SK284391B6

SK284391B6 - Mutantné proteíny ľudského interleukínu-4 ako antagonisty alebo parciálne agonisty ľudského interleukínu-4, liečivá, ktoré ich obsahujú, a použitie

Info

Publication number: SK284391B6
Application number: SK1692-96A
Authority: SK
Inventors: Hanno Wild; Rudolf Hanko; Michael D�Rschug; Hans-Dietrich H�Rlein; J�Rgen Beunink; Heiner Apeler; Hermann Wehlmann; Walter Sebald
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 2005-03-04
Also published as: ATE190068T1; WO1996001274A1; JP2011102302A; EP0769020A1; SK169296A3; HU221416B1; HUT77577A; US6130318A; EP0769020B1; TW458984B; HU9603563D0; ES2145280T3; DE59507920D1; CZ384896A3; GR3033498T3; NO965621D0; NO965621L; CZ292703B6; ZA955443B; CA2193993A1

Abstract

Sú opísané mutantné proteíny hIL-4 ako antagonisty alebo parciálne agonisty ľudského interleukínu-4, ktoré okrem výmen v pozíciách 121, 124 alebo 125 majú navyše inzerciu aminokyseliny medzi N-terminálnym metionínom a prírodným N-koncom HIL-4 mutantného proteínu, a ich použitie ako liečiv, obzvlášť pri neprimeraných, chybne riadených imunitných reakciách a autoimunitných chorobách.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka mutantných proteínov hIL-4, spôsobu ich výroby a ich použitia ako liečiv, obzvlášť pri neprimeraných, chybne riadených imunitných reakciách a autoimunitných chorobách.

Doterajší stav techniky

Z PCT WO 93/10235 sú už známe terapeutické prostriedky, ktoré sú alebo obsahujú antagonistov alebo parciálnych agonistov hIL-4, pričom antagonisty alebo parciálne agonisty sú mutantné proteíny hIL-4.

Ľudský interleukín-4 (hIL-4) je jeden z radu početných cytokínov, ktoré indukujú a koordinujú proliferáciu, zretie, prežívanie a diferenciáciu lymfoidných a myeloidných buniek. Obzvlášť sa hIL-4 podieľa na imunitej reakcii mediovanej IgE a priamo urýchľuje proliferáciu tymocytov a aktivovaných T-buniek. Bolo možné identifikovať vysoko afinný receptorový proteín pre IL-4 o Mr 140 000, ktorý podľa sekvencie cDNA pozostáva z 800 aminokyselinových zvyškov. Ten patrí do nedávno opísanej skupiny receptorov, ktoré sa označujú ako nadrodina hematopoietín -

- receptorov.

Sekvencia aminokyselín zrelého hIL-4 pozostáva zo 129 zvyškov, ak sa za základ zoberie klonovaná cDNA. Táto cDNA sa exprimuje v E. coli a kvasinkách. Z týchto zdrojov sa môže získať IL-4 s vysokou biologickou aktivitou.

Už zo skoršej doby je známa monoklonálna protilátka, ktorá oproti ľudskému interleukínu-4 má antagonistické vlastnosti. Táto protilátka obsahuje jeden fragment Fab a produkuje ho hybridómová línia človek - človek. Tiež jedna hybridómová línia z buniek krysy imunizovancj (nie)glykozylovaným ľudským IL-4 produkuje monoklonálnu protilátku proti hIL-4.

Na základe úlohy interleukínu 4 pri alergických procesoch je možné očakávať, že látky, ktoré procesy vyvolané interleukínom 4 inhibujú alebo ľudskému hIL-4 konkurujú, prerušia reťaz reakcii vyvolávajúcich chorobu.

V DE 41 37 333 A 1 opisujú mutantné proteíny hIL-4, pri ktorých sú v jednej alebo v niekoľkých pozíciách 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 alebo 128 pri divokom type prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny (aminokyselín) nahradené jednou alebo niekoľkými možnými prírodnými aminokyselinami. Tieto mutantné proteíny sú antagonisty alebo čiastočné agonisty ľudského IL-4.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú mutantné proteíny ľudského interleukínu-4 ako antagonisty alebo parciálne agonisty ľudského interleukínu-4, ktoré sú charakteristické tým, že okrem výmien v pozíciách 121, 124 alebo 125 majú navyše inzerciu aminokyseliny medzi N-terminálnym metionínom a prírodným N-koncom HIL-4 mutantného proteínu.

Výhodné sú mutantné proteíny ľudského interleukínu -

- 4, v ktorých je inzertovaná aminokyselina glycín, prolin, serín, treonín alebo valín, alebo alanín a mutantné proteíny vybrané zo skupiny zahrnujúcej Ala(-l)-Tyr(124)Asp

Ala(-1)-Arg( 121) Asp-Tyr( 124)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)-Ser( 125)Asp

Ala(-1 )-Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp Ala(-1 )-Arg(l 21 )Asp-Ser( 125)Asp

Ďalším predmetom vynálezu sú liečivá obsahujúce mutantné proteíny uvedené skôr a použitie týchto mutantných proteínov ľudského interleukínu-4 na výrobu liečiv.

Predložený vynález sa týka iba tých mutantných proteínov hIL-4, ktoré sú antagonisty alebo čiastočné agonisty ľudského interleukínu-4, v ktorých sú navyše k zmene (zmenám) na pozíciách 121, 124 alebo 125 vykonané ďalšie modifikácie proteínu hIL-4. Tieto modifikácie sa vykonávajú pre zvýšenie stability mutantného proteínu hIL-4, na predĺženie biologického polčasu života alebo na uľahčenie výrobného alebo purifikačného procesu.

Na to sa aminokyseliny, ktoré sa prirodzene vyskytujú v divokom type, deletujú, prípadne sú nahradené inými aminokyselinami, v jednej alebo v niekoľkých pozíciách, alebo sa zavedú dodatočné aminokyseliny - tiež na C-konci alebo N-konci alebo sa jedna, alebo niekoľko aminokyselín substituuje rôznymi neproteínovými polymérmi, ako je napríklad polyetylénglykol a jeho deriváty alebo glykozylovými zvyškami.

V rámci vynálezu znamenajú aminokyseliny všeobecne Ala L-alanín

Arg L-arginín

Asn L-asparagín

Asp L-kyselina asparágová

Cys L-cysteín

Gin L-glutamín

Glu L-kyselina glutámovú

Gly L-glycin

His L-histidín íle L-izoleucín

Leu L-leucín

Lys L-lyzín

Met L-metionín

Pro L-prolín

Phe L-fenylanín

Ser L-serín

Thr L-treonín

Trp L-tryptofán

Tyr L-tyrozín

Val L-valín pričom na zjednodušenie je možné potlačiť označenie konfigurácie.

Neproteínovými polymérmi sa chápe napríklad polyetylénglykol, polypropylénglykol alebo polyoxyalkylény, ako ich opisujú US patenty č. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144,4 670 417,4 791 192 alebo 4 179 337.

Pod pojmom glykozylácia sa chápe napojenie uhľovodíkovej štruktúry na bočný reťazec asparagínového zvyšku („N-glykozylácia“) alebo napojenie cukru, výhodne N-acetylgalaktózamínu, galaktózy alebo xylózy na serín, treonin, 4-hydroxyprolín alebo 5-hydroxylyzin (O-glykozylácia).

