KR100944845B1 - 아민의 존재하에서 높은 단백질 농도에서 이황화물-함유재조합 단백질을 탈변성하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변성되고 화학적으로 개질되거나 환원된 단백질의 용액에, 1차, 2차 또는 3차 아민을 함유하는 리폴딩 완충제를 첨가함을 포함하는 단백질의 탈변성 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 이 방법을, 미리 (i) 카오트로픽제인 구아니디늄 히드로클로라이드의 존재하에서 가용화되고, (ii) 아황산염첨가분해된, 인터루킨-4 및 소 췌장 트립신 저해제(BPTI)에 적용한다.
탈변성, 인터루킨-4, 리폴딩 완충제, 아민, 용해도 증강제.

Description

아민의 존재하에서 높은 단백질 농도에서 이황화물-함유 재조합 단백질을 탈변성하는 방법 {PROCESS FOR RENATURATION OF RECOMBINANT, DISULFIDE CONTAINING PROTEINS AT HIGH PROTEIN CONCENTRATIONS IN THE PRESENCE OF AMINES}
본 발명은 원핵세포에서 발현된 후 이황화물 결합을 함유하는 재조합 진핵세포 단백질의 탈변성 방법에 관한 것이다.
예를 들면 대장균과 같이 이종 발현 시스템에서 재조합 단백질을 형성하는 경우, 이러한 단백질은 종종 불활성 불용성 응집체(소위 "광굴절 소체(refractile body)" 또는 "봉입체")를 형성한다. 또한 이러한 봉입체는 숙주세포 단백질, 핵산 및 내독소 같은 숙주세포 성분, 및 저분자량 오물에 의해 오염된다. 이러한 봉입체의 형성은, 유도 및 단백질 생합성 동안에 이종 단백질이 세포내에 매우 국소적으로 편재되기 때문에 생기는 것이라고 생각된다. 그러나, 문제의 이종 단백질의 1차 아미노산 서열 뿐만 아니라, 산화적 리폴딩(refolding) 동안에 공유 이황화물 결합을 형성하는 시스테인-잔사의 존재도 매우 중요하다. 예를 들면 치료 목적을 위해서, 이러한 표적 단백질을 사용할 수 있게 되기 전에, 봉입체를 정제한 후 3차원 구조를 탈변성시켜 단백질을 생물학적으로 활성이 있는 형태로 전환해야 한다.
통상적으로 사용되는 공정 단계들의 순서는 첫번째로, 고농도의 카오트로픽 (chaotropic) 변성제(예를 들면 구아니디늄 히드로클로라이드 또는 요소)를 첨가하거나, 강산성제(예를 들면 글리신/인산 혼합물)를 첨가함으로써 봉입체를 가용화시킴을 포함한다. 그와 동시에, 봉입체내에 존재하는 분자간 이황화물 결합은 아황산염 및 산화제가 관여하는 소위 아황산염첨가분해(sulfitolysis)에 의해 화학적으로 환원되거나 절단될 수 있다. 두번째로는, 가용화된 단백질 혼합물을 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지되어 있는 크로마토그래피법 또는 여과법으로 추가로 정제할 수 있다.
이어서, 생물학적으로 활성이 있는 형태의 형성을 허용하기 위해, 고농도 카오트로픽제의 존재하에서 선형 단량체성 단백질 용액을 많이 희석한다. 이를 (단순히 다량의 리폴딩 완충제에 희석함으로써) 빠르게 또는 리폴딩 완충제에 대한 정용여과 또는 투석에 의해 느리게 수행할 수 있다. 문헌에 기술된 다른 기법은 표적 단백질을 크로마토그래피 수지상에 흡착시킨 후, 카오트로픽제의 농도를 낮추어 리폴딩이 일어나게 하거나, 크기배제 크로마토그래피법으로 단백질 쇄들을 분리함으로써 응집체 형성 경향을 회피함을 포함한다. 모든 경우에서, 카오트로픽염의 농도는 특정 한계 미만으로 감소되어야 하는데, 그 한계는 표적 단백질에 따라 달라지며, 예를 들면 통상적으로 0.5M 미만의 구아니디늄 히드로클로라이드이다.
리폴딩 동안의 주요 부반응은, 폴딩(folding) 중간체의 국소적 농도에 따라 달라지는 불용성 응집체의 형성이다. 문헌에, 불용성 단백질 응집체의 형성을 효과적으로 억제하는 광범위한 폴딩 보조제, 예를 들면 샤페론(chaperone) 단백질, 기타 유형의 단백질(예를 들면 소 혈청 알부민), 및 몇몇 유형의 비-단백질 물질, 예를 들면 당 및 고리형 당, 단쇄 알콜, 예를 들면 글리세롤, 펜탄올, 헥산올, 효소 기질, 합성 중합체, 세제 및 카오트로픽염이 기술되어 있다(문헌[de Bernardez Clark, E(1998): Curr.Opinion Biotechnol.9: 157-163] 및 여기에서 인용된 참고문헌; 문헌[Lilie H, Schwarz E, Rudolph R(1998): Curr. Opinion Biotechnol.9:947-501] 및 여기에서 인용된 참고문헌; 문헌[Sharma A, Karuppiah N(1998); 1995년 6월 2일에 출원된 미국특허 제 5,728,804 호]을 참조). 근래에 소위 인공 샤페론을 사용하여 소수성 폴딩 중간체를 용액내에 유지하는 상이한 해결 방법이 공개된 바 있다(문헌[Gellman S, Rozema DB(1996): 1994년 10월 31일에 출원된 미국특허 제 5,563,057 호를 참조). 첫번째 단계에서는, 소수성 폴딩 중간체를 세제 미셀내에 갇히게 하여 단백질 응집을 억제한다. 갇힌 폴딩 중간체는 원래 형태로 폴딩될 수가 없다. 두번째 단계에서는, "탈거제(stripping agent)", 예를 들면 상이한 시클로덱스트린 또는 선형 덱스트린을 상당히 많은 몰과량으로 첨가하여 다시 세제를 제거함으로써, 단백질이 그의 생물학적 활성 형태로 리폴딩될 수 있게 허용한다. 이러한 방법은 (1) 값비싼 "탈거제"가 몰과량으로 사용되며, (2) "탈거" 상 동안에 단백질 응집이 일어날 수 있으며, (3) 표적 단백질에 결합된 잔류 세제를 제거하기가 어렵고, (4) 단백질 용량 및 시클로덱스트린의 용해도에 제한이 있고, (5) 인공 샤페론 시스템은 공정 변화에 대해 민감하다는 것(제한된 견고성)과 같은 몇가지 단점을 갖는다. 더우기, 인공 샤페론 시스템은 표적 단백질, 세제 및 "탈거제"의 종류 및 사용된 실험 조건에 대해 특이적이다. 따라서 이용가능한 일반적인 인공 샤페론 시스템은 없다(문헌[Daugherty DL, Rozema D, Hanson PE, Gellman SH(1998): J.Biol.Chem.273: 33961-33971] 및 문헌[Rozema D, Gellman SH(1996): J.Biol.Chem.271:3478-3487]을 참조).
