JP2006506332A - インターロイキン−4およびその突然変異蛋白質の精製法 - Google Patents
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Abstract
Description
A.定義
本明細書で使用される「IL−4」は、天然の配列のもしくはバリアント形態のイヌ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス、ラットおよび好ましくはヒトを含むあらゆる種からのそして、天然の、合成のもしくは組換えで生産されようと、あらゆる源からのインターロイキン−4を表わす。IL−4は好ましくは組換えにより生産される。好ましい方法において、IL−4はクローン生産され、そのDNAは例えば、Apeler & Wehlmannにより1999年に記載の方法により発現される(Apeler H,Whelmann H(1999) Plasmids,their construction and their use in the manufacture of Interleukin−4 and Interleukin−4 muteins(プラスミド、それらの構造並びにインターロイキン−4およびインターロイキン−4突然変異蛋白質の製造におけるそれらの使用).欧州特許出願第00100129.6号明細書、1999年1月7日公開、を参照されたい)。
本発明の方法は最初に不溶性凝集体(aggregates)、いわゆる「封入体(inclusion bodies)」として、あらゆる適切な方法により適当な単離バッファー中の原核生物の宿主細胞から変性(non−native)インターロイキン−4を精製することを伴う。このような適当な方法は例えば、大部分の宿主蛋白質を可溶化するために適したイオン強度をもつが凝集インターロイキン−4が実質的に不溶性であるバッファーに細胞を暴露し、そして封入体を放出し、例えば遠心分離もしくは微量濾過による回収を可能にさせるように細胞を分解すること、である。この方法は周知であり、例えば米国特許第4,511,503号明細書に記載されている。
1.マトリックス補助復元
クロマトグラフィー樹脂に結合した蛋白質の復元は確立された方法である(Las他(1984):米国特許第5739281号、14/04/1998公開;国際公開第9418227号、18/08/1994公開、Denzyme,デンマーク)。一般に使用されるイオン交換マトリックス補助復元の主要な欠点は、樹脂に対する蛋白質の複数地点の結合であり、それが蛋白質の低い柔軟性をもたらし、それが正しい三次元構造の形成を妨げる可能性がある。更に、Lasおよび共同研究者により開示された特許に従うと(前記参照)カオトロープの濃度が変わると、インターロイキン−4は樹脂上に定量的に沈殿し、それがカラムの閉塞をもたらす。
2.透析もしくはダイアフィルトレーションによる復元
復元バッファーに対する透析もしくはダイアフィルトレーションの前に、可溶化され、そして好ましくはスルフィト分解された封入体を、0.01g/L〜0.5g/L、好ましくは0.05g/L〜0.3g/L、もっとも好ましくは0.2g/L〜0.3g/Lに蛋白質濃度を調整するために、希釈バッファー(例えば4Mのグアニジニウム塩酸、0.6Mのアルギニン塩酸、例えば50mMのリン酸塩バッファー、pH7)で希釈することができる。次にスルファイト保護基を例えばβ−メルカプトエタノール、還元グルタチオン、2−メルカプトイミダゾールもしくは好ましくはシステインのようなメルカプタンの添加により除去する。透析は3.5kDと10kDの間にカットオフを伴う透析バッグを使用して実施する。2倍のバッファーは0.1〜1.5M、好ましくは0.4〜1Mで添加されたアルギニンを含む20倍容量の復元バッファーに対して交換する。ダイアフィルトレーションは大規模復元の場合に透析の代わりに使用することができる。この目的のためには、1〜30kD、もっとも好ましくは5〜10kDの好ましいカットオフを伴う適した膜を使用する。この方法に適する限外濾過膜は例えば、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロースおよび、もっとも好ましくはセルロース−アセテート誘導体である。ダイアフィルトレーションは4容量の復元バッファー(前記参照)に対して実施される。