Výhodné sú mutantné proteíny hIL-4, pri ktorých jc aminokyselina 124 (tyrozín), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serín) v ľubovoľnej kombinácii vymenená za niektorú z možných prirodzených aminokyselín a pri ktorých je navyše N-koniec a/alebo C-koniec v molekule modifikovaný a/alebo je na molekule kovalentne viazaná jedna alebo niekoľko polyetylénglykolových molekúl a/alebo sú v molekule sa vyskytujúce glykozylačné miesta čiastočne alebo úplne deletované.

Obzvlášť výhodné vyhotovenia z tejto skupiny sú mutanty, pri ktorých je aminokyselina 124 (tyrozín), aminokyselina 121 (arginin) a aminokyselina 125 (serín) v ľubovoľnej kombinácii vymenené za kyselinu asparágovú alebo glutámovú a ktorých je navyše N-koniec a/alebo C-koniec v molekule modifikovaný a/alebo je na molekulu kovalentne viazaná jedna alebo niekoľko polyetylénglykolových molekúl a/alebo sú v molekule sa vyskytujúce glykozylačné miesta čiastočne alebo úplne deletované.

Výhodnou formou vyhotovenia je rovnako výmena aminokyseliny 121 (arginín) a aminokyseliny 125 (serín) za prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu, výhodne kyselinu asparágovú alebo glutamovú a pri ktorých je navyše N-koniec a/alebo C-koniec v molekule modifikovaný a/alebo je na molekulu kovalentne viazaná jedna alebo niekoľko polyetylénglykolových molekúl a/alebo sú v molekule sa vyskytujúce glykozylačné miesta čiastočne alebo úplne deletované.

Obzvlášť výhodné sú ďalej mutantné proteíny hIL-4, pri ktorých je aminokyselina 124 (tyrozín) vymenená za prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu a 0 až jedna ďalšia aminokyselina na pozíciách 121 a/alebo 125 vymenená za niektorú z možných aminokyselín a pri ktorých je navyše N-koniec a/alebo C-koniec v molekule modifikovaný a/alebo je na molekulu kovalentne viazaná jedna alebo niekoľko polyetylénglykolových molekúl a/alebo sú v molekule sa vyskytujúce glykozylačné miesta čiastočne alebo úplne deletované.

Z tejto skupiny sú obzvlášť vhodné mutantné proteíny hIL-4, pri ktorých je aminokyselina 124 (tyrozín) vymenená za kyselinu asparágovú alebo glutamovú a pozícia 121 za niektorú z možných aminokyselín, výhodne za kyselinu asparágovú alebo glutamovú a ktorých je navyše N-koniec a/alebo C-koniec v molekule modifikovaný a/alebo je na molekulu kovalentne viazaná jedna alebo niekoľko polyetylénglykolových molekúl a/alebo sú v molekule sa vyskytujúce glykozylačné miesta čiastočne alebo úplne deletované.

Výhodné vyhotovenie N-koncovej modifikácie pre menované príklady je inzercia aminokyseliny, výhodne Ala, Gly, Pro, Ser, Thr, Val, obzvlášť výhodne Ala, medzi N-koncový metionín a prirodzený N-terminus mutantného proteínu hIL-4.

Príklady takéhoto exprimovaného produktu sú: Ala(-1 )-Tyr(l 24)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp Ala(-1)-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)-Ser( 125) Asp Ala(-l)-Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp Ala(-1)-Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp

Výhodným vyhotovením delécie glykozylačných miest v menovaných vyhotoveniach je výmena asparagínu v pozícii 38 za nejakú prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu, výhodne kyselinu asparágovú a/alebo asparagín v polohe 105 za nejakú inú prirodzene sa vyskytujúcu aminokyselinu, výhodne kyselinu asparágovú.

Príkladmi takýchto exprimovaných produktov sú: Asn(3 8)Asp-Asn( 105)Asp-Tyr( 124)Asp Asn(3 8)Asp- Asn( 105)Asp-Arg( 121) Asp-Tyr( 124)Asp Asn(3 8) Asp-Asn( 105)Asp-Arg( 121 )Asp-T yr( 124)Asp-Ser(125)Asp

Asn(3 8) Asp-Asn( 105) Asp-T yr( 124)Asp- Ser( 125 )Asp Asn(3 8)Asp-Asn( 105)Asp-Arg( 121 )Asp-Ser( 125) Asp hIL-4 je možné vyrábať ako rekombinantný proteín (rhIL-4), napríklad v E. coli. Pritom vytvorený proteín sa nechá solubilizovať, renaturovať a izolovať. rhIL-4 potom má vysokú špecifickú biologickú aktivitu, ktorá sa môže stanoviť napríklad meraním syntézy/proliferácie DNA aktivovaných T-buniek alebo expresia CD 23 aktivovaných B-buniek (porovnaj Kruse, N. et al. (1991) FEBS Lett. 286, 58 - 60, Kikutani, J. et al. (1986) Celí 47, 657 - 665).

Na prípravu cDNA, ktorá obsahuje oblasť DNA, ktorá kóduje matumú oblasť hIL-4, alebo ktoré kódujú matumú oblasť hIL-4, sa odkazuje na Yokota, T., Otsuka, T., Moskmann, T., Banchereau, J., DeFrance, T., Blanchard, D., D.

Vrieš, J. E. Lee, F. a Aai, K. 1. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 5894 - 5898 a tam uvedenú literatúru. V uvedenej súvislosti sa ako „cDNA, ktoré kódujú matumú oblasť hIL-4“ chápu tiež cDNA, ktoré pri približne rovnakom počte párov báz predstavujú mutanty cDNA uvedené podľa konkrétneho stavu techniky, pokiaľ sú nimi očakávané mutantné hIL-4 rovnako antagonistami alebo čiastočnými agonistami.

Z hľadiska priebežného číslovania oblasti DNA, kódujúcej matumú oblasť hlL-4 sa tu postupuje podľa Garr, C. et al., Biochemistry 1991, 30, 1515 -1523.

cDNA, ktorá kóduje matumú oblasť hIL-4, sa môže získať vyštepením fragmentu EcoRV/BamHI z cDNA, vyrobenej génovou technológiou (napríklad British BioTechnology Ltd., Oxford, England). Fragment DNA sa za prídavku syntetických oligonukleotidov, napríklad 5-CATGCACAAGTGCGAT a 5-ATCGCACTTGTG, ktoré obsahujú prvé 4 kodóny aminokyselín interleukínu-4 a navyše iniciačný kodón metionínu, integruje do expresného vektora, napríklad medzi reštrikčné miesta Ncol a BamHI expresného vektora pRTS pRC 109 (porovnaj Weigel, U., Meyer, M. a Sebald W. (1989) Eur. J. Biochem. 189, 295 - 300).

Varianty sekvencií aminokyselín IL-4 sa vyrábajú zavedením vhodných zmenených nukleotidov do DNA kódujúcej IL-4 alebo syntézou in-vitro požadovanej formy IL-4. K takýmto variantom patrí napríklad delécia alebo inzercia, alebo substitúcia zvyškov v rámci sekvencie aminokyselín IL-4. Pritom je na dosiahnutie konečnej zostavy prípustná každá kombinácia delécie, inzercie a substitúcie, za predpokladu, že konečná konštrukcia má požadované znaky. Zmeny aminokyselín môžu meniť tiež posttranslačné úpravy IL-4: napríklad sa môže inzerciou, deléciou alebo iným ovplyvnením hlavnej sekvencie prirodzeného IL-4 zmeniť počet alebo pozícia glykozylačných miest, vlastnosti na zachytenie na membráne a/alebo mtraceluláme lokalizácie IL-4.

