TW458984B - Novel mutant hIL-4 proteins as antagonists or partial agonists of human interleukin 4 - Google Patents

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45 898 4 五、發明説明（i ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明朗於新穎之突變型hIL-4蛋白質》其製備方法 •K及其作為轚藥品*尤其用於超常*錯誤引導之免疫反 應與自體免疫疾病之用途。 其為或其包含hIL-4之拮抗劑或部份促動劑*及此等 拮抗爾或部份促動劑係突變型hIL-4蛋白質，之治療組合 物，業經由PCTtf093/10235掲示。 人類間白素-4( hIL-4)為許多细胞激活素中之一種，其誘 發並協調淋巴细胞與艨细胞之增殖*成熟，存活及分化。 hIL-4尤其涉及IgE-參與之免疫反應，且直接增加胸腺细胞 之增值速率並活化T细胞。以可確定一種具分子量(Hr)為 140,000之高親和性乩-4受體蛋白質，其(根據其〇01^序列 )由800涸胺基酸殘基所组成。此蛋白質羼於最近經描述定 義為血生成素受體超家族之受體組群中之成員。 根據其所選殖之cDHA ·成熟IL-4之胺基酸序列由129 個殘基組成。該cDNA已可於大腸稈菌與酵母菌中表規。具 高生物活性之重組型IL-4可由此等來源獲得。 最近*已知有一種表現對人類間白素4具拮抗特性之單 株抗體。此抗體含有一FabH段，且係由人類/人類融合瘤 细胞株製得。一種經由免疫對抗(未-)耱苷化人類IL-4之 老鼠之脾醱细胞獲得之融合瘤细胞株*亦生產對抗hIL-4之 單株抗體。 間白素4於過敏過程之角色，給予尋求一種抑制間白素 -參與之過程，或與hIL-4競爭，而可阻斷引起疾病反應鍵 之物質之希望。 --- n - - I I— , --- I - n (請先閱讀背面之注意事JA再填寫本頁) 本紙浪尺度適用中國國家#準{ CNS ) Μ規格（2丨公釐】 *5 898 4 a? _B7 五、發明説明（2 ) DE4137333A1描述其中出琨於妤生型之天然胺基酸於 位置 120,121,122,123,124,125,126,127 或 128 其中之一或 多處，被一或多種不同胺基酸取代之突變型hIL-4蛋白質 。此等突變型hIL-4蛋白質為人類IL-4之拮抗劑或部份促 動劑。 本發明係闉於其為人類間白素4之結抗劑或部份促動 劑之新穎突變型hIL-4 *且其中除了於位置121,124或125 之置換外，已完成對hIL-4蛋白質之進一步修飾。此等修 飾像用Μ增進突變型hIL-4之安定性，延長其生物半衰期 或對製備與純化程序有所幫助。 為此*將天然存在野生型之胺基酸於一或多個位置上 刪除或K其它胺基酸置換，或於C末端或N末端插入額外之 胺基酸*以及或將一或多個胺基酸經不同的非-蛋白質聚 合物（例如，聚乙二醇及其衍生物）或經糖苷基取代。 通常，於本發明之範圍内，胺基酸係表示如下： ^^1 ^^^1 n t—^1 - - . 1^1 I..... _ J^i ^eJ (請先聞讀背面之注意事叹再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Ala L-丙胺酸 Arg L-精胺酸 Asn L-天冬醸胺 Asp L-天冬胺酸 Cys L-半胱胺酸 Gin L-麩氨醢胺 Glu L-麩胺酸 Gly L-甘胺酸 His L-組胺酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格U丨0 X 297公釐} 45 898 4 Α7 Β7 五、發明説明（3) lie L-異白胺酸

Leu L-白胺酸

Lys L-離胺酸

Met L-甲硫胺酸

Pro L-脯胺酸

Phe L-苯丙胺酸

Ser L-綠胺酸

Thr L-羥丁胺酸

Trp L-色胺酸

Tyr L-路胺酸

Val L-纈胺酸 為求簡便，可將表示組態之指標省略。 非-蛋白質聚合物意指，例如，聚乙二醇，聚丙二醇 或聚氧基烯類，如揭示於美國專利第4,640,835，4,496,6 89，4,301,144，4,670,417，4,791,192或4,179,337號者 〇 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^^1- -- In ^^1 In 1^1 - "Hi/. m ^^1 n TJ . US. 、\1在 (請先聞讀背面之注意事啖再填寫本頁) 糖苷化作用經了解係指將碳水化合物骨架聯結至天冬 醯胺之側鏈（”N-糖苷化作用")或指將糖類(較佳為N-乙醸 基半乳胺耱，半乳糖或木耱)偶合至絲胺酸，羥丁胺酸，4 -羥基腩胺酸或5-羥基離胺酸(0-糖苷化作用）。 較佳之突變型hIL-4蛋白質為其中胺基酸124(酪胺酸) ，與胺基酸121 (精胺酸)及胺基酸125 (絲胺酸)K任何所希 望组合形式，被可能之天然胺基酸置換，且其中該分子之 Ν-末端及/或C-末蟠又被修飾，並且/或有一或多涸聚乙二 本紙張尺度逋用中國國家榡丰（CNS ) A4規格（210X297公釐） 45 898 4 A 7 B7 五、發明説明（Λ ) 4 經濟部中央標隼局員工消費合作社印裝 醇分子共價结合至該分子，且/或某些或全部存在該分子 中之糖苷化作用部位已經缺失者。 此類中特別較佳之突變型hIL-4蛋白質為其，中胺基酸 124(胳胺酸），胺基酸121(精胺酸)與胺基酸125(絲胺酸)M 任何所希望组合形式，被天冬胺酸或麩胺酸置換，且其中 該分子之末端及/或C-末端又被修飾，並且/或有一或多 個聚乙二醇分子共價結合至該分子，且/或某些或全部存 在該分子中之糖苷化作用部位已經缺失之突變蛋白質。 其它較佳之替代彤式為，胺基酸121 (精胺酸)與胺基酸 125(絲胺酸 > 被天然胺基酸）（較佳為天冬胺酸或麩胺酸)置 換，且其中該分子之N-末端及/或C-末端又被修飾，並且/ 或有一或多涸聚乙二酵分子共價结合至該分子，且/或某些 或全部存在該分子中之之糖苷化作用部位已經缺失者。 特別較佳之突變型hIL-4蛋白質，亦為該等其中賅基酸 124(胳胺酸)被天然胺基酸置換，而0-1個另外位於位置121 與/或125之胺基酸被其它可能之胺基酸置換，且其中該分 子之末端及/或C-末端又被修飾，並且/或有一或多偭聚 乙二醇分子共價結合至該分子，且/或某些或全部存在該 分子中之糖苷化作用部位已經缺失者。 此類中特別較佳之突變型hIL-4蛋白質為其中胺基酸 124(賂胺酸），被天冬胺酸或麩胺酸置換，而位置121係被 其它可能胺基酸(較佳為天冬胺酸或麩胺酸)置換，且其中 該分子之N-末端及/或C-末端又被修飾，並且/或有一或多 多個聚乙二醇分子共價結合至該分子，且/或某些或全部 ^^1 In -tn In ϊ -I— 1^1 m . -- - ^^^1^-8J (請先閲讀背面之注意事呔再填寫本頁) 本紙張尺度遗用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 45 898 4 A7 B7 五、發明説明（c ) 0 存在該分子中之糖苷化作用部位已經缺失之突變蛋白質。 上逑實例中之較佳N-末端修飾形式為，將一胺基酸（ 較佳係 A1 a, G ly, Pro, Ser, Thr，Va 1,且MAla 為最佳(插入N-末端之甲睫胺酸與突變型IL-4蛋白質之天然N-末端之間。 此類經表規製造之實施例為：

