JP2584697B2 - ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ - Google Patents
ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡInfo
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- JP2584697B2 JP2584697B2 JP3235687A JP23568791A JP2584697B2 JP 2584697 B2 JP2584697 B2 JP 2584697B2 JP 3235687 A JP3235687 A JP 3235687A JP 23568791 A JP23568791 A JP 23568791A JP 2584697 B2 JP2584697 B2 JP 2584697B2
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- recombinant protein
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＧ精製用組換え型
プロテインＡに関するものであって、このプロテインＡ
は、天然型プロテインＡに比して格段に免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）精製能がすぐれており、バイオテクノロジ
ー関連の各種分野において広範に利用することができ
る。
プロテインＡに関するものであって、このプロテインＡ
は、天然型プロテインＡに比して格段に免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）精製能がすぐれており、バイオテクノロジ
ー関連の各種分野において広範に利用することができ
る。
【０００２】
【従来の技術】プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に
存在する蛋白質で、通常、Ｃｏｗａｎ Ｉ株の培養液か
ら単離されることは既に知られている（福井三郎ほか監
修「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、
ｐ．９５８（１９８６−１０−９））。本発明のよう
に、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つに着目
し、遺伝子操作によってそれを複数個連結させた例とし
ては、Ｎｉｌｓｓｏｎら（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ １，１０７−１１３，１９８７）による人
工的な変異体であるドメインＺをくり返したものと、Ｓ
ａｉｔｏら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
２，４８１−４８７，１９８９）によるドメインＢを
くり返したものがすでに知られているが、ある特定のＩ
ｇＧ結合ドメインの特にくり返し数に着目してそれらの
ＩｇＧ結合能を詳細に比較した例はない。
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に
存在する蛋白質で、通常、Ｃｏｗａｎ Ｉ株の培養液か
ら単離されることは既に知られている（福井三郎ほか監
修「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、
ｐ．９５８（１９８６−１０−９））。本発明のよう
に、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つに着目
し、遺伝子操作によってそれを複数個連結させた例とし
ては、Ｎｉｌｓｓｏｎら（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ １，１０７−１１３，１９８７）による人
工的な変異体であるドメインＺをくり返したものと、Ｓ
ａｉｔｏら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
２，４８１−４８７，１９８９）によるドメインＢを
くり返したものがすでに知られているが、ある特定のＩ
ｇＧ結合ドメインの特にくり返し数に着目してそれらの
ＩｇＧ結合能を詳細に比較した例はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】蛋白質工学、生化学、
遺伝子工学、医学、農学、バイオアッセイその他のバイ
オテクノロジー関連の技術分野において、ＩｇＧは非常
に重要な役割を果すことから、ＩｇＧを効率的に分離精
製するシステムの開発が従来よりこれらの技術分野にお
いて強く要望されている。
遺伝子工学、医学、農学、バイオアッセイその他のバイ
オテクノロジー関連の技術分野において、ＩｇＧは非常
に重要な役割を果すことから、ＩｇＧを効率的に分離精
製するシステムの開発が従来よりこれらの技術分野にお
いて強く要望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような問
題点を解決する目的でなされたものであって、各方面か
ら検討の結果、特に遺伝子工学の手法に着目して、更に
研究を行った結果、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン
の内ドメインＡとＢの部分を一単位とし、ＰＣＲ法（プ
ライマー利用遺伝子増幅法）によりこれらの遺伝子を自
由に増幅することに成功し、その結果、これらを複数個
つなげた蛋白質を自由に製造することにはじめて成功し
