CN113603758B - 一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用 - Google Patents

一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用。本发明草地贪夜蛾SoxC基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次在草地贪夜蛾中克隆出SoxC基因，并获得了草地贪夜蛾SoxC基因的DNA全长序列，SoxC基因的蛋白序列，并且将原核表达纯化的草地贪夜蛾SoxC基因蛋白制备了多克隆抗体，可特异性地从草地贪夜蛾体内检测出SoxC基因的蛋白。本发明纯化出的草地贪夜蛾SoxC基因多可隆抗体可用于草地贪夜蛾不同发育时期其体内SoxC基因蛋白表达含量的检测，明确该基因的表达动态，预测该基因的重要生物学功能；同时本发明的SoxC基因在控制草地贪夜蛾羽化中起到重要作用。

Description

一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用。
背景技术
草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda属鳞翅目夜蛾科，别名秋粘虫。杂食性，是玉米、高粱、小麦、大麦、牧草等多种农作物上的重要害虫。原产于南美洲与北美洲的南部与中部，目前该害虫已经在逐渐传播至中国多个省区市。草地贪夜蛾对农业生产具有重大威胁。已经报道该害虫对多种药剂已经有较高的抗药性，目前农业生产上的草地贪夜蛾防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。
昆虫SoxC基因是一个重要调控基因，它是蜕皮激素信号早期响应基因，参与蜕皮激素信号的下游传导。以昆虫变态发育调控关键基因为靶标防治昆虫是一种害虫防控新兴方法。目前草地贪夜蛾中SoxC基因尚未有研究报道，基因的作用也不清楚，从体外获得的重组SoxC基因也无研究。因此克隆草地贪夜蛾SoxC基因基因序列并且获得体外重组蛋白并制备多克隆抗体，对深入研究该基因的功能并进一步开发其抑制剂有着重要的理论意义和实践作用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种草地贪夜蛾SoxC基因(Sf-SoxC)的DNA序列，该基因在昆虫羽化过程中起到重要作用，通过将草地贪夜蛾SoxC基因敲除，草地贪夜蛾羽化异常并最终死亡，达到防治草地贪夜蛾的作用。
本发明还提供了一种Sf-SoxC蛋白、含编码Sf-SoxC的DNA序列的重组表达载体和转基因重组菌株以及应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述草地贪夜蛾SoxC基因其编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述含有用于编码草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列的重组表达载体。
其中，将所述DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达草地贪夜蛾SoxC基因的重组表达载体。
作为优选，所述大肠杆菌表达载体为pET32a。
本发明所述的含草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列的转基因重组菌株。
其中，所述重组菌株是将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌株。
作为优选，所述的大肠杆菌为BL21(DE3)。
本发明所述的草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列在生产草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白中的应用。
其中，所述草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白的制备，包括以下步骤：
(1)草地贪夜蛾SoxC基因基因的扩增；
(2)草地贪夜蛾SoxC基因基因原核表达载体构建；
(3)草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白的变性和复性；
(4)草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白的纯化即得到草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白。
本发明所述的草地贪夜蛾SoxC基因原核表达蛋白在制备草地贪夜蛾SoxC基因的多克隆抗体中的应用。
进一步地，将上述得到的草地贪夜蛾SoxC基因蛋白采用抗原亲和纯化法获得针对Sf-SoxC蛋白特异性肽链多克隆抗体。
本发明所述的草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列在控制草地贪夜蛾羽化中的应用。
本发明所述草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列在制备控制草地贪夜蛾羽化防治草地贪夜蛾的药物或者试剂中的应用。