Ala(-1)-Tyr(124)Asp

Ala(-1)-Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp

Ala(-1)-Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Ala(-1)-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Ala (-1) -Arg(121) Asp-Ser*(125) Asp。 上述變異體中糖苷化作用部位缺失之較佳型式為，於 位置38之天冬釀胺酸，被其它天然胺基酸（較佳為天冬胺 酸）置換*及/或位置105之天冬醯胺*被其它胺基酸置換 (較佳為天冬胺酸)置換。 此類經表現製造之實施例為：

Asn(38)Asp-Asn(105)Asp-Tyr(124)Asp

Asn(38)Asp-Asn(105)Asp-Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp

Asn(38)Asp-Asn(105)Asp-Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Asn(38)Asp-Asn(105)Asp-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Asn (38)Asp-Asn(105)Asp~Arg(121)Asp-Ser(125)Asp 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i n ^^1 . J— (請先閱讀背面之注意事'再填寫本筲) hIL-4可藉由重組DNA之技術(如於大腸稈菌中），製造 成重組型蛋白質(r*hIL-4)。於此等情況下形成之蛋白質， 可經溶解化復原及分離。然後該rhIL-4具高專一性之生物 活性，其可藉由，例如，测量被活化细胞之DNA合成/增殖 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0'〆297公釐> 經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 4D 898 4 A7 _B7 五、發明説明（β) 〇 ，或由被活化B细胞所表琨之CD23而測定得〔參照， 克魯斯(Kruse),N.等人（1991)FEBS Lett. 286, 58-60; 柯古塔尼(KikutanihH.等人(1986)细胞 47,657-665〕。 躕於包含編碼hIL-4成熟區域之DNA區域，或編碼hIL-4 成熟區域之cDNA之獲得，則參考橫田,Τ. *雄田,Τ.，摩斯 曼（Hosiiiann)，T·，邦吉勞（Banchereau),J·，迪法爾斯（De France)，T. * 伯蘭恰得（Blanchard),D.，迪佛利斯(De Vries), J.E,，李,F.與艾利（Arai) Λ. I. (1986)Proc.

Natl. Acad. ScL,USA 83, 5894-5898及其中所引用之文 獻。於本文中，”編碼hIL-4成熟區域之cDNA”意指，表琨經 該項技藝所特定之確實cDNA之突變型（然而具有大約相同 數目之鹼基對）之cDNA，其包含於提供作為拮抗劑或部份 促動劑之hIL-4突變蛋白質之範圍中。 瞄於連鑛定數編碼hIL-4成熟區域之DNA區域，則依照 加耳(Garr),C.等人，生物化學1991, 30,1515-1523所公 開者。 編碼hIL-4成熟區域之cDNA，可藉由將EcoRV/BamHI片 段從以重姐製備得之cDNA (例如購置英國生物-科技股份有 限公司，牛津，英格蘭)切除而獲得。該DNA片段係藉添加 合成寡核苷酸(如5 ^CATGCACAAGTGCGAT與5 ’ -ATCGCACTTGTC， 其含有間白素之前4傾胺基酸密碼，及起始甲磙胺酸之密 碼)整合入一表琯載體中，例如併入表現載體pRTSpRC109之 Ncol與BanHI切割部位之間〔參照：威格(tfeigel), 11.，麥耳〇4即沈）肩.與錫巴得(5心31<1),¥.(1989)£狀· 〜8〜 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Hi ^^1 ^^1 In .^11 n ' 士^^^1 I ϋϋ U HE u? 、v* (請先閱讀背面之注意事砍再填寫本頁) 0 898 4 A7 __B7 五、發明説明（7 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 J. Biochem. 180, 295-300] 0 IL-4之胺基酸序列變異體，係藉由將適當*經改變之 核苷酸插入編碼IL-4 DNA中，或藉由於活體外合成所希望 形式之IL-4而製得。具此特性之變異體之實例，係IL-4胺 基酸序列中之殘基之缺失或插入或取代。本發明中，允許 任何缺失*插入輿取代之組合形式，K達成提供表規所希 望特性之最後構築结構。該等胺基酸之改變亦可能改變IL -4之轉譯後處理，例如，IL-4之糖苷化作用部位之數目或 位置，膜上固定特性及/或於细胞内之定位*可能因對天 然IL-4之引導序列進行插入*缺失或某些其它影響作用而 改變。 當在構築IL-4之胺基酸序列變異體時*突變部位之定 位及突變作用之本質，取決於欲被改變之IL-4之特性。突 變作用部位可涸別地或連續地改變*例如藉由(1)首先K 保守選擇之胺基酸取代，然後依所達成之結果以較徹底之 選擇進行取代* (2)將標的殘基缺失或(3)於所定位部位之 左右插入殘基。 用K確定作為較佳突變生成部位之特定IL-4殘基，或 區域之適宜方法為，由康寧漢(Cunningham)與威爾斯 (Wells)(科學，244:1081-1085, 1989)所述之”丙胺酸-掃描式突變生成”。於此方法中，一傾或一組標的殘基被 確定出（例如帶電荷之殘基如Arg,Asp,His,LyS與Glu)，並 K中性或代負電荷之胺基酸(較佳為丙胺酸或苯丙胺酸)置 換，Μ此方式，係為影響胺基酸與细胞中*或细胞外鄰近 I ^^^1 - — - - - - ^^^1 . ^^^1 n 一WJ (請先閱讀背面之注意事¾再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家棣率（CNS ) A4規格（210'乂297公釐） A7 45 898 4 _____B7 五、發明説明（8 ) 含水環境之交互作用。然後再經由與取代部位引人另外或 不同之變異體，處理Μ官能基敏感性方式，對取代作用反 應之區域。此意為：雖然改造作用本身之性質並未被事先 決定，然而用Μ引入胺基酸序列改造之位置可被事先決定 出來。 因此，為使於特定位置之突變技巧達到完善，丙胺酸 掃描方法*或陳機突變產生方法，可於具表現業經篩選， 以達成所希望特性的IL-4變異體，之最佳組合形式之標的 密碼或標的區域處完成。 因而當在構築該等胺基酸序列變異體時，有兩種主要 變數*即，突變作用之部位與突變作用之本質。 通常*於具有約1至30個殘基(較佳地約1至10個殘基) 之胺基酸序列中進行缺失作用，係一個一個地進行。一般 ，此等缺失作用直接影響並排之胺基酸殘基。 連績缺失之數目取決於IL-4中被影響區域之三级結構 ，例如所保持之半胱胺酸交聯，貝他平板结構或阿爾伐螺 旋结構。 於胺基酸序列中之插入作用，包括具有長度從1届單 一殘基多至含100或更多個殘基之多肽類，之胺基-末端及 /或羧基-末端融合*以及位於一序列(具一或多傾胺基酸） 中之插人作用。於序列中特定位置之插入作用（即IL-4序 列內之插入作用），一般可包含大約1至10涸殘基，較佳為 1至5，且最好為1至3個殘基。末端插入作用之實例為，具 有Ν-末端甲硫胺醢基殘基之IL-4 (此為於重組型细菌细胞 ^^1 HI 1^1 n .*之 ^^^1 ^ J 0¾ 囔 (請先閲讀背面之注意事孓再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21 ΟΧ2?7公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 45 898 4 A7 B7 五、發明説明（9) 培養中，直接表現1-4之人為結果），介於甲硫胺酸與天然 N端間之一或多個額外胺基酸插入，以增進甲磙胺酸之去 除(例如藉由内生性细菌蛋白酶），及將異源性N-末端信號 序列，接至IL-4分子H-末端之融合作用，Μ促使成熟IL-4 從重組型宿主细胞中分泌出來，或聚胺基酸(如聚組胺酸) 之融合作用*以助於將IL-4分離。通常，此等訊號序列係 選自所預定之宿主细胞型，且因而與該等细胞型同源。適 宜之序列實例為，用於大腸桿菌细胞之〇mpA,ompT,phoA, πκ>1Ε,3·ρ或pelB，用於酵母菌细胞之阿爾伐因子，澱粉晦 *轉化K，殺手毒素與米里素(Millitin)前原肽*及用於 哺乳動物细胞之病毒信號，如泡疹gD。 其它較佳之訊號序列為間白素-4之天然訊號序列。 特別較之訊號序列，為該等由確實表琨生物體自己切 除者，以使突變型間白素-4蛋白質含有天然之N-末端。於 訊號序列已被切除後之較佳表琨產物為：

