TW201144325A - Selective enrichment of antibodies - Google Patents

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201144325 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白質、尤其免疫球蛋白或具有以域之其 他蛋白質的純化方法。 【先前技術】 諸如蛋白質、聚核苷酸、多醣及其類似物之生物分子在 作為藥物、診斷劑、食品添加劑、清潔劑及其類似物、研 究試劑方面及對於許多其他應用而言具有日益增加之商業 重要性。藉由自天然來源分離分子（例如在蛋白質之情況 下）通常不再能夠滿足對該等生物分子之需要，而需要使 用生物技術製備方法。 蛋白質之生物技術製備通常始於將DNA片段選殖至 表現載體中。將表現載體轉染至適合原核或真核表現細胞 中且隨後選擇經轉染之細胞後，在生物反應器中培養該等 經轉染之細胞且表現所要蛋白質。接著收集細胞或培養物 上清液，且處理並純化其中所含之蛋白質。 在真核表現系統之情況下，亦即當使W乳動物細胞培 養物（諸如CHO或NS0細胞）時，在過去畔中細胞培養物 或細胞培養上清液中所要蛋白質之濃度顯著增加，此可在 表現步驟中達成。相比之下，歷經相同時段，在蛋白質之 後續純化中利之層析材料的結合能力僅略微增加。為 此，迫切需要生物分子、尤其蛋白質之經改良且最佳化之 純化方法’該等方法可在大工業規模上進行。 在生物藥物（諸如用作藥物之蛋白質，例如治療性抗體） 154048.doc 4 201144325 之情況下’除產物產率以外，分離雜質亦至關重要。過程 依賴性雜質與產物依賴性雜質之間可加以區分。過程依賴 性雜質含有宿主細胞之組分’諸如蛋白質(宿主細胞蛋白 質’ HCP)及核酸，且源於細胞培養（諸如培養基之組幻或 處理（諸如鹽或溶解之層析配位體）。產物依賴性雜質為且 有不同特性之產物分子變異體。此等變異體包括截短形式 (諸如前驅物及水解分解產物）以及例如藉由脫除胺基、不 正確糖基化或誤連接二硫橋產生 性變異體亦包括聚合物及聚集物 之經修飾形式。產物依賴 。其他雜質為污染物。此 術語涵蓋具有化學、生物化學或微生物學性質且不直接屬 於製備過程之所有其他物f。污染物之實例包括可能以不 合需要之方式存在於細胞培養物中之病毒。 在生物藥物之情況下，雜質產生安全性問題。若藉由注 射或輸注將治療性蛋白質直接投與血流中，如生物藥物中 極㊉發生，則此等問題加劇。因此，宿主細胞組分可能引 起過敏反應或免疫病理學影響。此外，雜質亦可能導致所 技與之蛋白質產生不合需要之免疫原性，亦即其可能在患 者體内引發對治療劑不合需要之免疫反應，從而可能造成 危及生命之過敏性休克。因此，需要適合之純化方法，藉 助於該等方法可使所有非所需之物質降至無害程度。 另一方面，即使在生物藥物之情況下，仍不能忽視經濟 考慮因素。因此’所用製備及純化方法不應損害由此製備 之生物醫藥產品的經濟生存力。 作為蛋白質之處理及加工步驟，（管柱）層析方法以及過 154048.doc 201144325 濾及沈澱方法至關重要。因此，濃縮抗體之確切操作含有 藉由親和層析純化之步驟。目前已知許多管柱層析方法及 可用於此等方法之層析材料。 親和層析基質在工業純化各種物質中用作固定相。經固 定之配位體可用於特定濃縮及純化對於所用特定配位體具 有特定親和力之物質。對於抗體（免疫球蛋白）之工業純 化，尤其單株抗體之純化，經固定之蛋白A常常用於初始 純化步驟。蛋白A為金黃色葡萄球菌㈧叩知 ⑽rew)之約41 kDa之蛋白質，其以高親和力（1〇-8 Ml〇_12 Μ人類IgG)結合於免疫球蛋白Fc區之CH2/CH3域。在蛋白A 層析中’移動相中具有蛋白A結合Fc區之免疫球蛋白或融 合蛋白特異性結合於共價偶合至載體（例如瓊脂糖 (Sepharose))之蛋白a配位體。金黃色葡萄球菌之蛋白a(野 生型蛋白A)及經遺傳修飾之重組蛋白A(重組蛋白A)經非共 價相互作用而與抗體之恆定區（Fc片段）相互作用。此特異 性相互作用可用於有效分離雜質與抗體。藉由改變pH，可 刻意終止抗體與蛋白A配位體之間的相互作用且自固定相 釋放或溶離抗體。 除蛋白A作為親和配位體以外，目前已知許多結合於Fc 片段之其他分子。因此’使用蛋白A之個別域替代完整蛋 白質（8)。已知與蛋白A之B域確切不同的蛋白質變異體， 其適合結合含Fc片段之分子（16，17)。此等不同變異體基 本上不同在於突變’該等突變已插入以提高穩定性或結合 親和力。此等B域之突變體通常稱作z域或蛋白Z。除蛋白 154048.doc 201144325 A或蛋白G以外’多種肽亦適合選擇性結合於Fc片段（14)。 現今對F c片段之親和配位體的極大關注使得吾人推測會發 現更多親和配位體。 然而’親和層析及尤其經常使用之蛋白A層析花費高， 且確切而言’當醱酵槽中產物濃度增加且有大量產物時， 可進行之層析純化方法有所限制。關鍵點為：裝載量、循 環數、處理時間、池體積及緩衝液之量。因此，將來需要 替代性純化方法。包括親和層析及親和層析之替代方法之 習知純化策略的一般概述可見於以下文章中（7 + 1〇)。 習知親和層析中， 因此自管柱溶離。 新近親和層析方法不使用恆定固定之親和配位體，而是 始於與標靶蛋白混合之溶解親和配位體〇1) ^該親和配位 體帶有融合標記或融合蛋白，可能使該親和配位體固定於 固相上，該固定發生於第二步驟中。在下一步驟中，如在 標靶蛋白與配位體在適合條件下分離 在此所述之本發明使用親和沈澱替代親和層析來純化生 物分子 物为子》此方法在較大規模使用時確實顯示(1， 2) 〇 示具有極大潛力

