CZ292703B6

CZ292703B6 - Mutantní proteiny lidského interleukinu-4

Info

Publication number: CZ292703B6
Application number: CZ19963848A
Authority: CZ
Inventors: Hanno Wild; Rudolf Hanko; Michael Dörschug; Hans-Dietrich Hörlein; Jürgen Beunink; Heiner Apeler; Hermann Wehlmann; Walter Sebald
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 2003-11-12
Also published as: DE59507920D1; NO965621L; JP2011102302A; HU9603563D0; AU705745B2; SK169296A3; KR100393508B1; TW458984B; CZ384896A3; HU221416B1; CA2193993A1; US6130318A; EP0769020A1; HUT77577A; EP0769020B1; JP2007051161A; SK284391B6; CA2193993C; ATE190068T1; DE4423131A1

Abstract

Řešení se týká mutantních proteinů lidského interleukinu-4 jako antagonistů nebo parciálních agonistů lidského interleukinu-4, které vedle výměn za známé přírodní aminokyseliny v pozicích 121, 124 nebo 125 mají zaveden alanin v poloze 2.ŕ

Description

Mutantní proteiny lidského interleukinu-4

Oblast techniky

Vynález se týká nových mutantních proteinů hIL-4, způsobu jejich výroby a jejich použití, obzvláště při nepřiměřených, chybně řízených imunitních reakcích a autoimunitních chorobách.

Dosavadní stav techniky

ZPCT WO 93/10235 jsou již známé terapeutické prostředky, které jsou nebo obsahují antagonisty nebo parciální agonisty hIL-4, přičemž antagonisty nebo parciální agonisty jsou mutantní proteiny hIL-4.

Lidský interleukin—4 (hIL—4) je jedním z řady početných cytokinů, které indukují a koordinují proliferaci, zrání, přežívání a diferenciaci lymfoidních a meyloidních buněk. Obzvláště se hIL-4 podílí na imunitní reakci mediované IgE a přímo urychlují proliferaci thymocytů a aktivovaných T-buněk. Bylo možné identifikovat vysoce afinní receptorový protein pro IL-4 o MR 140 000, který podle sekvence cDNA sestává z 800 aminokyselinových zbytků. Ten patří do nedávné popsané skupiny receptorů, které se označují jako nadrodina hematopoietin-receptorů.

Sekvence aminokyselin zralého hIL-4 sestává ze 129 zbytků, jestliže se za základ vezme klonová cDNA. Tato cDNA se exprimuje vE. coli a kvasinkách. Z těchto zdrojů se může získat rekombinantní IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.

Již z dřívější doby je známá monoklonální protilátka, která oproti lidskému interleukinu-4 vykazuje antagonistické vlastnosti. Tato protilátka obsahuje jeden fragment Fab a produkuje ho hybridomová linie člověk-člověk. také jedna hybridomová linie z buněk krysy imunizované (ne)-glykosylovaným lidským IL-4 produkuje monoklonální protilátku proti hIL-4.

Na základě role interleukinu 4 při alergických procesech je možné očekávat, že látky, které procesy vyvolané interleukinem-4 inhibují nebo lidskému hIL-4 konkurují, přeruší řetěz reakcí vyvolávajících nemoc.

vDE 41 37 333 AI se popisují mutantní proteiny hIL-4, u nichž jsou v jedné nebo v několika pozicích 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 nebo 128 u divokého typu přirozeně se vyskytující aminokyseliny (aminokyselin) nahraženy jednou nebo několika možnými přírodními aminokyselinami. Tyto mutantní proteiny jsou antagonisty nebo částečně agonisty lidského ILr4.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká mutantních proteinů hIL-4, které jsou antagonisty nebo částečnými agonisty lidského interleukinu-4, které mají navíc k výměně (výměna) za přírodní aminokyseliny na pozicích 121, 124 nebo 125 zaveden alanin v poloze 2 proteinu hIL-4. Tyto modifikace se provádějí ke zvýšení stability mutantního proteinu hIL-4, k prodloužení biologického poločasu života nebo k usnadnění výrobního nebo purifikačního procesu.

Ktomu se v jedné nebo v několika pozicích, na kterých se aminokyseliny přirozeně se vyskytující v divokém typu, deletují, případně jsou nahraženy jinými aminokyselinami, nebo se zavedou dodatečně aminokyseliny.

-1 CZ 292703 B6

V rámci vynálezu znamenají aminokyseliny obecně

Ala	L-alanin
Arg	L-arginin
Asn	L-asparagin
Asp	L-kyselina asparagová
Cys	L-cystein
Gin	L-glutamin
Glu	L-kyselina glutamová
His	L-histidin
lle	L-izoleucin
Leu	L-leucin
Lys	L-Lysin
Met	L-methionin
Pro	L-prolin
Phe	L-phenylanin
Ser	L-serin
Thr	L-threonin
Trp	L-tryptophan
Tyr	L-tyrosin
Val	L-valin

přičemž ke zjednodušení je možné upustit od značení konfigurace.

Výhodné jsou mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serin) v libovolné kombinaci vyměněna za některou z možných přirozených aminokyselin a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.

Obzvláště výhodné provedení z této skupiny jsou mutanty, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serin) v libovolné kombinaci za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.

Výhodnou formou provedení je rovněž výměna aminokyseliny 121 (arginin) a aminokyseliny 125 (serin) za přirozeně se vyskytující aminokyselinu, s výhodou kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.

