KR101067525B1 - 헤파린 결합 단백질의 재조합 생산 - Google Patents

Abstract

이질성 숙주 세포에서 생산된, 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수 및 정제하는 방법은 가용화된 단백질을 예로서, 덱스트란 설페이트와 같은 다중 음이온 종과 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.

헤파린 결합 단백질, 황산화된 다중 음이온제, 리폴딩, 정제, 회수

Description

헤파린 결합 단백질의 재조합 생산 {RECOMBINANT PRODUCTION OF HEPARIN BINDING PROTEINS}

관련 출원

본 출원은 2005년 12월 22일 출원된 미국 가출원 제60/753,615호, 및 2006년 7월 14일 출원된 미국 가출원 제60/807,432호 (이들 명세서 전문이 본원에서 참고로 인용됨)에 관한 우선권과, 그에 대한 잇점을 주장한다.

본 발명은 세포 배양물에서 생산된 헤파린-결합 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 원핵 숙주 세포에서 생산되고, 이들 세포, 전형적으로는 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간내 존재하는 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수 및 정제하는 방법을 포함한다. 원핵 숙주 세포에서 생산된 헤파린 결합 단백질은 또한 가용성 단백질, 또는 가용성 및 불용성 단백질의 혼합물로서 발견될 수 있다.

자연발생적으로 생성되고, 생물학적으로 활성인 매우 다양한 폴리펩티드가 헤파린에 결합하는 것으로 알려져 있다. 그러한 헤파린-결합 폴리펩티드로는 사이토카인, 예로서, 혈소판 인자 4 및 IL-8 (문헌 [Barber et al, (1972) Biochim . Biophys. Acta. 286:312-329]; [Handin et al, (1976) J. Biol . Chem . 251:4273-422]; [Loscalzo et al., (1985) Arch . Biochem . Biophys. 240:446-455]; [Zucker et al., (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 86:7571-7574]; [Talpas et al., (1991) Biochim . Biophys . Acta . 1078:208-218]; [Webb et al., (1993) Proc . Natl. Acad . Sci . USA. 90:7158-7162]); 헤파린-결합 성장 인자(문헌 [Burgess and Maciag, (1989) Annu . Rev . Biochem. 58:576-606]; [Klagsbrun, (1989) Prog. Growth Factor Res . 1:207-235]), 예로서, 표피 성장 인자(EGF); 혈소판-유래 성장 인자(PDGF); 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF); 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF); 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 및 간세포 성장 인자(HGF) (문헌 [Liu et al., (1992) Gastrointest . Liver Physiol. 26:G642-G649]); 및 셀렉틴, 예로서, L-셀렉틴, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴 (문헌 [Norgard-Sumnicht et al, (1993) Science. 261:480-483)을 포함한다. 또한, 문헌 [Munoz and Linhardt., (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol. 24:1549-1557]도 참조한다.

국제 공개 번호 WO 95/07097에는 치료용의, 정제된 천연 헤파린 또는 기타 다중 음이온 화합물과 함께, 헤파린 결합 성장 인자, 예로서, VEGF를 비롯한 헤파린 결합 단백질의 제제가 기재되어 있다. 헤파린 유래 올리고당 및 다양한 기타의 다중 음이온 화합물이 헤파린 결합 성장 인자에 대한 활성 입체 형태를 안정화시키는 것으로 나타났고 (문헌 [Barzu et al., (1989) J. Cell. Physiol . 140:538-548]; [Dabora et al., (1991) J. Biol . Chem . 266:23627-23640]), 헤파린 친화성 크로마토그래피가 다양한 정제 방식으로 사용되어 왔다 (일반적으로 국제 공개 번 호 WO 96/02562 참조).

많은 포유동물 기원의 헤파린 결합 단백질은 재조합 기술에 의해 생산되었고, 임상적 관련성을 갖는다 (문헌 [Munoz and Linhardt, (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol. 24:1549-1557]; [Favard et al. (1996) Diabetes and Metabolism 22(4):268-73]; [Matsuda et al., (1995) J. Biochem. 118(3):643-9: Roberts et al., (1995) Brain Research 699(1):51-61]). 예를 들면, VEGF는 혈관 내피 세포에 대하여 효능이 있는 미토겐이다. 이는 또한 혈관 투과 인자(VPF)로도 알려져 있다. 문헌 [Dvorak et al., (1995) Am . J. Pathol. 146: 1029-39]를 참조한다. VEGF는 배아의 혈관계 발생인 혈관형성(vasculogenesis), 및 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정인 혈관신생(angiogenesis), 둘 모두에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 문헌 ([Ferrara, (2004) Endocrine Reviews 25(4):581-611]; [Risau et al., (1988) Dev . Biol. 125:441-450]; [Zachary. (1998) Intl . J. Biochem Cell Bio 30:1169-1174]; [Neufeld et al., (1999) FASEB J. 13:9-22]; [Ferrara (1999) J. Mol Med. 77:527-543]; 및 [Ferrara and Davis-Smyth, (1997) Endocri . Rev. 18:4-25])을 참조한다. VEGF에 대한 임상적 적용으로는 상처 치유를 촉진시킬 때 (예를 들면, 국제 공개 번호 WO 91/02058; 및 2006년 6월 16일 출원된 것으로 발명의 명칭이 "Wound Healing"인, 변리사 문서 번호 P2358R1 참조), 예를 들어, 간 (예를 들어, WO2003/0103581 참조), 뼈 (예를 들어, WO2003/094617 참조) 등과 같은 조직 성장 및 수복을 촉진시킬 때 새로운 모세혈관계의 성장이 지시되는 경우를 포함한다. 문헌 [[Ferrara, (2004) Endocrine Reviews 25(4):581- 611]도 참조한다.

전형적으로, 치료학적으로 관련된 재조합 단백질은 다양한 숙주 유기체에서 생산된다. 대부분의 단백질은 진핵 숙주, 예로서, CHO 세포에서 그의 천연 형태로 발현될 수 있다. 동물 세포 배양물은 일반적으로 최대 세포 밀도에 도달하기 위해서는 장기간의 배양 시간이 필요하며, 궁극적으로는 원핵 세포 배양물보다 더 낮은 세포 밀도에 도달한다 (문헌 [Cleland, J. (1993) ACS Symposium Series 526, Protein Folding : In Vivo and In Vitro, American Chemical Society]). 추가로, 동물 세포 배양물은 종종 원하는 단백질의 회수를 방해할 수 있는 배양 성분을 함유하는 값비싼 배지를 필요로 한다. 세균 숙주 발현 시스템은 재조합 단백질의 제조업 규모의 생산에 대한 대안이자, 비용면에서 효율적인 대안을 제공한다. 재조합 단백질의 일반 세균 발현에 관한 미국 특허는 다수 존재하며, 이는 미국 특허 번호 제4,565,785호; 제4,673,641호; 제4,795,706호; 및 제4,710,473호를 포함한다. 생산 방법의 주된 장점은 원심분리 또는 정밀여과에 의해 세포 성분으로부터 산물을 용이하게 단리시킬 수 있다는 능력이다. 예를 들어, 문헌 ([Kipriyanov and Little, (1999) Molecular Biotechnology, 12: 173-201]; 및 [Skerra and Pluckthun, (1988) Science. 240: 1038-1040])을 참조한다.

재조합 헤파린 결합 성장 인자, 예로서, 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자는 세균을 비롯한 다수의 공급원으로부터 회수되고 정제되었다 (문헌 [Salter D. H. et al., (1996) Labor . Invest. 74(2):546-556 (VEGF)]; [Siemeister et al., (1996) Biochem . Biophys . Res . Commun. 222(2):249-55 (VEGF)]; [Cao et al., (1996) J. Biol . Chem. 261(6):3154-62 (VEGF)]; [Yang et al., (1994) Gaojishu Tongxun. 4:28-31 (VEGF)]; [Anspach et al., (1995) J. Chromatogr . A 711(1): 129-139 (aFGF and bFGF)]; [Gaulandris (1994) J Cell. Physiol. 161(1): 149-59 (bFGF)]; [Estape and Rinas (1996) Biotech. Tech. 10(7):481-484 (bFGF)]; [McDonald et al., (1995) FASEB J. 9(3):A410 (bFGF)]). 그러나, 세균 발현 시스템, 예로서, E. 콜라이(E. coli)에는 단백질의 적절한 리폴딩을 촉진시키는 세포 기관이 존재하지 않으며, 일반적으로는 거대 단백질을 배양 배지로 분비하지 못한다. 세균 숙주 세포에서 발현되는 재조합 단백질은 종종 부분적으로 폴딩된 환원된 단백질 및 미스폴딩된 환원된 단백질의 조밀한 매스로 구성된 봉입체로서 발견된다. 이러한 형태인 재조합 단백질은 일반적으로 불활성이다. 예를 들면, VEGF의 주된 활성 형태는 165-아미노산 폴리펩티드 2개의 동종이량체이다 (VEGF-165). 이러한 구조에서, 각 서브유니트는 7쌍의 쇄내 이황화 결합과, 5쌍의 서브유니트의 공유결합에 영향을 주는 추가의 2쌍을 함유한다 (문헌 [Ferrara et al., (1991) J. Cell . Biochem . 47:211-218]). 천연 입체 형태는 헤파린에 용이하게 결합하는 것으로 보이는 강염기 도메인을 포함한다 (문헌 [Ferrara et al (1991), 상기 동일 문헌]). 효과적인 수용체 결합과 생물학적 활성을 위해서는 VEGF의 공유 이량체화가 필요시 된다 (문헌 [Potgens et al., (1994) J. Biol . Chem. 269:32879-32885]; [Claffey et al., (1995) Biochim . et Biophys . Acta 1246:1-9]). 세균 산물은 잠재적으로, 미스폴딩되고, 이황화 스크램블된 중간체를 수개 함유한다.

추가로, 리폴딩은 종종 미스폴딩되고, 이황화-연결된 이량체, 삼량체, 및 다량체를 생산한다 (문헌 [Morris et al., (1990) Biochem . J. 268:803-806]; [Toren et al., (1988) Anal . Biochem ., 169:287-299]). 이러한 회합 현상은 단백질 리폴딩시에, 특히 단백질이 고농도일 때 매우 공통적이며, 종종 부분적으로 폴딩된 중간체의 소수성 상호작용을 통한 회합을 포함하는 것으로 보인다 ([Cleland and Wang, (1990) Biochemistry 29:11072-11078]).

미스폴딩은 세포에서 발효시에 또는 단리 진행시에 발생한다. 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간으로부터 회수된 단백질은 가용화되어야 하고, 가용성 단백질은 천연 상태로 리폴딩되어야 한다. 정확하게, 생물학적으로 활성인 입체 형태로 단백질을 리폴딩하는 시험관내 방법은 기능성 단백질을 수득하기 위해 필수적이다. 봉입체로부터 회수된 단백질에 관한 전형적인 하류 공정은 고농도의 변성제, 예로서, 우레아에서 봉입체를 해리시킨 후, 변성제를 희석시켜 리폴딩이 일어날 수 있도록 하는 것을 포함한다. (미국 특허 번호 제4,512,922호; 제4,511,502; 및 제 4,511,503호 참조). 또한, 예를 들어, 문헌 ([Rudolph and Lilie, (1996) FASEB J. 10:49-56]; 및 [Fischer et al, (1993), Biotechnology and Bioengineering, 41:3-13])도 참조한다. 그러한 회수 방법은 보편적으로 최소한의 수정을 통해 봉입체로부터 생물학적으로 활성인 재조합 단백질을 회수하는데 적용될 수 있는 것으로 간주된다. 이들 방법이 헤파린 결합 단백질, 예로서, VEGF에 적용되어 왔다 (문헌 [Siemeister et al. (1996) 상기 동일 문헌]). 이들 방법은 그의 다른 안정화력을 통해 재조합 단백질을 그의 생물학적으로 활성인 입체 형태가 되도록 하기 이전에 무작위적인 이황화 결합을 제거하고자 하며, 부적절하게 폴딩된 중간체를 제거할 수 없거나, 적절하게 폴딩된 산물의 동질적인 군집을 제공하지 못할 수 있다.

미셀내 단일 단백질을 포위하거나 수지 상에서 분리한 후, 변성제를 제거함으로써 변성된 단백질의 리폴딩을 보조하는데 역미셀 또는 이온 교환 크로마토그래피가 사용되어 왔다 (문헌 ([Hagen et al., (1990) Biotechnol . Bioeng. 35:966-975]; [Creighton (1985) in Protein Structure Folding and Design (Oxender, D.L. Ed.) pp.249-251, New York: Alan R. Liss, Inc.])). 이들 방법은 단백질 응집을 방지하고, 적절한 리폴딩을 촉진시키는데 유용하였다. 리폴딩 속도 또는 리폴딩 정도를 변경시키기 위하여 단백질의 천연 구조에 대한 리간드 및 항체를 사용하여 입체 형태-특이적 리폴딩을 실시하여 왔다 (문헌 [Cleland and Wang, (1993), in Biotechnology, (Rehm H.-J., and Reed G. Eds.) pp 528-555, New York, VCH]). 예를 들면, 크레아틴 키나제는 천연 구조체에 대한 항체의 존재하에서 리폴딩되었다 (문헌 [Morris et al., (1987) Biochem. J. 248:53-57]). 항체 이외에도 리폴딩을 증진시키기 위하여 리간드 및 보조인자가 사용되어 왔다. 이들 분자가 천연 단백질의 형성 이후 폴딩 단백질과 상호작용할 수 있는 가능성은 보다 크다. 예를 들면, 페리시토크롬 c의 리폴딩 속도는 헴철의 축 위치에 대한 외인성 리간드에 의해 증진되었다 (문헌 [Brems and Stellwagon, (1983) J. Biol . Chem. 258:3655- 3661]). 샤페론 단백질 또한 단백질 폴딩을 보조하는데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421]을 참조 한다.

생물학적으로 불활성인 중간체를 제거하거나 감소시키고, 고도로 정제되고 생물학적으로 활성이며 적절하게 리폴딩된 단백질의 회수를 개선시키면서, 일반적으로는 단백질의 제조업 규모의 생산에 적용될 수 있으며, 예를 들면, 세균 세포 배양물에서 헤파린 결합 단백질을 효과적이고 경제적으로 생산하기 위한, 헤파린 결합 단백질을 폴딩하고/거나, 숙주 세포 배양물로부터 헤파린 결합 단백질을 회수하는, 신규하고 보다 효과적인 방법이 요구되고 있다. 하기 개시 내용을 검토함으로써 자명하게 되는 바, 본 발명은 이러한 요구와 기타 요구들을 다룬다.