具体地，所述草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列作为调控/防治靶点在制备控制草地贪夜蛾羽化防治草地贪夜蛾的药物或者试剂中的应用。
本发明首次在草地贪夜蛾中克隆并鉴定到SoxC基因，并构建了其原核表达载体，获得了原核表达蛋白，制备了多克隆抗体；用于后续该基因表达动态检测分析；同时发现了其在草地贪夜蛾羽化过程中功能研究中的应用，本发明利用基因编辑技术(CRISPR/Cas9)将草地贪夜蛾SoxC基因敲除，观察试虫的生长发育表型，草地贪夜蛾羽化异常最终死亡，说明草地贪夜蛾SoxC基因在控制草地贪夜蛾羽化最终杀死草地贪夜蛾中起到重要作用。本发明的草地贪夜蛾SoxC基因可以作为防治靶点应用在制备防治草地贪夜蛾药物和试剂中，通过导致草地贪夜蛾羽化异常实现杀灭草地贪夜蛾的目的。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次获得了草地贪夜蛾SoxC基因的DNA全长序列、草地贪夜蛾SoxC基因的蛋白序列；并将原核表达纯化的草地贪夜蛾SoxC基因蛋白应用于免疫家兔后制备了多克隆抗体，可特异性地从草地贪夜蛾体内检测出SoxC基因的蛋白。本发明纯化出的草地贪夜蛾SoxC基因多可隆抗体可用于草地贪夜蛾不同发育时期其体内SoxC基因蛋白表达含量的检测，明确该基因的表达动态，预测该基因的重要生物学功能。同时应用本发明，可为深入研究该基因参与昆虫变态发育的调控机理等研究提供研究基础和技术支撑。
本发明利用基因编辑技术(CRISPR/Cas9)将草地贪夜蛾SoxC基因敲除，观察试虫的生长发育表型，草地贪夜蛾羽化异常最终死亡，说明草地贪夜蛾SoxC基因在控制草地贪夜蛾羽化最终杀死草地贪夜蛾中起到重要作用。本发明草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列可以应用在制备控制草地贪夜蛾羽化防治草地贪夜蛾的药物或者试剂中。
附图说明
图1为草地贪夜蛾SoxC基因基因全长序列的PCR扩增电泳图。泳道M：为2000bp的DNA maker，泳道1：草地贪夜蛾SoxC基因基因PCR扩展产物。
图2为pET32a-SFSOXC-1原核诱导表达的SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白质分子质量标准；泳道1：空载体pET32a诱导表达；泳道2：未诱导菌株总蛋白；泳道3：诱导后菌株总蛋白；泳道4：诱导菌株经超声破碎后离心的上清液；泳道5：诱导菌株经超声破碎后离心的沉淀(箭头指示)。
图3为纯化后的pET32a-SFSOXC-1原核表达蛋白产物SDS-PAGE电泳图。泳道M：蛋白质分子质量标准；泳道1：诱导菌株经超声破碎后未纯化蛋白；泳道2：纯化洗脱过程中的流出液；泳道3-4：纯化洗脱的靶标蛋白(箭头指示)。
图4为草地贪夜蛾SoxC基因被敲除后，试虫羽化异常，蛹壳无法完全脱离，草地贪夜蛾死亡。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
草地贪夜蛾SoxC基因基因的获得
采用TRIzol法提取草地贪夜蛾总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8～2.0之间的总RNA样品进行反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：2μg总RNA，4μl 5×PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix，2μl Random 6mers(50μM)，最后加超纯水至20μl(TaRaKa公司产品)。PCR反应参数为：30℃10min，42℃20min，70℃15min。合成好的cDNA于-20℃保存备用。
根据草地贪夜蛾基因组序列，设计适用于PCR扩增引物SOX-F(5′-ATGGTGCCCCAACAAGTGTCGGATGT-3′)及SOX-R(5′-CTAAGACGACGTCAGATACGATGAGA-3′)，获得草地贪夜蛾SoxC基因完整DNA序列，该DNA序列参见序列表中的SEQ ID NO.1。PCR反应体系为：25μl Premix Ex Taq Hot Start Version，2μl 10μM上游引物SOX-F，2μl 10μM下游引物SOX-R，cDNA模板2μl，最后加超纯水至50μl(TaRaKa公司产品)。PCR反应参数为：95℃3min；98℃10s，56℃30s，72℃1min，运行35个循环；最后72℃10min。电泳结果显示PCR扩增分别得到约840bp的条带(图1)。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离并胶回收纯化目的DNA，与pGEM-T3载体(北京全式金生物技术有限公司)进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液，送样测序确认序列正确后进行下一步表达载体的构建。
结论：草地贪夜蛾SoxC基因基因ORF框含有840个碱基，编码280个氨基酸，预测分子量31.18kDa。
实施例2
草地贪夜蛾SoxC基因基因原核表达载体的构建
