JP2013521258A - 抗体の選択的強化 - Google Patents
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンまたはFcドメインを有する他のタンパク質のための精製プロセスに関する。
生体分子、例えばタンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などは、医薬として、診断剤として、食品、洗浄剤などにおける添加剤として、研究試薬として、および多くの他の適用のために次第に商業的重要性を増している。このような生体分子の需要は、もはや通常では対応できず、例えばタンパク質の場合、天然源から分子を単離することによっては対応できず、バイオテクノロジーによる産生法の使用を必要とする。
本発明は、2つの結合部位を有する結合タンパク質を使用したアフィニティ沈降に関し、これは、追加の融合タンパク質またはリンカー分子を完全に省略する。アフィニティタンパク質はそのままで沈降するのに十分であり、そして固定相の必要が全くない。ここに使用した本発明はまた、アフィニティタンパク質を回収することも容易にする。
a.ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程;
b.結合が起こることを可能とする条件下で、正確に2つの結合部位を有するFc結合タンパク質を取り込む工程;
c.液相から沈降物を分離する工程;
d.Fc結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程
を含む、免疫グロブリンまたはFcドメインを含む他のタンパク質(ターゲットタンパク質)の選択的濃縮のためのプロセスに関する。
本発明は、細胞培養液(タンパク質が組換え発現または内因的に発現されている)から得られるようなタンパク質組成物から、不純物、特に宿主細胞のタンパク質(HCP)およびDNAを枯渇させる方法に関する。特に、本発明は、少なくとも2つの結合部位を有するFc結合タンパク質またはそのマルチマーと結合させることによって、タンパク質(ターゲットタンパク質)を精製または濃縮する方法に関する。さらなる工程において沈降物を分離し、そしてその後、ターゲットタンパク質へのFc結合タンパク質の結合を適切な条件を使用して除去する。
a.ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程;
b.結合が起こることを可能とする条件下で、正確に2つの結合部位を有するFc結合タンパク質を取り込む工程;
c.液相から沈降物を分離する工程;
d.Fc結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程
を含む、免疫グロブリンまたはFcドメインを含む他のタンパク質(ターゲットタンパク質)の選択的濃縮のためのプロセスに関する。
装置および方法:
ダイマー化したプロテインZの調製
プロテインZは、E.coliから組換えタンパク質として得られた。不純物の除去は、細胞片の分離後にイオン交換クロマトグラフィーによって行なった。
分泌産生に最適化されたCHO細胞の細胞培養上清は、数日間の培養後に濾過または遠心分離によって得られた。
実験1の試料のタンパク質不純物および抗体含量の分析を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって実施した。TSK−GEL SW3000を製造業者(TOSOH Bioscience)によって推奨されたプレカラムと共に使用した。分析を、Dionex Ultimate装置で、280および220nmにおけるUVシグナルのモニタリングをしながら行なった。
イオン交換クロマトグラフィーを、AKTA Explorer 10装置(GE Healthcare)で、220および280nmにおけるUV吸収を観察しながら行なった。使用したカラム材料はSPセファロースFF(19mLのゲルベッド体積)であった。酸性pHで再懸濁したペレットを適用した後、カラムをpH3.3の20mMリン酸緩衝液を用いて平衡化し、そしてその後、抗体およびZダイマーを互いに25カラム容量長の勾配にかけて分離した。pH3.3の3M NaClを含む20mMリン酸緩衝液を溶出のために使用した。
WatersまたはDionex装置(インジェクターポンプおよびカラムオーブンW2790/5、UV検出器W2489)でのプロテインA HPLCを使用して、細胞培養液を含まない上清および精製抗体の抗体含量を決定した。溶液の抗体含量を、酸性で溶出するピークのUVシグナルを使用して決定した。
試験で得られた溶液を、分析法(Amicon Ultra、排除サイズ3kD)のために一部濃縮した。
20%の均一なSDSゲルを使用して、個々の画分および上清を試験した。タンパク質バンドを、Heukeshovenによる銀染色によって検出した。
実験3において宿主細胞タンパク質の分析をELISAアッセイを使用して行なった。
DNA分析を、1本鎖産生後に、酵素的に触媒される検出反応によって行なった。
表面積180cm2を有するMessrs Pallによって製造された50kDaのCentramateシートPES(ポリエーテルスルホン)を、実験3でのUF/DF試験に使用した。UF/DFを実施して、抗体を6倍に最初に濃縮し、そしてその後、ダイアフィルトレーションし(6容量の緩衝液と交換)、その後、保持液バルブを完全に開けたまま10分間循環した。ダイアフィルトレーションを2回繰り返した。全UF/DFを、50mM酢酸緩衝液+100mMアルギニン+150mM NaCl(pH3.0)を用いて行なった。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(実験3)をAKTA装置で27mLのカラムを用いて行なった。使用したカラム材料は東ソーによって製造されたトヨパールフェニル650Mであった。この目的のために、UF/DF後に、165mS/cmの伝導率が得られるまで、3.5M硫酸アンモニウム緩衝液を保持液に加えた。緩衝液(50mMアセテートおよび1.2M硫酸アンモニウムpH4)を用いて平衡化したカラムにUF/DFからの保持液をチャージし、そしてその後、50mM酢酸緩衝液(pH4)までの勾配を40倍のベッド体積にかけて流した。
システインによるプロテインZのダイマー化の検出
システインによるプロテインZのダイマー化の検出をSDS−PAGE分析によって行なった(図1)。後処理がプロテインZの酸化を全く誘導しないことを確実にするために、まず始めに遊離システイン基をヨードアセトアミドを用いてアルキル化した。モノマーを検出するために、ジチオスレイトール(DTT)を用いてさらに還元を行なった。2.6nmolのZダイマーをDTTまたは対応する容量の緩衝液と混合し、そして95℃で5分間インキュベーションした。その後、混合物を周囲温度まで冷却し、そしてヨードアセトアミドまたは対応する容量の緩衝液を加え、そして混合物を暗闇でさらに20分間インキュベーションした。SDS−PAGE緩衝液と共に5分間インキュベーションした後、調製物をSDS−PAGEに適用した。SDS−PAGE分析は、Zモノマーが還元剤DTTの添加によって形成され、そしてZダイマーのゲルバンドが消失することを示す。
以下に記載した試験は、抗体の選択的沈降をZダイマーを用いて達成することができることを示す(図2、実験1)。Zダイマーは、2つの非天然のシステインを介して連結した黄色ブドウ球菌に由来するプロテインAのダイマー化したBドメインであり、これは野生型と比較して突然変異を有する(装置および方法を参照)。さらに、実験2は、得られたペレットを酸性pH範囲での再懸濁によって溶液に戻すことができ、そしてその後、酸性pHでのイオン交換クロマトグラフィーによってZダイマーから再度抗体を取り出すことができることを実証する。
無細胞の真核生物培養上清中に存在するプロテインZと抗体の種々の比を試験した。さらに、個々のバッチの容量を変化させた。試験1では、0.13μmolのZダイマーを、振とうしながら、無細胞真核生物培養上清に含まれる0.065μmolのIgG4と共に、全容量5.47mL中で2時間かけてインキュベーションした。試験2では、16.25nmolのZダイマーを、振とうしながら、無細胞真核生物培養上清に含まれる16.25nmolのIgG1と共に、全容量5.2mL中でここでも2時間かけてインキュベーションした。その後、混合物を4000rpmで10分間かけて遠心分離し、そして上清をペレットから分離した。上清の抗体含量は、分析用SECのUVシグナルによっておよびプロテインAクロマトグラフィーによって決定した(装置および方法)。ペレット中の抗体の含量は、使用した抗体の全含量から上清の抗体含量を差し引くことによって決定した。99%までの抗体の沈降が観察された(試験1:99%/試験2:76%)。さらに、培養上清を、分析用SECによる沈降の前後にタンパク質不純物について調べた。無細胞真核生物培養上清からのクロマトグラムを、直接、沈降後の上清と比較した。90〜99%の範囲のタンパク質不純物の欠失が観察された(試験1 90%/試験2 99%)。これは、タンパク質不純物の1%または10%が共沈降したことを意味する。ここでのタンパク質不純物は、宿主細胞タンパク質およびフラグメントの両方またはターゲットタンパク質の凝集体であり得る。
