.,Biochem.J.214（1986）１−12 Mullis,K.B.;Faloona,F.A.,Methods Enzymol.155（198
7）350−355 Sambrook,J.;Fritsch,E.F.;Maniatis,T.:Molecular Clo
ning:A Laboratory manual.Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor,New York,（1989） Thannhauser,T.W.,Konishi,Y.,Sheraga,H.A.,Analyt.Bi
ochem 138（1984）181−188 Thannhauser,T.W.,Scheraga,H.A.,Biochemistry 24（19
85）7681−7688 Ullrich et al.,Nature 303（1983）821−825 US Patent 4,933,434 Varon,S.,Nomura,J.,Perez−Polo,J.R.and Shooter,E.
M.,Meth.in Neurochemistry 3（1972）203−229 Wetzel,R.et al.,Gene 16（1981）63−71 WO 87/02673 WO 91/03568 WO 91/08762 WO 92/22665 WO 93/09144 WO 93/19084 WO 95/30686
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/02 C07K 1/08 C12N 9/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】タンパク質とジスルフィド成分から構成さ
れた混合ジスルフィドの製法であって、不活性・難溶性
形態における上記タンパク質が、変性濃度における変性
剤の溶液と共に、かつ、ジスルフィド成分の存在下で、
事前の還元を伴わずに単一工程においてインキュベー
ト、可溶化、及び誘導体化される、前記製法。 - 【請求項２】原核生物における組換え製造後に得られる
ことができるその不活性・難溶性形態からの生物学的に
活性なタンパク質の製法であって、その不活性・難溶性
形態におけるタンパク質が、ａ）事前の還元を伴わずに
第１のかつ単一の工程において、変性濃度における変性
剤の溶液により、かつ、ジスルフィド成分の存在下で溶
解され、ｂ）第２の工程において、その溶解されたタン
パク質が、上記の強い変性溶液を非変性又は弱い変性溶
液に変更することにより生物学的に活性なコンホメーシ
ョンを呈し、それにより上記ジスルフィド成分とのジス
ルフィド結合が、破壊され、そして上記タンパク質がそ
れを生物学的に活性ならしめるコンホメーションを採用
することができるような方法で、上記タンパク質の分子
内で新たに形成される、前記製法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96109288 | 1996-06-11 | ||
| EP96110109 | 1996-06-22 | ||
| EP96109288.9 | 1996-07-06 | ||
| EP96110109.4 | 1996-07-06 | ||
| PCT/EP1997/003026 WO1997047735A1 (de) | 1996-06-11 | 1997-06-11 | Verfahren zur aktivierung von denaturiertem protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11511759A JPH11511759A (ja) | 1999-10-12 |
| JP3288720B2 true JP3288720B2 (ja) | 2002-06-04 |
Family
ID=26141986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50095798A Expired - Lifetime JP3288720B2 (ja) | 1996-06-11 | 1997-06-11 | 変性タンパク質の活性化方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6342585B1 (ja) |
| EP (1) | EP0904355B1 (ja) |
| JP (1) | JP3288720B2 (ja) |
| KR (1) | KR100305341B1 (ja) |
| AT (1) | ATE260972T1 (ja) |
| AU (1) | AU714318B2 (ja) |
| BR (1) | BR9709569B1 (ja) |
| CA (1) | CA2257122C (ja) |
| DE (1) | DE59711375D1 (ja) |
| ES (1) | ES2214624T3 (ja) |
| TR (1) | TR199802584T2 (ja) |
| WO (1) | WO1997047735A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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