出且轉化為粒 挺而定，此步 驟導致沈澱。然而， 此沈澱通常非特異地發生。 Γ法（2)。蛋白質自溶 。因此，許多蛋白質 而自溶液中分離。在 154048.doc 201144325 因此’為更選擇性地濃縮分子（例如蛋白質），開發出親 和沈澱。親和沈澱係利用親和分子與標靶分子之選擇性結 合。親和分子可為例如蛋白質、肽、募核苷酸或小化學分 子。親和沈澱在兩種原理之間有所區別，第一級親和沈澱 及第一級親和沈殿（7)。在第一級親和沈澱中，親和分子與 標靶分子均具有兩個結合位點，使得兩個分子之間有可能 形成網路，且形成在特定尺寸下沈降之親和複合物。在第 一級親和沈澱中，使用例如親和巨型配位體（AML)。在此 類型之沈澱中，親和分子結合於可刺激性物質，通常為聚 合物。可刺激性物質因環境條件改變（諸如pH值或溫度變 化）而改變其溶解特徵，且發生沈澱。不同於第一級親和 沈澱，不需要雙官能親和分子或雙官能標靶分子。 在遍使用之親和沈殿中，目前親和配位體偶合至聚合 物或其他介體（15)。 含Fc片段之分子的親和沈澱已描述於許多研究中。目前 最常見應用之特徵為使用所謂的「智慧型聚合物（咖如 polymer)」智慧型聚合物」（或刺激反應性「智能」聚合 物或親和巨型配位體）為可回應外部影響（物理或化學刺激） 而改變特性之聚合物。此等刺激可為例如值或溫度變化 (12-13)。通常，智慧型聚合物對其刺激作出反應而在溶液 中沈殿。在上清溶液進行所要分離之後，藉由適合條件可 使此沈澱逆轉1慧型聚合物可與多種生物分子結合，從 而使得可用於各種應用之聚合物/生物分子系統大量積 聚。此等生物分子之實例包括蛋白f、寡核㈣及糖。 154048.doc 201144325 另一形式之親和沈殿為最近描述之「親和浸沒（affinity sinking)」方法。在此形式之親和沈澱中，使用連接分子 骨架使許多親和配位體彼此結合。此繼而使得有可能形成 沈澱所需之網路。親和配位體與網路形成物之結合可以非 共價方式與共價方式進行。此方法最近描述於專利 「Compositions and methods for purifying and crystallizing molecules of interest」中（6)。在此方法中，首先將含有抗 體之溶液與共價結合於交聯劑之親和配位體混合。未觀察 到沈澱。僅在隨後添加配位離子或分子之後，方產生沈 澱。在第二種類似應用中，親和配位體連接於生物素結合 蛋白’ δ亥生物素結合蛋白與介體抗生物素蛋白形成網路 (9)。 美國專利7,083,943描述如下親和沈澱：其中標靶蛋白之 結合域連接於骨架域，該骨架域之胺基酸序列預期可幫助 趨於發生沈澱。