Obzvláště výhodné jsou dále mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin) vyměněna za přirozeně se vyskytující aminokyselinu, a 0 až jedna další aminokyselina na pozicích 121 a nebo 125 výměna za některou zmožných aminokyselin a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.

Z této skupiny jsou obzvláště výhodné mutantní proteiny hIL-4, u kterých je aminokyselina 124 (tyrosin) vyměněna za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a pozice 121 za některou z možných aminokyselin, s výhodou za kyselinu asparagovou nebo glutamovou a u kterých je navíc N-konec v molekule modifikován.

Provedení N-koncové modifikace pro výše jmenované příklady je inzerce aminokyseliny Ala mezi N-koncový methionin a přirozený N-terminus mutantního proteinu hIL-4.

Příklady takového exprimovaného produktu jsou:

Ala(-l)-Tyr(124)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)-Ser( 125)Asp

Ala(-l)-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp

-2CZ 292703 B6 hIL-4 je možné vyrábět jako rekombinantní protein (rhIL-4), příkladně vE. coli. Přitom vytvořený protein se nechá solubilizovat, renaturovat a izolovat, rhIL-4 pak má vysokou specifickou biologickou aktivitu, která se může stanovit příkladně měřením syntézy/proliferace DNA aktivovaných T-buněk nebo exprese CD23 aktivovaných B-buněk [srovnej Kruše, N. et al. (1991) FEBS Lett. 286, 58 - 60; Kikutani, H. et al. (1986) Cell 47, 657 - 665].

K přípravě cDNA, která obsahuje oblast DNA, která kóduje maturitní oblast hIL-4, nebo které kódují matumí oblast hIL-4, se odkazuje na Yokota, T., Otsuka, T., Mosmanna, T., Banchereua, J., DeFrance, T., Blanchard, D., De Vries, J.E. Lee, F. a Arai, K.I. (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5894 - 5898 a tam uvedenou literaturu. V uvedené souvislosti se jako „cDNA, které kódují matumí oblast hIL4“ rozumí také cDNA, které při přibližně stejném počtu párů bází přestavují mutanty cDNA uvedené podle konkrétního stavu techniky, pokud jsou jimi očekávané mutantní hEL-4 rovněž antagonisty nebo částečnými agonisty.

Z hlediska průběžného číslování oblasti DNA, kódující matumí oblast hIL-4 se zde postupuje podle Carr. C. et al., Biochemistry 1991, 30,1515 - 1523.

cDNA, která kóduje matumí oblast hIL-4, se může získat vyštěpením fragmentu EcoRV/BamHI z cDNA, vyrobené genovou technologií (příkladně British Bio-Technology Ltd., Oxford, England). Fragment DNA se za přídavku syntetických oligonukleotidů, příkladně 5 - CATGCACAAGTGCGAT a 5 - ATCGCACTTGTG, které obsahují první 4 kodony aminokyselin interleukinu-4 a navíc iniciační kodon methioninu, integruje do expresního vektoru, příkladně mezi restrikční místa Ncol a BamHI expresního vektoru pR^TS pRC 109 [srovnej Weigel, U„ Meyer, M. a Sebald W. (1989) Eur. J. Biochem. 189,295 - 300],

Varianty sekvencí aminokyselin IL-4 se vyrábějí zavedením vhodných změněných nukleotidů do DNA kódující IL-4 nebo syntézou in-vitro požadované formy IL-4. K takovým variantám patří příkladně delece nebo inzerce nebo substituce zbytků v rámci sekvence aminokyselin IL-4. Přitom je k dosažení konečné sestavy přípustná každá kombinace delece, inzerce a substituce, za předpokladu, že konečná konstrukce vykazuje požadované znaky. Změny aminokyselin mohou měnit také post-translační úpravy IL-4: příkladně se mohou inzercí, delecí nebo jiným ovlivněním hlavní sekvence přirozeného IL-4 změnit počet nebo pozici glykosylačních míst, vlastnosti pro zachycení na membráně a/nebo intracelulámí lokalizace IL-4.

Při konstrukci variant sekvencí aminokyselin IL-4 závisí lokalizace mutovaných míst a druh mutace na měnící se vlastnosti nebo měnících se vlastnostech IL-4. Mutovaná místa se mohou měnit jednotlivě nebo v řadě, tak příkladně nejprve substitucí (1') s konzervativně volenými aminokyselinami a potom s radikálnějšími možnostmi volby v závislosti na dosahovaných výsledcích, (2) delecí aminokyselinového zbytku nebo inzercí (3) zbytku v blízkosti lokalizovaného místa.

Vhodnou metodou k identifikaci určitých zbytků nebo zbytků IL-4 jako výhodných míst pro mutagenezi je „Alanin-Scaning-Mutagenese“, popsaná autory Cunningham a Wells (Science, 244; 1081 - 1085, 1989). Přitom se zbytek nebo skupina zbytků target identifikuje (příkladně nabité zbytky jako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a neutrálními nebo negativně nabitými aminovými kyselinami (nejlépe alanin nebo polyalanin), aby se tak ovlivnila interakce amino kyselin se sousedním okolním vodným polem uvnitř nebo mimo buňku. Oblastí, které citlivě funkčně reagují na substituce, se potom připraví zavedením dalších nebo jiných variant na místa substituce nebo pro místa substituce. To znamená, že je sice místo pro zavedení změn v sekvenci aminových kyselin předem určeno, ale druh změny jako takové nemusí být předem určen.