3.希釈による復元
この場合には、異なる操作法を相互の代わりに使用することができる:
a)カオトロープ剤の存在下での変性インターロイキン−4の還元、
b)希釈後のインターロイキン−4の還元、
c)希釈中のインターロイキン−4の還元。
4.人工的シャペロン系
一連の酵素の構造復元に対し人工的シャペロン系が記載された(Gellman他(1994):米国特許第5 563 057号、1994年10月出願、Res.Foundations;Sivakama他(1999):FEBS Letts.443(2):215−219)。変性インターロイキン−4を含む適当な洗浄剤複合体、第2段階において蛋白質−洗浄剤−複合体から洗浄剤を取り除く適当な「ストリッピング」剤および酸化還元系(前記参照)をインターロイキン−4の構造復元を達成するための最適な濃度で選択しなければならない。適切な洗浄剤はイオン性、非イオン性から双性イオン洗浄剤までにわたる。前記のように、インターロイキン−4封入体は更に人工的シャペロン系による構造復元期間中にも使用することができる一連の洗浄剤中で効果的に可溶化させることができる。グアニジニウム塩が封入体を可溶化するために使用される場合には、例えばナトリウムドデシルスルフェートのようなアニオン洗浄剤はグアニジニウム−アルキル塩の沈殿のために使用することができない。
5.その他の方法
構造復元は具体的には約+0℃〜45℃で、好ましくは約20〜40℃で、より好ましくは約23〜37℃で、更により好ましくは約25〜30℃で、少なくとも約1時間実施される。
C.実施例
IL−4の封入体を含む50gの湿った大腸菌細胞を250mLの分解バッファー(0.1Mトリス−HClバッファー、pH7.5、5mMEDTA)中で洗浄し、遠心分離(8000g、15分間)する。細胞ペレットを250mLの分解バッファー中に再懸濁させ、リゾチーム12mg(〜1mgリゾチーム/1g細胞乾燥重量)を添加し、室温で30分間インキュベートする。次に前以て処理された懸濁液を60〜70mL/分の流量で、500〜1000バールのホモジナイズ圧で実験室規模のホモジナイザー(例えばStansted,Bran & Luebbe,Manton Gaulin)中でホモジナイズする(3〜5サイクル)。分解効率を説明の節で言及されたいずれかの手段により監視する。具体的には85%を超える細胞が分解される。
放出されたIL−4封入体を含む分解細胞の懸濁液(実施例1)を遠心分離(8000g、15分)し、封入体のペレットを250mLのIB洗浄バッファー(0.1Mトリス−HClバッファー、pH7.5、5mMのEDTA、0.1%Zwittergent3−14)中に再懸濁させる。この洗浄手順を更に3〜5回繰り返す。洗浄したIBを遠心分離により回収する(前記参照)。
洗浄IB(実施例2)を125mLの可溶化バッファー(7MのグアニジンHCl、5mMのEDTA、0.2Mのトリス−HCl、pH7)中に再懸濁させる。ジスルフィド橋のスルフィト分解を4gのナトリウムスルファイト(室温で撹拌しながら240分間インキュベート)および1.3gのカリウムテトラチオネート(室温で撹拌しながら30分間インキュベート)を添加することにより実施する。スルフィト分解後、不溶性物質を遠心分離(8000g、15分間)により除き、過剰のスルファイトおよびテトラチオネートを適当な限外濾過膜(例えばHydrosart 10kD、Sartorius,Goettingen)を使用して、GuHCl−透析バッファー(4Mのグアニジン−HCl、5mMのEDTA、50mMのリン酸塩、pH7)に対するダイアフィルトレーションにより除去する。
S−スルホン化IL−4(実施例3)の金属−キレート親和性クロマトグラフィー(IMAC)をSTREAMLINEカラム(Amersham Biosciences,スウェーデン)および適当なゲル(例えばSTREAMLINE−IMAC−ゲル;Amersham Biosciences,スウェーデン)上で実施することができる。充填操作法でゲル容量を3Lに調節する。最大圧を1バールに設定する。流量を充填操作法において150cm/時間、そして拡大操作法においては300cm/時間に調節する。IMAC−バッファーA(4MのグアニジンHCl、50mMの二ナトリウム水素リン酸塩、0.5MのNaCl、pH7.0)中でクロマトグラフィーを実施する。STREAMLINE−IMACゲルの動力学的結合能は約10g蛋白質/ゲル1Lである。IL−4の溶離のためには、IMAC−バッファーB(4MグアニジニウムHCl、50mMのリン酸二水素ナトリウム、0.5MのNaCl、50mMのイミダゾール、pH7.0)を使用する。ニッケルイオンのストリッピングをIMAC−バッファー(4MのグアニジンHCl、0.5MのNaCl、50mMのEDTA、pH7.0)を使用して実施する。IL−4の結合の前にSTREAMLINE−IMACにニッケルイオンを充填する(蒸留水中8.5g/1lのニッケル−アセテート四水和物)。イミダゾール−プールの画分を含む生成物を合わせると、SDS−PAGE分析(Coomassie染色)により判定されると約90%の生成物純度をもたらす。IL−4の平均回収率は概括的に80%を超える。
スルフィト分解したIL−4の構造復元を異なる方法を使用して実施することができる:
1.透析による構造復元
実験室規模
構造復元バッファーに対する透析による構造復元の前に、可溶化され、スルフィト分解された封入体(実施例3)をGuHCl−希釈バッファー(4Mのグアニジン−HCl、0.6Mアルギニン−HCl、50mMのリン酸塩バッファー、pH7)で7.5倍に希釈すると、1.8Lの最終容量および0.2〜0.3g/Lの蛋白質濃度をもたらす。次に1.21g/LのL−システインを添加する(2.2g、30分間、撹拌)ことによりスルファイト保護基を除去する。36Lの構造復元バッファー(50mMのリン酸塩バッファー、pH6.5、0.6Mのアルギニン−HCl)に対して10℃で2倍の透析(16時間および6時間)により復元を実施する。濾過された(Sartobran 300、0.22μ、Sartorius,Goettingen)透析物の容量は1.87Lである。可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に80%を超える。30〜40mg/Lの正確に折り畳んだIL−4 R121D Y124Dの復元収率を得る。
大規模
大規模透析は特別に設計されたステンレス−鋼のタンクを使用して実施することができる。2基のタンク(各約300L容量)をポンプにより連結した。第2のポンプはバッファー貯蔵タンク中にバッファーを配送した。タンクの入り口は底部にあり、他方、出口は上部に配置された。透析バッグをタンク中に浮かべてバッファー溶液中につるすためにタンク内に2本のステンレス鋼の棒を使用した。バルク容量のバッファーを1200−Lの撹拌タンク中に保存し、2基のタンク中に連続的にポンプで送った。バッファーを10℃に維持した。復元の96時間中、温度およびポンプの動態をオンラインでモニターした。
2.ダイアフィルトレーションによる構造復元
ダイアフィルトレーションによる構造復元を5〜10kDのカットオフ膜(例えばHydrosart 10kD、Sartorius,ドイツもしくはOmegaスクリーン−チャンネル5kD、Filtron,ドイツ)を使用して実施する。50mMのリン酸塩もしくは4Mのグアニジニウム塩酸(GuHCl)を含むトリス−HClバッファー(pH7)中に溶解されたスルフィト分解IL−4(実施例3)をダイアフィルトレーション装置に適用する。GuHClの除去は50mMのリン酸塩もしくはTRIS−HCl(pH7)および0.6MのL−アルギニンを含む復元バッファー6容量に対するダイアフィルトレーションにより実施する。可溶性蛋白質に関する復元収率は概括的に80%を超える。野生型IL−4および異なる突然変異蛋白質に関する詳細についてはDomingues他(2000):J.Biotechnol.84:217−230を参照されたい。
3.希釈による構造復元
この場合は、異なる操作法を代わりに使用することができる:
a)カオトロープ剤、例えばグアニジニウム塩酸の存在下での変性IL−4およびその突然変異蛋白質の還元、
b)希釈後のIL−4およびその突然変異蛋白質の還元、
c)希釈中のIL−4およびその突然変異蛋白質の還元。
4.人工的シャペロンを使用する復元
