JPH09512710A - 組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログ - Google Patents
組換えフィブリン鎖、フィブリンおよびフィブリン−ホモログInfo
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- JPH09512710A JPH09512710A JP7528513A JP52851395A JPH09512710A JP H09512710 A JPH09512710 A JP H09512710A JP 7528513 A JP7528513 A JP 7528513A JP 52851395 A JP52851395 A JP 52851395A JP H09512710 A JPH09512710 A JP H09512710A
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.変異体γ鎖。 2.該γ鎖のC末端部分に認められる2つの保存されたCys残基のうちの最初 の残基のおよその位置とC末端との間の配列中に変異または欠失が生じている請 求項1に記載の変異体γ鎖。 3.ヒトγ鎖のCys残基352および365または非ヒトγ鎖の等価Cys残 基よりなる群から選ばれたCys残基の変異または欠失を有する、請求項2に記 載の変異体γ鎖。 4.γ鎖がヒトγ鎖である請求項1に記載の変異体γ鎖。 5.変異または欠失がヒトγ鎖のアミノ酸166とC末端との間の配列中に生じ ている請求項4に記載の変異体γ鎖。 6.ヒトフィブリン−ホモログを含む組成物であって、該ヒトフィブリン−ホモ ログが請求項4に記載の変異体γ鎖を含む組成物。 7.フィブリン−ホモログを含む組成物であって、該フィブリン−ホモログが請 求項1に記載の変異体γ鎖を含む組成物。 8.フィブリンモノマーまたはフィブリン−ホモログを含む組成物であって、本 質的にフィブリノーゲン、フィブリノーゲンAα鎖、フィブリノーゲンBβ鎖、 フィブリノペプチドAおよびフィブリノペプチドBの少なくとも一つを含まない 組成物。 9.本質的にフィブリノーゲンを含まない請求項8に記載の組成物。 10.フィブリンIまたはフィブリンIIモノマー組成物であって、本質的にフ ィブリノーゲンAα鎖を含まない請求項9に記載の組成物。 11.本質的にAフィブリノペプチドをも含まない請求項10に記載の組成物。 12.desBBフィブリンモノマーまたはフィブリンIIモノマー組成物であ って、本質的にフィブリノーゲンBβ鎖を含まない請求項9に記載の組成物。 13.本質的にBフィブリノペプチドをも含まない請求項12に記載の組成物。 14 該フィブリンモノマーがヒトフィブリンモノマーであり、該フィブリノー ゲン半分子がヒトのものであり、該フィブリノーゲンがヒトフィブリノーゲンで あり、該フィブリノーゲンAα鎖がヒトフィブリノーゲンAα鎖であり、該フィ ブリノーゲンBβ鎖がヒトフィブリノーゲンBβ鎖であり、該フィブリノペプチ ドAがヒトフィブリノペプチドAであり、該フィブリノペプチドBがヒトフィブ リノペプチドBである、請求項8に記載の組成物。 15.フィブリンを含むフィブリンポリマー組成物であって、本質的にフィブリ ノーゲン、フィブリノーゲンAα鎖、フィブリノーゲンBβ鎖、フィブリノペプ チドAおよびフィブリノペプチドBの少なくとも一つを含まない組成物。 16.本質的にフィブリノーゲン、フィブリノーゲンAα鎖およびAフィブリノ ペプチドを含まない請求項15に記載の組成物。 17.本質的にフィブリノーゲン、フィブリノーゲン半分子、フィブリノーゲン Bβ鎖およびBフィブリノペプチドを含まない請求項15に記載の組成物。 18.(1)修飾γ鎖を含むフィブリン−ホモログ組成物、および (2)フィブリノーゲン、フィブリノーゲン−アナログまたはフィブリンモノマー を含む第二成分組成物 からなり、該フィブリン−ホモログが該フィブリノーゲン、フィブリノーゲン− アナログまたはフィブリンモノマーに非共有結合により結合している、フィブリ ン関連混合ポリマー組成物。 19.該フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン−アナロ グまたはフィブリンモノマーがヒトタンパク質である、請求項18に記載のフィ ブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン混合ポリマー組成物。 