K optimalizaci provedení mutace na určité místě se tedy může na cílový kodon nebo v cílové oblasti provést způsobem „Ala-Scanning“ nebo náhodná mutageneze, přičemž exprimované varianty IL-4 se v zájmu požadovaných vlastností přezkoumají z hlediska optimální kombinace.

-3CZ 292703 B6

Při konstrukci variant sekvencí aminokyselin jsou tedy dvě hlavní proměnné: místo mutace a druh mutace.

Velikost delecí v sekvenci aminokyselin činí zpravidla asi 1 až 30 zbytků, s výhodou 1 až 10 zbytků a v normálním případě loží za sebou. V normálním případě postihují delece bezprostředně vedle sebe ležící zbytky aminokyselin.

Počet po sobě následujících delecí se volí tak, aby terciární struktura IL-4 v dotčené oblasti, 10 příkladně cysteinové disulfidy, struktura β-skládaného listu nebo alpha-helix zůstala zachována.

K inzercím v sekvenci aminokyselin patří fuze s aminovou a/nebo karboxylovou koncovou skupinou s délkou jediného zbytku až po polypeptidy se 100 nebo více zbytky a rovněž inzerce ležící v rámci jedné sekvence jednotlivých nebo několika zbytků aminokyselin. Inzerce ležící 15 v rámci jedné sekvence (to znamená inzerce v rámci sekvence IL-4), mohou obsahovat asi 1 až zbytků, s výhodou 1 až 5 a optimálně 1 až 3 zbytky. Příklady terminálních inzercí jsou IL-4 s N-koncovým methionylovým zbytkem, artefakt přímé exprese IL-4 v rekombinantní bakteriální buněčné kultuře, inzerce jedné nebo několika dodatečných aminokyselin mezi methioninem a přirozeným N-koncem k lepšímu odštěpení methioninu, příkladně bakteriálními 20 proteázami, a fuze heterologní signální N-koncové sekvence na N-konec molekuly IL-4 k podpoře sekrece mutamího EL-4 z rekombinantních hostitelských buněk případně fuze polyaminových kyselin, příkladně polyhistidinu k lehčí izolaci IL-4. Tyto signální sekvence se zpravidla volí z předpokládaných druhů hostitelských buněk a jsou proto jejich homology. Vhodnými sekvencemi jsou příkladně ompA, ompT, phoA, molE, amp nebo pelB pro E. coli, 25 Alpha-Faktor, amyláza, invertaza, Killer-Toxin a mellitinpepro-peptid pro kvasinkové signály a virální signály jako herpes gD pro buňky savců.

Další výhodnou signální sekvencí je přirozená signální sekvence interleukinu-4.

Obzvlášť vhodné jsou signální sekvence, které se samy odštěpí v exprimujícím organismu, takže mutantní protein interleukinu-4 vykazuje přirozený N-konec.

Výhodnými produkty exprese po odštěpení signálních sekvencí jsou:

Tyr(124)Asp

Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp

Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp

Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp

Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp

K dalším variantám inzerce IL-4, patří fuze imunogenních peptidů na N- nebo C- konec IL—4, příkladně bakteriální polypeptidy jako beta-laktamáza nebo enzym kódovaný E.coli-trplokusem nebo kvasinkový protein, a také fuze na C-konci s proteiny s dlouhým poločasem života jako příkladně imunoglobulinové konstantní oblasti (nebo jiné imunoglobulinové oblasti), 45 albumin nebo ferritin - srovnej popis ve WO 89/02922 (zveřejněný 6. dubna 1989).

Další skupinou variant jsou varianty se substitucí aminokyseliny. U těchto variant se nejméně jeden aminový zbytek v molekule IL-4 nahradí jiným zbytkem.

Přirozeně se vyskytující zbytky se na základě společných charakteristik bočních řetězců dělí do tříd:

1) hydrofobní: Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutrální hydrofilni: Cys, Ser, Thr;

3) kyselé: Asp, Glu;

-4CZ 292703 B6

4) bazické: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

5) zbytky s vlivem na orientaci řetězce: Gly, pro a

6) aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativní substituce zahrnují výměnu zástupce jedné třídy za zástupce jiné třídy.

Substituce aminokyselin se mezi jiným použije při změnách přirozeně glykosylační struktury polypeptidu. „Změna“ znamená deleci jedné nebo několika uhlovodíkových struktur v přirozeném IL-4 a/nebo zavedení jednoho nebo několika glykosylačních míst, které s v přirozeném IL-4 nevyskytují.

Výhodnou používanou možností ke zlepšení doby poločasu života proteinů cirkulujících in vivo je jejich konjugace na polymer, který jim propůjčuje delší dobu poločasu života. Tak se příkladně osvědčila konjugace polyethylenglykolu (PEG) na Cl-NH jako vynikající možnost k prodloužení doby poločasu života. PEG je neimunogenní, lineární, nenabitý polymer se třemi molekulami vody na molekulu ethylenoxidu, takže se hydrodynamické vlastnosti konjugované molekuly mohou dramaticky měnit (Maxfield et al., Polymer, 16:505-509 (1975); Bailey, F.E., et al., v: Nonionic surfactants [Schick. M. J., Hrsg.J strany 794-821, 1967). Řada terapeuticky používaných enzymů se s cílem účinného zvýšení doby poločasu života in vivo spojiva s PEG (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252:3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et. al., Cancer Biochem. Biphysl., 7:175-186, 1984). Vazba PEG-IL-2 (Interleukin-2) nemá jenom prodloužit cirkulační dobu přežití, ale také zvýšit jeho potenci (Katre, N. V. et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 84:1487-1491 (1987); Goodson, R. et al., Bio/Technology, 8:343-346 (1990). Pro vazby PEG na jiné molekuly je referováno o snížení imunogenity a toxicity (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem, 252:3598-3581,1977).

IL-4 se může také uzavřít do mikrokapslí, vyrobených příkladně koacervačními technikami nebo „polymerací na fázovém rozhraní“ (interfacial polymerization“) (příkladně hydroxymethylcelulózové nebo želatinové mikrokapsle a poly-(methylmetakrylátové) mikrokapsle)) vkoloidních systémech uvolňujících léčiva (příkladně liposomy, albuminové kuličky, mikroemulze, nano-částice a nano-kapsle) nebo v makroemulzích. Takové techniky uvádí Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Osol, A., vydání (1980).

Preparáty IL-4 jsou také vhodné pro přípravu protilátek, jako standardy pro kvantitativní imunoanalytické stanovení IL-4 (příkladně značení IL—4 k použití jako indikátor pro radioimunoanalýzu, pro ELISA stanovení, pro kvantitativní stanovení receptoru IL-4, pro afinitní purifíkační techniky) a pro kvantitativní stanovení receptoru kompetitivním testem při značení radioaktivním jodem, enzymy, fluorofory, „spin labels“ a tak dále.

Protože předpověď vlastností určité varianty IL-4 je obtížná, je samozřejmé, že je nutný určitý „screening“ získané varianty, aby bylo možné dosáhnout optimální varianty. Tak se příkladně měří změna v imunologickém charakteru molekuly IL-4, příkladně afinita k určitým protilátkám pomocí kompetitivní imunoanalýzy. Změny varianty se vyšetřují z hlediska snížení nebo zesílení jejich aktivity - ve srovnání s aktivitou zjištěnou ve stejném vzorku pro přirozený IL-4. Další případné změny vlastností proteinů nebo polypeptidů - jako příkladně redox- nebo tepelná stabilita, hydrofobicita, citlivost vůči proteolytické degradaci, stabilita v buněčných strukturách rekombinantních organismů nebo v plazmě nebo také tendence agregovat s „nosičem“ nebo agregovat do multimerů - se stanovují metodami, odpovídajícími stavu techniky.

Terapeutické přípravky a podávání IL-4

Sloučeniny podle vynálezu inhibují buďto procesy zprostředkované interleukinem-4, nebo konturují hIL-4. Jsou proto vhodné k ošetření nepřiměřených případně chybně řízených imunitních reakci a chorob autoimunity. K tomu patří také imunní deficience jak primárního, tak

-5CZ 292703 B6 i sekundárního druhu. Navíc se může antagonista použít jak při transplantacích, tak i při paliativní terapii tumorových onemocnění.

Patří k nim příkladě:

- alergie (blokování reakce primární a zprostředkované IgE, desensibilace známých alergií, atopická onemocnění, úlevy při atacích astma, hyper syndrom IgE).

- transplantace (redukce exprese HLA-DR při transplantacích orgánů, suprese reakce štěpu proti hostiteli, použití při čištění kostní dřeně)

- leukemie a tuhé tumory exprimuj ící receptor pro IL—4 (redukce nepřiměřené autokrinní produkce IL—4, potlačení růstu tumoru)

- protiregulaci při nadprodukci trombocytů

- terapie poruch srážlivosti (přes monocytový blok)

- použití při poruchách výměny lipidů

- náprava při poruchách hospodaření s cukry

- zlepšení imunního statusu při infekcích (sepse).

Na základě své dobré rozpustnosti ve vodě se může mutantní protein IL—4 použít jak systematicky, tak i lokálně, to znamená topicky, mimo jiné inhalačně jako spray. Možná je i receptura jako depotní preparát. Při všech formách terapie je možné zvažovat jak krátkodobou terapii, tak i trvalou terapii.

Terapeutické přípravky antagonistů IL-4 se připravují ke skladování tak, že se antagonista IL-4 po dosažení požadovaného stupně čistoty smíchá s fyziologicky přijatelnými nosiči (carrier), pomocnými látkami nebo stabilizátory (Remingtons Pharmaceutical Sciences, na uvedeném místě) ve formě lyofílizátu nebo vodných roztoků. Přijatelné nosiče, pomocné látky nebo 30 stabilizátory nejsou pro příjemce při použitých dávkách a koncentracích toxické; patří knim pufry, jako fosfáty, citráty a jiné organické kyseliny; antioxidanty jako příkladně kyselina askorbová; nízkomolekulámí polypeptidy (méně než 10 zbytků), proteiny jako serumalbumin, želatina nebo imunoglobulin; hydrofilní polymery jako polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny jako glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin; monosacharidy, disacharidy a jiné cukry, 35 příkladně glukóza, manoza nebo dextrin; chelatotvomé látky jako EDTA; cukerné alkoholy jako mannitol nebo sorbitol; ionty, tvořící soli jako sodík a/nebo neionické povrchově aktivní látky jako tween, pluronics nebo polyethylenglykol (PEG).

Antagonisté IL-4 k použití in-vivo musí být sterilní. Toho se snadno dosáhne filtrací přes sterilní 40 membránový filtr, buďto před, nebo po lyofilizaci a rekonstituci. IL-4 antagonisté se skladují obvyklým způsobem v lyofilizované formě nebo v roztoku.