Pri konštrukcii variantov sekvencií aminokyselín IL-4 závisí lokalizácia mutovaných miest a druh mutácie od meniacej sa vlastnosti alebo meniacich sa vlastností IL-4. Mutované miesta sa môžu meniť jednotlivo alebo v rade, tak napríklad najprv substitúciou (1) s konzervatívne volenými aminokyselinami a potom s radikálnejšími možnosťami voľby v závislosti od dosahovaných výsledkov, (2) deléciou aminokyselinového zvyšku alebo inzerciou (3) zvyšku v blízkosti lokalizovaného miesta.

Vhodná metóda na identifikáciu určitých zvyškov alebo zvyškov IL-4 ako výhodných miest pre mutagenézu je „Alanin-Scaning- Mutagenese“, opísaná autormi Cunningham a Wells (Science, 244, 1081 - 1085, 1989). Pritom sa zvyšok alebo skupina zvyškov target identifikuje (napríklad nabité zvyšky ako Arg, Asp, His, Lys a Glu) a neutrálnymi alebo negatívne nabitými amínovými kyselinami (najlepšie alanín alebo polyalanín), aby sa tak ovplyvnila interakcia aminokyselín so susedným okolným vodným poľom vnútri alebo mimo bunku. Oblasti, ktoré citlivo funkčne reagujú na substitúcie, sa potom pripravia zavedením ďalších alebo iných variantov na miesta substitúcie alebo pre miesta substitúcie. To znamená, že je síce miesto na zavedenie zmien v sekvencií amínových kyselín vopred určené, ale druh zmeny samej osebe nemusí byť vopred určený.

Kvôli optimalizácii vykonania mutácie na určitom mieste sa teda môže na cieľový kodón alebo v cieľovej oblasti vykonať spôsob „Ala-Scanning“ alebo náhodná mutagenéza, pričom exprimované varianty IL-4 sa v záujme požadovaných vlastností preskúmajú z hľadiska optimálnej kombinácie.

Pri konštrukcii variantov sekvencií aminokyselín sú teda dve hlavné premenné: miesto mutácie a druh mutácie.

Veľkosť delécií v sekvencií aminokyselín je spravidla asi 1 až 30 zvyškov, výhodne 1 až 10 zvyškov a v normálnom prípade ležia za sebou. V normálnom prípade postihujú delécie bezprostredne vedľa seba ležiace zvyšky aminokyselín.

Počet po sebe nasledujúcich delécií sa volí tak, aby terciáma štruktúra IL-4 v dotknutej oblasti, napríklad cysteínové disulfidy, štruktúra β-skladaného listu alebo alfa-helix zostala zachovaná.

K inzerciám v sekvencií aminokyselín patrí fúzia s amínovou a/alebo karboxylovou koncovou skupinou s dĺžkou jediného zvyšku až po polypeptidy so 100 alebo viacerými zvyškami a rovnako inzercia ležiaca v rámci jednej sekvencie jednotlivých alebo niekoľkých zvyškov aminokyselín. Inzercia ležiaca v rámci jednej sekvencie (to znamená inzercia v rámci sekvencie IL-4), môže obsahovať asi 1 až 10 zvyškov, výhodne 1 až 5 a optimálne 1 až 3 zvyšky. Príkladmi terminálnych inzercií sú IL-4 s N-koncovým metionylovým zvyškom, artefakt priamej expresie IL-4 v rekombinantnej bakteriálnej bunkovej kultúre, inzercia jednej alebo niekoľkých dodatočných aminokyselín medzi metionínom a prirodzeným N-koncom kvôli lepšiemu odštiepeniu metionínu, napríklad bakteriálnymi proteázami, a fúzia heterológnej signálnej N-koncovej sekvencie na N-koniec molekuly IL-4 na podporu sekrécie matumého IL-4 z rekombinantných hostiteľských buniek, prípadne fúzie polyamínových kyselín, napríklad polyhistidínu kvôli ľahšej izolácii IL-4. Tieto signálne sekvencie sa spravidla volia z predpokladaných druhov hostiteľských buniek a sú preto ich homológmi. Vhodnými sekvenciami sú napríklad ompA, ompT, phoA, molE, amp alebo pelB pre E. coli, Alpha - Faktor, amyláza, invertáza, Killer - Toxín a melitin-pre-pro-peptid pre kvasinkovc signály a virálne signály ako herpes gD pre bunky cicavcov.

Ďalšou vhodnou signálnou sekvenciou je prirodzená signálna sekvencia interleukínu-4.

Obzvlášť výhodné sú signálne sekvencie, ktoré sa samotné odštiepia v exprimujúcom organizme, takže mutantný proteín interleukínu-4 má prirodzený N-koniec.

Výhodnými produktmi expresie po odštiepení signálnych sekvencií sú:

Tyr(124)Asp

Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp Tyr(124)Asp-Ser(125)Asp Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp

K ďalším variantom inzercie IL-4 patrí fúzia imunogénnych peptidov na N- alebo C-koniec IL-4, napríklad bakteriálne polypeptidy ako beta-laktamáza alebo enzým kódovaný E. coli - trop-lokusom alebo kvasinkový proteín a tiež fúzia na C-konci s proteínmi s dlhým polčasom života ako napríklad imunoglobulinové konštantné oblasti (alebo iné imunoglobulinové oblasti), albumín alebo feritín - porovnaj opis vo WO 89/02922 (zverejnený 6. apríla 1989).

Ďalšou skupinou variantov sú varianty so substitúciou aminokyselinami. Pri týchto variantoch sa najmenej jeden amínový zvyšok v molekule IL-4 nahradí iným zvyškom.

Prirodzene sa vyskytujúce zvyšky sa na základe spoločných charakteristík bočných reťazcov delia do tried:

1. hydrofóbna: Met, Ala, Val, Leu, íle

2. neutrálna hydrofiIná: Cys, Ser, Thr

3. kyslé: Asp, Glu

4. bázické: Asn, Gin, His, Lys, Arg

5. zvyšky s vplyvom na orientáciu reťazca: Gly, Pro a

6. aromatické: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervatívne substitúcie zahrnujú výmenu zástupcu jednej triedy za zástupcu inej triedy.

Substitúcia aminokyselín sa medzi iným použije pri zmenách prirodzenej glykozylačnej štruktúry polypeptidu. „Zmena“ znamená deléciu jednej alebo niekoľkých uhľovodíkových štruktúr v prirodzenom IL-4 a/alebo zavedenie jedného alebo niekoľkých glykozylačných miest, ktoré sa v prirodzenom IL-4 nevyskytujú.

Glykozylácia polypeptidov má zvyčajne N-väzbu alebo O-väzbu. „N-väzba“ sa vzťahuje na spojenie uhľovodíkovej štruktúry s bočným reťazcom asparaginového zvyšku. Tripeptidové sekvencie asparagín - X - serín a asparagín - X - treonín, pričom X môže byť každá aminokyselina s výnimkou prolínu, sú rozpoznávacie sekvencie pre enzymatickú väzbu uhľovodíkovej štruktúry na bočný reťazec asparagínu. Prítomnosť jednej z týchto tripeptidových sekvencií v polypeptide tak následkom toho vytvára potenciálne glykozylačné miesto.