20.該第二成分組成物がフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログ を含む、請求項18に記載のフィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン混合 ポリマー組成物。 21.該第二成分組成物が本質的にフィブリンモノマーを含まない請求項20に 記載のフィブリン−ホモログおよびフィブリノーゲン混合ポリマー組成物。 22.(1)修飾γ鎖を含むフィブリン−ホモログ組成物、および (2)フィブリノーゲン、フィブリノーゲン−アナログまたはフィブリンモノマー を含む第二成分組成物 からなり、該フィブリン−ホモログが該フィブリノーゲン、フィブリノーゲン− アナログまたはフィブリンモノマーと反応してフィブリンポリマーを生成する、 フィブリンシーラントキット。 23.フィブリン−ホモログ、フィブリノーゲン、フィブリノーゲン−アナログ またはフィブリンモノマーがヒトタンパク質である、請求項22に記載のフィブ リンシーラントキット。 24.該第二成分組成物がフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログ を含む請求項22に記載のフィブリンシーラントキット。 25.該第二成分組成物が本質的にフィブリンモノマーを含まない請求項24に 記載のフィブリンシーラントキット。 26.N末端伸長を有するα鎖をコードする実質的に純粋なヌクレオチド配列で あって、該N末端伸長がAフィブリノペプチドとは異なるヌクレオチド配列。 27.該伸長がトロンビン認識配列を欠く請求項26に記載の配列。 28.請求項27に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該配 列が該配列の発現を制御するプロモーターに機能的に連結している発現ベクター 。 29.コードされたN末端伸長を有するフィブリンα鎖がフィブリンα鎖前駆体 である請求項27に記載のヌクレオチド配列。 30.コードされた前駆体のN末端伸長が、該ヌクレオチド配列が適当な細胞中 で発現されたときにフィブリンα鎖から開裂されるように選択される、請求項2 9に記載のヌクレオチド配列。 31.該フィブリンα鎖がヒトフィブリンα鎖である請求項27に記載のヌクレ オチト配列。 32.N末端伸長を有するβ鎖をコードする実質的に純粋なヌクレオチド配列で あって、該伸長がBフィブリノペプチドとは異なるヌクレオチド配列。 33.該伸長がトロンビン認識配列を欠く請求項32に記載のヌクレオチド配列 。 34.請求項33に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該配 列が該配列の発現を制御するプロモーターに機能的に連結している発現ベクター 。 35.コードされたN末端伸長を有するフィブリンβ鎖がフィブリンβ鎖前駆体 である請求項33に記載のヌクレオチド配列。 36.コードされた前駆体のN末端伸長が、該ヌクレオチド配列が適当な細胞中 で発現されたときにフィブリンα鎖から開裂されるように選択される、請求項3 5に記載のヌクレオチド配列。 37.該フィブリンβ鎖がヒトフィブリンβ鎖である請求項33に記載のヌクレ オチド配列。 38.変異体γ鎖をコードする実質的に純粋なヌクレオチド配列。 39.請求項38に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクターであって、該配 列が該配列の発現を制御するプロモーターに機能的に連結している発現ベクター 。 40.変異または欠失が、非変異γ鎖のC末端部分に認められる2つの保存され たCys残基の最初の位置に対応するおよその位置とC末端との間の配列中に生 じている、請求項38に記載の変異体γ鎖をコードする精製されたヌクレオチド 配列。 41.該変異体γ鎖が、ヒトγ鎖のCys残基352および365または非ヒト γ鎖の等価Cys残基よりなる群から選ばれたCys残基の変異または欠失を有 する、請求項40に記載のヌクレオチド配列。 42.該変異体γ鎖がヒトγ鎖の変異体である請求項38に記載のヌクレオチド 配列。 43.N末端伸長を有するα鎖をコードする実質的に精製したヌクレオチド配列 を含む細胞であって、該N末端伸長はAフィブリノペプチドとは異なり、該配列 は該配列を制御するプロモーターに機能的に連結している細胞。 