草地贪夜蛾SoxC基因基因原核表达载体构建方法：将上述实施例1测序正确的PCR产物通过克隆位点Nde I和Xho I连入表达载体pET32a。通过酶切验证是否形成重组质粒。酶切体系为：2种限制性内切酶(Nde I和Xba I)各0.25μl，10×Buffer缓冲液1.0μl，质粒3μl，用超纯水补足至10μl，37℃水浴3h。连接产物转化大肠杆菌TOP10(北京全式金生物技术有限公司)后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pET32a-SFSOXC-1转化到100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，置冰上20min，42℃热激90s，迅速至冰中5min，加入600μl LB培养液振摇一个小时，离心后涂布到含卡那霉素(50μg/mL)的平板上，37℃倒置培养过夜；从转化后培养过夜的平板上挑单克隆到3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按体积比1％的比例接种到LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃摇床(250rpm)振摇至菌液的OD600达到0.6-0.8之间(约2h)。取出1ml培养菌液，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀作为诱导前的对照样品；剩余的培养菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mM，37℃250rpm振摇约4h，诱导靶标载体融合蛋白表达得到培养菌液；取出1ml培养菌液，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE电泳检测(图2)。
结论：经37℃，0.4mM IPTG诱导4h后草地贪夜蛾SoxC基因基因可在pET32a载体中进行高效表达，主要以包涵体形式存在。
实施例3
草地贪夜蛾SoxC基因融合蛋白变性、复性及蛋白的纯化
对实施例2中所述的包涵体蛋白进行变性处理：取上述实施例2最后菌液10毫升，4000g、4℃离心15min，弃上清，PBS洗涤菌体2次后PBS重悬，超声破碎细胞(功率400W，工作4s，间歇8s，共20min)，12000g、4℃离心30min，保留沉淀包涵体，加入60mL结合缓冲液(6M盐酸胍、100mM Tris、300mM NaCl、pH8.0)，重悬包涵体，搅拌溶解，16000g、4℃离心30min，保留上清；随后分别加入以下缓冲液进行洗脱(缓冲液A：6M盐酸胍、100mM Tris、300mM NaCl、pH8.0；缓冲液B：8M尿素、100mM Tris、300mM NaCl、pH8.0；缓冲液C：8M尿素、100mM Tris、300mM NaCl、不同浓度咪唑、pH8.0)；然后用10倍于柱床体积的Binding buffer(20mM pH7.9的Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl)清洗平衡柱子，流速为60ml/h；再将上清上柱，流速为45ml/h，收集穿透液，用10倍于柱床体积的Binding buffer(20mM pH 7.9的Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl)清洗柱子，流速为60ml/h；最后用Eultion Buffer(pH＝8.0的TE洗脱液)洗脱，流速为45ml/h，收集包含目标蛋白的洗脱液。
包涵体蛋白的复性：复性缓冲液包含的成分为55mM Tris、50mM NaCl、0.88mMKCl、0.77M尿素、0.44M精氨酸、0.05％PEG4000、2mM谷胱甘肽(GSH)、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)。包涵体蛋白样品(包含目标蛋白的洗脱液)加入终浓度为0.3％十二烷基肌胺酸钠(SKL)在复性缓冲液缓慢透析(透析袋规格14KD)，逐步去除变性剂，最终于PBS(pH7.4)中4℃过夜透析(透析袋规格14KD)。最后，将复性得到的蛋白溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)中，得到纯化的蛋白，取适量样品进行12％SDS-PAGE电泳检测(图3)。蛋白浓度利用Eppendorf公司生产的核酸蛋白检测仪测定。
结论：通过变复性的方式，重溶，纯化获得靶标蛋白，电泳检测目标条带清晰可见。
实施例4
草地贪夜蛾SoxC基因多克隆抗体制作
动物免疫：将实施例3纯化获得的表达纯化的靶标蛋白免疫2只新西兰白兔(2-2.5KG)，皮下注射免疫400μg/次，2周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1:50000进行采血制备抗血清，并准备纯化。抗体纯化：将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
结论：获得高质量的草地贪夜蛾SoxC基因多克隆抗体，抗体纯化后纯度在90％以上。
实施例5
草地贪夜蛾SoxC基因敲除后的表型
利用CRISPR/Cas9技术对草地贪夜蛾SoxC基因进行敲除。
步骤(1)：根据CRISPR/Cas9技术体系的基本原则，设计草地贪夜蛾SoxC基因的敲除靶位点，包括两个敲除靶位点，以SoxC基因为模板设计合成敲除靶位点sgRNA的引物序列为(SEQ ID NO.3-5)：SFsg-F1：5’-TAATACGACTCACTATAGGGGCCTGTACTTGTAGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA-3’(第一个靶位点上游引物)，SFsg-F2：5’-TAATACGACTCACTATAGGCAACACCCCTGTTGTTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA-3(第二个靶位点上游引物)’和SFsg-R：5’AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTC-3’(靶位点共用下游引物)，以提取的草地贪夜蛾基因组DNA为模板，扩增反应为50μl体系，扩增程序为：98℃10s，55℃15s，68℃15s，累计35个循环；最后72℃10min。所用的扩增反应试剂盒为PrimeSTARGXL Premix(TakaRa公司产品)。得到的PCR扩增产物用MAXIscriptT7 In Vitro Transcription Kit试剂盒体(Invitrogen公司产品)体外合成sgRNA，合成好的sgRNA测定浓度后于-80℃保存备用。
步骤(2)：收集草地贪夜蛾1小时内产的卵，通过显微注射将上述合成的两条sgRNA和Cas9蛋白(Invitrogen公司)的混合液一并注射进每一粒卵中。一共注射200粒卵。进行显微注射时，每条sgRNA的浓度为100ng/ul，Cas9蛋白浓度为300ng/ul，注射量均约为100nl。
步骤(3)：所有注射后的卵粒放于养虫室内(温度27±1℃；光周期14h:10h(明：暗)；相对湿度65±5％)孵化并单头饲养。
步骤(4)：持续观察试虫的生长发育变化，并统计死亡率。结果显示，有169粒卵成功孵化，其中39个个体在幼虫阶段死亡，剩余个体均成功化蛹。化蛹的个体最终只有13个个体羽化正常，其余个体有的在蛹期死亡，有的羽化异常(蛹壳无法完全脱落)并最终死亡(图4)，总体死亡率达90％以上；同时在同样条件正常饲养的非基因敲除品系的草地贪夜蛾试虫死亡率在5％以下。
结论：草地贪夜蛾SoxC基因被敲除后，试虫个体无法正常羽化存活，表明SoxC基因在羽化过程中具有重要作用，该基因具有开发成害虫防控药剂靶标的潜力，可用于开发制备防治控制草地贪夜蛾的药物或者试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种草地贪夜蛾SoxC基因、其编码蛋白、载体、菌株及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgcccc aacaagtgtc ggatgtgagg tccctgtcac caacgtcgag tggagtaccc 60
gtgttcgggt cccagctcgt cgacaaaaat tcatcaaccc catacacgga tgccacacag 120
acaaagaaga acaacccaaa ccacataaag aggccgatga acgcgttcat ggtctggtcg 180
cagatagagc gcaggaaaat atgcgagcag acaccagaca tgcacaacgc ggaaatatcc 240
aagaacctcg gccgcgtgtg gaagacgctc aacgacgagg aacgtcagcc cttcatcgac 300
gaggcggaga ggttgaggca gttgcacatg cgggagtacc ccgactacaa gtacaggccc 360
cgcaagaaaa ccgccaagtc ggacaggtcc gggcctaaga ctggaggcgt gaccaaacca 420
aagcgcaagc aacgcgcaga ctccaataac aacaggggtg ttgccaggcg aagacgacca 480
gttccatcgg tacccagtgt gccagtggaa actcccgcgc ctcctccact accggctagt 540
ccagctggct caccagactc ccctgagtca gcttgcttct acgaagacca caatcgtcgc 600
gagcaggcgg acttaacaga tctctactcc atcaccgacc tgctgccgct ccctgcagac 660
tgcgaagtag acctggaggc cctcacgacg gacatagact cgttcgagac cgcgtcctca 720
tcatcagggt cccactttga gttctcgtgc acgcccgacg tgtcggacat gctcagcgag 780
attggcgtgg cgggcgactg ggtcgaccac acgttctcat cgtatctgac gtcgtcttag 840
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Pro Gln Gln Val Ser Asp Val Arg Ser Leu Ser Pro Thr Ser
1 5 10 15
Ser Gly Val Pro Val Phe Gly Ser Gln Leu Val Asp Lys Asn Ser Ser
20 25 30
Thr Pro Tyr Thr Asp Ala Thr Gln Thr Lys Lys Asn Asn Pro Asn His
35 40 45
Ile Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe Met Val Trp Ser Gln Ile Glu Arg
50 55 60
Arg Lys Ile Cys Glu Gln Thr Pro Asp Met His Asn Ala Glu Ile Ser
65 70 75 80
Lys Asn Leu Gly Arg Val Trp Lys Thr Leu Asn Asp Glu Glu Arg Gln
85 90 95
Pro Phe Ile Asp Glu Ala Glu Arg Leu Arg Gln Leu His Met Arg Glu
100 105 110
Tyr Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro Arg Lys Lys Thr Ala Lys Ser Asp
115 120 125
Arg Ser Gly Pro Lys Thr Gly Gly Val Thr Lys Pro Lys Arg Lys Gln
130 135 140
Arg Ala Asp Ser Asn Asn Asn Arg Gly Val Ala Arg Arg Arg Arg Pro
145 150 155 160
Val Pro Ser Val Pro Ser Val Pro Val Glu Thr Pro Ala Pro Pro Pro
165 170 175
Leu Pro Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Asp Ser Pro Glu Ser Ala Cys
180 185 190
Phe Tyr Glu Asp His Asn Arg Arg Glu Gln Ala Asp Leu Thr Asp Leu
195 200 205
Tyr Ser Ile Thr Asp Leu Leu Pro Leu Pro Ala Asp Cys Glu Val Asp
210 215 220
Leu Glu Ala Leu Thr Thr Asp Ile Asp Ser Phe Glu Thr Ala Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gly Ser His Phe Glu Phe Ser Cys Thr Pro Asp Val Ser Asp
245 250 255
Met Leu Ser Glu Ile Gly Val Ala Gly Asp Trp Val Asp His Thr Phe
260 265 270
Ser Ser Tyr Leu Thr Ser Ser
275
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg gcctgtactt gtagtcggtt ttagagctag aaatagcaag 60
ttaaaataa 69
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactataggc aacacccctg ttgttatgtt ttagagctag aaatagcaag 60
ttaaaataa 69
<210> 5
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60
gctatttc 68

Claims (4)

1.一种草地贪夜蛾SoxC基因在控制草地贪夜蛾羽化中的应用，所述草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述草地贪夜蛾SoxC基因被敲除。
2.一种草地贪夜蛾SoxC基因在制备防治草地贪夜蛾药物和试剂中的应用，所述草地贪夜蛾SoxC基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述草地贪夜蛾SoxC基因被敲除。
3.一种草地贪夜蛾SoxC基因在控制草地贪夜蛾羽化中的应用，所述基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述草地贪夜蛾SoxC基因被敲除。
4.一种草地贪夜蛾SoxC基因在制备防治草地贪夜蛾药物和试剂中的应用，所述基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述草地贪夜蛾SoxC基因被敲除。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110622998A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 中国农业科学院植物保护研究所 一种蛋白在防治草地贪夜蛾和/或斜纹夜蛾中的应用

Non-Patent Citations (1)

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脊尾白虾蜕皮和性别调控相关基因的鉴定及功能分析;周丽红;《cnki优秀硕士学位论文全文库》;20170215;全文 *

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