본 발명의 요약

본 발명은 세포 배양물로부터 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수하고 정제하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 원핵 숙주 세포, 예를 들어, 세균 세포로부터 헤파린 결합 단백질을 회수하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 방법은 (a) 상기 세균 세포의 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간으로부터 불용성 헤파린 결합 단백질을 단리시키는 단계; (b) 카오트로픽제 및 환원제를 포함하는 제1 완충 용액 중에서 상기의 단리된 불용성 헤파린 결합 단백질을 가용화시키는 단계; 및 (c) 카오트로픽제 및 황산화된 다중 음이온제를 포함하는 제2 완충 용액 중에서 상기 가용화된 헤파린 결합 단백질의 리폴딩이 일어나는 시간 동안 그러한 조건하에 상기 헤파린 결합 단백질을 인큐베이션시키는 단계; 및 (d) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수하되, 이때, 황산화된 다중 음이온제와 함께 인큐베이션시킴으로써 회수되어진 단백질의 농도는 대조군과 비교하여 2 내지 10배 증가한 것인 단 계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제2 완충 용액은 추가로 아르기닌을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제2 완충 용액은 추가로 시스테인 또는 순한 환원제를 포함한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 예를 들어, 회수되어진, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 단백질의 단백질 농도는 2-8배 증가, 또는 회수되어진, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 단백질의 단백질 농도는 2-5배 증가, 또는 회수되어진, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 단백질의 단백질 농도는 3-5배 증가, 또는 회수되어진, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 단백질의 단백질 농도는 2-3배 증가되어 있다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 예를 들어, 회수되어진, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 단백질의 단백질 농도는 2.0배 초과, 2.5배 초과, 2.8배 초과, 3.0배 초과, 5배 초과, 6배 초과, 7.0배 초과, 및 8배 초과, 9배 초과 등으로 증가되어 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 생물학적으로 활성인 리폴딩된 VEGF의 단백질 농도는 3 내지 5-배 증가되어 있다.

본 발명의 공정은 광범위하게 헤파린 결합 단백질에, 및 특히 헤파린 결합 성장 인자에, 및 특히, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 적용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 황산화된 다중 음이온제는 약 3,000 내지 10,000 달톤이다. 하나의 실시태양에서, 본 생산 공정에 사용되는 황산화된 다중 음이온제는 덱스트란 설페이트, 황산나트륨 또는 헤파린 설페이트이다. 하나의 측면에서, 덱스트란 설페이트는 3,000 달톤 내지 10,000 달톤이다.

본 발명은 추가로 헤파린 결합 단백질의 정제만을 단독으로 하는 공정 및 방 법을 제공하거나, 본원에 기술되어 있는 바와 같이 헤파린 결합 단백질을 회수하는 것과 함께 하는 헤파린 결합 단백질 정제 공정 및 방법을 제공한다. 특정 실시태양에서, 정제 방법은 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 수산화인회석 크로마토그래피 지지체; 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체 및 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 정제 방법은 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 양이온 교환 지지체; 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 및 이온 교환 또는 혼합-매질 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함한다. 회수 단계를 위한 단계는 임의의 순서대로, 예를 들어, 순차적으로 또는 크로마토그래피 지지체의 순서를 변경시킴으로써 수행될 수 있다는 것에 주시한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명은 제조업 또는 산업 규모의 세포 배양물로부터 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수하고 정제하는 것을 제공한다.

도 1은 포로스(POROS) HE2/M 칼럼 (4.6 x 100 mm, 매사추세츠주 캠브리지에 소재하는 퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠(PerSeptive BioResearch Products)) 상에 로딩된 세균 균주 W3110에 의해 생산된 VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다. 예를 들면, 포로스 HE2/M 칼럼을, 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 10 mM 인산나트륨 (pH 7)에서 평형화시킨다. 10분에 걸쳐 10 mM의 인산염 나트륨 (pH 7) 중 0.15-2 M 염화나트륨으로부터 선형 구배를 사용하여 칼럼을 용리시킨다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 각 피크에서 회수된 단백질은 VEGF에 상응하지만, 오직 피크 3만이 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 2는 헤파린에 의한 천연의 적절하게 폴딩된 VEGF의 안정화를 나타낸 그래프를 도시한다. VEGF를, 5 mM EDTA, 0.2 M NaCl 및 10 mM 시스테인을 함유하는 50 mM HEPES (pH 8)에 현탁시킨다.

도 3A - 3D는 매사추세츠주 캠브리지에 소재하는 퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠에 의해 생산되고, 12 ㎍/ml 덱스트란 설페이트 5,000 달톤 (도 3A); 12 ㎍/ml 덱스트란 설페이트 8,000 달톤 (도 3B); 12 ㎍/ml 덱스트란 설페이트 10,000 달톤 (도 3C) 또는 25 ㎍/ml 헤파린 (도 3D), 3,000 달톤과 함께 인큐베이션되고, 포로스 HE2/M 칼럼 (4.6 x 100 mm, 매사추세츠주 캠브리지에 소재하는 퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠) 상에 로딩된, VEGF로부터의 크로마토그래프를 도시한다. 예를 들면, 칼럼을, 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 10 mM 인산나트륨 (pH 7)에서 평형화시킨다. 10분에 걸쳐 10 mM의 인산나트륨 (pH 7) 중 0.15-2 M 염화나트륨으로부터 선형 구배를 사용하여 칼럼을 용리시킨다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 각 피크에서 회수된 단백질은 VEGF에 상응하지만, 오직 피크 3만이 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 4는 규모가 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다.

도 5는 저 분자량(MW) 및 고 MW의 헤파린, 및 덱스트란 설페이트, 10,000 달 톤이 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다. 피크 3은 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 6은 황산나트륨이 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다. 피크 3은 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 7은 헤파린, 저 분자량 (MW) 및 고 MW, 및 덱스트란 설페이트, 5,000 달톤, 8,000 달톤, 및 10,000 달톤이 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다. 피크 3은 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 8은 헤파린 및 덱스트란 설페이트가 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다. 피크 3은 생물학적으로 활성인 것으로서, 적절하게 리폴딩된 VEGF에 상응하는 것이다.

도 9는 우레아 및 DTT가 세균 봉입체로부터의 VEGF 추출에 미치는 효과를 도시한다.

도 10은 우레아 및 DTT 농도가 VEGF 리폴딩에 미치는 효과를 도시한다.

도 11은 표시된 바와 같은 이황화 결합을 갖는 VEGF₁₆₅의 아미노산 서열 (서열 번호: 1)을 도시한다.

도 12는 전하를 띤 아미노산의 존재의 효과를 도시한다. 제2 완충 용액 중 0.75M 농도의 아르기닌 및 리신, 둘 모두는 유익한 반면, 히스티딘은 그를 포함하지 않는 완충 용액과 비교하여 첨가 효과가 거의 없다. 추가로 아르기닌은 0.1 내지 1M의 농도에서 유사한 효과를 갖는 것으로 나타났다.

도 13은 희석 효과를 리폴딩 효율(％)로서 도시하는데, 여기서, 희석율이 증가함에 따라 총 VEGF 농도는 낮아지지만, 희석율이 클수록 리폴딩 효율(％)은 더 높아진다.

정의

"헤파린" (헤파린산으로도 지칭됨)은 글라이코스아미노글리칸으로도 명명되는, 고도로 황산화된, 직쇄 음이온성 뮤코다당류의 이질성 군이다. 다른 것들 또한 존재할 수 있지만, 헤파린내 주요 당은 α-1-이듀론산 2-설페이트, 2-데옥시-2- 설프아미노-α-글루코스 6-설페이트, β-D-글루쿠론산, 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-글루코스, 및 L-이듀론산이다. 이들 당과 임의로 기타 당은 글리코시드 결합에 의해 결합하여 크기가 다양한 중합체를 형성한다. 그의 공유 결합된 설페이트 기 및 카복실산 기의 존재로 인하여 헤파린은 강한 산성을 띤다. 헤파린의 분자량은 공급원과 측정 방법에 따라 약 3,000 내지 약 20,000 달톤으로 다양하다.

천연 헤파린은 다양한 조직, 특히, 간, 및 폐, 및 수개의 포유동물 종에서 비만 세포의 구성 성분이다. 헤파린 및 헤파린 염 (헤파린 나트륨)은 상업적으로 이용가능하며, 이는 주로 다양한 임상적 상황하에서 항응고제로서 사용된다.

"덱스트란 설페이트"는 그의 주 구조가 D-글루코스 중합체인 덱스트란의 설페이트가다. 글루코스 및 임의로 기타 당은 α-D(1-6) 글리코시드 결합에 의해 결합하여 크기가 다양한 중합체를 형성한다. 공유 결합된 설페이트의 존재로 인하여 덱스트란 설페이트는 강한 산성을 띤다. 황 함량은 일반적으로 10％보다 적지 않고, 전형적으로는 약 15％-20％보다 적지 않으며, 글루코스 분자 1개당 3개 이하의 설페이트 기를 갖는다. 덱스트란 설페이트의 평균 분자량은 약 1,000 내지 약 40,000,000 달톤이다. 본 발명에 사용될 수 있는 덱스트란 설페이트의 예로는 미생물, 예로서, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroide) 및 L. 덱스트라니쿰(L. dextranicum)로부터 생산된 덱스트란의 설페이트를 포함한다.

본 발명의 범주내에서 사용되는 "다중 음이온제"는 상업적으로 이용가능한 정제된 천연 헤파린 제제, 및 기타 "다중 음이온제," 예로서, 황산나트륨, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트, 펜토산 (다중) 설페이트, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 및 케라탄 설페이트를 비롯한, 헤파린 결합 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 기술하는 것으로 의미된다. 본 발명과 관련하여 특히 유용한 것은 "황산화된 다중 음이온제," 예로서, 예를 들면, 다당류의 설페이트 유도체, 예로서, 헤파린 설페이트, 덱스트란 설페이트, 미국 특허 번호 제5,314,872호에 기재되어 있는 미생물, 예로서, 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)에 의해 생산된 사이클로덱스트린의 설페이트 뿐만 아니라, 기타 글리칸, 예로서, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속 또는 애그로박테리움(Agrobacterium) 속에 속하는 미생물에 의해 생산된 β-1,3 글루칸 설페이트, β-1,3 글루칸, 및 콘드로이틴 설페이트 뿐만 아니라, 황산화된 헤파린 단편이다.

상기 언급한 제제는 일반적으로 이용가능하고, 당업자에 의해 인지되고 있다. 예를 들면, 황산화된 헤파린 단편은 겔-투과 크로마토그래피에 의해 분획화된 헤파린-유래 올리고당 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 친화성-분획화된, 헤파린-유래 올리고당 제조는 문헌 [Ishihara et al., (1993) J. Biol . Chem ., 268:4675-4683]에 의해 보고되었다. 이러한 올리고당은 아질산을 사용한 부분 해중합반응, 수소화붕소나트륨을 사용한 환원, 및 겔 투과 크로마토그래피에 의한 분획화에 따라 상업용 돼지 헤파린으로부터 제조되었다. 생성된 2-, 4-, 6-, 8-, 및 10당류 풀을 세파로스(SEPHAROSE)™ 4B에 공유 결합된 인간 재조합 bFGF의 친화성 칼럼에 순차적으로 적용시키고, 염화나트륨 구배에 대한 반응으로 상기 칼럼으로부터의 용리에 기초하여 서브풀로 추가 분획화될 수 있다. 이로써 헥사(Hexa)-1 내지 헥사-5로 명시되는 5개의 풀을 수득하였고, 그의 구조 및 생물학적 활성이 추가로 평가되었다. 헥사-5C의 구조 및 그의 500-MHz NMR 스펙트럼은 문헌 [Tyrell et al., (1993) J. Biol . Chem . 268:4684-4689]의 도 5에 제시되어 있다. 이러한 6당류는 구조 [IdoA(2-OSO₃)α1-4GlcNSO₃(6-OSO₃)α1-4]₂IdoA(2-OSO₃)α1-4AMan_R(6-OSO₃)를 갖는다. 상기 논의된 모든 헤파린-유래 올리고당 뿐만 아니라, 기타의 헤파린-유사 올리고당이 본 발명에 적합하고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 6당류 및 보다 유니트 크기가 큰, 헤파린의 다당류 (예를 들어, 7-, 8-, 9- 및 10당류)가 사용된다. 추가로, 예를 들면, 고도한 황산화로 인하여 큰 순 음전하를 띠는 헤파린-유래 또는 헤파린-유사 올리고당을 사용하는 것이 이롭다.

