BG60256B2

BG60256B2 - Рекомбинантен метод за получаване на лимфотоксин

Info

Publication number: BG60256B2
Application number: BG70460A
Authority: BG
Inventors: Bharat Aggarwal; Timothy BRINGMAN; Patrick Gray; Glenn Nedwin
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1994-03-24
Also published as: JP2804237B2; PT80573B; CZ393085A3; NO852173L; IL75318A; NO179075C; EP0164965A3; FI852143L; PT80573A; RO100383A2; EP0509553A1; HUT37814A; AU4320385A; BG60256B1; YU91985A; EP0164965A2; DE3588225D1; SK393085A3; CA1340641C; IE930589L

Abstract

Лимфотоксинът намира приложение в медицината и проявява токсичен ефект спрямо туморните клетки. Биологично активен лимфотоксин се синтезира в рекомбинантни клетки. Създадени са нови нуклеинови киселини и вектори. По метода икономично се приготвят препарати, съдържащи еднакви лимфотоксинови полипептиди и производни на лимфотоксина, които имат аминокиселинна последователност, различна от естествената. Лимфотоксините са пречистени до специфична активност 2-10 х 107 единици/мг белтък чрез пречистване с нови, имобилизирани лимфотоксиннеутрализиращимоноклонални антитела. 51 претенции

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до рекомбинантен метод за получаване на лимфотоксин и неговите производни.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че лимфотоксинът найнапред е идентифициран като биологичен фактор с противоклетъчна активност по отношение на неопластични клетъчни линии.Активността на лимфотоксина се проявява от стимулирани с митоген лимфоцити и обхваща цял спектър от ефекти, започващи от цитостаза на някои туморни клетки и достигащи до изразена цитолиза на трансформирани клетки. Лимфотоксинната активност се характеризира и с много ниска или напълно липсваща активност спрямо първични клетъчни култури и или нормални клетъчни линии. Този специфично насочен спектър на активността на лимфотоксина предизвиква проучването му ин виво, в резултат на което се изказа предположението, че лимфотоксинът може да има мощно антитуморно действие.

Лимфотоксин е понятие, което се прилага спрямо цяло семейство молекули. Лимфотоксиновите молекули са определени като гликопротеини, които се разделят на пет класа по молекулното си тегло /м.т./, всеки от които е хетерогенен по отношение на товара си. Човешките класове алфа /м.т. 70-90,000/ и бета /м.т. 25-50,000/ преобладават при повечето лимфоцитарни извлеци. Класът алфа се разделя по отношение на товара на 7 подкласа, докато класът бета се състои от два различаващи се подкласа /1/. Идентифицирани са и комплексни форми /м.т. > 200,000/, а също и клас гама /м.т. 10-20,000/.

Различните класове и форми на лимфотоксините се различават помежду си по своята стабилност и по кинетиката на появяването им в културата. Освен това, те могат да агрегират помежду си в комплексни класове при условия на ниска йонна сила. Лимфотоксините от нискомолекулните класове са относително по-нестабилни и с по-слаб цитолитичен ефект от високомолекулните /2,3/ . Лимфотоксините от клас гама не са добре проучени поради нестабилността им /4/. Има данни, че лимфотоксините от клас бета са също така нестабилни /5/.

Трябва да се подчертае, че терминологията, отнасяща се до лимфотоксините, не е уеднаквена. Названията, които се дават на различни продукти от клетъчни култури, се определят главно от свойствата на клетките, произвеждащи продукта, и от качествата на продукта, регистрирани в биологични проби. Тези продукти си остават слабо характеризирани, тъй като проучванията се извършват върху недостатъчно чисти препарати и опитите да се характеризират не са молекулно специфични, поради което получените резултати варират в широки граници. Истинската идентичност на различните цитостатични фактори ще остане неизвестна в отсъствие на стандартна терминология, основана на ясно различими характеристики като аминокиселинна последователност или имунологичен епитоп. Някои примери на названия, давани на клетъчни продукти с цитотоксично действие , са: фактор на туморната некроза, цитотоксичен фактор на НК клетките, фактор на хеморагичната некроза, макрофагеален цитотоксин или цитотоксичен фактор.

Очакващите решение патентни заявки U.S.S.N 608.316 от 7.V.1984 г. и ЕР 100.641 от 15.11.1984 г. описват аминокиселинната последователност на човешки лимфотоксин, изолиран от човешката лимфобластоидна линия RPM1-1788 /6/.

Хайаши и сътр. /1985 - 7/ изолират един белтък от зайци след стимулиране на ретикулоендотелната им система. Този белтък има противотуморна активност и следната Nкрайна аминокиселинна последователност:

В литературата са описани заешки антисеруми, които могат да неутрализират цитолитичната активност на различни цитотоксини,включително и на лимфотоксините /29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36/. Тъй като антисерумите са поликлонални, те съдържат многобройни антитела, насочени срещу лимфотоксичния имуноген. Всяко едно от тях допринася за неутрализацията на “лимфотоксичната” активност. Данните в литературата относно молекулната същност на имуногена обикновено са неясни. За нуждите на диагностиката и на имуноафинитетното пречистване е необходимо създаването на моноспецифични антитела, насочени срещу точно и недвусмислено идентифицирана лимфотоксинова молекула.

Задачата се решава съгласно изобретението с метод за рскомбинантно синтезиране на лимфотоксин и неговите производни, който се характеризира с това, че се получава нуклеинова киселина, която кодира лимфотоксин, нуклеиновата киселина се вмъква във възпроизвеждащ се вектор, трансформиране на клетки с вектора, култивиране на клетките, за да се натрупа лимфотоксин в културалната среда и извличане на лимфотоксина от културалната среда.

ДНК кодираща лимфотоксина може да бъде идентифицирана, независимо от ниските концентрации на лимфотоксин, изразяване в хомоложни клетки и на известна несигурност по отношение на момента, в който се появява информационната РНК, кодираща лимфотоксина в хомоложните клетки. Лимфотоксинът се изразява в рекомбинантни клетки, които не го глюкозилират ( или поне това не става по същия начин, както в хомоложните клетки) и че той има твърде хомогенна аминокиселинна последователност, без Nкрайна ензимна хидролиза. Лимфотоксинът (или съединения, идентифицирани като лимфотоксини) се получават до сега от лимфоцитни култури в много ниски концентрации - 0,05-2 х 10⁶ ед./л от екстракти от RPMI-1788 клетки или първични лимфоцити. Добивът често варира значително, а първичните лимфоцити са много скъпи, поради което е голяма нуждата от създаване на икономичен метод за получаване на лимфотоксин /28/.

Досега използваните методи не позволяват получаването на лимфотоксини с хомогенен аминокиселинен състав, което е много важно за лекарственото му приложение. Лимфотоксините, получавани от клетъчни линии, показват амино-терминална хетерогенност, вероятно поради протеолитични трансформации /6/. Културите от първични лимфоцити (напр. от аденоиди или от периферна кръв) естествено съдържат клетки от голям брой донори поради необходимост от икономичност. Поради тази причина продуктите на такива клетки ще отразяват генетичните различия между донорите и получените “лимфотоксини” ще бъдат в действителност смес от алелни видове. Очевидно съотношението и идентичността на алелите ще бъдат неизвестни. Тъкмо за това е необходим метод за производство на еднороден по аминокиселинната си последователност лимфотоксин.

Досегашните методи са ограничени само до производството на лимфотоксини с първична аминокиселинна последователност, която може да се намери в природата. Заместването, отстраняването и включването на други аминокиселинни последователности изисква продължителни и скъпи химични модификации, ако въобще е възможно. Необходими са методи, които да позволяват лесно да се променя аминокиселинната последователност на лимфотоксина.

Въпреки че още от 1968 г. са известни антитуморната активност и терапевтичната стойност на лимфотоксина, той все още не е проучен достатъчно подробно в клинично отношение и е недостъпен на пазара поради малките количества и хетероложния състав на лимфотоксиновите препарати, получавани по досегашните методи. Необходими са методи за получаване на достатъчни количества на достъпна цена лимфотоксин за извършване на адекватни клинични изследвания.