44.N末端伸長を有するフィブリンβ鎖をコードする実質的に精製したヌクレ オチド配列を含む細胞であって、該N末端伸長はBフィブリノペプチドとは異な り、該配列は該配列を制御するプロモーターに機能的に連結している細胞。 45.変異体γ鎖をコードする実質的に精製したヌクレオチド配列を含む細胞で あって、該配列が該配列の発現を制御するプロモーターに機能的に連結している 細胞。 46.(i)フィブリンα鎖またはN末端伸長を有するフィブリンα鎖をコードす る配列を含む発現ベクター、 (ii)フィブリンβ鎖またはN末端伸長を有するフィブリンβ鎖をコードする配列 を含む発現ベクター、および (iii)γ鎖をコードする配列を含む発現ベクター を含む細胞であって、発現ベクター(i)または(ii)の少なくとも一つがそれぞれ AフィブリノペプチドまたはBフィブリノペプチドと異なるN末端伸長を有する α鎖またはフィブリンβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、各コード配列 (i)〜(iii)が該配列の発現を制御するプロモーターに機能的に連結しており、該 発現ベクター(i)〜(iii)は互いに同じであっても異なっていてもよい、細胞。 47.該発現ベクターによってコードされるフィブリン鎖がヒトフィブリン鎖で ある請求項46に記載の細胞。 48.(i)α鎖またはN末端伸長を有するα鎖のうちの一つをコードする配列を 含む発現ベクター、 (ii)フィブリンβ鎖またはN末端伸長を有するフィブリンβ鎖のうちの一つをコ ードする配列を含む発現ベクター、および (iii)変異体γ鎖をコードする配列を含む発現ベクター を含む細胞であって、各コード配列は該配列の発現を制御するプロモーターに機 能的に連結しており、該発現ベクター(i)〜(iii)は互いに同じであっても異なっ ていてもよい、細胞。 49.変異体γ鎖中の変異または欠失が、γ鎖のC末端部分に認められる2つの 保存されたCys残基の最初のおよその位置とC末端との間の配列中に生じてい る、請求項48に記載の細胞。 50.該変異体γ鎖が、ヒトγ鎖のCys残基352および365または非ヒト γ鎖の等価Cys残基よりなる群から選ばれたCys残基の変異または欠失を有 する、請求項49に記載の細胞。 51.該変異体γ鎖が変異体ヒトγ鎖である請求項48に記載の細胞。 52.(a)(i)フィブリンα鎖前駆体をコードする配列を含む発現ベクター、 (ii)フィブリンβ鎖前駆体をコードする配列を含む発現ベクター、およ び (iii)γ鎖をコードする配列を含む発現ベクター を含む細胞であって、各コード配列は該配列の発現を制御するプロモーターに機 能的に連結している細胞を培養し、それによって、α鎖、β鎖およびγ鎖を細胞 内で産生し、会合してフィブリンIモノマー、フィブリンIIモノマーまたはd esBBフィブリンモノマーを形成させ、ついで (b)該フィブリンIモノマー、フィブリンIIモノマーまたはdesBBフィブ リンモノマーを回収する ことを特徴とするフィブリンモノマーの製造方法。 53.該細胞を約5.0未満のpHで増殖させる請求項52に記載のフィブリン の製造方法。 54.コードされたフィブリン鎖がヒトフィブリン鎖であり、回収されたフィブ リンがヒトフィブリンである請求項52に記載のフィブリンの製造方法。 55.形成されたフィブリンモノマーが培地中に分泌され、該培地から回収され る、請求項52に記載のフィブリンの製造方法。 56.(a)(i)フィブリンα鎖前駆体の一つをコードする配列を含む発現ベクタ ー、 (ii)フィブリンβ鎖前駆体の一つをコードする配列を含む発現ベクター、 および (iii)変異体γ鎖をコードする配列を含む発現ベクター を含む細胞であって、各コード配列は該配列の発現を制御するプロモーターに機 能的に連結している細胞を培養し、それによって、α鎖、β鎖および変異体γ鎖 を細胞内で産生し、会合してフィブリンI−ホモログ、フィブリンII−ホモロ グまたはdesBBフィブリン−ホモログを形成させ、ついで (b)該フィブリンI−ホモログ、フィブリンII−ホモログまたはdesBBフ ィブリン−ホモログを回収する ことを特徴とするフィブリン−ホモログの製造方法。 57.コードされたフィブリン鎖がヒトフィブリン鎖であり、回収されたフィブ リン−ホモログがヒトフィブリン−ホモログである請求項56に記載のフィブリ ンの製造方法。 