대부분의 전술된 응집 억제제는 제한된 수의 단백질에 대해서만 작용한다. 예외중 하나가 아미노산 L-아르기닌으로서, 이것은 일반적으로 광범위한 상이한 단백질들(예를 들면 t-PA, Fab 단편, 리소짐 및 기타 효소)에 적용가능함이 밝혀졌다(문헌[Rudolph R, Fischer S, Mattes R(1997): Process for the activating of gene-technologically produced, heterologous, disulfide bridge-containing eukaryotic proteins after expression in prokaryotes. 미국특허 제 5,593,865 호]; 문헌[Rudolph R, Fischer S, Mattes R(1995): Process for the activation of T-PA or ING after genetic expression in prokaryotes. 미국특허 제 5,453,363 호]; 및 문헌[de Bernardez Clark, E(1998): Curr. Opinion Biotechnol. 9: 157-163] 및 여기서 인용된 참고문헌을 참조).
L-아르기닌은 수많은 단백질에 대해서, 리폴딩될 단백질의 몰농도에 비해 많은 몰과량으로만 효과적임이 밝혀졌다. L-아르기닌이 단백질 응집체의 형성을 억제하는 메카니즘은 아직 공지되어 있지 않다(문헌[Lilie H 등(1998): Curr.Opinion Biotechnol.9:497-501]을 참조). 더우기, L-아르기닌은 값비싼 키랄 정밀화학약품이다.
따라서, 통상적인 기법을 사용하는 단백질 리폴딩 전략을 개발할 필요가 여전히 있다. 종래 기술의 이러한 사정에서는, 0.5 내지 1g/ℓ이하의 높은 농도에서 단백질의 상업적으로 매력적인 리폴딩 과정에 사용될 수 있는, 일반적으로 이용가 능하고 화학적으로 단순하고 값싼 응집 억제제가 공지되어 있지 않다.
발명의 개요
본 발명의 주제는, 대장균에서의 과다발현에 의해 수득되는 불용성 단백질 응집체(소위 봉입체)로부터 출발해서, 적합하고 화학적으로 단순하고 쉽게 구할 수 있는 응집 억제제를 사용해서 높은 단백질 농도에서 단백질(예를 들면 인터루킨-4 및 그의 유도체)을 탈변성시키는, 상업적으로 매력적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서 기술된 응집 억제제는 그의 비특이성으로 인해서 광범위한 상이한 단백질들에 적용될 수 있다.
본원에서 기술된 방법은 변성되고 화학적으로 개질되거나 환원된 단백질의 용액을, 1차 아민, 더욱 바람직하게는 2차 아민, 또는 치환체 R1, R2 및 R3를 갖는 하기 화학식 1의 3차 아민을 함유하는 리폴딩 완충제에 첨가함을 포함한다.
Figure 112004021482252-pct00001
상기 식에서, R1 및 R2는 리간드 H, O=C-NH2, (CH2)4-NH 2, (CH2)3-COOH, (CH2)2-CHOH-CH3, CH2-CH2-OH, CH2-CH 3, CH3 또는 NH2의 임의의 조합일 수 있다. 잔사 R3는 C(NH2)=NH, C(CH2OH)3, CH2-CH2-OH 또는 H일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 리폴딩 완충제는 단백질 응집체의 형성을 시너지적으로 억제하는 것을 돕는 추가의 용해도 증강제, 예를 들면 추가의 이온, 예를 들면 클로라이드, 또는 더욱 바람직하게는 술페이트 이온을 함유한다.
종래 기술 분야에서는 많은 단백질에 대해서, 탈변성의 경우, 특정 한계값의 단백질 농도를 넘어서는 안 된다는 것이 알려져 있다. 이러한 농도 한계 수준은 리폴딩되는 단백질의 성질에 따라 달라진다. 본 발명에 이르러, 전술된 아민 또는 전술된 아민과 기타 용해도 증강제의 조합이 매우 높은 가용화 용량을 갖기 때문에, 상당히 많은 양의 변성된 단백질도 보다 많은 양의 리폴딩된 단백질을 달성하기 위해 더 많은 양의 용액을 필요로 하지 않는다는 것이 인식되었다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 불활성 단백질을 원래의 형태로 리폴딩함으로써 리폴딩률 및 가용성 단백질의 복원률을 손상시키는 단백질 응집체의 형성을 효과적으로 억제하는 상기 방법, (b) 높은 단백질 농도에서 리폴딩을 허용하는 상기 방법, 및 (c) 값싸고 흔한 비-키랄 화학약품을 사용할 수 있는 상기 방법을 제공하는 것을 포함한다.
본 발명의 전술된 목적 및 기타 목적 및 장점은 다음의 명세서를 통해 명백해질 것이다. 다음 명세서는 바람직한 실시양태를 기술한 것일 뿐이지 모든 가능한 실시양태를 기술한 것은 아니라는 것을 알아야 한다. 본 발명의 완전한 범위를 결정하려면 청구항들을 검토해야 한다.
정의
본원에서 "인터루킨-4 유도체"란, 문헌[Sebald, W(1992): 1992년 11월 13일자 미국특허 제 5,723,118 호 및 유럽특허 613499B1] 및 문헌[Domingues 등(1999): PCT 출원 PCT/IB00/00769]에 따르면, 폴리펩티드쇄의 상이한 위치에서 교 환된 아미노산 잔사를 갖는 인간 인터루킨-4의 돌연변이단백질(mutein)을 말한다.
본원에서 BPTI란 소 췌장 트립신 저해제(아프로티닌이라고도 함)를 말한다.
본원에서 "제대로 폴딩된 단백질"이란 원래의 이황화물 결합을 나타내는 원래 구조의 표적 단백질을 말한다.
본원에서 "리폴딩률"이란 탈변성 혼합물중 제대로 폴딩된 미개질 표적 단백질의 농도(예를 들면 [㎎/ℓ])이다.
본원에서 "총 리폴딩률"이란 제대로 폴딩된 미개질 표적 단백질의 농도(예를 들면 [㎎/ℓ])를 탈변성 혼합물중 총 단백질의 양으로 나눈 것이다. 총 리폴딩률은 [%]로 표현된다.
본원에서 "단백질 복원률" 또는 "가용성 단백질의 복원률"이란 최초 총 단백질에 대한 리폴딩 후 복원된 가용성 단백질의 비이다. 단백질 복원률은 [%]로 표현된다.
본원에서 "순도[%]"는 RP-HPLC에 의해 결정된(실시예 1을 참조) 표적 단백질의 리폴딩률 및 탈변성 혼합물중 가용성 단백질의 농도를 기준으로 계산된다.
본원에서 TRIS란 기본 완충 물질인 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄을 말한다. 본원에서 TEA란 기본 완충 물질인 트리에탄올아민을 말한다. 본원에서 GndHCl이란 카오트로픽염인 구아니디늄 히드로클로라이드를 말한다.