„O-väzba“ sa vzťahuje na spojenie cukrov N-acetylgalaktózamín, galaktóza alebo xylóza s hydroxyaminokyselinou, ako je serín alebo treonín, hoci sa môže použiť tiež 4-hydroxyprolín alebo 5-hydroxylyzín.

Zavedenie glykozylačných miest na IL-4 sa vykonáva bezproblémovo zmenou sekvencie aminokyselín tohto druhu, že táto sekvencia obsahuje jednu alebo niekoľko opísaných tripeptidových sekvencií (pre N-väzby glykozylačných miest). Zmena sa môže vykonávať rovnako adíciou alebo substitúciou jedného alebo niekoľkých serínových alebo treonínových zvyškov na prirodzenú sekvenciu IL-4 (pre O-väzby glykozylačných miest). V zmysle jednoduchšieho postupu sa sekvencia aminokyselín IL-4 mení výhodne zmenami na rovine DNA, obzvlášť mutáciou DNA kódujúcou IL-4 na vopred zvolených bázach, takže sa vytvorí kodón, ktorý kóduje požadované aminokyseliny. Analogicky sa pri požadovanej delécii uhľovodíkovej štruktúry modifikuje jedna alebo niekoľko súčasných tripeptidových sekvencií (pre glykozylácie s N-väzbou) substitúciou alebo deléciou celých tripeptidov alebo ich častí. V prípade O-glykozylačných miest sa môže uhľovodíková štruktúra deletovať substitúciou alebo deléciou zodpovedajúcej aminokyseliny.

Ďalšia možnosť zvýšenia počtu uhľohydrátových štruktúr v IL-4 spočíva v chemickej alebo enzymatickej väzbe glykozidov na polypeptid. Tento postup je výhodný v tom, že nevyžaduje výrobu polypeptidu v hostiteľskej bunke s možnosťami glykozylácie pre väzby N- a O-. Podľa použitého mechanizmu spojenia sa môže cukor (môžu cukry) spájať s (a) arginínom a histidínom, (b) voľnými karboxylovými skupinami, (c) voľnými sulfhydrylovými skupinami ako sú v cysteíne, (d) voľnými hydroxylovými skupinami ako sú v seríne, treoníne alebo hydroxyprolíne, (e) aromatickými zvyškami ako sú vo fenylalaníne, tyrozíne alebo tryptofáne, alebo (f) amidovú skupinu glutamínu. Tieto metódy opisuje WO 87/05330, zverejnený 11. septembra 1987 a ďalej Aplin a Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., strany 259 - 306 (1981)).

Kvôli odstráneniu uhľohydrátových štruktúr vyskytujúcich sa v prírodnom IL-4 sa môžu okrem zmienených metód použiť tiež chemické alebo enzymatické prostriedky. Pri chemickej deglykozylácii je potrebná expozícia polypeptidu zlúčeninou kyseliny trifluórmetánsulfónovej alebo ekvivalentnej zlúčeniny. Toto spracovanie vedie k odštiepeniu väčšiny alebo všetkých cukrov s výnimkou spojovacích cukrov (N-acetylglukózamín alebo N-acetylgalaktózamín), polypeptidu sa ale nedotkne. Chemickú deglykozyláciu opisuje Hakkimuddin et al., Árch. Biochem. Bio phys., 259, 52 (1987) a Edge et al., Anál. Biochem., 118, 131 (1981). Enzymatické odštiepenie uhľovodíkových štruktúr v polypeptidoch je možné dosiahnuť použitím radu endo- a exoglykozidáz, ako opisuje Thotakura et al. (Meth. Enzymol., 138, 350(1987)).

Glykozylácii na potenciálnych glykozylačných miestach je možné zabrániť použitím zlúčeniny tunicamycín, ako opisuje Duskin et al. (J. Biol. Chem., 257, 3105 (1982)). Tunicamycín blokuje tvorbu väzieb proteín-N-glykozid.

Ďalší typ kovalentnej modifikácie IL-4 zahŕňa väzbu IL-4 na rôzne neproteínové polyméry, napríklad polyetylénglykol, polypropylénglykol alebo polyoxyalkylény spôsobom, ktorý sa opisuje v US patentoch 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 alebo

179 337.

Reagencie používané na priečne zosieťovanie, stupeň substitúcie a reakčné podmienky sa volia experimentmi s bifunkčnými činidlami, výhodne s radom činidiel, z ktorých každý reaguje s iným bočným reťazcom.

Výhodnou používanou možnosťou na zlepšenie doby polčasu života proteínov cirkulujúcich in vivo je ich konjugácia na polymér, ktorý im prepožičiava dlhšiu dobu polčasu života. Tak sa napríklad osvedčila konjugácia polyetylénglykolu (PEG) na Cl-NH ako vynikajúca možnosť na predĺženie doby polčasu života. PEG je neimunogénny, lineárny, nenabitý polymér s troma molekulami vody na molekulu etylénoxidu, takže sa hydrodynamické vlastnosti konjugovanej molekuly môžu dramaticky meniť (Maxfield et al., Polymér, 16, 505 - 509 (1975), Bailey, F. E., et al., v: Nonionic surfactants (Schick, M. J., Hrsg.), strany 794 -

- 821, 1967). Rad terapeuticky používaných enzýmov sa s cieľom účinného zvýšenia doby polčasu života in vivo spojil s PEG (Abuchowski, A. el al., J. Biol. Chem. 252, 3582 -

- 3586, 1977, Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175 - 186, 1984). Väzba PEG-1L-2 (Interleukin-2) nemá len predĺžiť cirkulačnú dobu prežitia, ale tiež zvýšiť jeho potenciu (Katre, N. V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 1487 - 1491 (1987), Goodson, R. et al., Bio/Technology, 8, 343 - 346 (1990). Pre väzby PEG a iné molekuly je referované o znížení imunogenity a toxicity (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3578 - 3581,1977).

IL-4 sa môže uzatvoriť tiež do mikrokapsúl, vyrobených napríklad koacervačnými technikami alebo „polymerizáciou na fázovom rozhraní“ (interfacial polymerization“) (napríklad hydroxymetylcelulózové alebo želatínové mikrokapsuly a poly- (metylmetakrylátové) mikrokapsuly) v koloidných systémoch uvoľňujúcich lieky (napríklad liposómy, albumínové guľôčky, mikroemulzie, nano - častice a nano - kapsuly) alebo v makroemulziách. Takéto techniky uvádza Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. vydanie, Osol, A., vydanie (1980).

Preparáty IL-4 sú tiež vhodné na prípravu protilátok, ako štandardy na kvantitatívne imunoanalytické stanovenie IL-4 (napríklad značenie IL-4 na použitie ako tracer na rádioimunoanalýzu, na ELISA stanovenie, na kvantitatívne stanovenie receptora pre IL-4, na afinitne purifikačné techniky) a na kvantitatívne stanovenie receptora kompetitívnym testom pri značení rádioaktívnym jódom, enzýmami, fluorofórmi, „spin labels“ atď.

Pretože predpoveď vlastností určitého variantu IL-4 je problematická, je samozrejmé, že je nevyhnutný určitý „skrining“ získaného variantu, aby bolo možné dosiahnuť optimálny variant. Tak sa napríklad meria zmena v imunologickom charaktere molekuly IL-4, napríklad afinita k určitým protilátkam pomocou kompetitívnej imunoanalýzy. Zmeny variantu sa vyšetrujú z hľadiska zníženia alebo zosilnenia ich aktivity - v porovnaní s aktivitou zistenou v rovnako asay pre prirodzený IL-4. Ďalšie prípadné zmeny vlastností proteínov alebo polypeptidov - ako napríklad redox- alebo tepelná stabilita, hydrofobicita, citlivosť proti proteolytickej degradácii, stabilita v bunkových štruktúrach rekombinantných organizmov alebo vplazme, alebo tiež tendencia agregovať s „nosičom“ alebo agregovať do multimérov - sa stanovujú metódami, zodpovedajúcimi stavu techniky.