Tyr(124)Asp

Arg(121)Asp-Tyr(124)Asp

Arg (121)Asp-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp

Tyr (124)Asp-Ser(125)Asp

Ar*g (121) Asp-Ser (125) Asp。 另外之IL-4插入變異體，包括融合至IL-4 N末端或C 末端之免疫生成多狀，例如细菌多肽類如貝他-內醢胺酶， 或由大腸桿菌trp區域編碼之酵素，或是一種酵母菌蛋白 質* K及使蛋白質具有長半衰期之C-末端融合，例如，免 .n - - — — ^^^1 I -- I —^ϋ 一^ (請先閱讀背面之注意事呔再填寫本頁) 本紙張尺度逋用辛國國家標準（CMS ) A4規格（2丨0X297公釐） q 898 4 A7 B7 五、發明説明（1()) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 疫球蛋白固定之區域(或其它免疫球蛋白區域），白蛋白或 鐵蛋白一參照：於W0 89/029225中之敘速(公告於19拙年 4月6日）。另一組變異體為*具有胺基酸取代作用者。此等 變異體中，至少有一個IL-4分子之胺基酸殘基被不同殘基 置換。 一般天然之殘基依其支鍵特徴可分類為： (1) 厭水性：^*61^13,731,1^11與110; (2) 中性親水性：Cys.Ser與Thr ; (3) 酸性：Asp與Giu ; (4) 驗性：知11，61|1，1113，1^8與為「8; (5) 影響鍵位向之殘基：Gly與Pn>;及 (6) 芳香族：Trp,Tyr與Phe。 非保守性取代作用意指其中胺基酸被其它類胺基酸置 換。 胺基酸取代作用之一項用途，為改變多肽之天然糖苷 化作用形式。 ”改變”意指造成天然IL-4中一或多個碳水化合物骨架 之缺失，及/或於夭然IL-4中添加一或多個，原先不存在 之耱苷化作用部位。通常條以N-連結或M0-連结之方式， 將多肽糖苷化作用。”ϋ-連结”意指將碳水化合物骨架，偶 合至天冬醢胺殘基之側_。三肽序列天冬醢胺-X-絲胺酸 ，與天冬醢胺-X-羥丁胺酸(其中X可為除了脯胺酸外之其 它胺基酸），為酵素性催化碳水化合物，偁合至天冬醢胺 側鐽之辨識序列。有此等三肽序列存在多肽中*則產生一 ^^^1 In II -- ^—^1 ^^^1 —^1 ^^^1 - - JH 一 tfl (請先閱讀背面之注意事芩再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2.97公釐） 經濟部中央梂率局員工消費合作社印製 。8 9 8 4 A? __B7 五、發明説明（U) 可能之糖苷化作用部位。”0-連结”意指，將糖類Ιί-乙醢基 半乳胺糖，半乳糖或木糖，偁合至羥基胺基酸（通常為綠 胺酸或羥丁胺酸，而亦可使用4-羥基脯胺酸或5-羥基離胺 酸）。 藉由改變胺基酸序列，使其含有一或多個上述三肽序 列(用於Ν-連結耱苷化部位)之方式，而在IL-4添加糖苷化 作用部位，並不困難。該項改變，同樣可藉將躲胺酸或羥 丁胺酸殘基，添加或取代至天然IL-4序列來達成(用於〇-連结糖苷化作用部位）。為使該方法更簡便，較佳地於DNA 層次上*改變IL-4胺基酸序列，尤其藉由將編碼IL-4之DNA ，於預先選定之鹼基上突變* Κ使所製出之密碼，經轉譯 成為所希望之胺基酸。以相同方式，為完成所希望碳水化 合物骨架之缺失作用*藉由將該三肽之全部或部份取代或 刪除，而改變已存在之一或多偭三肽序列（用於Ν-連結糖 苷化作用）。於0-糖苷化作用部位之情況中，碳水化合物 骨架*可藉由將相對應之胺基酸*取代或刪除而被去除。 另一項用Μ增加IL-4中碳水化合物骨架數目之選擇， 為將糖苷化學或酵素偁合至該多肽上。這些方法之優點在 於*其不需要於宿主细胞中，製備可提供連結或0-連結 糖苷化作用之多肽。視所使用之偁合搌剌而定，可將耱類 連结至(a)精胺酸與組胺酸；（b)游離羧基（c)如胱胺酸之 游離氫硫基，（d)如絲胺酸，羥丁胺酸，羥基脯胺酸之游 離羥基，（e)如苯甲胺酸，酪胺酸或色胺酸之芳香殘基； 或(f)麩氨醸胺之胺基。此等方法揭示於如δ7/05330 (公 ml n^i pftBl ^^^^1 ~1^1^1 J i 言 (請先閲讀背面之注意事呔再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐} 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 υ 898 4 Α7 ___Β7 五、發明説明（12) 告於1987年9月11日），及艾普林(Aplin)與威斯頓(Wriston) 之CRC Crit. Rev· Biochen·，ρρ·259-306 (1981)中。 除了上述方法外，化學或酵素方法亦可用於，將存在 天然IL-4中之碳水化合物骨架去除。於化學去糖苷化作用 中，需要將該多肽暴露於化合物，三氟甲磺酸或相當化合 物中。此處理造成除連结糖(N-乙醣基葡萄胺耱或N-乙醢 基半乳胺糖）外，大部分或全部糖基之去除，然該多肽仍 維持完整。化學去耱苷化作用，係掲示於哈奇慕汀 (Hakki祖uddin)等人，Arch* Biochen. Biophys.，259: 52 (1987)，及亞吉(Edge)等人，Anal· Biochen·, 118: 131 (1981)。多肽中碳水化合物骨架之酵素去除法，可藉 使用一系列由托塔庫拉(Thotakura)等人(Meth. Enzymol. ,138: 350 (1987)，所述之內耱苷酶及外糖苷海來達成。 可藉使用衣嫌素，來防止於可能糖苷化作用部位之糖 苷化作用，其經揭示於杜斯金(Duskin)等人之〔J. Biol. Chen., 257: 3105 (1982)〕。衣嫌素阻斷蛋白質糖苷 連结之形成。 另一型IL-4之供價修飾，包括將IL-4與不同非-蛋白 質聚合物，如聚乙二醇，聚丙二醇或聚氧基烯類，Μ美國 專利4,640,835:4,496,689; 4,301,144:4,670,417; 4,791,192或4,179,337號中所述之方法連结。 用於交職作用之試劑*取代作用之程度及反應條件， 係依使用個別與不同ft鐽反懕，之雙官能試劑（較佳使用 一系列試劑）*之實驗來做選擇。 ~14~ m ^^^1 ^^^1 m an nt an ^^^1 HI ^ J. 0¾--fl (請先閱讀背面之注意事,λ再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 45 898 4 A7 B7 五、發明説明（13) 較佳地，使用一項用K增進蛋白質於活體内循環之半衰 期之選擇，其係將此類蛋白質，共輾至一種可使其具較長半 衰期之聚合物。因此，例如，聚乙二醇（PEG)與C1-NH之共 扼作用，已經證實為一項用K延長半衰期之優良選擇。PEG 為一種非免疫性，直鍵，未帶電荷之聚合物，其每分子環 氧乙烷含有三個水分子*因此可顯著改變被共甎分子之流 體動力特性(馬克斯佛得(Maxfield)等人，聚合物，16 : 505-509;拜利(Bailey),F. E.等人於：非離子性界面活 性劑〔希克編著〕f>p. 794-821, 1967)。已有許多 具醫療用途之酵素與PEG结合* Μ助於達成增進其活體内半 衰期之功效（阿布考斯基(Abuchowski), Α.等人，J.