본 발명의 주제는 원핵세포에서의 이종 발현에 의해 생성된 불용성 봉입체를 정제하고, 고농도의 적합한 카오트로픽염에서 변성시키고, 화학적으로 개질시키고( 단백질-SH기와 적합한 메르캅탄 사이에 혼합 이황화물을 형성하거나 아황산염기를 단백질-SH기에 첨가하여 S-SO3기를 형성), 1차 아민, 더욱 바람직하게는 2차 아민, 또는 치환체 R1, R2 및 R3를 갖는 화학식 1의 3차 아민(여기서, R1 및 R2는 리간드 H, O=C-NH2, (CH2)4-NH2, (CH2)3-COOH, (CH2)2-CHOH-CH3, CH2-CH2-OH, CH2-CH 3, CH3 또는 NH2의 임의의 조합일 수 있고, 잔사 R3는 C(NH2)=NH, C(CH2OH) 3, CH2-CH2-OH 또는 H일 수 있다)을 고농도로 함유하는 리폴딩 완충제에서 탈변성시키는, 재조합 이황화물 가교된 단백질의 재활성화 방법이다. 또한 기타 용해도 증강제(예를 들면 염화물, 또는 더욱 바람직하게는 황산염 이온)과의 조합이 단백질 응집을 예방하는데 효과적이다.
숙주 생물로서 대장균을 이용하는 재조합 인터루킨-4 유도체의 제조는 이미 상세하게 기술된 바 있다(문헌[Apeler H, Wehlmann H(1999) Plasmids, their construction and their use in the manufacture of Interleukin-4 and Interleukin-4 muteins. EP 10 22 339, 2000-07-26]을 참조).
세포 수확, 세포 파쇄, 봉입체 정제, 가용화 및 SH기의 화학적 개질 방법은 당해 분야의 숙련자에게 잘 공지된 방법이다(문헌[Creighton TE(ed.)(1989): Protein structure-A Pratical Approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo]을 참조).
종래 기술 분야에서 저분자량 화학약품이 리폴딩 동안 응집체의 형성을 억제할 수 있다는 것이 잘 알려져 있었다. 따라서, 인터루킨-4 유도체 뿐만 아니라 예 를 들면 BPTI와 같은 기타 단백질의 리폴딩 과정에 사용하기에 적합한 응집 억제제를 찾기 위해서 광범위한 화학약품을 선별 작업하였다.
실시예 1(표 1)에서 기술된 바와 같이, 수많은 화학약품들이 폴딩 중간체의 가용화를 효과적으로 도움으로써 가용성 단백질의 복원률을 현저하게 증가시킨다. 그러나 이것이 반드시, 이러한 화합물들이 제대로 폴딩된, 생물학적으로 활성이 있는 이황화물 동형(isoform)의 수율을 현저하게 증가시킨다는 것을 뜻하지는 않는다(표 1의 "상대 리폴딩률" 열을 참조). 예를 들면, 세제인 세틸 트리에틸암모늄 클로라이드(CTAC)는 폴딩 중간체를 효과적으로 가용화시켜 인산염 대조물에 비해 단백질 수율을 735%로 증가시킨다. 그러나, CTAC는 제대로 폴딩된 이황화물 동형의 수율을 증가시키지는 못해서 낮은 리폴딩률 및 낮은 순도를 달성한다. 표 1에 열거된 몇몇 약품(예를 들면 L-아르기닌, 요소, 구아니디늄 히드로클로라이드, 폴리(에틸렌)글리콜, 아세트아미드 및 단쇄 알콜)은 종래 기술 분야에서 리폴딩 동안에 응집 억제제로서의 보조 기능이 알려져 있던 것이다. 그러나, 인터루킨-4 유도체의 경우 L-아르기닌을 제외하고, 그리고 보다 덜한 정도로 구아니디늄 히드로클로라이드를 제외하고는 이들 대부분은 실패했다.
구아니디늄 히드로클로라이드는 750mM의 최적 농도에서 폴딩 중간체를 효과적으로 가용화한다. N-메틸화 또는 N-에틸화 유도체 및 비스(-1-아미노구아니디늄)-술페이트는 구아니디늄 히드로클로라이드보다 더 낮은 농도(200 내지 600mM)에서 폴딩 중간체를 보다 효과적으로 가용화한다. 그러나, 리폴딩된 단백질의 순도(18.4 내지 27.1%)는 인산염 대조물보다 훨씬 더 낮았다.
놀랍게도, 황산과 조합된 완충제 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄(TRIS)은 고농도에서 폴딩 중간체의 가용화(850%) 및 리폴딩률(677%)에 긍정적인 영향을 미치는 반면, 인산염 대조물에 비해 순도를 약간 감소시킨다. TRIS는 리폴딩 혼합물에서 완충 물질로서 매우 낮은 농도(0.1M 미만)로 널리 사용되지만, 응집 억제제로서 높은 농도로는 사용되지 않는다. 구조적으로 TRIS와 관련있는 에탄올아민도 폴딩 중간체의 가용화에 긍정적인 영향을 미쳐서(HCl을 사용한 pH-적정), 필적할만한 리폴딩률, 단백질 수율 및 순도를 달성한다. 황산으로 적정된 TRIS와 염산으로 적정된 TRIS를 비교해보면, 단백질 수율, 리폴딩률 및 순도에 황산염 이온이 긍정적 부가적 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 그러나, 황산으로 적정된 에탄올아민은 리폴딩률 및 단백질 수율에 시너지 효과를 나타내지는 않았다.
예를 들면, 실시예 4 및 6에 명시된 바와 같이, 인터루킨-4-유도체 및 BPTI는 TRIS와 황산염 이온(황산 적정)으로 이루어진 조합된 완충 시스템에서 효과적으로 리폴딩될 수 있다. 인터루킨-4 유도체의 경우, 바람직하게는 250 내지 1000[㎎/ℓ], 더욱 바람직하게는 400 내지 700[㎎/ℓ], 더욱 더 바람직하게는 450 내지 550[㎎/ℓ]의 단백질 농도를 사용할 수 있다. 안정화 이황화물 결합의 형성을 허용하기 위해서, L-시스테인을 바람직하게는 1 내지 4[mM], 더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.5[mM]의 농도로 리폴딩 혼합물에 첨가해야 한다. TRIS/H2SO4는 바람직하게는 1 내지 3[M], 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2.4[M]로 존재해야 한다. 완충제의 pH는 약 7 내지 9, 더욱 바람직하게는 7 내지 8, 가장 바람직하게는 7.5로 조정된 다.
BPTI의 경우, 바람직하게는 500 내지 1000[㎎/ℓ], 더욱 바람직하게는 600 내지 800[㎎/ℓ], 더욱 더 바람직하게는 700 내지 800[㎎/ℓ]의 단백질 농도가 사용될 수 있다. 안정화 이황화물 결합의 형성을 허용하기 위해서, L-시스테인을 바람직하게는 2.5 내지 4[mM], 더욱 바람직하게는 3.0 내지 3.5[mM]의 농도로 리폴딩 혼합물에 첨가해야 한다. TRIS/H2SO4는 바람직하게는 0.2 내지 1.4[M], 더욱 바람직하게는 0.3 내지 1.0[M]로 존재해야 한다. 완충제의 pH는 약 7 내지 9, 더욱 바람직하게는 7 내지 8, 가장 바람직하게는 7.5로 조정된다.
더욱 더 놀랍게도, 트리에탄올아민은 폴딩 중간체를 효과적으로 가용화하며(800%), 리폴딩된 단백질의 순도에는 영향을 미치지 않아서(인산염 대조물에 필적할만한 정도인 44.1%), 가장 좋은 리폴딩률을 달성한다(인산염 대조물에 비해 1039%).
예를 들면, 실시예 5에 명시된 바와 같이, 인터루킨-4 유도체는 TEA와 황산염 이온(황산 적정)으로 이루어진 조합된 완충 시스템에서 효과적으로 리폴딩될 수 있다. 바람직하게는 250 내지 1000[㎎/ℓ], 더욱 바람직하게는 400 내지 700[㎎/ℓ], 더욱 더 바람직하게는 450 내지 550[㎎/ℓ]의 단백질 농도를 사용할 수 있다. 안정화 이황화물 결합의 형성을 허용하기 위해서, L-시스테인을 바람직하게는 0.4 내지 4[mM], 더욱 바람직하게는 0.8 내지 2[mM]의 농도로 리폴딩 혼합물에 첨가해야 한다. TEA/H2SO4는 바람직하게는 0.5 내지 2[M], 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.5[M]로 존재해야 한다. 완충제의 pH는 약 7 내지 9, 더욱 바람직하게는 7 내지 8, 가장 바람직하게는 7.5로 조정된다.
표 1에 열거된 데이타를 취합해서, 구조-기능 관계를 추론해 보면, 다음과 같은 일반적인 화학원리를 알 수 있다: 가장 효과적인 응집 억제제는 1차 아민, 더욱 바람직하게는 2차 아민, 또는 치환체 R1, R2 및 R3를 갖는 화학식 1의 3차 아민(여기서, R1 및 R2는 리간드 H, O=C-NH2, (CH2)4-NH 2, (CH2)3-COOH, (CH2)2-CHOH-CH3, CH2-CH2-OH, CH2-CH3, CH3 또는 NH2의 임의의 조합일 수 있고, 잔사 R3는 C(NH2)=NH, C(CH2OH)3, CH2-CH2-OH 또는 H일 수 있다)이다. 아민 관능기의 중심 역할을, 중심 아민기가 산소기로 대체된 카나바닌-황산염이 가용성 단백질의 복원률을 완전히 잃어버리고(임의의 응집 억제제를 첨가하지 않은 대조물과 동일) 제대로 리폴딩된 인터루킨-4 유도체를 잃어버린 것을 보아 알 수 있었다. 표 1에 열거된 데이타는 카운터이온도 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다. 황산염 이온은 리폴딩률 및 단백질 응집의 억제에 있어서 염화물 이온보다 우수하다. 따라서, 전술된 아민과 황산의 황산염의 조합이 단백질 응집체의 형성을 가장 효과적으로 억제하고 단백질이 원래의 형태로 리폴딩되는 것을 허용한다.
실시예 1
분석 방법
분석용 RP-HPLC를 YMC C4 칼럼(5μ, 200Å, 4.6×250mm)에서 1.0㎖/분의 유속으로 수행하였다. 검출을 210nm에서 수행하였다. 임의적 프리칼럼(20mm×4mm) 에 소스(Source) 15 RPC(스웨덴 파마시아(Pharmacia))를 채웠다. 완충제 A는 0.1% TFA이고, 완충제 B는 0.1% TFA와 70% 아세토니트릴의 혼합물이었다. 다음과 같이 구배를 형성하였다: 0 내지 2분, 40% B; 2 내지 19.5분, 40% 내지 85% B; 19.5 내지 20분, 85% 내지 100% B; 20 내지 21분, 100% B; 21 내지 22분, 100% 내지 40% B; 22 내지 25 분, 40% B(재평형). 제대로 폴딩된 인터루킨-4는 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard) LC 1100 시스템에 의해서 16분의 체류시간에서 용리되었다. 제대로 폴딩된 BPTI는 12.8분의 체류시간에서 용리되었다. 리폴딩 혼합물의 샘플을 분석 전에 멸균 여과하였다(0.22μ컷-오프).
원래 형태의 체류 시간에서 용리된 피크를 합해서, [㎎/ℓ] 단위로 표현되는 리폴딩률을 얻었는데, 이것은 (외부 표준물 곡선을 기준으로 계산된) 제대로 폴딩된 단백질의 농도에 상응한다. 총 면적 계수는 [㎎/ℓ] 단위로 표현되는 리폴딩 혼합물중 가용성 단백질의 농도에 상응한다. 이러한 두 값의 비가 [%] 단위로 표현되는 리폴딩된 단백질의 순도이다.
생화학 표준 방법에 따라 시판 BCA-분석(미국 피어스(Pierce)) 및 보정용 표준물로서 소 혈청 알부민(독일 베링거-만하임(Boehringer-Mannheim))을 사용하여 트리클로로아세트산 침전을 수행한 후에, 총 단백질 농도를 결정하였다.
실시예 2
리폴딩 실험용 출발물질의 제조
8M 구아니디늄 히드로클로라이드를 함유하는 pH 9의 0.2M TRIS-HCl의 존재하에서 단백질을 가용화시켜 10[g/ℓ]의 최종 단백질 농도를 달성하였다. 이어서 30[g/ℓ]의 아황산나트륨 및 60[g/ℓ]의 포타슘 테트라티오네이트를 첨가함으로써 SH기를 아황산염첨가분해하였다. 아황산염을 첨가한 후, 가용화된 단백질내에 존재하는 임의의 이황화물과 아황산염의 반응이 완결되도록 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서 테트라티오네이트를 첨가하고, SH기가 이황화물로 전환되고 S-아황산염-기의 분해가 완결되도록, 용액을 추가로 90분 동안 교반하였다. 마지막으로, 용액을 1.2μ컷-오프 깊이의 여과기(예를 들면 독일의 사르토리우스 아게(Sartorius AG)의 사르토퓨어(Sartopure) PP2, 1.2μ)를 통해 여과하였다. 이어서 한외여과막(컷-오프 10,000 MW, 예를 들면 독일 사르토리우스 아게의 히드로사르트(Hydrosart) 10kD)을 사용해서, 4M 구아니디늄 히드로클로라이드를 함유하는 pH 9의 0.2M TRIS-HCl로 이루어진 정용여과 완충제 5 부피에 대해서 용액을 정용여과하였다. 한외여과 장치로부터 수확된 잔류액(retentate)은 최종 단백질 농도가 약 10[g/ℓ]였으며, 이것을 2 내지 8℃에서 2주 이하 동안 보관하였다.
실시예 3
인터루킨-4 유도체의 리폴딩에 대한 상이한 화학약품들의 효과
탈변성되고 아황산염첨가분해된 단백질을 함유하는, 실시예 2에서 얻어진 단백질 용액을 리폴딩 완충제에 희석시켜, BCA-분석(미국 피어스)에 의해 결정된 최종 단백질 농도가 250 [㎎/ℓ] 이 되게 하였다. 이 리폴딩 완충제는 다음 성분들로 이루어졌다.
◆ pH 7.5의 50mM 인산나트륨 완충제
◆ 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 사나트륨염(EDTA)
◆ 0.8mM L-시스테인
◆ 표 1에 명시된 바와 같은 특정량의 응집 억제제
리폴딩 용액의 총 최종부피는 50㎖였다(독일 스코트(Schott)의 유리 바이알). 유리 바이알을 파라필름으로 마개를 만들어 덮었다. 자석막대 교반기에서 교반하면서(100 내지 200rpm) 24 내지 36 시간 이내에 리폴딩을 완결하였다. 이따금씩 샘플을 채취하여 RP-HPLC로 분석하였다(실시예 1을 참조).
응집 억제제의 선별 작업 결과
그룹 화합물 농도범위 [mM] 최적농도 [mM] 인산염 대조물의 상대 리폴딩률[%] 인산염 대조물의 상대 단백질 용해도[%] 순도[%]
대조물 인산염 50 0 100 100 44.7
아미노산 L-리신 0-1500 400 386 315 32.8
L-아스파라긴 0-200 200 107 93 37.8
L-글루타민 0-150 75 99 89 37.4
D,L-노르루신 0-100 50-100 106 93 37.2
L-아르기닌 0-1200 600 873 845 32.5
아르기닌 유도체 χ-구아니디노-부티르산 0-250 250 283 472 20.0
4-구아니디노-부탄-2-올 0-1000 600 299 740 13.8
4-구아니디노-부틸아민-술페이트 0-1000 200 177 456 20.6
카나바닌-술페이트 0-1200 600 0 100 0
카오트로픽제 요소 0-1500 1500 285 209 37.6
GuHCl 0-1000 750 609 915 18.4
N-메틸구아니디늄-술페이트 0-1000 600 720 1063 19.9
N,N-디메틸구아니디늄-술페이트 0-1000 200 645 700 27.1
N,N-디에틸구아니디늄-술페이트 0-1000 400 691 963 21.1
비스-(1-아미노구아니디늄)-술페이트 0-1000 400 798 1037 22.7
세제 트윈(Tween) 80 0.1-100 100 169 221 21.1
쯔비터젠트(Zwittergent) 3-14 0.01-10 0.01 85 76 30.3
쯔비터젠트 3-12 0.1-100 0.1 110 168 18.3
CHAPS 0.5-500 5 120 167 28.9
트리톤(Triton) X-100 0.1-100 1 140 570 6.8
CTAC 0.1-100 100 57 735 1.2
용매 에탄올 1-100 50 104 112 37.1
1-프로판올 1-100 10 96 103 37.6
1-부탄올 1-100 5 102 107 38.5
1-헥산올 1-100 1 88 80 44.1
염 NaCl 0-1000 800-1000 495 575 41.4
NH4Cl 0-1000 800-1000 504 635 37.2
Na2SO4 0-1000 200 456 505 41.2
(NH4)2SO4 0-1000 400 540 600 41
완충제 인산염 0-1000 200 182 175 41.5
TRIS-HCl 0-1000 1000 489 505 24.6
TRIS-H2SO4 0-1000 1000 677 850 37.8
에탄올아민-HCl 0-1000 400 431 760 25.8
에탄올아민-H2SO4 200-600 400 61 81 25.7
트리에탄올아민-H2SO4 0-2000 1500 1039 800 44.1

그룹 화합물 농도범위 [mM] 최적농도 [mM] 인산염 대조물의 상대 단백질 용해도[%] 인산염 대조물의 상대 단백질 용해도[%] 순도 [%]
기타 아세트아미드 0-2000 800-1500 136 126 34.9
PEG 200 0-1 0.5-1.0 102 89 38.5
PEG 400 0-1 1.0 111 93 41.2
PEG 600 0-1 0.05-0.25 111 114 33.1
PEG 1000 0-1 0.25 101 89 38.8
PEG 2000 0-1 0.5-1.0 132 122 35.2
PEG 3000 0-1 0.1-0.5 122 104 35
PEG 4000 0-1 0.1 153 133 37.6
* 대조물: 리폴딩 조건: 50mM 인산나트륨 완충제, pH 7.5, 1mM EDTA, 0.4mM L-시스테인, 최종 단백질 농도 250㎎/ℓ
리폴딩률: 8㎎/ℓ 제대로 폴딩된 인터루킨-4 R121D Y124D(총 단백질 약 3%), 가용성 단백질의 복원률 23.5㎎/ℓ(총 단백질 약 9%)
실시예 4
TRIS-황산을 기재로 하는 시스템을 사용한 인터루킨-4 유도체의 리폴딩의 다요인 최적화
응집 억제제의 매력적인 조합이 TRIS-기재/H2SO4-시스템이다. 따라서 이 시스템을, 다요인 분석을 사용한 추가의 최적화에 사용하는 것으로 선택하였다.
리폴딩 용액의 총 최종 부피는 50㎖였다(독일 스코트의 유리 바이알). 유리 바이알을 파라필름으로 마개를 만들어 덮었다. 자석막대 교반기에서 교반하면서(100 내지 200rpm) 24 내지 36 시간 이내에 리폴딩을 완결하였다. 이따금씩 샘플을 채취하여 RP-HPLC로 분석하였다(실시예 1을 참조).
탈변성되고 아황산염첨가분해된 단백질을 함유하는, 실시예 2에서 얻어진 단 백질 용액을 리폴딩 완충제에 희석시켜, 표 3에 명시된 바와 같은 최종 단백질 농도를 달성하였다. 다음과 같은 사양의 리폴딩 완충제 조성물에 대해서 연구하였다: TRIS-기재의 농도(0.5 내지 3[M]), H2SO4의 농도(TRIS-농도에 따라 달라짐; 0.4 내지 1.4[M]), 잔류 구아니디늄 히드로클로라이드 농도(80 내지 400mM), L-시스테인 농도(0.4 내지 4[mM]), 및 최초 단백질 농도(50 내지 1000[㎎/ℓ]). 리폴딩 완충제의 pH를 7.5로 조정하였다. 모든 리폴딩 혼합물은 1mM의 EDTA를 함유하였다.
본 실시예에서 기술된 실험은, 모든 단일 요인 및 모든 두 요인간 상호작용의 중요성을 평가하기 위해서, 제대로 폴딩된 인터루킨-4 유도체 수율 데이타의 다요인 통계학적 분석을 허용하도록 고안된 것이다. 부분 3차(partial cubic) 실험 디자인을 생성하고, 그 결과 얻은 데이타를 역시 부분 3차 모델을 사용하여 분석하였다. 부분 3차 모델의 다항식의 계수를 표 2에 명시하였다.
인터루킨-4 R121D Y124D의 리폴딩 최적화의 실험 디자인에 사용되는 부분 3차 모델
항 TRIS CYS 단백질 항
0 0 0 0 상수
1 1 0 0 TRIS-H2SO4[M] 1차항
2 0 1 0 시스테인[mM]
3 0 0 1 단백질[㎎/ℓ]
4 1 1 0 TRIS-H2SO4[M]*시스테인[mM] 상호작용항
5 1 0 1 TRIS-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]
6 0 1 1 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]
7 2 0 0 TRIS-H2SO4[M]2 2차항
8 0 2 0 시스테인[mM]2
9 0 0 2 단백질[㎎/ℓ]2
10 1 2 0 TRIS-H2SO4[M]*시스테인[mM]2 부분 3차항
11 2 1 0 TRIS-H2SO4[M]2*시스테인[mM]
12 1 0 2 TRIS-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]2
13 2 0 1 TRIS-H2SO4[M]2*단백질[㎎/ℓ]
14 0 1 2 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]2
15 0 2 1 시스테인[mM]2*단백질[㎎/ℓ]

인터루킨-4 R121D Y124D의 리폴딩률, 가용성 단백질의 복원률, 총 리폴딩률 및 순도에 미치는 용액 조건(TRIS-H2SO4-시스템)의 효과
실험 번호 TRIS-기재 시스테인 단백질 리폴딩률 [㎎/ℓ] 단백질 복원률[%] 총 리폴딩률[%] 순도[%]
1 3 4 50 9 81.3 18.00 22.1
2 3 0.4 1000 2.92 10.65 0.29 2.7
3 0.5 4 525 90.45 48.55 17.23 35.5
4 0.5 2.2 1000 137.7 46.34 13.77 29.7
5 1.75 4 1000 199.72 54.77 19.97 36.5
6 1.75 0.4 1000 25.05 27.23 2.50 9.2
7 3 2.2 50 11.3 60.79 22.60 37.2
8 0.5 4 50 10.37 53.54 20.73 38.7
9 3 0.4 525 68.32 55.36 13.01 23.5
10 0.5 0.4 525 81.82 36.66 15.58 42.5
11 1.75 0.4 50 13.6 62.08 27.21 43.8
12 0.5 0.4 1000 15.8 18.89 1.58 8.4
13 3 4 1000 176.31 43.94 17.63 40.1
14 1.75 4 525 131.19 68.94 24.99 36.2
15 1.3333 1.6 366.667 93.63 68.21 25.54 37.4
16 2.1667 1.6 366.667 91.95 69.77 25.08 35.9
17 3 2.8 683.333 134.38 55.72 19.67 35.3
18 0.5 1.6 683.333 110.68 48.94 16.20 33.1
20 2.1667 2.8 50 12.49 71.59 24.98 34.9
1 3 4 50 9.38 52.32 18.76 35.9
2 3 0.4 1000 8.94 18.32 0.89 4.9
3 0.5 4 525 97.16 50.43 18.51 36.7
4 0.5 2.2 1000 140.29 45.63 14.03 30.7
5 1.75 4 1000 197.53 56.85 19.75 34.7
6 1.75 0.4 1000 19.75 27.61 1.97 7.2
7 3 2.2 50 15.08 72.5 30.15 41.6

이러한 성분들의 특정 조합을 사용해 달성한 수율을 표 3에 명시하였다. 이 결과들을 면밀하게 살펴보았더니, 사용된 실험 조건하에서, 다음과 같은 경향이 명백함을 알 수 있었다: (1) 가장 좋은 리폴딩률은 높은 단백질 농도(750 내지 1000[㎎/ℓ])에서 얻어지며, (2) 가장 좋은 총 리폴딩률은 250 내지 650[㎎/ℓ]의 총 단백질 농도에서 얻어지며, (3) 최적의 L-시스테인 농도 범위는 2.5 내지 4[mM]이고, (4) 최적의 TRIS-H2SO4 농도 범위는 1.4 내지 2.4[M]이고, (5) 가장 좋은 단백질 복원률은 낮은 단백질 농도(50 내지 250[㎎/ℓ]), 높은 TRIS-H2SO4 농도(2 내지 3[M]) 및 2 내지 3.5[mM]의 L-시스테인 농도에서 얻어지며, (6) 가장 좋은 순도는 높은 단백질 농도(400 내지 1000[㎎/ℓ]) 및 높은 L-시스테인 농도(2.5 내지 4[mM])에서 얻어졌다. 순도는 TRIS-H2SO4 농도에 따라 달라졌다.
500㎎/ℓ의 총 단백질, 3.3mM의 L-시스테인, 2M TRIS-H2SO4 및 1mM EDTA를 사용하여, 최적의 리폴딩률, 순도 및 단백질 복원률 사이에 타협을 이룰 수 있었다.
이러한 최적의 조건을 사용해 검사한 결과, 예상값과 측정값이 상당히 잘 부합되므로, 이 모델이 적당함을 알 수 있었다.
총 리폴딩률: 예상값: 24.9[%](±1.84 StdErr)
측정값: 25.4[%](±0.37 StdErr)
단백질 복원률: 예상값: 65.9[%](±6.55 StdErr)
측정값: 62.9[%](±0.63 StdErr)
순도: 예상값: 38.6[%](±3.63 StdErr)
측정값: 40.4[%](±0.45 StdErr)
리폴딩률: 예상값: 127[㎎/ℓ](±14.5 StdErr)
측정값: 126.9[㎎/ℓ](±1.85 StdErr)
실시예 5
트리에탄올아민-황산을 기재로 하는 시스템을 사용한 인터루킨-4 유도체의 리폴딩의 다요인 최적화
응집 억제제의 또다른 매력적인 조합이 트리에탄올아민(TEA)/H2SO4-시스템이 다. 따라서 이 시스템을, 추가의 최적화 및 단백질 농도의 규모확대(scale-up)에 사용하는 것으로 선택하였다.
리폴딩 용액의 총 최종 부피는 50㎖였다(독일 스코트의 유리 바이알). 유리 바이알을 파라필름으로 마개를 만들어 덮었다. 자석막대 교반기에서 교반하면서(100 내지 200rpm) 24 내지 36 시간 이내에 리폴딩을 완결하였다. 이따금씩 샘플을 채취하여 RP-HPLC로 분석하였다(실시예 1을 참조).
탈변성되고 아황산염첨가분해된 단백질을 함유하는, 실시예 2에서 얻어진 단백질 용액을 리폴딩 완충제에 희석시켜, 표 5에 명시된 바와 같은 최종 단백질 농도를 달성하였다. 다음과 같은 사양의 리폴딩 완충제 조성물에 대해서 연구하였다: TEA의 농도(1 내지 2[M]), H2SO4의 농도(TEA의 농도에 따라 달라짐), 잔류 구아니디늄 히드로클로라이드 농도(80 내지 400mM), L-시스테인 농도(0.4 내지 10[mM]), 및 최초 단백질 농도(50 내지 1000[㎎/ℓ]). 리폴딩 완충제의 pH를 7.5로 조정하였다. 모든 리폴딩 혼합물은 1mM의 EDTA를 함유하였다.