Vhodnými příklady přípravků se zpožděným uvolňováním jsou příkladně semipermeabilní matrice zpěvných hydrofobních polymerů, které obsahují protein; u těchto matric se jedná 45 o tvarované články („shaped articles“), příkladně filmové tablety nebo mikrokapsle. Příklady matric se zpožděným uvolňováním jsou polyestery, hydrogely (příkladně poly(2-hydroxyethylmethakrylát), které popisují Langer et al., J. Biomed. mater. Res., 15:167-277 (1981) a Lander, Chem. těch., 12:98-105 (1982) - nebo poly(vinylalkohol)), polyaktidy (patent US 3 773 919, EP 58481), kopolymery kyseliny L-glutamové a gama-ethyl-L-glutamátu (Sidman et al., 50 Biopoolymers 22:547-556 (1983)), neodbouratelný ethylenvinylacetát (Langer et al., na uvedeném místě), odbouratelné kopolymery kyseliny mléčné - kyseliny glykolové jako Lupron DepotTM (injikovatelné mikrokuličky z kopolymerů kyseliny mléčné - kyseliny glykolové a leuprolidacetát) a kyseliny poly-D-(-)-3-hydroxymáselné (EP 133 988). Zatímco polymery

-6CZ 292703 B6 jako ethylenvinylacetát a kyselina mléčná - kyselina glykolová umožňují uvolňování molekul více jak 100 dní, dochází k uvolňování proteinu u některých hydrogelů v kratším časovém období. Pokud zůstávají chráněné proteiny v těle delší časové období, mohou se vlivem vlhkosti při teplotě 37 °C denaturovat nebo agregovat, v důsledku čehož dochází ke ztrátě biologické účinnosti a možných změnách imunogenity. Ke stabilizaci proteinu je možné podle mechanizmu, přicházejícího v úvahu, vyvinout účelnost strategii. Zjistí-li se příkladně, že mechanismus, který vede k agregaci, spočívá na intermolekulámí tvorbě můstků S-S v důsledku thiodisulfidové výměny, je možné dosáhnout stabilizace modifikací sulfhydrylovými zbytky, lyofilizací z kyselých roztoků, řízením obsahu kapaliny, použitím vhodných přísad a vývojem specielních kombinací polymemích matric.

K přípravkům antagonistů IL-4 se zpožděným uvolňováním patří také antagonisty IL-4 uzavřené vliposomech. Liposomy se vyrábějí známými metodami: DE 3 218 121; Epstein et al., Proč. Nati. Acad., Sci. USA, (82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proč. Nalt. Acad. Aci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; japonská patentová přihláška 83-118008; patent US 4 485 045 a 4 544 545; rovněž EP 102 324. Liposomy jsou zpravidla malého (asi 200-800 Angstrom) unilamelámího typu s obsahem lipidu více než asi 30 % molových cholesterolu, přičemž podíl se vždy optimálně přizpůsobí antagonistům IL-4. Liposomy s prodlouženou dobou cirkulace zveřejňuje patent US 5 013 556.

Další použití vynálezu se týká vestavby antagonistů IL-4 do „tvarových článků“. Ty se mohou použít k modulování nebo zabránění vzniku šoku.

Příklady provedení vynálezu

Přikladl

Odstranění potenciálních N-glykosylačních míst v mutantním proteinu hIL-4.

V přirozené sekvenci aminokyselin hIL-4 se vyskytují dvě glykosylační místa s vazbou na asparagin v pozicích aminokyselin 38 a 105. Odpovídající kodony ve strukturních genech se mohou vyměnit za kodony kyseliny asparagové. Tím při expresi genu v kvasinkových kmenech odpovídá N-glykosylace výslednému mutantnímu proteinu ML-4.

Provedení obou výměn kodonu („site-directed mutagenesis“) ve strukturním genu za vzniku genu pro mutantní protein hIL-4 se provádí metodou podle Deng a Nickoloff (Anal. Biochem. 200:81 (1992)) s použitím klonovacího vektoru pUC18. Syntetické oligonukleotidy, které jsou potřebné pro změnu strukturního genu mají následující sekvence:

a) k výměně asparaginu za kyselinu asparagovou na pozici 38:

-GCC TCC AAG GAC ACA ACT GAG-3

b) k výměně asparaginu za kyselinu asparagovou na pozici 105:

-GTG AAG GAA GCC GAC CAG AGT ACG-3

Podtržené pozice v uvedených sekvencích nukleotidů označují kodony pro kyselinu asparagovou.

Sekvenování DNA se potvrdila výměna kodonu v sekvenci nukleotidů. Změněný strukturní gen se zabuduje do expresního kvasinkového vektoru a indukuje se k expresi ve vhodných kmenech.

-7CZ 292703 B6

Příklad 2

Inzerce aminokyseliny v pozici (+2) k přípravě mutantního proteinu IL-4 bez N-koncového methioninu v E. coli

K výrobě mutantního proteinu IL-4, jemuž chybí N-koncový methionin se zavede v pozici (+2) aminokyselina, která vede k odštěpení N-koncového methioninu v E. coli specifickou aminopeptidázou pro methionin (Flinta et al., Eur. J. Biochem. 154, 193-196 1986). Ktomu účelu se rozštěpí vektor RPR9-IL4-Y124D (příklad 1) restrikčními endonukleázami Xhol a BamHI. Přitom vznikají fragment DNA dlouhý asi 450 bp, který nese sekvenční informaci pro gen IL4Y124D a krátký fragment (dlouhý asi 50 bp) z oblasti vektoru atpE, se vyčistí elektroforézou na agarózovém gelu a překlonuje se do vektoru M13mpl8 otevřeného Sáli a BamHI. Připraví se jednořetězcová DNA a podrobí se „mutagenezi in vitro“ s následujícím oligonukleotidem:

5' CTGGAGACTGCCATGGCCCACAATGCGATATCACC3'

Touto mutagenezi se zavede do pozice (+2) genu IL4Y-124D aminokyselina alanin (kodon GCC). Kromě toho se na 5'-konci genu zavede Ncol restrikční místo (CCATGG), aby se usnadnil následný screening a klonování do expresního vektoru. Screening plaků se provádí restrikční analýzou vycházející z dvouřetězcové M13 RF DNA (replikativní forma). Pozitivní klony je možné identifikovat restrikčním štěpením enzymy Ncol a BamHI. Správnost sekvence se navíc potvrdí sekvenováním.

Fragment DNA dlouhý asi 400bp se pomocí Ncol a BamHI vyštěpí ze zvoleného klonu M13mpl8, vyčistí se elektroforézou na agarózovém gelu a klonuje se do vektoru pTrc99A rozštěpeném rovněž s pomocí Ncol a BamHI (obchodně dodávaný Pharmacia P-L Biochemicals). Vektorem pAPHIOO (IL4A125D), vzniklým z tohoto klonování se transformují buňky E. coli (TG1) a selektují se na živném agaru obsahujícím ampicilin.

Exprese a purifikace proteinu vede kmutantnímu proteinu IL-4, kterému chybí N-koncový methionin.

Příklad 3

Fermentace kvasinkových buněk

Živné roztoky:

Ke kultivaci kvasinkových buněk exprimujících mutantní proteiny hIL-4 se použijí následující živné roztoky:

	Živný roztok
Použitá látka	SD2	Sc 6
Bacto Yeast dusíkatá báze	6,7 g/1	—
Yest extrakt Difco	—	20,0 g/1
Glukóza	20,0 g/1	5,0 g/1
KH₂PO₄	6,7 g/1	1,4 g/1
(NH4)₂SO₄	-	2,0 g/1
MgSO₄ x 7 H₂O	-	0,5 g/1
Odpěňovací prostředek PPG 2000	-	0,2 g/1

Použité látky se rozpustí v deionizované vodě a hodnota pH se nastaví na pH 5,5. Sterilizace se provádí po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Glukóza se rozpustí v 1/5 potřebného objemu

-8CZ 292703 B6 v děionizované vodě, odděleně se sterilizuje a po ochlazení se přidá k ostatnímu živnému roztoku.

Kmenové konzervy

Kmenové konzervy všech transformantů kvasinek se připraví plněním 2 ml alikvotů předkultury a skladováním v kapalném dusíku.

Předkultury

Fermentace předkultur se provádí v 1-litrových třepacích buňkách, které se plní 200 ml živného roztoku SD-2. Očkování se provádí kmenovou konzervou nebo jednotlivou kolonií z agarózové plotny SD-2. Kultury se inkubují za trvalého třepání po dobu 2 až 3 dní při teplotě 26 až 30 °C.

Fermentace hlavní kultury

Fermentace hlavní kultury se provádí za použití 10-litrových míchaných kotlových fermentorů v živném roztoku Sc-6. Očkování se provádí 3 až 5 % objemovými předkultury, přičemž se před očkováním odcentrifuguje z předkultury biomasa a suspenduje se v médiu Sc-6. Podmínky fermentace pro 10 litrů hlavní kultury jsou následující:

Teplota Otáčky míchadla Provzdušňovací poměr Požadovaná hodnota pH

26 až 30 °C 600 ot/min 0,5 wm 5,5 (korektuiy pomocí 5 N NaOH a 5 N H2SO4

Po uplynutí doby fermentace 5 hodin se kultury kontinuálně doplňují glukózou a kvasničným extraktem. Živné dávky se řídí respiračním kvocientem (hodnota RQ) kultury. Požadovaná hodnota RQ činí 1,0. Živný roztok má následující složení:

Glukóza Yeast extrakt Difco

500 g/1 75 g/1

Složky se odděleně rozpustí v děionizované vodě a stabilizují se po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Po ochlazení se oba roztoky spojí.

Při použití indukovatelného promotoru Gal 10 nebo derivátu promotoru Gal 10 se provádí indukce výměnou cukru v krmném roztoku z glukózy (500 g/1) na galaktrózu g/1).

Další kontrola živné dávky se potom neprovádí pomocí hodnoty RQ. Živná dávka se nastaví ručně na dvojnásobnou živnou dávku v okamžiku indukce. K indukce promotoru GallO dochází obvykle po asi 48 hodinách doby fermentace.

Získávání buněk

Po ukončení fermentace (80 až 120 hodin) se obsah fermentorů ochladí na teplotu 10 až 15 °C a v případě intracelulámí exprese se získávají kvasinkové buňky standardními centrifugačními technikami (příkladně centrifugou skyvetami). Buněčná hmota získaná po centrifugaci se kryopeletizuje přímým vkapáním do kapalného dusíku a skladuje se při teplotě -80 °C. Zpracování produktu se provádí z takto ošetřené biomasy. Při sekvenci heterologního proteinu do kultivačního média se provádí oddělení kvasinkových buněk z kultivačního média standardními centrifugačními technikami (příkladně centrifugou s kyvetami) nebo pomocí mikrofitrace s příčným prouděním (příkladně systém Filtron-Minisette). Pokud je to nutné, kultivační médium se sterilizuje. Další zpracování produktu se provádí z kultivačního média neobsahujícího buňky.