Biol. Chea. 252: 3582-3586, 1977;阿布考斯基，A.等 人，癌症生化.生物物理，7: 175-186, 1984)。曾指出： 將IL-2(間白素-2)與PEG連结，不僅延長其餘循環中之存活 週期*亦增加其效價(卡瑞(Katre), N. V.等人，Proc. Katl. Acad. Sci. USA, 84：1 487-1491 (1987)； 古德森(Goodson), R.等人，生物/科技，8: 343-346, 1990)。業經報導，將PEG與其它分子連结*可減低此等分子 之免疫性與毒性(阿布考斯基，A.等人，J. Biol. Chem. 252： 3578-3581, 1977) 〇 α-4亦可被包圍於微膠囊〔其係κ (例如)膠粒堆稹技 術或界面聚合作用”(例如，羥甲基纖維素撤膠囊，或 明膠撤膠囊與聚〔甲基丙烯酸甲酯〕微膠囊)製備得〕中 ，形成膠體藥物釋放糸統(如微脂粒，白蛋白微球，微乳膠 ^^^1 ^^^1 am H ίί— ^^^1 m ^^^1 In U3."β (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS〉A4规格（210 X 297公釐） 45 898 4 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（14) ，毫微粒子與毫徹膠囊)或形成巨乳膠液。此等技術揭示 於雷明頓藥物科學（Remington、Pharmaceutical Science ，第16販，歐索(Osol), A.等人編著（1980))。 IL-4製劑亦通用於抗體分離中，作為IL-4分析之標準 物(例如藉由標定IL-4 * Μ用於放射性免疫分析*用於酵 素-偁合免疫分析，或用於放射受體分析中作為標準物）* 藉使用放射性碘*酵素，熒光團，旋轉標定等，標定IL-4 ，使之用於親和性鈍化技術，及受體结合分析（具競爭型 式者）中。 因為難Μ預測IL-4變異體之性質，故可理解地需要對 所獲得之變異體，進行篩檢以尋得最佳之變異體。因此， 例如，藉由競爭性免疫分析，來測定IL-4分子在免疫學特 性上之變化(例如其對一特定抗體之親和性）。篩選具改變 之變異體，包括將其活性與天然IL-4 *於相同分析中所觀察 之活性比較* Μ決定其係增加或減少。其它於蛋白質或多 肤特性中之潛在改變一例如*氧化堪原安定性或熱安定性 ，嫌水性，對蛋白分解作用之敏感性，於重姐型细胞培養 或血漿中之安定性，或與載體聚集或形成多重物(nuiltiiae r)-則使用該技藝所指定之方法來測定。 IL-4之治療配方與施藥形式 本發明新穎化合物，抑制間白素-參與之程序或與hIL-4 競爭。因此他們應缠用於治療超常，或錯誤引導之免疫反應 或自體免疫疾病。此亦包括，初級與次級之免疫缺陷。闞於 此點*拮抗劑可用於移植與腫瘤疾病之媛和治療上。此等 -1 - — --I I ί - _ - m I n .^1 K .^1 T U3 、-* (請先閲讀背面之注意事¾再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2丨0X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 d 5 898 4 A7 B7 五、發明説明（15) 包括，例如： 一過敏症 (阻斷初鈒反應IgE-參與之反應；已知過敏症之脫敏 ;特應性疾病；減輕氣喘發作；高IgE徵候群） —移植 (減低HLA-DR於器官移植中之表琨，壓制GVHD，用於 淨化骨M) 一白血病貧血輿固態IL-4受體-表現腫瘤 (減輕超常之自泌性IL-4製造；抑制腫瘤生長） 一對抗調節血小板之過度產生 -治療血液凝结障礙 (藉由單核白血球阻礙） _用於脂肪代謝作用之障礙 -矯正碳水化合物平衡之障礙 一增進受感染時之免疫狀態(敗血病）。 由於其良好之水可溶度，可系統性或區域性（即局部地 ，包括噴®式吸入)使用該突變體IL-4蛋白質，亦可能將其 調配成延遲釋放製劑*所有治療形式，可依短期治療或持 續性治療來做考量。 IL-4結抗劑之治療配方，係為IL-4拮抗劑之儲存而製備 ，一旦其已達到所希望之纯度，即與生理上所接受之載體 ，輔肋物質或安定劑(雷明頓藥物科學，前所引用)混合， 形成冷凍乾煉劑或水溶液之形式。可接受載體，輔助物質 或安定劑，於劑量及所使用之湄度下，對接受者不具毒性 111 al^i ^^^1 n I - - ml - --I— In 一ffJ (請先閱讀背面之注意事Ιλ再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 5 8 93 4 A7 B7 五、發明説明（16) ;其包括緩衝劑，如磷酸馥，檸檬酸鹽及其它有機酸類； 抗氧化劑，如抗壊血酸*低分子量多肽類(少於約10個殘 基）*蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水 性聚合物，如聚乙烯氫吡咯銅；胺基酸，如甘胺酸，麩氨 醸胺*夭冬醢胺，精胺酸或離胺酸；單_ *雙_與其它釀 類，如葡萄糖*甘露糖或糊精；绀合物形成劑，如EDTA ; 耱醇，如甘露糖酵或葡萄耱醇；形成鹽類之相對離子，如 納；及/或非離子性界面活性物質，如吐溫(Tween),普羅 尼克(Pluronics)或聚乙二醇(PEG)。 