TWI476207B - 重組蛋白之再摺疊 - Google Patents

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Description

重組蛋白之再摺疊
本發明係關於獲得於細胞培養物中產生之異種重組蛋白之方法。本發明包括回收且純化已於原核宿主細胞中產生且存在於此等細胞中、通常在周質空間或胞內空間中之再摺疊重組蛋白之方法。亦可發現原核宿主細胞中所產生之重組蛋白為可溶蛋白或可溶蛋白與不可溶蛋白之混合物。
許多治療相關之重組蛋白係於各種宿主有機體中產生。大多數蛋白可以其天然形式於諸如CHO細胞之真核宿主中表現。動物細胞培養物一般需要很長之生長時間以達成最大細胞密度且最終達成比原核細胞培養物低的細胞密度(Cleland,J.(1993)ACS Symposium Series 526,Protein Folding：In Vivo and In Vitro ,American Chemical Society)。此外，動物細胞培養物通常需要含有可能干擾所需蛋白回收之生長組份之昂貴培養基。細菌宿主表現系統提供重組蛋白之製造規模化生產之節省成本的替代方法。存在許多關於重組蛋白之一般細菌表現之美國專利，包括美國專利第4,565,785號、第4,673,641號、第4,795,706號及第4,710,473號。該產生方法之一主要優點為易於藉由離心或微量過濾將產物自細胞組份分離之能力。例如參見Kipriyanov及Little,(1999)Molecular Biotechnology .12：173－201；及Skerra及Pluckthun,(1988)Science,240：1038－1040。
然而，諸如大腸桿菌之細菌表現系統缺少有助於蛋白適當再摺疊之細胞機制且一般不導致大蛋白分泌至培養基中。通常發現細菌宿主細胞中所表現之重組蛋白為由部分摺疊及摺疊異常之還原蛋白之緻密塊組成的包涵體。例如參見Baneyx,(1999)Current Opin.Biotechnology 10：411－421；及Villaverde及Carrio,(2003)Biotech.Letts. 25：1385－1395。亦可在不形成包涵體之情況下表現蛋白。例如參見上文。通常在包涵體中，重組蛋白一般為非活性的。
此外，再摺疊通常產生摺疊異常及二硫鍵連接之二聚體、三聚體及多聚體。(Morris等人，(1990)Biochem.J., 268：803－806；Toren等人，(1988)Anal.Biochem., 169：287－299)。此締合現象在蛋白再摺疊期間、特別是在較高蛋白濃度下極為常見，且通常看起來涉及經由部分摺疊之中間物之疏水性相互作用而締合(Cleland及Wang,(1990)Biochemistry ,29：11072－11078)。
摺疊異常於醱酵期間或於分離程序期間發生於細胞中。必須將自周質空間或胞內空間回收之蛋白溶解且使可溶蛋白再摺疊為天然態。例如參見Rudolph,Renaturation of Recombinant,Disulfide－Bonded Proteins From "Inclusion Bodies", Modern Methods in Protein－and Nucleic Acid Research (Walter de Gruyter New York,1990)第149－172頁。使蛋白再摺疊為正確、生物學活性之構形之活體外方法對於獲得功能蛋白而言為必需的。自包涵體回收之蛋白的典型下游處理包括於高濃度之變性劑(諸如尿素)下溶解包涵體，隨後稀釋變性劑以允許發生再摺疊(參見美國專利第4,512,922號、第4,511,502號及第4,511,503號)。亦例如參見Rudolph及Lilie,(1996)FASEB J. 10：49－56；Fischer等人，(1993),Biotechnology and Bioengineering ,41：3－13；Misawa & Kumagai,(1999)Biopolvmers 51：297－307；及Clark,(1998)Current Opinion in Biotechnology ,9：157－163；及Tsumoto等人，(2003)Protein Expression and Purification 28：1－8。認為該等回收法可在進行微小修改之情況下普遍適用於自包涵體回收生物學活性重組蛋白。此等方法已應用於肝素結合蛋白(HBP)，諸如VEGF(Siemeister等人(1996)，上文 )。此等方法在經由重組蛋白之其他穩定力使重組蛋白變為其生物學活性構形之前設法消除隨機二硫鍵結，且也許不消除不適當摺疊之中間物，提供適當摺疊產物之同源群體或提供足量之適當摺疊產物。
已使用反微胞或離子交換層析以藉由將單一蛋白封閉於微胞內或於樹脂上將其分離且接著移除變性劑來幫助變性蛋白之再摺疊(Hagen等人，(1990)Biotechnol.Bioeng. 35：966－975；Creighton(1985)Protein Structure Folding and Design (Oxender,D.L.編)第249－251頁，New York：Alan R.Liss,Inc.)。此等方法適用於防止蛋白凝集且幫助適當再摺疊。為改變再摺疊速率或程度，以蛋白天然結構之配位體及抗體進行構形特異性再摺疊(Cleland及Wang,(1993),Biotechnology ,(Rehm H.－J.及Reed G.編)第528－555頁，New York,VCH)。舉例而言，在天然結構之抗體存在下使肌酸激酶再摺疊(Morris等人，(1987)Biochem.J. 248：53－57)。除抗體外，亦使用配位體及輔因子來增強再摺疊。此等分子更可能於天然蛋白形成後與摺疊蛋白相互作用。因此，可"驅使"摺疊平衡朝向天然態。舉例而言，亞鐵細胞色素c之再摺疊速率係由血質鐵之軸向位置之外來配位體來增強(Brems及Stellwagon,(1983)J.Biol.Chem. 258：3655－3661)。亦使用伴隨蛋白及摺疊催化劑來幫助蛋白摺疊。例如參見Baneyx,(1999)Current Opinion in Biotechnology ,10：411－421；及Carrio & Villaverde,(2003)FEBS Letters 537：215－221。然而，此等方法對於產生大量蛋白產物而言並非總是有效或足夠。
(例如)為了於細菌細胞培養物中有效且經濟地產生重組蛋白，需要自宿主細胞培養物摺疊及/或回收重組蛋白之新穎及更有效的方法。此等新穎及更有效的方法提供高度純化之生物學活性適當再摺疊蛋白之改良的回收且一般適用於蛋白之製造規模化生產。如將於以下揭示之論述中顯而易見，本發明滿足此等及其他需要。
本發明提供自細胞培養物回收且純化再摺疊重組蛋白之方法。詳言之，本發明提供自例如細菌細胞之原核宿主細胞回收重組蛋白之方法。本發明之方法可廣泛應用於重組蛋白。在特定實施例中，重組蛋白為生長因子，例如血管內皮生長因子(VEGF)。在一實施例中，生長因子為VEGF165 。
在一實施例中，方法包括：(a)將該重組蛋白自原核細胞培養物分離；(b)於包含第一離液劑之pH值大於9之第一緩衝溶液中溶解該蛋白；(c)於包含第二離液劑、兩種或兩種以上還原劑之pH值>9但11之第二緩衝溶液中，在伴隨添加空氣或氧的情況下，在使得發生重組蛋白再摺疊之時間及條件下使該溶解蛋白再摺疊；及(d)回收該再摺疊重組蛋白。在一實施例中，第一緩衝溶液及/或第二緩衝溶液進一步包含精胺酸。在一實施例中，第一緩衝溶液包含1 M尿素、300 mM精胺酸、10 mM CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為11。在另一實施例中，第一緩衝溶液包含1 M尿素、300 mM精胺酸、10 mM TRIS、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為11。在一實施例中，第二緩衝溶液包含兩種或兩種以上還原劑，例如DTT及半胱胺酸。在一實施例中，第二緩衝溶液包含1 M尿素、15 mM半胱胺酸、2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為10。在另一實施例中，第二緩衝溶液包含1 M尿素、15 mM半胱胺酸、0.5－2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM TRIS、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為10。
在一實施例中，方法包括：(a)自原核細胞培養物分離該重組蛋白；(b)於pH值>9但11之組合緩衝溶液中在伴隨添加空氣或氧的情況下使該蛋白溶解且再摺疊；及(c)回收該重組蛋白。在一實施例中，組合緩衝溶液包含1 M尿素、15 mM半胱胺酸、2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為10。在另一實施例中，組合緩衝溶液包含1 M尿素、15 mM半胱胺酸、0.5－2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM TRIS、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為10。
可以空氣源或富集氧之壓縮氣體供應來提供用於再摺疊反應之氧或空氣。在一實施例中，使用為0.004 min－1 之kLa ，例如其表示於含有船用型葉輪之2.5 L容器中200－400 rpm之混合速率及0.3 cc/min/L之噴射速率。在其他實施例中，使用kLa ＝0.01 min－1 或0.1 min－1 以產生再摺疊蛋白。
可在多種溫度下進行溶解及/或再摺疊。在一實施例中，用於溶解及/或再摺疊之培育溫度為室溫。培育時間可根據回收且再摺疊之重組蛋白而變化。在一實施例中，將重組蛋白在第一緩衝溶液中培育至少1小時或1至2小時。在一實施例中，將溶解蛋白在第二緩衝溶液中培育約3至24小時。在一實施例中，將經分離重組蛋白在組合緩衝溶液中培育3至24小時。
本發明另外提供單獨或結合本文所述之重組蛋白之回收使重組蛋白再摺疊之過程及方法。在特定實施例中，純化方法包括使含有重組蛋白之溶液澄清且將經澄清溶液中之該再摺疊重組蛋白與混合模式載體、陽離子層析載體、第一疏水性相互作用層析載體及可選之第二疏水性層析載體或離子交換載體接觸；且自各載體選擇性回收或溶離再摺疊重組蛋白。在一實施例中，使溶液澄清包含添加清潔劑直至最終濃度為1%，將pH值調節至約8.5－9.5，將溶液在25－30℃下培育1至10小時，離心溶液且過濾自離心步驟回收之液體。在一實施例中，pH值為約8.7。在另一實施例中，pH值為約9.0。預期回收步驟之步驟可以任何順序進行，例如依序或改變層析載體之順序。在本發明之特定實施例中，提供自製造規模或工業規模之細胞培養物回收且純化再摺疊重組蛋白之方法。
 定義
如本文所使用之"多肽"一般係指來自任何細胞來源之具有約十個以上胺基酸之肽及蛋白。"異種"多肽為對於所利用之宿主細胞而言為外來的彼等多肽，諸如由大腸桿菌所產生之人類蛋白。儘管異種多肽可為原核或真核多肽，但較佳為真核多肽，更佳為哺乳動物多肽且最佳為人類多肽。在本發明之特定實施例中，其係經重組產生(例如重組多肽或重組蛋白)。