実施例1、実施例2および実施例3に記載のように調製されたS−スルホン化IL−4は以下の復元バッファー:50mMのリン酸塩、pH7.5、1mMのEDTA、2mMのZwittergent 3−14、1.2mMのL−システイン、0.2MのL−アルギニンもしくは0.4MのL−シジンまたは0.4Mのナトリウムもしくはアンモニウムサルフェート、中に希釈することによる人工的シャペロンを使用して最良に復元することができる。最終蛋白質濃度は10と1000mg/L、好ましくは50〜500mg/Lの間で変動することができる。蛋白質−洗浄剤−複合体の形成は3時間実施される。次に、β−シクロデキストリンを復元混合物に添加すると、6(12mM)のβ−シクロデキストリン/洗浄剤のモル比を与える。復元反応はβ−CD−添加の4時間後に終結する(総復元時間:7〜8時間)。復元は実施例9に記載のようにRP4−HPLCによりモニターされる。可溶性蛋白質の総回収率は85%より良い。総復元率は約18%である。45mg/Lの正しく折り畳んだIL−4のR121D Y124Dの復元収量が得られる。
IL−4の復元中に生成された比較的高い容量を更なる工程段階をとおして濃縮しなければならない。原則的に、これは限外濾過によりもしくはクロマトグラフィーにより実施することができる。双方の方法に対して以下の節に例を与える。
a)限外濾過/ダイアフィルトレーション
復元IL−4の濃縮は例えばHydrosart 10kD(Sartorius,Goettingen)もしくはOmega 5kD(Filtron,ドイツ)のような限外濾過膜(カットオフ:5〜10kD)を備えた適切な濾過装置を使用して実施する。約300mg/Lの最終蛋白質濃度に容量を減少後、生成物溶液を4容量の復元バッファーに対してダイアフィルトレーションする(実施例5.1参照)。蛋白質の回収率は概括的に90%以上である。
b)中速度逆相クロマトグラフィー
カラム(例えば100mLの床容量)にポリマー基材の逆相樹脂(例えばSource 30 RPC(Amersham Biosciences,スウェーデン)、CG−1000(TosoHaas、ドイツ)のような)もしくはもう1種の同等な大きい空隙のポリマーRPC樹脂(例えば、Polymer−Labs large pore、10〜25μもしくは50〜75μの粒径、4000Åまでの孔径)を充填する。カラムをバッファーA(トリフルオロ酢酸もしくはH3PO3のような0.1%の酸)で平衡にする。デプスフィルターした(例えばSeitz Bio40/20カスケード、IL−4の定量的回収)復元用混合物をカラムに充填しそして洗浄後、直線状勾配のエタノール(1カラム容量の溶離剤B20〜50%、7カラム容量の溶離剤B50〜80%)もしくは適当なその他の有機溶媒を使用して生成物を溶離する。生成物を含む画分を分析的逆相HPLCにより分析し、正しく折り畳んだアイソフォームに関して50%を超える純度に従ってプールする。主要プール中のIL−4の回収率は具体的には88%まで良好である。主要プール中のIL−4の純度は分析的RP4−HPLCにより判定されると概括的に>50%である。
実施例6bに従って調製された主要プールの希釈後(蒸溜水で1:5)、塩基性リン酸塩(例えばK2HPO4)によりpHを6.5(±0.5)に調整する。生成される溶液をデプスフィルター(例えばSeitz Bio40/20)をとおして濾過し、IL−4の定量的な回収を得る。出発物質が実施例6aに従って調製された場合は、5mMのリン酸塩バッファー(pH6.5(±0.5))で溶液の伝導度を<5mS/cmに調整する。前記リン酸塩バッファーで前以て平衡化されたセラミックヒドロキシアパタイトを充填されたカラム(14cmφ×10.5cm高さ;タイプ−ICHA、BioRad、ドイツ)をとおして200cm/時間の流量で溶液をポンプで送る。OD280信号が基底線に到達するまで、約3カラム容量の5mMのリン酸塩バッファー(pH6.5(±0.5))でカラム中の未結合蛋白質を洗浄する。直線状勾配のリン酸塩(20カラム容量)を使用することにより200cm/時間の流量で生成物を溶離する。1Lの画分を収集し、IL−4を含むものを分析的RP4−HPLCにより同定し、合わせる。主要プール中のIL−4の回収率は具体的には85%までも良好である。CHAプール中のIL−4の純度は分析的RP4−HPLCにより判定されると>70%である。
[実施例7b]カチオン交換クロマトグラフィーによる一部精製されたIL−4の中速度クロマトグラフィー精製
実施例6に従って調製されたIL−4のプールされた活性溶液の伝導度を脱イオン水で<5mS/cmに調整する。20mMのリン酸塩バッファー(pH3)で前以て平衡化されたSource 15 S(Amersham Biosciences,15μ粒径;カラムディメンション:14cmφ×10cm高さ)を充填されたカラムをとおして溶液を200cm/時間の流量でポンプで流す。OD280信号が基底線に到達するまで、約3カラム容量の20mMのリン酸塩バッファー(pH3)でカラム中の未結合蛋白質を洗浄する。直線状NaCl勾配(20カラム容量)を使用することにより200cm/時間の流量で生成物を溶離する。1Lの画分を収集し、IL−4を含むものを分析的RP4−HPLCにより同定し、合わせる。主要プール中のIL−4の回収率は具体的には75%までも良好である。カチオン交換プール中のIL−4の純度は分析的RP4−HPLCにより判定されると>70%である。
実施例7aもしくは実施例7bからのIL−4の活性プールを濾過し(例えばSartobran 300、0.22μ)、HPLCバッファーA(0.1%TFA/水)で前以て平衡化されたSource 15 RPCカラム(Amersham Biosciences,15μ粒径;カラムディメンション:3.2cm×12cm)上に適用する。次に未結合物質を溶離(3カラム容量)し、勾配(16%エタノール、0.1CV、16〜40%エタノール、3CV、40〜64%エタノール、7CV)を使用して225cm/時間の流量でIL−4を溶離する。画分(10mL)をHPLCバッファーAで適当に希釈し、分析的RP4−HPLCを使用して正しく折り畳んだ蛋白質を分析する。主要プール中のIL−4の回収率は具体的には87%までも良好である。RPCプール中のIL−4の純度は分析的RP4−HPLCにより判定されると概括的に>80%である。
正しく折り畳んだIL−4およびその突然変異蛋白質を含む画分を決定するために使用されるアッセイはすべて通常のものである。精製IL−4の測定における280nmのUV吸収に対してA280光学密度単位(OD)はアミノ酸組成分析により1.6mgに等しく、Lowryの方法により2.0mgに等しい。アミノ酸置換物(replacement)に応じて、異なる突然変異蛋白質に異なる因子を適用しなければならない。Lowryの方法はLowry他(1951)J.Biol.Chem.193:265−275に記載されている。分析的RP4−HPLCを1.0ml/分の流量でYMCイソ−ブチルC4カラム(5μ、200Å、4.6×250mm)上で実施する。検出波長は210nmである。バッファーAは0.1%TFAであり、バッファーBは70%アセトニトリルを含む0.1%TFAである。勾配は以下:0〜2分、40%B;2〜19.5分、40〜85%B;19.5〜20分、85%〜100%B;20〜21分、100%B、21〜22分、100〜40%B、22〜25分、40%B(再平衡)、のように実施する。その他のIL−4突然変異蛋白質は僅かに異なる溶離動態を示す。アミノ酸置換物に応じて、IL−4突然変異蛋白質は野生型IL−4に比較してより早くもしくはより遅く溶離するかも知れない。
実施例1、2、3、4、5.1、6a、7aおよび8に記載の方法を使用して、IL−4のR121D Y124Dの最終生成物を調製し、生化学的に特徴を調べた。C−およびN−末端配列分析並びにアミノ酸分析により分子の同定が示された。第1サイクルの%−PTH−メチオニンとして表わされる平均均一度は94%であった。マトリックス支援レーザー脱離分光分析(MALDI)を使用して分子量を測定した。IL−4R121D Y124D突然変異蛋白質の平均分子量は14.995ダルトン(STD:±3、n=7)に決定し、予測分子量(14.998ダルトン)およびMALDI法の精度に良好に一致した。逆相(C18−樹脂)高速液体クロマトグラフィー(RP18−HPLC)を高度分解法として使用して、最終生成物の純度を測定し、90%であった。Superdex−75樹脂(Amersham Biosciences,スウェーデン)および中性pHの希釈リン酸塩バッファー中0.6MのNaClを使用してゲル透過クロマトグラフィーを実施した。