본 실시예에서 기술된 실험은, 모든 단일 요인 및 모든 두 요인간 상호작용의 중요성을 평가하기 위해서, 제대로 폴딩된 인터루킨-4 유도체 수율 데이타의 다요인 통계학적 분석을 허용하도록 고안된 것이다. 부분 3차 실험 디자인을 생성하고, 그 결과 얻은 데이타를 역시 부분 3차 모델을 사용하여 분석하였다. 부분 3차 모델의 다항식의 계수를 표 4에 명시하였다.
인터루킨-4 R121D Y124D의 리폴딩 최적화의 실험 디자인에 사용되는 부분 3차 모델
항 TEA CYS 단백질 항
0 0 0 0 상수
1 1 0 0 TEA-H2SO4[M] 1차항
2 0 1 0 시스테인[mM]
3 0 0 1 단백질[㎎/ℓ]
4 1 1 0 TEA-H2SO4[M]*시스테인[mM] 상호작용항
5 1 0 1 TEA-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]
6 0 1 1 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]
7 2 0 0 TEA-H2SO4[M]2 2차항
8 0 2 0 시스테인[mM]2
9 0 0 2 단백질[㎎/ℓ]2
10 1 2 0 TEA-H2SO4[M]*시스테인[mM]2 부분 3차항
11 2 1 0 TEA-H2SO4[M]2*시스테인[mM]
12 1 0 2 TEA-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]2
13 2 0 1 TEA-H2SO4[M]2*단백질[㎎/ℓ]
14 0 1 2 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]2
15 0 2 1 시스테인[mM]2*단백질[㎎/ℓ]

인터루킨-4 R121D Y124D의 리폴딩률, 가용성 단백질의 복원률, 총 리폴딩률 및 순도에 미치는 용액 조건(TEA-H2SO4-시스템)의 효과
실험 번호 TEA [M] 시스테인 [mM] 단백질 [㎎/ℓ] 리폴딩률 [㎎/ℓ] 단백질 복원률[%] 총 리폴딩 률[%] 순도[%]
1 2 10 0.1 5.91 138.09 5.9 4.3
2 2 0.4 1 135.12 49.49 13.5 27.3
3 0.5 10 0.55 15.23 16.92 2.8 16.4
4 0.5 5.2 1 70.06 19.28 7 36.3
5 1.25 10 1 49.37 18.06 4.9 27.3
6 0.5 5.2 0.1 9.64 66.78 9.6 14.4
7 1.25 0.4 1 167.96 42.5 16.8 39.5
8 2 5.2 0.1 13.66 103.17 13.7 13.2
9 0.5 10 0.1 3.56 76.7 3.6 4.6
10 2 0.4 0.55 45.39 54.66 8.3 15.1
11 0.5 0.4 0.55 68.41 31.3 12.4 39.7
12 1.25 0.4 0.1 30.09 77.34 30.1 38.9
13 0.5 0.4 1 90.11 21.55 9 41.8
14 2 10 1 63.75 22.94 6.4 27.8
15 0.5 0.4 0.1 24.18 59.26 24.2 40.8
16 1.25 10 0.55 43.47 31.42 7.9 25.2
17 1 3.6 0.4 107.54 61.7 26.9 43.6
18 1.5 3.6 0.4 118.95 70.26 29.7 42.3
19 2 6.8 0.7 115.96 45.83 16.6 36.1
20 0.5 3.6 0.7 97.81 32.69 14 42.7
21 1.5 6.8 0.1 12.29 75.29 12.3 16.3
1 2 10 0.1 6.51 91.62 6.5 7.1
2 2 0.4 1 136.71 44.08 13.7 31.0
3 0.5 10 0.55 17.13 13.98 3.1 22.3
4 0.5 5.2 1 68.29 17.34 6.8 39.4
5 1.25 10 1 53.25 16.96 5.3 31.4
6 0.5 5.2 0.1 10.75 44.69 10.8 24.1
7 1.25 0.4 1 170.11 39.82 17 42.7
8 2 5.2 0.1 18.01 81.64 18 22.1
9 0.5 10 0.1 4.92 43.65 4.9 11.3

이러한 성분들의 특정 조합을 사용해 달성한 수율을 표 5에 명시하였다. 이 결과들을 면밀하게 살펴보았더니, 사용된 실험 조건하에서, 다음과 같은 경향이 명백함을 알 수 있었다: (1) 가장 좋은 리폴딩률은 높은 단백질 농도(750 내지 1000[㎎/ℓ])에서 얻어지며, (2) 가장 좋은 총 리폴딩률은 100 내지 550[㎎/ℓ]의 총 단백질 농도에서 얻어지며, (3) 최적의 L-시스테인 농도 범위는 0.4 내지 4[mM]이고, (4) 최적의 TEA-H2SO4 농도 범위는 1 내지 1.6[M]이고, (5) 가장 좋은 단백질 복원 률은 낮은 단백질 농도(50 내지 250[㎎/ℓ]), 높은 TEA-H2SO4 농도(1.5 내지 2[M]) 및 4 내지 10[mM]의 L-시스테인 농도에서 얻어지며, (6) 가장 좋은 순도는 높은 단백질 농도(600 내지 1000[㎎/ℓ]), 0.4 내지 4[mM]의 L-시스테인 농도 및 0.8 내지 1.5[M]의 TEA-H2SO4 농도에서 얻어졌다. 500㎎/ℓ의 총 단백질, 0.8mM의 L-시스테인, 1.4M TEA-H2SO4 및 1mM EDTA를 사용하여, 최적의 리폴딩률, 순도 및 단백질 복원률 사이에 타협을 이룰 수 있었다.
이러한 최적의 조건을 사용해 검사한 결과, 예상값과 측정값이 상당히 잘 부합되므로, 이 모델이 적당함을 알 수 있었다.
총 리폴딩률: 예상값: 24.6[%](±4.1 StdErr)
측정값: 24.3[%](±0.8 StdErr)
단백질 복원률: 예상값: 52.8[%](±10.5 StdErr)
측정값: 58.2[%](±4.5 StdErr)
순도: 예상값: 43.2[%](±5.3 StdErr)
측정값: 41.8[%](±3.9 StdErr)
리폴딩률: 예상값: 106.8[㎎/ℓ](±16.9 StdErr)
측정값: 121.6[㎎/ℓ](±2.0 StdErr)
실시예 6
TRIS-황산을 기재로 하는 시스템을 사용한 소 췌장 트립신 저해제(BPTI, 아프로티닌)의 리폴딩
TRIS/H2SO4-시스템을 인터루킨-4 유도체 외의 다른 단백질의 리폴딩에도 사용할 수 있음을 증명하기 위해서, TRIS/H2SO4-시스템을 BPTI에 대해 최적화하였다.
리폴딩 용액의 총 최종 부피는 50㎖였다(독일 스코트의 유리 바이알). 유리 바이알을 파라필름으로 마개를 만들어 덮었다. 자석막대 교반기에서 교반하면서(100 내지 200rpm) 24 내지 36 시간 이내에 리폴딩을 완결하였다. 이따금씩 샘플을 채취하여 RP-HPLC로 분석하였다(실시예 1을 참조).