Chen及Hoffman(i5)描述IgG與聚（Ν異丙基丙烯醯胺）蛋 白Α結合物之親和沈澱。然而，抗體與未經修飾之蛋白a 的沈澱尚未證實有效。 先刖技術中所述之方法的一個缺陷為，在第一級親和沈 澱期間，沈澱僅可能經由交聯分子達成；或在第二級親和 沈澱中’需要可刺激性物f。最為熟知之親和沈殺的其他 缺陷彳面為a)位阻，纟中標靶蛋白之結合受高分子親和 巨型配位體之結合限也丨.k、α 〇吸制，b)已沈澱之聚合物複合物的再溶 解較緩慢；c)雜質之非枯_ s 買之非特異性共沈澱，此一般需要第二沈 154048.doc 201144325 澱步驟；d)使親和蛋白與聚合物或與交聯劑結合之額外步 驟（2-5)。 【發明内容】 本發明係關於使用具有兩個結合位點之結合蛋白的親和 沈版，其完全不需要額外的融合蛋白或連接分子。親和蛋 白本身足以用於沈澱，且不需要固定相。在此所用之發明 内容亦可較容易地回收親和蛋白。 本發明尤其係關於一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有& 域之其他蛋白質（標靶蛋白）之方法，其包含以下步驟： a. 製備含有標靶蛋白之溶液； b. 在允許發生結合之條件下併入確切具有兩個結合位點之 F c結合蛋白； c. 自液相分離沈澱物； d. 解除標乾蛋白與fc結合蛋白之結合。 在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其中Fc結合蛋 白為蛋白A或蛋白G之Fc結合域的二聚體。該二聚體之兩 個單體較佳經由二硫橋彼此連接。 在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其中二聚體為 均二聚體，其單體具有SEQ ID NO: 1、SEQ id N0: 2或 SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO. 1之不同之處在Mi、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20個胺基酸的序列。 在另一態樣中，所用Fc結合蛋白相對於標靶蛋白之比率 為〇·5·20。步驟a·十溶液之pH值較佳為5.5_8。步驟d.中結 154048.doc -9- 201144325 合解除較佳在2-4.5之pH值下發生。 在另一態樣中’本發明係關於一種由2個相同次單元組 成之Fc結合蛋白’該等次單元具有序列SEq id NO: 1、 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或與 SEQ ID NO. 1之不同之 處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的序列，該兩個次 單元經由共價鍵彼此連接。共價鍵較佳為二硫鍵。 【實施方式】 本發明係關於自一定種類之蛋白質組合物中去除雜質、 尤其宿主細胞蛋白質（HCP)及DNA之方法，該等蛋白質組 合物係自重組或内源表現蛋白質之細胞培養物獲得。詳言 之本發明係關於藉由結合具有至少兩個結合位點之fc結 口蛋白或其多聚體而純化或濃縮蛋白質（標靶蛋白）之方 法。在其他步驟中，分離出沈澱物，接著使用適合條件拆 開Fc結合蛋白與標靶蛋白之結合。 本發明係關於一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fc域之 其他蛋白質（標靶蛋白）之方法，其包含以下步驟： a. 製備含有標把蛋白之溶液； b. 在允許發生結合之條件下併人確切具有兩個結合位點之 Fc結合蛋白； c ‘自液相分離沈澱物； d.解除標靶蛋白與Fc結合蛋白之結合。 "之私靶蛋白可為免疫球蛋白或含有免疫球蛋白以 域之蛋白質且可結合於蛋白A或蛋白A之片段。免疫球蛋 154048.doc 201144325 白由兩條重鏈及兩條輕鏈組成。視免疫球蛋白而定，重鏈 各具有一個可變域及二至四個怪定域。此等域類似地稱作 VH及CHI、CH2、CH3。輕鍵及重鍵之可變域形成抗原結 合位點。CH2域含有形成補體系統之結合位點的碳水化合 物鏈。CH3域含有Fc受體結合位點。可應用於本發明方法 之標鞋•蛋白為具有Fc域之所有蛋白質。含有CH2/CH3區之 蛋白質的實例為抗體、免疫黏附素及融合蛋白，其中相關 蛋白質連接於CH2/CH3區。在本發明之一個實施例中，標 無蛋白為例如具有CH2/CH3區且因此能夠結合於蛋白a之 抗體。術語CH2/CH3區係指抗體Fc區中與蛋白a相互作用 之胺基酸。 根據本發明，Fc結合蛋白確切包含一個Fc域之兩個結合 位點。 在另一態樣中，本發明係關於一種方法，其中Fc結合蛋 白為蛋白A或蛋白G之Fc結合域的二聚體。該二聚體之兩 個單體較佳由二硫橋連接在一起。