В литературата са описани заешки антисеруми, които могат да неутрализират цитолитичната активност на различни цитотоксини,включително и на лимфотоксините /29,30,31,32,33,34,35,36/. Тъй като антисерумите са поликлонални, те съдържат многобройни антитела, насочени срещу лимфотоксичния имуноген. Всяко едно от тях допринася за неутрализацията на “лимфотоксичната” активност. Данните в литературата относно молекулната същност на имуногена обикновено са неясни. За нуждите на диагностиката и на имуноафинитетното пречистване е необходимо създаването на моноспецифични антитела, насочени срещу точно и недвусмислено идентифицирана лимфотоксинова молекула.

Съгласно изобретението се създава метод за икономично синтезиране на лимфотоксинова форма, в която аминокиселинната последователност на практически всички лимфотоксинови молекули да е еднаква.

Освен това създават се предварително определени вариации в аминокиселинната последователност на лимфотоксините и поспециално отстраняване, заместване и включване на аминокиселини и на комбинации от тях.

Техническа същност на изобретението

Задачата на изобретението е решена чрез успешното осъществяване на рекомбинантното изразяване на един белтък, имащ активността на лимфотоксина. Този лимфотоксинов вид, описан по-долу по отношение на неговата активност и на естествената и производна аминокиселинна последователност, се означава като лимфотоксин. ДНК, кодираща лимфотоксина, е идентифицирана независимо от ниските концентрации на лимфотоксин, изразяване в хомоложни клетки и на известна несигурност по отношение на момента, в който се появява информационната РНК, кодираща лимфотоксина в хомоложните клетки. Изненадващо е също и това, че лимфотоксинът се изразява в рекомбинантни клетки, които не го глюкозилират (или поне това не става по същия начин, както в хомоложните клетки) и че той има твърде хомогенна аминокиселинна последователност, без N-терминална ензимна хидролиза. ДНК, кодираща лимфотоксина, се изразява в клетъчни култури във високи концентрации, достигащи до 0,1 до 1 х 10¹¹ед./л културален лизат.

Изразяването на лимфотоксина от рекомбинантен клетъчен гостоприемник зависи както от ДНК, която кодира лимфотоксина или неговите предшественици, така и от избрания клетъчен гостоприемник. Последователността на нуклеиновите киселини, използвани за синтез на лимфотоксин, е нова. Тя се характеризира с нуклеотидна последователност, различна от тази на нативните или естествените, по следните показатели: ДНК е свободна от интрони /при човешкия лимфотоксин един интрон е вмъкнат между 284 и 285 нуклеотид - фиг.2а/; ДНК е свободна от нуклеинови киселини, кодиращи други белтъци на организма, от който произхожда; нуклеиновата киселина, кодираща лимфотоксина, е свързана във вектор и / или нуклеиновата киселина е способна да хибридизира с нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксин, при условие, че хибридизиращата ДНК не съдържа нуклеотидни последователности от естествена ДНК или РНК, кодиращи лимфотоксин.

Мутантните нуклеинови киселини, кодиращи лимфотоксин, са резултат на генетични манипулации. Създадени са мутации в 5· превеждана или непревеждана нуклеинова киселина за лимфотоксин, за да се засили нивото на изразяване в избрани гостоприемници - т.е. да се намали вероятността от поява на информационни РНК структури от типа стебло-бримка в 5' областта на нуклеиновата киселина или да се замести някой предпочитан от гостоприемника кодон с такъв намиращ се в естествени ДНК изолати.

Мутации в нуклеиновите киселини, които се изразяват, позволяват приготвянето на лимфотоксинни видове, имащи аминокиселинната последователност на нативните лимфотоксини, или пък на варианти с последователност, различаваща се от тази на нативните. Мутантните лимфотоксини се изолират като такива или се трансформират от клетката до получаването на желаните лимфотоксинни видове.

Нуклеиновите киселини, които участват в хибридизацията, или фрагменти от тях са белязани и се използват за идентификация или определяне на генетичния материал, кодиращ лимфотоксина.

За постигане на синтеза на лимфотоксин, ДНК, която го кодира, се свързва с вектор, който от своя страна се използва за трансформиране на гостоприемни клетки, последните се култивират и лимфотоксинът се изолира от културата. Същият общ процес се използва за синтезиране на лимфотоксин с аминокиселинна последователност на нативния лимфотоксин и за създаване на нови лимфотоксинови производни в зависимост от природата на вектора и качествата на клетките, избрани за трансформация. Лимфотоксиновите видове, които могат да се синтезират, включват левцил-аминотерминален лимфотоксин, хистидиламинотерминален лимфотоксин, прелимфотоксин и лимфотоксиновите производни-/а/ сляти белтъци, при които един хетероложен белтък или полипептид е свързан посредством пептидна връзка с амино-или карбоксилния край на лимфотоксина,/б/ лимфотоксинови фрагменти, поспециално фрагменти на прелимфотоксина, при които която и да е от аминокиселините между -34 и +23 е аминотерминалната аминокиселина на фрагмента, /в/ лимфотоксинови мутанти, при които една или повече аминокиселини са отстранени, заместени или допълнени, /г/ метионилови или модифицирани метионилови (напр. формилметионилови или други блокирани мстионилови видове) аминотерминални производни и /д/ неглюкозилирани или алтернативно глюкозилирани лимфотоксинови видове.

Когато клетка от млекопитаещо животно се трансформира с нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксина, необходимо е тя да е оперативно свързана е еукариотна секрсторна водеща последователност, а когато новата нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксин, е оперативно свързана с бактериален или дрождев вектор, той се разпознава от гостоприемната клетка (обикновено взета от организма, от който е получена, и водещата последователност), гостоприемната клетка след трансформиране и след култивиране е в състояние да изразява неметилиран на аминокрая си лимфотоксин и последният може да се изолира от културата.

Ако ДНК, кодираща лимфотоксина, е оперативно свързана с вектор без водеща последователност и след това се използва за трансформиране на гостоприемна клетка, синтезираните лимфотоксинови видове са субституирани с аминотерминален метионил или с модифициран метионилов остатък като нпр. формилметионил.

Съществуват методи за мутагенизиране ин витро на нуклеинови киселини, кодиращи лимфотоксин, което води до изразяване на нови производни. На първо място, N-терминални метионилови или производни на метионила лимфотоксини се изразяват от клетки, трансформирани с нуклеинова киселина, която се изразява направо, т.е. не е свързана оперативно с водеща секреторна последователност.

На второ място, може да се използва участъково-специфична ин витро мутагенеза за създаване на отстранявания, замествания или добавяния на нуклеотиди в нуклеиновата киселина, кодираща лимфотоксина. По този начин се произвеждат сляти лимфотоксинови продукти. Лимфотоксиновите производни, получени след изразяване на мутантна нуклеинова киселина, имат съответно променени характеристики.

На последно място, възможно е създаването на неглюкозилирани или на алтернативно глюкозилирани лимфотоксинови производни.Неглюкозилирани лимфотоксини се получават след изразяване в прокариотен организъм на ДНК, кодираща лимфотоксин. Алтернативно глюкозилираните лимфотоксинови производни са продукти на рекомбинантни култури от трансформирани висши еукариоти, най-често клетки от млекопитаещи. Получените по тези начини лимфотоксини се пречистват от надутаечните фракции или от лизатите на културите чрез имуноафинитетна адсорбция с използване на неразтворими неутрализиращи-лимфотоксин антитела. Тези антитела най-добре се получават от моноклонални клетъчни култури и се създават в мишки след имунизация с алумино-адсорбирани лимфотоксини.

Лимфотоксинът от изобретението се комбинира за терапевтична употреба с безвредни стабилизатори и ексипиенти и се приготвя в стерилни дози чрез лиофилизиране или чрез съхранение в стабилизирани разтворени препарати. Алтернативно, лимфотоксинът може да се свърже с някакъв полимерен носител за присаждане направо в тумори или в хирургически участъци след изрязване на тумори, като с това се постига депоефект при много висок пад на концентрациите.

Получените по този начин фармацевтични препарати могат да се въвеждат с лечебна цел в достатъчно ефективни дози чрез имплантация, инжекционно или чрез инфузия в животни и в хора, носещи злокачествени тумори.

Описание на приложените фигури.

Фигура 1а показва ДНК последователност, кодираща лимфотоксин, и производната й аминокиселинна последователност.

Фигура 16 представя конструирането на синтетичната ДНК, показана на фиг.1.

Фигура 2а показва пълната аминокиселинна последователност на прелимфотоксина, нейната кодираща ДНК, включително и 5' и 3' ограничаващите непревеждани участъци.

Фигура 26 илюстрира метода за създаване на вектор за изразяването на метиониллевцил аминотерминален лимфотоксин и на неговите аминотерминални метионилови производни.

Фигура 3 показва метода за създаване на вектор за изразяване на метионилхистидил аминотерминален лимфотоксин.

Фигура 4 показва аминокиселинната последователност на човешкия, мишия и говеждия лимфотоксин и на съответния лимфотоксин от млекопитаещо.

Фигури 5а и 56 описват конструирането на плазмид, кодиращ сливането на лимфотоксина с бактериална сигнална последователност.

Описание на изобретението

За целите на настоящето патентно искане лимфотоксинът се определя като биологично активен полипептид, имащ участък с изразена хомоложност с поне една част от аминокиселинната последователност на лимфотоксина, показана на фиг.2а. Биологичната активност се определя като специфична цитостатична активност, имунологична реактивност с цитотоксичен лимфотоксин или способност да конкурира с цитотоксичен лимфотоксин за лимфотоксиновите повърхностни клетъчни рецептори. В последните два случая не е необходимо лимфотоксинът да е цитотоксичен сам по себе си. Имунологичната кръстосана реактивност в различни мутанти е полезна при използването им като имуногени за получаване на антилимфотоксични антитела в животни, т.е. за приготвяне на имунни препарати, докато нецитотоксичните конкуриращи мутанти могат да се използват като белязани проби за имунното определяне на цитотоксичен лимфотоксин в реакции от конкурентен тип.

Специфичната цитотоксична активност се определя като специфично разрушаване и потискане на растежа на туморни клетки ин виво и ин витро , сравнено с поведението на нормални клетки при същите условия. Разрушаването на туморни клетки чрез лизиране ин витро или некроза ин виво е найсигурният опитен критерий, макар че за същата цел могат да се използват и цитостазата и антипролиферативната активност.

Подходящи тестове за изпитване на анти клетъчна та активност на лимфотоксините са описани в литературата /37, 38/.

Специфичната лимфотоксична активност се определя по-скоро като лизис на таргетните клетки, отколкото като цитостаза. Една единица лимфотоксин е количеството, което осъществява 50 % лизиране на таргетните клетки във всяка ямка, както това е описано подробно в пример 1. Приемливи са обаче и други методи за измерване на цитотоксичната активност.

Под съществена структурна хомоложност се разбира, че тя е по-голяма от 60 % и обикновено, че повече от 70 % от аминокиселинните остатъци в полипептида са същите или съответстват на съответните консервативни остатъци в последователността, показана на фиг.2а.

Не е необходимо цялата последователност на лимфотоксиновия полипептид да е хомоложна на показаната на фиг.2а последователност.

Достатъчно е да е налице хомоложност само на една част от веригата, при условие, че полипептидът има изискваната биологична активност. Обикновено хомоложност се установява в участъци от 20 до 100 аминокиселинни остатъци, въпреки че понякога се налага въвеждането на “отвори” за постигане на максимална хомоложност.

По-малка степен на хомоложност е достатъчна за един полипептид да попадне в обхвата на дефиницията, ако тя не е в някои от ключовите участъци на лимфотоксина, т.е. участъци които са важни за проявяване на цитотоксичното действие. Ключовите участъци на показаната на фиг.2а последователност се предполага, че лежат около аминокиселинните остатъци 162-171, 52-83 и 127-148.

Определянето на лимфотоксина изключва фактора на човешката туморна некроза и неговите естествени животински варианти /39, 40/.

Изказаните структурни съображения се отнасят и до главните характеристики на страничните аминокиселини верига, били те основни, неутрални, кисели, хидрофилни и хидрофобни, с ароматно ядро. Заменянето на една аминокиселина с друга, структурно подобна на нея, обикновено се означава като консервативно заместване.

Важен фактор за установяване на идентичността на полипептида като лимфотоксин е способността на антисеруми, неутрализиращи цитолитичната активност на хомогенни лимфобластоидни (или естествени) лимфотоксини, да неутрализират и цитолитичната активност на въпросния полипептид. Трябва да се подчертае обаче, че имунологичната идентичност и цитотоксичната идентичност не се покриват напълно. Неутрализиращо антитяло за лимфотоксина от фиг.2а може да не се свърже с протеина, защото то е насочено към участък на лимфотоксина, разположен в съседство с участъка, отговорен за лимфотоксиновата цитотоксична активност. Белтъкът, претърпял мутация в тази област, може да не се свързва е неутрализиращото антитяло, но въпреки това да бъде лимфотоксин поради значителна хомоложност и биологична активност.

Лимфотоксините, получени чрез култивиране на лимфобластоидни клетки, имат следните характеристики: молекулна маса от 20 000 до 25 000 в зависимост от степента на глюкозилиране и N-тер.миналната хетерогенност, глюкозилиране при Асн+62 (фиг.2а), тенденция за агрегираяе и по-точно за организиране в мултимери, изоелектрична точка при pH 5,8, pH неустойчивост (загуба на 50 % от активността при съхранение за 24 ч в амониев бикарбонат 10 г/мл с pH по-малко от 5 и по-голямо от 10), чувствителна загуба на активност след инкубиране във воден разтвор за 5 мин при 80°С

Идентифицирани са два вида лимфобластоидни лимфотоксини според молекулната им маса. Полипептидът с м.м. 25 000 има левцинов остатък на аминокрая си и всички полипептиди с първична аминокиселинна последователност от същия тип се наричат левцил аминотерминални лимфотоксини. Трябва да се отбележи, че посочените характеристики се отнасят до нативния или див тип човешки лимфотоксин, получен от лимфобластоидни клетъчни култури. Лимфотоксините, според определението, използвано в настоящото описание, включват освен нативни и други цитотоксични полипептиди. Например, глгокозилирането обикновено се свързва с животински лимфотоксин, който е модифициран при изразяването му в хетероложна рекомбинантна еукариотна клетка, което има за цел извеждането на лимфотоксина извън нея и той може да получи характеристики- молекулна маса и изоелектрична точка, отличаващи се от установените за човешкия лимфобластен лимфотоксин. Съвършено неглокозилиран лимфотоксин се синтезира в рекомбинантни бактериални култури, при което молекулната му маса и И.Е. точка също се променят. В допълнение на това, след транслационната обработка на молекулата на прелимфотоксина, произхождащ от една животинска линия, в клетъчна линия от друго животно може да доведе до появата на различен от обичайния за първото животно амино терминален остатък. По същия начин, мутационните въздействия, описани тук, дават възможност да се променя аминокиселинната последователност и N-терминала на лимфотоксин, което предизвиква промени в pH стабилността, И.Е. точка и др.

Преписваната човешка аминокиселинна последователност на лимфотоксина е описана на фиг.2а. Трябва да се отбележи, че тази последователност съдържа един участък от 34 аминокиселинни остатъка (препоследователност), за която се предполага, че се отстранява при нормалния процес на модификация на преписания полипептид в човешката клетка (заедно с мутантните “прелимфотоксини”) и се получава левцилния аминотерминален лимфотоксинов вид. Хистидилният аминотерминален вид е хомоложен на левцилния, с тази разлика, че в него отсъстват първите 23 аминокиселини. И трите вида, прелимфотоксинът, левцил аминотерминалният лимфотоксин и хостидил аминотерминалният лимфотоксин, както и техните метионилови, модифицирани метионилови, мутантни и неглюкозилирани форми се включват в понятието лимфотоксин. Неглюкозилираните левцил и хистидил аминотерминални видове имат по-ниска молекулна маса от описаните по-горе хомоложни на лимфобластоидния лимфотоксин форми.

Прелимфотоксинът е вид, който също се включва в горната дефиниция. Той се характеризира с присъствието на сигнална (водеща) полипептидна последователност към аминокрая на молекулата. Обикновено естествената полипептидна сигнална последователност се изрязва от лимфотоксина с помощта на протеолитичен ензим при секрецията му от клетката. Сигналният пептид може да бъде бактериален или еукариотен (естественият сигнален полипептид съдържа 34 аминокиселини), но се предпочита той да е хомоложен на гостоприемната клетка. Някои комбинации от лимфотоксинсигнален пептид могат да не се “разпознават” и да не се превръщат от клетката в N-терминален свободен от метионин лимфотоксин. Подобни лимфотоксини със слят сигнален пептид от бактериален произход могат да се използват например като лимфотоксинови имуногени.