58.形成されたフィブリン−ホモログが培地中に分泌され、該培地から回収さ れる、請求項56に記載のフィブリンの製造方法。 59.フィブリンα鎖が産生されるように請求項43に記載の細胞を増殖させ、 ついでフィブリンα鎖を回収することを特徴とする、フィブリンα鎖の製造方法 。 60.フィブリンα鎖が該細胞から分泌される請求項59に記載のフィブリンα 鎖の製造方法。 61.フィブリンα鎖前駆体が産生されるように請求項43に記載の細胞を増殖 させ、ついでフィブリンα鎖前駆体を回収することを特徴とする、フィブリンα 鎖前駆体の製造方法。 62.回収したフィブリンα鎖前駆体をインピトロプロセシングし、フィブリン α鎖を回収することをさらに含む、請求項61に記載の方法。 63 フィブリンβ鎖が産生されるように請求項44に記載の細胞を増殖させ、 ついでフィブリンβ鎖を回収することを特徴とする、フィブリンβ鎖の製造方法 。 64.フィブリンβ鎖が該細胞から分泌される請求項63に記載のフィブリンβ 鎖の製造方法。 65.フィブリンβ鎖前駆体が産生されるように請求項44に記載の細胞を増殖 させ、ついでフィブリンβ鎖前駆体を回収することを特徴とする、フィブリンβ 鎖前駆体の製造方法。 66.回収したフィブリンβ鎖前駆体をインビトロプロセシングし、該フィブリ ンβ鎖を回収することをさらに含む、請求項65に記載の方法。 67 変異体γ鎖が産生されるように請求項45に記載の細胞を増殖させ、つい で変異体γ鎖を回収することを特徴とする、変異体γ鎖の製造方法。 68.(a)(i)フィブリンα鎖組成またはN末端伸長を有するフィブリンα鎖の 組成物を有する第一成分、(ii)フィブリンβ鎖組成またはN末端伸長を有するフ ィブリンβ鎖の組成物を有する第二成分および(iii)γ鎖組成を有する第三成分 、よりなる混合物を得、ついで (b)鎖組成(i)、(ii)および(iii)を含むフィブリンモノマー、フィブリノーゲン またはフィブリノーゲン−アナログを形成する ことを特徴とするフィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲ ン−アナログの製造方法。 69.該形成が、該混合物を折り畳みを解除する量の変性剤および還元剤に暴露 し、ついで該変性剤および還元剤の濃度を減少させることからなる、請求項68 に記載のフィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナ ログの製造方法。 70.該変性剤の濃度が約0.5Mからおよそ飽和までの範囲であり、該還元剤 の濃度が約0.05mMから約100mMの範囲である、請求項69に記載のフ ィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログの製造 方法。 71.鎖組成の異種ペアのモル比が約1.5:1未満である、請求項68に記載 のフィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログの 製造方法。 72.鎖組成がほぼ等モルである、請求項71に記載のフィブリンモノマー、フ ィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナログの製造方法。 73.前駆体が最初に形成され、ついでフィブリンに変換される、請求項68に 記載のフィブリンモノマー、フィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン−アナロ グの製造方法。 74.(a)(i)フィブリンα鎖調製物またはフィブリンα鎖前駆体の調製物を有 する第一成分、(ii)フィブリンβ鎖調製物またはフィブリンβ鎖前駆体の調製物 を有する第二成分および(iii)変異体γ鎖組成を有する第三成分、よりなる混合 物を得、ついで (b)鎖組成(i)、(ii)および(iii)を含むフィブリン−ホモログまたはフィブリン −ホモログ前駆体を形成する ことを特徴とするフィブリン−ホモログまたはフィブリンホモログ前駆体の製造 方法。 75.自己重合できない第一のフィブリン関連タンパク質を自己重合できない第 二のフィブリン関連タンパク質と反応させることを特徴とする、フィブリンシー ラントの形成方法。 76.該第一のフィブリン関連タンパク質が修飾γ鎖を含むフィブリン−ホモロ グを含む、請求項75に記載のフィブリンポリマーシーラントの形成方法。 