位於活性體內使用，IL-4拮抗劑必須為無菌。此可藉 由在凍乾與復原之前或之後，通過無菌瞑過濾器過滤而立 即達成。IL-4诘抗劑一般儲存於冷凍乾燥型式或溶液中。 具有延遲釋放之製劑之適宜實例為，例如，由含有蛋 白質之固體，厭水性聚合物組成之半通透性基質：此等基質 為成型物品*例如薄膜錠劑或微膠囊。具有延遲釋放之基 質實例為聚酯類，水凝膠〔如聚(2-理乙基甲基丙烯酸酯） 一由藍格(Langer)等人，J. Blomed. Mater. Res.，15: 167-277 ( 1981)及藍格，Chem. Tech., 12: 98-105 〔1982〕所述一或聚(乙稀醇）〕，P〇lyactides(美國專利 3,773,919號，歐洲專利58,481號），由L-麩胺酸與L-麩胺 酸加瑪-乙酯姐成之共聚物(席曼等人，生物聚合物，22: 574-556 〔1983〕），不可降解性乙酸伸乙基乙烯酯(藍格 等人，前所引用），可降解性乳酸/羥基乙酸共聚物如Lupr* on DepotTM (乳酸/羥基乙酸共聚物與白脯萊（leupro 1 ide) 普 i 1 1^1^1 i ^^^1 . I— nn ^^^1 IE ^^^1 l ·* 泠 、ν· (請先鬩讀背面之注意事VT再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公嫠） A7 B7 45 898 4 五、發明説明（17) 乙酸酯組成)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利133,988) 。雖然諸如乙酸伸乙基乙烯酯與乳酸/經基乙酸，可使分子經 過一段超過100天之時間釋出，而於某些水凝膠之個案中 ，蛋白質經過較短之時間釋出。若經封膠之蛋白質留存於 體内一段相對長之時間，他們可能於371下變性，或因濕氣 而聚集，導致生物活性喪失，且可能改變其免疫性。視所討 論的機制而定，可發展出用K穩定蛋白質之有用策略。若 經發現，例如，導致導致聚集之櫬制係，基於因磙=磙化 物交換而造成分子間S-S鍵橋之形成*則穩定作用可藉改 變氫硫基，從酸溶液冷凍乾燥*控制液賸含量，使用適宜 之添加劑，及發展特異之聚合物/基質姐合物來達成。 具有延遲釋放IL-4诘抗劑配方*亦可包括包被於微腊粒 之IL-4拮抗劑。含有IL-4拮抗劑之微脂粒，係Μ本身已知之 方法製備得：德國專利DE 3,218,121 ;艾斯坦(Epstein) 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985);黃等人，Proc. Natl. Acad. Sci. liSA，77: 4030-4034 (19 80);歐洲專利52,322 ;歐洲專利 36,676 ;歐洲專利88,046 ;歃洲專利143,949 ;歐洲專 利142,641 ;日本專利申請案83-118008 ;美國專利 4,485,045與 4,544,545號；以及歐洲專利 1〇2,324。一 般，微脂粒具有小體積(直徑大約200-800埃)之單層型式 ，其具有大於約30莫耳％膽固醇腊肪含量，比例賭最佳IL -4拮抗劑而調整。具有經延長循環時間之微腊粒，揭示於美 國專利 5,013,556。 -- - 1^1 HI . HI *^1 —>I 1— (請先閲讀背面之注意事巧再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中圃國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4 5 898 4 A7 五、發明説明（18) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印装 本發明之另一用途係闞於將IL-4拮抗劑併入”成型物 品”中。後者係用K緩和或預防衝擊之發生。 y施例1 突變體hIL-4蛋白質中潛在N-糖苷化作用部位之去除 於天然hIL-4胺基酸序列中*存在兩個天冬醯胺-偁合之 糖基化作用部位，胺基酸位置38與105。結構基因中之相 對應密碼，可以編碼天冬胺酸之密碼置換。此防止當基因於 酵母菌株中表現時，所形成突變型IL-4蛋白質之N-糖苷化 作用。 突變型IL-4蛋白質结構基因中之兩個密碼置換(部位-引導之突變生成），係依照丹格(Dang)與尼可拉夫(Nickol off)之方法〔Anal. Biochem· 200: 81 (1992)〕使用選 殖載體PUC18達成。需要用來改變结構基因之合成聚核苷 酸具有下列序列： a) 用於於位置38上以天冬胺酸置換天冬醸胺： 5'-GCCTCCAAGGAC b) 用於於位置105上以天冬胺酸置換天冬醢胺： 5，-GTGAAGGA纖 於以上核苷酸序列中，畫底線之位置指示為天冬胺酸 之密碼。 該項核苷酸中之密碼之置換係MDNA定序方法來做確 定。將經改變之結構基因插入酵母菌表琨載體中*於適當 菌株中表琨。 I I …I _ 1 I I . 灯 {請先閱讀背面之注^|^8再填寫本頁) 普 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 898 4