Fc結合蛋白意謂能夠結合於Fc區之蛋白質或肽。Fc結合 蛋白較佳以1〇-2·1〇-η M範圍内之解離常數（Kd值）結合。 在本發明之較佳實施例中，Fc結合蛋白為Fc結合域之均 二聚體或雜二聚體，該等Fc結合域包含或含有表1中 之序列： I54048.doc 201144325 SEQ ID NO: 序列 描述 1 MVDNKFNKEQ QNAFYEILHL PNLNEEQRNA FIQSLKDDPS QSANLLAEAK KLNDAQAPKS SACRRRRRRR RP Z域Cys標記 2 MVDNKFNKEQ QNAFYEILHL PNLNEEQRNA FIQSLKDDPS QSANLLAEAK KLNDAQAPKS SAC Z 域 Cys 3 DNKFNKEQQN AFYEILHLPN LNEEQRNAFI QSLKDDPSQS ANLLAEAKKL NDAQAPK Z域 4 QQNAFYQVLN MPNLNADQRN GFIQSLKDDP SQSANVLGEA QKLNDSQAPK 蛋白 A (Swissprot P02967)之E域 5 QNNFNKDQQS AFYEILNMPN LNEAQRNGFI QSLKDDPSQS TNVLGEAKKL NESQAPK 蛋白 A (Swissprot P02967)之D域 6 DNNFNKEQQN AFYEILNMPN LNEEQRNGFI QSLKDDPSQS ANLLSEAKKL NESQAPK 蛋白 A (Swissprot P02967)之C域 7 DNKFNKEQQN AFYEILHLPN LNEEQRNGFI QSLKDDPSQS ANLLAEAKKL NDAQAPK 蛋白 A (Swissprot P02967)之B域 8 DNKFNKEQQN AFYEILHLPN LTEEQRNGFI QSLKDDPSVS KEILAEAKKL NDAQAPK 蛋白 A(Swissprot P02967)之A域 9 TTYKLVINGK TLKGETTTKT VDAETAEKAF KQYANDNGVD GVWTYDDATK TFTVT 來自鏈球菌屬 (Streptococcus Sp.)(Uniprot Q53337)之蛋白G Fc結 合域 10 TTYKLVINGK TLKGETTTKA VDAETAEKAF KQYANDNGVD GVWTYDDATK TFTVT 來自停乳鏈球菌 (Streptococcus dysgalactiae)(YP 0 02997067)之蛋白g Fc 結合域 11 TTYRLVIKGV TFSGETATKA VDAATAEQTF RQYANDNGIT GEWAYDTATK TFTVTE 來自馬鏈球菌 (Streptococcus equi)(YP一002123072 )之IgG結石域 在此情形下，均二聚體意謂由兩個具有相同序列之次單 元構成的Fc結合蛋白。 在此情形下’雜二聚體意謂由兩個具有不同序列之次單 元構成的Fc結合蛋白’各次單元具有Fc域之結合位點。次 單元較佳含有選自表1中之序列的序列。 在另一態樣中’本發明係關於一種方法，其中二聚體為 均二聚體，其單體具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或 154048.doc -12- 201144325 SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO. 1之不同之處在於ι、2、 3、4、5、6、7、8、9、1〇、U、12、13、14、15、16、 17、18、19或20個胺基酸的序列。與SEq ID N〇 1之不同 之處在於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之單體的特性 為以1〇-2-1〇_13 Μ範圍内之Kd值結合Fc域。 結合條件為如下條件：其中Fc結合蛋白與標靶蛋白之結 合較佳在pH 5.5-9、較佳ρΗ 6·8之？11值範圍内發生。 沈澱在結合條件下自發發生，諸如，在例如無細胞真核 培養物上清液中所發現之情況。不需要使本發明之二聚體 連接於聚合物（例如聚乙二醇）以促進與聚合物一起沈澱。 在另一態樣中，所用Fc結合蛋白相對於標靶蛋白之莫耳 比為 0.5-20。 分離沈澱物可藉由離心及隨後移除上清液來進行，但亦 可藉由過濾技術進行。 解除與心乾蛋白之結合在能夠使F e結合蛋白與標乾蛋白 刀離之條件下進行。較佳可藉由調整pH值至pH 2至4 5之 範圍來進行此。 在另一態樣中 成之F c結合蛋白 SEQ ID NO： 2 > 處在於1、2、3 ，本發明係關於一種由2個相同次單元組 ’該等次單元具有序列SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO. 1之不同之 、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 17、18、19或20個胺基酸的序列，其中該兩 個人單7G由共價鍵連接在__起。共價鍵較佳為二硫鍵。 154048.doc -13. 201144325 實例 設備與方法： 製備二聚蛋白z 自大腸桿菌獲得重組蛋白形式之蛋白Z。藉由離子交換 層析分離細胞碎片之後移除雜質。 所用Z域之蛋白質序列：