Terapeutické prípravky a podávanie IL-4

Zlúčeniny podľa vynálezu inhibujú buď procesy sprostredkované interleukínom-4, alebo konkurujú hIL-4. Sú preto vhodné na ošetrenie neprimeraných, prípadne chybne riadených imunitných reakcií a chorôb autoimunity. K tomu patrí tiež imunitná deficiencia tak primárneho, ako i sekundárneho druhu. Navyše sa môže antagonista použiť tak pri transplantáciách, ako i pri paliatívnej terapii tumorových ochorení. Patria k nim napríklad:

- alergie (blokovanie reakcie primárnej a sprostredkovanej IgE, desenzibilácia známych alergií, atopické ochorenia, úľava pri atakoch astmy, hyper syndróm IgE)

- transplantácie (redukcia expresie HLA-DR pri transplantáciách orgánov, supresia reakcie štepu proti hostiteľovi, použitie pri čistení kostnej drene)

- leukémia a tuhé tumory exprimujúce receptor pre IL-4 (redukcia neprimeranej autokrínnej produkcie IL-4, potlačenie rastu tumoru)

- protiregulácia pri nadprodukcii trombocytov

- terapia porúch zrážanlivosti (cez monocytový blok)

- použitie pri poruchách výmeny lipidov

- náprava pri poruchách hospodárenia s cukrami

- zlepšenie imúnneho statusu pri infekciách (sepsia).

Na základe svojej dobrej rozpustnosti vo vode sa môže mutantný proteín IL-4 použiť tak systematicky, ako i lokálne, to znamená topicky, okrem iného inhalačné ako sprej. Možná j c i receptúra ako depotný preparát. Pri všetkých formách terapie je možné zvažovať tak krátkodobú terapiu, ako i trvalú terapiu.

Terapeutické prípravky antagonistov IL-4 sa pripravujú na skladovanie tak, že sa antagonista IL-4 po dosiahnutí požadovaného stupňa čistoty zmieša s fyziologicky prijateľnými nosičmi (carrier), pomocnými látkami alebo stabilizátormi (Remingtons Pharmaceutical Sciences, na uvedenom mieste) vo forme Iyofilizátu alebo vodných roztokov. Prijateľné nosiče, pomocné látky alebo stabilizátory nie sú pre príjemcu pri použitých dávkach a koncentráciách toxické; patria k nim pufre, ako fosfáty, citráty a iné organické kyseliny; antioxidanty ako napríklad kyselina askorbová; nízkomolckuláme polypeptidy (menej ako 10 zvyškov), proteíny ako sérumalbumín, želatín alebo imunoglobulin hydrofilné polyméry ako polyvinylpyrolidón; aminokyseliny ako glycín, glutamín, asparagín, arginín alebo lyzín; monosacharidy, disacharidy a iné cukry, napríklad glukóza, manóza alebo dextrín; chelatotvomé látky ako EDTA; cukomé alkoholy ako manitol alebo sorbitol; ióny, tvoriace soli ako sodík a/alebo neiónové povrchovo aktívne látky ako Tween, Pluronics alebo polyetylénglykol (PEG).

Antagonista IL-4 na použitie in - vivo musí byť sterilný. Toto sa ľahko dosiahne filtráciou cez sterilný membránový filter, buď pred, alebo po lyofilizácii a rekonštitúcii. IL-4 antagonisty sa skladujú bežným spôsobom v lyofilizovanej forme alebo v roztoku.

Vhodným príkladmi prípravkov s oneskoreným uvoľňovaním sú napríklad semipermeabilné matrice z pevných hydrofóbnych polymérov, ktoré obsahujú proteín; pri týchto matricách ide o tvarované články („shaped articles“), napríklad filmové tabletky alebo mikrokapsuly. Príkladmi matríc s oneskoreným uvoľňovaním sú polyestery, hydrogely (napríklad poly(2-hydroxyetylmetakrylát), ktoré opisuje Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, 167 - 277 (1981) a Langer, Chem. Techn., 12, 98 - 105 (1982) - alebo poly (vinylalkohol)), polyaktidy (US patent č. 3 773 919, EP 58481), kopolyméry kyseliny L-glutamovej a gamaetyl-L-glutamátu (Sidman et al., Bioppolymers 22, 547 - 556 (1983)), neodbúrateľný etylénvinylacetát (Langer et al., na uvedenom mieste), odbúrateľné kopolyméry kyseliny mliečnej - kyseliny glykolovej ako Lupron DepotTm (injikovateľné mikroguľôčky z kopolymérov kyseliny mliečnej - kyseliny glykolovej a leuprolidacetát) a kyseliny poly-D-(-)-3-hydroxymaslovej (EP 133 988). Zatiaľ čo polyméry ako etylénvinylacetát a kyselina mliečna - kyselina glykolová umožňujú uvoľňovanie molekúl viac ako 100 dní, dochádza k uvoľňovaniu proteínu pri niektorých hydrogéloch v kratšom časovom období. Pokiaľ zostávajú chránené proteíny v tele dlhšie časové obdobie, môžu sa vplyvom vlhkosti pri teplote 37 °C denaturovať alebo agregovať, v dôsledku čoho dochádza k strate biologickej účinnosti a možným zmenám imunogenity. Na stabilizáciu proteínu je možné podľa mechanizmu, prichádzajúceho do úvahy, vyvinúť účelnú stratégiu. Ak sa napríklad zistí, že mechanizmus, ktorý vedie k agregácii, spočíva na intermolekulámej tvorbe mostíkov S - S v dôsledku tiodisulfidovej výmeny, je možné dosiahnuť stabilizáciu modifikáciou sulíhydrylovými zvyškami, lyofilizáciou z kyslých roztokov, riadením obsahu kvapaliny, použitím vhodných prísad a vývojom špeciálnych kombinácií polymémych matríc.

K prípravkom antagonistov IL-4 s oneskoreným uvoľňovaním patria tiež antagonisty IL-4 uzatvorené v liposómoch. Liposómy sa vyrábajú známymi metódami: DE 3 218 121, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82, 3688 - 3692 (1985)), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4030 - 4034 (1980), EP 52322, EP 36 676, EP 88 046, EP 143 949, EP 142641, japonská patentová prihláška 83-118008, US patent č. 4 485 045 a 4 544 545, rovnako EP 102 324. Liposómy sú spravidla malého (asi 200 - 800 Angstrom) unilamelámeho typu s obsahom lipidu viac ako asi 30 % mólových cholesterolu, pričom podiel sa vždy optimálne prispôsobí antagonistom IL-4. Liposómy s predĺženou dobou cirkulácie zverejňuje US patent č. 5 013 556.

Ďalšie použitie vynálezu sa týka vostavby antagonistov IL-4 do „tvarových článkov“. Tie sa môžu použiť na modulovanie alebo zabránenie vzniku šoku.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Odstránenie potenciálnych N-glykozylačných miest v mutantnom proteíne hIL-4

V prirodzenej sekvencii aminokyselín hIL-4 sa vyskytujú dve glykozylačné miesta s väzbou na asparagín v pozíciách aminokyselín 38 a 105. Zodpovedajúce kodóny v štruktúrnych génoch sa môžu vymeniť za kodóny kyseliny asparágovej. Tým pri expresii génu v kvasinkových kmeňoch zodpovedá N-glykozylácia výslednému mutantnému proteínu hIL-4.