본원에서 사용되는 "헤파린-결합 단백질" 또는 "HPB"라는 용어는 헤파린 (상기 정의된 바와 같음)에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 정의는 성숙한 형태, 프리 형태, 프리-프로 형태, 및 프로 형태의 천연 및 재조합적으로 생산된 헤파린-결합 단백질을 포함한다. 전형적인 헤파린-결합 단백질의 예는 "헤파린 결합 성장 인자"이며, 내피 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 성장 인자(HGF) (산란 인자로도 공지되어 있음) 및 신경 성장 인자(NGF), IL-8 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "혈관 내피 성장 인자," 또는 "VEGF"는 원래 문헌 [Castor, C. W., et al., (1991) Methods in Enzvmol. 198:391-405]에 개시된 아미노산 서열을 갖는 돼지 뇌하수체 소포 세포로부터 유래된 포유동물의 성장 인자와, 그와 함께, 상응하는 천연 VEGF의 정성적인 생물학적 활성을 갖는 그의 기능성 유도체를 지칭하는데, 이는 문헌 [Houck et al., (1991) Mol Endocrin. 5:1806-1814]에 보고된 바와 같은 인간 VEGF 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 문헌 ([Leung et al. (1989) Science . 246:1306], 및 [Robinson ＆ Stringer, (2001) Journal of Cell Science . 144(5):853-865], 미국 특허 번호 제5,332,671호도 참조한다. VEGF의 주된 형태는 7개의 분자내 이황화 결합과, 2개의 분자간 이황화 결합을 형성하는 16개의 시스테인 잔기를 갖는 165 아미노산 동종이량체이다. 선택적인 스플라이싱이 121, 145, 165, 189 및 206개의 아미노산으로 구성된 다중 인간 VEGF 폴리펩티드의 형성과 연루되어 있지만, VEGF₁₂₁ 변이체에는 다른 변이체들이 헤파린 결합 도메인이 존재하지 않고, 그러므로, 본원에서 설명되는 헤파린 결합 단백질 정의에 포함되지 않는다. VEGF의 모든 이소폼은 공통 아미노-말단 도메인을 공유하지만, 분자의 카복실-말단부의 길이는 상이하다. VEGF의 바람직한 활성 형태인 VEGF₁₆₅는 각 단량체 중 아미노산 잔기들 사이, Cys26-Cys68; Cys57-Cys1O4; Cys61-Cys1O2; Cys117-Cys135; Cys120-Cys137; Cys139-Cys158; Cys146-Cys160에서 이황화 결합을 갖는다. 도 11을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Keck et al., (1997) Archives of Biochemistry and Biophysics 344(1): 103-113]도 참조한다. VEGF₁₆₅ 분자는 2개의 도메인: 아미노-말단 수용체-결합 도메인 (아미노산 1-110 이황화 결합된 동종이량체) 및 카복실-말단 헤파린-결합 도메인 (잔기 111-165)으로 구성된다. 예를 들어, 문헌 [Keyt et al., (1996) J, Biol . Chem. 271(13):7788-7795]을 참조한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 75번 잔기 (Asn)에서 당화되어 있지 않다. 예를 들어, 문헌 [Yang et al., (1998) Journal of Pharm . ＆ Experimental Therapeutics, 284: 103-110]을 참조한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 실질적으로 잔기 Asn10에서 탈아미드화되어 있지 않다(undeamidated). 본 발명의 특정 실시태양에서, 단리되고 정제된 VEGF₁₆₅는 탈아미드화된 (잔기 Asn10에서) 단백질 및 탈아미드화되어 있지 않은 단백질의 혼합물이되, 전형적으로 상기 단백질 대부분은 탈아미드화되어 있지 않은 단백질이다. VEGF₁₆₅는 동종이량체이기 때문에, 하나의 폴리펩티드 쇄 또는 둘 모두에서 탈아미드화가 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "적절하게 폴딩된" 또는 "생물학적으로 활성인" VEGF 또는 기타 HBP 등은 생물학적으로 활성인 입체 형태를 갖는 분자를 지칭한다. 당업자는 미스폴딩되고, 이황화 스크램블된 중간체가 생물학적 활성을 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러한 경우, 적절하게 폴딩되거나 생물학적으로 활성인 VEGF 또는 HBP는 VEGF (상기 기술된 바와 같음) 또는 기타 HBP의 천연 폴딩 패턴에 상응한다. 예를 들면, 적절하게 폴딩된 VEGF는 상기 언급한 이황화 쌍을 갖지만, 이량체 분자내 2개의 분자간 이황화 결합 이외의 다른 중간체가 세균 세포 배양물에 의해 생산될 수 있다 (도 1 및 3A-3D). 적절하게 폴딩된 VEGF의 경우, 2개의 분자간 이황화 결합은 각 단량체의 동일한 잔기, Cys51 및 Cys60 사이에서 발생한다. 예를 들어, WO98/16551 특허를 참조한다. VEGF의 생물학적 활성으로는 예를 들어, 혈관 투과 촉진, 혈관 내피 세포 성장 촉진, VEGF 수용체에 대한 결합, VEGF 수용체를 통하 결합 및 신호 전달 (예를 들어, 문헌 [Keyt et al., (1996) Journal of Biological Chemistry, 271(10):5638-5646] 참조), 혈관신생 유도 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "정제된" 또는 "순수한 HBP" 등은 보통 재조합적 생산, 및 특히, 원핵 또는 세균 세포 배양물에서 발견되는 것과 같은 것을 수반하는 물질이 존재하지 않는 물질을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 그의 계내 환경과 관련된 오염성 DNA, 숙주 세포 단백질 또는 기타 분자가 존재하지 않는 재조합 HBP를 지칭한다. 본 용어는 약 75％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상 또는 그 이상의 순도를 지칭한다.

"봉입체" 또는 "굴절반사 소체(refractile body)"라는 용어는 관심의 대상이 되는 응집된 폴리펩티드의 조밀한 세포내 매스를 지칭하며, 이는 모든 세포 성분을 비롯한 전체 세포 단백질 상당부로 구성되어 있다. 모든 경우가 그러한 것은 아니지만, 몇몇의 경우, 이러한 폴리펩티드 응집체는 1,000배 낮은 배율에서 위상차 현미경하에 세포의 봉입체(enclosure)내에서 육안으로 볼 수 있는 밝은 스폿으로서 인지될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "미스폴딩된" 단백질은 굴절반사 소체내 함유된, 침전되거나 응집된 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "불용성" 또는 "미스폴딩된" VEGF 또는 기타 HBP는 원핵 숙주 세포, 또는 다르게는 관련된 원핵 숙주의 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간내 함유된, 침전되거나 응집된 폴리펩티드를 지칭하고, 미스폴딩되거나, 이황화 결합이 형성되지 않은, 생물학적으로 불활성인 입체 형태를 취한다. 불용성 HBP는 일반적으로는 굴절반사 소체내 함유되어 있지만, 반드시 그러한 것은 아니며, 즉, 위상차 현미경하에 육안으로 볼 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "카오트로픽제"는 수용액 중 적합한 농도에서, 폴리펩티드가 수성 매질중 가용성이 되도록 그의 표면을 변경시켜 폴리펩티드의 공간 구성 또는 입체 형태를 변경시킬 수 있는 화합물을 지칭한다. 상기 변경은 예를 들어, 수화 상태, 용매 환경, 또는 용매-표면 상호작용을 변화시킴으로써 일어날 수 있다. 카오트로픽제의 농도는 그의 강도와 효과에 직접적으로 영향을 미칠 것이다. 강한 변성 카오트로픽 용액은 고농도로 카오트로픽제를 함유하는데, 이는 용액 내에서 단백질 2차 구조를 효과적으로 제거시키면서 상기 용액내 존재하는 폴리펩티드를 효과적으로 언폴딩시킬 것이다. 언폴딩은 상대적으로 광범위하지만 가역성일 것이다. 중간 정도의 변성 카오트로픽 용액은, 폴리펩티드가 취하는 어떠한 왜곡형 입체 형태부터라도 용액 내에서 가용성인 중간체를 거쳐 내재성 또는 동질성의 생리학적 조건하에 그가 활성 형태로 작동할 때에 그 자체가 발견되는 공간 입체 형태로 폴리펩티드를 부분적으로 폴딩시킬 수 있는 충분한 농도로 카오트로픽제를 용액 내에 함유한다. 카오트로픽제의 예로는 구아니딘 하이드로클로라이드, 우레아, 및 수산화물, 예로서, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함한다. 카오트로픽제는 이들 시약의 조합물, 예로서, 수산화물과 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 혼합물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "환원제"는 수용액내 적합한 농도로 유리 설프하이드릴 기를 유지시켜 분자내- 또는 분자간 이황화 결합이 화학적으로 파괴되도록 하는 화합물을 지칭한다. 적합한 환원제의 대표적인 일례로는 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), 베타-머캅토에탄올(BME), 시스테인, 시스테아민, 티오글리콜레이트, 글루타티온, 트리스[2-카복시에틸]포스핀(TCEP), 및 수소화붕소나트륨을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "완충 용액"은 그의 산성-염기성 접합체 성분의 작용에 의해 pH에 대한 변화에 내성을 띠는 용액을 지칭한다.

본원의 목적을 위한 "세균"은 진정 세균 및 고세균을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 그램-양성 및 그램-음성 세균을 비롯한 진정 세균이 본원에 기술된 방법 및 공정에 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 그램-음성 세균, 예를 들어, 엔테로박테리아세애(Enterobacteiaceae)가 사용된다. 엔테로박테리아세애에 속하는 세균의 예로는 에스케리키아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus ), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 시겔라(Shigella)를 포함한다. 다른 유형의 적합한 세균으로는 아조토박터(Azotobacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla ), 및 파라코쿠스(파라코쿠스)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, E. 콜라이가 사용된다. 적합한 E. 콜라이 숙주로는 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325), E. 콜라이 294 (ATCC 31,446), E. 콜라이 B, 및 E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537)을 포함한다. 이들 예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것이며, W3110은 일례이다. 상기-언급한 세균 중 임의의 것의 돌연변이체 세포 또한 사용될 수 있다. 물론, 세균 세포에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적합한 세균을 선택하는 것이 필요하다. 예를 들면, E. 콜라이, 세라티아, 또는 살모넬라 종은, 잘-알려져 있는 플라스미드, 예로서, pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410을 사용하여 레플리콘을 공급하고자 할 때 숙주로서 적합하게 사용될 수 있다. 적합한 세균 숙주 세포의 일례와 관련하여 추가로 하기를 참조한다.

본원에서 사용되는 바, "세포," "세포주," "균주," 및 "세포 배양물"이라는 표현은 상호교환적으로 사용되고, 그렇게 명시하는 것은 모두 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포와, 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 고의적이거나 부주의적인 돌연변이화에 기인하여 모든 자손의 DNA 함량은 정확하게 동일할 수 없다는 것도 이해하여야 한다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 명확하게 명시하고자 하는 경우, 이는 문맥으로부터 명백해질 것이다.

본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 초과의 아미노산을 갖는, 임의 세포로부터 기원된 펩티드 및 단백질을 지칭한다. "이질성" 폴리펩티드는 사용된 숙주 세포에 대하여 외래의 것인 폴리페티드, 예로서, E. 콜라이에 의해 생산된 인간 단백질이다. 이질성 폴리펩티드는 원핵성 또는 진핵성의 것일 수 있지만, 진핵성이 바람직하고, 포유동물의 것이 더욱 바람직하며, 인간의 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 이는 재조합적으로 생산되거나, 재조합 폴리펩티드이다.

헤파린 결합 단백질

헤파린 결합 단백질 단리

불용성의, 미스폴딩된 헤파린 결합 단백질(HBP)은 당업계의 많은 표준 기법들중 임의의 것에 의해 단백질을 발현시키는 원핵 숙주 세포로부터 단리된다. 예를 들면, 대부분의 숙주 단백질을 가용화시키기는데 적합한 이온 강도를 갖지만, 그 안에서 대상 단백질은 실질적으로 불용성인 완충액에 세포를 노출시키거나, 세포를 파괴하여 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간으로부터 단백질 또는 봉입체를 유리시키고, 그를 예를 들면, 원심분리에 의해 회수할 수 있도록 함으로써 불용성 HBP를 적합한 단리용 완충액에서 단리시킨다. 이러한 기법은 잘 알려져 있고, 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,511,503에 기재되어 있다. 클라이트(Kleid) 등은 균질화시킨 후 원심분리하여 굴절반사 소체를 정제하는 것에 관하여 개시하였다 (문헌 [Kleid et al., (1984) in Developments in Industrial Microbiology, (Society for Industrial Microbiology, Arlington, VA) 25:217-235]). 또한, 예를 들어, 문헌 [Fischer et al., (1993) Biotechnology and Bioengineering 41 :3-13]을 참조한다.

미국 특허 번호 제5,410,026호에는 봉입체로부터 단백질을 회수하는 전형적인 방법이 기재되어 있고, 하기와 같이 요약된다. 원핵 세포를 적합한 완충액에 현탁시킨다. 전형적으로, 완충액은 pH 5 내지 9, 또는 약 6 내지 8 사이에서 완충처리하기에 적합한 완충제 및 염으로 구성된다. NaCl을 비롯한 임의의 적합한 염은 완충 용액에서 충분한 이온 강도를 유지시키는데 유용하다. 전형적으로, 약 0.01 내지 2 M, 또는 0.1 내지 0.2 M의 이온 강도가 사용된다. 이러한 완충액에 세포를 현탁시키는 동안, 통상 사용되는 기법, 예를 들면, 기계적인 방법, 예를 들어, 균질기 (맨톤-가울린(Manton-Gaulin) 프레스, 미세 유동화기, 또는 니로-사오비(Niro-Soavi)), 프렌치 프레스, 비드 밀, 또는 초음파 발진기를 사용함으로써, 또는 화학적 또는 효소적 방법에 의해 파괴되거나, 용해된다.

세포를 파괴시키는 화학적 또는 효소적 방법의 일례로는 세균 벽을 용해시키기 위하여 리소자임을 사용하는 것을 포함하는 스페로플라스트화 (문헌 [H. Neu et al., (1964) Biochem . Biophys. Res . Comm ., 17:215]), 및 고장성 용액, 및 저장성 냉수 세척제로 생육성 세포를 처리하여 폴리펩티드를 유리시키는 것을 포함하는 삼투압 충격 (문헌 [H. Neu et al., 1965 J. Biol . Chem. 240(9):3685-3692])을 포함한다. 초음파는 일반적으로 분석 규묘 용량의 발효 브로쓰내 함유된 세균을 파괴시키는데 사용된다. 전형적으로 고압 균질화는 대규모로 사용된다.

세포를 파괴시킨 후, 전형적으로 현탁액을 저속으로, 일반적으로, 예를 들어, 500 내지 15,000 x g으로 원심분리시킨다. 본 발명의 하나의 실시태양에서는 표준 원심분리법에서 실질적으로 모든 불용성 단백질을 펠릿화시키기에 충분한 시간 동안 약 12,000 x g를 사용한다. 상기 시간은 간단하게 결정될 수 있고, 이는 원심분리하려는 부피 뿐만 아니라, 원심분리 디자인에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 약 10분 내지 0.5시간이 불용성 단백질을 펠릿화시키기에 충분하다. 하나의 실시태양에서, 현탁액은 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리된다.

생성된 펠릿은 실질적으로 모든 불용성 단백질 분획을 함유한다. 세포 파괴 공정이 완성되지 않았다면, 펠릿은 또한 무손상 세포 또는 파손된 세포 단편을 함유할 수 있다. 소량의, 상기와 동일한 완충 용액에 펠릿을 재현탁시키고, 위상차 현미경을 사용하여 검사함으로써 세포 파괴의 완결성을 검정할 수 있다. 파손된 세포 단편 또는 온전한 세포가 존재하는 것은 단편 또는 세포 및 관련된 비-굴절반사 폴리펩티드를 제거하기 위해 추가의 초음파 또는 기타 파괴 수단이 필요하다는 것을 지시한다. 그러한 추가의 파괴 이후, 필요하다면, 현택액을 다시 원심분리하고, 펠릿을 회수하고, 재현탁시키고, 재검사한다. 본 공정은 육안 검사로 펠릿화된 물질내 파손된 세포 단편이 존재하지 않는 것으로 나타날 때까지, 또는 추가 처리를 통해 생성된 펠릿의 크기를 축소시키지 못할 때까지 반복된다.