77.変異、欠失または修飾が、γ鎖のC末端部分に認められる2つの保存され たCys残基の最初の位置とC末端との間の配列中に生じている、請求項76に 記載のフィブリンポリマーシーラントの形成方法。 78.該γ鎖が、ヒトγ鎖のCys残基352および365または非ヒトγ鎖の 等価Cys残基よりなる群から選ばれたCys残基の変異、欠失または修飾を有 する、請求項77に記載のフィブリンポリマーシーラントの形成方法。 79.該変異体γ鎖が変異体ヒトγ鎖である、請求項76に記載のフィブリンポ リマーシーラントの形成方法。 80.該第二のフィブリン関連タンパク質がフィブリノーゲンまたはフィブリノ ーゲン−アナログの少なくとも一つを含む、請求項75に記載のフィブリンポリ マーシーラントの形成方法。 81.該第二のフィブリン関連タンパク質が、トロンビン認識配列を欠くN末端 伸長を有するフィブリンα鎖またはフィブリンβ鎖を含むフィブリノーゲン−ア ナログを含む、請求項80に記載のフィブリンポリマーシーラントの形成方法。 82.フィブリノーゲン−アナログが、タンパク質加水分解プロセシングに適合 しないN末端伸長を有するフィブリンα鎖またはフィブリンβ鎖を含む、請求項 81に記載のフィブリンポリマーシーラントの形成方法。 83.該第二のフィブリン関連タンパク質が本質的にフィブリノーゲンまたはフ ィブリノーゲン−アナログからなる、請求項80に記載のフィブリンポリマーシ ーラントの形成方法。 84.フィブリン関連タンパク質のうち、自己重合するタンパク質が約20%w t/wt未満を示す、請求項75に記載のフィブリンポリマーシーラントの形成 方法。 85.該第一のフィブリン関連タンパク質および第二のフィブリン関連タンパク 質を約2:1〜約1:2の範囲の比で混合する、請求項75に記載のフィブリン ポリマーシーラントの形成方法。 86.該第一のフィブリン関連タンパク質および第二のフィブリン関連タンパク 質を約1.5:1〜約1:1.5の範囲の比で混合する、請求項85に記載のフィ ブリンポリマーシーラントの形成方法。 87.(a)i.組換えフィブリンα鎖前駆体またはフィブリノーゲンAα鎖前駆体 、 ii.組換えフィブリンβ鎖前駆体またはフィブリノーゲンBβ前駆体、および iii.組換えγ鎖前駆体 を発現する組換え細胞または生物を増殖させ、ついで (b)該細胞または組織から、または該細胞または組織から輸送された物質からフ ィブリンI、フィブリンIIまたはdesBB−フィブリンを回収する 工程により調製されたフィブリン組成物。 88.該工程をインビトロタンパク質加水分解工程なしに行う、請求項87に記 載の工程。 89.(a)i.組換えフィブリンα鎖前駆体またはフィブリノーゲンAα鎖前駆体 、 ii.組換えフィブリンβ鎖前駆体またはフィブリノーゲンBβ前駆体、および iii.組換えγ鎖前駆体 を発現する組換え細胞または生物を増殖させ、 (b)フィブリン鎖を回収し、 (c)回収したフィブリン鎖を含むフィブリンI、フィブリンIIまたはdesB B−フィブリンモノマーを形成させ、ついで (d)フィブリンI、フィブリンIIまたはdesBB−フィブリンを回収する工 程により調製されたフィブリン組成物。 90.該工程をインビトロタンパク質加水分解工程なしに行う、請求項89に記 載の工程。 91.N末端伸長を有するフィブリンα鎖であって、該伸長が、伸長されたフィ ブリンα鎖がトロンビンによってフィブリンα鎖に変換されることを可能にする トロンビン認識配列を欠くフィブリンα鎖。 92.該フィブリンα鎖がフィブリンα鎖への変換を受けない、請求項91に記 載の伸長されたフィブリンα鎖。 93.N末端伸長を有するフィブリンβ鎖であって、該伸長が、伸長されたフィ ブリンβ鎖がトロンビンによってフィブリンβ鎖に変換されることを可能にする トロンビン認識配列を欠くフィブリンβ鎖。 94.該鎖がフィブリンβ鎖への変換を受けない、請求項93に記載の伸長され たフィブリンβ鎖。 95.(1)変異、欠失または修飾されたγ鎖を同定し、 (2)該変異、欠失または修飾されたγ鎖を含むフィブリンモノマーを単離し、つ いで (3)該フィブリンモノマーが自己重合できるか否かおよびフィブリノーゲンと非 共有結合を形成しうるか否かを決定する ことを特徴とする、修飾されたγ鎖の同定方法。
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