た。
題点を解決する目的でなされたものであって、各方面か
ら検討の結果、特に遺伝子工学の手法に着目して、更に
研究を行った結果、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン
の内ドメインＡとＢの部分を一単位とし、ＰＣＲ法（プ
ライマー利用遺伝子増幅法）によりこれらの遺伝子を自
由に増幅することに成功し、その結果、これらを複数個
つなげた蛋白質を自由に製造することにはじめて成功し
た。
【０００５】しかも全く予期せざることに、このように
して得られた連結蛋白質（以下、連結蛋白質ということ
もある）は、天然型のプロテインＡに比してＩｇＧとの
特異的結合能においてすぐれていることを発見し、これ
らの新知見を基礎として更に研究の結果、本発明の完成
に至ったものである。
して得られた連結蛋白質（以下、連結蛋白質ということ
もある）は、天然型のプロテインＡに比してＩｇＧとの
特異的結合能においてすぐれていることを発見し、これ
らの新知見を基礎として更に研究の結果、本発明の完成
に至ったものである。
【０００６】本発明に係る連結蛋白質は、後記するとこ
ろからも明らかなように遺伝子組換え技術によって所望
する分子量のものを正確且つ自由に作製することがで
き、しかも画期的なことに、ＩｇＧに特異的に結合する
能力に卓越している。したがって本発明に係る連結蛋白
質（プロテインＡ）によれば、ＩｇＧ含有試料中のＩｇ
Ｇのみを選択的に結合することができるので、ＩｇＧの
精製、分離に利用することができ、あるいは逆にＩｇＧ
含有試料からＩｇＧのみを選択的に除去するのに利用す
ることも可能である。しかも、本連結蛋白質はＩｇＧに
対する結合能に優れ、溶離液を作用させれば容易にＩｇ
Ｇを溶離することがでる。
ろからも明らかなように遺伝子組換え技術によって所望
する分子量のものを正確且つ自由に作製することがで
き、しかも画期的なことに、ＩｇＧに特異的に結合する
能力に卓越している。したがって本発明に係る連結蛋白
質（プロテインＡ）によれば、ＩｇＧ含有試料中のＩｇ
Ｇのみを選択的に結合することができるので、ＩｇＧの
精製、分離に利用することができ、あるいは逆にＩｇＧ
含有試料からＩｇＧのみを選択的に除去するのに利用す
ることも可能である。しかも、本連結蛋白質はＩｇＧに
対する結合能に優れ、溶離液を作用させれば容易にＩｇ
Ｇを溶離することがでる。
【０００７】本発明に係る連結蛋白質を用いてＩｇＧを
精製するには、不均一系、均一系のいずれの系も利用す
ることができ、いずれの場合においても常法が適宜使用
される。
精製するには、不均一系、均一系のいずれの系も利用す
ることができ、いずれの場合においても常法が適宜使用
される。
【０００８】例えば不均一系を利用する場合には、常法
にしたがって容器、器壁や担体に本発明に係る組換え型
プロテインＡを固定し、これにＩｇＧ含有試料を接触さ
せればよく、バッチ式、連続式のいずれの方式も利用す
ることができる。固定化法としては、微生物や酵素を固
定化する方法が適宜利用され、例えば共有結合法、イオ
ン結合法、物理的吸着法といった各種の担体結合法が好
適に利用される。また、担体ないし器壁材料としては、
利用する結合法に最適なものを選択すればよく、例え
ば、合成樹脂、多糖類等合成又は天然の有機物；ガラ
ス、金属、多孔質粘土等無機物；血球、細胞、微生物菌
体等生物系物質等が広範に適宜選択使用される。
にしたがって容器、器壁や担体に本発明に係る組換え型
プロテインＡを固定し、これにＩｇＧ含有試料を接触さ
せればよく、バッチ式、連続式のいずれの方式も利用す
ることができる。固定化法としては、微生物や酵素を固
定化する方法が適宜利用され、例えば共有結合法、イオ
ン結合法、物理的吸着法といった各種の担体結合法が好
適に利用される。また、担体ないし器壁材料としては、
利用する結合法に最適なものを選択すればよく、例え
ば、合成樹脂、多糖類等合成又は天然の有機物；ガラ
ス、金属、多孔質粘土等無機物；血球、細胞、微生物菌
体等生物系物質等が広範に適宜選択使用される。
【０００９】このようにして本発明に係る組換え型プロ
テインＡを固定した担体は、例えばこれをカラムに充填
した後、ＩｇＧ含有試料をこれにアプライしてＩｇＧの
みを選択的に固定化担体に結合させ、しかる後に溶離液
を流下させるとＩｇＧが溶離して、連続的に精製ＩｇＧ
を得ることができる。そして更に精製度を高めるために
は、この操作をくり返したり、必要あれば新たに調製し
た該プロテインＡ固定化担体充填カラムで改めて処理し
てもよい。バッチ式で精製する場合も同様にＩｇＧを担
体に結合せしめた後、これを固液分離し、次いでＩｇＧ
を溶離すればよい。
テインＡを固定した担体は、例えばこれをカラムに充填
した後、ＩｇＧ含有試料をこれにアプライしてＩｇＧの
みを選択的に固定化担体に結合させ、しかる後に溶離液
を流下させるとＩｇＧが溶離して、連続的に精製ＩｇＧ
を得ることができる。そして更に精製度を高めるために
は、この操作をくり返したり、必要あれば新たに調製し
た該プロテインＡ固定化担体充填カラムで改めて処理し
てもよい。バッチ式で精製する場合も同様にＩｇＧを担
体に結合せしめた後、これを固液分離し、次いでＩｇＧ
を溶離すればよい。
【００１０】以下、本発明を実施例について更に詳しく
説明する。
説明する。
【００１１】
【実施例１】
【００１２】〔（１）プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−
ＡＢＩ〜ＶＩの構築〕 最も分子量の小さい基本蛋白質として、プロテインＡの
ＡＢドメインを用いることを計画し、その遺伝子を市販
のプロテインＡ融合蛋白質発現ベクターｐＲＩＴ２Ｔを