ダイマー/オリゴマーの量は1%より十分少なく、比較的小さい分解生成物の量は検出限界(0.04%)より下であった。エンドトキシン含量は薬局方LALアッセイに従って測定した。平均エンドトキシン含量は0.24EU/mg(STD:±0.34,n=10)であった。最終生成物の染色体のDNA−含量は閾値DNAアッセイ(Molecular Devices,USA)の検出限界(8pgDNA/蛋白質1mg)より下であった。方法#1から誘導されたIL−4 R121D Y124Dの完全な拮抗作用はインビボで(Shanafelt AB,Forte CP,Kasper JJ,SanchezPescador L,Wetzel M,Gundel R,Greve JM(1998):Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(16),9454−9458;Morton M,Harris P,Xu J,Gorina S,Roczniak S,Fitch N,Gundel R(1999):Am.J.Respir.Crit.Care Med.159(3.Suppl.):A660およびHarris P,Lindell D,Fitch N,Gundel R(1999):Am.J.Respir.Crit.Care Med.159(3.Suppl.):A230)そしてインビトロで受容体結合アッセイ(Shen et al.(1996):Europ.J.Biochem.240:252−261,Wang et al.(1997):Proc.Natl.Acad.Sci.US94:1657−1662)およびルシフェラーゼリポーター細胞培養アッセイ双方を使用して示された。konは4.3E+07[M−1s−1]でありkoffは4.9E−11[M−1]であった。IL−4のR121D Y124DのIC50値は6nMであった。
実施例1、2、3、5.3c、6b、7aおよび8に記載の方法を使用してもまた、IL−4 R121D Y124Dの最終生成物を調製し、生化学的に特徴を調べた。C−およびN−末端配列分析並びにアミノ酸分析により分子の同定が示された。第1サイクルの%−PTH−メチオニンとして表わされる平均均一度は94.6%であった。マトリックス支援レーザー脱離分光分析(MALDI)を使用して分子量を測定した。IL−4 R121D Y124D突然変異蛋白質の平均分子量は14.999ダルトン(STD:±6、n=11)に決定され、それは予測分子量(14.998ダルトン)およびMALDI法の精度に良好に一致した。逆相(C18−樹脂)高速液体クロマトグラフィー(RP18−HPLC)を高度分解法として使用して、最終生成物の純度を測定し、92%であった。Superdex−75樹脂(Amersham Biosciences,スウェーデン)および中性pHの希釈リン酸塩バッファー中0.6MのNaClを使用してゲル透過クロマトグラフィーを実施した。ダイマー/オリゴマーの量は<0.2%より十分下であり、比較的小さい分解生成物の量は検出限界(0.04%)より下であった。エンドトキシン含量は薬局方LALアッセイに従って測定した。平均エンドトキシン含量は0.03EU/mg(STD:±0.013,n=11)であった。最終生成物の染色体のDNA−含量は閾値DNAアッセイ(Molecular Devices,USA)の検出限界(8pgDNA/蛋白質1mg)より下であった。方法#2から誘導されたIL−4のR121D Y124D調製物の拮抗作用は受容体結合アッセイ(Shen et al.(1996):Europ.J.Biochem.240:252−261,Wang et al.(1997):Proc.Natl.Acad.Sci.US 94:1657−1662)およびルシフェラーゼレポーター細胞培養アッセイ双方により決定された。konは4.1E+07[M−1s−1]でありkoffは4.7E−11[M−1]であった。IL−4 R121D Y124DのIC50値は4nMであった。