상기 공정은 불용성 단백질이 세포내에 존재하든, 원형질막주위 공간에 존재하는 간에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 헤파린 결합 단백질을 단리시키기 위해 본원에서 주어진 조건은 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간에 침전된 봉입체에 관한 것이고, 특히, VEGF에 관한 것이다. 그러한 본 공정 및 방법은 일반적으로 하기 텍스트 전역에 걸쳐 언급된 바와 같이, 최소한의 수정을 통해 헤파린 결합 단백질에 적용될 수 있는 것으로 사료된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본 공정 및 방법은 HBP의 제조 또는 산업적 규모의 생산, 리폴딩, 및 정제에 적용될 수 있다.

헤파린 결합 단백질 리폴딩

실질적으로 헤파린 결합 단백질을 가용화시키기에 충분한 양으로 카오트로픽제 및 환원제를 함유하는 제1 완충 용액에서 단리된 불용성의, 미스폴딩된 헤파린 결합 단백질을 인큐베이션시킨다. 헤파린 결합 단백질 중 일부 또는 실질적으로 그 모두를 가용화시킬 수 있는 농도, 인큐베이션 시간, 및 인큐베이션 온도 조건하에, 및 언폴딩이 일어날 수 있도록 하는 조건하에서 인큐베이션시킨다.

완충 용액에서의 가용화도 측정은 간단히 측정될 수 있고, 이는 예를 들면, 혼탁도 측정에 의해, 환원된 SDS-PAGE 겔 상에서의 원심분리 이후의 상등액과 펠릿 사이의 분획화 분석에 의해, 단백질 검정법에 의해 (예를 들어, 브래드포드 시약(Bradford reagent) 단백질 검정법 (예를 들어, 피어스(Pierce), 바이오-래드(Bio-Rad) 등)), 또는 HPLC에 의해 적합하게 수행된다.

제1 완충 용액은 완충액의 pH 범위를 약 7.0 이상으로 유지시키는데 적합한 완충제를 포함하며, 전형적인 pH 범위는 7.5-10.5이다. 하나의 실시태양에서, VEGF에 대한 pH는 pH 8.0이다. 상기에서 후자의 범위내의 pH를 제공하는 적합한 완충액의 예로는 트리스-HCl (트리스[하이드록시메틸]아미노메탄), HEPPS (N-[2-하이드로시에틸]피페라진-N'-[3-프로판-설폰산]), HEPES (N-[2-하이드로시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산])), CAPSO (3-[사이클로헥실아미노]-2-하이드록시-1-프로판설폰산), AMP (2-아미노-2-메틸-1-프로판올), CAPS (3-[사이클로헥실아미노]-1-프로판설폰산), CHES (2-[N-사이클로헥실아미노]에탄설폰산), 글리신, 및 아세트산나트륨을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본원의 완충액은 약 pH 8.0의 HEPPS이다. 추가의 실시태양에서, 완충액, 예로서, HEPPS는 황산화된 것이다.

본 발명을 실시하는데 적합한 카오트로픽제는 예를 들어, 우레아 및 구아니딘 또는 티오시안산 염, 예를 들어, 우레아, 구아니딘 하이드로클로라이드, 티오시안산 나트륨 등을 포함한다. 완충액내 존재하여야 하는 카오트로픽제의 양은 용액내 HBP를 언폴딩하는데 충분한 양이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 카오트로프는 약 4 내지 약 10몰로 존재한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 카오트로픽제는 약 5-8 M, 또는 약 7 M의 우레아이다. 또다른 실시태양에서, 카오트로픽제는 약 6-8 M의 구아니딘 하이드로클로라이드이다.

적합한 환원제의 일례로 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨(DTE), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인, DTE 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 완충액내 존재하는 환원제의 양은 주로 환원제 및 카오트로픽제의 유형, 사용되는 완충액의 유형 및 pH, 용액내 혼입되거나, 그에 도입된 산소의 양, 및 완충액내 단백질의 농도에 따라 달라질 것이다. 4-8 M의 우레아를 함유하는, pH 7.0-10.0의 완충액내 0.5-1.5 mg/ml 단백질이 존재하는 경우, 환원제는, 예를 들어, DTT는 약 1-15 mM 농도이거나, BME는 약 0.2-2 mM 농도이거나, 시스테인은 약 2-10 mM 농도이다. 하나의 실시태양에서, 환원제는 약 0.5 내지 약 4 mM, 또는 2-4 mM의 DTT이다. 도 9는 VEGF 추출에 우레아 및 DTT가 미치는 효과를 도시한다. 피크 3 VEGF는 적절하게 폴딩된 것으로서, 생물학적으로 활성인 VEGF를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 환원제는 약 10 mM의 DTT이다. 단일 환원제 또는 환원제 조합물이 본원의 완충액에 사용될 수 있다.

완충 용액 중 단백질의 농도는 광학 밀도에 의해 측정되는 바 단백질이 실질적으로 가용화되는 것이어야 한다. 정확한 사용량은 예를 들어, 완충액 중 다른 성분들의 농도 및 유형, 특히 단백질 농도, 환원제, 및 완충액의 pH에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 헤파린 결합 단백질의 농도는 1 ml당 0.5-5.5 mg 범위, 또는 1.5-5.0 mg/ml이다. 가용화는 적어도 약 1시간 내지 24시간 동안 전형적으로 약 0-45℃, 또는 약 20-40℃, 또는 약 23-37℃, 또는 약 25-37℃, 또는 약 25℃에서 수행된다. 하나의 실시태양에서, 가용화는 실온에서 약 2시간 이상 동안 수행된다. 전형적으로, 온도는 외관상으로 염, 환원제 및 카오트로픽제 수준에 의해 영향을 받지는 않는다.

폴리펩티드를 가용화시킨 후, 상기 기술된 바와 같은 카오트로픽제 및 황산화된 다중 음이온제를 함유하되, 카오트로픽제는 헤파린 결합 단백질의 리폴딩을 허용하는 농도로 함유하는 제2 완충 용액에 상기를 배치하거나 그에 희석시킨다.

가용성의, 미스폴딩된 단백질의 제2 인큐베이션 조건은 일반적으로 단백질의 리폴딩이 일부, 또는 상당, 또는 완전하게 일어날 수 있도록 하는 것이다. 정확한 조건은 완충액의 pH, 및 황산화된 다중 음이온제의 유형 및 농도, 및 만약 존재한다면, 카오트로픽 및 환원제의 유형 및 농도에 따라 달라질 것이다. 인큐베이션 온도는 일반적으로 약 0-40℃, 또는 10-40℃이고, 인큐베이션은 리폴딩이 일어날 수 있도록 약 1시간 이상 동안 수행될 것이다. 특정 실시태양에서, 반응은 예를 들어, 약 15-37℃에서, 또는 20-30℃에서, 약 6 시간 이상 동안, 약 10 시간 이상 동안, 약 10 내지 48 시간 사이 동안, 또는 약 15 내지 20 시간 사이 동안, 또는 6 내지 20 시간 사이 동안, 또는 12 내지 24 시간 사이 동안 수행된다.

리폴딩 정도는 HPB의 방사능-면역검정법(RIA) 역가에 의해, 또는 예를 들어, 포로스 HE2/M 칼럼 (퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠) 또는 기타 적절한 헤파린 친화성 칼럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 적합하게 측정된다. RIA 역가 증가 또는 정확하게 폴딩된 HBP의 피크 크기 증가는 완충액내 존재하는 정확하게 폴딩된, 생물학적으로 활성인 HPB 양의 증가와 직접적으로 상관관계에 있다. RIA 또는 HPLC에 의해 측정되는 바, 정확하게 폴딩된 HPB 대 미스폴딩된 HPB의 비를 최대화시키기 위하여 인큐베이션이 수행된다.

하나의 실시태양에서, 적절하게-폴딩된 VEGF의 정성 및 정량은 헤파린-결합 분석법을 사용하여 평가한다. 희석된 헤파린 결합 단백질을 함유하는 샘플을 예를 들어, 포로스 HE2/M 칼럼 (4.6 x 100 mm, 매사추세츠주 캠브리지에 소재하는 퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠) 또는 기타 적합한 헤파린 친화성 칼럼 상에 로딩한다. 예를 들면, 헤파린 친화성 칼럼을 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 pH 7의 10 mM 인산나트륨에서 평형화시킨다. 1 ml/분 또는 2 ml/분의 유속으로 10분에 걸쳐 10 mM의 인산나트륨 (pH 7)중 0.15-2 M 염화나트륨으로부터 선형 구배를 사용하여 칼럼을 용리시킨다. 용리액을 280 nm에서 모니터한다. 하나의 실시태양에서, 생물학적으로 활성인, 적절하게 리폴딩된 HBP에 상응하는 단백질을 단일 피크에서 회수한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 생물학적으로 활성인, 적절하게 리폴딩된 HBP를 측정하는 검정법은 RPHPLC이다. 이황화 결합은 임의로 펩티드 지도에 의해 확인할 수 있다. 원편광 이색성 분광 분석 또한 2 ＆ 3D 구조/폴딩을 측정하는데 사용될 수 있다.

제2 완충 용액용 완충액은 VEGF 리폴딩을 위해 예를 들어, 약 50 mM의 농도로 존재하는 예를 들어, HEPPS (pH. 8.0)와 같이 제1 완충 용액에 대하여 상기 열거된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 리폴딩 완충액을 사용하여 폴리펩티드를 예를 들어, 5배 이상, 또는 약 10배 이상, 약 20 이상, 또는 약 40배 이상으로 희석시킬 수 있다. 별법으로, 리폴딩 완충액에 대하여 폴리펩티드를 투석시킬 수 있다.

제2 완충 용액은 HPB가 리폴딩될 수 있도록 하는 농도로 카오트로픽제를 함유한다. 일반적으로, 카오트로프는 약 0.5 내지 2 몰 사이로 존재한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본원의 카오트로픽제는 약 0.5-2 M, 0.5-2 M, 또는 약 1 M의 우레아이다. 하나의 실시태양에서, 카오트로픽제는 농도 약 1.3 M의 우레아이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 카오트로픽제는 약 1 M의 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 도 10은 VEGF의 리폴딩에 대하여 우레아 및 환원제 DTT가 미치는 효과를 도시한다. 피크 3 VEGF는 적절하게 폴딩된 것으로서, 생물학적으로 활성인 VEGF를 지칭한다.

언급한 바와 같이, 용액은 임의로 환원제 또한 함유한다. 환원제는 시스테인인 경우, 약 0.5 내지 약 10 mM의 농도 범위, DTT인 경우, 0.1 - 1.0 mM의 농도 범위 및/또는 BME인 경우, 약 0.2 mM보다 작은 농도 범위로 가용화 단계를 위해 상기 기술된 것으로부터 적합하게 선택된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 환원제는 약 0.5-2 mM의 DTT이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 환원제는 약 0.5 mM의 DTT이다. 적합한 환원제의 예로는 디티오트레이톨(DTT), β-머캅토에탄올(BME), 시스테인, DTE 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. DTT 및 BME는 일반적으로 헤파린 결합 단백질에 대해 상기 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 바, 약 0.1 내지 약 10 mM의 시스테인과 약 0.1 내지 약 1.0 mM의 DTT의 조합물은 VEGF의 회수를 위한 일례이다.

리폴딩 단계는 가용화된 단백질을 완전히 리폴딩시키는데 충분한 농도로 황산화된 다중 음이온제를 포함한다. 적합한 다중 음이온제의 예는 본원 상기에 기재되어 있고, 예를 들면, 상기 언급된 다당류의 설페이트 유도체와 황산화된 다중 음이온제, 예로서, 헤파린 설페이트, 덱스트란 설페이트, 헤파린 설페이트, 및 콘드로이틴 설페이트 뿐만 아니라, 황산화된 헤파린 단편이 있다. 본 발명과 관련하여 사용되는 헤파린 설페이트의 경우, 분자량은 일반적으로 약 3,000 내지 10,000 달톤, 또는 약 3,000 내지 6,000 달톤이다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명과 관련하여 덱스트란 설페이트가 사용된다. 본 발명에서 사용되는 황산화된 다중 음이온 또는 기타 제제, 예로서, 덱스트란 설페이트의 분자량은 회수되는 특정 헤파린 결합 단백질의 크기에 따라 달라진다. 일반적으로, 약 3,000 및 10,000 달톤의 덱스트란 설페이트가 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 예를 들어, VEGF를 회수하는 경우, 약 5,000 달톤 내지 10,000 달톤의 덱스트란 설페이트가 사용된다. 또다른 실시태양에서, HBP를 회수하는 경우, 약 5,000 내지 8,000 달톤의 덱스트란 설페이트가 사용된다. 도 3A-3D는 헤파린 친화성 크로마토그래피에 의해 분석되는 바, 다양한 농도 및 분자량의 덱스트란 설페이트 (도 3A-C) 및 헤파린 (도 3D)을 사용하여 VEGF를 회수하는 것을 나타낸다. 피크 3은 적절하게 폴딩된 VEGF에 상응한다.

사용되는 다중 음이온 화합물의 농도는 회수되는 단백질 및 그의 농도, 및 조건, 예로서, 리폴딩 완충액의 온도 및 pH에 따라 달라진다. 전형적인 농도는 황산나트륨의 경우, 약 50 내지 500 mM 사이이고, 저 분자량 헤파린, 예로서, 6,000 달톤 헤파린 (시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.))의 경우, 약 10 내지 200 ㎍/ml 사이이고, 고 분자량 헤파린, 예로서, 돼지 헤파린 I-A (시그마 케미칼 코포레이션)의 경우, 약 10 내지 200 ㎍/ml 사이이며, 덱스트란 설페이트의 경우, 약 10 내지 400 ㎍/ml 사이, 또는 약 10 내지 200 ㎍/ml 사이이다.

리폴딩 완충액은 임의로 추가의 제제, 예로서, 각종 비-이온성 제제, 예로서, 예로서, 트리톤(TRITON)™ X-100, 노니뎃(NONIDET)™ P-40, 트윈(TWEEN)™ 시리즈 및 BRIJ™ 시리즈를 함유할 수 있다. 비-이온성 세정제는 0.01％ 내지 1.0％ 사이로 존재한다. 일례로, 비-이온성 세정제의 농도는 약 0.025％ 내지 0.05％ 사이, 또는 약 0.05％이다.

임의로, 양 전하를 띤 아미노산, 예를 들어, 아르기닌 (예를 들어, L-아르기닌/HCl), 리신 등이 리폴딩 완충액에 존재할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 아르기닌 농도는 예를 들어, 약 0-1000 mM, 또는 약 25 내지 750 mM, 또는 약 50-500 mM, 또는 약 50-250 mM, 또는, 최종 농도 약 100 mM 등이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 단백질은 최종 농도 0.5-3 M로 우레아를, 0-30 mg/L로 덱스트란 설페이트를, 0-0.2％로 트리톤 X-100을, 2-15 mM로 시스테인을, 0.1-1 mM로 DTT를 및 0-750 mM로 아르기닌을 함유하는 pH 7.0-9.0의 완충 용액내 존재한다. 하나의 실시태양에서, 50 mM HEPPS가 사용된다. 하나의 실시태양에서, 리폴딩 완충 용액의 최종 농도는 1 M 우레아, 50 mM HEPPS, 15mg/L 덱스트란 설페이트, 0.05％ 트리톤 X-100, 7.5 mM 시스테인, 100 mM 아르기닌, pH 8.0이다. 하나의 실시태양에서, 리폴딩 완충 용액의 최종 농도는 1.3 M 우레아, 50 mM HEPPS, 15mg/L 덱스트란 설페이트, 0.05％ 트리톤 X-100, 7.5 mM 시스테인, 0.5 mM DTT, 100 mM 아르기닌, pH 8.0이다.

헤파린 결합 단백질의 회수 및 정제

배양 배지로부터 헤파린 결합 단백질을 회수 및 정제하는 것은 상기 단백질을 분리시키기 위한 다양한 방법 및 공지 방법, 예로서, 염 및 용매 분획화, 콜로이드성 물질을 사용한 흡착, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피, 전기천공 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있지만, 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 수산화인회석 크로마토그래피 지지체; 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체 및 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고, 선택적으로 각각의 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 용리시키는 것을 포함하는 4 단계 크로마토그래피 방법을 일례로서 기술한다. 별법으로, 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 양이온 교환 지지체; 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 및 이온 교환 크로마토그래피 지지체와 접촉시키고, 선택적으로 각각의 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 용리시키는 것을 포함하는 또다른 크로마토그래피 방법을 기술한다. 방법의 단계들은 임의 순서로 실시될 수 있다는 것에 주시한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 단계는 순차적으로 실시된다.

헤파린 결합 단백질의 추가의 회수 및 정제에서 적합한 제1 단계는 특징적으로 헤파린 결합 단백질의 농도 및 샘플 용량을 감소시킨다. 예를 들면, 상기 기술된 제2 인큐베이션 단계는 회수되는 헤파린 결합 단백질의 용량을 대량으로 증가시킬 수 있고, 동시에 리폴딩 완충액내 단백질을 희석시킬 수 있다. 적합한 제1 크로마토그래피 지지체는 회수되는 헤파린 결합 단백질의 용량을 감소시키고, 원치않는 오염 단백질로부터 단백질을 일부 정제시킬 수 있다. 적합한 제1 크로마토그래피 단계는 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체 상에 용리될 수 있고, 직접 로딩될 수 있는, 크로마토그래피 지지체를 포함한다. 예를 들면, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체를 로딩하는데 적합한 것으로, 그로부터 고염농도의 헤파린 결합 단백질이 용리될 수 있는 크로마토그래피 지지체가 사용된다.

예시적인 제1 크로마토그래피 지지체로는 수산화인회석 크로마토그래피 지지체, 예를 들어, CHT 세라믹 I형 및 II형(공식적으로는 마크로프렙(MacroPrep) 세라믹으로 공지됨), 바이오-겔(Bio-Gel) HT, 바이오-겔 HTP(캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드(BioRad)) 등; 고정된 금속 이온, 예로서, 구리, 니켈 등의 불활성 수지로 구성된 금속 킬레이팅 크로마토그래피 지지체; 뿐만 아니라, 비-유도체화된 실리카겔을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, VEGF의 정제 및 회수를 위한 제1 크로마토그래피 지지체는 수산화인회석 크로마토그래피 지지체이다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, VEGF의 정제 및 회수를 위한 제1 크로마토그래피 지지체는 예를 들면, 하기에 더욱 상세히 기술되는 양이온 교환 지지체이다.

제1 크로마토그래피 지지체로부터의 용리는 당업계의 표준 실행법에 따라 달성된다. 적합한 용리 조건 및 완충액이 용리된 HPB를 하기 기술되는 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체에 직접 로딩하는 것을 촉진시킬 것이다.

소수성 상호작용 크로마토그래피는 당업계에 잘 알려져 있고, 이는 "크로마토그래피 지지체"에 부착된 소수성 리간드와 상호작용하는 분자의 소수성 부분의 상호작용에 입각한다. 매트릭스에 커플링된 소수성 리간드는 HIC 크로마토그래피 지지체, HIC 겔, 또는 HIC 칼럼 등으로서 다양하게 지칭된다. 추가로, 단백질과 HIC 칼럼 사이의 상호작용의 강도는 단백질 상의 비극성 대 극성 표면의 비 뿐만 아니라, 비-극성 표면의 분포와도 함수 관계에 있음을 이해한다.

다수의 매트릭스가 HIC 칼럼 제조에 사용될 수 있다. 실리카 및 유기 중합체 수지가 사용될 수 있지만, 가장 광범위하게 사용되는 것은 아가로스이다. 유용한 소수성 리간드로는 약 2 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기, 예로서, 부틸, 프로필, 또는 옥틸, 또는 아릴 기, 예로서, 페닐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 겔 및 칼럼용의 종래 HIC 지지체는 공급처, 예로서, 스웨덴 웁살라에 소재하는 GE 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터 제품명 부틸-세파로스™, 페닐-세파로스™ CL-4B, 옥틸 세파로스™ FF 및 페닐 세파로스™ FF하에, 및 공급처, 예로서, 일본 도쿄에 소재하는 토소 코포레이션(Tosoh Corporation)으로부터 제품명 토요펄(TOYOPEARL)™ 부틸 650M (프락토겔(Fractogels) TSK 부틸-650) or TSK-겔 페닐 5PW하에 상업적으로 이용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, VEGF의 정제 및 회수에서, 제1 HIC 크로마토그래피 지지체는 부틸-아가로스이고, 제2 소수성 크로마토그래피 지지체는 페닐 아가로스이다. 또다른 실시태양에서, 제1 HIC 크로마토그래피 지지체는 페닐 아가로스이다.

리간드 밀도는 단백질의 상호작용 강도 뿐만 아니라, 칼럼 용량에도 영향을 준다는 점에서 중요한 파라미터이다. 상업적으로 이용가능한 페닐 또는 옥틸 페닐 겔의 리간드 밀도는 약 5-40 μmol/ml 겔 상이다. 겔 용량은 당해의 특정 단백질 뿐만 아니라, pH, 온도 및 염 농도와 함수 관계에 있지만, 일반적으로 3-20 mg/ml 겔 범위에 포함되는 것으로 예측될 수 있다.

특정 겔을 선택하는 것은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 단백질의 상호작용 강도 및 HIC 리간드는 알킬 리간드의 쇄 길이에 따라 증가하지만, 대부분의 분리를 위해서는 약 4 내지 약 8개의 탄소를 갖는 리간드가 적합하다. 단백질의 방향족 기와의 pi-pi 상호작용 가능성 때문에 선택성이 상이할 수 있지만, 페닐 기는 펜틸 기와 거의 동일한 소수성을 갖는다.

단백질이 HIC 칼럼에 흡착되기 위해서는 고염농도가 유리하지만, 실제 농도는 선택된 특정 HIC 리간드와 단백질의 성질에 따라 폭넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 일반적으로 염 농도는 약 1 내지 4 M인 것이 유용하다.

단계식이든 또는 구배 형태이든 간에, 다양한 방식으로, 예로서, a) 염 농도를 변화시키거나, b) 용매의 극성을 변화시키거나, 또는 c) 세정제를 가함으로써 HIC 지지체로부터의 용리를 수행할 수 있다. 염 농도를 감소시킴으로써 단백질은 소수성이 증가하는 순서로 용리된다. 극성을 변화시키는 것은 예로서, 에틸렌 글리콜 또는 이소프로판올과 같은 용매를 첨가함으로써 소수성 상호작용의 강도를 감소시킴에 따라 수행될 수 있다. 세정제는 단백질의 여과기로서 작용을 하며, 주로 막 단백질의 정제와 관련하여 사용되어 왔다.

크로마토그래피용의 양이온 지지체를 형성하기 위하여 다양한 음이온 성분들이 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 성분들로는 카복시메틸, 설프에틸 기, 설포프로필 기, 인산염 및 설폰산염 (S)을 포함한다. 셀룰로스 이온 교환 수지 예로서, SE52 SE53, SE92, CM32, CM52, CM92, P11, DE23, DE32, DE52, 익스프레스 이온(EXPRESS ION)™ S 및 익스프레스 이온™ C는 영국 켄트주 메이드스톤에 소재하는 와트만 리미티드(Whatman LTD)로부터 이용가능하다. 세파덱스(SEPHADEX)™ 및 세파로스™ 기반 및 가교 결합된 이온 교환체는 또한 제품명 CM 세파덱스™ C-25, CM 세파덱스™ C-50 및 SP 세파덱스™ C-25 SP 세파덱스™ C-50 및 SP-세파로스™ 하이 퍼포먼스(High Performance), SP-세파로스™ 패스트 플로우(Fast Flow), SP-세파로스 XL, CM-세파로스™ 패스트 플로우, 및 CM-세파로스™, CL-6B하에 공지되어 있으며, 이들 모두는 GE 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터 이용가능하다. 본 발명의 실시를 위한 이온 교환체의 예로는, 예를 들면, 캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드(BioRad)로부터의 제품명 마크로프렙(MACROPREP)™ 예로서, 예를 들면 마크로프렙™ S 지지체, 마크로프렙™ 하이(High) S 지지체 및 마크로프렙™ CM 지지체하의 이온 교환체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

양이온 크로마토그래피 지지체로부터의 용리는 일반적으로 염 농도를 증가시킴으로써 수행된다. 이온 칼럼으로부터의 용리는 염을 첨가하는 것을 포함하기 때문에, 그리고, 상기 언급한 바와 같이, HIC에서 염 농도가 증가하기 때문에, 이온 단계 또는 기타 염 단계 이후에 HIC 단계를 도입하는 것이 임의로 사용된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 HIC 단계보다 앞선다.

VEGF를 정제하는 방법의 일례는 본원 하기에 기술되어 있고, 예를 들면, 실시예 V 및 VI를 참조한다. 리폴딩 이후, 풀 내의 불용성 물질은 심층 여과에 의해 제거한다. 이어서, 정화된 풀을 5-mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/pH 8에서 평형화된 세라믹 수산화인회석 (캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드)에 로딩한다. 비-결합 단백질은 평행 완충액으로 세척하여 제거하고, 50 mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/0.15 M 인산나트륨/pH 8의 등용매 단계를 사용하여 VEGF를 용리시킨다. VEGF 풀을 50 mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/0.15 M 인산나트륨/pH 8로 평형화된 부틸 세파로스™ 패스트 플로우 칼럼 (스웨덴 웁살라에 소재하는 GE 헬쓰케어) 상에 로딩시킨다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척하고, 칼럼 용출액에서 VEGF를 수집한다. 부틸 세파로스™ 풀을 50 mM HEPES/pH 8로 평형화된 마크로 프렙 하이 S 칼럼 (캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드)에 로딩한다. 흡광도 280 nm부터 기준선까지의 용출액을 세척한 후, 칼럼을 2 칼럼 용량의 50 mM HEPES/0.25 M 염화나트륨/pH 8로 세척한다. 50 mM HEPES/pH 8에서 0.25-0.75 M 염화나트륨으로부터 선형의, 8-칼럼-용량 구배를 사용하여 VEGF를 용리시킨다. 분획을 수집하고, 헤파린-결합 검정법에 의해 측정되는 바, 적절하게 폴딩된 VEGF를 함유한 것을 풀링시킨다.

마크로 프렙 하이 S 풀은 동량의 50 mM HEPES/0.8 M 시트르산나트륨/pH 7.5를 사용하여 조절한다. 이어서, 조절된 풀을 50 mM HEPES/0.4 M 시트르산나트륨/pH 7.5로 평형화된 페닐 5PW TSK 칼럼 (펜실베니아주 몽고메리빌에 소재하는 토소하아스(Tosohaas))에 로딩시킨다. 평형 완충액을 사용하여 칼럼 전반에 걸쳐 비-결합 단백질을 세척해 낸 후, 50 mM HEPES (pH 7.5)중 0.4-0 M 시트르산나트륨으로부터 10-칼럼-용량 구배를 사용하여 칼럼으로부터 VEGF를 용리시킨다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분획을 검정하고, 순도가 충분한 VEGF를 함유하는 것을 풀링시킨다.

숙주 세포에서 헤파린 결합 단백질의 발현

요컨대, 숙주 원핵 세포 게놈과 관련하여 자동 복제할 수 있고, 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다. 본원에 기술된 헤파린 결합 단백질의 뉴클레오티드 서열을 포함하여 적절한 발현 벡터를 작제하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]; [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols John Wiley and Sons (New Jersey) (2002)]; 및 [Baneyx, (1999) Current Opinion in Biotechnology, 10:411-421])를 참조한다. 세균을 비롯한 적절한 원핵 세포 발현 벡터는 예를 들면, 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)을 통해 상업적으로 이용가능하다. 원핵 세포, 및 특히, 세균 세포 배양물을 대량 배양하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 이들 방법은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.

예를 들면, 원핵 숙주 세포를 관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 코딩하는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 형질감염시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하도록 개질된 종래의 영양 배지에서 배양한다. 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 적합하게 임의의 공급원으로부터 유래된 RNA, cDNA, 또는 게놈 DNA이되, 단, 이는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드(들)를 코딩한다. 미생물 숙주에서 이질성 폴리펩티드 (그의 변이체 포함)를 발현시키는 적절한 핵산을 선별하는 방법은 잘 알려져 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 예를 들면, VEGF를 코딩하는 DNA는 예를 들어, VEGF를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 단리되고 서열 분석된다.