Vykonanie obidvoch výmien kodónu („site-directed mutagenesis“) v štruktúrnom géne za vzniku génu pre mutantný proteín hIL-4 sa vykonáva metódou podľa Deng a

Nickoloff (Anál. Biochem. 200, 81 (1992)) s použitím klonovacieho vektora pUC 18. Syntetické oligonukleotidy, ktoré sú potrebné na zmenu štruktúrneho génu, majú nasledujúce sekvencie:

a) na výmenu asparagínu za kyselinu asparágovú na pozícii 38:

- GCC TCC AAG GAC ACA ACT GAG-3

b) na výmenu asparagínu za kyselinu asparágovú na pozícii 105:

- GTG AAG GAA GCC GAC CAG AGT ACG-3.

Podčiarknuté pozície v uvedených sekvenciách nukleotidov označujú kodóny pre kyselinu asparágovú.

Sekvenovaním DNA sa potvrdila výmena kodónu v sekvencii nukleotidov. Zmenený štruktúrny gén sa zabuduje do expresného kvasinkového vektora a indukuje sa na expresiu vo vhodných kmeňoch.

Príklad 2

Inzercia aminokyseliny v pozícii (+2) na prípravu mutantného proteínu IL-4 bez N-koncového metionínu v E. coli

Na výrobu mutantného proteínu IL-4, ktorému chýba N-koncový metionín, sa zavedie v pozícii (+2) aminokyselina, ktorá vedie k odštiepeniu N-koncového metionínu v E. coli špecifickou aminopeptidázou pre metionín (Flinta et al., Eur. J. Biochem. 154,193 - 196,1986). Na tento účel sa rozštiepi vektor RPR9-IL4-Y124D (príloha 1) reštrikčnými endonukleázami Xhol a BamHI. Pritom vznikajúci fragment DNA dlhý asi 450 bp, ktorý nesie sekvenčnú informáciu pre gén IL4Y124D a krátky fragment (dlhý asi 50 bp) z oblasti vektora atpE, sa vyčistí elektroforézou na agarázovom géli a preklonuje sa do vektora M13mpl8 otvoreného Sali a BamHI. Pripraví sa jednoreťazová DNA a podrobí sa „mutagenéze in vitro“ s nasledujúcim oligonukleotidom:

CTGGAGACTGCCATGGCCCACAAGTGCGATATCACC3.

Touto mutagenézou sa zavedie do pozície (+2) génu IL4Y-124D aminokyselina alanín (kodón GCC). Okrem toho sa na 5 - konci génu zavedie Ncol reštrikčné miesto (CCATGG), aby sa uľahčil následný skríning a klonovanie do expresného vektora. Skríning plakov sa vykonáva reštrikčnou analýzou vychádzajúcou z dvojreťazovej M13 RF DNA (replikatívna forma). Pozitívne klony je možné identifikovať reštrikčným štiepením enzýmami Ncol a BamHI. Správnosť sekvencie sa navyše potvrdí sekvenovaním.

Fragment DNA dlhý asi 400 bp sa pomocou Ncol a BamHI vyštepí zo zvoleného klonu M13mpl8, vyčistí sa elektroforézou na agarózovom géli a klonuje sa do vektora pTrc99A rozštiepením rovnako pomocou Ncol a BamHI (obchodne dodávaný Pharmacia P-L Biochemicals). Vektorom pAPHlOO (IL4Y125D), vzniknutým z tohto klonovania, sa transformujú bunky E. coli (TG1) a selektujú sa na živnom agare obsahujúcim ampicilín.

Expresia a purifikácia proteínu vedie k mutantnému proteínu IL-4, ktorému chýba N-koncový metionín.

Príklad 3

Fermentácia kvasinkových buniek Živné roztoky:

Na kultiváciu kvasinkových buniek cxprimujúcich mutantné proteíny hIL-4 sa použijú nasledujúce živné roztoky:

Živný roztok
Použitá látka	SD 2 (g/1)	Sc6(g/i)
Bacto Yeast dusíkatá báza	6.7
Yeast extrakt Difco	-	20.0
Glukóza	20.	05.0
KH2PO4	6.7	1.4
(nh₄)₂so₄		2.0
MgSO4 x 7 H2O		0.5
Odpefiovacl prostriedok PPG 2000	-	0.2

Použité látky sa rozpustia v deionizovanej vode a hodnota pH sa nastaví na pH 5,5. Sterilizácia sa vykonáva počas 20 minút pri teplote 121 °C. Glukóza sa rozpustí v 1/5 potrebného objemu v deionizovanej vode, oddelene sa sterilizuje a po ochladení sa pridá k ostatnému živnému roztoku.

Kmeňové konzervy

Kmeňové konzervy všetkých transformantov kvasiniek sa pripravia plnením 2 ml alikvotov predkultúry a skladovaním v kvapalnom dusíku.

Predkultúry

Fermentácia predkultúr sa vykonáva v 1-litrových trepacich bankách, ktoré sa plnia 200 ml živného roztoku SD-2. Očkovanie sa vykonáva kmeňovou konzervou alebo jednotlivou kolóniou z agarovej plame SD-2. Kultúry sa inkubujú za trvalého trepania v čase 2 - 3 dni pri teplote 26 - 30 °C.

Fermentácia hlavnej kultúry

Fermentácia hlavnej kultúry sa vykonáva s použitím 10-litrových miešaných kotlových fermentorov v živnom roztoku Sc-6. Očkovanie sa vykonáva 3 - 5 % objemovými predkultúry, pričom sa pred očkovaním odcentrifuguje z predkultúry biomasa a suspenduje sa v médiu Sc-6. Podmienky fermentácie pre 10 litrov hlavnej kultúry sú nasledujúce:

Teplota: 26 - 30 °C Otáčky miešadla: 600 ot./min. Prevzdušňovači pomer: 0,5 vvm Požadovaná hodnota pH: 5,5 (korektúry pomocou 5 N NaOH a 5 N H₂SO₄)

Po uplynutí času fermentácie 5 hodín sa kultúry kontinuálne dopĺňajú glukózou a kvasničným extraktom. Živné dávky sa riadia respiračným kvocientom (hodnota RQ) kultúry. Požadovaná hodnota RQ je 1,0. Živný roztok má nasledujúce zloženie:

Glukóza 500 g/1

Yeast extrakt Difco 75 g/1

Zložky sa oddelene rozpustia v deionizovanej vode a sterilizujú sa počas 20 minút pri teplote 121 °C. Po ochladení sa obidva roztoky spoja.

Pri použití indukovateľného promótora Gal 10 alebo derivátu promótora Gal 10 sa vykonáva indukcia výmenou cukru v kŕmnom roztoku z glukózy (500 g/1) na galaktózu g/1. Ďalšia kontrola živnej dávky sa potom nevykonáva pomocou hodnoty RQ. Živná dávka sa nastaví ručne na dvojnásobnú živnú dávku v okamihu indukcie. K indukcii promótora Gal 10 dochádza zvyčajne po asi 48 hodinách času fermentácie.

Získavanie buniek

Po skončení fermentácie (80 - 120 hodín) sa obsah fermentora ochladí na teplotu 10 - 15 °C a v prípade intracelulámcj expresie sa získavajú kvasinkové bunky štandardnými centrifugačnými technikami (napríklad centrifúgou s kyvetami). Bunková hmota získaná po centrifugácii sa kryopeletizuje priamym kvapkaním do kvapalného dusíka a skladuje sa pri teplote -80 °C. Spracovanie produktu sa vykonáva z takto ošetrenej biomasy. Pri sekrécii heterológneho proteínu do kultivačného média sa vykonáva oddelenie kvasinkových buniek z kultivačného média štandardnými centrifugačnými technikami (napríklad centrifúgou s kyvetami) alebo pomocou mikrofiltrácie s priečnym prúdením (napríklad systém Filtron-Minisette). Ak je to nutné, kultivačné médium sa sterilizuje. Ďalšie spracovanie produktu sa vykonáva z kultivačného média, neobsahujúceho bunky.

Príklad 4

Fermentácia E. coli Živné roztoky

Kultivácia kvasinkových buniek exprimujúcich transformanty E. coli sa vykonáva v LB-roztokoch nasledujúceho zloženia:

Bacto Tryton 10 g/1 Bacto kvasinkový extrakt 5 g/1 NaCI 10 g/1

Zložky sa rozpustia v deionizovanej vode a sterilizujú sa počas 20 minút pri teplote 121 °C. Pred zaočkovaním sa k živnému roztoku sterilné pridá antibiotikum vhodné na selekciu transformantov (napríklad 100 mg/1 Na-ampiciíínu alebo 50 mg/1 kanamycínsulfátu v závislosti od selekčného markéra použitého vo vektore).

Kmeňové konzervy

Predkultúry

Fermentácia predkultúr sa vykonáva v 1-litrových trepacích bankách, ktoré sa plnia 200 ml živného roztoku LB. Očkovanie sa vykonáva kmeňovou konzervou alebo jednotlivou kolóniou z agarovej platne LB. Kultúry sa inkubujú za trvalého trepania počas 12-18 hodín pri teplote 30 °C.

Fermentácia hlavnej kultúry

Fermentácia hlavnej kultúry sa vykonáva s použitím 10-litrových miešaných kotlových fermentorov v živnom roztoku LB. Očkovanie sa vykonáva 1 - 5 % objemovými predkultúry, pričom sa pred očkovaním odcentrifuguje z predkultúry biomasa a suspenduje sa v čerstvom médiu LB. Podmienky fermentácie pre 10 litrov hlavnej kultúry sú nasledujúce:

Počiatočná teplota:

°C (pri použití promótorov indukovaných teplotou) °C (pri použití vektorov indukovaných IPGT) Otáčky miešadla: 500 ot./min

Prevzdušňovači pomer: 0,5 vvm

Na sledovanie rastu biomasy sa v intervaloch asi 1 hodina odoberajú z kultivačného roztoku sterilné vzorky a stanovuje sa optická hustota pri 600 nm (OD600). Pri dosiahnutí hustoty OD600 0,8 - 1,2 sa vykonáva indukcia kultúr. V závislosti od zvoleného promótora sa indukuje nasledovne:

Teplotná indukcia: Zvýšenie fermentačnej teploty z 30 °C na 42 °C

Indukcia IPTG: Sterilný prídavok izopropyl-fi-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG) ad 0,4 mM Čas indukcie je typicky 4-8 hodín.

Získavanie buniek

Po skončení fermentácie (6-14 hodín) sa obsah fermentora ochladí na teplotu 10 - 15 °C a bunky baktérií sa získavajú štandardnými centrifugačnými technikami (napríklad centrifúgou s kyvetami). Bunková hmota získaná po centrifugácii sa prípadne skladuje v mrazenom stave. Spracovanie produktu sa vykonáva z takto ošetrenej biomasy.

Príklad 5

Expresia mutantného proteínu interleukín-4 v kvasinkových bunkách s použitím konštitutívnych promótorov

Kvasinkové transformanty s expresným vektorom obsahujúcim gén kódujúci mutantný proteín hIL-4 a konštitutívny promótor (napríklad Alfa-mating-faktor-promótor, promótor GAPDH, promótor TPI) sa kultivujú v 10-litrovom objeme pri teplote 28 °C. Počas fermentácie sa pomocou SDS-PAGE vykonávajú kvalitatívne skúšky na expresiu mutantného proteínu hIL-4. Čas fermentácie je 96 hodín. Koncentrácia biomasy, dosiahnutá na konci fermentácie, je 27 g/1 TG. Po oddelení buniek centrifugáciou (15 minút, 6500 x g, 4 °C) a sterilnej filtrácii sa vykonáva čistenie produktu z kultivačného média neobsahujúceho bunky.

Príklad 6

Expresia mutantného proteínu interleukín-4 v kvasinkových bunkách s použitím indukovateľných promótorov

Kvasinkové transformanty s expresným vektorom obsahujúcim gén kódujúci mutantný proteín hIL-4 a indukovateľný promótor (napríklad Gal 10 alebo derivát promótora Gal 10) sa kultivujú v 10-litrovom objeme pri teplote 28 °C. Po čase fermentácie 48 hodín sa vykonáva indukcia výmenou uhľohydrátu použitého v živnom roztoku glukózou po galaktózc. V priebehu fermentácie sa pomocou SDS-PAGE vykonávajú kvalitatívne skúšky na expresiu mutantného proteínu hIL-4. Čas fermentácie je 96 hodín. Koncentrácia biomasy, dosiahnutá na konci fermentácie, je 24 g/1 TG. Po oddelení buniek sterilnou filtráciou (15 minút, 6500 x g, 4 °C) a sterilnou filtráciou sa vykonáva čistenie produktu z kultivačného média neobsahujúceho bunky.

Analogicky tomuto spôsobu sa môžu k expresii mutantného proteínu hIL-4 použiť tiež iné indukovateľné promótory. V závislosti od druhu zvoleného promótora sa musí použiť vhodná indukčná technika.

Príklad 7

Expresia mutantného proteínu interleukín-4 v E. coli s použitím indukovateľných promótorov

Transformanty E. coli s expresným vektorom obsahujúcim gén kódujúci mutantný proteín hIL-4 a teplotou indukovateľný promótor (napríklad lambdapL-promótor alebo derivát lambdapL-promótora) sa kultivujú v 10-litrovom objeme v živnom roztoku LB. Selekcia buniek obsahujúcich vektor sa vykonáva prídavkom 100 mg/1 Na-ampicilínu k živnému roztoku LB (= LB + živný roztok - amp). Očkovanie násady hlavnej kultúry sa vykonáva 5 objemovými % 14 hodín starej kultivovanej predkultúry do LB + živný roztok - amp. Teplota fermentácie je pri začiatku fermentácie 30 °C a na indukciu promótora citlivého na teplotu sa po dosiahnutí OD600 0,8 - 1,2 zvýši na 42 °C. Počas fermentácie sa pomocou SDS-PAGE vykonávajú kvalitatívne skúšky na expresiu mutantného proteínu hlL-4. Po čase indukcie 4 - 6 hodín sa vykoná ukončenie fermentácie ochladením kultivačného roztoku na teplotu 10 -

- 15 °C. Koncentrácia biomasy, dosiahnutá na konci fermentácie, je asi 5 g/1 FG. Bunky E. coli sa zberajú centrifugáciou v centrifúge s kyvetami (15 minút, 6500 x g, 4 °C) a bunková hmota sa kryopeletizuje priamym kvapkaním do kvapalného dusíka. Puriftkácia produktu sa vykonáva z takto získanej biomasy.