鋳型としてＰＣＲ法で合成した（図２）。その際、遺伝
子の両端に制限酵素ＡｃｃＩの認識配列を導入し、この
遺伝子が一定方向に連結されるようにした。ＡｃｃＩの
認識配列はｎｏｎ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃであり、両
末端にそのような配列を持つＤＮＡ断片は一定方向にし
か連結されない特徴がある。この様な制限酵素としては
他に、ＡｆＬＩＩＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩ
Ｉ、ＨｇｉＡＩなどがある。ＡＢドメインの遺伝子の合
成法は図２に示したＰＣＲ法に限定されるものでなく、
数十塩基からなるオリゴヌクレオチドに分割してＤＮＡ
合成機により合成し、それらをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
って順に連結していくことによっても得られる。この場
合は大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適
コドンを用いた遺伝子の塩基配列を用いることは当業者
によって一般的に行われている。
ＡＢＩ〜ＶＩの構築〕 最も分子量の小さい基本蛋白質として、プロテインＡの
ＡＢドメインを用いることを計画し、その遺伝子を市販
のプロテインＡ融合蛋白質発現ベクターｐＲＩＴ２Ｔを
鋳型としてＰＣＲ法で合成した（図２）。その際、遺伝
子の両端に制限酵素ＡｃｃＩの認識配列を導入し、この
遺伝子が一定方向に連結されるようにした。ＡｃｃＩの
認識配列はｎｏｎ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃであり、両
末端にそのような配列を持つＤＮＡ断片は一定方向にし
か連結されない特徴がある。この様な制限酵素としては
他に、ＡｆＬＩＩＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩ
Ｉ、ＨｇｉＡＩなどがある。ＡＢドメインの遺伝子の合
成法は図２に示したＰＣＲ法に限定されるものでなく、
数十塩基からなるオリゴヌクレオチドに分割してＤＮＡ
合成機により合成し、それらをＴ４ＤＮＡリガーゼによ
って順に連結していくことによっても得られる。この場
合は大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適
コドンを用いた遺伝子の塩基配列を用いることは当業者
によって一般的に行われている。
【００１３】発現ベクターとしては、ｔｒｐプロモータ
と、クローニング部位としてＡｃｃＩサイトを持ち、大
腸菌で高発現させるために、Ｎ末端アミノ酸のＭｅｔの
次のアミノ酸をＬｙｓとし、そのコドンをＡＡＡとし
て、いわゆるＡＴＧベクター（ｐＴＲＰＡＣＣ）を作製
した。この発現べクターに上記プロテインＡのＡＢドメ
インの遺伝子を基本単位として、それらが１個から６個
連結されたものを挿入した。ＰＣＲ反応は、ｐＲＩＴ２
ＴをＨｉｎｃＩＩで切断したものを鋳型とし、センスプ
ライマーとして、５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡ−３’（図３、ＰＲＯＴ
Ｓ）を、アンチセンスプライマーとして、５’−ＧＧＴ
ＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴ
ＴＡ−３’（図３、ＰＰＯＴＡＳ）を用い、Ｔａｑポリ
メラーゼ（２．５単位）を用いて、９４℃、１分、５０
℃、１分、７２℃、５分を３０サイクル行って、目的の
ＡＢドメインの遺伝子を増幅した。発現べクターも同様
のＰＣＲ反応を利用して、クローニング部位を導入し
た。この場合に用いたセンスプライマー（ＡＣＣＳ）及
びアンチセンスプライマー（ＡＣＣＡＳ）は、図３に示
すとおりである。
と、クローニング部位としてＡｃｃＩサイトを持ち、大
腸菌で高発現させるために、Ｎ末端アミノ酸のＭｅｔの
次のアミノ酸をＬｙｓとし、そのコドンをＡＡＡとし
て、いわゆるＡＴＧベクター（ｐＴＲＰＡＣＣ）を作製
した。この発現べクターに上記プロテインＡのＡＢドメ
インの遺伝子を基本単位として、それらが１個から６個
連結されたものを挿入した。ＰＣＲ反応は、ｐＲＩＴ２
ＴをＨｉｎｃＩＩで切断したものを鋳型とし、センスプ
ライマーとして、５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡ−３’（図３、ＰＲＯＴ
Ｓ）を、アンチセンスプライマーとして、５’−ＧＧＴ
ＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴ
ＴＡ−３’（図３、ＰＰＯＴＡＳ）を用い、Ｔａｑポリ
メラーゼ（２．５単位）を用いて、９４℃、１分、５０
℃、１分、７２℃、５分を３０サイクル行って、目的の
ＡＢドメインの遺伝子を増幅した。発現べクターも同様
のＰＣＲ反応を利用して、クローニング部位を導入し
た。この場合に用いたセンスプライマー（ＡＣＣＳ）及
びアンチセンスプライマー（ＡＣＣＡＳ）は、図３に示
すとおりである。
【００１４】ライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（３５０単位）を用いて、１４℃、１６時間行った。
この反応生成物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ
ｌ，ｅｎｄＡｌ，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡｌ，λ−，Δ（ｌａｃ−ｐ
ｒｏＡＢ），［Ｆ’，ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａ
ｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５］）の形質転換を行った後、
受容菌を寒天０．７％およびアンピシリンを１ｍｌ当た
り１００μｇ含む寒天培地（組成：１リットル当たりト
リプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ｐ
Ｈ７．４）と混合した後、寒天１．５％およびアンピシ
リンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬ寒天培地のプレー
ト上に重層して３７℃にて一昼夜培養を行い、アルカリ
ーＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、アガロー
スゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡ断片が挿入され
たクローンを選択した。また、得られたプラスミドＤＮ
ＡをＡｃｃＩで部分消化することにより、何単位のプロ
テインＡのＡＢドメインの遺伝子が挿入されているかを
調べ、１個から６個連結されたものをそれぞれ、ｐＴＲ
Ｐ−ＰＲＯＴ−ＡＢＩからｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢＶ
Ｉと名付けた。
ゼ（３５０単位）を用いて、１４℃、１６時間行った。
この反応生成物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ
ｌ，ｅｎｄＡｌ，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡｌ，λ−，Δ（ｌａｃ−ｐ
ｒｏＡＢ），［Ｆ’，ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａ
ｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５］）の形質転換を行った後、
受容菌を寒天０．７％およびアンピシリンを１ｍｌ当た
り１００μｇ含む寒天培地（組成：１リットル当たりト
リプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ｐ
Ｈ７．４）と混合した後、寒天１．５％およびアンピシ
リンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬ寒天培地のプレー
ト上に重層して３７℃にて一昼夜培養を行い、アルカリ
ーＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、アガロー
スゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡ断片が挿入され
たクローンを選択した。また、得られたプラスミドＤＮ
ＡをＡｃｃＩで部分消化することにより、何単位のプロ
テインＡのＡＢドメインの遺伝子が挿入されているかを
調べ、１個から６個連結されたものをそれぞれ、ｐＴＲ
Ｐ−ＰＲＯＴ−ＡＢＩからｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢＶ
Ｉと名付けた。
【００１５】
【（２）形質転換大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＲＰ−ＰＲＯ
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩの培養】プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲＯ
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９をア
ンピシリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬＢ培地中、
３７℃で２４時間培養した。このようにして得た菌体は
−２０℃で凍結保存した。
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩの培養】プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲＯ
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９をア
ンピシリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬＢ培地中、
３７℃で２４時間培養した。このようにして得た菌体は
−２０℃で凍結保存した。
【００１６】
【（３）菌の粉砕と各マーカー蛋白質の精製】凍結して
あった菌体を室温で融解した後、菌体の３倍量の０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより
菌を破砕した。これに１／５０容量の１０％ Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸを加え、０℃で１５分間撹拌した後、１５，０
００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心し、その遠心上清に硫
安を加えて３０％飽和にし、さらにその遠心上清に硫安
を加えて６０％飽和にして遠心し、３０−６０％飽和硫
安沈澱画分を得た。これを少量の緩衝液Ａ（０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５）に
溶解し、セファデックスＧ−２５カラムで脱塩後、緩衝