哺乳動物多肽之實例包括諸如以下各物之分子：生長因子；肝素結合生長因子；血管內皮生長因子(VEGF)，例如VEGF－A(同功異型物)、VEGF－B、VEGF－C及VEGF－D；VEGF之受體及抗體，諸如rhuFab V2及貝伐單抗(bevacizumab)、雷尼單抗(ranibizumab)；VEGF受體之抗體；凝乳酶；生長激素，包括人類生長激素(hGH)；牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；1－抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；血小板生成素；促卵泡激素；抑鈣素；促黃體素；升糖素；生長激素受體；生長激素釋放蛋白(GHRP)；LIV－1(EP 1263780)；TRAIL；凝血因子，諸如因子VIIIC、因子IX、組織因子及von Willebrands因子；因子VIII；因子VIII B結構域；抗組織因子；抗凝血因子，諸如蛋白C；心房利尿鈉因子；肺界面活性物質；纖維蛋白溶酶原活化因子，諸如尿激酶或人類尿或組織型纖維蛋白溶酶原活化因子(t－PA)及其變異體；鈴蟾素(bombesin)；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α及β；ErbB2結構域之抗體腦啡肽酶(enkephalinase)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；繆勒管抑制物質；鬆馳素A鏈；鬆弛素B鏈；鬆弛素原；小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，諸如β－內醯胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；激素或生長因子之受體；整合素；蛋白A或D；類風濕因子；神經營養因子，諸如來源於腦之神經營養因子(BDNF)、神經營養素－3、－4、－5或－6(NT－3、NT－4、NT－5或NT－6)或諸如NGF之神經生長因子；心營養素(心肥大因子)，諸如心營養素－1(CT－1)；血小板來源生長因子(PDGF)(A、B、C或D)；纖維母細胞生長因子，諸如aFGF及bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF－α及TGF－β，包括TGF－1、TGF－2、TGF－3、TGF－4或TGF－5；胰島素樣生長因子－I及－II(IGF－I及IGF－II)及其受體，諸如IGFBP－1－IGFBP－6；des(1－3)－IGF－I(腦IGF－I)，其為胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，諸如CD－3、CD－4、CD－8及CD－19；紅血球生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；干擾素，諸如干擾素α、β及γ；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；群落刺激因子(CSF)，例如M－CSF、GM－CSF及G－CSF；介白素(IL)，例如IL－1至IL－10；抗HER－2抗體；Apo2配位體；超氧化歧化酶；抗CD20；赫瑞古林(heregulin)、抗IgE、抗CD11a、抗CD18；腫瘤壞死因子(TNF)及其抗體、TNF受體及相關抗體、TNF－受體－IgG、TNF受體相關因子(TRAF)及其抑制劑、T細胞受體；表面膜蛋白；加速衰變因子；抗TGF，諸如抗TGF－β；抗活化素；抗抑制素；抗Fas抗體；Apo－2配位體抑制劑；Apo－2受體；Apo－3；細胞凋亡因子；Ced－4；DcR3；死亡受體及促效劑抗體(DR4、DR5)；淋巴毒素(LT)；泌乳素；泌乳素受體；SOB蛋白；WISP(wnt誘發分泌之蛋白)；抗NGF；脫氧核糖核酸酶；肝炎抗原；單純型疱疹抗原；瘦素；Toll蛋白、TIE配位體、CD40及抗CD40、免疫黏附素、枯草桿菌蛋白酶、肝細胞生長因子(HGF)、血小板生成素(TPO)；前列腺特異性癌症抗原(PSCA)；病毒抗原，諸如AIDS包膜之部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；抗體；及以上所列多肽中任一者之片段。本文中之術語"抗體"係以最廣泛的意義使用且特別涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需生物學活性即可。在本發明之特定實施例中，重組多肽為生長因子。在一實施例中，重組多肽為哺乳動物多肽VEGF。在另一實施例中，重組多肽為人類VEGF(例如VEGF165 )。在一實施例中，重組多肽不為血管抑制素。在一實施例中，重組多狀不為IGF－1。
如本文所使用之"血管內皮生長因子"或"VEGF"係指最初來源於牛垂體濾泡細胞之哺乳動物生長因子，其具有Castor,C.W.等人，(1991)Methods in Enzymol. 198：391－405所揭示之胺基酸序列；以及其具有相應天然VEGF之定性生物學活性之功能衍生物，包括(但不限於)Houck等人，(1991)Mol.Endocrin. 5：1806－1814中所報導之人類VEGF胺基酸序列。亦參見Leung等人(1989)Seience, 246：1306及Robinson & Stringer,(2001)Journal of Cell Science .144(5)：853－865、美國專利第5,332,671號。其亦稱作VEGF－A。其他家族成員係以VEGF末端之字母符號表示，例如VEGF－B、VEGF－C或VEGF－D。VEGF或VEGF－A之主要形式為具有十六個半胱胺酸殘基之165個胺基酸均二聚體，該等半胱胺酸殘基形成7個分子內二硫鍵及兩個分子間二硫鍵。在由121、145、165、189及206個胺基酸組成之多種人類VEGF多肽之形成中涉及替代性剪接，然而，VEGF121 變異體缺少其他變異體之肝素結合域。VEGF之所有同功異型物具有共同之胺基末端域，但分子之羧基末端部分長度不同。較佳之VEGF活性形式(VEGF165 )在各單體之胺基酸殘基Cys26－Cys68、Cys57－Cys104、Cys61－Cys102、Cys117－Cys135、Cys120－Cys137、Cys139－Cys－158、Cys146－Cys160之間具有二硫鍵。參見圖10 。亦例如參見Keck等人，(1997)Archives of Biochemistry and Biophysics 344(1)：103－113。VEGF165 分子係由兩個結構域組成：胺基末端受體結合域(胺基酸1－110二硫鍵連接之均二聚體)及羧基末端肝素結合域(殘基111－165)。例如參見Keyt等人，(1996)J.Biol.Chem. ,271(13)：7788－7795。在本發明之特定實施例中，所分離且純化之VEGF165 在殘基75(Asn)處未經糖基化。例如參見Yang等人，(1998)Journal of Pharm.& Experimental Therapeutics, 284：103－110。在本發明之特定實施例中，所分離且純化之VEGF165 在殘基Asn10處大體上未經去醯胺化。在本發明之特定實施例中，所分離且純化之VEGF165 為經去醯胺化(殘基Asn10處)與未經去醯胺化蛋白之混合物，通常絕大部分蛋白為未經去醯胺化的蛋白。由於VEGF165 為均二聚體，因此一個或兩個多肽鏈上可發生脫胺基作用。
如本文所使用之術語"肝素結合蛋白"係指能夠結合肝素(如本文所定義)之多肽。該定義包括天然及重組產生之肝素結合蛋白之成熟形式、前形式、前原形式及原形式。肝素結合蛋白之典型實例為"肝素結合生長因子"，其包括(但不限於)表皮生長因子(EGF)、血小板來源生長因子(PDGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)(亦稱為擴散因子SF)及神經生長因子(NGF)、IL－8等。
"肝素"(亦稱為肝素酸)為高度硫酸化、直鏈陰離子黏多醣(稱為葡糖胺聚糖)之異種群組。儘管可存在其他糖類，但肝素中之主要糖類為：α－L－艾杜糖醛酸2－硫酸鹽、2－去氧－2－磺胺基－α－葡萄糖6－硫酸鹽、β－D－葡糖醛酸、2－乙醯胺基－2－去氧－α－D－葡萄糖及L－艾杜糖醛酸。此等及視情況其他糖類由糖苷鍵接合而形成具有不同尺寸之聚合物。由於存在與肝素共價連接之硫酸基及羧酸基，因此其呈強酸性。視來源及測定方法而定，肝素之分子量在約3,000至約20,000道爾頓之間變化。天然肝素為若干哺乳動物物種之多種組織(尤其是肝及肺)及肥大細胞之組份。肝素及肝素鹽(肝素鈉)有市售且主要在各種臨床情形中用作抗凝劑。
如本文所使用之"適當摺疊"或"生物學活性"VEGF或其他重組蛋白及其類似術語係指具有生物學活性構形之分子。熟習此項技術者將認識到摺疊異常及二硫鍵混雜之中間物可能具有生物學活性。在該種狀況下，適當摺疊或生物學活性之VEGF或重組蛋白對應於VEGF(如上所述)或其他重組蛋白之天然摺疊模式。舉例而言，除二聚分子中之兩個分子間二硫鍵以外，適當摺疊之VEGF亦具有上述二硫鍵對，然而，可以細菌細胞培養物產生其他中間物。對於適當摺疊之VEGF而言，於各單體之相同殘基Cys51與Cys60之間存在兩個分子間二硫鍵。例如參見WO98/16551。例如，VEGF之生物學活性包括(但不限於)促進血管滲透性、促進血管內皮細胞生長、與VEGF受體結合、經由VEGF受體結合及信號轉導(例如參見Keyt等人，(1996)Journal of Biological Chemistry .271(10)：5638－5646)、誘發血管生成等。
術語"經純化"或"純重組蛋白"及其類似術語係指不含如在其重組產生中且尤其是在原核或細菌細胞培養物中所見通常與其伴生之物質的材料。因此，該等術語係指無污染DNA、宿主細胞蛋白或與其原位環境相關之其他分子的重組蛋白。該等術語係指至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約98%或更高之純度。
術語"包涵體"或"折射體"係指所關注之聚集多肽之緻密胞內塊體，其構成大部分的總細胞蛋白(包括所有細胞組份)。在一些狀況下(但非所有狀況)，此等多肽聚集體可在相差顯微鏡下於低至1,000倍之放大倍率下識別為細胞外殼內之可見亮點。
如本文所使用之術語"摺疊異常"蛋白係指折射體內所含之沈澱或聚集多肽。如本文所使用之"不可溶"或"摺疊異常"VEGF或其他重組蛋白係指原核宿主細胞之周質空間或胞內空間內所含或以其他方式與原核宿主細胞相關且採取具有錯配或未形成之二硫鍵之無生物學活性構形的沈澱或聚集VEGF或重組蛋白。不可溶重組蛋白一般(但非必需)內含於折射體中，亦即其在相差顯微鏡下可見或不可見。
如本文所使用之"離液劑"係指在水溶液中在適當濃度下能夠經由多肽表面變化而改變其空間組態或構形從而使多肽可溶於水性介質中的化合物。變化可藉由改變(例如)水合狀態、溶劑環境或溶劑－表面相互作用而發生。離液劑之濃度將直接影響其強度及有效性。強變性離液溶液含有在溶液中將有效地使存在於溶液中之多肽摺疊打開從而有效地消除蛋白二級結構的高濃度之離液劑。摺疊打開可相對廣泛，但為可逆的。中度變性離液溶液含有離液劑，該離液劑在溶液中具有足夠濃度以允許多肽由其經由可溶於溶液中之中間物所採取之任何扭曲構形部分摺疊成當在內源或同源生理學條件下以活性形式操作時發現其自身的空間構形。離液劑之實例包括鹽酸胍、尿素及諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀之氫氧化物。離液劑包括此等試劑之組合，諸如氫氧化物與尿素或鹽酸胍之混合物。
如本文所使用之"還原劑"係指在水溶液中在適當濃度下維持游離硫氫基從而使分子內或分子間二硫鍵以化學方式斷裂的化合物。合適還原劑之代表性實例包括二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤藻糖醇(DTE)、β－巰基乙醇(BME)、半胱胺酸、半胱胺、硫代乙醇酸鹽、麩胱甘肽及硼氫化鈉。
如本文所使用之"緩衝溶液"係指藉由其酸－鹼共軛組份之作用而阻止pH值改變之溶液。
出於本文之目的，"細菌"包括真細菌(eubacteria)及古細菌(archaebacteria)。在本發明之特定實施例中，在本文所述之方法及過程中使用包括革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌之真細菌。在本發明之一實施例中，使用革蘭氏陰性菌，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)。屬於腸內菌科之細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia )、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )、沙雷氏菌屬(Serratia )及志賀菌屬(Shigella )。其他類型之合適細菌包括固氮菌屬(Azotobacter )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、根瘤菌屬(Rhizobia )、透明顫菌屬(Vitreoscilla )及副球菌屬(Paracoccus )。在本發明之一實施例中，使用大腸桿菌。合適之大腸桿菌宿主包括大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)、大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B及大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)。此等實例具有說明性而非限制性，且W3110為一實例。亦可採用任何上述細菌之突變細胞。當然，必需考慮細菌細胞中複製子之可複製性來選擇適合之細菌。舉例而言，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410之熟知質體來提供複製子時，可適當地使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬或沙門氏菌屬物種作為宿主。進一步參見適當細菌宿主細胞之下列有關實例。
如本文所使用之表述"細胞"、"細胞株"、"菌株"及"細胞培養物"可互換使用，且所有該等命名均包括子代。因此，詞語"轉型體"及"轉型細胞"包括原始受檢細胞及來源於其之培養物(不考慮轉移次數)。亦應瞭解由於有意或無意突變，所有子代之DNA含量可能不會正好相同。與在原始轉型細胞中所篩選之細胞具有相同功能或生物學活性之突變子代包括在內。當意指不同命名時，將由上下文對其得到瞭解。
混合模式管柱係指具有陽離子交換特性以及疏水相互作用之樹脂管柱。
重組蛋白
已自包括細菌在內之許多來源回收且純化重組蛋白，例如生長因子，諸如酸性纖維母細胞生長因子、鹼性纖維母細胞生長因子及血管內皮生長因子(Salter D.H.等人，(1996)Labor.Invest. 74(2)：546－556(VEGF)；Siemeister等人，(1996)Biochem.Biophvs.Res.Commun. 222(2)：249－55(VEGF)；Cao等人，(1996)J.Biol.Chem. 261(6)：3154－62(VEGF)；Yang等人，(1994)Gaoiishu Tongxun ,4：28－31(VEGF)；Anspach等人，(1995)J.Chromatogr.A 711(1)：129－139(aFGF及bFGF)；Gaulandris(1994)J Cell.Physiol. 161(1)：149－59(bFGF)；Estape及Rinas(1996)Biotech.Tech. 10(7)：481－484(bFGF)；McDonald等人，(1995)FASEB J. 9(3)：A410(bFGF))。舉例而言，VEGF之主要活性形式為兩種165胺基酸多肽之均二聚體(VEGF－165)。在此結構中，各亞單元均含有7對鏈內二硫鍵及實現兩個亞單元共價連接之兩對額外二硫鍵(Ferrara等人，(1991)J.Cell.Biochem .47：211－218)。天然構形包括已展示易於結合肝素之強鹼性結構域(Ferrara等人(1991)上文)。儘管有效受體結合及生物活性需要VEGF之共價二聚(Ptgens等人，(1994)J.Biol.Chem. 269：32879－32885；Claffey等人，(1995)Biochim.et Biophvs.Acta 1246：1－9)，但細菌產物可能含有若干摺疊異常及二硫鍵混雜之中間物。提供適用於分離、純化及再活化以"折射體"形式及亦以可溶蛋白形式出現於宿主細胞中之蛋白的程序。
分離重組蛋白
藉由此項技術中之多種標準技術中之任一種自表現蛋白之原核宿主細胞分離不可溶的摺疊異常重組蛋白。舉例而言，不可溶重組蛋白係藉由以下步驟於適當分離緩衝液中分離：使細胞暴露於具有溶解大部分宿主蛋白之適當離子強度但目標蛋白於其中大體不可溶的緩衝液，或使細胞破裂以便自周質空間或胞內空間釋放包涵體或蛋白且使得其可用於藉由(例如)離心而回收。此技術為人所熟知且描述於(例如)美國專利第4,511,503號中。Kleid等人揭示藉由均質化隨後離心來純化折射體(Kleid等人，(1984)於Developments in Industrial Microbiology (Society for Industrial Microbiology,Arlington,VA)25：217－235中)。亦例如參見Fischer等人，(1993)Biotechnology and Bioengineering 41：3－13。
美國專利第5,410,026號描述一種自包涵體回收蛋白之典型方法且概述如下。將原核細胞懸浮於適當緩衝液中。緩衝液通常係由適於在pH值為5至9或約6至8之間緩衝之緩衝劑及鹽組成。任何適當之鹽(包括NaCl)均適用於維持緩衝溶液中之足夠離子強度。通常採用之離子強度為約0.01至2 M或0.1至0.2 M。當將細胞懸浮於此緩衝液中時，使用諸如機械方法(例如均質器(Manton－Gaulin壓力機、微流體化儀或Niro－Soavi)、法式壓力機(French press)、球磨機(bead mill)或超音波振盪器)或化學或酶促方法之常用技術使細胞破裂或溶解。
細胞破裂之化學方法或酶促方法之實例包括需要使用溶菌酶溶解細菌壁之原生質球狀體法(spheroplasting)(H.Neu等人，(1964)Biochem.Biophys.Res.Comm .,17：215)及滲透衝擊法，滲透衝擊法涉及用具有高張力之溶液及具有低張力之冷水洗液處理活細胞以釋放多肽(H.Neu等人，1965J.Biol.Chem., 240(9)：3685－3692)。一般使用超音波處理來破壞分析規模體積之醱酵肉湯中所含之細菌。在較大規模下，通常使用高壓均質化作用。
細胞破裂後，通常在標準離心機中以低速(一般為約500至15,000×g，例如在本發明之一實施例中使用約12,000×g)使懸浮液離心足夠時間以使大體上所有不可溶蛋白粒化。該等時間可經簡單確定且其係視待離心之體積以及離心機之設計而定。通常約10分鐘至0.5小時足以使不可溶蛋白粒化。在一實施例中，以12,000×g將懸浮液離心10分鐘。
所得離心塊含有大體所有不可溶蛋白部分。若細胞破裂過程不完全，則離心塊亦可含有完整細胞或破碎的細胞片段。可藉由將離心塊再懸浮於少量相同緩衝溶液中並用相差顯微鏡檢查懸浮液來檢定細胞破裂之完全性。破碎之細胞片段或全細胞之存在表明需要進一步執行超音波處理或其他破裂方式以移除片段或細胞及相關非折射多肽。在該進一步破裂後，視需要再次離心懸浮液且回收離心塊，將其再懸浮並進行再檢查。重複此過程直至目視檢查揭示粒化材料中不存在破碎之細胞片段或直至進一步處理無法減小所得離心塊之尺寸。
無論不可溶蛋白係處在胞內空間中還是處在周質空間中，均可使用上述方法。在本發明之一實施例中，本文所提供之用於分離重組蛋白之條件係針對沈澱於周質空間或胞內空間中之包涵體且尤其係關於VEGF。然而，如下文通篇所指出，認為該等方法及程序一般稍加修改即適用於重組蛋白。在本發明之特定實施例中，該等方法及程序適用於製造規模化或工業規模化生產、再摺疊及純化重組蛋白。
在一實施例中，將離心塊中之經分離重組蛋白於足以大體上溶解重組蛋白之第一緩衝溶液中培育。此培育在允許溶解所需量或大體上所有重組蛋白之濃度、培育時間及培育溫度條件下進行。
第一緩衝溶液包含適用於將緩衝液之pH值範圍維持在至少約9或更高(典型範圍為9－11)之緩衝劑。在一實施例中，VEGF之pH值為pH 11。將提供後一範圍內之pH值之合適緩衝液的實例包括TRIS(參[羥甲基]胺基甲烷)、HEPPS(N－[2－羥乙基]哌嗪－N'－[3－丙烷－磺酸])、CAPSO(3－[環己胺基]－2－羥基－1－丙烷磺酸)、AMP(2－胺基－2－甲基－1－丙醇)、CAPS(3－[環己胺基]－1－丙烷磺酸)、CHES(2－[N－環己胺基]乙烷磺酸)、精胺酸、離胺酸及硼酸鈉。在一實施例中，本文中之緩衝液包括pH值為約11之CHES及精胺酸。在另一實施例中，本文中之緩衝液包括pH值為約11之Tris及精胺酸。在一實施例中，本文中之緩衝液包括pH值為約11之CHES。在另一實施例中，本文中之緩衝液包括pH值為約11之Tris。在特定實施例中，第一緩衝溶液包括離液劑。
適用於實施本發明之離液劑包括(例如)尿素及胍鹽或硫氰酸鹽，例如尿素、鹽酸胍、硫氰酸鈉等。需要存在於緩衝液中之離液劑之量為足以使溶液中之重組蛋白摺疊打開之量。在本發明之特定實施例中，離液劑係以約介於約0.5－5莫耳濃度之間的量存在。在本發明之一實施例中，離液劑為約1 M之尿素。
蛋白在緩衝溶液中之濃度必須使得蛋白大體溶解(如藉由光學密度所測定)。所採用之確切量將視(例如)緩衝溶液中其他成份之濃度及類型(尤其是蛋白濃度)、離液劑及緩衝液之pH值而定。在本發明之一實施例中，重組蛋白之濃度在0.5－5.5 mg/ml或1.5－5.0 mg/ml之範圍內。溶解通常係在約0－45℃或約2－40℃或約20－40℃或約23－37℃或約25－37℃或約25℃下進行至少約1小時至24小時。溫度通常不受鹽、還原劑及離液劑含量明顯影響。在特定實施例中，溶解係在大氣壓力下進行。
可確定緩衝溶液中溶解程度之量測且該量測適當地(例如)係藉由濁度測定、藉由分析離心後上清液與離心塊之間的分離、在還原性SDS－PAGE凝膠上、藉由蛋白檢定(例如Bio－Rad蛋白檢定套組)或藉由HPLC來進行。
視情況，不將破裂細胞離心，但於本文所述之第二緩衝溶液(再摺疊緩衝液)中以(例如)1：4、1：6、1：8稀釋。此培育係在將允許重組蛋白溶解且再摺疊之濃度、培育時間及培育溫度條件下發生。在一實施例中，約30%或更多重組蛋白經溶解及再摺疊。
使重組蛋白再摺疊
多肽經溶解或者細胞經破裂後，將多肽置放或稀釋於具有使重組蛋白再摺疊之濃度的含有至少一種還原劑及離液劑之第二緩衝溶液中，伴隨添加空氣或氧，例如使用恆定體積質量轉化係數kLa ＝0.004至0.1 min－1 (例如對於具有船用型葉輪之2.5 L容器而言，空氣噴射速率為0.3－10 cc/min/L、0.3－3 cc/min/L或1 cc/min/L或25 cc/min/L，其中混合速度為200－400 rpm)。可以空氣源或富集氧之壓縮氣體供應來提供用於再摺疊反應之氧或空氣。自氣相至液相之質量轉移之效率係藉由攪拌、噴射及加壓來控制且係由體積質量轉化係數kLa 擷取。例如參見Blanch,& Clark Biochemical engineering,Marcel Dekker,New York,1997；及Aunins,& Henzler,Aeration in cell culture bioreactors, Biotechnology：A multi－volumecom prehensive treatise ,G.Stephanopoulos編，Weinheim,New York,1993，第219－281頁。在一實施例中，使用0.004 min－1 之kLa ，其表示在含有船用型葉輪之2.5 L容器中200－400 rpm之混合速率及0.3 cc/min/L之噴射速率。在其他實施例中，使用kLa ＝0.01 min－1 或0.1 min－1 來產生適當摺疊之蛋白。
在本發明之特定實施例中，第二緩衝溶液含有兩種或兩種以上還原劑。可用再摺疊緩衝液將多肽稀釋(例如)至少5倍或至少約10倍或約20倍或約40倍。此第二次培育可溶的未摺疊蛋白之條件一般將使得蛋白發生所需量或大體或完全再摺疊。確切條件將視(例如)緩衝液之pH值及所存在之離液劑及還原劑之類型及濃度而定。培育溫度一般為約0－40℃且培育一般將進行至少約1小時至約48小時以實現再摺疊。在特定實施例中，反應係在例如約0－45℃或約2－40℃或約20－40℃或約23－37℃或約25－37℃或約25℃下進行至少約3小時、至少約10小時或約3與30小時之間或約3與24小時之間。在特定實施例中，反應係在大氣壓力下進行。
第二緩衝溶液包含適用於將緩衝液之pH值範圍維持於至少約9或大於9(典型範圍為9－11)之緩衝劑、離液劑及至少一種還原劑。在特定實施例中，第二緩衝溶液包含兩種或兩種以上還原劑。在一實施例中，VEGF之pH值為pH 10。將提供後一範圍內之pH值之合適緩衝液的實例包括TRIS(參[羥甲基]胺基甲烷)、HEPPS(N－[2－羥乙基]哌嗪－N'－[3－丙烷－磺酸])、CAPSO(3－[環己胺基]－2－羥基－1－丙烷磺酸)、AMP(2－胺基－2－甲基－1－丙醇)、CAPS(3－[環己胺基]－1－丙烷磺酸)、CHES(2－[N－環己胺基]乙烷磺酸)、精胺酸、離胺酸及硼酸鈉。在一實施例中，本文中之第二緩衝溶液包含pH值為約10之CHES及精胺酸(分別為約10 mM及100 mM最終濃度之濃度)及兩種或兩種以上還原劑及至少一種離液劑。在另一實施例中，本文中之第二緩衝溶液包含pH值為約10之Tris及精胺酸(分別為約10 mM及100 mM最終濃度之濃度)及兩種或兩種以上還原劑及至少一種離液劑。
精胺酸(或另一種帶正電荷之胺基酸)(例如L－精胺酸/HCl)可存在於第一緩衝溶液及第二緩衝溶液中。在本發明之特定實施例中，精胺酸之濃度為(例如)約50－500 mM、約75－300 mM或約100－300 mM或約100 mM或300 mM之最終濃度等。在本發明之特定實施例中，蛋白係在pH值大於9且具有0.5－3 M尿素、50－500 mM精胺酸及5 mM EDTA之最終濃度之第一緩衝溶液中。在一實施例中，使用10 mM CHES之最終濃度。在另一實施例中，使用10 mM Tris之最終濃度。在一實施例中，第一緩衝溶液包含1 M尿素、300 mM精胺酸、10 mM CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為11。在另一實施例中，第一緩衝溶液包含1 M尿素、300 mM精胺酸、10 mM Tris、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為11。在本發明之特定實施例中，蛋白係在含有0.5－3 M尿素、50－500 mM精胺酸、0.25－1 mM DTT、5－20 mM半胱胺酸及2－10 mM EDTA之最終濃度之pH值>9但11的第二緩衝溶液(再摺疊緩衝溶液)中。在一實施例中，使用10 mM CHES之最終濃度。在另一實施例中，使用10 mM Tris之最終濃度。在一實施例中，蛋白係在具有1 M尿素、15 mM半胱胺酸、2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM CHES、5 mM EDTA(pH值為9－10)之最終濃度之再摺疊緩衝溶液中。在另一實施例中，蛋白係在具有1 M尿素、15 mM半胱胺酸、0.5－2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM Tris、5 mM EDTA(pH值為9－10)之最終濃度之再摺疊緩衝溶液中。
如上所述，溶液亦含有至少一種還原劑。合適還原劑之實例包括(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT)、β－巰基乙醇(BME)、半胱胺酸、DTE等。存在於緩衝液中之還原劑之量主要將視還原劑及離液劑之類型、所採用之緩衝液之類型及pH值、溶液中夾帶或引入之氧之量及緩衝液中之蛋白濃度而定。舉例而言，還原劑係合適地選自以下濃度範圍內之上述還原劑：對於半胱胺酸而言為約0.5至約20 mM，對於DTT而言為0.25－3.0 mM(例如0.5－2 mM DTT)且對於BME而言小於約0.2 mM。在本發明之一實施例中，存在兩種或兩種以上還原劑，例如約0.5－2 mM DTT及0.5至約20 mM半胱胺酸。而一般而言DTT及BME可與用於重組蛋白之本文所提供之程序聯合使用，約15 mM半胱胺酸與上述DTT之組合為用於回收VEGF之一實例。在一實施例中，還原劑具有約2 mM DTT及15 mM半胱胺酸之最終濃度。在另一實施例中，還原劑具有約0.5 mM DTT及15 mM半胱胺酸之最終濃度。
第二緩衝溶液含有使得發生重組蛋白再摺疊之濃度之至少一種離液劑。離液劑一般係以約介於約0.5與2莫耳濃度之間的最終濃度存在。在本發明之一實施例中，本文之離液劑為最終濃度為約0.5－2 M、0.5－2 M或約1 M之尿素。在本發明之另一實施例中，離液劑為最終濃度為約0.1－1 M之鹽酸胍。
再摺疊緩衝液可視情況含有額外試劑，諸如多種非離子清潔劑中之任一種，諸如TRITONTM X－100、NONIDETTM P－40、TWEENTM 系列及BRIJTM 系列。非離子清潔劑係以約介於0.01%與1.0%之間的最終濃度存在。在一實例中，非離子清潔劑之濃度係介於約0.025%與0.05%之間或為約0.05%之最終濃度。
再摺疊程度係使用(例如)rpHPLC層析管柱、陽離子交換HPLC(SP－5PW TSK凝膠管柱，Tosoh Bioscience LLC)或其他適當肝素親和管柱藉由高效液相層析(HPLC)而合適地測定。陽離子交換HPLC檢定或肝素結合HPLC檢定中正確摺疊重組峰值尺寸之增加與存在於緩衝液中之摺疊、生物學活性重組蛋白量之增加直接相關。進行培育以使如以rpHPLC檢定所測定之正確摺疊重組蛋白與所回收之摺疊異常重組蛋白之比率最大化。
在一實施例中，使用肝素結合檢定來評定適當摺疊之VEGF之品質及數量。將含有經稀釋重組蛋白之樣本負載於(例如)Heparin－5PW管柱(7.5×75 mm，Tosoh Biosciences LLC,Tokyo,Japan)或其他合適的肝素親和管柱上。舉例而言，在含有0.15 M氯化鈉之10 mM磷酸鈉(pH值為7.4)中使Heparin－5PW管柱平衡。以1 ml/min或2 ml/min之流率，使用10 mM磷酸鈉(pH值為7.4)中之0.15－2 M氯化鈉線性梯度經10分鐘溶離管柱。在280 nm下監測溶析液。在一實施例中，回收對應於具生物學活性之適當再摺疊VEGF之單峰形式的蛋白。在本發明之一實施例中，用於測定適當再摺疊VEGF之檢定為RPHPLC。可視情況由肽圖譜確定二硫鍵。亦可使用圓二色性測定2 & 3D結構/摺疊。
在一實施例中，可在一個步驟中進行溶解及再摺疊。獲得破裂細胞離心塊後，將其置放或溶解於上述第二緩衝溶液(在此種狀況下稱作組合緩衝溶液)中。可用組合緩衝溶液將多肽稀釋(例如)至少5倍或至少約10倍或約20倍或約40倍。此離心塊之培育條件一般將使得在伴隨添加空氣或氧下發生蛋白之所需量或大體或完全溶解及再摺疊。在一實施例中，使用0.004 min－1 之kLa ，其表示在含有船用型葉輪之2.5 L容器中200－400 rpm之混合速率及0.3 cc/min/L之噴射速率。在其他實施例中，使用kLa ＝0.01 min－1 或0.1 min－1 以產生適當摺疊蛋白。確切條件將視(例如)緩衝液之pH值及所存在之離液劑及還原劑之類型及濃度而定。培育溫度一般為約0－40℃且培育一般將進行至少約1至48小時以實現溶解及再摺疊。反應係在(例如)約0－45℃或約2－40℃或約20－40℃或約23－37℃或約25－37℃或約25℃下進行至少約3小時、至少約10小時或約3與48小時之間或約3與30小時之間。在特定實施例中，反應係在大氣溫度下進行。
重組蛋白之回收及純化
儘管重組蛋白之回收及純化可採用各種方法及已知程序來分離該等蛋白，諸如鹽及溶劑分餾、以膠狀材料吸附、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、免疫親和層析、電泳及高效液相層析(HPLC)，但描述澄清步驟及多步驟層析程序之實例。澄清步驟包含添加清潔劑直至1%之最終濃度(例如Triton－X－100)，將pH值調節至約8.5－9.5(或約8.7或約9)，在25－30℃下培育溶液1至10小時，將溶液離心且過濾自離心步驟回收之液體。多步驟層析程序包含將該再摺疊重組蛋白與混合模式樹脂、陽離子層析載體、第一疏水性層析載體及可選之第二疏水性層析載體或離子交換載體接觸，且自各載體選擇性地回收或溶離重組蛋白。預期每一程序之步驟均可以任何順序進行。在本發明之一實施例中，該等步驟依序進行。
進一步回收及純化重組蛋白之適當第一步驟特徵性地提供重組蛋白之濃度及樣本體積之降低。舉例而言，上文所述之第二培育步驟可引起所回收之重組蛋白之體積顯著增加且再摺疊緩衝液中之蛋白得以同時稀釋。適當之第一層析載體使所回收之重組蛋白之體積降低，且可有利地自非所要污染蛋白中部分純化蛋白。適當之第一層析步驟包括可經溶離且直接負載於第二層析載體上之層析載體。
示範性第一層析載體包括(但不限於)混合模式樹脂(例如CaptoMMCTM ,GE Healthcare或MEP Hypercel,Pall Corporation)；羥基磷灰石層析載體，例如I型及通俗稱作MacroPrep陶瓷之類型之CHT陶瓷、Bio－Gel HT、Bio－Gel HTP(Biorad,Hercules,CA)等；由固定金屬離子(諸如銅、鎳等)之惰性樹脂組成之金屬螯合層析載體；以及非衍生之矽膠。在本發明之一實施例中，用於純化及回收VEGF之第一層析載體為混合離子交換層析載體。自第一層析載體進行溶離係根據此項技術中之標準實務來實現。合適之溶離條件及緩衝液將有利於將經溶離重組蛋白直接負載於如下所述之陽離子層析載體上。
可使多種陰離子組份附著至基質上以形成用於層析之陽離子載體。陰離子組份包括羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸根及磺酸根(S)。諸如SE52、SE53、SE92、CM32、CM52、CM92、P11、DE23、DE32、DE52、EXPRESS IONTM S及EXPRESS IONTM C之纖維素離子交換樹脂可自Whatman LTD、Maidstone Kent U.K.購得，以SEPHADEXTM 及SEPHAROSETM 為主且交聯之離子交換劑亦係在產品名CM SEPHADEXTM C－25、CM SEPHADEXTM C－50及SP SEPHADEXTM C－25、SP SEPHADEXTM C－50及SP－SEPHAROSETM High Performance、SP－SEPHAROSETM －XL SP－SEPHAROSETM Fast Flow、CM－SEPHAROSETM Fast Flow及CM－SEPHAROSETM 、CL－6B下已知，其均可自Pharmacia AB獲得。用於實施本發明之離子交換劑之實例包括(但不限於)例如來自BioRad,Hercules,CA之產品名為MACROPREPTM 之離子交換劑，諸如MACROPREPTM S載體、MACROPREPTM High S載體及MACROPREPTM CM載體。
自陽離子層析載體溶離一般係藉由增加鹽濃度來完成。由於自離子管柱溶離涉及添加鹽且由於如本文所述HIC之鹽濃度增強，因此視情況於離子步驟或其他鹽步驟後使用引入HIC之步驟。在本發明之一實施例中，陽離子交換層析步驟至少在HIC步驟之前、例如第一疏水性相互作用層析載體及/或第二疏水性相互作用之前進行。
例如在第2、第3及/或第4純化步驟中，可將疏水性管柱用於純化重組蛋白。疏水性相互作用層析法已為此項技術中所熟知且係基於與附著至"層析載體"上之疏水性配位體相互作用之分子疏水性部分的相互作用。與基質偶合之疏水性配位體另外稱為HIC層析載體、HIC凝膠或HIC管柱及其類似物。應進一步瞭解蛋白與HIC管柱之間的相互作用之強度不僅為蛋白上非極性表面與極性表面之比例的函數而且亦為非極性表面之分布的函數。
可採用多種基質來製備HIC管柱。儘管可使用二氧化矽及有機聚合物樹脂，但最常使用瓊脂糖。適用之疏水性配位體包括(但不限於)具有約2個至約10個碳原子之烷基，諸如丁基、丙基或辛基；或芳基，諸如苯基。用於凝膠及管柱之習知HIC載體可自諸如Pharmacia,Uppsala,Sweden(在產品名butyl－SEPHAROSETM 、buty－SEPHAROSETM －Fast Flow、phenyl－SEPHAROSETM CL－4B、octyl SEPHAROSETM FF及phenyl SEPHAROSETM FF下)及Tosoh Corporation,Tokyo,Japan(在產品名TOYOPEARLTM butyl 650M(Fractogel TSK Butyl－650)或TSK－GEL Phenyl 5PW下)之供應商購得。
配位體密度為重要參數，因為其不僅影響蛋白相互作用之強度而且亦影響管柱容量。市售苯基或辛基苯基凝膠之配位體密度為約每毫升凝膠床5－40微莫耳。凝膠容量為所述特定蛋白以及pH值、溫度及鹽濃度的函數，但一般預期可在每毫升凝膠3－20毫克之範圍內。
特定凝膠之選擇可由熟習此項技術者確定。一般而言，蛋白與HIC配位體之相互作用之強度隨烷基配位體之鏈長增加而增加，但具有約4個至約8個碳原子之配位體適用於大多數分離。苯基具有與戊基大致相同之疏水性，儘管由於可能與蛋白之芳族基團進行π－π相互作用而導致選擇性可能不同。
蛋白對HIC管柱之吸附受高鹽濃度促進，但實際濃度可視蛋白性質及所選擇之特定HIC配位體而定在廣泛範圍內變化。一般而言，可使用介於約1與4 M之間的鹽濃度。
逐步或以梯度形式自HIC載體溶離可以多種方式完成，諸如a)藉由改變鹽濃度；b)藉由改變溶劑極性；或c)藉由添加清潔劑。藉由降低鹽濃度以增加疏水性之順序溶離所吸附之蛋白。可藉由添加諸如乙二醇或異丙醇之溶劑來實現極性改變，藉此降低疏水性相互作用之強度。清潔劑充當蛋白之置換劑且已主要與膜蛋白之純化聯合使用。
用於純化VEGF之方法之實例描述於下文中，例如參見實例IV及V。
表現重組蛋白
簡言之，將相對於宿主原核細胞基因組能夠自主複製及表現蛋白之表現載體引入宿主細胞中。適當表現載體之構建已為此項技術中所熟知，其包括本文所述之重組蛋白之核苷酸序列。例如參見Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,New York)(2001)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols John Wiley and Sons(New Jersey)(2002)；及Baneyx,(1999)Current Opinion in Biotechnology ,10：411－421。適當原核細胞(包括細菌)表現載體可經由例如美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(Rockville,Maryland)購得。使原核細胞且尤其是細菌細胞培養物大規模生長之方法已為此項技術所熟知，且此等方法可用於本發明之上下文中。
舉例而言，以編碼所關注重組蛋白之表現或選殖載體轉染原核宿主細胞，且將其培養於經修飾而適用於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因之習知營養培養基中。編碼所關注之多肽之核酸適當地為任何來源之RNA、cDNA或基因組DNA，其限制條件為其編碼所關注之多肽。選擇適於在微生物宿主中表現異種多肽(包括其變體)之核酸的方法已為人所熟知。編碼多肽之核酸分子係由於此項技術中已知之各種方法製備。舉例而言，藉由使用能夠特異性地結合至編碼VEGF之基因之寡核苷酸探針而將編碼VEGF之DNA分離且定序。
將異種核酸(例如，cDNA或基因組DNA)適當地插入可複製載體中以在適當啟動子之控制下在微生物體中表現。許多載體可用於此目的，且適當載體之選擇將主要視待插入載體中之核酸之尺寸及用載體轉型之特定宿主細胞而定。視可與載體相容之特定宿主細胞而定，各載體含有多種組份。視特定宿主類型而定，載體組份一般包括(但不限於)以下各物中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、啟動子及轉錄終止序列。
一般而言，將來源於與宿主細胞相容之物種的含有複製子及控制序列之質體載體與微生物宿主聯合使用。載體一般具有複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，大腸桿菌通常係使用來源於大腸桿菌物種之質體pBR322轉型(例如參見Bolivar等人，(1977)Gene ,2：95)。pBR322含有安比西林(ampicillin)及四環素(tetracycline)抗性基因，且因此提供鑑別轉型細胞之簡單方式。pBR322質體或其他細菌質體或噬菌體一般亦含有或經修飾而含有可由表現可選擇標記基因之宿主使用的啟動子。
(i)信號序列本發明之多肽不僅可直接由重組方式產生，且亦可以具有異種多肽之融合多肽形式產生，該異種多肽通常為在成熟蛋白或多肽之N－末端處具有特異性裂解位點之信號序列或其他多肽。所選擇之異種信號序列通常為經宿主細胞識別及處理(亦即，由信號肽酶裂解)之序列。對於不識別及處理天然多肽信號序列之原核宿主細胞而言，以選自(例如)鹼性磷酸酶、青黴素酶、lpp或熱穩定腸毒素II前導序列之群之原核信號序列取代信號序列。
(ii)複製起點組份表現載體含有能夠使載體在一或多個所選擇之宿主細胞中複製之核酸序列。多種微生物之該等序列已為人所熟知。來自質體pBR322之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性菌，諸如大腸桿菌。
(iii)選擇基因組份表現載體一般含有選擇基因，亦稱為可選擇之標記。此基因編碼在選擇性培養基中生長之經轉型宿主細胞之存活或生長所必需的蛋白。未經含有選擇基因之載體轉型之宿主細胞將無法在培養基中存活。將此可選擇之標記與如本發明所用及定義之遺傳標記分離。典型之選擇基因編碼具有以下特性之蛋白：(a)賦予對例如安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤或四環素之抗生素或其他毒素之抗性；(b)補充除由遺傳標記存在所引起之彼等缺陷之外的營養缺陷；或(c)供給不可自複合培養基獲得之關鍵養份，例如對於桿菌(Bacilli )而言為編碼D－丙胺酸消旋酶之基因。
選擇流程之一實例利用藥物中斷宿主細胞之生長。在此種狀況下，經所關注之核酸成功轉型之彼等細胞產生賦予藥物抗性之多肽，且由此在選擇方案中存活。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素(Southern等人，(1982)J.Molec.Appl.Genet., 1：327)、黴酚酸(Mulligan等人，(1980)Science 209：1422)或效高黴素(Sugden等人，(1985)Mol.Cell.Biol., 5：410－413)。上文所提供之三個實例採用在真核控制下分別傳送對適當藥物G418或新黴素(遺傳黴素)、xgpt(黴酚酸)或效高黴素之抗性的細菌基因。
(iv)啟動子組份用於產生所關注之重組蛋白之表現載體含有適當啟動子，該啟動子由宿主有機體識別且可操作地連接至編碼所關注之多肽之核酸。適用於與原核宿主一起使用之啟動子包括β－內醯胺酶及乳糖啟動子系統(Chang等人，(1978)Nature ,275：615；Goeddel等人，(1979)Nature ,281：544)、阿拉伯糖啟動子系統(Guzman等人，(1992)J. Bacteriol., 174：7716－7728)、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統(Goeddel,(1980)Nucleic Acids Res., 8：4057及EP 36,776)及諸如tac啟動子之雜交啟動子(deBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,80：21－25)。然而，其他已知之細菌啟動子亦適用。其核苷酸序列已經公開，藉此使熟習此項技術者能夠使用連接子或接附子可操作性地使其與編碼所關注多肽之DNA(Siebenlist等人，(1980)Cell ,20：269)接合以提供任何所需限制位點。亦例如參見Sambrook等人，上文 及Ausubel等人，上文 。
用於細菌系統中之啟動子一般亦含有可操作地連接至編碼所關注之多肽之DNA的Shine－Dalgarno(S.D.)序列。可藉由限制酶消化而自細菌來源之DNA中移除啟動子，且將啟動子插入含有所需DNA之載體中。
(v)載體之構建及分析採用標準接合技術構建含有上述組份中之一或多種的適當載體。將經分離之質體或DNA片段裂解、修整且再接合成產生所需質體所需之形式。
為進行分析以確定所構建質體中之正確序列，使用接合混合物轉型大腸桿菌K12菌株294(ATCC 31,446)或其他菌株，且適當時以安比西林或四環素抗性選擇成功之轉型體。製備來自轉型體之質體，藉由限制性核酸內切酶消化對其分析及/或藉由Sanger等人，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA .74：5463－5467或Messing等人，(1981)Nucleic Acids Res., 9：309之方法或藉由Maxam等人，(1980)Methods in Enzymology ,65：499之方法對其定序。亦例如參見Sambrook等人，上文 及Ausubel等人，上文 。
將編碼所關注之重組蛋白之核酸插入宿主細胞中。通常，藉由用上文所述之表現載體轉型宿主細胞並在經修飾而適於誘導各種啟動子之習知營養培養基中進行培養來實現此目的。
培養宿主細胞
用於實施本發明之合適原核細胞為此項技術中所熟知。通常使用表現大部分為包涵體形式或在周質空間或胞內空間中之重組蛋白的宿主細胞。合適原核生物包括細菌，例如真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌；桿菌，諸如枯草桿菌(B.subtilis )；假單胞菌(Pseudomonas species)，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa )、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )或黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens )。大腸桿菌宿主之一個實例為大腸桿菌294(ATCC 31,446)。諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其他菌株亦適用。此等實例為說明性的而非限制性的。由於菌株W3110為重組DNA產物醱酵之常用宿主菌株，因此其為典型宿主。在本發明之一態樣中，宿主細胞應分泌最小量之蛋白水解酶。舉例而言，可修飾菌株W3110以實現於編碼蛋白之基因中之基因突變，該等宿主之實例包括於1995年4月25日頒予之美國專利第5,410,026號中所述之大腸桿菌W3110菌株1A2、27A7、27B4及27C7。舉例而言，產生VEGF之菌株為具有命名為49B3之基因型tonA△ptr3 phoA△E15△(argF－lac)169 degP41 ilvg 之大腸桿菌菌株W3110。亦例如參見WO 2004/092393第23－24頁之表格。
將用於產生所關注之重組蛋白之原核細胞生長於此項技術中已知且適於培養所選擇之宿主細胞的培養基中，包括一般描述於Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Cold Spring Harbor,New York)(2001)中之培養基。適用於細菌之培養基包括(但不限於)AP5培養基、營養肉湯、Luria－Bertani(LB)肉湯、Neidhardt氏基本培養基及C.R.A.P.基本培養基或完全培養基加上必需營養補充物。在特定實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構建進行選擇之選擇劑以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林添加至培養基中以使表現安比西林抗性基因之細胞生長。除碳、氮及無機磷酸鹽源外，亦可包括適當濃度之單獨引入或作為與另一補充物或培養基之混合物(諸如複合氮源)引入的任何必需補充物。培養基視情況可含有一或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、硫代乙醇酸鹽、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇組成之群之還原劑。
合適培養基之實例係於美國專利第5,304,472號及第5,342,763號中給出。C.R.A.P.磷酸鹽限制培養基係由3.57 g(NH4 )2 (SO4 )、0.71 g檸檬酸鈉－2H2 O、1.07 g KCl、5.36 g酵母提取物(經驗證)、5.36 g HycaseSFTM －Sheffield組成，以KOH將pH值調節至7.3，以去離子H2 O將體積調節至872 ml且高壓滅菌；將其冷卻至55℃且以110 ml 1 M MOPS(pH值為7.3)、11 ml 50%葡萄糖、7 ml 1 M MgSO4 補充。接著可以50 μg/ml之濃度將卡本西林(Carbenicillin)添加至誘導培養物中。
將原核宿主細胞在適當溫度下培養。舉例而言，對於大腸桿菌生長而言，溫度在(例如)約20℃至約39℃或約25℃至約37℃之範圍內或為約30℃。
在採用鹼性磷酸酶啟動子之情況下，將用於產生本發明所關注之多肽之大腸桿菌細胞培養於適當培養基中，在此培養基中如一般於(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,New York)(2001)中所描述可部分或完全誘導鹼性磷酸酶啟動子。培養在不存在無機磷酸鹽之情況下或在磷酸鹽饑餓含量下不能進行。首先，培養基含有量大於誘導蛋白合成之含量且足以使細菌生長的無機磷酸鹽。隨著細胞生長且利用磷酸鹽，其降低培養基中磷酸鹽之含量，藉此誘導多肽合成。
若啟動子為可誘導啟動子，則為使誘導發生，通常使用高細胞密度方法培養細胞直至達成特定光學密度(例如A550 為約200)，此時起始(例如藉由添加誘導劑、藉由耗盡培養基組份等)誘導以誘導編碼所關注多肽之基因之表現。
亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的單獨引入或作為與另一補充物或培養基之混合物(諸如複合氮源)引入之任何必需補充物。培養基之pH值可為約5－9之任何pH值，此主要視宿主有機體而定。對於大腸桿菌而言，pH值為(例如)約6.8至約7.4，或為約7.0。
重組蛋白之用途
如此回收之多肽可於醫藥學上可接受之載劑中調配且用於各種診斷、治療或該等分子已知之其他用途。舉例而言，本文所述之蛋白可用於免疫檢定，諸如酶免疫檢定。
亦涵蓋使用本文所述之方法獲得之重組蛋白的治療用途。舉例而言，必要時可使用生長因子或激素(例如VEGF)增強生長。舉例而言，可使用VEGF促進(例如)急性創傷(例如，燒傷、手術創傷、普通創傷等)或慢性創傷(例如，糖尿病性潰瘍、壓瘡、褥瘡、靜脈性潰瘍等)之創傷癒合；促進毛髮生長；促進組織生長及修復等。
藉由將具有所需純度之分子(例如多肽)與可選之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington'sPharmaceutical Sciences第18版 ，Osol,A.編輯(1995))來製備凍乾調配物或水溶液形式之重組蛋白之治療調配物以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3－戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn－蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
在特定實施例中，用於活體內投藥之調配物為無菌的。易於藉由使其濾過無菌過濾膜而使其無菌。重組蛋白可以凍乾形式或以水溶液或凝膠形式儲存。重組蛋白製劑之pH值可為(例如)約4至8(在一實施例中，pH值為5.0)，儘管更高或更低pH值在某些情況下亦可為適當的。應瞭解使用該等賦形劑、載劑或穩定劑中之某些可導致形成重組蛋白鹽。
多肽投藥途徑係根據已知方法，例如藉由靜脈內、腹膜內、大腦內、肌肉內、眼內、動脈內或病變部位內(intralesional)途徑或藉由如下文所說明之持續釋放系統局部投與、注射或輸液。多肽可藉由輸液或藉由快速注射持續投與。
對於創傷癒合而言，通常調配重組蛋白以用於部位特異性傳遞。在局部施用時，適當地將重組蛋白與其他成份(諸如載劑及/或佐劑)組合。對此等其他成份之性質無限制，但其必須為醫藥學上可接受的且對於其預定投藥有效，且不能使組合物活性成份之活性顯著下降。適當媒劑之實例包括含有或不含經純化膠原蛋白之軟膏、乳膏、凝膠、噴霧劑或懸浮液。亦可將組合物視情況以液體或半液體形式浸漬於無菌敷料、經皮貼片、石膏及繃帶中。
為獲得凝膠調配物，可將調配成液體組合物之重組蛋白與有效量之水溶性多醣或合成聚合物(諸如聚乙二醇)混合以形成具有對於局部施用適當之黏度之凝膠。可使用之多醣包括(例如)纖維素衍生物，諸如醚化纖維素衍生物，包括烷基纖維素、羥基烷基纖維素及烷基羥基烷基纖維素，例如甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素及羥丙基纖維素；澱粉及經分餾澱粉；瓊脂；海藻酸及海藻酸鹽；阿拉伯膠；支鏈澱粉；瓊脂糖；角叉菜膠；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊糖；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；聚葡萄胺糖；肝糖；葡聚糖；及合成生物聚合物；以及樹膠，諸如三仙膠、瓜爾膠、刺槐豆膠、阿拉伯膠、黃蓍膠及刺梧桐膠；及其衍生物及混合物。在本發明之特定實施例中，本文之膠凝劑為(例如)對生物系統呈惰性、無毒、易於製備及/或不過於易流動或膠黏且將不會使其中所保持之重組蛋白去穩定的膠凝劑。
在本發明之特定實施例中，多醣為醚化纖維素衍生物，在另一實施例中，其為經明確定義、經純化且列於USP中之多醣，例如甲基纖維素及羥烷基纖維素衍生物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素及羥丙基甲基纖維素。在一實施例中，甲基纖維素為多醣。
適用於膠凝之聚乙二醇通常為低分子量與高分子量聚乙二醇之混合物以獲得適當黏度。舉例而言，分子量為400－600之聚乙二醇與分子量為1500之聚乙二醇之混合物當以適當比率混合時將對此目的有效以獲得糊狀物。
用於多醣及聚乙二醇之術語"水溶性"意欲包括膠狀溶液及分散液。一般而言，纖維素衍生物之溶解度係由醚基之取代程度決定，且本文中適用之穩定衍生物應在纖維素鏈中之每一葡萄糖殘基中具有足量之該等醚基以使衍生物可溶於水。每一葡萄糖殘基至少0.35個醚基之醚取代程度一般為足夠的。此外，纖維素衍生物可為鹼金屬鹽之形式，例如Li、Na、K或Cs鹽。
若在凝膠中採用甲基纖維素，則(例如)其組成凝膠之約2－5%或約3%或約4%或約5%，且重組蛋白係以每毫升凝膠約300－1000 mg之量存在。
該等活性成份亦可(例如)藉由團聚技術或藉由界面聚合法，分別以膠狀藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或以巨乳液捕集於所製備之微囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。該等技術揭示於Remington'sPharmaceutical Sciences第18版 ，Osol,A.編(1995)中。亦參見Johnson等人，Nat.Med., 2：795－799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther., 27：1221－1223(1993)；Hora等人，Bio/Technology .8：755－758(1990)；Cleland,"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,"Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach ,Powell及Newman編，(Plenum Press：New York,1995)，第439－462頁；WO 97/03692、WO 96/40072、WO 96/07399及美國專利第5,654,010號。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適當實例包括含有本發明多肽之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如膜或微囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L－麩胺酸與γ乙基－L－麩胺酸酯之共聚物、不可降解性乙烯－乙酸乙烯酯、可降解性乳酸－乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸－乙醇酸共聚物與亮丙瑞林乙酸鹽(leuprolide acetate)組成之可注射微球體))、聚乳酸－共乙醇酸(PLGA)聚合物及聚－D－(－)－3－羥基丁酸。雖然諸如乙烯－乙酸乙烯酯及乳酸－乙醇酸之聚合物能使分子釋放逾100天，但某些水凝膠在較短時段內釋放蛋白。當經囊封蛋白在長時間內保持於體內時，其可由於暴露於37℃之濕氣中而變性或聚集，從而導致損失生物學活性且可能改變免疫原性。視所涉及之機制而定，可設計出用於穩定之合理策略。舉例而言，若發現聚集機制為經由硫基－二硫化物互換之分子間S－S鍵形成，則可藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水份含量、使用適當添加劑及研發特定聚合物基質組合物來達成穩定。
持續釋放型多肽組合物亦包括脂質體捕集之多肽。含有蛋白之脂質體係由以下本身已知之方法製備：DE 3,218,121；Epstein等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,82：3688－3692；Hwang等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA .77：40304034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請案83－118008；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；及EP 102,324。脂質體通常為小(約200－800埃)單層型，其中脂質含量大於約30 mol%膽固醇，所選比例可經調節以便用多肽最有效地治療。
舉例而言，治療上待採用之重組蛋白之有效量將視治療目的、投藥途徑及患者病症而定。因此，治療師必需根據需要滴定劑量且改變投藥途徑以獲得最佳治療效應。視上文所提及之因素而定，典型日劑量可在約1 μg/kg至最多10 mg/kg或更高之範圍內。臨床醫師通常將投與多肽直至達到獲得所需效應之劑量。患者亦可在臨床醫師指導下投與多肽。易於藉由習知檢定來監測此療法之進展。
以下實例係以說明方式而非限制方式提供。
實例 實例I： 使於大腸桿菌中表現之重組人類VEGF溶解及再摺疊
方法用於VEGF 165 表現之質體－ 對質體pVEGF171進行設計以用於在大腸桿菌周質中表現人類VEGF165 (例如參見Leung等人，(1989)Science, 246：1306－1309)。在鹼性磷酸酶(AP)啟動子之嚴密控制下進行VEGF編碼序列之轉錄(例如參見Kikuchi等人，(1981)Nucleic Acids Research ,9：5671－8)，而轉譯起始所需之序列係由trp Shine－Dalgarno區域提供(例如參見Yanofsky等人，(1981)Nucleic Acids Research ,9：6647－68)。於細菌熱穩定腸毒素II(STII)信號序列下游融合VEGF編碼序列(例如參見Lee等人，(1983)Infect.Immun. 42：264－8；及Picken等人，(1983)Infect.Immun. 42：269－75)以供隨後分泌至大腸桿菌周質中。提供STII信號序列中之密碼子修飾以調節轉譯水平，從而產生周質中最佳程度之VEGF累積(例如參見Simmons及Yansura,(1996)Nature Biotechnloly ,14：629－34)。λ之轉錄終止子(例如參見Scholtissek及Grosse,(1987)Nucleic Acids Research 15：3185)位於VEGF轉譯終止密碼子之下游。複製起點及安比西林及四環素抗性基因係由質體pBR322提供。例如參見Bolivar等人，(1977)Gene 2：95－113。
細胞均質化及折射體製備－ 以微流體化儀(microfluidizer)或Niro Soavi在大於8000 psid之壓力下使產生重組蛋白之大腸桿菌細胞之全細胞肉湯均質化。將勻漿以160 mM MgSO4 、0.0375硫酸葡聚糖及1% Triton X－100以1：1稀釋，隨後藉由離心收集離心塊(BTUX離心機，Alfa Laval，Sweden)。
穩定及再摺疊－ 將離心塊(例如1公克)懸浮於4體積(例如4 ml)之溶解緩衝液中：最終濃度(4 L/kg離心塊)為1 M尿素/300 mM精胺酸、10 mM Tris或CHES、5 mM EDTA，pH值為11。將懸浮液在室溫(15－30℃)下徹底混合1－2小時。藉由添加每體積溶解緩衝液3體積(1：4 v/v)緩衝液來起始再摺疊，其導致再摺疊緩衝液之最終濃度為1 M尿素、15 mM半胱胺酸、0.5－2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM Tris或CHES、5 mM EDTA，pH值為9－10。將混合物在室溫下於恆定體積質量轉化係數kLa (例如對於在2.5 L容器中之空氣噴射而言，kLa ＝0.004至0.01 min－1 ，噴射速率為0.3－3 cc/min/L且混合速度為200－400 rpm)下在添加空氣或氧的同時攪拌6－24小時。參見圖1 之再摺疊時程。視情況可在6小時後藉由添加氮(例如對於2.5 L槽而言，0.3－3 cc/min/L)替代空氣而使VEGF於再摺疊緩衝液中穩定。參見圖7 。藉由SDS－PAGE、陽離子交換HPLC及rpHPLC層析及/或肝素HPLC來監測摺疊。
藉由於含有輕微含量之變性劑及還原劑之高pH值緩衝液中再摺疊來觀測到在維持經回收VEGF二聚體之產率的同時處理體積之顯著降低(5倍)。期望此方法可應用於其他重組蛋白(例如其他生長因子)之再摺疊中。
實例II： 於大腸桿菌中表現之重組人類VEGF之單一步驟溶解及再摺疊
溶解及再摺疊－ 將離心塊懸浮於每公斤細胞離心塊10－39公升體積之再摺疊緩衝液(在此種狀況下稱作"組合緩衝溶液")中，其中組合緩衝溶液含有1 M尿素、15 mM半胱胺酸、0.5或2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM Tris或CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為9.5－10.5。參見圖6 之添加尿素及精胺酸在再摺疊緩衝溶液中之影響。圖6 展示在室溫下在pH 9.5下歷時15小時之如此實例中所述之1步驟離心塊再摺疊(組合緩衝溶液)的結果。變性劑濃度係如下變化：(1)1 M尿素及100 mM精胺酸；(2)1 M尿素(及0 mM精胺酸)；(3)2 M尿素(及0 mM精胺酸)，同時所有其他緩衝組份(例如Tris或CHES、DTT等)保持相同濃度。如藉由陽離子交換HPLC檢定所測定，自此等濃度擷取之VEGF效價相同。圖6 展示在精胺酸存在下或不存在下rpHPLC概況相當。
使溶解及再摺疊培育在室溫下進行3－24小時且以空氣在質量轉化係數kLa ＝0.004至0.1 min－1 (例如對於具有船用型葉輪之2.5 L容器而言，空氣噴射速率為0.3至10 cc/min/L或0.3－1 cc/min/L或1 cc/min/L或25 cc/min/L，同時混合為200－400 rpm)下噴射。參見圖8 之不同空氣噴射速率對再摺疊條件之影響。舉例而言，將含有VEGF之離心塊以1：39之比率(離心塊kg比緩衝液L)添加至pH值為10之組合緩衝溶液中。製備三個2.5 L反應槽且改變每一者之混合速率及空氣噴射速率以達成(a)0.004 min－1 、(b)0.01 min－1 、(c)0.1 min－1 之kLa 。在各槽中所測試之混合速率為314 rpm，而空氣噴射之範圍為1 cc/L/min至25 cc/L/min。隨時間監測反應之產率及產物品質。圖8 中所呈現之rpHPLC概況展示12小時後所得摺疊VEGF之相當的產物品質。視情況可使培育在室溫下進行長達約48小時。視情況可於6小時後藉由以相同噴射及混合速率添加氮替代空氣而使VEGF於再摺疊緩衝液中穩定。參見圖7 ，其展示在空氣存在下(例如對於2.5 L槽而言，kLa ＝0.004 min－1 或0.3 cc/min/L)2步驟離心塊再摺疊(如實例I所述)之結果，其中在6小時處單體峰值降低(從而表示再摺疊反應大體上完成)。以N2 (例如kLa ＝0.004 min－1 )替代空氣噴射維持長達48小時。如圖7 所見，如rpHPLC跡線所示材料保持穩定。藉由SDS－PAGE、陽離子交換HPLC及rpHPLC層析管柱及/或肝素HPLC監測摺疊。
實例III： 重組蛋白之非離心塊再摺疊
將產生重組蛋白之大腸桿菌全細胞肉湯於15 M型實驗室均化器Gaulin 15M(小規模)或M3(大規模)(Gaulin Corporation,Everett,MA)中均質化且每體積勻漿於再摺疊緩衝液中以1：4(v/v)稀釋，且以空氣在質量轉化係數kLa ＝0.004至0.01 min－1 下噴射(例如對於具有船用型葉輪之2.5 L容器而言，空氣噴射速率為0.3至3 cc/min/L或0.3－1 cc/min/L或1 cc/min/L或3 cc/min/L，同時混合為200－400 rpm)。再摺疊緩衝液含有1 M尿素、15 mM半胱胺酸、2 mM DTT、100 mM精胺酸、10 mM Tris或CHES、5 mM EDTA之最終濃度，pH值為9－10。在室溫下進行再摺疊培育3－24小時。視情況可於3小時再摺疊培育後藉由添加氮替代空氣而使VEGF於再摺疊緩衝液中穩定。藉由陽離子交換HPLC、rpHPLC層析及/或肝素HPLC監測摺疊。
實例IV： 再摺疊後重組人類VEGF(rhVEGF)之純化
純化： 藉由添加Triton X－100直至1%之最終濃度、將pH值調節至9且接著離心(在4℃下10,000×g歷時20分鐘)來澄清再摺疊池。接著將上清液過濾(Cuno深度過濾器＋0.22或0.45 μ膜過濾器)，隨後在pH 9且傳導率<10 mS/cm之混合模式樹脂(CaptoMMCTM ,GE Healthcare,Piscataway,NJ)上俘獲。視情況，將再摺疊池於平衡負載緩衝液中以至少1：5稀釋且接著過濾(Cuno深度過濾器＋0.22或0.45 μ膜過濾器)，隨後在pH 9且傳導率<10 mS/cm之混合模式樹脂(CaptoMMCTM ,GE Healthcare,Piscataway,NJ)上俘獲。以pH值為9之25 mM HEPES使經包裝管柱平衡，隨後將樣本負載至管柱上。用pH值為6－9(例如pH值為7.5)之1 M精胺酸/25 mM HEPES將VEGF自MMC管柱等度溶離。參見圖2 。
以0.1 N氫氧化鈉將CaptoMMCTM 池調節至pH值為7.5且以WFI稀釋至20 mS/cm傳導率，隨後負載至SP－Sepharose HP管柱(以pH值為7.5之50 mM HEPES平衡)上。使用由pH值為7.5之50 mM HEPES/0－1.2 M乙酸鈉組成之線性鹽梯度，以10－20管柱體積(例如15管柱體積)溶離VEGF且收集溶離份(1管柱體積)。在280 nm下具有最高吸光度(~42 mS/cm下之OD max)之溶離份通常含有>90%之VEGF且將該等溶離份彙集以供進一步處理。參見圖3 。
第三層析步驟包括疏水性樹脂(例如Hi Propyl,J.T.Baker,Phenyl Sepharose Fast Flow(low sub),GE Healthcare,Piscataway,NJ)。使用乙酸鈉或硫酸鈉將SP－Sepharose HP溶離池調節至50 mS/cm傳導率，隨後負載至經平衡管柱上(50 mM HEPES、1.2 M乙酸鈉，pH值為7.5)。參見圖4 。將VEGF等度溶離至pH值為7.5之50 mM HEPES中且分析池中所剩餘之宿主細胞雜質及可溶聚集物。收集溶離份，並彙集如藉由本文所述之檢定所測定含有適當摺疊VEGF之溶離份。視情況，例如使用第二疏水性樹脂(例如Phenyl TSK)或離子交換樹脂執行額外層析步驟。
超濾/透濾－可將經彙集VEGF於實驗級TFF系統之5kD再生纖維素膜上超濾至6 g/L(UF1)之濃度。經由TFF系統，以7－14 DV(Diavolume)以5 mM琥珀酸鈉將樣本透濾至10 g/L且接著調配成5 g/L以供在－80℃下儲存。所使用之調配緩衝液為5 mM琥珀酸鈉/275 mM脫水海藻糖/0.01%聚山梨醇酯20/pH 5.0。
實例V： 再摺疊後重組人類VEGF(rhVEGF)之純化
純化：藉由添加Triton X－100直至1%之最終濃度、調節pH值至8.5－9.5(例如pH值為8.7)且於25－30℃下保持1至10小時來澄清再摺疊池，隨後進行離心。於離心機(在4℃下10,000×g歷時20分鐘)上處理以移除大密度顆粒之後，使回收之液體(離心液)通過一系列深度過濾器及無菌保護(0.22或0.45 μ膜)過濾器以移除精細顆粒。接著在pH 8.7且傳導率<10 mS/cm之混合模式樹脂(CaptoMMCTM ,GE Healthcare,Piscataway,NJ)上俘獲rhVEGF。以pH值為8.7之25 mM CHES使經包裝管柱平衡，隨後將樣本負載於管柱上。以pH值為6－9(例如pH值為7.5)之0.9 M L－精胺酸HCl/25 mM HEPES將VEGF自MMC管柱等度溶離。
以0.1 N氫氧化鈉將CaptoMMCTM 池調節至pH值為7.5且以WFI稀釋至20 mS/cm傳導率，隨後負載於SP－Sepharose高效管柱(以pH值為7.5之25 mM HEPES平衡)上。使用由pH值為7.5之50 mM HEPES/0－1.2 M乙酸鈉組成之線性鹽梯度，以10－20管柱體積(例如15管柱體積)溶離VEGF且收集溶離份(1管柱體積)。在280 nm下具有最高吸光度(~42 mS/cm下之OD max)之溶離份通常含有>90%之VEGF且將該等溶離份彙集以供進一步處理。第三層析步驟包括疏水性樹脂(例如Hi Propyl,J.T.Baker,Phenyl Sepharose Fast Flow(low Sub),GE Healthcare,Piscataway,NJ)。將SP－Sepharose HP溶離池直接負載至經平衡HIC管柱(25 mM HEPES、0.75 M乙酸鈉，pH值為7.5)上。參見圖5 。將VEGF等度溶離至pH值為7.5之50 mM HEPES中且分析池中之剩餘宿主細胞雜質及可溶聚集物。收集溶離份並彙集如藉由本文所述之檢定所測定含有適當摺疊VEGF之溶離份。視情況，例如使用第二疏水性樹脂(例如Phenyl TSK)或離子交換樹脂執行額外層析步驟以進一步移除宿主雜質。
超濾/透濾－可將經彙集VEGF於商業TFF系統(Pellicon 2匣，Millipore,Billerica,MA)中之5kD再生纖維素膜上超濾至10 g/L之濃度，接著以7－14透濾體積(diavolume)(例如10 DV)透濾至調配緩衝液中。最終調節產生於5 mM琥珀酸鈉/275 mM脫水海藻糖/0.01%聚山梨醇酯20/pH 5.0中含有5 g/L VEGF之溶液，其可在－80℃下儲存。
實例VI： 測定摺疊及/或經純化重組蛋白之檢定
在本文所述之方法及過程中，最終純度及/或活性可藉由以下方法來評定：肽圖譜、二硫鍵圖譜、SDS－PAGE(經還原及未經還原)、圓二色性、鱟變形細胞溶菌液(LAL)、陽離子交換HPLC、肝素HPLC(例如，肝素HPLC可用以測定VEGF二聚體濃度及摺疊異常物質之含量)、逆相(rp)HPLC層析(例如，經還原樣本之rpHPLC可用以測定總VEGF濃度，而天然樣本之rpHPLC可評定再摺疊VEGF之品質)、受體結合(例如，對於VEGF而言，例如KDR受體結合－Bioanalytic R & D及/或Flt1受體結合)、SEC分析、細胞檢定、HUVEC效能檢定、以VEGF抗體進行之ELISA、質譜分析等。
測定總VEGF表現之檢定
(1)經還原樣本之rpHPLC－ 於C18管柱(Jupiter C18管柱(4.6×250 mm，5微米，Phenomenex,Torrance,CA))上使用逆相HPLC檢定來量測經表現VEGF之數量。使管柱於0.22%三氟乙酸中平衡且使用含有0.2%三氟乙酸之25%至45%乙腈線性梯度於30分鐘內以1 mL/min之流率溶離。在280 nm下監測溶析液。處理樣本且將樣本於胍及DTT中完全還原，隨後注射。將經還原VEGF蛋白溶離約26分鐘且使用峰值面積由已知標準曲線來計算樣本中總VEGF之量。
再摺疊VEGF之檢定
(1)陽離子交換HPLC檢定－ 使用分析型陽離子交換管柱(例如SP－5PW管柱(TSK凝膠SP－5PW，7.5×75 mm，10微米，Tosoh Biosciences LLC,Japan))來測定適當再摺疊VEGF二聚體之數量。以pH值為7.5之50 mM磷酸鈉使管柱平衡。在1 mL/min之流率下，經60分鐘使用平衡緩衝液中0至2 M氯化鈉之線性梯度來溶離管柱。於280 nm或214 nm下監測溶析液。通常，大部分蛋白係於頭30分鐘內溶離且VEGF溶離約40分鐘。參見圖9 。
(2)rp－HPLC檢定－ 使用Zorbax 300SB－C8管柱(4.6×150 mm，3.5微米，Agilent Technologies,Santa Clara,CA)測定適當再摺疊VEGF之品質。使管柱於0.1%三氟乙酸中平衡且以1 mL/min之流率，使用含有0.08%三氟乙酸之0至50%乙腈之線性梯度經50分鐘溶離。於214 nm下監測溶析液。通常，VEGF溶離約35分鐘且以前沿疏水性物質相對於主峰之百分比含量來評估峰值概況。摺疊打開之VEGF單體稍後溶離2－3分鐘。
(3)肝素結合HPLC檢定－ 使用含有固定肝素之管柱測定適當再摺疊VEGF之品質及數量。使管柱Heparin－5PW(7.5×75 mm，10微米，TSK凝膠，Tosoh Biosciences LLC,Japan)於含有0.15 M氯化鈉之pH值為7.4之10 mM磷酸鈉中平衡。使用平衡緩衝液中0.15 M至1.6 M氯化鈉之線性梯度經20分鐘以1 mL/min之流率來溶離管柱。在一些檢定中，溶離係在16分鐘內完成。於280 nm下監測溶析液。通常，在空隙容積中溶離大部分蛋白且可鑑別三類VEGF。將最高親和力、最後溶離之物質鑑別為正確摺疊VEGF且有時鑑別為"峰值3 VEGF"。
應瞭解本文所述之內容、實例及實施例僅出於說明之目的，且熟習此項技術者將根據其提出各種修改或改變，且此等修改或改變將包括在本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。出於所有目的，本文所引用之所有公開案、引文、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文。
圖1 說明如本文所述之再摺疊法之時程研究的實例，其係藉由rpHPLC層析來評估。
圖2 說明負載於CaptoMMCTM 管柱上之由菌株W3110所產生之VEGF的層析圖。以pH值為9.0之25 mM HEPES使管柱平衡。以pH值為6－9之1 M精胺酸/25 mM HEPES將VEGF自MMC管柱等度溶離。
圖3 說明負載於SPHP管柱上之由菌株W3110所產生之VEGF的層析圖。舉例而言，將SPHP管柱於pH值為7.5之50 mM HEPES中平衡。使用pH值為7.5之50 mM HEPES中之0.0－1.2 M乙酸鈉線性梯度以1管柱體積將管柱溶離。於280 nm下監測溶析液。自在280 nm下具有最高吸光度(~42 mS/cm下之OD max)之溶離份回收蛋白，該等溶離份通常含有>90%之VEGF且將其彙集以用於進一步處理。
圖4 說明負載於HiPropyl管柱上之由菌株W3110所產生之VEGF的層析圖。
圖5 說明負載於Phenyl Sepharose管柱上之由菌株W3110所產生之VEGF的層析圖。
圖6 說明尿素及精胺酸對再摺疊條件之影響。
圖7 說明當於再摺疊開始後6小時添加N2 時，如由rpHPLC時程所評估N2 在長達48小時內於穩定再摺疊池方面之作用。
圖8 說明不同空氣噴射速率對再摺疊條件之影響。
圖9 說明將陽離子交換HPLC用於再摺疊VEGF之檢定之管柱檢定。
圖10 說明具有指定二硫鍵之VEGF165 胺基酸序列。
<110> 美商建南德克公司<120> 重組蛋白之再摺疊<130> P2385R1 <140> 096125690 <141> 2007－07－13 <150> US 60/830,831 <151> 2006－07－14 <160> 1 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> 智人<400> 1
(無元件符號說明)

Claims (19)

  1. 一種自原核細胞培養物回收再摺疊重組蛋白之方法，其中該重組蛋白為血管內皮生長因子(VEGF)，該方法包含下列步驟：(a)自該原核細胞培養物分離重組蛋白；(b)將該蛋白溶解於pH值大於9之第一緩衝溶液中，該緩衝溶液包含：(i)1M尿素、300mM精胺酸、10mM CHES、5mM EDTA之最終濃度，pH值為11；或(ii)1M尿素、300mM精胺酸、10mM TRIS、5mM EDTA之最終濃度，pH值為11；(c)將該重組蛋白於pH值>9但11之第二緩衝溶液中再摺疊，該緩衝溶液包含(i)1M尿素、15mM半胱胺酸、2mM DTT、100mM精胺酸、10mM CHES、5mM EDTA之最終濃度，pH值為10；或(ii)1M尿素、15mM半胱胺酸、0.5-2mM DTT、100mM精胺酸、10mM TRIS、5mM EDTA之最終濃度，pH值為10，且於使得該重組蛋白發生再摺疊之時間及條件下添加空氣或氧；及(d)回收該再摺疊重組蛋白。
  2. 如請求項1之方法，其中該VEGF為VEGF165 。
  3. 如請求項1之方法，其中將該重組蛋白於該第一緩衝溶液中培育至少1小時。
  4. 如請求項3之方法，其中該培育係在2-40℃下進行。
  5. 如請求項1之方法，其中將該溶解蛋白在該第二緩衝溶液中培育約3至24小時。
  6. 如請求項5之方法，其中該培育係在2-40℃下進行。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包含藉由添加氮來穩定該再摺疊重組蛋白。
  8. 如請求項1之方法，其中該回收步驟(d)包含澄清具有該重組蛋白之該第二緩衝溶液，且將該再摺疊重組蛋白與混合模式層析載體、陽離子層析載體及第一疏水性層析載體依次接觸，且自各載體選擇性地溶離該再摺疊重組蛋白。
  9. 如請求項8之方法，其中該澄清步驟包含：添加清潔劑直至1%之最終濃度，將pH值調節至約8.5-9.5，將溶液在25-30℃下培育1至10小時，離心該溶液且過濾自該離心步驟回收之液體。
  10. 如請求項8之方法，其進一步包含將該再摺疊重組蛋白與第二疏水性層析載體或離子交換載體接觸且自該載體選擇性地溶離該再摺疊重組蛋白。
  11. 如請求項8或10之方法，其中該第一及該第二疏水性相互作用層析載體係選自由丁基-、丙基-、辛基-、苯基-及芳基-瓊脂糖樹脂組成之群。
  12. 一種自原核細胞培養物回收再摺疊重組蛋白之方法，其中該重組蛋白為血管內皮生長因子(VEGF)，該方法包含下列步驟：(a)自該原核細胞培養物分離重組蛋白； (b)在伴隨添加空氣或氧的情況下於pH值>9但11之緩衝溶液中使該蛋白溶解且再摺疊，其中該緩衝溶液包含(i)1M尿素、15mM半胱胺酸、2mM DTT、100mM精胺酸、10mM CHES、5mM EDTA之最終濃度，pH值為10，或(ii)1M尿素、15mM半胱胺酸、0.5-2mM DTT、100mM精胺酸、10mM TRIS、5mM EDTA之最終濃度，pH值為10；及(c)回收該再摺疊重組蛋白。
  13. 如請求項12之方法，其中該回收步驟包含澄清具有該重組蛋白之該緩衝溶液，且將該再摺疊重組蛋白與混合模式層析載體、陽離子層析載體及第一疏水性層析載體依次接觸且自各載體選擇性地溶離該再摺疊重組蛋白。
  14. 如請求項13之方法，其中該澄清步驟包含：添加清潔劑直至1%之最終濃度，將pH值調節至約8.5-9.5，在25-30℃下培育溶液1至10小時，離心該溶液且過濾自該離心步驟回收之液體。
  15. 如請求項12之方法，其中將該重組蛋白在該組合緩衝溶液中培育約3至24小時。
  16. 如請求項15之方法，其中該培育係在2-40℃下進行。
  17. 如請求項13之方法，其進一步包含將該再摺疊重組蛋白與第二疏水性層析載體或離子交換載體接觸且自該載體選擇性地溶離該再摺疊重組蛋白。
  18. 如請求項1之方法，其中該回收步驟(d)包含將重組蛋白與混合模式載體、陽離子層析載體、第一疏水性相互作 用層析載體依次接觸且自各載體選擇性地溶離該重組蛋白。
  19. 如請求項18之方法，其進一步包含將該重組蛋白與第二疏水性層析載體或離子交換載體接觸且自該載體選擇性地溶離該重組蛋白。
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