Analogicky tomuto spôsobu sa môžu na expresiu mutantného proteínu hIL-4 v E. coli použiť tiež iné indukovateľné promótory. V závislosti od druhu zvoleného promótora sa musí použiť vhodná indukčná technika.

Príklad 8

Spracovanie mutantného proteínu IL-4 Rozpustenie buniek a izolácia „inclusion bodies“ g vlhkej hmoty E. coli z príkladu 7 sa vloží do 200 ml pufra (0,1 M fosforečného pufra, pH 7,3, 0,1 % Tritonu, 1 mM EDTA, 1 pg/ml Pepstatin) a rozpustí sa pôsobením ultrazvuku (Branson Sonifíer B 15). „Inclusion bodies“ obsahujúci produkt sa získajú pomocou centrifugácie (35 000 x g, 20 min.) a premyjú sa v rozpúšťačom pufre, obsahujúcom navyše 4 M močoviny.

Solubilizácia a sulfitolýza produktu

Premyté „inclusion bodies“ sa solubilizujú v 125 ml pufra (0,2 M Tris, pH 8,1, 8 M hydrochlorid guanidínu). Pridajú sa 4 g siričitanu sodného a 2 g káliumtetrationátu a reakčná zmes sa mieša v čase 2 hodiny. Nerozpustné súčasti sa po skončení reakcie odstránia centrifugáciou (35 000 x g, 20 min.).

Gélová filtrácia

Zvyšok sa nanesie na stĺpec pre gélovú filtráciu (Sephacryl-S-300 HR, Pharmacia, 10 x 90 cm) a filtruje sa v pufŕe PBS, ktorý obsahuje 6 M hydrochloridu guanidínu s prietočným množstvom 280 ml/h. Frakcie obsahujúce produkt sa identifikujú pomocou SDS-PAGE a spoja.

Renaturácia

Na redukciu molekúl sa pridá B-merkaptoetanol (konečná koncentrácia 15 mM). Po dvoch hodinách inkubácie pri teplote miestnosti sa násada zriedi päťnásobkom vody a dialyzuje sa 3 - 4 dni proti pufru (3 mM NaH₂PO₄, 7 mM Na₂HPO₄,2 mM KC1,120 mM NaCl).

Koncentrácia

Dialyzovaný materiál sa upraví pomocou kyseliny octovej na pH 5 a vodivosť sa zníži prídavkom vody na < 10 mS/cm. Za miešania sa k násade pridá 50 ml CM-Sepharose-FF (Pharmacia), ekvilibrovanej 25 mM octanu amónneho, pH 5,0. Neviazaný materiál sa odfiltruje a gél sa plní na stĺpec. Produkt sa eluuje lineárnym gradientom 0 -

- 1 M NaCl v 25 ml octanu amónneho, pH 5,0 pri prietočnom množstve 300 ml/h. Frakcie obsahujúce produkt sa identifikujú pomocou SDS-PAGE alebo analytickou chromatografiou RP.

Konečné čistenie

Poolované frakcie CM-Sepharozy sa nanesú na stĺpec Vydac C-4 (1 x 25 cm, 10 pm), ekvilibrovaný pomocou 0,1 % TFA a eluujú sa stúpajúcim gradientom acetonitrilu. Frakcie obsahujúce čistý produkt sa spoja a lyofilizujú.

Sekvenčný protokol (1) Všeobecné informácie (1) Prihlasovateľ:

(A) Meno: Bayer AG (B) Ulica: Bayerwerk (C) Miesto: Leverkusen (E) Štát: Nemecko (F) Poštové smerovacie číslo: D-51368 (G) Telefón: 0214/3061455 (H) Telefax: 0214/303482 (ii) Názov prihlášky: Nové mutantné proteíny hIL-4 ako antagonisty alebo čiastočné agonisty ľudského interleukínu4 (iii) Počet sekvencií: 5 (iv) Forma uložená v počítači;

(A) Nosič dát: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Prevádzkový systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release = 1,0, verzia = 1,25 (EPA) (2) Informácie k SEQ ID č. 1:

(1) Sekvenčná charakteristika:

(A) Dĺžka: 16 základných báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Štruktúra: jednoreťazová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: cDNA (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Počiatočný pôvod:

(C) Indivíduum izolát: syntetický (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 1:

CATGCACAAG TGCGAT (2) Informácie k SEQ ID č. 2:

(1) Sekvenčná charakteristika:

(A) Dĺžka: 21 základných báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Štruktúra: jednoreťazová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: cDNS (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Počiatočný pôvod:

(C) Indivíduum izolát: syntetický (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 2:

ATCGCACTTG TG (2) Informácie k SEQ ID č. 3:

(1) Sekvenčná charakteristika:

(A) DÍžka: 21 základných báz (B) Druh: nukleová kyselina (C) Štruktúra: jednoreťazová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: cDNS (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Počiatočný pôvod:

(C) Indivíduum izolát: syntetický (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 3:

GCCTCCAAGG ACACAACTGA G (2) Informácie k SEQ ID č. 4:

(i) Sekvenčná charakteristika:

(A) Dĺžka: 24 základných párov (B) Druh: nukleová kyselina (C) Štruktúra: jednoreťazová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: cDNS (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Počiatočný pôvod:

(C) Indivíduum izolát: syntetický (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 4:

GTGAAGGAAG CCGACCAGAG TACG (2) Informácie k SEQ ID č. 5:

(i) Sekvenčná charakteristika:

(A) DÍžka: 36 základných párov (B) Druh: nukleová kyselina (C) Štruktúra: jednoreťazová (D) Topológia: lineárna (ii) Druh molekúl: cDNS (iii) Hypoteticky: nie (iii) Antisense: nie (vi) Počiatočný pôvod:

(C) Indivíduum izolát: syntetický (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 5:

CTGGAGACTG CCATGGCCCA CAAGTGCGAT ATCACC

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Mutantné proteíny ľudského interleukinu-4 ako antagonisty alebo parciálne agonisty ľudského interleukinu-4, vyznačujúce sa tým, že okrem výmien v pozíciách 121, 124 alebo 125 majú navyše inzerciu aminokyseliny medzi N-terminálnym metionínom a prírodným N-koncom HIL-4 mutantného proteínu.
2. Mutantné proteíny ľudského interleukinu-4 podľa nároku 1, v ktorých je inzertovaná aminokyselina glycín, prolín, serín, treonín alebo valín.
3. Mutantné proteíny ľudského interleukínu-4 podľa nároku 1, v ktorých je inzertovaná aminokyselina alanín.
4. Mutantné proteíny ľudského interleukínu-4 podľa nároku 1, vybrané zo skupiny zahŕňajúcej Ala(-l)-Tyr(124)Asp

Ala(-1)-Arg( 121 )Asp-T yr( 124)Asp

Ala(-1)-Arg( 121 )Asp-Tyr( 124)-Ser( 125 )Asp

Ala(-1 )-Tyr( 124)Asp-Ser( 125)Asp

Ala(-1 )-Arg( 121 )Asp-Ser( 125)Asp.
5. Liečivá obsahujúce látky podľa nárokov 1 až 4.
6. Použitie mutantných proteínov ľudského interleukínu-4 podľa nárokov 1 až 4 na výrobu liečiv.