液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムにアプ
ライした。目的蛋白質はこの条件でＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着する。緩衝液Ａでカラムを十分洗浄後、０−
１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質
は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡにより検出した。目的蛋白質画分を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＩｇＧセファ
ロースカラムにアプライし、同緩衝液で十分カラムを洗
浄後、０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．４）
で溶出した。溶出画分を８０％飽和硫安で沈澱させ、少
量の緩衝液Ａで溶解後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化されたＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷカラムによる高速分子篩クロマトグ
ラフィにかけた。このようにして得られた画分はＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し
た。下記の表１に各連結蛋白質におけるＡＢドメインの
連結数とその分子量についてまとめた。ＡＢドメイン１
個は１１６アミノ酸からなり、その分子量は１３２０
５．２４である。各連結蛋白質のＮ末端にはＭｅｔＬｙ
ｓＶａｌＡｓｐの４アミノ酸がついており、Ｃ末端には
ＴｈｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｈｅＴｈｒＴｈｒＳｅｒの
８アミノ酸がついている。また各ＡＢドメインはＶａｌ
Ａｓｐの２アミノ酸で連結されている。
あった菌体を室温で融解した後、菌体の３倍量の０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより
菌を破砕した。これに１／５０容量の１０％ Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸを加え、０℃で１５分間撹拌した後、１５，０
００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心し、その遠心上清に硫
安を加えて３０％飽和にし、さらにその遠心上清に硫安
を加えて６０％飽和にして遠心し、３０−６０％飽和硫
安沈澱画分を得た。これを少量の緩衝液Ａ（０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５）に
溶解し、セファデックスＧ−２５カラムで脱塩後、緩衝
液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムにアプ
ライした。目的蛋白質はこの条件でＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着する。緩衝液Ａでカラムを十分洗浄後、０−
１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質
は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡにより検出した。目的蛋白質画分を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＩｇＧセファ
ロースカラムにアプライし、同緩衝液で十分カラムを洗
浄後、０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．４）
で溶出した。溶出画分を８０％飽和硫安で沈澱させ、少
量の緩衝液Ａで溶解後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化されたＴＳＫｇｅ
ｌ Ｇ３０００ＳＷカラムによる高速分子篩クロマトグ
ラフィにかけた。このようにして得られた画分はＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示し
た。下記の表１に各連結蛋白質におけるＡＢドメインの
連結数とその分子量についてまとめた。ＡＢドメイン１
個は１１６アミノ酸からなり、その分子量は１３２０
５．２４である。各連結蛋白質のＮ末端にはＭｅｔＬｙ
ｓＶａｌＡｓｐの４アミノ酸がついており、Ｃ末端には
ＴｈｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｈｅＴｈｒＴｈｒＳｅｒの
８アミノ酸がついている。また各ＡＢドメインはＶａｌ
Ａｓｐの２アミノ酸で連結されている。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【（４）固定化担体の作製】担体（臭化シアン活性化セ
ファロース４Ｂ：ファルマシア社製）０．３ｇをカラム
中にて１ｍＭ ＨＣｌ中で１５分間膨潤しゲル化させ
た。次いで１ｍＭ ＨＣｌを用いてこれを洗浄した（乾
燥ゲル１ｇあたり２００ｍｌ）。更に、カップリングバ
ッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．３）−
０．５Ｍ ＮａＣｌ）で、これを洗浄した（乾燥ゲル１
ｇあたり５ｍｌ）。一方、カップリングバッファーにリ
ガンド蛋白質（前項で作製した組換え型プロテインＡ：