-9CZ 292703 B6

Příklad 4

Fermentace E. coli

Živné roztoky:

Kultivace kvasinkových buněk exprimujících transformanty E. coli se provádí v LB-roztocích následujícího složení:

Bacto Tryton Bacto kvasinkový extrakt NaCl

10 g/1 5 g/1 10 g/1

Složky se rozpustí v deionizované vodě a sterilizují se po dobu 20 minut při teplotě 121 °C. Před zaočkováním se k živnému roztoku sterilně přidá antibiotikum vhodné k selekci transformantů (příkladně 100mg/l Na-ampicilinu nebo 50mg/l kanamycinsulfátu v závislosti na selekčním markéru použitém ve vektoru).

Kmenové konzervy

Kmenové konzervy všech transformantů kvasinek si připraví plněním 2 ml alikvotů předkultuiy a skladováním v kapalném dusíku.

Předkultury

Fermentace předkultur se provádí v 1-litrových třepacích baňkách, které se plní 200 ml živného roztoku LB. Očkování se provádí kmenovou konzervou nebo jednotlivou kolonií z agarózové plotny LB. Kultury se inkubují za trvalého třepání po dobu 12 až 18 hodin při teplotě 30 °C.

Fermentace hlavní kultury

Fermentace hlavní kultuiy se provádí za použití 10-litrových míchaných kotlových fermentorů v živném roztoku LB. Očkování se provádí 1 až 5 % objemovými předkultury, přičemž se před očkováním odcentrifuguje z předkultury biomasa a suspenduje se v čerstvém médiu LB. Podmínky fermentace pro 10 litrů hlavní kultury jsou následující:

Počáteční teplota	30 °C (při použití promotorů indukovaných teplotou) 37 °C (při použití vektorů indukovaných IPGT
Otáčky míchadla Provzdušňovací poměr	500 ot/min 0,5 wm

Ke sledování růstu biomasy se v intervalech asi 1 hodiny odebírající z kultivačního roztoku sterilní vzorky a stanovuje se optická hustota při 600 nm (ÓD600). Při dosažení hustoty OD600 0,8 až 1,2 se provádí indukce kultur. V závislosti na zvoleném promotoru se indukuje následovně:

Teplotní indukce:	Zvýšení fermentační teploty ze 30 °C na 42 °C
Indukce IPTG:	Sterilní přídavek izopropyl-[3-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) an 0,4 mM

Doba indukce činí typicky 4 až 8 hodin.

-10CZ 292703 B6

Získání buněk

Po ukončení fermentace (6 až 14 hodin) se obsah fermentoru ochladí na teplotu 10 až 15 °C a buňky bakterií se získávají standardními centrifiigačními technikami (příkladně cetrifugou s kyvetami). Buněčná hmota získaná po centrifugaci se příkladně skladuje v mraženém stavu. Zpracování produktu se provádí z takto ošetřené biomasy.

Příklad 5

Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v kvasinkových buňkách za užití konstitutivních promotorů

Kvasinkové transformanty s expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a konstitutivní promotor (příkladně Alfa-mating-faktor-promotor, promotor GAPDH, promotor TPI) se kultivují v 10-litrovém objemu při teplotě 28 °C. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Doba fermentace činí 96 hodin. Koncentrace biomasy, dosažená na konci fermentace, činí 27 g/1 TG. Po oddělení buněk centrifugaci (15 minut, 6500 x g, 4 °C) a sterilní filtraci se provádí čištění produktu z kultivačního média neobsahujícího buňky.

Příklad 6

Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v kvasinkových buňkách za použití indukovatelných promotorů

Kvasinkové transformanty se expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a indukovatelný promotir (příkladně promotor Gal 10 nebo derivát promotoru Gal 10) se kultivují v 10-litrovém objemu při teplotě 28 °C. Po době fermentace 48 hodin se provádí indukce výměnou uhlohydrátu použitého v živném roztoku glukózou po galaktóze. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Doba fermentace činí 96 hodin. Koncentrace biomasy, dosažená na konci fermentace, činí 24g/l Tg. Po oddělení buněk sterilní filtrací (15 minut, 6500 x g, 4 °C) a sterilní filtraci se provádí čištění produktu z kultivačního média neobsahujícího buňky.

Analogicky tomuto způsobu se mohou k expresi mutantního proteinu hIL-4 použít také jiné indukovatelné promotory. V závislosti na druhu zvoleného promotoru se musí použít vhodná indukční technika.

Příklad 7

Exprese mutantního proteinu interleukin-4 v E. coli za použití indukovatelných promotorů

Transformanty E. coli s expresním vektorem obsahujícím gen kódující mutantní protein hIL-4 a teplotou indukovatelný promotor (příkladně ZaznMapL-promotor nebo derivát lambdafiLpromotor) se kultivují v 10-litrovém objemu v živném roztoku LB. Selekce buněk obsahujících vektor se provádí přídavkem 100 mg/1 Na-ampicilinu k živnému roztoku LB (= LB + živný roztok-amp). Očkování násady hlavní kultury se provádí 5 objemovými % 14 hodin staré kultivované předkultury do LB+živný roztok-amp. Teplota fermentace činí při začátku fermentace 30 °C a k indukci promotoru citlivého na teplotu se po dosažení OD600 0,8 až 1,2 zvýší na 42 °C. Během fermentace se pomocí SDS-PAGE provádí kvalitativní zkoušky na expresi mutantního proteinu hIL-4. Po době indukce 4 až 6 hodin se provede ukončení fermentace ochlazením kultivačního roztoku na teplotu 10 až 15 °C. Koncentrace biomasy,

-11CZ 292703 B6 dosažená na konci fermentace, činí asi 5 g/1 FG. Buňky E. coli se sklízí centrifugací v centrifuze s kyvetami (15 minut, 6500 x g, 4 °C), a buněčná hmota se kryopeletizuje přímým kapáním do kapalného dusíku. Purifikace produktu se provádí z takto získané biomasy.