이질성 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 적합한 프로모터의 조절하에 미생물에서의 발현을 위한 복제가능한 벡터 내로 적합하게 삽입된다. 본 목적을 위해 많은 벡터가 이용될 수 있으며, 적절한 벡터를 선택하는 것은 주로 벡터 내로 삽입시키고자 하는 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환시키고자 하는 특정 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 각 벡터는 그와 상용성에 있는 특정 숙주 세포에 따라 다양한 성분들을 함유하게 된다. 특정 유형의 숙주에 따라 벡터 성분은 일반적으로 하기: 단일 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터, 및 전사 종결 서열중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 미생물 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 보통 복제 부위 뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형으로 선별될 수 있도록 하는 마킹 서열도 수반한다. 예를 들면, E. 콜라이는 전형적으로 E. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환된다 (예를 들어, 문헌 [Bolivar et al., (1977) Gene, 2: 95] 참조). pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하는 바, 이로써, 형질전환된 세포를 용이하게 동정할 수 있는 수단을 제공해 준다. pBR322 플라스미드, 또는 기타 세균 플라스미드 또는 파지는 또한 일반적으로 선별가능한 마커 유전자의 발현을 위해 숙주가 사용할 수 있는 프로모터를 함유하거나, 함유하도록 변형된다.

(i) 신호 서열

본 발명의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 이질성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있는데, 상기 이질성 폴리펩티드는 전형적으로 신호 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적인 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드이다. 선택된 이질성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱된 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단된) 것이다. 천연 폴리펩티드 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 페니실린, lpp, 또는 내열성 장독소 II 리더로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터는 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 상기 벡터를 복제시킬 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 그러한 서열은 각종 미생물에 대하여 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그램-음성 세균 예로서, E. 콜라이에 적합하다.

(iii) 선별 유전자 성분

발현 벡터는 일반적으로, 선별가능한 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 선택적인 배양 배지에서 배양시킨 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터를 이용하여 형질전환되지 않은 숙주 세포는 이러한 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 이러한 선별가능한 마커는 본 발명에 의해 이용되고 정의되는 바와 같은 유전자 마커와는 별도의 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 유전자 마커(들)의 존재에 의해 유발되는 것 이외의 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어, 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자가 있다.

선별 계획에 대한 한가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용하는 것이다. 이러한 경우, 관심의 대상이 되는 핵산을 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 폴리펩티드를 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 그러한 우성 선택의 예는 약물로서 네오마이신 (문헌 [Southern et al., J. Molec. Appl . Genet., 1: 327 (1982)]), 미코페놀산 (문헌 [Mulligan et al., Science, 209: 1422 (1980)]) 또는 하이그로마이신 (문헌 [Sugden et al., Mol. Cell . Biol., 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 상기 3가지 예들은 진핵세포 제어 하에 세균성 유전자를 이용하여 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (미코페놀산) 또는 하이그로마이신 각각에 대한 내성을 전달한다.

(ⅳ) 프로모터 성분

관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터는 숙주 유기체에 의해 인식되는 적합한 프로모터를 함유하고, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된다. 원핵 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터는 베타-락타마제와 락토스 프로모터 시스템 (문헌 ([Chang et al., (1978) Nature, 275: 615]; [Goeddel et al., (1979) Nature, 281: 544])), 아라비노스 프로모터 시스템 (문헌 [Guzman et al., (1992) J. Bacteriol., 174: 7716-7728]), 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, (1980) Nucleic Acids Res., 8: 4057(1980)] 및 EP 36,776) 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터 (deBoer et al., (1983) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80: 21-25])를 포함한다. 그러나, 기타 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있기 때문에, 당업자는 링커 또는 임의의 필요한 제한 부위를 제공하는 어댑터를 사용하여 이들 서열을 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결찰시킬 수 있을 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al., 상기 동일 문헌]; 및 [Ausubel et al., 상기 동일 문헌])을 참조한다.

일반적으로 세균 시스템에 사용되는 프로모터는 또한 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 포함한다. 이 프로모터를 제한 효소 분해에 의해 세균 공급원 DNA로부터 제거하여 원하는 DNA를 함유하는 벡터 내로 삽입시킬 수 있다.

(v) 벡터의 작제 및 분석

상기 열거된 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 결찰 기법을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 재단하고, 원하는 형태로 다시 결찰시켜 필요한 플라스미드를 생성시킨다.

작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하는 분석을 위해, 결찰 혼합물을 사용하여 E. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446) 또는 다른 균주를 형질전환시키고, 성공적인 형질전환체를 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별한다. 형질전환체로부터의 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고/거나, 문헌 ([Sanger et al., (1977) Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 74: 5463-5467] 또는 [Messing et al., (1981) Nucleic Acids Res ., 9: 309])의 방법에 의해, 또는 문헌 [Maxam et al., (1980) Methods in Enzvmology , 65: 499]의 방법에 의해 서열 분석한다. 또한 문헌 ([Sambrook et al., 상기 동일 문헌]; 및 [Ausubel et al., 상기 동일 문헌])을 참조한다.

관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 삽입한다. 전형적으로 이는, 숙주 세포를 상기-기술된 발현 벡터로 형질전환시키고, 다양한 프로모터를 유도하도록 적절하게 개질된 종래의 영양 배지에서 배양한다.

숙주 세포 배양

관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 발현시키는데 사용하기 위한 적합한 원핵 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 봉입체 형태로, 또는 원형질막주위 공간 또는 세포내 공간에서 풍부하게 재조합 단백질을 발현시키는 숙주 세포가 전형적으로 사용된다. 적합한 원핵생물로는 세균, 예를 들어, 진정 세균, 예로서, 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들면, E. 콜라이, 바실리(Bacilli), 예로서, B. 섭틸리스(B. subtilis), 슈도모나스 종, 예로서, P. 애루지노사(P. aeruginosa), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 또는 세라티아 마케스센스(Serratia marcescens)를 포함한다. E. 콜라이 숙주의 일례는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 기타 균주, 예로서, E. 콜라이 B, E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 또한 적합하다. 이들 예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것이다. 균주 W3110이 전형적인 숙주인데, 이는 균주 W3110이 재조합 DNA 산물 발효를 위해 공통적인 숙주 균주이기 때문이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비하여야 한다. 예를 들면, 균주 W3110은 단백질을 코딩하는 유전자내 유전자 돌연변이를 일으키도록 변형될 수 있고, 그러한 숙주의 일례로는 1995년 4월 25일 발행된 미국 특허 번호 제5,410,026호에 기재되어 있는 E. 콜라이 W3110 균주 1A2, 27A7, 27B4, 및 27C7을 포함한다. 예를 들면, VEGF 생산용 균주는 유전형 tonA Δ ptr3 phoA Δ E15 Δ (argF-lac)169 degP41 ilvg를 갖는, 49B3으로 명시되는 E. 콜라이 균주 W3110이다. 또다른 일례로, VEGF 생산용 균주는 유전형 Δ fhuA (Δ tonA ) ptr3 , lacl ^q , lacL8 , Δ ompT Δ( nmpC - fepE ) Δ degP ilvG⁺를 갖는 E. 콜라이 균주 (62A7)이다. 또한, 예를 들어, WO2004/092393의 23페이지부터 24페이지까지의 표를 참조한다.

관심의 대상이 되는 헤파린 결합 단백질을 생산하는데 사용되는 원핵 세포는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]에 의해 일반적으로 기재된 배지를 비롯한, 당업계에 알려져 있고 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 배양한다. 세균에 적합한 배지는 AP5 배지, 영양 브로쓰, 루리아-베르타니(LB) 브로쓰, 나이다르츠(Neidhardt's) 최소 배지, 및 C.R.A.P. 최소 또는 완전 배지와, 필요한 영양분 보충물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 배지는 또한 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하는, 발현 벡터의 작제에 기초하여 선택되는, 선별제를 함유한다. 예를 들면, 앰피실린이 앰피실린 내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위한 배지에 첨가된다. 탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 임의의 필요한 보충성분 또한 적절한 농도로, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충성분 또는 배지와의 혼합물로 도입된다. 임의로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.

적합한 배지의 예는 미국 특허 제5,304,472호 및 제5,342,763호에 주어져 있다. C.R.A.P. 인산염-제한 배지는 탈이온수(deionized H₂O)로 872 ml까지의 적량으로 조정되고, 오토클레이브되고; 55℃로 냉각되고 110 ml 1 M MOPS (pH 7.3), 11 ml 50％ 글루코스, 7 ml 1 M MgS0₄로 보충되는, KOH로 pH가 7.3으로 조정된, 3.57 g (NH₄)₂(SO₄), 0.71 g 시트르산나트륨-2H₂0, 1.07 g KCl, 5.36 g 효모 추출물(인증된), 5.36 g 하이케이스SF™-쉐필드(HycaseSF™-Sheffield)로 구성된다. 이어서, 50 ㎍/ml 농도의 카르베니실린이 유도 배양물에 첨가될 수 있다.

원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. 예를 들어, E. 콜라이 성장을 위한 온도는 예컨대, 약 20℃ 내지 약 39℃, 또는 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위이거나, 약 30℃이다.

알칼리성 포스파타제 프로모터가 사용되는 경우, 본 발명의 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 E. 콜라이 세포는 알칼리성 포스파타제 프로모터가 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, New York) (2001)]에 일반적으로 기재된 바와 같이 부분적으로 또는 완전하게 유도될 수 있는 적합한 배지에서 배양된다. 배양 필요성은 무기 인산염의 부재 또는 인산염 기아 수준에서 결코 일어나지 않는다. 처음에, 배지는 단백질 합성의 유도 수준 초과 및 세균 성장에 충분한 양으로 무기 인산염을 함유한다. 세포가 성장하고 인산염을 이용함에 따라, 그들은 배지 중의 인산염 수준을 감소시켜, 폴리펩티드의 합성 유도를 유발한다.

프로모터가 유도성 프로모터이면, 유도가 일어나기 위해, 전형적으로 세포는 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하기 위하여, 유도가 시작되는 (예를 들어, 유도제의 첨가에 의해, 배지 성분의 결핍에 의해 등) 시점에서, 특정의 광학 밀도, 예를 들어, 고 세포 밀도 방법을 이용하여 약 200의 A₅₅₀이 달성될 때까지 배양된다.

임의의 필요한 보충성분이 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함되고, 단독으로 또는 복합 질소원과 같은 다른 보충성분 또는 배지와의 혼합물로서 도입될 수 있다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라 약 5-9의 임의의 pH일 수 있다. E. 콜라이의 경우에는 pH가 약 6.8 내지 약 7.4이거나, 약 7.0이다.

헤파린 결합 단백질 제제화

예컨대, 본원에 기술된 방법을 사용하여 회수된 폴리펩티드는 약제학적으로 허용가능한 담체에서 제제화될 수 있고, 다양한 진단, 치료 또는 그러한 분자에 대해 알려진 다른 용도로 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술된 VEGF는 효소 면역검정법과 같은 면역검정법에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 수득된 헤파린 결합 단백질의 치료학적 용도 또한 주시된다. 예를 들어, 성장 인자 또는 호르몬, 예컨대, VEGF는 원하는 바와 같이 성장을 증진시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, VEGF는 예를 들어, 급성 상처 (예를 들어, 화상, 수술 상처, 일반 상처 등), 또는 만성 상처 (예를 들어, 당뇨성 궤양, 압력 궤양, 욕창, 정맥 궤양 등)의 상처 치유를 촉진시키는데, 모발 성장을 촉진시키는데, 조직 성장 및 수복 (예를 들어, 뼈, 간 등)을 촉진시키는 것 등에 사용될 수 있다.

헤파린 결합 단백질의 치료학적 제제는 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 분자, 예를 들어, 폴리펩티드를 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18 th edition, Gennaro, A. Ed. (1995)]). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량과 농도에서 수혜자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예로서, 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예로서, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 예로서, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은, 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 당질; 예로서, EDTA와 같은 킬레이팅제; 예로서, 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 솔비톨과 같은 당; 예로서, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 착물 및/또는 예로서, 트윈™, 플루로닉™, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

특정 실시태양에서, 생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균 상태이다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. HBP는 동결건조된 형태로 또는 수용액 또는 겔 형태로 저장될 수 있다. HBP 제제의 pH는 특정 경우에 하기의 pH보다 높거나 낮은 pH 값이 적절할 수 있지만, 예를 들면, 약 5 내지 8일 수 있다. 특정의 부형제, 담체, 또는 안정화제를 사용함으로써 HBP의 염이 형성될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

전형적으로, 상처 치유용의 HBP는 부위-특이적 전달을 위한 것으로 제제화된다. 국소 적용시, HBP는 예로서, 담체 및/또는 애쥬번트와 같은 다른 성분과 적합하게 배합된다. 상기 다른 성분들의 성질에 관한 제한은 없지만, 단, 상기 다른 성분들은 약제학적으로 허용가능하여야 하고, 그가 의도하는 투여에 대하여 효과가 있어야 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 유의적으로 분해하지 않아야 한다. 적합한 비히클의 예로는, 정제된 콜라겐을 포함하거나 포함하지 않는, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 임의로 액상 또는 반-액상 형태로 멸균 드레싱, 경피용 패취, 반창고, 및 붕대로 주입될 수도 있다.

겔 제제를 수득하기 위하여 액상 조성물로 제제화되는 HBP를 유효량의 수용성 다당류 또는 합성 중합체, 예로서, 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 국소 적용하기에 적절한 점성을 갖는 겔을 형성한다. 사용될 수 있는 다당류로는 예를 들면, 셀룰로스 유도체, 예로서, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들면, 메틸셀룰로스, 하이드로시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필 셀룰로스를비롯한 에테르화된 셀룰로스 유도체; 전분 및 분획된 전분; 아가; 알긴산 및 알긴산염; 아라비아 검; 풀루란; 아가로스; 카라기닌; 덱스트란; 덱스트린; 프락탄; 크실란; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체중합체; 뿐만 아니라, 검, 예로서, 크산탄 검; 구아 검; 로커스트 콩 검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검; 및 그의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 본원의 겔화제는 예를 들어, 생물 시스템에 불활성이고, 비독성이며, 제조가 간편하고/거나, 너무 유동성이거나(runny) 너무 점성을 띠지 않으며, 그 안에 함유된 HBP를 불안정화시키지 않는 것이다.

특정 실시태양에서, 다당류는 에테르화된 셀룰로스 유도체이고, 또다른 실시태양에서는, 잘 정의되고, 정제되고, USP에 열거되어 있는 것, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 하이드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예로서, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드로시에틸 셀룰로스, 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 하나의 실시태양에서, 메틸셀룰로스는 다당류이다. 메틸셀룰로스가 겔에 사용될 경우, 예를 들어, 이는 전형적으로 겔의 약 2-5％, 또는 약 3％, 또는 약 4％ 또는 약 5％로 포함되고, HBP는 겔 1 ml 당 약 300-1000 mg의 양으로 존재하게 된다.

겔화시키는데 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로, 적절한 점성을 얻기 위해 저 분자량 및 고 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 혼합물이다. 예를 들면, 페이스트를 수득하기 위해서는 분자량이 400-600인 폴리에틸렌 글리콜과 분자량이 1500인 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이 적절한 비율로 혼합될 때 본 목적에 효과적일 것이다.

다당류 및 폴리에틸렌 글리콜에 적용되는 바, "수용성"이라는 용어는 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르 기의 치환도에 의해 측정되고, 본원에 유용한 안정화 유도체는 셀룰로스 쇄내 무수글루코스 단위당 상기 에테르 기를 유도체가 수용성이 되도록 하는데 충분한 양으로 가져야 한다. 에테르 치환도는 무수글루코스 단위당 0.35개 이상의 에테르 기인 것이 일반적으로 충분하다. 추가로, 셀룰로스 유도체는 알칼리성 금속 염, 예를 들면, Li, Na, K, 또는 Cs 염 형태일 수 있다.

활성 성분을 또한 마이크로캡슐, 또는 지효성-방출 제제내 포획시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18 th edition, Gennaro, A. Ed. (1995)]를 참조한다. 또한, 문헌 ([Johnson et al, Nat . Med. 2:795-799 (1996)]; [Yasuda, Biomed . Ther. 27:1221-1223 (1993)]; [Hora et al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990)]; [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design : The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462]; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 미국 특허 번호 제5,654,010호; DE 3,218,121; [Epstein et al., (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 82: 3688-3692]; [Hwang et al., (1980) Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 77: 40304034]; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)를 참조한다.

하기 실시예는 제한적이라기 보다는 예시적인 것으로 제공되는 것이다.

실시예 1: 에스케리키아 콜라이에서 발현되는 재조합 인간 VEGF

재조합 인간 VEGF를 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰다. 합성시, 단백질은 원형질막주위 공간으로 분비되었고, 굴절반사 소체로서 축적되었다. 그러므로, 연구는 단백질의 추출 및 리폴딩을 달성하기 위하여 수행되었다. 본 연구를 통해 다중 음이온제를 첨가하지 않고 표준 회수 기법을 사용할 때 3종 이상의 VEGF가 단리되었음이 밝혀졌다 (도 1). 천연 VEGF를 사용한 연구에서는 헤파린 첨가가 카오트로프- 및 티올-유도성 변성에 대한 내성을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 2). 추가로, 헤파린은 소규모 리폴딩 실험에서 적절하게 리폴딩된 VEGF의 양을 증가시켰다. 이러한 결과를 대규모 공정에 적합화시키기 위해서, 헤파린과 구조상 유사 한 분자인 덱스트란 설페이트의 존재하에서 VEGF 리폴딩을 허용하는 조건을 밝혀냈다. 덱스트란 설페이트 첨가시, 적절하게 폴딩된 것으로서, 생물학적으로 활성인 VEGF의 수율은 대조군과 비교하여 3-5-배 개선되었다.

방법

VEGF ₁₆₅ 발현용 플라스미드 - E. 콜라이 원형질막주위에서 인간 VEGF₁₆₅의 발현을 위해 플라스미드 pVEGF171을 디자인하였다 (예를 들어, 문헌 [Leung et al, (1989) Science, 246:1306-1309] 참조). VEGF 코딩 서열의 전사는 알칼리성 포스파타제(AP) 프로모터의 엄격한 조절하에 배치된 반면 (예를 들어, 문헌 [Kikuchi et al., (1981) Nucleic Acids Research, 9:5671-8] 참조), 번역 개시에 필요한 서열은 샤인-달가노 부위에 의해 제공되었다 (예를 들어, 문헌 [Yanofsky et al., (1981) Nucleic Acids Research, 9:6647- 68]). 이후의, E. 콜라이 원형질막주위 내로 분비되도록 하기 위해 VEGF 코딩 서열을 세균 내열성 장독소 II(STII) 신호 서열 하류에 융합시켰다 (예를 들어, 문헌 ([Lee et al., (1983) Infect. Immun. 42:264-8]; 및 [Picken et al., (1983) Infect . Immun. 42:269-75]) 참조). STII 신호 서열내 코돈 변형은 번역 수준을 조절함으로써 원형질막주위내 VEGF를 최적 수준으로 축적시켰다 (예를 들어, 문헌 [Simmons and Yansura, (1996) Nature Biotechnoloy, 14:629-34]). 전사 종결 인자에 대한 람다 (예를 들어, 문헌 [Scholtissek and Grosse, (1987) Nucleic Acids Research 15:3185] 참조)는 VEGF 번역 종결 코돈 하류에 위치시켰다. 복제 기점, 및 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자 둘 모두가 플라스미드 pBR322에 의해 제공되었다. 예를 들어, 문헌 [Bolivar et al., (1977) Gene 2:95-113]를 참조한다.

세포 균질화 및 굴절반사 소체 제조 - 수거한 에스케리키아 콜라이 세포를 냉동시키고, -70℃에서 저장하였다. 세포를 BTUX (원심분리기, 알파 라발(Alfa laval)) 원심분리에 의해 수거하고, BEPEX (대규모 동결기)를 사용하여 동결시켰다. 세포를 5 용량의 50 mM HEPES/150 mM NaCl/5 mM EDTA pH 7.5 (5 L/kg 펠릿)에 현탁시키고, 모델 15 M 실험실용 균질기 가울린 15M (소규모) 또는 M3 (대규모) (매사추세츠주 에버렛에 소재하는 가울린 코포레이션(Gaulin Corporation))에서 균질화시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 동량의 동일한 완충액으로 희석시키고, BTPX 205 (알파 라발 세퍼레이션 AB(Alfa Laval Separation AB)(스웨덴 툼바 소재)) 연속 유입 원심분리기에서 원심분리하여 굴절반사 소체를 수거하였다. 중간 규모의 원심분리기 SA1이 사용되었다. 별법으로, 세포를 균질화시키고, 균질화시에 동결시키지 않고, 재수화시키지 않고, 펠릿을 직접 수거할 수 있다.

실시예 II: 에스케리키아 콜라이-I에서 발현된 재조합 인간 VEGF의 추출 및 리폴딩

방법

추출 및 리폴딩 - 7 M 우레아/50 mM HEPPS/pH 8 (최종 농도)을 함유하는 추출 완충액에 5 L의 완충액/kg 펠릿으로 굴절반사 펠릿을 현탁시켰다. 이어서, 고체 디티오트레이톨은 4 mM의 최종 농도를 위해 3.7 g/kg 펠릿으로 가하였다. 예를 들어, VEGF 추출에 대하여 우레아 및 DTT가 미치는 효과에 관하여는 도 9를 참조한 다. 현탁액을 1-2시간 동안 2O℃에서 철저히 혼합하였다. 50％ 수산화나트륨 (w/w)을 사용하여 pH를 pH 8.0으로 조정할 수 있다. 추출 완충액 1 용량당 19 용량의 리폴딩 완충액을 가함으로써 리폴딩이 개시되었다. 리폴딩 완충액은 50 mM HEPPS/1 M-2M 우레아/2-5 mM 시스테인/0.05％-0.2％ 트리톤™ X 100/pH 8을 최종 농도로 함유하였다. 예를 들어, 리폴딩시 존재하는 우레아 및 DTT 농도가 미치는 효과에 관해서는 도 10을 참조한다. 덱스트란 설페이트, 헤파린 또는 황산나트륨은 지시된 바와 같이 첨가하였다. 임의로, 약 48시간 이하의 시간 동안 실온에서 인큐베이션을 수행할 수 있다. SDS-PAGE 및/또는 헤파린 HPLC에 의해 폴딩을 모니터하였다. 쿠노 90SP(Cuno 90SP) 필터로 심층 여과한 후, 0.45 ㎛ 여과하여 산물을 정화시켰다.

헤파린-결합 HPLC 검정법 - 적절하게 리폴딩된 VEGF의 정성과 정량은 고정된 헤파린을 함유하는 칼럼을 사용하여 측정하였다. 칼럼 포로스 HE2/M (4.6 x 100 mm, HE2/M (매사추세츠주 캠브리지에 소재하는 퍼셉티브 바이오리서치 프로덕츠))은 0.15 M 염화나트륨을 함유하는 10 mM 인산나트륨 (pH 7)에서 평형화시켰다. 1 mL/분 또는 2 ml/분의 유속으로 10분에 걸쳐 평형 완충액중 0.15 M 내지 2 M 염화나트륨의 선형 구배를 사용하여 칼럼을 용리시켰다. 일부 검정법에서는 16분간 용리시켰다. 용리제를 280 nm에서 모니터하였다. 전형적으로, 대다수의 단백질은 빈 용량으로 용리되었고, 3 부류의 VEGF를 동정할 수 있었다. 친화성이 가장 높은 것으로 가장 마지막에 용리된 종을 정확하게 폴딩된 VEGF로 동정하고, 이어서, "피크 3 VEGF"로서 동정하였다.

결과

헤파린이 시스테인-매개 변성에 대하여 VEGF 를 보호한다 - 10 mM 시스테인을 천연 VEGF에 가하였을 때, 적절하게 폴딩된 분자는 대량 감소하였다 (도 2). 2가지의 상이한 형태의 헤파린을 20 mM 만큼 낮은 농도로 첨가하였을 때 상기와 같은 변성은 방지되었다.

헤파린 및 덱스트란 설페이트가 VEGF 리폴딩에 미치는 효과

첨가물	농도 (㎍/ ml )
	0	10	55	100	200	400	증가율(％) 또는 배수
증가
없음	5.3*						- -
저 (3 kd) MW 헤파린		12.2	14.2	14.8	14.1		179％ 2.8
고 MW (6 kD) 헤파린		15.3	16.6	13.9	15.3		213％ 3.1
덱스트란 설페이트 (10 Kd)		15.9	15.4	13.6	7.4	8.3	191％ 2.9
표에 있는 값은 굴절반사 펠릿 1 g당 형성된 피크 3 VEGF의 양 (mg)이다. 첨가물의 농도는 표기된 바와 같다. * 평균 대조군 (5.6+5.0=5.3)

황산나트륨이 VEGF 리폴딩에 미치는 효과

첨가물	농도 (㎍/ ml )
	0	50	98	195	293	455	증가율(％) 또는 배수
증가
없음	5.3						- -
황산나트륨		6.9	9.1	10.4	10.9	10.4	106％ 2.1
표에 있는 값은 굴절반사 펠릿 1 g당 형성된 피크 3 VEGF의 양 (mg)이다. 황산나트륨의 농도는 표기된 바와 같다.

헤파린 및 덱스트란 설페이트가 VEGF 리폴딩에 미치는 효과

첨가물	농도 (㎍/ ml )
	0	2.5	12.5	50	100	증가율(％) 또는 증가배수
증가
없음	2.2					- -
덱스트란 설페이트 (5 Kd)		10.1	13.7	13.4	11.2	523％ 6.2
덱스트란 설페이트 (8Kd)		9.9	17.2	14.0	12.9	682％ 7.8
덱스트란 설페이트 (10Kd)		13.8	19.2	14.6	10.1	773％ 8.7
저 (3 kd) MW 헤파린		10.4	16.9	14.7		668％ 7.7
고 (6 kD) MW 헤파린		14.1	18.8	20.2		818％ 9.2
표에 있는 값은 굴절반사 펠릿 1 g당 형성된 피크 3 VEGF의 양 (mg)이다.

요약

헤파린 및 덱스트란 설페이트가 리폴딩 수율 을 증가시킨다 - 상기 기술된 바와 같은 변성에 대한 보호적인 성질에 기인하여 VEGF 리폴딩에 미치는 여러 상이한 형태의 황산화된 중합체의 효과를 조사하였다. 표 Ia (및 도 5)에 나타낸 바와 같이, 저 분자량 및 고 분자량 형태의 헤파린, 둘 모두는 VEGF의 리폴딩 수율을 대략 3-배 정도 증가시켰다. 표 Ib (및 도 6)에 나타낸 바와 같이, 황산나트륨은 VEGF의 리폴딩 수율을 대략 2-배 정도 증가시켰다. 10 Kd 형태의 덱스트란 설페이트 또한 리폴딩 수율을 증가시키는데 효과적이었지만; 조사된, 보다 고농도의 범위는 기질 저해를 일으켰다. 추가로, 5 Kd, 8 Kd 및 10 Kd 형태의 덱스트란 설페이트 모두 VEGF의 리폴딩 수율을 현저히 증가시킨다는 것이 조사를 통해 입증되었다 (표 II). 도 7을 참조한다. 또한 도 8도 참조한다.

실시예 III : 상이한 완충액 및 트리톤 ™ X-100이 VEGF 회수에 미치는 효과

결과

완충액	VEGF (mg/g 펠릿)
HEPES (pH 8)	13.3
트리톤™을 포함하는 HEPES (pH 8)	14.3
HEPPS (pH 8)	16.6
트리스HCl (pH 8)	12.8

완충액	VEGF (mg/g 펠릿)
HEPES (pH 7.2)	9.1
HEPPS (pH 7.2)	10.7
HEPES (pH 8)	10.3
HEPPS (pH 8)	12.8
HEPES (pH 8) + 트리톤™ X-100	12.4
HEPPS (pH 8) + 트리톤™ X-100	13.9

요약

실시예 I, II 및 III의 데이타 조합을 통해, VEGF, 헤파린-결합 성장 인자 리폴딩시 헤파린 설페이트 또는 덱스트란 설페이트를 포함함으로써 수율이 현저히 (2-5개) 개선되었다는 것 뿐만 아니라, 회수 조건도 입증되었다. 이러한 방법은 산업 규모에서도 성공적으로 이행되었다. 이러한 방법은 다른 염기성 성장 인자 및 헤파린에 결합하는 다른 단백질의 리폴딩에도 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 IV: 에스케리키아 콜라이-II에서 발현된 재조합 인간 VEGF의 추출 및 리폴딩

방법

추출 및 리폴딩 - 최종 농도가 7 M 우레아, 2-30 mM DTT (예를 들어, 10 mM DTT), 50 mM HEPPS/pH 7-9 (예를 들어, pH 8)인 추출 완충액에 5 L의 완충액/kg 펠릿으로 굴절반사 펠릿을 현탁시켰다. 현탁액을 1-2시간 동안 실온에서 철저히 혼합하였다. 추출 완충액 1 용량당 19 용량의 리폴딩 완충액을 가함으로써 리폴딩이 개시되었다. 리폴딩 완충액은 1 M 또는 1.3 M 우레아, 2-15 mM 시스테인 (예를 들어, 7.5 mM 시스테인), 0.5 mM DTT, 0-0.75 M 아르기닌 (예를 들어, 100 mM 아르기닌), 15 mg/L 덱스트란 설페이트, 50 mM HEPPS, 0.05％ 트리톤™ X 100/pH 8을 최종 농도로 함유하였다. 예를 들어, 전하를 띤 아미노산 존재하의 리폴딩에 미치는 효과에 관해서는 도 12를 참조하는데, 여기서, 히스티딘 첨가시, 아미노산 첨가제를 첨가하지 않았을 때와 동일한 효과를 내었다. 실온에서 12-24시간 동안 리폴딩 인큐베이션을 수행하였다. 임의로, 실온에서 약 48시간 이하의 시간 동안 인큐베이션을 수행할 수 있다. 임의로, 리폴딩 과정시 대기 또는 산소를 가할 수 있다 (0.3-1cc/분/L). SDS-PAGE 및/또는 헤파린 HPLC에 의해 폴딩을 모니터하였다. 쿠노 90SP 필터로 심층 여과한 후, 0.45 ㎛ 여과하여 산물을 정화시켰다.