* kr 五、發明説明（19) 專利申請^84107101號 ROC Patent Appin. No.84107101 中轉呢寶脩正及30頁-附件(一)

Amended Pages 21j 33 of the Chinese Specification EncL I (S® bt> ΐυ >3 曰修!QgglJ (Amended 4 Subnitted on October 1997) 經濟部中央樣率局員工消費合作社印裝 於位置(+2)插入一胺基酸，K於大腸稈菌中製備缺少N-末端甲硫胺酸之iL-4突變型蛋白質。 為製備一種缺少N-末端甲硫胺酸之IL-4突變型蛋白質 ，遂將一胺基酸插入於位置(+2)上，其於大腸捍菌中，促 使一種特定之甲硫胺酸胺基肽_，將N-末端甲硫胺酸去除 (沸林達（Flinta)等人，Eur. J. Biochem. 154 193-196, 19δ6)。為進行此項工作，將載體成1^9-11^-丫 124D (圖1 ) Κ限制核酸内切海Xhol與Bamiil切開。 所形成(大约450bp)帶有IL4Y124D基因序列訊息之DNA 片段，與較短(大約50bp)得自載體atpE區域之片段，经由瓊 脂凝膠電泳術纯化*並將其重新選殖至M13rapl8(其已用Sa II與BainHI切開）。製備單股DHA並使用下列寡核苷酸，進行 活體外突菱生成反懕： 51CTGG AGACTGCCATGGCCCAC AAGTGCGATATCAA3 ’ 此項突變生成之结果，胺基酸丙胺酸(密碼GCC)係插於I L4Y124D基因之位置（+2)中。此外，將ficol裂解部位引入 於基因之5·端，以幫助後缡於表琨載體中之篩選與選殖。 Μ限制分析之方法使用雙股M13 RF DNA(複製形式)來篩選溶 菌斑。具正表現之選殖株，Κ酵素Ncol與BaraHI之限制消化 確定。除此之外，已定序法確認正確之序列。 使用Ncol與BaniHI將一長度大約400bp之DNA片段，從選 得之Μ13ιιιρ1δ選殖株中切出，以瓊脂凝膠電泳術纯化，並 選殖於載體pTrc99A(可由法瑪西雅）P-L生物化學品公司(Ρ harmacia P-L Biochemlcals)購得）中，其同樣也已绖以 ---------1 1,1#农------、1T (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格ί 210X297公釐） 898 4 A7 B7 五 '發明説明（2Q)

Ncol與BamHI切開。Μ載體，pAPH100(IL4Y125D)，其由此 項選殖中獲得，轉型大腸桿菌细胞(TGI)，並於含有胺苄 青黴素之營養基質上進行篩選。經蛋白質之表現與純化後， 產生缺少H-末端甲硫胺酸之IL-4突變型蛋白質。 奮淪例3 酵母菌细胞之發酵 螢着溶液 下列營養溶液係用於培養表現突變型hIL-4蛋白質之 酵母菌细胞： 營養溶液 成份 SD2 SC6 Bacto酵母菌氮源 6.7克/升 Difco酵母抽出物 20.0克/升 葡萄糖 20.0克/升 5.0克/升 6.7克/升 1.4克/升 (NH4)2S〇4 2.0克/升i MgS04 〇·5克/升 消泡劑PPG200 1 0.1克/升 - , -— -- 」j ~~各成份製備於去礦質水中*且將pH調至5.5。混合物 於12ΐυ下滅菌20分鐘。將葡萄糖溶於1/5所需要體積之去 礦質水中，分開滅菌並於泠卻後，加至其餘營養溶液中。 (請先閱讀背面之注意事年再填寫本頁) 裝. -1Τ .丨知 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 儲存菌株 所有酵母菌轉形株之儲存菌株，係將儲存容器充入2 毫升預先培養物*並將儲存容器保存於液態氮中而製備得。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > Α4规格（210X297公釐）

a D 898 4 Α7 Β7 五、發明説明（21) 預先培養物之發酵，係於1升搖晃燒瓶(其各充Κ200毫 升SD2營養溶液)中完成。於這些燒瓶内接種一儲存菌株，或 從SD2壤腊平板上取得之單一菌落。將培養物於26-30t：下， 伴隨連鎮搖晃培育2-3天。 主要培養物發酵 主要培養物之發酵，係於Sc6營養溶液中，使用10升攪拌 槽發酵器來完成。使用3-5體積％之預先培養物(其原先之 生質量經離心去除，並於接種前再懸浮於Sc6培養基中），來 進行接種。對於10升主要培養物之發酵條件如下： 溫度 授拌器之旋轉速率 通氣速率 pH值設定點 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 26-30¾ 6000rpm 0.5 vvm 5.5(使用5冊3〇11與5好 阳04來校正） 於發酵進行5小時之後，將培養基連縝餵以葡萄糖與 酵母抽出物。餵料速率係依培養饬之呼吸商數(RQ值)作調 整。RQ設定點為1.0。餵給溶液具有下列姐成物： 匍萄糖 500克/升 Difco酵母抽出物 75克/升 將組成份分別溶於去礦質水中，並於121¾下滅菌20 分鐮。待冷卻後將該兩種溶液組合。 當使用受誘發性GallO啟動子或GallO啟動子之衍生物 時，則藉由將餵給溶液中之葡萄糖(500克/升)換成半乳糖 ^^1- - ^^^1 4m n^i nn TJ (請先閲讀背面之注意事啖再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家橾率（CNS ) A4规格（210X297公釐）

ά5 898 A Α7 Β7 五、發明説明（

2Z 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 (500克/升)以進行誘發作用。其後*餵料速率不再依RQ值 做調整。餵料速率以手動調整，至誘發作用發生時之餵料 速率之兩倍。一般，Gal 10啟動子係於大約48小時之發酵 期間後被誘發。 细胞之收取 於發酵完成後(18-120小時），將發酵器內之内容物冷 卻至10-15Ϊ：，其中细胞內表現已經發生，並K標準離心 技術(如吊桶離心機)收取酵母菌细胞，經離心後得到细胞 之質量，藉由將其直接逐滴加入疲態氮中，而直接形成極冷轉 粒，並儲存於-80t：下。由以此方式廉理之细胞質量做成 產品。當異源蛋白質被分泌至培養液中時，則將酵母菌细 朐Κ檷準離心技術(如吊桶離心機）*或以交流微過濾方法（ 如Piltrom-Minisette系統)從培養液分離出。若需要，將 培養液Μ過滤法滅菌。進一步由不含细胞之培養液作成產 品。 奮施例4 大腸捍菌之發酵 營羞溶液 表現突變型hIL-4蛋白質之大腸稈菌(E. Coli)轉形株， 係培養於含有下組成物之LB營養溶液中·-Bactotrptone 10 克/升 Bacto酵母抽出物 5克/升 NaCl 10 克/升 將組成物溶解於去離子水中，並於12ΐυ下滅菌20分鐘