Analogicky tomuto způsobu se mohou k expresi mutantního proteinu hIL-4 v E. coli použít také jiné indukovatelné promotory. V závislosti na druhu zvoleného promotoru se musí použít vhodná indukční technika.

ío Příklad 8

Zpracování mutantního proteinu IL-4

Rozpuštění buněk a izolace „inclusion bodies“ g vlhké hmoty E. coli z příkladu 7 se vloží do 200 ml pufru (0,1 M fosforečného pufru, pH 7,3, 0,1 % Tritonu, 1 mM EDTA, 1 pg/ml Pepstatin) a rozpustí se účinkem ultrazvuku (Branson Sonifíer B 15). „Inclusion bodies“ obsahující produkt se získají pomocí centrifugace (35 000 x g, 20 min.) a promyjí se v rozpouštěcím pufru, obsahujícím navíc 4 M močoviny.

Solubilizace a sulfitolýza produktu

Promyté „inclusion bodies“ se solubilizují ve 125 ml pufru (0,2 M Tris, pH 8,1, 8 M hydrochlorid guanidinu).

Přidají se 4 g siřičitanu sodného a 2 g kaliumtetrathionátu a reakční směs se míchá po dobu 2 hodin. Nerozpustné součásti se po ukončení reakce odstraní centrifugací (35 000 x g, 20 min.).

Gelová filtrace

Zbytek se nanese na sloupec pro gelovou filtraci (Sephacryl-S-300 HR, Pharmacia, 10 x 90 cm) a filtruje se v pufru PBS, který obsahuje 6 M hydrochloridu guanidinu s průtočným množstvím 280 ml/h. Frakce obsahující produkty se identifikují pomocí SDS-PAGE a spojí.

Renaturace

K redukci molekul se přidá β-merkaptoethanol (konečná koncentrace 15 mM). Po dvou hodinách inkubace při teplotě místnosti se násada zředí pětinásobkem vody a dialyzuje se 3 až 4 dny proti pufru (3 mM NaH₂PO₄, 7 mM Na₂HPO₄,2 mM KC1, 120 mM NaCl).

Koncentrace

Dialyzovaný materiál se upraví pomocí kyseliny octové na pH 5 a vodivost se sníží přídavkem vody na < lOmS/cm. Za míchání se k násadě přidá 50 ml CM-Sepharose-FF (Pharmacia), 45 ekvilibrované 25 mM octanu amonného, Ph 5,0. Nevázaný materiál se odfiltruje a gel se plní na sloupec. Produkt se eluuje lineárním gradientem 0-1 M NaCl v 25 ml octanu amonného, pH 5,0 při průtočném množství 300 ml/h. Frakce obsahující produkt se identifikují pomocí SDS-PAGe nebo analytickou chromatografií RP.

Konečné čistění

Poolované frakce CM-Sepharozy se nanesou na sloupec Vydac C-4 (1 x 25 cm, 10 pm) ekvilibrovaný pomocí 0,1 % TFA a eluují se stoupajícím gradientem acetonitrilu. Frakce obsahující čistý produkt se spojí a lyofilizují.

- 12CZ 292703 B6

Sekvenční protokol (1) Všeobecné informace (1) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Bayer AG (B) Ulice: Bayerwerk (C) Místo: Leverkusen (E) Země: Německo (F) Poštovní směrovací číslo: D-51368 (G) Telefon: 0214/3061455 (H) Telefax: 0214/302482 (ii) Název přihlášky: Nové mutantní proteiny hIL-4 jako antagonisty nebo částečné agonisty lidského interleukinu 4 (iii) Počet sekvencí: 5 (iv) Forma uložená v počítači:

(A) Nosič dat: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Provozní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release = 1.0, verze a 1,25 (EPA) (2) Informace o SEQ ID č. 1:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 16 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNA (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:

(C) Individuum isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

CATGCACAAG TGCGAT (2) Informace k SEQ ID č. 2:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 12 základní bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární

-13CZ 292703 B6 (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:

(C) Individuum isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

ATCGCACTTG TG (2) Informace k SEQ ID č. 3:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 21 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:

(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

GCCTCCAAGG ACACAACTGA G (2) Informace k SEQ ID č. 4:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 24 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:

(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:

- 14CZ 292703 B6

GTGAAGGAAG CCGACCAGAG TAGG (2) Informace k SEQ ID č. 5:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 36 základních bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Struktura: jednořetězová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: cDNS (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisense: ne (vi) Počáteční původ:

(C) Individuu isolat: synteticky (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

CTGGAGACTG CCATGGCCCA CAAGTGCGAT ATCACC

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mutantní proteiny lidského interleukinu-4 jako antagonisty nebo parciálního agonisty lidského interleukinu-4, které vedle výměn za známé přírodní aminokyseliny v pozicích 121,124 nebo 125 mají zaveden alanin v poloze 2.