추출 및 리폴딩 단계의 전체 희석율은 1:100이었다. 추출 및 리폴딩 단계의 전체 희석율을 증가시켰을 때, 예를 들어, 1:100에서 1:200으로 전체 희석율을 증가시켰을 때, 비록 농도는 낮아졌지만, 활성 VEGF의 총량은 증가하였다. 도 13을 참조한다.

리폴딩 효율은 이량체/단량체의 양을 측정함으로써 측정할 수 있는데, 여기서, 단량체는 C18 역상 HPLC 칼럼에 의해 측정할 수 있고, 이량체 형성은 헤파린 칼럼 크로마토그래피 또는 SP-5PW 양이온 교환 크로마토그래피 검정법에 의해 측정할 수 있다.

실시예 V: 대규모 리폴딩

최적화된 리폴딩 조건의 확장성을 시험하기 위하여 소규모 (0.1 L), 중간 규모 (1 L) 및 시험 공장 규모 (250 L 내지 400 L)에서의 리폴딩의 동력학을 조사하는 연구를 수행하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대규모에서의 리폴딩의 동력학을 보다 소규모에서의 것으로부터 구별할 수 없었고, 리폴딩된 VEGF의 최종 역가는 약간 증가되었다. 이러한 데이타는 덱스트란 설페이트를 사용한 리폴딩의 확장성을 입증한다. 쿠노 90SP 필터로 심층 여과한 후, 0.45 ㎛ 여과하여 산물을 추가로 정화시켰다.

실시예 VI: 리폴딩 이후 rhVEGF의 정제 I

마크로프렙 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 - 리폴딩 이후, 풀 내에 존재하는 불용성 물질을 심층 여과에 의해 제거하였다. 이어서, 정화시킨 풀을 50 mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/pH 8에서 평형화된 세라믹 수산화인회석 칼럼 (35D x 31H = 30L) (캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드)에 로딩하였다. 평형 완충액으로 세척하여 비-결합 단백질을 제거하고, 50 mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/0.15 M 인산나트륨/pH 8의 등용매 단계를 사용하여 VEGF를 용리시켰다. 유속은 120 cm/hr였다. 분획을 헤파린 HPLC 분석하여 풀링된 분획을 측정하였다.

부틸 세파로스 ™ 패스트 플로우 크로마토그래피 - VEGF 풀을 50 mM HEPPS/0.05％ 트리톤™ X 100/0.15 M 인산나트륨/pH 8로 평형화된 부틸 세파로스™ 패스트 플로우 칼럼 (35 D x 26 H = 25L) (스웨덴 웁살라에 소재하는 GE 헬쓰케어) 상에 로딩하였다. 유속은 100 cm/hr였다. 칼럼을 평형 완충액으로 세척하고, 칼럼 용출액에서 VEGF를 수집하였다. 분획을 수집하고, A280nm 측정함으로써 단백질 함유 분획을 풀링시켰다.

마크로 프렙 하이 S 크로마토그래피 - 부틸 세파로스™ 풀을 50 mM HEPES/pH 8로 평형화된 마크로 프렙 하이 S 칼럼 (30D x 39 H = 27 L) (캘리포니아주 허큘레스에 소재하는 바이오래드)에 로딩하였다. 흡광도 280 nm부터 기준선까지의 용출액을 세척한 후, 칼럼을 2 칼럼 용량의 50 mM HEPES/0.25 M 염화나트륨/pH 8로 세척하였다. 50 mM HEPES/pH 8에서 0.25-0.75 M 염화나트륨으로부터 선형의, 8-칼럼-용량 구배를 사용하여 VEGF를 용리시켰다. 유속은 75-200 cm/hr였다. 분획을 수집하고, 헤파린-결합 검정법에 의해 측정되는 바, 적절하게 폴딩된 VEGF를 함유한 것을 풀링시켰다.

페닐 5 PW TSK 크로마토그래피 - 마크로 프렙 하이 S 풀은 동량의 50 mM HEPES/0.8 M 시트르산나트륨/pH 7.5를 사용하여 조절하였다. 조절된 풀을 50 mM HEPES/0.4 M 시트르산나트륨/pH 7.5로 평형화된 페닐 5PW TSK 칼럼 (18D x 43 H = 1 IL) (펜실베이니아주 몽고메리빌에 소재하는 토소하아스)에 로딩하였다. 평형 완충액을 사용하여 칼럼 전반에 걸쳐 비-결합 단백질을 세척해 낸 후, 50 mM HEPES (pH 7.5)중 0.4-0 M 시트르산나트륨으로부터 10-칼럼-용량 구배를 사용하여 칼럼으로부터 VEGF를 용리시켰다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분획을 검정하고, 순도가 충분한 VEGF를 함유하는 것을 풀링시켰다.

한외여과 / 투석여과 - 5 kD의 재생 셀룰로스 막 (G30619) (유니트 펠리콘(Unit Pellicon); 유입 속도 17.1 L/분) 상에서 풀링된 VEGF를 한외여과시켰다. 폴리소르베이트 20으로 막을 조절하였다. 6 g/L (UFl)의 농도로 풀링된 VEGF를 한외여과하였다. 샘플을 5 mM 숙신산나트륨/275 mM 트레할로스/pH 5.0을 사용하여 7-14 DV (투석부피)로 투석여과시켰다. 최종 제제는 5 mg/ml 농도의 5 mM 숙신산나트륨/275 mM 트레할로스/0.01％ 폴리소르베이트 20/pH 5.0이었다.

실시예 VII: 리폴딩 이후 rhVEGF의 정제 II

양이온 교환 액체 크로마토그래피 - 리폴딩 이후, 풀내에 존재하는 불용성 물질을 심층 여과에 의해 제거할 수 있다. 리폴딩 풀을 pH 5.0-7.5 및 약 2 내지 6.5 mS/cm로 조절한다. 하나의 실시태양에서, 풀을 pH 6.5 및 5 mS/cm로 조절한다. 이어서, 리폴딩 풀을 설포프로필 익스트림 로드 칼럼(SPXL)에 로딩시키고, 증가하는 염 농도 구배를 사용하여 용리시킬 수 있다. 풀링 분획은 분획의 헤파린 HPLC 분석에 의해 측정할 수 있다.

소수성 상호작용 칼럼 ( HIC ): - 페닐 TSK 크로마토그래피 칼럼 (펜실베이니아주 몽고메리빌에 소재하는 토소하아스) 상에 로딩하기 위하여 VEGF의 SPXL 용리 풀을 50 mS/cm로 조절할 수 있다. 분획을 수집하고, 단백질 함유 분획을 풀링시킨다.

IEX 또는 혼합형 모드: - 페닐 TSK 풀을 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 또는 혼합형-모드 크로마토그래피 상에 로딩할 수 있다. 분획을 수집하고, 본원에 기술된 검정법에 의해 측정된 바, 적절하게-폴딩된 VEGF를 함유하는 것을 풀링시킨다.

한외여과 / 투석여과 - 5kD의 재생 셀룰로스 막 (G30619) (유니트 펠리콘(Unit Pellicon); 유입 속도 17.1 L/분)상에서 풀링된 VEGF를 한외여과시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리소르베이트 20으로 막을 조절한다. 6 g/L (UFl)의 농도로 풀링된 VEGF를 한외여과한다. 샘플을 5 mM 숙신산나트륨/275 mM 트레할로스/pH 5.0을 사용하여 7-14 DV (투석부피)로 투석여과시킨다.

본원에 기술된 방법 및 공정에서, 최종 순도 및/또는 활성은 펩티드 지도화, 이황화 지도화, SDS-PAGE (환원성 및 비-환원성 둘 모두), 원편광 이색성 분광 분석, 리물루스 암베오사이트 용해물(LAL), 헤파린 크로마토그래피, 헤파린 HPLC (예를 들어, 헤파린 HPLC를 사용하여 VEGF 이량체 농도를 측정할 수 있음), 역상(rp) HPLC 크로마토그래피 (예를 들어, rpHPLC를 사용하여 VEGF 단량체 농도를 측정할 수 있음), 헤파린 결합 수용체 결합 (예를 들면, VEGF의 경우, 예를 들어, KDR 수용체 결합-생체분석 R＆D, 및/또는 Flt1 수용체 수용체 결합), SEC 분석, 세포 검정법, HUVEC 효능 검정법, VEGF 항체를 사용한 ELISA, 질량 분광 분석 등에 의해 평가될 수 있다.

본원에 기술된 기탁물, 실시예, 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원의 정신 및 범위, 및 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 포함될 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 인용물, 특허, 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다.

<110> Butler, Michelle D. Cleland, Jeffrey L. Kahn, David W. Pizarro, Shelly Schmelzer, Charles H. Winkler, Marjorie E. <120> Recombinant Production of Heparin Binding Proteins <130> P2389R1 <150> US 60/807,432 <151> 2006-07-14 <150> US 60/753,615 <151> 2005-12-22 <160> 1 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val 1 5 10 15 Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu 20 25 30 Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 35 40 45 Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 50 55 60 Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn 65 70 75 Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His 80 85 90 Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg 95 100 105 Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys 110 115 120 Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 125 130 135 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln 140 145 150 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 155 160 165

Claims (23)

1. (a) 원핵 세포 배양물의 원형질막주위로부터 헤파린 결합 단백질을 단리시키는 단계;

   (b) 카오트로픽제 및 환원제를 포함하는 제1 완충 용액 중에서 상기 헤파린 결합 단백질을 변성시키는 단계;

   (c) 카오트로픽제 및 황산화된 다중 음이온제를 포함하는 제2 완충 용액 중에서 상기 헤파린 결합 단백질의 리폴딩이 일어나는 시간 동안 그러한 조건하에 상기 헤파린 결합 단백질을 인큐베이션시키되, 이때, 상기 황산화된 다중 음이온제는 덱스트란 설페이트 또는 황산나트륨인 단계; 및

   (d) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 회수하되, 이때, 회수되어진 리폴딩된 헤파린 결합 단백질은 황산화된 다중 음이온제 없이 인큐베이션시킨 것과 비교하여 2 내지 5-배 증가한 것인 단계

   를 포함하고, 이때, 상기 헤파린 결합 단백질은 헤파린에 결합하는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)인, 원핵 세포 배양물로부터 헤파린 결합 단백질을 회수하는 방법.
2. 제1항에 있어서, VEGF가 VEGF₁₆₅인 방법.
3. 제1항에 있어서, 덱스트란 설페이트가 3,000 달톤 내지 10,000 달톤인 방법.
4. 제1항에 있어서, 덱스트란 설페이트가 8,000 달톤 내지 10,000 달톤인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충 용액이 HEPPS (pH 8.0)를 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 황산나트륨의 농도가 50 내지 500 mM인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 제2 완충 용액이 추가로 (i) 환원제, (ii) 비이온성 세정제, 또는 (iii) 아르기닌, 리신 또는 둘다를 포함하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 제2 완충 용액의 환원제가 시스테인 및 DTT의 조합물을 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 회수 단계 (d)가, (i) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 수산화인회석 크로마토그래피 지지체, 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 및 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 순차적으로 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함하거나, 또는 (ii) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 양이온 교환 지지체, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 및 이온 교환 크로마토그래피 지지체와 순차적으로 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키는 것을 포함하는 것인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 제1 및 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 부틸-, 프로필-, 옥틸- 및 아릴-아가로스 수지로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 부틸-아가로스 지지체이고, 상기 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체가 페닐-아가로스 지지체 수지인 방법.
12. (a) 원핵 세포 배양물의 원형질막주위로부터 헤파린 결합 단백질을 단리시키는 단계;

    (b) 카오트로픽제 및 환원제를 포함하는 제1 완충 용액 중에서 상기 단리된 헤파린 결합 단백질을 변성시키는 단계;

    (c) 카오트로픽제 및 황산화된 다중 음이온제를 포함하는 제2 완충 용액 중에서 상기 헤파린 결합 단백질의 리폴딩이 일어나는 시간 동안 그러한 조건하에 상기 변성된 헤파린 결합 단백질을 인큐베이션시키되, 이때, 상기 황산화된 다중 음이온제는 덱스트란 설페이트 또는 황산나트륨이고, 회수되어진 리폴딩된 헤파린 결합 단백질은 황산화된 다중 음이온제 없이 인큐베이션시킨 것과 비교하여 2 내지 5-배 증가한 것인 단계; 및

    (d) (i) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 수산화인회석 크로마토그래피 지지체, 제1 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 양이온 크로마토그래피 지지체, 및 제2 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체와 순차적으로 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키거나, 또는 (ii) 상기 리폴딩된 헤파린 결합 단백질을 양이온 교환 지지체, 소수성 상호작용 크로마토그래피 지지체, 및 이온 교환 크로마토그래피 지지체와 순차적으로 접촉시키고, 각 지지체로부터 헤파린 결합 단백질을 선택적으로 용리시키는 단계

    를 포함하고, 이때, 상기 헤파린 결합 단백질은 헤파린에 결합하는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)인, 원핵 세포 배양물로부터 헤파린 결합 단백질을 회수하는 방법.
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