Met-Val-Asp-Asn-Lys-Phe-Asn-Lys-Glu-Gln-Gln-Asn-Ala-Phe-Tyr-Glu-Ile-

Leu-His-Leu-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg-Asn-Ala-Phe-Ile-Gln-Ser-

Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln-Ser-Ala-Asn-Leu-Leu-Ala-Glu-Ala-Lys-Lys-

Leu-Asn-Asp-Ala-Gln-Ala-Pro-Lys-Ser-Ser-Ala-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-

Arg-Arg-Arg-Pro 藉由將非原生半胱胺酸插入Z域之肽鏈中，有可能經由 二硫橋有意連接兩個蛋白Z分子。純化重組蛋白Z之後，即 刻藉由氧化獲得二聚蛋白質形式之重組蛋白Z。 無細胞真核培養物上清液 培養數天之後，藉由過濾或離心獲得經最佳化以進行分 泌性製備之C Η Ο細胞的細胞培養物上清液。 SEC分析 藉由分析型尺寸排阻層析（SEC)進行實驗1之樣品的蛋白 質雜質及抗體含量分析。將TSK-GEL SW 3000與製造商 (TOSOH Bioscience)推薦之前管柱（precolumn)—起使用。 在Dionex Ultimate裝置上進行分析，於280及220 nm下監 視UV信號。 分離Z-二聚體與抗體之離子交換層析 154048.doc 14 201144325 在 AKTA Explorer 10裝置（GE Healthcare)上進行離子交 換層析，於220及280 nm下觀察UV吸收。所用管柱材料為 SP瓊脂糖FF(19 mL凝膠床體積）。施用在酸性pH值下再懸 浮之集結塊（pellet)之後，用20 mM磷酸鹽緩衝液（pH 3.3) 平衡管柱，接著使抗體與Z-二聚體經25個管柱體積之長梯 度彼此分離。使用含3 M NaCl之20 mM磷酸鹽緩衝液（pH 3.3)進行溶離。

蛋白A HPLC 在Waters或Dionex裝置（注射泵及管柱烘箱W2790/5，UV 偵測器W2489)上使用蛋白A HPLC測定無細胞培養物上清 液及經純化抗體之抗體含量。使用酸性溶離峰之UV信號 測定溶液之抗體含量。 濃縮 部分濃縮測試中獲得之溶液以供分析方法（Amicon Ultra，排阻尺寸3 kD)所用。 SDS-PAGE ： 使用20%均質SDS凝膠來測試個別溶離份及上清液。藉 由根據Heukeshoven進行銀染色來彳貞測蛋白質色帶。 藉由ELISA檢定分析宿主細胞蛋白質 在實驗3中，使用ELISA檢定進行宿主細胞蛋白質分 析。 DNA分析