I

I I % 訂 -24〜 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 45 898 4 A7 B7 五、發明説明（23) 。於接種之前，將適合用來篩選轉形株之抗生素(例如1〇〇 毫克/升胺苄青嫌素納，或50毫克/升卡那嫌素硫酸鹽，視載讀 中所使用之遘擇記號(selection Barker)而定)於無菌狀 況下加入營養溶液中。 儲存菌株 所有大腸稈菌轉形株之儲存菌株，係將儲存容器充入 2毫升預先培養物，並將儲存容器保存於液態氮中而製備 得° 預先培養物 預先培養物之發酵係於1升搖晃燒瓶(其各充以200毫 升LB營養溶液）中完成。使用一儲存菌株*或使用得自LB瓊 脂平板之單一菌落進行接種。將培養物於30t：下伴随連續 搖晃培育12-18小時。 主要培養物發酵 主要培養物之發酵，係於LB營養溶液中，使用10升攪 拌槽發酵器來完成。使用卜5體積％之預先培養物(其原先 之生質量從預先培養物中雕心出*並於接種前再懸浮於新 鲜LB培養基中）來進行接種。對於10升主要培養物之發酵 條件如下： 背 事 填 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 起始溫度 搜拌器之旋轉速率

30它（當使用溫度-可誘發型 啟動子時） 37 t：(當使用IPTG-可誘發型 載體時） 500 rpiH 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） Α7 Β7 五、發明説明（24) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 通氣速率 0.5 vvm 為偵査生質量之成長，每經過大約1小時，從培養液 取出無菌樣本，並且於600nm下测定其光學密度(0D 600)。 一旦0D 600達到0.8到1.2，及誘發培養物。視所選用之啟 動子而定，誘發作用之發生如下： 溫度誘發作用： 將發酵溫度從301C增加至42Ό IPTG誘發作用： 無菌添加異丙基-点-D半乳哌 喃糖苷至最終濃度為0.4mM 代表性地，誘發期為4-8小時。 细胞之收取 於發酵完成後(6-14小時），將發酵器內之內容物冷卻 至10-15t，並Μ標準離心技術(如吊捅離心機)收取细 菌细胞，於離心之後獲得之细胞質量(若適當)暫時保存於 冷凍狀態。由Μ此獲得细胞質量做成產品。 實施例5 突變型間白素4蛋白質於使用基本啟動子 (constitutive promoter)之酵母菌细胞中之表琨 將帶有一包含編碼突變型hIL-4蛋白質之基因，及基本 啟動子(如阿伐交配因子啟動子，GAPDH啟動子或TPI啟動 子)之表現載體之酵母菌轉形株* K10升之規模於28t下培 養。於發酵期間，使用SDS PAGE定童測試突變型hIL-4蛋 白質之表現。發酵進行時間為96小時。於發酵結束時生質 量之濃度已達27克/升乾重。於Μ離心(15分鐘，6500xg ，4勺）將细胞分離出，並經過漶滅菌之後，由無-细胞之 - - - - - _ .^1^1 ϊ IJ^^i ^nr n^i ^in >SJ (請先閱讀背面之注再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） 千2893 4 · A7 B7 五、發明説明（25) 培養液製成產品。 奮施例6 突變型間白素4蛋白質於使用可誘發性啟動子之酵母 菌细胞中之表現 將帶有一包含編碼突變型hIL-4蛋白質之基因，及可誘 發性啟動子(如GallO啟動子或GallO啟動子之衍生物)之表 現載體之酵母菌轉形株*以10升之規模於28Ό下培養。於發 酵期48小時之後，藉由將用於餵給溶液中之碳水化合物*從 葡萄糖改變為半乳糖，來進行誘發作用。發酵期間，使用 SDS PAGE定蠆測試突變型hIL-4蛋白質之表琨。發酵進行 時間為96小時。於發酵結束時生質量之濃度已達到24克/ 升乾重。於將细胞分離出，並經過濾滅菌之後，由無-细 胞之培養液製成產品。 其它適用於表現突變型hIL-4蛋白質之可誘發性啟動 子，亦可K此相同之方法使用。必須視所選擇之啟動子之 本質，而決定使用適宜之誘發技術。 麵例7 突變型間白素4蛋白質於使用可誘發性啟動子之大腸 稈菌中之表現 經濟部中央標準局負工消費合作社印裂 I;--------裝-- (請先閱讀背面之注意事3再填寫本f ) 將帶有一包含編碼突變型hIL-4蛋白質之基因，及溫度-可誘發性啟動子(如λ pL啟動子或λ pL啟動子之衍生物)之 表現載體之大腸桿菌轉形株，以10升之規模於LB營養溶液中 。帶有載體之细胞，K於LB營養溶液中添加100毫克/升胺苄 青黴素納（=U+Aibp營養溶液)進行篩選。於主要培養混合 本紙张尺度逋用中圏國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} 4 5 898 4 A7 五、發明説明（26) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 物中，接種5體積％培養於LB+Amp營養溶液之U小時久前培 養物。於發酵開始時，發酵溫度為30t：且，在到達0.8-1. 2之0D 600值之後，將此溫度調升至4210，以誘發溫度敏 感性啟動子。於發酵期間，使用SDS PAGE定量測試突變型 hIL-4蛋白質之表現。誘發時間4-6小時之後，藉由將培養 液冷卻至10-15C，來终止發酵。於發酵結束時生質量之濃 度已到達5克/升濕重。Μ於吊桶離心機中離心(15分鐘， 6500xg，41)收取大腸稈菌细胞，將细胞質量，藉由將其 直接逐滴加入液態氮中，而形成極冷顆粒。接著將以此方 法快速冷凍之生質量，儲存於-80C下。由已經此方法處 裡之生質量製成產品。 其它適用於大腸桿菌中表琨突變型hIL-4蛋白質之可 誘發性啟動子，亦可以此相同之方法使用。必須視所選擇 之啟動子之本質，而決定使用適宜之謗發技術。 窨施例8 突變型IL-4蛋白質之回收 钿_崩解街肉含體之分饈 將25克濕重由實施例7獲得之大腸桿菌^於200毫升 鑀衝液(0.1 Μ碟酸鹽緩衝液，PH7.3 * ，1 bM EDTA，1微克/毫升抑狀素)中’並从超^波 崩解(Bra_ Son丨fier Β15)。含有產物之1 法(35,000xg，20分鐘)分離，並於另外含有4 M尿累之崩 解媛衝液中清洗。 產物之溶解化作用與亞硫酸 _____** 1^1 - I ^n. 1- ί I — , i^i ^^1 ^^1 ^^1 1^1 (請先閲讀背面之注意事i,再填寫本頁) 本紙浪尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4C格（2丨〇乂297公釐） 4 5 898 4 A7 B7 經濟部中夬標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（27) 將經清洗之肉含體*溶解於125毫升鍰衝液(0*2 M Tris ，ί>Ηδ.1，8 Μ氫氯化胍）中。將4克亞硫酸納輿2克四硫 磺酸鉀加人，並將反應混合掁拌2小時。帶反應完成後， 將未溶解之組成物以離心法(35,000xg，20分鐘)去除。 凝膣遒濾 將上清液裝載於凝膠過漶管柱(Sephacryl-S-300 HR ，法瑪西雅，10x90公分），並於含有6 Μ氫氯化脹之PBS 緩衝液中，使用280毫升/小時之流速，進行凝膠遇滤。將含 有產物之流份KSDS PAGE確定，並收集組合。 性霤還原 將冷-羥基乙醇(最終濃度15πιΜ)加人，以使分子堪原。 於室溫下培育2小時之後將混合物以水稀釋5倍，並於媛衝 液(3ibM HaHifU，7mMNa2HP04 ，2nM KC1，120mM NaCl)中進行透析3-4天。 mm 使用醋酸將經過透析之物質調蝥至pH 5，並藉由添加 水*將傳導度減低至小於等於10mS/公分。將50毫升CM-瓊腊 糖凝膠-FF(法瑀西雅）（其K25biM醋酸銨平衡，pH 5.0)於 授拌同時加入混合物中，將未鍵結之物質濾除*並用該凝膠 來填充管柱◦產物以線型梯度之0-1M NaCl (存於25nM醋酸 銨中，p Η 5.0) »使用300毫升/小時之流速進行溶析。含 有產物之流份* MSDS PAGE或以分析用RP色層分析術確定。 愚後純化 將全部CM-瓊腊糖凝膠裝載於一Vytfec C-4管柱(1x25 公分，10微米）*其已經M0.1% TFA平衡，之上，並Μ上 -29- —^ι· —1 1^1 - j m 4*m n ^^^1 、y9J (請先閱讀背面之注意事v〇再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）