陽イオン交換体(SPセファロースFF)を使用して抗体からZダイマーを分離した。0.2μmolの精製抗体を、10.1mLの容量中で0.2μmolのZダイマーと共に36分間かけてインキュベーションした。その後の遠心分離(4000rpm、10分間)後に、上清を除去した。その後、ペレットをバッチ毎に10mLリン酸緩衝液(pH7.4)に溶解し、そして再度遠心分離した(4000rpm、10分間)。このようにして得られたペレットを20mLリン酸緩衝液(20mMリン酸、pH3.3)に再懸濁し、そしてイオン交換体を使用して精製した。Zダイマーは、25ベッド体積におよぶ勾配を通して抗体から分離され得る(図3および4)。
多段階抗体精製プロセスは、捕獲工程としてアフィニティ沈降を用いて行なわれた。
無細胞培養上清からの沈降において、500mgの抗体(3.3μmol)がZダイマー(6.6μmol)に対して1:2の比率で使用された。穏やかに撹拌しながら1時間インキュベーションした後、全懸濁液を0.22μmフィルター(Millipore)に加え、そしてこのようにして沈降物の上清を濾過によって分離した。その後、沈降物を緩衝液(231mLの50mMリン酸緩衝液、pH7.4)で洗浄し、そして次の工程でフィルター中に酢酸緩衝液(179mLの50mM酢酸緩衝液+100mMアルギニン+150mM NaCl pH3.0)と共に再懸濁した。抗体からZダイマーを分離するために、UF/DFを50kDaのメンブレンを用いて実施した。次の工程は、Zダイマーおよびさらに不純物を分離するためのHICであった。
Claims (10)
- 以下の工程:
a.ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程;
b.結合が起こることを可能とする条件下で、正確に2つの結合部位を有するFc結合タンパク質を取り込む工程;
c.液相から沈降物を分離する工程;
d.Fc結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程
を含む、免疫グロブリンまたはFcドメインを含む他のタンパク質(ターゲットタンパク質)の選択的濃縮のためのプロセス。 - Fc結合タンパク質が、プロテインAまたはプロテインGのFc結合ドメインのダイマーであることを特徴とする、請求項1記載のプロセス。
- Fc結合ドメインが、配列番号1から配列番号11の配列の1つを含むまたは含有することを特徴とする、請求項2記載のプロセス。
- ダイマーの2つのモノマーが、ジスルフィド橋によって一緒に連結されていることを特徴とする、請求項2または3記載のプロセス。
- ダイマーがホモダイマーであり、そのモノマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7の配列、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20のアミノ酸において配列番号1とは異なる配列を有することを特徴とする、請求項1〜4の1項記載のプロセス。
- Fc結合タンパク質が、ターゲットタンパク質に対して0.5〜20のモル比で使用されることを特徴とする、請求項1〜5の1項記載のプロセス。
- 工程a.の溶液が、5.5〜9、好ましくは6〜8のpHを有することを特徴とする、請求項1〜6の1項記載のプロセス。
- 工程d.の結合の解離が、pH2〜4.5で起こることを特徴とする、請求項1〜7の1項記載のプロセス。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号7の配列、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20のアミノ酸において配列番号1とは異なる配列を有する2つの同一のサブユニットからなるFc結合タンパク質であって、2つのサブユニットは共有結合を介して一緒に連結されている、前記Fc結合タンパク質。
- 共有結合がジスルフィド結合であることを特徴とする、請求項9記載のFc結合タンパク質。
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