產生單股之後，藉由酶催化之偵測反應進行DNA分析。 UF/DF 154048.doc 15 201144325 在實驗3中使用Messrs Pall製造之表面積為180 cm2的50 kDa Centramate Sheet PES(聚喊颯）進行 UF/DF 測'試。進行 UF/DF，以將抗體初始濃縮六倍，接著透濾（換成6體積之 緩衝液），隨後在完全打開滯留閥下循環10分鐘。重複透 濾兩次。整個UF/DF用50 mM乙酸鹽緩衝液+ 100 mM精胺 酸+ 150 mM NaCl(pH 3.0)進行。 疏水相互作用層析（HIC) 在AKTA裝置上用27 mL管柱進行疏水相互作用層析（實 驗3)。所用管柱材料為Tosoh製造之Toyopearl Phenyl 650 Μ。出於此目的，進行UF/DF之後，向滯留物中添加3.5 Μ 硫酸銨緩衝液直至獲得165 mS/cm之電導率。向經緩衝液 (50 mM乙酸鹽+1.2 Μ硫酸銨，pH 4)平衡之管柱中饋入來 自UF/DF之滯留物，接著經40個床體積使梯度達到50 mM 乙酸鹽緩衝液（pH 4)。 實驗： 偵測經半胱胺酸達成之蛋白Z二聚 藉由SDS-PAGE分析來偵測經半胱胺酸達成之蛋白Z二聚 (圖1)。為確保處理不會誘導蛋白Z發生任何氧化，首先用 碘乙醯胺使游離半胱胺酸基團烷基化。為偵測單體，另外 用二硫蘇糖醇（DTT)進行還原。將2.6 nmol Z-二聚體與 DTT或相應體積之緩衝液混合，且在95°C下培育5分鐘。 接著冷卻混合物至環境溫度，且添加碘乙醯胺或相應體積 之緩衝液，且在黑暗中再培育混合物20分鐘。與SDS-PAGE緩衝液一起培育5分鐘之後，將製劑施用於SDS- 154048.doc 16 201144325 PAGE。 SDS-PAGE为析！貝示，藉由添加還原劑dtt形成z單體且 Z二聚體之凝膠色帶消失。 使用Z-二聚體進行選擇性沈澱 下文所述之測試顯示，抗體之選擇性沈澱可用Z-二聚體 達成⑽’實驗1)βζ_二聚體為來自金黃色葡萄球菌之蛋 白的f Β域，該二聚Β域經由兩個非原生半脱胺酸連 接’相較於野生型其帶有突變（參看設備與方法）。此外， 實驗2展不，所得集結塊可藉由於酸性pH值範圍内再懸浮 而返回'合液# ’接著可藉由在酸性PH值下進行離子交換層 析自Z-二聚體再次移除抗體。 實驗1 : /貝1。式無細胞真核培養物上清液中所存在的不㈤比率之蛋 白Z與抗體。此外，個別批次之體積存在變化。在測⑴ 中’於震盈下將().13 μηκ)1 z_二聚體與無細胞真核培養物 上凊液中所含之0 065 μηΐ()1 IgG4_ ^培育2小時，總體積 為5.47 mL。在測試2中，於震蘯下將i6 25 nm〇i z•二聚體 與無細胞真核培養物上清液中所含之16 25 _丨卿一起 =培育2小日寺，總！t積為5.2 mL。接著以彻〇啊離心混 〇刀鐘，且使上清液與集結塊分離。藉助於分析型 SEC之UV6號且藉由蛋白A層析（設備與方法）測定上清液 2體含量°藉由自所用抗體之總含量減去上清液之抗體 3里來挪疋集結塊中抗體之含量。觀察到多達99%之抗體 沈澱（树試1:99%/測試2:76%)。此外，在沈澱之前及之後藉 154048.doc -17· 201144325 由为析型SEC檢查培養物上清液之蛋白質雜質。將無細胞 真核培養物上清液之層析圖與沈澱後之上清液直接比較β 觀察到去除90-99%範圍内之蛋白質雜質（測試！ 9〇%/測試2 99%)。此意謂1%或1〇%之蛋白質雜質已發生共沈澱。此處 蛋白質雜質可為宿主細胞蛋白質以及標靶蛋白之片段或聚 集物。 實驗2 : 使用陽離子交換劑（SP瓊脂糖FF)來分離Ζ-二聚體與抗 體。將0.2 μιηοΐ經純化抗體與〇.2 μπιοί Ζ-二聚體一起培育 36分鐘’體積為101 mL。隨後離心（4〇〇〇 rpm，1〇分鐘）之 後’移除上清液。接著將集結塊分批溶解於1〇 mL磷酸鹽 緩衝液（pH 7.4)中’且再次離心（4〇〇〇 rpm，1〇分鐘）。將由 此獲得之集結塊再懸浮於20 mL磷酸鹽緩衝液（2〇 mM磷酸 鹽’ pH 3.3)中’且使用離子交換劑純化。可經由經25個床 體積之梯度分離Z-二聚體與抗體（圖3及圖4)。 實驗3 : 進行多步抗體純化方法，其中使用親和沈澱作為捕捉步 驟。 自無細胞培養物上清液沈澱時，使用500 mg抗體（3.3 μπιοί)，其與Z-二聚體（6.6 μπιοί)之比率為1:2。在緩緩搜拌 下培育1小時之後，將整個懸浮液添加至0.22 μηι過濾器 (Millipore)中，且以此方式藉由過濾分離沈澱物之上清 液。接著用緩衝液（23 1 mL 50 酸鹽緩衝液，pH 7.4) 洗滌沈澱物，且在下一步驟中再懸浮於含乙酸鹽緩衝液 154048.doc -18· 201144325 (179 mL 50 mM乙酸鹽緩衝液+100 mM精胺酸+150 mM NaCl，pH 3.0)之過濾器中。為分離Z-二聚體與抗體，用50 kDa膜進行UF/DF。在下一步驟中進行HIC以分開Z-二聚體 及其他雜質。 沈澱之後抗體之總產率為98%，UF/DF之後降至87%， 且HIC之後降至64%。除使用抗體之選擇性沈澱獲得良好 產率以外，DNA及宿主細胞蛋白質分析顯示，相較於初始 值（無細胞培養物上清液），可藉由沈澱步驟、繼之以 UF/DF使DNA減少99%，且宿主細胞蛋白質含量可減少 99.9%。 文獻 1) Labrou N, Clonis YD. (1994) J Biotechnol. 36(2), 95-119。 2) Hilbrig F, Freitag R. (2003) J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 790(1-2), 79-90 ° 3) Mattiasson B, Kumar A, Galaev IYu. (1998) J Mol 11(1-6)，211-6。 4) Vaidya AA, Lele BS, Kulkarni MG, Mashelkar RA. (1999) 64(4)，418-25。 5) Garret-Flaudy F, Freitag R. (2000-2001) Biotechnol 71(3)，223-34。 6) US 2006/0121519 A1 「Compositions and Methods for purifying and crystallizing molecules of interest」o 7) H. Chmiel, Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer 154048.doc -19- 201144325