Трябва да се отбележи, че понятието “способен” по отношение на цитотоксичната активност трябва да се разбира в смисъл, че лимфотоксинът включва полипептиди, които могат да се трансформират с помощта на ензимна хидролиза от неактивни аналози в желаните биологично активни форми.

С термините “способен” за цитотоксична активност ин виво и ин витро се означават нецитотоксичните полипептиди, които могат с помощта на ензимна хидролиза да се превърнат от неактивни хомолози в полипептидни фрагменти, имащи определената в дефиницията биологична активност. Обикновено, неактивните предшественици са слети белтъци, в които лимфотоксинът е свързан с пептидна връзка за друг белтък или пептид. Последователността в близост с пептидната връзка е така подбрана, че след ензимна хидролиза да се освобождава лимфотоксин, било ин виво или в резултат на производствен протокол, ин витро. Типичната свързваща последователност е лизин-лизин или аргинин-лизин. Нелимфотоксиновата част на такъв прелимфотоксин за предпочитане е някакъв хомоложен белтък, за да се намали имуногенността на слетия продукт. Хомоложният белтък освен това трябва да бъде безвреден и да не се свързва с клетъчната стена. Полученият по този начин лимфотоксин ще може да демонстрира изискваната според дефиницията активност.

Въпреки че обикновено лимфотоксин означава човешки лимфотоксин, и други лимфотоксини от мишки, свине, коне или говеда се включват в определението, при условие, че отговарят на описаните изисквания за хомоложни участъци и биологична активност. Например, оказва се, че говеждият и мишият лимфотоксини показват висока степен на хомоложност (80 %) с човешкия лимфотоксин. Лимфотоксините не са видово специфични, т.е. човешкият лимфотоксин е активен срещу мишите тумори и неопластични клетъчни линии. Следователно, лимфотоксин от един вид може да бъде използван при лечение на животно от друг вид.

Лимфотоксините включват също и мултимерни форми. Лимфотоксинът спонтанно агрегира в мултимери - обикновено димери или п-мери. Мултимерите са цитотоксични и съответно подходящи за лечение ин виво. Лимфотоксините се изразяват в рекомбинантни клетки като мономери, но проявяват спонтанна тенденция за полимеризиране. Хомогенна смес от мултимери или смес от различни мултимери също са подходящи за терапевтично приложение.

Производните лимфотоксини включват също предварително определени или участъково специфични мутации в молекулата, показана на фиг.2а или нейните фрагменти. Производните лимфотоксини се определят като полипептиди, отговарящи на изискванията за лимфотоксините, но имащи аминокиселинна последователност, различаваща се от показаната на фиг.2а, независимо от това дали се касае за заместване, изпускане или добавяне на аминокиселина. Нечовешките лимфотоксини и човешките алелни лимфотоксини трябва да се разглеждат като лимфотоксинови производни по същия начин, както и мутантните, които нямат естествен аналог. Целта на мутагенезата е конструирането на ДНК, която кодира лимфотоксини, отговарящи на горното определение, но имащи характеристики, които променят биологичната им активност или улесняват производството. Например лизин +89 кодона е променен с цел изразяването на хистидинов остатък на мястото на лизина. Хистидин +89 не се хидролизира от трипсин (който обикновено разкъсва полипептида при аргининов или при лизинов участък). Устойчивостта към протеази удължава периода на биологичния полуразпад на мутантната форма в сравнение с лимфотоксина, имащ последователността, показана на фиг.2а. Други лизинови и аргининови остатъци в лимфотоксина могат също да бъдат променяни с хистидин - напр. лизин +28, лизин +19 или аргинин +15.

Някои области от лимфотоксиновата молекула показват хомоложност с един белтък с подобна активност, наречен фактор на туморната некроза. Аминокиселините в тази област и в непосредствено съседство с нея са предпочитани за мутагенизиране с цел идентифициране на лимфотоксинови мутанти, които показват променена биологична и цитотоксична активност. Такива мутанти се получават по познатите методи и се проверяват за търсената биологична активност - т.е. увеличена цитотоксичност срещу точно определен вид неоплазма, която трябва да бъде лекувана, или както е в случая с лимфотоксиновите видове, предназначени за имунизация на животни, способност за засилен имунен отговор. Няколко примера на подобни лимфотоксинови варианти са хидрофобна аминокиселина, като валин, изолевцин или левцин, е вмъкната между Тр +163 и Вал +164; Ала +168 е заменен с аминокиселина с разклонена верига - /Вал.Иле,Лев/; тирозин е заменен с Тр +163; лизин заменя Сер +82; изолевцин, левцин, фенилаланин, валин или хистидин заменят Сер +42; глутамин, триптофан, серии или хистидин заменят лиз +84; хидрофобен ди- или трипептид е свързан с лев +171; аспаратова киселина или лизин заменят Тр +163; ала-лиз са вмъкнати между глу+127 е про +128; лизин или глицин заменят сер +70; тирозин заменя Тр +69; аргинин или хистидин заменят хис +32; пролин, серин, треонин, тирозин или глутаминова киселина заменят асп +36; тирозин, метионин или глутаминова киселина заменят сер +38; треонин, тирозин, хистидин или лизин заменят сер +61; аспаратова киселина, серин или тирозин заменят гли +124; аргинин, лизин, тирозин, триптофан или пролин заменят хис +135; аспаратова киселина заменя тр +142; лизин или треонин заменят глн +146.

Особено предпочитана група мутанти са тези, при които метиониновият остатък на човешкия лимфотоксин в позиции +20, +120 и +133 е отстранен или още по-добре, заменен със съответните аминокиселинни остатъци, намирани в лимфотоксини от други видове. Например, мет +20, +120 и +133 са заместени с треонин, серин и валин. Това са остатъците съответно на говеждия лимфотоксин. Заместването се извършва по начина, описан в пример 9, с изкл. на това, че мет +133 е заменен е валин след едно допълнително мутационно стъпало посредством фага М13 Мр8, съгласно познатите методи. Този мутантен животински вид хибридна лимфотоксинова ДНК се използва вместо левцил аминотерминалната ДНК от пример 7 и се изразява като слят продукт. Според познатите методи се използва цианоген бромид за разкъсване на ST П сигнала от хибридния лимфотоксин и се изолират зрели левцил аминотсрминални варианти на лимфотоксина.

Друга полезни лимфотоксинови производни са тези, при които аминокиселинните остатъци от фактора на туморната некроза са заменени със съответните лимфотоксинови остатъци и са получени хибридни производни. Един типичен пример е заменянето на първите 8,9 или 10 остатъка на зрелия фактор на туморната некроза с / вал-арг-сер-сер-сер-арг-тр-про-сер-асп/ за първите 27 аминокиселинни остатъци на левцил аминотерминалния лимфотоксин.

При директно изразяване в E.col съществува голяма вероятност за получаване на деметионираната N-терминална форма.

Тъй като мутационният участък е предварително определен, не е необходимо самото мутационно въздействие да е специфично. Например за оптимизиране качествата на мутантния хизсидин +89 лимфотоксин се извършва случайна мутагенеза върху лизин +89 кодона и изразените лимфотоксинови мутанти се селекционират за намиране на оптималната комбинация на цитотоксична активност и протеазоустойчивост.

Лимфотоксините могат да съдържат и включвания, обикновено от порядъка на 1 до 10 аминокиселинни остатъка, а също така и делеции с големина от 1 до 30 аминокиселинни остатъка. Заместване, отстраняване и включване или всякаква друга комбинация могат да се използват, за да се стигне до крайния продукт. Включванията могат да съдържат амино- или карбоксилтерминални сливания, напр. прибавяне на хидрофобни вериги към карбоксилния край. За предпочитане е обаче да се извършва само заместваща мутагенеза. Логично е, че мутацията в кодиращата ДНК не трябва да нарушава рамката за четене и не трябва да съдържа комплементарни участъци, които могат да доведат до синтеза на вторични информационни РНК структури. Извлеци от E.col, трансформиран с вектори, съдържащи ДНК, която кодира лимфотоксинови мутанти с делеция в последните 16 аминокиселини от карбоксилния край или делеция в първите 33 аминокиселини от аминокрая, съдържат левцил аминотерминален лимфотоксин без цитотоксична активност. Причините за липсата на активност са непознати и могат да бъдат която и да е от изброените в пример 1.

Не всички мутации в ДНК, кодираща лимфотоксин, се изразяват в крайния продукт, получен от рекомбинантна клетъчна култура. Например, един голям клас заместващи мутации са тези, при които секреционна водеща последователност от различен тип е заместила показаната на фиг.2а последователност, било чрез отстраняване в областта на 34 аминокиселинния лидер или чрез заместване, като по-голямата част или целият нативен лидер се замени с друг, който е по-вероятно да се разпознае от клетката. Например, при конструирането на вектор за изразяване в прокариоти (фиг.2а) водещата последователност се отстранява и се заменят последователностите за бактериалната алкална фосфатаза или за термостабилния ентеротоксин. При вектор, предназначен за дрожди, водещата последователност се заменя с последователността за дрождената инвертаза, алфа фактора или киселата фосфатаза. Това не означава обаче, че водещата последователност от човешки произход не се разпознава от други гостоприемници освен от човешки клетки. Когато водещата последователност е “разпозната” от клетката,слетият белтък, състоящ се от лимфотоксин и водещ полипептид, се разкъсва на мястото на съединяването, с което се стига до секреция на лимфотоксин. Така, дори и при използване на мутантна ДНК за трансформиране на гостоприемните клетки, получаваният продукт може да бъде било нативен лимфотоксин, било слят продукт, в зависимост от ефективността, с която клетката въздейства на слетия продукт.

Друг голям клас ДНК мутанти, които не са в състояние да изразяват лимфотоксиновите производни, са т.нар. нуклеотидни замествания, създадени с цел да се избегне появяването на структури на РНК от типа стебло-бримка или за да се получат кодони, които се преписват с по-голяма готовност от избрания гостоприемник - напр. добре известните E.coli кодони.

Мутантните нуклеинови киселини се приготвят по познати методи /41, 42, 43, 44/. Тук се включват мутагенеза с помощта на М13 фага, синтез на мутантен лимфотоксинов ген, както е описано в пример 1 или по който и да е друг познат метод.

Нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксин, е всяка ДНК или РНК последователност, която кодира полипептид, отговарящ на дефиницията, независимо от това дали нуклеотидната й последователност съответства на природната. Освен това, нуклеиновата киселина в смисъла на изобретението е способна да хибридизира с нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксин, дори и ако хибри дизиращата нуклеинова киселина не кодира самата тя белтък, който да отговаря на дефиницията за лимфотоксин. Подобна нуклеинова киселина може да се използва за проба, защото малката дължина на кодирания от нея полипептид не е достатъчна за изразяване биологичната активност на лимфотоксина. Нуклеиновата киселина, кодираща лимфотоксина или хибридизираща с друга, се приготвя чрез органичен синтез, както това е показано в пример 1 или се добива от естествени източници, чрез избор в геномни или с ДНК библиотеки, както това е показано в примерите.

Лимфотоксинът съгласно изобретението се произвежда в резултат на процес, който включва трансформация на гостоприемник с вектор, носещ нуклеиновата киселина, която кодира лимфотоксин. Векторът представлява репродуцираща се ДНК конструкция. Векторите се използват за умножаване на ДНК и за изразяване на ДНК, кодираща лимфотоксин. При експресионния вектор ДНК последователността, кодираща лимфотоксина, е операционно свързана с подходяща контролна последователност, способна да осигури изразяването на лимфотоксина в съответния гостоприемник. Като контролни последователности се използват транскрипционен промотор, допълнителна операторна последователност, която контролира транскрипцията, последователност, кодираща рибозомните участъци за свързване на РНК, последователности, които контролират края на транскрипцията и транслацията.

Векторът може да бъде плазмид, вирус (включително фаг) или интеграционен ДНК фрагмент, който може да се интегрира в генома на гостоприемника чрез рекомбинация. Веднъж пренесен в подходящ гостоприемник, векторът се възпроизвежда и функционира независимо от генома на гостоприемника или в определени случаи се включва в този геном. В настоящето описание “плазмид” и “вектор” се използват като синоними, защото плазмидите са найчесто използваните вектори в настоящия момент. Независимо от това, всички други варианти на вектори, които имат подобна функция и които са познати или могат да бъдат открити в бъдеще, са подходящи за използване. Подходящите вектори съдържат репликони и контролни последователности, които произ лизат от видове, съвместими с гостоприемника, в който ще се изразява продуктът. Трансформираните клетки на гостоприемника са клетки, които са трансформирани или трансфектирани с лимфотоксинови вектори, създадени по рекомбинантната ДНК технология, Трансформираните клетки на гостоприемника обикновено изразяват лимфотоксина. Синтезираният от тях лимфотоксин се отлага вътреклетъчно или се секретира било в периплазматичното пространство или в културалната течност в зависимост от избрания вид на гостоприемника.

Участъците на ДНК са оперативно свързани, когато се отнасят функционално един към друг. Например, ДНК на една предпоследователност или на една изразяваща водеща последователност е оперативно свързана с ДНК на един полипептид, ако е изразявана като препротеин, осигуряващ секрецията на полипептида; промоторът е оперативно свързан с кодиращата последователност, ако контролира транскрипцията й; рибозомният участък за свързване е оперативно скачен с кодиращата последователност, ако е така разположен, че да е възможно транслирането. Най-общо, оперативно свързан означава непрекъснат, а в случаите с водещите секреторни последователности и в правилна фаза за разчитане.

Подходящите гостоприемници могат да се намерят между прокариотите, дрождите или висшите еукариотни клетки. Прокариотите включват грам положителни и грам отрицателни микроорганизми, като напр. Е.coli или бацили. Висшите еукариотни клетки включват установени клетъчни линии от млекопитаещи, както е описано по-долу. Един предпочитан гостоприемник е фагоустойчивият щам Е.coli W 3110 /АТСС 27 325, описан в примерите, въпреки че и други прокариоти като E.coli В, E.coli X 1776. /АТСС 31 537/, E.coli 294 / АТСС 31 446/, различни видове псевдомонас, или Серация марцесенс, са също подходящи.

Прокариотнитс вектор-гостоприемник системи са предпочитани за изразяването на лимфотоксина. Голям брой подходящи микробни вектори са на разположение. По принцип, микробен вектор, който съдържа репликационно начало, разпознавано от гостоприемника, промотор, способен да функционира в него и ген за фенотипна селекция, например ген, кодиращ белтъци, придаващи антибиотикоустойчивост или осигуряващи някаква хранителна потребност, е напълно подходящ. Подобни векторни конструкции сс произвеждат и за други гостоприемници. Типично е трансформирането на E.coli с рВР 322, един плазмид, който произлиза от един щам на E.coli /45/ . рВР 322 съдържа гените за устойчивост към ампицилин и тетрациклин и по този начин осигурява прост и удобен начин за идентифициране на трансформираните клетки.

Векторите, подходящи за изразяване, трябва да съдържат промотор, лесно разпознаван от гостоприемника, докато векторите, предназначени за клониране, могат да се използват и без подобен промотор. Промоторът обикновено е хомоложен за избрания гостоприемник. Най-често използваните промотори при конструиране на рекомбинантни ДНК включват β -лактамазната /пеницилиназната/ и лактозната промоторна система /46,47/, триптофановата система /48/, и tac-промотора /49/. Освен посочените широко разпространени промоторни системи, подходящи са и други известни микробни промотори. Подробности, отнасящи се до тяхната нуклеотидна последователност, са публикувани, което позволява на запознатите с техниката да ги свързват оперативно с ДНК, кодираща лимфотоксин, в плазмидни вектори /50/. Понастоящем, предпочитаният вектор е производен на рВР 322, съдържащ промотора на алкалната фосфатаза с триптофановата Шайн-Далгарно последователност. Промоторът и Шайн-Далгарно последователността са оперативно свързани с ДНК, кодираща лимфотоксина, т.е. те са разположени така, че да се осигури транскрипцията на информационната РНК за лимфотоксина от ДНК.

Освен прокариотите, еукариотни микроорганизми като дрождите могат да се трансформират с лимфотоксинкодиращи вектори. Сахаромицес церевизие, или обикновените хлебни дрожди, е измежду найчесто използваните еукариотни гостоприемници, въпреки че са налице и други щамове. Дрождените вектори обикновено съдържат репликационно начало от 2 микроновия дрождев плазмид или автономна възпроизвеждаща се последователност /А В П/, промотор, ДНК, кодираща лимфотоксин, /включително и човешки прелимфотоксин/, последователности за полиаденилиране и преписване и селекционен ген. Подходящ плазмид за изразяване ма лимфотоксин в дрожди е YRp 7 /51,52,53/. Този плазмид съдържа трп 1 генът, който е подходящ за селекция в дрожди, неспособни да се развиват в среда без триптофан, например АТСС 44076 или РЕР4-1/54/. Присъствието на увреждане в триптофановия оперон на гостоприемника осигурява подходящи условия за откриване на трансформанти, чрез растежа им в отсъствие на триптофан.

В списъка на подходящите дрождени промоторни последователности се включват също и промоторите за металотионеина, 3фосфоглицерат киназата /55/ или други гликолитични ензими /56,57/, като например енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозофосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза, глюкокиназа. Описани са и други подходящи вектори и промотори за изразяване в дрожди /58/.

Други промотори, които имат и предимството, че транскрипцията може да се контролира от растежните условия са промоторните области на алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С кисела фосфатаза, разграждащи ензими на азотния метаболизъм, посочените металотионин и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, а също така и ензимите, отговорни за използването на малтозата и галактозата. При конструиране на плазмиди, подходящи за експресия, завършващите последователности на тези гени се свързват с З'края на последователността, кодираща лимфотоксин, за да може да се осигури полиаденилиране на РНК.

Освен микроорганизми, за гостоприемници могат да се използват и клетъчни култури, произлизащи от многоклетъчни организми. Този подход нс е предпочитан, тъй като за сега отлични резултати се получават при използване на микроби за експресията на лимфотоксина. По принцип всяка еукариотна клетъчна култура може да се използва независимо от това дали произхожда от гръбначни или от безгръбначни животни. Независимо от това, съществува голям интерес по отношение на клетки от гръбначни животни и по тази причина отглеждането на такива клетки в тъканни култури през последните години вече е рутинна техника. Като примери за полезни клетъчни линии се посочват линиите VEPO и Hela, линията, произлизаща от яйчниците на китайски хамстери /СНО/, VV 138, ВНК, CO -7 и MOCK линиите. Векторите за изразяване в такива клетки обикновено съдържат (ако е необходимо) репликационно начало, промотор, разположен над гена, който се изразява, рибозомален участък за свързване, участък за разцепване на РНК (ако е използвана съдържаща интрони геномна ДНК), участък за полиаденилиране и последователност за приключване на транскрипцията.

Последователностите за контрол на транскрипцията и транслацията във вектори, предназначени за изразяване в клетки на гръбначни, често се взаимстват от вирусни източници. Например, най-често използваните промотори произлизат от вируса на полиома, аденовирус 2 и най-често от вируса V 40. Ранните и късните промотори са особено полезни, защото се получават лесно от вируса като фрагмент, който съдържа освен това и вирусното начало на репликацията /59/. Могат да се използват различни по големина фрагменти от ДНК на CV 40, при условие че съдържат приблизително 250 базови двойки последователност, простираща се от Хинд III участъка до Бгл1 участъка на вирусното репликационно начало. Освен това е възможно и желателно да се използва човешки геномен промотор, контролни и/или сигнални последователности, свързани с лимфотоксина, при условие че са съвместими с избрания гостоприемник.

Репликационното начало може да се потърси при конструирането на подобни вектори, както от екзогенен източник - CV 40 или друг вирус (полиома, аденовирус, VSV, или BPV), така и от самия репликационен механизъм на хромозомата на гостоприемника. Ако векторът се интегрира в хромозомата на гостоприемника, последният е често достатъчно ефикасен. При трансформация на висши еукариотни клетки с ДНК, кодираща човешки прелимфотоксин, се получава безметионилната форма на лимфотоксина.

При избиране на предпочитан гостоприемник от клетки от млекопитаещи животни за трансфекция с вектори, които носят ДНК последователности както за лимфотоксина, така и за дихидрофолат редуктазата се препоръчва да се избира гостоприемникът според типа на ДХФР белтъка. Ако се използва див тип ДХФР белтък, е за предпочитане да се използва последователността, кодираща ДХФР в дефицитен по отношение на този тип белтък гостоприемник, за да може да се осъществи успешна селекция в среда без хипоксантин, глицин и тимин. В такива случаи подходящи гостоприемници са клетки от яйчници на китайски хамстери /СНО/ линия, приготвени и култивирани, както е описано / 60/.

От друга страна, ако се използва ДНК, кодираща ДХФР белтък с нисък афинитет към метотрексат /МТХ/ за контролна последователност не е необходимо клетките на гостоприемника да са устойчиви на ДХФР. Тъй като самият мутантен ДХФР е устойчив на МТХ, за успешна селекция е достатъчна среда, съдържаща МТХ, при условие че самите клетки са МТХ чувствителни. Повечето еукариотни клетки, способни да адсорбират МТХ, са чувствителни спрямо него. Една клетъчна линия от този тип е СНО-К1 /АТСС CCI 61/.

Трансформираните клетки на гостоприемника са клетки, които са трансформирани или трансфектирани с лимфотоксинови вектори, получени по рекомбинантната ДНК технология. Трансформираните клетки обикновено изразяват лимфотоксина и той найчесто се отлага вътреклетъчно.

Лимфотоксинът се извлича от рекомбинантни култури на несекретиращи клетки след разрушаване на клетките и отстраняване на клетъчните частици чрез центрофугиране. Клетки, секретиращи лимфотоксин, се отстраняват от културалната течност също така чрез центрофугиране. Лимфотоксинът се пречиства от разтвора било по цитираните методи, било по аминоафинитетния метод, описан в пример 4. Лимфотоксинът се пречиства до степен, подходяща за фармакологична употреба, и се разпределя в подходящи дозировки - напр. шишенца или ампули. Могат да се използват и смеси от лимфотоксини - напр. комбинация от цитотоксични мутантни лимфотоксинови видове.

Най-добре е лимфотоксинът да се лиофилизира, ако е нужно дълго време да се съхранява, но е възможно да се приготвят и водни разтвори със стабилизатори и ексципиенти - изотоничен натриев хлорид, които могат да се прилагат на пациентите, както е описано /60/.

Лимфотоксинови композиции се прилагат на животни с тумори. Начинът на въвеждане е в съответствие с познатите методи - венозно, интраперитонеално, подкожно, мускулно, чрез инфузия в тумора или чрез инжектиране на стерилен лимфотоксинов разтвор, или пък в системи с деподействие, както е описано. При дисеминирани тумори като левкемия приложението на лимфотоксина е най-добре да се извършва венозно или в лимфната система. Тумори на коремните органи, като напр. рак на яйчниците, се третират най-добре чрез интраперитонеална инфузия с помощта на перитонеална диализа с подходящи разтвори. Обикновено при продължително въвеждане на лимфотоксин се използва инфузия, макар че са приложими и отделни инжекции.

За предпочитане е лимфотоксинът да се прилага в депоформа чрез имплантация. Примерите за подходящи системи за белтъци с молекулна маса, сравнима с тази на лимфотоксиновите димери и тримери, включват кополимери на L-глутаминовата киселина и гамаетил-Ь-глутамата /62/, поли/ 2-хидроксиетил-метакрилат/ /63/ или етиленвинилацетат. Препарати, съдържащи лимфотоксин, се имплантират в хирургическите участъци, от които е отстранен туморът. Алтернативно, лимфотоксинът може да се капсулира в полупропускливи микрокапсули или липозоми за инжектиране в тумора. Тази форма на приложение е особено подходяща за лекуване на тумори, които не подлежат на хирургическо лечение - напр. мозъчни тумори.

Количеството на приложения лимфотоксин се определя от начина на приложение, природата на тумора и състоянието на пациента. Необходимо е терапевтът да изпита дозировката и да промени начина на въвеждане с цел получаване на оптимална цитотоксична активност спрямо конкретния тумор, за което е нужно извършване на биопсии на тумора или диагностично определяне на туморните маркери, като напр. карциноембрионалните антигени, за да се избегнат токсични увреждания при високи дози на рекомбинантния лимфотоксин. Обикновено неговата доза при мишки е от 50 до 200 г/кг телесна маса/ ден при венозно въвеждане, която е практически нетоксична ин виво. Очевидно, дозите ще се променят според вида на животното.

В настоящото описание се предлага метод за получаване на лимфотоксин неутрализиращи антитела. Под неутрализиращо антитяло се разбира такова, което е в състояние имунно да свърже лимфотоксина по такъв начин, че съществено да намали неговата цитостатична или цитолитична активност, регистрирано в опити за определяне на лимфотоксиновата цитостатична или цитолитична активност, подобни на описания тук миши L 929 тест. Обстоятелството, че антитялото е в състояние да неутрализира лимфотоксичната активност не означава, че то се свързва направо с активния или свързващия рецептора участък на лимфотоксина. Антитялото ще бъде в състояние да неутрализира съществено лимфотоксичната активност, ако е свързано етерично в участък, разположен в съседство с критичен участък, т.е. в съседство в пространствено отношение, а не в оглед на аминокиселинната последовател ност.

При опитите да се приготвят моноклонални неутрализиращи антитела срещу лимфотоксина се е оказало трудно да се имунизират мишките по такъв начин, че неутрализиращите антитела да се образуват от животните. Както имунизация с лимфобластен лимфотоксин, така и с лимфотоксин, свързан с глутаралдехид, не довеждат до появата на доловими количества неутрализиращи антитела в серума на имунизираните мишки, дори и когато мишките натрупват антилимфотоксинови антитела от друг тип, доловими с ензимни имунни експерименти. При имунизация с комплекс лимфотоксин-алумина (алуминиев хидроксид - А1₂0₃.ЗН₂0) се предизвиква появяването на неутрализиращи антитела, дори и при животни, при които това не се получава по други начини. Приготвянето на алуминиевия хидроксид и неговото приложение за предизвикване на антисеруми се извършва, както е описано /64/.

Получени са сливания на далачни клетки от животни, произвеждащи неутрализиращи антитела и клетки от миша миелома. Средно е било необходимо да се проверят от 50 до 100 клона, за да се идентифицира един клон, синтезиращ неутрализиращи антитела. Процесът на избиране на подобен клон е рутинен, напълно по силите на запознатия с техниката и може да се възпроизведе без големи експериментални усилия.

Серумът, плазмата или 1сС фракциите от имунизираните животни, а също така и имуноглобулините, секретирани от хибридоми, произлизащи от далечни или лимфни клетки на имунизирани животни, са напълно задоволителни. В едно предпочитано изпълнение неутрализиращите антитела се получават практически чисти от други антилимфотоксини в хибридомната култура.

Неутрализиращите антитела се имобилизират чрез адсорбция на повърхности, напр. на термопласти от типа на полистирена или чрез ковалентно свързване с матрикси от типа на цианоген бромидно активирана сефароза. Получените по този начин антитела след това могат да се използват в имунни определения или за имуноафинитетно пречистване. Тъй като антителата са от неутрализиращ тип, те най-вероятно само се адсорбират или откриват биологично активен лимфотоксин или негови фрагменти. Антителата са особено полезни в т.нар. имунорадиоактивни опити (сандвичметоди) заедно с ненеутрализиращи антилимфотоксинови моноклонални антитела или поликлонален антисерум, съдържащ ненеутрализиращи антилимфотоксини. Имунното определяне се извършва, като се използват както неутрализиращи, така и ненеутрализиращи антитела за белязана съставка, при което белязането е осъществено с лесно за откриване съединение от типа на флуоресцентните, хемилуминисцентните или радиоктавнп съединения, в съответствие с познатите методи. За имунни определяния на лимфотоксина от компетитивен тип самият лимфотоксин се бележи по същия начин. Йодиране с хлорамин Т е еднакво подходящо както за лимфотоксина, така и за антилимфотоксиновите антитела и се извършва, както е описано /66/.

За да се опрости описанието на примерите, някои често използвани методи ще бъдат отбелязвани със съкращения.

Плазмидите се означават с малка буква “р”, предшествана или последвана от главни букви или от цифри. Изходните плазмиди са достъпни на пазара, или са на разположение без ограничения или пък могат да се конструират от подобни плазмиди по описани методи. Други плазмиди са също така познати и са достъпни за запознатите е техниката.

Под “смилане” на ДНК се разбира каталитично разкъсване на ДНК молекулата от ензим, който действа само на определени участъци. Подобни ензими се наричат рестрикционни, а участъците, в които действат, рестрикционни участъци. “Частично” смилане има при такова въздействие с рестрикционен ензим, условията на което са подбрани така, че да се засегнат някои, но не всички рестрикционни участъци. Различните използвани рестрикционни ензими са търговски продукти и изискванията за тяхното действие са определени от производителя. Обикновено, рестрикционните ензими се означават с главна буква, следвана от други букви и номер, посочващ микроорганизма, от който ензимът е изолиран. Най-често 1 г плазмид или ДНК се смила с 1 ед.ензим в 20 л буферен разтвор. Подходящите буфери и количеството на субстрата се посочват от производителя за всяка отделна рестриктаза. Инкубирането продължава обикновено 1 ч при 37₀С, но може да има и други стойности, според препоръките на производителя. След завършването на инкубирането освободените белтъци се отстраняват с фенол или с хлороформ, а смляната ДНК се извлича от водния разтвор чрез утаяване с алкохол. Понякога смилането на ДНК с рестриктаза е последвано от хидролиза на 5'края с помощта на бактериална алкална фосфатаза, за да се попречи на съединяването на двата рестрикционни участъка и получаването на “кръгова” или във вид на затворена бримка ДНК молекула, което ще предотврати възможността за включване на друг ДНК фрагмент в рестрикционния участък.

Навсякъде, където не е изрично споменато, смилането на плазмидите не се последва от дефосфорилиране на 5'края. Самият метод на дефосфорилирането и необходимите реактиви са общоизвестни /67/.

“Изолиране” на даден ДНК фрагмент от рестрикционната смес означава разделяне на фрагментите от сместа чрез полиакриламидна електрофореза, идентифициране на отделните фрагменти чрез сравняване на подвижността им спрямо подвижността на ДНК фрагменти с позната молекулна маса, изрязване от гела на участъка, съдържащ интересуващия ни фрагмент, и разделяне на ДНК от гела. Тази процедура е общоизвестна и е описана /68,69/.

“Сътърн-анализ” е метод, с чиято помощ се потвържадава присъствието на определена ДНК последователност чрез хибридизация с познат белязан олигонуклеотид или ДНК фрагмент. Освен където изрично е подчертано, в следващото описание “Сътърн-анализ” означава разделяне на фрагментите от смилането на 1 % агароза, денатуриране и пренасяне върху нитроцелулозни филтри по метода на Сътърн /70/ и последваща хибридизация /71/.

“Трансформация” означава въвеждане на ДНК в организъм по такъв начин, че ДНК да се възпроизвежда, било като част от хромозомата, било като извънхромозомен елемент. Освен където не е изрично споменато, използва се методът с СаС1₂ за трансформация на E.coli /72/.

“Лигиране” означава образуването на фосфодиестерни връзки между два двуверижни фрагмента нуклеинови киселини /67/. Освен където не е изрично споменато, лигирането се извършва в познати буфери и при познати условия с 10 г Т4 ДНК лигаза на 0.5 г приблизително еквимоларна смес от ДНК фрагменти.

“Изолиране” на ДНК от трансформантите означава изолиране на плазмидна ДНК от микробна култура. Освен ако не е изрично казано друго, е използван алкалноSDS-методът /67/.

“Олигонуклеотиди” са къси едно-или двуверижни полидеоксинуклеотиди, синтезирани химично по метода, описан в пример 1, и след това пречистени с полиакриламидна електрофореза.

Всички цитирани литературни източници са включени в справката.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Пречистване и секвениране на лимфотоксин.