탈변성되고 아황산염첨가분해된 단백질을 함유하는, 실시예 2에서 얻어진 단백질 용액을 리폴딩 완충제에 희석시켜, 표 7에 명시된 바와 같은 최종 단백질 농도를 달성하였다. 다음과 같은 사양의 리폴딩 완충제 조성물에 대해서 연구하였다: TRIS의 농도(0 내지 2[M]), H2SO4의 농도(TRIS-기재의 농도에 따라 달라짐), 잔류 구아니디늄 히드로클로라이드 농도(80 내지 400mM), L-시스테인 농도(0.1 내지 4[mM]) 및 최초 단백질 농도(50 내지 1000[㎎/ℓ]). 리폴딩 완충제의 pH를 7.5로 조정하였다. 모든 리폴딩 혼합물은 1mM의 EDTA를 함유하였다.
본 실시예에서 기술된 실험은, 모든 단일 요인 및 모든 두 요인간 상호작용의 중요성을 평가하기 위해서, 제대로 폴딩된 BPTI 수율 데이타의 다요인 통계학적 분석을 허용하도록 고안된 것이다. 부분 3차 실험 디자인을 생성하고, 그 결과 얻은 데이타를 역시 부분 3차 모델을 사용하여 분석하였다. 부분 3차 모델의 다항식의 계수를 표 6에 명시하였다.
BPTI의 리폴딩 최적화의 실험 디자인에 사용되는 부분 3차 모델
항 TRIS CYS 단백질 항
0 0 0 0 상수
1 1 0 0 TRIS-H2SO4[M] 1차항
2 0 1 0 시스테인[mM]
3 0 0 1 단백질[㎎/ℓ]
4 1 1 0 TRIS-H2SO4[M]*시스테인[mM] 상호작용항
5 1 0 1 TRIS-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]
6 0 1 1 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]
7 2 0 0 TRIS-H2SO4[M]2 2차항
8 0 2 0 시스테인[mM]2
9 0 0 2 단백질[㎎/ℓ]2
10 1 2 0 TRIS-H2SO4[M]*시스테인[mM]2 부분 3차항
11 2 1 0 TRIS-H2SO4[M]2*시스테인[mM]
12 1 0 2 TRIS-H2SO4[M]*단백질[㎎/ℓ]2
13 2 0 1 TRIS-H2SO4[M]2*단백질[㎎/ℓ]
14 0 1 2 시스테인[mM]*단백질[㎎/ℓ]2
15 0 2 1 시스테인[mM]2*단백질[㎎/ℓ]

BPTI의 리폴딩률, 가용성 단백질의 복원률 및 총 리폴딩률에 미치는 용액 조건의 효과
실험 번호 TRIS-기재 [M] 시스테인 [mM] 단백질 [㎎/ℓ] 리폴딩률 [㎎/ℓ] 단백질 복원률[%] 총 리폴딩률[%] 순도[%]
1 2 4 50 20.43 85.69 40.86 47.7
2 2 0.1 1000 0 0 0 0
3 0 4 525 159.29 61.05 30.34095 49.7
4 0 2.05 1000 275.45 70.84 27.545 38.9
5 1 4 1000 256.9 71.75 25.69 35.8
6 0 2.05 50 35.67 136.48 71.34 52.3
7 1 0.1 1000 0 2.59 0 0
8 2 2.05 50 19.45 80.85 38.9 48.1
9 0 4 50 8.51 39.92 17.02 42.6
10 2 0.1 525 0 0 0 0
11 0 0.1 525 0 0.4 0 0
12 1 0.1 50 15.71 69.04 31.42 45.5
13 0 0.1 1000 0 1.05 0 0
14 2 4 1000 158.93 36.23 15.893 43.9
15 0 0.1 50 5.03 14.13 10.06 71.2
16 1 4 525 18.64 89.48 3.550476 4
17 0.6667 1.4 366.667 107.29 83.34 29.26088 35.1
18 1.3333 1.4 366.667 104.5 82.6 28.49997 34.5
19 2 2.7 683.333 97.4 41.66 14.25367 34.2
20 0 1.4 683.333 149.44 51.46 21.86928 42.5
21 1.3333 2.7 50 14.08 76.21 28.16 36.9
1 2 4 50 16.15 69.37 32.3 46.5
2 2 0.1 1000 1.47 3.44 0.147 4.3
3 0 4 525 162.49 58.91 30.95048 52.5
4 0 2.05 1000 273.77 68.91 27.377 39.7
5 1 4 1000 265.9 78.2 26.59 34
6 0 2.05 50 9.73 39.56 19.46 49.2
7 1 0.1 1000 0 0.94 0 0
8 2 2.05 50 19.18 77.88 38.36 49.3

이러한 성분들의 특정 조합을 사용해 달성한 수율을 표 7에 명시하였다. 이 결과들을 면밀하게 살펴보았더니, 사용된 실험 조건하에서, 다음과 같은 경향이 명백함을 알 수 있었다: (1) 가장 좋은 리폴딩률은 높은 단백질 농도(750 내지 1000[㎎/ℓ])에서 얻어지며, (2) 가장 좋은 총 리폴딩률은 500 내지 1000[㎎/ℓ]의 총 단백질 농도에서 얻어지며, (3) 최적의 L-시스테인 농도 범위는 2.5 내지 4[mM]이고, (4) 최적의 TRIS-H2SO4 농도 범위는 0.2 내지 1.0[M]이고, (5) 가장 좋은 단백질 복원률은 낮은 단백질 농도(50 내지 100[㎎/ℓ]), 중간 정도의 TRIS-H2SO4 농도 (0.9 내지 1.4[M]) 및 1.8 내지 3.3[mM]의 L-시스테인 농도에서 얻어지며, (6) 가장 좋은 순도는 낮은 단백질 농도(50 내지 100[㎎/ℓ]), 0.1 내지 0.4[mM]의 L-시스테인 농도 및 0.1 내지 0.5[M]의 TRIS-H2SO4 농도에서 얻어졌다.
700㎎/ℓ의 총 단백질, 3.3mM의 L-시스테인, 0.3M TRIS-H2SO4 및 1mM EDTA를 사용하여, 최적의 리폴딩률, 순도 및 단백질 복원률 사이에 타협을 이룰 수 있었다.

Claims (8)

  1. 변성되거나 화학적으로 개질되거나 환원된 인터루킨-4 또는 그의 돌연변이단백질의 용액에, L-시스테인 및 1 내지 3M의 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄/H2SO4 또는 0.5 내지 2M의 트리에탄올아민/H2SO4를 함유하는 리폴딩 완충제를 첨가하는 것을 포함하는, 상기 인터루킨-4 또는 그의 돌연변이단백질을 250 내지 1000㎎/ℓ의 단백질 농도에서 탈변성시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충제가 용해도 증강제로서 클로라이드 이온을 추가로 함유하는 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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