Verlag，第 2版，2006。 8) EP1179014B1。 9) Patchornik，G.及 Albeck A. (2005)，CAew· 16, 1310-1315 。 10) Wilchek, M.及 Gorecki，Μ. (1973), 31， 1， 149-152 。 11) W02009062942 KYHSE-ANDERSEN JAN [DK] 「DUAL AFFINITY POLYPEPTIDES FOR PURIFICATION」。 12) Hoffman，Controlled release (1987) 6，297-305 ° 13) Hoffmann (1997) Intelligent polymers. Park K編， Controlled drug delivery. Washington: ACS Publications 485-98 。 14) Haiou Yang，Patrick V. Gurgel及 Ruben G· Carbonell (2009) d 1216，910-918。 15) Chen及 Hoffman (1990)，Biomaterials 11 (9)，631-634 ° 16) Nilsson等人，1987. B. Nilsson，T. Moks，B. Jansson， L. Abrahmsen, A. Elmblad, E. Holmgren, C. Henrichson, T. A. Jones 及 Μ. Uhl0n，A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. protein Eng. 1 (1987)， 第 107-113頁。 17) Tashiro，Μ.，Tejero，R·，Zimmerman，D.E·，Celda, B·，

Nilsson, B.及Montelione，G.T. 1997. High-resolution solution NMR structure of the Z domain of staphylococcal protein A. 154048.doc -20- 201144325 J. Mol. Biol. 272: 573-590。 【圖式簡單說明】 圖1 : Z二聚體之SDS-PAGE。為展示經由半胱胺酸達成 之二聚，在施用於SDS-PAGE之前添加碘乙醯胺或碘乙醯 胺與二硫蘇糖醇； 跡線 樣品 1 與0.6 μιηοΐ蜗乙醯胺混合之重組Z-二聚體 2 與0.3 μιηοΐ DTT及碘乙醯胺混合之重組Ζ-二聚體 3 純的重組Ζ-二聚體 4 科姆比標記物(Kombi marker) 5 與0·2μιηο1埃乙醯胺混合之重組Z-二聚體 6 與0.1 μηιοί DTT及0.2 μιηοΐ蛾乙醯胺混合之重組Ζ-二聚體 7 純的重組Ζ-二聚體 圖2 :使用Ζ-二聚體進行之親和沈澱。作為第一步驟， 使蛋白Ζ氧化。在第二步驟中，向含有抗體（mAB)之溶液 中添加Z-二聚體，此使得抗體選擇性沈澱； 圖3 :在酸性條件下分離Z二聚體與抗體之離子交換層析 的UV圖（實驗2)。220 nm下之UV層析圖以紅色展示，2 8 0 nm下之UV層析圖以藍色展示，且漸增含量之緩衝液B(20 mM磷酸鹽，3 M NaCl)以綠色展示； 圖4:實驗2之SDS-PAGE; 跡線樣品 1 經純化抗體 2 蛋白Z二聚體 3 沈澱後之上清液 4 視情況選用之洗滌步驟之後的上清液 154048.doc -21 - 201144325 5 再懸浮之集結塊(抗體與Z-二聚體） 6 酸性pH值下之離子交換層析之峰1(抗體） 7 酸性pH值下之酸性離子交換層析之峰2(Z-二聚體) 8 科姆比標記物 154048.doc -22- 201144325 序列表 <11〇>德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 <120>抗體之選擇性富集 <130> POl-2592/wo/l <140〉 100107413 <141> 2011-03-04 <150> 10155647.0 <151> 2010-03-05 <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 72

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 1

Met val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 15 10 15 lie Leu His Leu pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Ala Phe lie 20 25 30

Cln Ser Leu Lys Asp Asp Pro ser Gin 5er Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45

Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys ser ser Ala Cys Arg 50 55 60

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro 65 70 <210> 2 <211> 63

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 2

Met val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu 15 10 15 lie Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Ala Phe lie 20 25 30

Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu 35 40 45

Ala lys Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys Ser Ser Ala Cys 50 55 60 <210> 3 <2X1> 57