ＡＢドメインのくり返し数１〜６（すなわち、ＰＲＯＴ
ＡＢ1‐6）；なお対照として、天然型プロテインＡ（市
販品）を溶解しておき、これを上記ゲルに、ゲル１ｍ
ｌ：バッファー２ｍｌの割合で懸濁し、これを４℃で一
昼夜振動混合した。次いでブロッキング試薬（０．２Ｍ
グリシン（ｐＨ８．０））を加え、室温に２時間保持し
た後、カラムを、カップリングバッファー、０．１Ｍ
酢酸バッファー（ｐＨ４）−０．５Ｍ ＮａＣｌ、次い
でカップリングバッファーの順序で洗浄して、各種組換
え型プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムを
それぞれ作製した。なお、いずれのプロテインＡも担体
への結合率は良く、例えばＰＲＯＴ−ＡＢ4の担体への
結合率は約９５％であった。
ファロース４Ｂ：ファルマシア社製）０．３ｇをカラム
中にて１ｍＭ ＨＣｌ中で１５分間膨潤しゲル化させ
た。次いで１ｍＭ ＨＣｌを用いてこれを洗浄した（乾
燥ゲル１ｇあたり２００ｍｌ）。更に、カップリングバ
ッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ８．３）−
０．５Ｍ ＮａＣｌ）で、これを洗浄した（乾燥ゲル１
ｇあたり５ｍｌ）。一方、カップリングバッファーにリ
ガンド蛋白質（前項で作製した組換え型プロテインＡ：
ＡＢドメインのくり返し数１〜６（すなわち、ＰＲＯＴ
ＡＢ1‐6）；なお対照として、天然型プロテインＡ（市
販品）を溶解しておき、これを上記ゲルに、ゲル１ｍ
ｌ：バッファー２ｍｌの割合で懸濁し、これを４℃で一
昼夜振動混合した。次いでブロッキング試薬（０．２Ｍ
グリシン（ｐＨ８．０））を加え、室温に２時間保持し
た後、カラムを、カップリングバッファー、０．１Ｍ
酢酸バッファー（ｐＨ４）−０．５Ｍ ＮａＣｌ、次い
でカップリングバッファーの順序で洗浄して、各種組換
え型プロテインＡを固定化した担体を充填したカラムを
それぞれ作製した。なお、いずれのプロテインＡも担体
への結合率は良く、例えばＰＲＯＴ−ＡＢ4の担体への
結合率は約９５％であった。
【００１９】
【（５）ＩｇＧの分離精製】ウサギの血清２ｍｌにバッ
ファーＡ（０．１Ｍ Ｎａ−Ｐｉ（ｐＨ７．０））４ｍ
ｌを加えて希釈した後、濾過、滅菌処理し、これを前項
で調製した各カラムにそれぞれ添加した。次いでバッフ
ァーＡを各カラムに１０ｍｌずつ流した後、溶離液とし
てバッファーＢ（０．３Ｍ ＫＣｌ−ＨＣｌ（ｐＨ２．
３））を流して溶離処理を行い、１ｍｌずつ分画操作し
てそれぞれＡ２８０及びＥＬＩＳＡ法によるＡ４９２の
吸光度で蛋白質及びＩｇＧ量を測定した。その結果、カ
ラム１ｍｌに吸着して溶離してきたＩｇＧ量１１．１ｍ
ｇのＩｇＧを得た。なお、ＰＲＯＴ−ＡＢ4のアフィニ
ティクロマトグラフィの結果を図４に示したが、これか
らも明らかなように、フラクションナンバー２０前後に
おいて、精製ＩｇＧが溶離されていることがわかる。
ファーＡ（０．１Ｍ Ｎａ−Ｐｉ（ｐＨ７．０））４ｍ
ｌを加えて希釈した後、濾過、滅菌処理し、これを前項
で調製した各カラムにそれぞれ添加した。次いでバッフ
ァーＡを各カラムに１０ｍｌずつ流した後、溶離液とし
てバッファーＢ（０．３Ｍ ＫＣｌ−ＨＣｌ（ｐＨ２．
３））を流して溶離処理を行い、１ｍｌずつ分画操作し
てそれぞれＡ２８０及びＥＬＩＳＡ法によるＡ４９２の
吸光度で蛋白質及びＩｇＧ量を測定した。その結果、カ
ラム１ｍｌに吸着して溶離してきたＩｇＧ量１１．１ｍ
ｇのＩｇＧを得た。なお、ＰＲＯＴ−ＡＢ4のアフィニ
ティクロマトグラフィの結果を図４に示したが、これか
らも明らかなように、フラクションナンバー２０前後に
おいて、精製ＩｇＧが溶離されていることがわかる。
【００２０】各組換え型プロテインＡ及び市販の天然型
プロテインＡについて、ＩｇＧの結合容量の測定結果を
図５に示す。この結果から明らかなように、組換え型プ
ロテインＡはＩｇＧ結合ドメインの連結数の増加に伴っ
てＩｇＧ結合容量が増し、例えばＰＲＯＴ−ＡＢ4は対
照の約３５％も結合容量が高く、精製純度が非常に高く
なることが実証された。また、ＰＲＯＴ−ＡＢ4 セフ
ァロースカラムによって精製されたウサギＩｇＧを４μ
ｇの割合でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、得られたパ
ターンを図６に示した。図中１は分子量マーカー、２は
ウサギの抗ヒトＣＲＰ血清（８μｇ）、３は精製ＩｇＧ
（４μｇ）を示すが、図６から明らかなように、目的と
するＩｇＧが集中して分離されたこと、つまりきわめて
高度に精製されたことが、これによってもはっきりと実
証された。なお本実施例におけるＥＬＩＳＡ法では、１
次抗体は用いず、２次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体を用いて行った。
プロテインＡについて、ＩｇＧの結合容量の測定結果を
図５に示す。この結果から明らかなように、組換え型プ
ロテインＡはＩｇＧ結合ドメインの連結数の増加に伴っ
てＩｇＧ結合容量が増し、例えばＰＲＯＴ−ＡＢ4は対
照の約３５％も結合容量が高く、精製純度が非常に高く
なることが実証された。また、ＰＲＯＴ−ＡＢ4 セフ
ァロースカラムによって精製されたウサギＩｇＧを４μ
ｇの割合でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、得られたパ
ターンを図６に示した。図中１は分子量マーカー、２は
ウサギの抗ヒトＣＲＰ血清（８μｇ）、３は精製ＩｇＧ
（４μｇ）を示すが、図６から明らかなように、目的と
するＩｇＧが集中して分離されたこと、つまりきわめて
高度に精製されたことが、これによってもはっきりと実
証された。なお本実施例におけるＥＬＩＳＡ法では、１
次抗体は用いず、２次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ抗体を用いて行った。
【００２１】
【実施例２】実施例１と同様にして、プロテインＡのＤ
ドメインを用いて各種の連結蛋白質を調製した。その結
果を下記の表２に示す。表２は、Ｄドメインを単位とし
た場合の連結数と各連結蛋白質の分子量についてまとめ
たものである。
ドメインを用いて各種の連結蛋白質を調製した。その結
果を下記の表２に示す。表２は、Ｄドメインを単位とし
た場合の連結数と各連結蛋白質の分子量についてまとめ
たものである。
【００２２】
【表２】
【００２３】これらの各組換え型プロテインＡも、ＡＢ
ドメインに係る実施例１の場合と同様に、すぐれたＩｇ
Ｇ精製能を有していた。
ドメインに係る実施例１の場合と同様に、すぐれたＩｇ
Ｇ精製能を有していた。
【００２４】上記結果から明らかなように、本発明によ
れば各種分子量を有する濃縮蛋白質を目的に応じて自由
に調製することができる。またプロテインＡのＩｇＧ結
合ドメインには上記したＡ、Ｂ、Ｄのほか、Ｅ、Ｃがあ
るので（これのアミノ酸配列は図１に示した）、上記し
たと同様の手法によって、Ｅ、Ｃのドメインについて
も、目的とする連結蛋白質を同種又は異種のドメインの
間で自由に調製することができ、ＩｇＧを高度に精製す
ることができる。
れば各種分子量を有する濃縮蛋白質を目的に応じて自由
に調製することができる。またプロテインＡのＩｇＧ結
合ドメインには上記したＡ、Ｂ、Ｄのほか、Ｅ、Ｃがあ
るので（これのアミノ酸配列は図１に示した）、上記し
たと同様の手法によって、Ｅ、Ｃのドメインについて
も、目的とする連結蛋白質を同種又は異種のドメインの
間で自由に調製することができ、ＩｇＧを高度に精製す
ることができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明は、遺伝子工学の手法を利用する
ことによってＩｇＧ精製能にすぐれたプロテインＡを製
造するものであって、各ドメインを選択、結合すること
によって目的とする正確な分子量を有する連結蛋白質を
自由に工業的に製造することができ、これらは、いずれ
も、天然型のプロテインＡに比して卓越したＩｇＧ分離
精製能を示すものである。
ことによってＩｇＧ精製能にすぐれたプロテインＡを製
造するものであって、各ドメインを選択、結合すること
によって目的とする正確な分子量を有する連結蛋白質を
自由に工業的に製造することができ、これらは、いずれ
も、天然型のプロテインＡに比して卓越したＩｇＧ分離
精製能を示すものである。
【００２６】したがって本発明によれば、バイオテクノ
ロジーの各分野において重要な役割を果しているＩｇＧ
を効率よく分離精製することができ、精製された高純度
のＩｇＧを効率的に製造することができる。また、本発
明によれば、試料からＩｇＧのみを選択的に分離除去す
ることができるし、更にまた本発明は、試料中のＩｇＧ
の正確且つ簡便なバイオアッセイにも利用することがで
きる。
ロジーの各分野において重要な役割を果しているＩｇＧ
を効率よく分離精製することができ、精製された高純度
のＩｇＧを効率的に製造することができる。また、本発
明によれば、試料からＩｇＧのみを選択的に分離除去す
ることができるし、更にまた本発明は、試料中のＩｇＧ
の正確且つ簡便なバイオアッセイにも利用することがで
きる。
【図１】プロテインＡの５つのＩｇＧ結合ドメイン
（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）のアミノ酸配列を比較した図で
あり、図中、５種の間で完全に一致しない部分につい
て、共通でないアミノ酸にアンダーラインを示した。
（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）のアミノ酸配列を比較した図で
あり、図中、５種の間で完全に一致しない部分につい
て、共通でないアミノ酸にアンダーラインを示した。
【図２】本発明に係る発現プラスミドの構築図である。
【図３】ＰＣＲ法でプロテインＡのＡＢドメインの遺伝
子を増幅するための２種のプライマー（ＰＲＯＴＳ、Ｐ
ＲＯＴＡＳ）および、発現ベクターに開始コドンとＡｃ
ｃＩサイトを導入するための２種のプライマー（ＡＣＣ
Ｓ，ＡＣＣＡＳ）の塩基配列である。
子を増幅するための２種のプライマー（ＰＲＯＴＳ、Ｐ
ＲＯＴＡＳ）および、発現ベクターに開始コドンとＡｃ
ｃＩサイトを導入するための２種のプライマー（ＡＣＣ
Ｓ，ＡＣＣＡＳ）の塩基配列である。
【図４】ＰＲＯＴ−ＡＢ4 セファロース カラム上に
おけるウサギ抗ヒトＣＲＰ抗体のアフィニティクロマト
グラムである（○：蛋白質、△：ＩｇＧ）。
おけるウサギ抗ヒトＣＲＰ抗体のアフィニティクロマト
グラムである（○：蛋白質、△：ＩｇＧ）。
【図５】６種の組換え型プロテインＡによるウサギ抗血
清由来ＩｇＧの結合容量を示したグラフである。
清由来ＩｇＧの結合容量を示したグラフである。
【図６】ＰＲＯＴ−ＡＢ4 セファロース カラムによ
って精製されたウサギＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ パタ
ーンである（１：分子量マーカー、２：ウサギ抗血清、
３：精製ＩｇＧ）。
って精製されたウサギＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ パタ
ーンである（１：分子量マーカー、２：ウサギ抗血清、
３：精製ＩｇＧ）。
Claims (1)
- 【請求項１】 プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインＡＢ
を単位とし、このＡＢドメインを４個連結してなること
を特徴とするＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3235687A JP2584697B2 (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ |
| EP92916247A EP0550771B1 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-binding artificial protein |
| EP97122254A EP0863210A3 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-binding artificial protein |
| DE69230061T DE69230061T2 (de) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Künstliches immunoglobulin-bindendes protein |
| PCT/JP1992/000938 WO1993002107A1 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-combining artificial protein |
| US08/406,809 US5580788A (en) | 1991-07-25 | 1995-03-20 | Use of immunoglogulin-binding artificial proteins as molecular weight markers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3235687A JP2584697B2 (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0551399A JPH0551399A (ja) | 1993-03-02 |
| JP2584697B2 true JP2584697B2 (ja) | 1997-02-26 |
Family
ID=16989731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3235687A Expired - Lifetime JP2584697B2 (ja) | 1991-07-25 | 1991-08-23 | ＩｇＧ精製用組換え型プロテインＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2584697B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656427A (en) * | 1994-08-29 | 1997-08-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid |
| GB9823071D0 (en) * | 1998-10-21 | 1998-12-16 | Affibody Technology Ab | A method |
| US8597908B2 (en) * | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JP5345539B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2013-11-20 | ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー | 抗体単離のためのスタフィロコッカスアウレウス由来のドメインｃを含むクロマトグラフィーリガンド |
| WO2008143199A1 (ja) | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Nomadic Bioscience Co., Ltd. | 新規ポリペプチド，アフィニティークロマトグラフィー用材，及びイムノグロブリンの分離及び／又は精製方法 |
| JP5917417B2 (ja) * | 2010-03-05 | 2016-05-11 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗体の選択的強化 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59113890A (ja) * | 1982-10-27 | 1984-06-30 | レプリゲン・コ−ポレ−シヨン | プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 |
-
1991
- 1991-08-23 JP JP3235687A patent/JP2584697B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59113890A (ja) * | 1982-10-27 | 1984-06-30 | レプリゲン・コ−ポレ−シヨン | プロテインａ様物質の遺伝子及び該遺伝子含有微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0551399A (ja) | 1993-03-02 |
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