45 898 4 五、發明説明（28) ' ( 升梯度之乙睛溶析。將含有純產物之流份收集姐合並冷凍 乾燥。 圖式簡單說明 圖1說明載體RPRa-!L-4-Y124D之構造 序列明细表 (1) 一般資料： (i)申請者：

(A) 名稱：拜爾AG (B) 街道名：拜爾威爾克(Bayerverk) (C) 城市名：里佛庫森(Leverkusen) (E) 國名：德國 (F) 郵遞區號：D-51368 (G) 電話：02U/3061455 (H) 傳真號碼：0214/303482 (ii)申請案名稱：作為人類間白素4之拮抗劑或部份促 動劑之新穎突變型hIL-4蛋白質 (iii)序列數目：5 (W)電腦可讀取形式： (A)介質類型：軟式磁碟片 ⑻電腦：IBM PC可相容

(C) 操作系统：PC-D0S/MS-D0S (D) 軟體：專利入放(Patent In Release)#1·0， 譯本 #1·25(Ε：ΡΑ) (2) 序列鑑定第1號(SEQ ID Ν〇·1)之黃料 (ί)序列特徼： (Α)長度：16鹼基對 本紙張又度適用中國困家揉準（CNS > A4規格（210XW7公簸） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部宁央搮率扃貝工消费合作社印¾ 4 5 8984 A7 B7 五、發明説明（％) 經濟部中央標率局員工消費合作社印裝 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線形 (Π)分子類型：d)NA (iH)假定值：否 (Hi)反有意義：否 (vi)原始來源： (c)涸體/分離物：合成 (xi)序列描逑：序列鑑定第1號： CATGCACAAGTGCGAT (2)序列鑑定第2號之資料 (i)序列特徼： (A) 長度：12驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓樸學：線形 (Π)分子類型：cDNA (iii)假定值：否 (ΠΪ)反有意義：否 (νί)原始來源： (c)個體/分離物：合成 (χϊ)序列描述：序列鑑定第2號： ATCGCACTTGTG (2)序列鑑定第3號之資料 -31- (請先閱讀背面之注意事5再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} η 5 898 4 Α7 Β7 五、發明説明（3()) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 (υ序列特徵： (Α)長度：21鐮基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線形 (Π)分子類型：cDHA (iii)假定值：否 (Hi)反有意義：否 (W)原始來源： (c)個體/分離物：合成 (xi)序列描逑：序列鑑定第3號： GCCTCCAAGGACACAACTGAG (2)序列鑑定第4號之資科 (i)序列特激： (A) 長度：24驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線形 (Π)分子類型：cDNA (Πϊ)假定值：否 (iii)反有意義：否 (vi)原始來源： (c)個體/分離物：合成 (xi)序列描述：序列鑑定第4號： 1 I— n^i. - - HI I i 士又- ---- ---I ---- ---\ I， 、v* (請先閲讀背面之注意事i.再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 4 5 B98 a A7 B7 五、發明説明（31)

GTGAAGGAAGCCGACCAGAGTACG (2)序列鑑定第5號之資料 (i)序列特徵： (A) 長度：36驗基對 (B) 類型：核酸 (C) 股數：單股 (D) 拓撲學：線彤 (Π)分子類型：cDNA (Πί)假定值：否 (Hi)反有意義：否 (vi)原始來源： (c)涸體/分離物：合成 (xi)序列描逑：序列鑑定第5號： CTGGAGACTG CCATGGCCCA CAAGTGCGAT ATCACC (請先閲讀背面之注意事3再填寫本頁) 經濟部中央標隼扃員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準{ CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. Amended Claims in Chinese - Enel. (I) (民國90年8月15日送呈） (Submitted on August 15 , 2001) 1. 一種作爲人類間白素4之拮抗劑或部份促動劑之人類 突變型間白素4蛋白質，其特徵爲，除了於人類間白 素-4野生型位置121，124或125之置換外，丙胺酸經 插入於位置2中；其中人類間白素-4野生型具有下述 胺基酸序列： His-Lys-Cys-Asp^Ile-Thr-Lcu-Gln-Glu^Il^^ 1〇 工le-Lys-Thr-Leu-A3n-Ser“Leu-Th:c-61114111- 20 Lys -Thr-Leu-Cys-Thr-Olu-Leu-Thr-Val-Thr^ 30 Asp-Ile-Phe-Ala-Ala-Ser-Ijys-*Asn-Thr-ThrM 40 Glu-Lys-Glu-Thr-Phe-Cys-Arg^Ala-Ala-Thr*- 50 Val-LeU'-Arg^Gln-Phe^Tyr-Ser-HiS'-His-Glu- 60 Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala- 70 Glrv-Gln-Phe-Hi s-Axg-His-Lys ^Gin-Leu-lie- 80 Arg-Phe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu- 90 Trp-Gly-Le-u^Ala-Gly-Ijeu-Asn-Ser-Cys-Pro- 100 Val-Lys-Glu-Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu- 110 Asn-Phe-LGU-Glu-Arg_Leu-Lys-Thr-Ile-Met:- 120 Arg-Glu-Lys^Tyr-Ser-Lys^Cys-Ser-Ser 129 ;及人類間白素-4野生型位置121，124或丨25上之胺 基酸被天門冬胺酸或榖胺酸置換D -34- 84207b修刪 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297公釐> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ! * I I I 訂---------銹. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 45 898 4 8 8 8 8 ABCD τ、申請專利範圍 2. —種作爲人類間白素4之拮抗劑或部份促動劑之醫藥 組成物，其包含根據申請專利範圍第1項之人類突變 型間白素4蛋白質。 (請先閱讀背面之>;i意事項再填寫本頁) 裝-------- 訂—--------^_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮）