JP2013540157A - 封入体を処理する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体及び抗体フラグメントなどの組換えタンパク質を精製するための方法に関する。好適には、本方法は、可溶化した混合物から所望のタンパク質を清澄化するために深層濾過を使用し、また、組換えタンパク質を機能性かつ活性のタンパク質に再生することを可能にするための再生方法及び再生バッファーを提供する。抗体フラグメントの例としては、機能性かつ活性のフラグメントに再生される、ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗ＣＤ２２抗体フラグメントを含む。
【選択図】図６

Description

本発明は、抗体及び抗体フラグメントなどの組換えタンパク質を精製するための方法に関する。好適には、本方法は、可溶化した混合物から所望のタンパク質を清澄化するために深層濾過を使用し、また、組換えタンパク質を機能性かつ活性のタンパク質に再生することを可能にするための再生方法及び再生バッファーを提供する。
組換えタンパク質、特に抗体及び抗体フラグメントの精製は、高度に複雑で、労力を要する上に時間のかかる工程となりうる。細菌細胞培養物からの組換えタンパク質の生産によって、細胞から、封入体と結合している所望のタンパク質が得られる。一般に、封入体からの所望のタンパク質の分離には、遠心分離と深層濾過、深層濾過とタンジェンシャルフロー濾過の組合せ、又はタンジェンシャルフロー濾過単独による清澄化を用いる。こうした清澄化のための組合せ方法は、十分な清澄化を可能にすると同時に、さらに下流の精製カラムの汚損を防止するために、一般に用いられている。分離後、タンパク質を活性及び機能性形態に再生することができる。複合タンパク質、例えば、可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖を含む抗体フラグメントを清澄化する場合には、精製ステップの数を最小限にすることにより、生成物の収率及び純度が高められると共に、生産時間及び費用が減じられる。
米国特許第７，３５５，０１２号明細書（以後、「‘０１２特許」と呼ぶ）（その開示内容は、その全文を参照として本明細書に組み込む）は、ＣＤ２２−発現細胞、特にその外部表面にＣＤ２２を発現する癌細胞に結合する抗体を開示している。‘０１２特許は、抗体ＲＦＢ４の配列を有するＶＬ鎖と、抗体ＲＦＢ４の配列を有するＶＨ鎖とを含む抗ＣＤ２２抗体を記載しており、ＶＨ鎖のＣＤＲ３の残基１００、１００Ａ及び１００Ｂ（Ｋａｂａｔ及びＷｕ番号付けシステムにより番号付けした）は、ＴＨＷ、ＹＮＷ、ＴＴＷ及びＳＴＹからなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。‘０１２特許は、組換え方法を用いた完全長抗体フラグメントの作製、続いて精製及び再生による抗ＣＤ２２の生産を記載している。しかし、一部（例えば、抗体又は抗体フラグメントのＶＨ及びＶＬ部分）を様々な細胞培養物（又は同じ細胞培養）において個別に生産する、組換えタンパク質の製造のためには、効率的で、高純度かつ高収率のタンパク質生産をもたらす精製方法が必要とされる。
米国特許第７，３５５，０１２号
前述した必要性は、組換えタンパク質の精製方法を提供する本願によって解決される。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製する方法が提供される。本方法は、好適には、可溶化バッファーで、封入体と結合した組換えタンパク質を含む混合物を可溶化するステップ、１つ以上の深層フィルターで可溶化混合物から組換えタンパク質を清澄化するステップ、及び清澄化組換えタンパク質を回収するステップを含む。好適には、本方法は、清澄化の前に、結合封入体を有する組換えタンパク質を含む混合物を遠心分離するステップを含まない。
いくつかの実施形態例では、組換えタンパク質は、抗体又は、可変重鎖（ＶＨ）抗体フラグメント又は可変軽鎖（ＶＬ）抗体フラグメントなどの抗体フラグメント、例えば、抗ＣＤ２２抗体フラグメントを含む。
例としての可溶化バッファーは、エタノールアミン、アルギニン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥ、例えば、約１０〜約１１のｐＨで、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約５Ｍ〜約１０Ｍの尿素及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＤＴＥを含む。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、好適には連続した、２つ以上の深層フィルター、例えば、セルロース繊維及び珪藻土を含み、約０．１μｍ〜約１μｍのミクロン濾過度を有する第１深層フィルター（例えば、Ｃ０ＨＣ深層フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）））で清澄化し、また、好適な第２深層フィルターは、セルロース繊維及び珪藻土を含み、約０．１μｍ未満のミクロン濾過度を有する（例えば、Ｘ０ＨＣ深層フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標）））。
本方法は、好適には、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン、約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含むタンパク質再生バッファーで、濃縮した清澄化組換えタンパク質を希釈するステップ、約９〜約１０のｐＨ及び約２℃〜約１５℃の温度で、希釈した清澄化組換えタンパク質を約４８時間〜約９６時間にわたりインキュベートするステップ、並びに組換えタンパク質を回収するステップをさらに含む。
ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを含む組換え抗体フラグメントを生産する方法も提供される。本方法は、好適には、第１細菌細胞においてＶＨ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させると共に、第２細菌細胞においてＶＬ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。ＶＨ抗体フラグメントとＶＬ抗体フラグメントを混合して、混合物を作製するが、混合物はさらに封入体を含んでいる。封入体と結合したＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを含む混合物を可溶化バッファーで可溶化する。ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを、１つ以上の深層フィルターによって可溶化混合物から清澄化し、清澄化したＶＨ抗体フラグメント及び清澄化したＶＬ抗体フラグメントを回収する。好適には、本方法は、深層濾過を用いた清澄化の前に、ＶＨ抗体フラグメント、ＶＬ抗体フラグメント及び封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを含まない。
清澄化したＶＨ抗体フラグメント及び清澄化したＶＬ抗体フラグメントを濃縮した後、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約５００ｍＭ〜１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む再生バッファーで希釈する。希釈した清澄化ＶＨ抗体フラグメント及び希釈した清澄化ＶＬ抗体フラグメントを約９〜約１０のｐＨ及び約１０℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間にわたりインキュベートする。次に、組換え抗体フラグメントを回収する。
本明細書に記載するように、好適には、ＶＨ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントであり、ＶＬ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＬフラグメントであり、組換え抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２抗体フラグメントである。可溶化及び再生バッファーの例は、深層濾過方法と同様に、本明細書に記載する。
さらなる実施形態、実施形態の特徴、及び利点、並びに様々な実施形態の構造及び操作について、添付の図面を参照にしながら、以下に詳しく説明する。
第１セットの再生条件下での再生後に行った抗ＣＤ２２抗体の逆相高性能液体クロマトグラフィー質量分光法（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）分析の結果を示す。 第２セットの再生条件下での再生後に行った抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 第３セットの再生条件下での再生後に行った抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 第４セットの再生条件下での再生後に行った抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 時間＝０の再生後の抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 時間＝２０時間の再生後の抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 時間＝９０時間の再生後の抗ＣＤ２２抗体のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す。 さらなる精製後に抗ＣＤ２２抗体フラグメントの存在を示すＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳの結果を示す。 さらなる精製後に抗ＣＤ２２抗体フラグメントの存在を示すＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳの結果を示す。 時間＝０での５ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝１５時間での５ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝２４時間での５ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝３９時間での５ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝０での１００ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝２４時間での１００ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝４８時間での１００ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 時間＝７０時間での１００ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を示す。 再生した抗ＣＤ２２抗体フラグメントの存在を証明するウエスタンブロットを示す。
本明細書に示し、説明する特定の実施形態は、例であり、本発明の範囲を何ら制限する意図はないことを理解すべきである。
本明細書で引用する公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、各々が、参照として組み込まれることを具体的かつ個別に明示されているのと同様に、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。本明細書で引用するいずれかの参照文献と本明細書の具体的教示内容との間に何らかの衝突がある場合には、後者の利益となるように解決されるものとする。同様に、当分野で理解されている単語又はフレーズの定義と、本明細書で明確に教示されている単語又はフレーズの定義との間に何らかの衝突がある場合には、後者の利益となるように解決されるものとする。
本明細書で用いられているように、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文の内容から明らかに別のことを示しているのでない限り、それらが指している用語の複数形も明確に包含する。本明細書で用いる「約」という用語は、約、ほぼ、およそ、又は前後を意味する。用語「約」が、数値の範囲に関して用いられるとき、これは、記載されている数値を上下に超えて限界を拡大することにより、この範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、記載の値を２０％の変動率で上下に超えて数値を変更するために用いられる。
本明細書で用いられる技術及び科学用語は、別途定義されていない限り、本願が関連する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者には公知の様々な方法及び物質について述べる。組換えＤＮＡ技術の一般原理を記載している標準的参照文献として、以下のものがある：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｅｄｓ．，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ（１９９５）；及びＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）。尚、これら各々の開示内容は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質、例えば、抗体及び抗体フラグメントを精製するための方法が提供される。一実施形態では、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製するための方法が提供される。本方法は、好適には、可溶化バッファーで、封入体と結合した組換えタンパク質を含む混合物を可溶化するステップ、１つ以上の深層フィルターで、可溶化した混合物から組換えタンパク質を清澄化するステップ、及び清澄化した組換えタンパク質を回収するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、組換えタンパク質の清澄化の前に、組換えタンパク質と封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを含まない。
本明細書では、「精製する」という用語を用いて、所望のタンパク質が、他のタンパク質を少なくとも約７５％含まない、他のタンパク質を少なくとも約８０％含まない、他のタンパク質を少なくとも約９０％含まない、さらに好適には、他のタンパク質を少なくとも約９５％含まない、最も好適には、他のタンパク質を少なくとも約９８％含まないように、所望の組換えタンパク質を他のタンパク質又は不要な生成物若しくは構造から取り出す方法を意味する。
本明細書において、「組換えタンパク質」とは、いずれかの好適な発現系、例えば、原核及び真核発現系を用いて、又はファージ展示方法（例えば、Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号明細書及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号明細書；及び米国特許第５，９６９，１０８号明細書を参照；尚、これらの文献は、その全文を参照として本明細書に組み込む）を用いて、生産されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を意味する。用語「タンパク質（単数）」及び「タンパク質（複数）」が、全体を通して置換え可能に用いられることは理解すべきである。
本明細書において、「ペプチド」又は「ポリペプチド」という用語は、好ましくは、α−アミノ酸、Ｄ−、Ｌ−アミノ酸、及びその組合せが規定順序で連結したものから形成されるポリマーを意味する。１アミノ酸残基と次のアミノ酸との連結は、アミド結合又はペプチド結合と呼ばれる。タンパク質は、多数のポリペプチドサブユニットを有するポリペプチド分子である。その違いは、ペプチドが一般に短いのに対し、ポリペプチド／タンパク質は、一般に、それより長いアミノ酸鎖であることである。「タンパク質」という用語は、誘導体化分子、例えば、糖タンパク質及びリポタンパク質、並びに低分子ポリペプチドも含むものとする。「アミノ酸配列」及び類似用語、例えば、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、表示するアミノ酸配列を、記載のタンパク質分子に関連する完全な天然のアミノ酸配列に限定するわけではない。
各種宿主細胞、例えば、細菌、植物、酵母、昆虫及び哺乳動物細胞を用いて、組換えタンパク質を生産する方法は公知である。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、他の細菌宿主、酵母、及び様々な高等真核細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及び骨髄腫細胞系を用いた、タンパク質発現のための多数の発現系が入手可能である。
手短には、所望のタンパク質をコードする天然又は合成核酸の発現は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡをプロモーター（構成的又は誘導性のいずれか）に機能的に連結した後、発現カセットに組み込むことによって達成される。カセットは、原核又は真核細胞系のいずれにおける複製及び組込みにも適している。典型的な発現カセットは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにタンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用なプロモーターを含む。クローン化遺伝子の高レベル発現を取得するためには、最低でも、転写を指令する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネーターを含む発現カセットを構築するのが望ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、これは、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃ、又はλプロモーターのようなプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合、制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルス、及びポリアデニル化配列に由来するプロモーター及びエンハンサーを含んでよく、また、スプライスドナー及びアクセプター配列を含んでもよい。カセットは、公知の方法、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合には、塩化カルシウム形質転換又はエレクトロポレーション、また哺乳動物細胞の場合には、リン酸カルシウム処理、又はエレクトロポレーション若しくはリポフェクションによって、選択した宿主細胞に転移させることができる。カセットによって形質転換した細胞は、カセットに含まれる遺伝子、例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏ及びｈｙｇ遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。
宿主細胞での発現後、組換えタンパク質は、封入体と結合していることが多く、再生する前に、タンパク質を封入体から抽出しなければならない。本方法では、封入体と結合した所望の組換えタンパク質を含む混合物を可溶化バッファーで可溶化する。
可溶化バッファーの例として、当分野で公知のものがある。例えば、好適な可溶化バッファーは、ジスルフィド結合を分離するための還元剤を含む。例としてバッファーは、Ｔｒｉｓ、グアニジン、ＥＤＴＡ及びＤＴＥを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、可溶化バッファーは、エタノールアミン、アルギン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥを含む。例えば、可溶化バッファーは、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約５Ｍ〜約１０Ｍの尿素及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＤＴＥを含んでよく、また、約１０〜約１１のｐＨを有するものでよい。好適には、可溶化バッファーは、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約１Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約６Ｍ〜約９Ｍの尿素及び約８ｍＭ〜約１５ｍＭのＤＴＥを含む。さらに好適には、可溶化バッファーは、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭのエタノールアミン、約４００ｍＭ〜約６００ｍＭのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約７Ｍ〜約９Ｍの尿素及び約８ｍＭ〜約１２ｍＭのＤＴＥを含む。最も好適には、可溶化バッファーは、約５０ｍＭのエタノールアミン、約５００ｍＭのアルギニン、約２ｍＭのＥＤＴＡ、約８Ｍの尿素及び約１０ｍＭのＤＴＥを含み、約１０．５のｐＨを有する。
所望の組換えタンパク質及び封入体を含む混合物の可溶化の後、１つ以上の深層フィルター、好適には、２つ以上の深層フィルターで、可溶化混合物から組換えタンパク質を清澄化する。
本明細書で用いる「清澄化する」又は「清澄化（すること）」という用語は、不要なタンパク質及び他の物質から所望のタンパク質を取り出すことによる、可溶化混合物からの所望の組換えタンパク質の分離を意味し、この場合、不要な物質を清澄化材（例えば、フィルター）上に滞留させる。背景技術の節で述べたように、清澄化は、概して、組換えタンパク質及び封入体の可溶化混合物の遠心分離と、それに続く深層濾過、又は深層濾過と、それに続くタンジェンシャルフロー濾過、又はタンジェンシャルフロー濾過のみを含む。驚くことに、組換えタンパク質の清澄化は、１つ以上の深層フィルターで可溶化混合物を濾過することによって達成できることがわかった。従って、有利なことに、本方法は、清澄化の前に、組換えタンパク質及び封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを含まない。さらに、本方法は、深層濾過後のタンジェンシャルフロー濾過の使用も含まない。
いくつかの実施形態では、本方法は、清澄化前に、組換えタンパク質及び封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを明確に除外する。遠心分離ステップの除外は、開示する方法の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響することがわかっている。これらの基本的かつ新規の特徴として、限定するものではないが、以下に挙げるもののいずれかが含まれる：遠心分離に典型的に関連する時間の省除；遠心分離に典型的に関連するエネルギーコストの省除；遠心分離に典型的に関連する設備コストの省除；遠心分離に典型的に関連する工程の非効率性の省除。さらに、遠心分離ステップを除外することによって、遠心分離が利用可能でない場合、例えば、小規模な医薬品製造品質管理基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｖａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））精製所でのスケールアップが可能になる。
従って、好適な実施形態では、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製するための方法が提供され、この方法は、可溶化バッファーで、封入体と結合した組換えタンパク質を含む混合物を可溶化するステップ、１つ以上の深層フィルターで、可溶化した混合物から組換えタンパク質を清澄化するステップ、及び清澄化した組換えタンパク質を回収するステップからほぼ構成される。清澄化ステップの前に、遠心分離ステップを追加することは、こうした方法に対する実質的改変とみなされ、従って、前述したステップからほぼ構成される本方法から除外される。
さらに別の実施形態では、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製するための方法が提供され、この方法は、可溶化バッファーで、封入体と結合した組換えタンパク質を含む混合物を可溶化するステップ、１つ以上の深層フィルターで、可溶化した混合物から組換えタンパク質を清澄化するステップ、及び清澄化した組換えタンパク質を回収するステップから構成される。こうした実施形態において、前述したステップ以外の追加ステップは一切許容されない。
本明細書に記載の方法の清澄化から遠心分離を除外すると、遠心分離を用いた方法と少なくとも同じくらい高い量及び純度で、所望の組換えタンパク質が回収されたため、予想外の、驚くべき結果がもたらされたと同時に、前述した基本的かつ新規の特徴が得られた。遠心分離を除外し、深層濾過のみを用いて十分な清澄化が可能になることは予想されていなかった。
本明細書で用いる「深層濾過」とは、多孔性濾材を含むフィルターを用いた濾過を意味し、この濾材は、濾材の表面上だけではなく、濾材全体を通して粒子の滞留を可能にする。深層濾材及び濾過方法の例としては、本明細書に記載するものか、あるいは、当分野では公知のものがある。深層濾過の後、清澄化組換えタンパク質を回収する。
実施形態例では、本方法は、抗体又は抗体フラグメントである組換えタンパク質を精製するのに用いる。本明細書で用いる「（１つの）抗体」又は「（複数の）抗体」は、あらゆるタイプの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、さらにはそれらのフラグメント（すなわち、抗体の標的分子に特異的に結合することができる抗体のフラグメント、例えば、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）２フラグメント）、並びに組換え、ヒト化、ポリクローナル、及びモノクローナル抗体及び／又はそれらの結合フラグメントを指す。この抗体という用語はまた、遺伝子的に改変した形態、例えば、キメラ抗体（例：ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例：二重特異的抗体）、組換え一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、及びジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメントも含む。
概して、抗体は、重鎖及び軽鎖を有する。各重及び軽鎖は、定常領域と可変領域（領域は、「ドメイン」としても知られる）を含む。軽及び重鎖可変領域は、３つの超可変領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる）によって分断される「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は画定されている。様々な軽又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成している軽及び重鎖のフレームワーク領域の組合せは、３次元空間でＣＤＲを配置及び配列する役割を果たす。
ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープとの結合の原因となる。各鎖のＣＤＲは、一般に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から開始して順に番号付けられており、また、概して、特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。従って、ＶＨＣＤＲ３は、それが存在する抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬＣＤＲ１は、それが存在する抗体の軽鎖の可変ドメインに位置する。
「ＶＨ」又は「ＶＨ」と言うとき、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂがある。「ＶＬ」又は「ＶＬ」と言うとき、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂがある。
用語「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、伝統的二本鎖抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが結合して、一本鎖を形成している抗体を指す。典型的には、適正なフォールディング及び活性結合部位の形成を達成するために、リンカーペプチドを２本の鎖の間に挿入する。「リンカーペプチド」という用語は、抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）内のペプチドも指し、これは、重鎖の可変ドメインを軽鎖の可変ドメインと間接的に結合させる役割を果たす。
好適には、可溶化され、清澄化される混合物は、抗体フラグメント、例えば、封入体と結合した重鎖（ＶＨ）抗体フラグメント又は軽鎖（ＶＬ）抗体フラグメントを含む。別の実施形態では、混合物は、封入体と結合したＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントの両方を含んでいてもよい。ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントの両方が混合物中に存在する場合、ＶＨ抗体フラグメントとＶＬ抗体フラグメントの比は、最終抗体フラグメントの形成を最大にするように、適切に調節する。好適には、ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントは、約１：１〜約１：２０（ＶＨ：ＶＬ）、又は約２０：１〜約１：１、さらに好適には約１：１〜約１：１０、又は約１０：１〜約１：１、又は最も好適には約１：１の初期モル比で存在する。
実施形態例では、ＶＨ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントであり、ＶＬ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントである。好適には、抗体フラグメントは、‘０１２特許に開示されているような抗ＣＤ２２抗体フラグメントである。‘０１２特許に開示されている抗ＣＤ２２抗体フラグメントは、抗体ＲＦＢ４の配列を有する可変軽鎖と、抗体ＲＦＢ４の配列を有する可変重鎖とを有するが、ＶＨ鎖のＣＤＲ３の残基１００、１００Ａ及び１００Ｂ（Ｋａｂａｔ及びＷｕ番号付けシステムにより番号付けする）は、ＴＨＷ、ＹＮＷ、ＴＴＷ、及びＳＴＹから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。本明細書に記載するように、混合物中の抗ＣＤ２２抗体のＶＨ及びＶＬ部分の可溶化及び清澄化によって、後に、機能性及び活性抗ＣＤ２２抗体フラグメントへの再生が可能になる。
‘０１２特許に記載されているように、これら抗ＣＤ２２抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２抗体フラグメントによりターゲティングされる特定の細胞への送達のために、各種治療薬、例えば、細胞毒性薬と結合させることができる。「治療薬」という用語は、抗腫瘍薬、抗炎症薬、サイトカイン、抗感染薬、酵素活性剤又は阻害剤、アロステリック修飾因子、抗生物質又は患者において所望の治療効果を誘導するために投与されるその他の薬剤として作用する、現在公知の、若しくは後に開発される任意の数の化合物を含む。治療薬はまた、毒素又は放射性同位体であってもよく、その場合、意図される治療効果は、例えば、癌細胞の死滅である。毒素の例として、リシン、アブリン、ジフテリア毒素及びそのサブユニット、並びにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆがある。これら毒素例のいくつかは、市販のものが入手可能である（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）。
実施形態例では、毒素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）である。本明細書で用いる「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素」という用語は、完全長天然（天然に存在する）ＰＥ又は修飾されたＰＥを指す。こうした修飾としては、限定するものではないが、ドメインＩａの排除、ドメインＩｂ、ＩＩ及びＩＩＩでの様々なアミノ酸の欠失、単一アミノ酸置換並びにカルボキシル末端での１つ以上の配列の付加が挙げられる。
本明細書に記載するように、好適には、本方法は、組換えタンパク質の清澄化のために１つ以上の深層フィルターを使用する。実施形態例では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上等の深層フィルターで、組換えタンパク質を清澄化する。２つ以上の深層フィルターによる清澄化は、好適には、可溶化混合物を第１深層フィルターで濾過した後、第１深層フィルターからの組換えタンパク質を含む濾液を第２深層フィルター（必要に応じて、続いてさらなる深層フィルター）で濾過することによりさらに清澄化することを含む。
いくつかの実施形態では、清澄化は、セルロース繊維及び珪藻土を含む第１深層フィルターで可溶化混合物を濾過することを含む。また、深層フィルター用の別の濾材を用いてもよい。好適には、第１深層フィルターは、約０．１μｍ〜約１μｍのミクロン濾過度を有する。清澄化は、さらに第２深層フィルターによる清澄化を含む。これは、第１深層フィルターから得た濾液を第２深層フィルターで濾過するものである。好適には、第２深層フィルターは、セルロース繊維及び珪藻土を含む。深層フィルターに別の濾材を用いてもよい。好適には、第２深層フィルターは、約０．１μｍ未満のミクロン濾過度を有する。さらに別の深層フィルターを使用してもよく、その場合、第２深層フィルターから得た濾液を第３深層フィルターで濾過し、その後も同様に続ける。深層フィルターは、容易に入手可能であり、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（商標），Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ（ＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（商標））；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ（ＳＴＡＸ（商標））；３Ｍ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（ＣＵＮＯ（登録商標）），Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ（ＺＥＴＡ ＰＬＵＳ（商標））；及びＢＥＧＥＲＯＷ，Ｌａｎｇｅｎｌｏｎｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入することができる。
ＣＵＮＯ（登録商標）フィルターの例として、ＺＥＴＡ ＰＬＵＳ（商標）フィルター１０ＳＰ０５Ａ、３０ＳＰ１０Ａ、６０ＳＰ３０Ａ及び９０ＳＰ６０Ａがある。こうしたフィルターを用いて、約０．１Ｌ／分／ｆｔ２〜約０．５Ｌ／分／ｆｔ２（例えば、約０．２Ｌ／分／ｆｔ２）の流量を、約１５〜４０ポンド／ｉｎ２（ＰＳＩ）（例えば、約２５ＰＳＩ）の圧力及び約２〜１０Ｌ／ｆｔ２（例えば、約５Ｌ／ｆｔ２）の出力と共に、使用することができる。
好適な実施形態では、本方法は、２つの深層フィルター、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（商標）Ｃ０ＨＣ深層フィルターである第１深層フィルターと、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（商標）Ｘ０ＨＣ深層フィルターである第２深層フィルターを使用する。深層フィルターは、好適には、計量可能な濾過を実施するために、ＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（商標）Ｐｏｄ使い捨て深層フィルターシステムの一部として使用する。好適には、Ｃ０ＨＣ深層フィルターは、約７〜８ｍ２（例えば、７．７０ｍ２）の表面積を有し、Ｘ０ＨＣ深層フィルターは、約５〜６ｍ２（例えば、５．５０ｍ２）の表面積を有する。深層フィルターを通る流量及び流束は、当業者によって決定及び変更することができる。一般に、深層フィルターによる清澄化の場合の流量は、約５〜約２０Ｌ／分であり、さらに好適には、約６〜約１６／分である。深層フィルターを通過する流束は、一般に、Ｃ０ＨＣフィルターの場合、約４０〜約１５０Ｌ／ｍ２／時（ＬＭＨ）であり、Ｘ０ＨＣフィルターの場合、約６０〜約２００ＬＭＨであるが、これ以外の流量及び流束を用いることもできる。
本方法は、好適には、約５０％を超える、好適には約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、又は約９８％を超える清澄化組換えタンパク質の収率を提供する。タンパク質収率は、清澄化の前に存在する組換えタンパク質と比較して、清澄化から回収された組換えタンパク質の量を測定することにより計算する。
清澄化方法は、好適には、ＶＨ及びＶＬ抗体フラグメント、例えば、抗ＣＤ２２ＶＨ及びＶＬ抗体フラグメントの混合物を清澄化するステップを含む。別の実施形態では、ＶＨ及びＶＬフラグメントは、本明細書で述べるように、個別に（例えば、個別の可溶化の後）清澄化して、混合した後、再生に付すことができる。好適には、ＶＨ及びＶＬ抗体フラグメントは、再生まで精製工程全体を通じて別々に維持し、これによって、より高い収率の最終フォールディングした抗体フラグメントを取得することができる。
いくつかの実施形態では、本方法は、清澄化した組換えタンパク質を濃縮するステップと、タンパク質再生バッファーで、清澄化した組換えタンパク質を再生するステップをさらに含む。好適には、濃縮は、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ総タンパク質、好適には５ｍｇ／ｍＬ総タンパク質の濃度まで濃縮することを含む。
実施形態例では、清澄化した組換えタンパク質の再生は、タンパク質再生バッファーで、濃縮した清澄化組換えタンパク質を希釈することを含む。使用することができる好適なタンパク質再生バッファーは、当分野では公知であり、好適には、Ｔｒｉｓ、Ｌ−アルギニン、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）及びＥＤＴＡを含む。例えば、好適な再生バッファーは、ｐＨ８で約５０ｍＭ〜約２００ｍＭのＴｒｉｓ（例えば、約１００ｍＭ）、約１００ｍＭ〜約１ＭのＬ−アルギニン（例えば、約５００ｍＭ）、約５ｍＭ〜約１０ｍＭのＧＳＳＧ（例えば、約８ｍＭ）及び約０．５ｍＭ〜約４ｍＭのＥＤＴＡ（例えば、約２ｍＭ）を含んでよい。
別の好適なタンパク質再生バッファーは、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン、約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含み、約９〜１０のｐＨを有する。
タンパク質再生バッファーでの希釈後、希釈した清澄化組換えタンパク質を、約９〜約１０のｐＨ、約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間インキュベートする。次に、フォールディングした組換えタンパク質を回収する。約９〜約１０のｐＨを有する再生バッファーは、約８以下のｐＨを有するバッファーより多くの再生最終タンパク質を生産することがわかっている。
個別のＶＨ及びＶＬ部分を含む抗体フラグメントの場合、好適なタンパク質再生バッファー中にＶＨ及びＶＬ部分の両方を一緒に含む混合物を希釈することにより、ＶＨ及びＶＬ部分を、ＶＨ及びＶＬ部分の両方を含む機能性抗体フラグメントへと再生することができる。例えば、抗ＣＤ２２抗体フラグメントのＶＨ及びＶＬ部分を一緒に混合し、清澄化した後、再生することにより、完全に機能性の抗ＣＤ２２抗体フラグメントを形成することができる。あるいは、ＶＨ及びＶＬフラグメントを個別に清澄化した後、混合して、機能性抗体フラグメントに再生することにより、抗体フラグメントのさらなる修飾及び精製が可能になる。例えば、本明細書及び‘０１２特許（その開示内容は、参照として本明細書に組み込む）に記載されているように、抗ＣＤ２２抗体をさらに治療薬、例えば、細胞毒性薬と結合することもできる。
本明細書に記載するように、本方法は、好適には、組換えタンパク質を再生するステップを含む。従って、別の実施形態では、可溶化した組換えタンパク質、例えば、抗ＣＤ２２抗体フラグメントのような抗体フラグメントを再生するためのタンパク質再生バッファーが提供される。タンパク質再生バッファーは、好適には、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む。好適には、再生バッファーは、約９〜約１０のｐＨを有する。実施形態例では、タンパク質再生バッファーは、約３０ｍＭ〜約６０ｍＭのエタノールアミン；約８００ｍＭ〜約１．５Ｍのアルギニン；約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．７ｍＭ〜約１．２ｍＭのＧＳＳＧを含む。別の実施形態では、タンパク質再生バッファーは、約５０ｍＭのエタノールアミン；約１Ｍのアルギニン；約２ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．９ｍＭのＧＳＳＧを含む。好適には、再生バッファーは、約９．５のｐＨを有する。
驚くことに、再生バッファーは、組換えタンパク質のグルタチオン付加物、特に、抗ＣＤ２２抗体フラグメントのような抗体フラグメントのグルタチオン付加物を抑制又は排除することがわかった。好適には、再生バッファーは、最終再生抗体フラグメントが含む抗体フラグメントのグルタチオン付加物が約４０％を下回るように、抗体フラグメントなどの組換えタンパク質のグルタチオン付加物の存在を抑制する。さらに好適には、再生バッファーは、グルタチオン付加物を回収された組換えタンパク質（例えば、抗体フラグメント）の約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、又は約０．１％未満に低減する。
さらに別の実施形態では、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧからほぼ構成される再生バッファーが提供される。こうしたバッファーは、バッファーの基本的かつ新規の特徴（特に、組換えタンパク質のグルタチオン付加物を約３０％未満に低減するバッファーの能力）に実質的に影響する他の成分を含まない。さらにまた別の実施形態では、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧから構成され、従って、それ以外の成分を除外する（ただし、必要に応じて、希釈のための水は含みうる）再生バッファーが提供される。
別の実施形態では、可溶化した組換えタンパク質を再生する方法が提供される。こうした方法は、好適には、可溶化した組換えタンパク質を濃縮するステップと、濃縮した組換えタンパク質を再生バッファーで希釈するステップを含む。本明細書に記載するように、好適には、再生バッファーは、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む。
希釈した組換えタンパク質を、約９〜約１０のｐＨ、約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間インキュベートする。次に、再生した組換えタンパク質を回収する。
本明細書に記載するように、好適には、可溶化した組換えタンパク質は、組換え抗体又は組換え抗体フラグメントを含む。実施形態例では、組換え抗体フラグメントは、組換えＶＨ抗体フラグメント及び組換えＶＬ抗体フラグメント、例えば、組換え抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメント及び組換え抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントを含む。好適には、再生前に、ＶＨ及びＶＬフラグメントを混合する。
本明細書に記載する再生バッファーの使用によって、好適には、回収された再生組換えタンパク質の約３０％未満が、組換えタンパク質のグルタチオン付加物であるように、回収された組換えタンパク質のグルタチオン付加物を低減する。さらに好適には、回収された再生組換えタンパク質の約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、又は約０．１％未満が、組換えタンパク質のグルタチオン付加物である。
別の実施形態では、ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを含む組換え抗体フラグメントを生産する方法が提供される。本方法は、好適には、第１細菌細胞においてＶＨ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップと、第２細菌細胞においてＶＬ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。別の実施形態では、ＶＨ及びＶＬフラグメントを同じ細菌細胞で生産することができる。あるいは、ＶＨ及びＶＬフラグメントは、異なる細胞型（例えば、哺乳動物又は細菌）において生産することもできるし、細菌細胞以外の細胞において一緒に生産することもできる。
本明細書に記載するように、組換えタンパク質を生産する方法は、当分野では公知であり、好適には、様々なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞において発現させるステップを含む。本明細書で用いるように、細菌細胞には、組換えタンパク質の生産に使用することができるあらゆる細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを混合して、混合物を調製するが、混合物は、封入体をさらに含む。ＶＨ及びＶＬを同じ細胞において生産する実施形態では、これらを一緒に混合する必要はない。本明細書に記載されているように、細菌細胞を用いた組換えタンパク質の生産によって、封入体と結合した所望のタンパク質が得られる。所望のタンパク質を封入体から清澄化した後、さらにフォールディング及び精製に付すのが好適である。
封入体と結合したＶＨ抗体フラグメント、ＶＬ抗体フラグメントを含む混合物を可溶化バッファーで可溶化する。本方法で用いる可溶化バッファーの例は、本明細書に記載されており、好適には、エタノールアミン、アルギニン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥ、例えば、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約５Ｍ〜約１０Ｍの尿素及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＤＴＥを含む。可溶化バッファーは、約１０〜約１１のｐＨ、例えば、ｐＨ約１０．５を有するのが好適である。
１つ以上の深層フィルターを用いて、可溶化した混合物からＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを清澄化する。本明細書に記載するように、本方法は、ＶＨ抗体フラグメント、ＶＬ抗体フラグメント及び封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを含まない。本明細書に記載するように、遠心分離ステップの除外は、本方法の新規かつ基本的特徴に実質的に影響する。
清澄化したＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを回収した後、濃縮する。濃縮した清澄化ＶＨ抗体フラグメント及び濃縮した清澄化ＶＬ抗体フラグメントを再生バッファーで希釈する。本明細書に記載するように、好適な実施形態では、再生バッファーは、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含み、約９〜１０、好適には約９．５のｐＨを有する。
希釈した清澄化ＶＨ抗体フラグメント及び希釈した清澄化ＶＬ抗体フラグメントを、約９〜約１０のｐＨ及び約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間インキュベートする。これによって、ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを十分に機能性かつ活性の抗体フラグメントに再生することができる。次に、例えば、必要に応じて、抗体フラグメントを回収及び保存する当分野では公知の方法で、抗体フラグメントを回収する。
本明細書に記載するように、好適には、ＶＨ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントであり、ＶＬ抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントであり、組換え抗体フラグメントは、抗ＣＤ２２抗体フラグメント、例えば、‘０１２特許に開示されているものである。本明細書に記載するように、これらの抗体フラグメントは、治療薬又は毒性剤とさらに結合することもできる。
ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントは、好適には、２つ以上の深層フィルター、実施形態例では２つの深層フィルターで清澄化する。本明細書に記載するように、深層フィルターを用いた清澄化の前に遠心分離は使用しない。
いくつかの実施形態では、清澄化で用いられる第１深層フィルターは、セルロース繊維と珪藻土を含み、約０．１μｍ〜約１μｍのミクロン濾過度を有する（例えば、Ｃ０ＨＣ深層フィルター）。本方法は、好適には、第２深層フィルターで、ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを清澄化するステップをさらに含み、第２深層フィルターは、セルロース繊維と珪藻土を含み、約０．１μｍ未満のミクロン濾過度を有する（例えば、Ｘ０ＨＣ深層フィルター）。
本明細書に記載するように、遠心分離ステップの除外は、開示する方法の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響することがわかっている。従って、いくつかの実施形態では、前述したステップからほぼ構成される、又は、別の実施形態では、前述のステップから構成され、特に、深層濾過による清澄化の前に遠心分離ステップを含まない方法が提供される。
本明細書に記載する方法は、大きな製造能力に合わせて容易にスケーリングすることができる。例えば、本方法は、約１００Ｌ〜約２０，０００Ｌ、好適には、約１００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１，０００Ｌ、例えば、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ又は約１，０００Ｌの容量の使用に合わせて容易にスケーリングすることができる。
本明細書に記載する本方法及び適用に対するその他の変更及び改変を、どの実施形態の範囲からも逸脱することなく、実施可能であることは、当業者には容易に明らかであろう。以下に示す実施例は、説明の目的のためだけに本明細書に含まれるものであり、限定する意図はない。
実施例１：抗ＣＤ２２抗体フラグメントの精製
可溶化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えクローニング方法により、抗ＣＤ２２抗体フラグメントのＶＨ及びＶＬ部分を生産した。所望の再生量を決定したら、再生量１ｋｇにつき０．５６ｇのＶＨ及び０．１２８ｇのＶＬが反応するように、封入体を混合した。ＶＬ１ｇにつき４．３７５ｇのＶＨの添加は、１：１モル比に相当する。例えば、１０ｋｇの再生には、５．６ｇのＶＨと１．２８ｇのＶＬが必要である。封入体は純度６５％であり、グラム当たり０．１６５８２ｇのタンパク質を含むことから、５．６ｇのＶＨの添加は、１８１．６０ｇのＶＨ溶液の添加によって達成される。同様に、１．２８ｇのＶＬの添加は、１２５．４４ｇのＶＬ溶液の添加によって達成される。次に、固形分がそれぞれ２６．９１％及び２０％のＶＨ及びＶＬの混合物をＴＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で希釈することにより、固形分１５％の混合物を形成した。１５％封入体混合物を各々５容量の可溶化バッファー（５０ｍＭのエタノールアミン、０．５Ｍのアルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、８Ｍの尿素、及び１０ｍＭのＤＴＥ）で可溶化した。各可溶化反応により、４０．５〜４９．１７μｇ／ｍＬの範囲の再生値が得られた。封入体混合物は、複数のロット及び様々なスケールで、同様の条件下で可溶化している。以下の表１は、使用した可溶化条件の概要を示す。
Figure 2013540157
表２は、封入体混合物の２つのロットについての可溶化条件の概要を示す。ＶＨ及びＶＬの量は、反応物中の総量及び総タンパク質が両ロットで等しくなるように、半分に減らした。従って、所望する再生物１ｋｇにつき、０．２８ｇのＶＨと０．０６４ｇのＶＬを混合して、可溶化した。表２の５ｋｇの再生反応物を表１の５ｋｇ反応物と比較すると、可溶化反応物中のＶＨ及びＶＬの量は半分であるが、各可溶化物質の総量は類似しており、２９５８．２１ｇに対して２０７０．２０ｇであることがわかる。いずれの反応物も同様の総タンパク質レベルを含み、同じ膜面積の深層フィルターによって清澄化して、同じ量で再生した。これらの下流単位操作に対する影響は最小限であるが、再生収率は異なっていた。可溶化反応物中のＶＨ（再生物１ｋｇ当たり０．５６ｇから０．２８ｇへ）及びＶＬ（再生物１ｋｇ当たり０．１２８ｇから０．０６４ｇへ）の濃度低下によって、再生物中に形成された抗ＣＤ２２抗体フラグメントの濃度が、４９．１７μｇ／ｍＬから２９μｇ／ｍＬへと低下した。収率の低下は、ラージスケール可溶化反応物中でもみとめられた。可溶化反応物に半分の量のＶＨ及びＶＬを添加することにより、再生反応物中に形成された抗ＣＤ２２抗体フラグメントの量が半分になった。従って、２倍の量の再生及び精製を実施する必要がある。
Figure 2013540157
清澄化
比較の目的で、遠心分離の後深層濾過を用いた清澄化を実施した。可溶化封入体を１２９ｍＬ／分でディスクスタック遠心分離機に供給し、３０ｐｓｉの圧力下、９４７０ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離液はまだ濁っており、さらなる清澄化を要した。遠心分離液を、２８Ｌ／ｍ２の容量を有するＢＥＧＥＲＯＷ ＰＲ Ｓｔｅｒｉｌ Ｓ１００フィルター（ＢＥＧＥＲＯＷ、Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｓ００１Ｐ）で深層濾過した。遠心分離と深層濾過の組合せによって、濁度が２ｎｔｕの物質が得られた。表３に清澄化のパラメーターの概要を示す。重鎖及び軽鎖含有封入体のロットを混合し、可溶化した後、遠心分離に続き深層濾過を用いて清澄化した。清澄化した物質は、反応物中で好適に再生し、４０．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２２抗体フラグメントを生産した。
Figure 2013540157
また、ＴＦＦ膜も清澄化について評価した。０．１μｍ及び１０００ＫＤａ膜の能力は低すぎて、製造工程の予想した１５０Ｌ量を処理できなかった。従って、０．１μｍ膜による清澄化からのＶＨ及びＶＬ回収は、遠心分離と深層濾過の組合せと同等（それぞれ、７６．３４％及び８０．５７％）であったが、ＴＦＦは許容可能とみなされなかった。
抗ＣＤ２２抗体フラグメントはまた、深層濾過のみを用いて（深層濾過による清澄化の前に遠心分離ステップを含まない）、さらに比較の目的でタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を用いて、清澄化した。前述したように、封入体（ＶＨ及びＶＬロット）を混合し、可溶化した。次に、表４に示す膜を用いて、可溶化封入体を清澄化した。初めに、可溶化した物質をＣ０ＨＣ深層フィルターで濾過した。深層フィルターを物質が通過すると、濁度が６８．５ｎｔｕに低下した。この濾液を、より密なＡ１ＨＣ及びＸ０ＨＣフィルターでさらに清澄化した。Ａ１ＨＣ深層フィルターでは圧力が急速に上昇して、２．９Ｌ／ｍ２という許容不可能な容量に達した。Ｘ０ＨＣフィルターによるＣ０ＨＣ濾液の濾過の際には、容量１２９．５Ｌ／ｍ２が記録され、急激な圧力上昇はみられなかった。Ｃ０ＨＣ及びＸ０ＨＣフィルターは、優れた処理量を示し、物質の濁度も良好であった。ＶＨ及びＶＬ回収は、それぞれ７４，８２％及び６８．６３％であった。
Figure 2013540157
Ｃ０ＨＣ及びＸ０ＨＣフィルターを含む深層濾過系列をさらに評価して、この工程が有効にスケーリングするか否かを決定した。表５に、ベンチスケール及びスケールアップ試験において使用し、記録したパラメーターの概要を示す。封入体混合物を１：１モル比で混合し、固形分１５％に希釈した後、可溶化した。可溶化した物質をＣ０ＨＣ及びＸ０ＨＣ深層フィルター系列によって清澄化した。ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を用いて、ＶＨ及びＶＬの収率を定量した。濾過操作によるＶＨ及びＶＬ回収は、それぞれ、７８．６〜８３．３％及び６３．９〜７９．８％の範囲であった。物質の濁度は、２．１〜２．２ｎｔｕの範囲であった。再生反応中に形成された抗ＣＤ２２抗体フラグメントの収率は、３７．８〜６８．１μｇ／ｍＬの範囲であった。重鎖及び軽鎖の一貫した回収、並びに各スケールでの濁度及び回収率から、Ｃ０ＨＣ−Ｘ０ＨＣ深層フィルター系列は、遠心分離／深層濾過手順より優れていることがわかった。
Figure 2013540157
以下の表６及び７に、抗ＣＤ２２抗体フラグメントの清澄化に用いられる２つの深層フィルターについての好適な操作パラメーターの概要を示す。
Figure 2013540157
Figure 2013540157
再生
比較例として、５ＫＤａ膜を用いたタンジェンシャルフロー濾過により清澄化した抗ＣＤ２２抗体フラグメント物質を５ｍｇ／ｍＬの総タンパク質まで濃縮することにより、再生を実施した。濃縮した物質を、ｐＨ９．５の５０ｍＭのエタノールアミン、１．０Ｍのアルギニン、２ｍＭのＥＤＴＡ、９．１ｍＭのＧＳＳＧ、及び０．９１ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）で１０倍希釈した。２〜８℃で７２時間にわたり穏やかに混合しながら、反応を進行させた。図１Ａ（条件１）に示すように、逆相高性能液体クロマトグラフィー質量分光法（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）による再生サンプルの分析から、反応によって、３０〜４０％のグルタチオン付加物を含む物質が終始一貫して生産されることがわかった。
比較のために、グルタチオン付加物の形成を抑制又は防止するために以下の方法を用いた。ＧＳＨ及びＧＳＳＧのレベルの変更によって、再生効率を維持しながら、グルタチオン付加物のレベルが低下するか否かを決定するために実験を実施した。表８は、０．２５ｋｇ再生スケールで試験した再生条件を示す。使用直前に、ＧＳＨ及びＧＳＳＧをｐＨ９．５の５０ｍＭのエタノールアミン、１．０ｍＭのアルギニン、及び２ｍＭのＥＤＴＡに添加した。条件１は、前述した比較例を表す。その他の条件は、好適な再生にＧＳＨが必要か否かを決定し、ＧＳＳＧの最小最適レベルをみいだすために選択した。
Figure 2013540157
ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳデータは、予想通り、条件１の対照生成物にグルタチオン付加物が存在することを示した（図１Ａ参照）。グルタチオン付加物を含む抗ＣＤ２２抗体は、条件２でも生産された（図１Ｂ参照）。条件１及び２のいずれでも、濃度及びグルタチオン付加物の割合が同じ物質が生産された。図１Ｃに示す条件３の結果は、条件１及び２と同じ濃度を有する抗ＣＤ２２抗体再生生成物が形成されたが、グルタチオン付加物を含有する抗ＣＤ２２は検出されなかったことを示している。条件４では抗ＣＤ２２は生産されなかった（図１Ｄ参照）。これらの結果は、抗ＣＤ２２の再生に、ＧＳＳＧは必要だが、ＧＳＨは必要ではないことを示している。さらに、反応物中のグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）の最適レベルを１０倍減少することができ、抗体フラグメントの収率に影響を及ぼすことなく、含有するグルタチオン付加物が低減した抗ＣＤ２２抗体がもたらされる。
再生バッファーにおけるインキュベーションの開始後の３つの時点で、前述の条件３を用いて、抗ＣＤ２２抗体フラグメントの再生を示すさらに別の結果（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ）を図２Ａ（時間＝０）、図２Ｂ（時間＝２０時間）及び図２Ｂ（時間＝９０時間）に示す。図３Ａ及び図３Ｂは、さらなる精製後の再生抗ＣＤ２２フラグメントを示す。
グルタチオン付加物含有抗ＣＤ２２が、異なるスケール又は異なるロットの封入体混合物で形成されないことを確認するために、条件３を用いた再生実験を、異なるロットの重鎖及び軽鎖を用いて、５ｋＧ及び１００ｋｇスケールで実施した。図４Ａ〜４Ｄ及び５Ａ〜５Ｄは、様々な時点での５ｋｇ及び１００ｋｇ再生反応物のＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析をそれぞれ示す。５ｋｇの再生について、時間＝０、１５時間、２４時間及び３９時間でのデータを図４Ａ〜４Ｄに示す。１００ｋｇの再生については、時間＝０、２４時間、４８時間及び７０時間でのデータを図５Ａ〜５Ｄに示す。データは、グルタチオン付加物が生成物中に検出されなかったこと、また、スケールアップした反応物では高濃度の抗ＣＤ２２が形成された（１００ｋｇ再生の場合、５４．８μｇ／ｍＬ）ことを示している。データは、ＧＳＨの排除及びＧＳＳＧの１０倍減少によって、グルタチオン付加物のない抗ＣＤ２２が形成されたことを示している。この条件を用いた再生によって、封入体のスケール又はロットとは無関係に同等の濃度の物質が生産された。
図６は、１００Ｌスケールの反応物における抗ＣＤ２２抗体フラグメントの存在を証明するウエスタンブロットを示す。７２時間にわたって再生を実施したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づき２．３グラムの抗ＣＤ２２抗体が得られた。これは、１０００Ｌの反応物の場合、約２３グラムの潜在的収率を意味する。表７は、ウエスタンブロットで呈示されたレーンの内容物を示す。
Figure 2013540157
本明細書においていくつかの実施形態を例示し、説明してきたが、請求の範囲が、説明及び表示した製品の具体的形状又は構成に限定されるわけではないことは理解すべきである。本明細書では、例示的実施形態を開示しており、また、特定の用語を用いているが、これらは一般的かつ説明の意味で用いているにすぎず、限定を目的とするものではない。実施形態の変更及び変形は、以上の教示内容に照らして可能である。従って、具体的に説明した以外の様式で実施形態を実施してもよいことは理解すべきである。

Claims (32)

  1. 組換えタンパク質及び封入体を含む混合物から組換えタンパク質を精製する方法であって、
    ａ）可溶化バッファーで、封入体と結合した組換えタンパク質を含む混合物を可溶化するステップと、
    ｂ）１つ以上の深層フィルターで可溶化混合物から組換えタンパク質を清澄化するステップと、
    ｃ）清澄化組換えタンパク質を回収するステップと
    を含み、清澄化の前に、組換えタンパク質及び封入体を含む混合物を遠心分離するステップを含まない、上記方法。
  2. 前記組換えタンパク質が、抗体又は抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗体フラグメントが、重鎖（ＶＨ）抗体フラグメントである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記抗体フラグメントが、軽鎖（ＶＬ）抗体フラグメントである、請求項２に記載の方法。
  5. 前記組換えタンパク質が、ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントの両方を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記ＶＨ抗体フラグメントが、抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントである、請求項３に記載の方法。
  7. 前記ＶＬ抗体フラグメントが、抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントである、請求項４に記載の方法。
  8. 前記ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントが、約１：１の初期モル比で存在する、請求項５に記載の方法。
  9. 前記可溶化バッファーが、エタノールアミン、アルギニン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥを含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記可溶化バッファーが、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約５Ｍ〜約１０Ｍの尿素及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＤＴＥを含み、前記可溶化バッファーが、約１０〜約１１のｐＨを有する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記組換えタンパク質を２つ以上の深層フィルターで清澄化する、請求項１に記載の方法。
  12. 第１深層フィルターは、セルロース繊維及び珪藻土を含み、前記第１深層フィルターが、約０．１μｍ〜約１μｍのミクロン濾過度を有する、請求項１１に記載の方法。
  13. 第２深層フィルターで清澄化するステップをさらに含み、前記第２深層フィルターが、セルロース繊維及び珪藻土を含み、前記第２深層フィルターが、約０．１μｍ未満のミクロン濾過度を有する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記第１深層フィルターが、Ｃ０ＨＣ深層フィルターであり、前記第２深層フィルターが、Ｘ０ＨＣ深層フィルターである、請求項１３に記載の方法。
  15. 清澄化組換えタンパク質収率が、約７０％を超える、請求項１に記載の方法。
  16. ｄ）清澄化した組換えタンパク質を濃縮して、清澄化した組換えタンパク質をタンパク質再生バッファーで再生するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記再生ステップが、
    ａ）濃縮した清澄化組換えタンパク質を、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む再生バッファーで希釈するステップと、
    ｂ）希釈した清澄化組換えタンパク質を、約９〜約１０のｐＨ、及び約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間にわたりインキュベートするステップと、
    ｃ）組換えタンパク質を回収するステップと
    を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 可溶化した組換えタンパク質を再生するためのタンパク質再生バッファーであって、
    約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含み、
    約９〜約１０のｐＨを有する、上記タンパク質再生バッファー。
  19. 約５０ｍＭのエタノールアミン；約１Ｍのアルギニン；約２ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．９ｍＭのＧＳＳＧを含む、請求項１８に記載のタンパク質再生バッファー。
  20. ａ）可溶化した組換えタンパク質を濃縮するステップと、
    ｂ）濃縮した組換えタンパク質を、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約５００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む再生バッファーで希釈するステップと、
    ｃ）希釈した組換えタンパク質を、約９〜約１０のｐＨ及び約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間にわたりインキュベートするステップと、
    ｄ）再生した組換えタンパク質を回収するステップと
    を含む、可溶化組換えタンパク質を再生する方法。
  21. 可溶化した組換えタンパク質が、組換え抗体又は組換え抗体フラグメントを含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 組換え抗体フラグメントが、組換えＶＨ抗体フラグメント及び組換えＶＬ抗体フラグメントを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記組換えＶＨ抗体フラグメントが、組換え抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントを含み、前記組換えＶＬ抗体フラグメントが、組換え抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 回収された再生組換えタンパク質の約１０％未満が、組換えタンパク質のグルタチオン付加物である、請求項２０に記載の方法。
  25. ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを含む組換え抗体フラグメントを生産する方法であって、
    ａ）ＶＨ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを第１細菌細胞において発現させるステップと、
    ｂ）ＶＬ抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドを第２細菌細胞において発現させるステップと、
    ｃ）ＶＨ抗体フラグメントとＶＬ抗体フラグメントを混合して混合物を調製するステップであって、前記混合物はさらに封入体を含む、ステップと、
    ｄ）可溶化バッファーで、ＶＨ抗体フラグメント、ＶＬ抗体フラグメント、及び結合封入体を含む混合物を可溶化するステップと、
    ｅ）１つ以上の深層フィルターで、可溶化した混合物からＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを清澄化するステップと
    ｆ）清澄化したＶＨ抗体フラグメント及び清澄化したＶＬ抗体フラグメントを回収するステップであって、
    ここで、前記方法は、ＶＨ抗体フラグメント、ＶＬ抗体フラグメント、及び封入体の可溶化混合物を遠心分離するステップを含まない、ステップと、
    ｇ）清澄化したＶＨ抗体フラグメント及び清澄化したＶＬ抗体フラグメントを濃縮するステップと、
    ｈ）濃縮した清澄化ＶＨ抗体フラグメント及び濃縮した清澄化ＶＬ抗体フラグメントを、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン；約０．５Ｍ〜約２Ｍのアルギニン；約０．５ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ；及び約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭのＧＳＳＧを含む再生バッファーで希釈するステップと、
    ｉ）希釈した清澄化ＶＨ抗体フラグメント及び清澄化ＶＬ抗体フラグメントを、約９〜約１０のｐＨ及び約２℃〜約１５℃の温度で、約４８時間〜約９６時間にわたりインキュベートするステップと、
    ｊ）組換え抗体フラグメントを回収するステップと
    を含む、上記方法。
  26. 前記ＶＨ抗体フラグメントが、抗ＣＤ２２ＶＨ抗体フラグメントであり、前記ＶＬ抗体フラグメントが、抗ＣＤ２２ＶＬ抗体フラグメントであり、前記組換え抗体が、抗ＣＤ２２抗体フラグメントである、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記可溶化バッファーが、エタノールアミン、アルギニン、ＥＤＴＡ、尿素及びＤＴＥを含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記可溶化バッファーが、約２０ｍＭ〜約７０ｍＭのエタノールアミン、約２００ｍＭ〜約２Ｍのアルギニン、約１ｍＭ〜約３ｍＭのＥＤＴＡ、約５Ｍ〜約１０Ｍ尿素及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＤＴＥを含み、前記可溶化バッファーが、約１０〜約１１のｐＨを有する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを２つ以上の深層フィルターで清澄化する、請求項２５に記載の方法。
  30. 第１深層フィルターは、セルロース繊維及び珪藻土を含み、前記第１深層フィルターが、約０．１μｍ〜約１μｍのミクロン濾過度を有する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＶＨ抗体フラグメント及びＶＬ抗体フラグメントを第２深層フィルターで清澄化するステップをさらに含み、前記第２深層フィルターが、セルロース繊維及び珪藻土を含み、前記第２深層フィルターが、約０．１μｍ未満のミクロン濾過度を有する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記第１深層フィルターが、Ｃ０ＨＣ深層フィルターであり、前記第２深層フィルターが、Ｘ０ＨＣ深層フィルターである、請求項３１に記載の方法。
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