<212> PRT 154048-序列表.doc 201144325 <乏13>金黃色葡萄球菌 <400> 3

Asp ash Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu 15 10 15

His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Ala Phe lie Gin Ser 20 25 30

Leu Lys Asp Asp Pro ser Gin ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45

Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 50

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 4

Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Gin val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala 15 10 15

Asp Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin 20 25 30

Ser Ala Asn val Leu Gly Glu Ala Gin Lys Leu Asn Asp Ser Gin Ala 35 40 45 p厂〇 Lys 50 <210> 5 <211> 57

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 5

Gin Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gin Gin Ser Ala Phe Tyr Glu lie Leu 1 5 10 15

Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu ΑΊά Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser 20 25 30

Leu Lys Asp Asp Pro ser Gin ser Thr Asn val Leu Gly Glu Ala Lys 35 40 45

Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys 50 55 <210> 6 <211> 57 154048·序列表.doc 201144325

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 6

Asp Asn Asn Phe A$n Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu 1 5 10 15

Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser 20 25 30

Leu Lys Asp Asp Pro ser Gin Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys 35 40 45

Lys Leu Asn Glu Ser Gin Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 57

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 7

Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu 15 10 15

His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser 20 25 30

Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gin ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45

Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 57

<212> PRT <213>金黃色葡萄球菌 <400> 8

Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gin Gin Asn Ala Phe Tyr Glu lie Leu 15 10 15

His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gin Arg Asn Gly Phe lie Gin Ser 20 25 30

Leu Lys Asp Asp Pro Ser val Ser Lys Glu lie Leu Ala Glu Ala Lys 35 40 45

Lys Leu Asn Asp Ala Gin Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 154048·序列表.doc 201144325 <211> 55 <212> PRT <213>鏈球菌屬 <400> 9

Thr Thr Tyr Lys Leu val lie Asn Gly Lys Thr Leu Ly$ Gly Glu Thr 15 10 15

Thr Thr Lys Thr Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gin 20 25 30

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45

Thr Lys Thr Phe 丁hr val Thr 50 55 <210> 10 <211> 55 <212> PRT <213>停乳鏈球菌 <400> 10

Thr Thr Tyr Lys Leu val lie Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 15 10 15

Thr Thr Lys Ala val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gin 20 25 30

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala 35 40 45

Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 50 55 <210> 11 <211> 56 <212> PRT <213>馬鍵球菌 <400> 11

Thr Thr Tyr Arg Leu val lie Lys Gly val Thr Phe Ser Gly Glu Thr 15 10 15

Ala Thr Lys Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Gin Thr Phe Arg Gin 20 25 30

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly lie Thr Gly Glu Trp Ala Tyr Asp Thr Ala 35 40 45

Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 -4- 154048-序列表.doc

Claims (1)

1. 201144325 七、申請專利範圍： 1. 一種選擇性濃縮免疫球蛋白或含有Fc域之其他蛋白質（標 乾蛋白）之方法’其包含以下步驟： a.製備含有該標把蛋白之溶液； . b .在允許發生結合之條件下併入確切具有兩個結合位點 之Fc結合蛋白； c·自液相分離沈澱物； d.解除該標靶蛋白與該Fc結合蛋白之結合。 2·如請求項丨之方法，其特徵在於該以結合蛋白為蛋白a或 蛋白G之Fc結合域的二聚體。 3 ·如明求項2之方法，其特徵在於該Fc結合域包含或含有 序列 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 11之一。 4’如4求項2或3之方法’其特徵在於該二聚體之兩個單體 係由一硫橋連接在一起。 "月求項2或3之方法，其特徵在於該二聚體為均二聚 體’其單體具有序列SEQ ID N〇: !、SEQ m N〇: 2、 Q ID NO. 3 ’或序列與SEq ID N〇丨不同之處在於卜 2、3、4、5、6、7、8'9、1〇、u、12、i3、i4、i5、 . 16、17 ' 18、19或20個胺基酸。 • β求項1至3中任-項之方法，其特徵在於使用該Fc結 合蛋白相對於該縣蛋白之莫耳比為OH 7·如清求項1至3中任一項夕女、+ 項之方法，其特徵在於步驟a.中該 溶液之pH為5.5-9，較佳為6_8。 ’其特徵在於步驟d.中該 8·如請求項1至3中任一項之方法 154048.doc 201144325 結合解除發生在2-4.5之pH。 9. 一種Fc結合蛋白，其由2個相同次單元組成，該等次單 元具有序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3，或序列與SEQ ID NO. 1不同之處在於1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、l9或20個胺基酸，其中該兩個次單元係經由共價鍵 連接在一起。 1〇·如請求項9之Fc結合蛋白，其特徵在於該共價鍵為二硫 鍵0 154048.doc -2-