レポーター遺伝子細胞株、D2−49細胞をBL−2細胞、Burkittリンパ腫細胞株中へのIμ/Luc.遺伝子の安定な導入(stable introduction)により確立した。D2−49細胞を10%コウシ胎児血清(Hyclone,Utah,USA)、100μg/1mlのストレプトマシン(Gibco BRL,New York,USA)、100IU/1mlのペニシリン(Gibco BRL,New York,USA)および800μg/1mlのG418(Gibco BRL,New York,USA)を補給されたRPMI 1640培地中で培養した。D2−49細胞を3〜4日毎に継代培養した。ルシフェラーゼの導入のために、3×106細胞/mlの密度の細胞懸濁液100μlを96ウェルプレートのウェルに入れ、別記されない限り組換えヒトIL−4を伴ってもしくは伴わずに24時間培養した。
mIL−4 Q116D Y119Dの封入体を含む360gの湿った大腸菌−細胞を1800mLの分解バッファー(0.1Mトリス−HClバッファー、pH7.5、5mMのEDTA)中で洗浄し、遠心分離(8000g、15分間)する。細胞ペレットを1800mLの分解バッファー中に再懸濁し、86mgのリゾチーム(〜1mgリゾチーム/細胞乾燥重量1g)を添加し、室温で30分間インキュベートする。7.2gのMgCl2(×6H2O)を添加し、撹拌溶解する。次に18μLのBenzonasesuspension(Merck,Darmstadt;0.25U/mL)を添加し、懸濁液を室温で更に30分間撹拌する。懸濁液を8000×gで15分間遠心分離し、ペレットを1800mLの蒸留水中に再懸濁させる(浸透圧衝撃)。説明の項に挙げたいずれかの方法により分解効率をモニターする。具体的には85%を超える細胞が分解される。
Claims (10)
- (a)封入体中に発現させること、
(b)細胞を分解し、封入体を分離すること、
(c)そのように得られた封入体を洗浄すること、
(d)変性により封入体を可溶化させること、
(e)発現生成物を復元すること、および
(f)発現生成物を精製すること、
を含んで成り、(c)で封入体が封入体の表面に結合された脂質もしくは細胞壁断片中に含まれる脂質を効果的に可溶化させる洗浄剤を含むバッファーで洗浄されることを特徴とする、組換え体発現によるインターロイキン−4もしくはインターロイキン−4の突然変異蛋白質の調製法。 - 封入体を洗浄するための洗浄剤が非イオン洗浄剤、イオン界面活性剤もしくは双性イオン洗浄剤である請求項1記載の方法。
- 洗浄剤がCHAPS、CHAPSO、デスオキシコレートおよびzwittergentシリーズ(N−アルキル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート)の群から選択される双性イオン洗浄剤である請求項1記載の方法。
- 封入体のための洗浄バッファーが7と10の間のpHを維持するバッファーである請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 洗浄バッファーが更にキレート物質を含む請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- キレート形成物質がエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール−O,O’−ビス−(2−アミノエチル)−N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、ニトリロ酢酸(NTA)もしくはトランス−1,2−ジアミノ−シクロヘキサン−N,N,N’,N’−四酢酸(CDTA)の群から選択される請求項5記載の方法。
- 組換え蛋白質がインターロイキン4 R121D Y124Dである請求項1〜6記載の方法。
- 復元(e)が場合により人工的シャペロンの存在下で透析、ダイアフィルトレーションもしくは希釈により実施される請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 復元(e)が人工的シャペロンの存在下で実施される請求項8記載の方法。
- 精製(f)がクロマトグラフィーにより実施される請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
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