Човешка лимфобластоидна клетъчна линия RPM1-1788 /АТСС CCL-156/ се култивира в 15 литрови колби до клетъчна гъстота 4Х10⁵ клетки на мл, като се използва среда, свободна от серум /РРМ1-1640/. Чрез добавяне на 20 г/мл форбод миристат ацетат се индуцира 10-20 кратно увеличение на нивото на лимфотоксина (500-1000ед/мл, определени, както е описано) над нормалното ниво. След 65 ч култивиране клетките се събират чрез филтриране и лимфотоксиновата активност на филтрата се адсорбира на стъклени перли с контролиран размер на порите (Електронюклеоникс) в колона (5 смХ20 см), уравновесена с 5 мМ фосфатен буфер (pH 7.4). Във всички буфери се добавят 0.1 мМ фенил метил сулфонил флуорид (ФМСФ), който е инхибитор на протеазите и 1 мМ натриев азид, инхибитор на микробния растеж. Полученият елюат съдържа 84000 ед/мл лимфотоксин/мг белтък. Следващите стъпки са хроматография на ДЕАЕ целулоза, лентил лецитин сефарозна хроматография и препаративна полиакриламидна електрофореза, както е описана / 68/. Чистотата на белтъка, носител на цитотоксичната активност, се определя чрез 5Д5-ПААГ обратно фазово HLPC в колона тип RP-18 “Лихросорб” и чрез аминотерминално секвениране.

Лимфотоксиновият препарат, съдържащ повече от 95% тегл. левцил аминотерминален лимфотоксин, има приблизително молекулно тегло 25 000 по данните от SAS-nAAT електрофорезата. Теоритичното молекулно тегло на белтъчната компонента на този вид е 18 664 далтона; останалите приблизително 6 500 далтона се дължат вероятно на гликозилната странична верига при Асн +62 и на някои други О-свързани захарни остатъци. Надутаечните течности от тъканните култури съдържат мултимери на същия вид (60 000 далтона според данните от HLPC или 64 000 далтона според данните от Сефадекс Г-100 хроматографията).

Останалите 5% от лимфотоксиновата смес представляват хистидилови аминотерминални видове с молекулно тегло около 20 000. И двата вида имат практически една и съща цитотоксична активност, поне в границите на чувствителност на метода, основаващ се на лизиране на миши фибробласти, описан подолу.

Триптичното разграждане на нативните лимфотоксинови молекули води до появата на малък брой фрагменти. Хистидил аминотерминалният лимфотоксин се разпада на два фрагмента в участъка между 89 и 90 аминокиселини, докато левцил аминотерминалният лимфотоксин след смилане с трипсин дава 4 фрагмента, разкъсани съответно между 15 и 16, между 19 и 20 и между 89 и 90 аминокиселини.

Микросеквенирането с помощта на метода на Едман позволява да се натрупа информация за аминокесиланната последователност на цялата молекула и на фрагментите, получени след разкъсване с трипсин.

Допълнителна информация за аминокиселинната последователност се намира във фрагментите, получени след въздействие с карбоксипептидаза Р и химотрипсин, оцетна киселина и цианоген бромид. По този метод е определена почти цялата последователност на човешкия лимфотоксин. Разположението на 156 остатъка в посока от аминокрая на веригата е точно установено. От данните за последователността става ясно, че разликата между двата вида лимфотоксини се състои в това, че 23 аминокиселини от аминокрая на левцилния аминотерминален вид отсъстват в аминокрая на хистидил аминотерминалния вид. Разположението на първите три остатъка от карбоксилния край на веригата се е оказало трудно за определяне поради някои особени пептидни връзки в този участък и поради хидрофобния характер на тези остатъци.

Създаден е синтетичен ген, който може да кодира белтъчната последователност, доколкото тя е определена чрез микросеквениращите методи. В генната последователност са включени и някои общи кодони от E.coli, а в случаите, когато такива липсват, са използвани човешки кодони. Това е направено с цел да се улесни изразяването на гена в E.coli, а също, за да може той да се използва като идентификационна проба за откриване на естествени последователности в комплементарна ДНК или в генни библиотеки. Въведените единични разпознавателни участъци за Хва1, ВамН1, Нтд III и Bgl И, улесняват конструкцията на фрагментите и позволяват бъдещо манипулиране на гена.

58-те първоначални олигомери, предназначени за синтетичния лимфотоксинов ген, се синтезират по фосфитния метод /69,70/. Размерът на олигомсрите е от 16 до 20 бази и е показан на фиг. 1а. Застъпванията между олигомсрите достигат до 6 бази и са уникални. Целият ген има конструкцията, показана на фиг. 16. Той е построен от три самостоятелни части. Първата, наречена сегмент А, има дължина 117 базови двойки и представлява 5’кодиращия край на аминокрая на левцилния вид. Сегмент В представлява ДНК, кодираща средната част на лимфотокси новата молекула, и има дължина 145 базови двойки. Сегмент С е 317 базови двойки дълъг и се предполага, че кодира всичко освен 16 аминокиселинни остатъка от карбоксилния край на лимфотоксиновата верига. Олигомсрите, необходими за синтезиране на всеки един от фрагментите, са пречистени електрофоретично и след това събрани. Относително малкият размер на всеки отделен олигомер (от 16 до 20 бази) позволява намаляване на грешките при синтеза.

Всяка група олигомери се фосфорилира в реакция в присъствие на 20 мМ Трис-НС1 (pH 7.5), 10 мМ MgCI₂,2O мМ дитиотреитол, 0.5 мМ АТР, 15 единици Т4 полинуклеотид киназа в общ обем 50μη; количеството на всеки олигомер е приблизително 60 pmol. След 30 мин при 37°С, сместа се нагрява до 65°С за инактивиране на киназата и бавно се охлажда до 20°С за около 1 ч. Фосфорилираните олигомери се лигират чрез добавка на 10 ед.Т 4 ДНК лигаза при 20°С за 2 ч. След топлинно инактивиране на ДНК лигазата, лигираните олигомери се разкъсват за 3 ч при 37°С с рестрикционни ендонуклеази, разпознаващи терминалните участъци (Хва! и ВамН! за сегмент А). Фрагментите от ссеки сегмент се изолират на 7% полиакриламиден гел. Фрагментите, имащи очакваната подвижност, се оцветяват с етидиев бромид и се елюират от гела. Плазмидът pFlF трп 69/71,72/ се разгражда с Хва! и ВамН1 и големият векторен фрагмент се изолира чрез 6% полиакриламидна електрофореза, след което около 60 нг от сегмент А се свързват с изолирания фрагмент от плазмидния вектор. По подобен начин, сегмент В е лигиран с разграден с ВамН1 и Н1пдШ pBR 322, а сегмент С е разграден с Н1пд1П и Bgl II pIeIFA-125-i !1Ъ!. С помощта на лигационните смеси се трансформират E.coli АТСС 31446 и получените рекембинантни плазмиди се характеризират чраз рес трикционен анализ и ДНК секвениране по метода на Мксам и Гилберт.пет от шестте съдържащи сегмент А клонове носят желаната последователност. Изолират се 4 клона със сегмент В и 4 със сегмент С, в които вложката е правилно ориентирана. Всеки сегмент се изолира след разграждане с рестрикционна ендонуклеаза, разпознаваща крайните участъци, и след това лигира в плазмидния вектор pFIF трп 69, разграден от своя страна с Хва1 и Bgl II. Полученият рекомбинантен плазмид с означение pLTXBl се характеризира чрез секвениране на Хва1 - Bgl II фрагмента, който съдържа последователността, показана на фиг. 1а.

За да се определи дали синтетичният ген ще бъде в състояние да произвежда биологично активен лимфотоксин, трансформантите на E.coli с pLTXBl се култивират в минимални хранителни среди при условия, дерепресиращи триптофановия промотор, за да се осъществи изразяване на синтетичния лимфотоксинов ген. След култивиране до плътност 1.0 при 550 нм, клетките от културата се събират чрез центрофугиране. Клетъчната утайка се суспендира в 1/10 от обема и се разрушава с ултразвук.

Лимфотоксиновата активност се определя по модифицирания метод за клетъчна лиза /74/. За целта миши L-929 фибробластни клетки се култивират в плаки за микротитриране в присъствие на актиномицин Д. След 12 до 18 ч 0.125 мл от серийно разредената проба се прибавя към всяко кладенче за определяне нивото на лимфотоксичната активност. След 18 ч плаките се промиват и лизирането на клетките се регистрира чрез прилепването на клетките към стената на плаката след оцветяване с 1 % разтвор на кристал виолет в метанол вода (1:4 обемно отношение). Интензивността на оцветяването се наблюдава както визуално, така и спектрофотометрично при 450 и 570 нм с помощта на фотометър Дайнатех. Клетките, размесени в кладенче с чиста културална течност, се приравняват към 0 лиза, а клетките, обработени с 3 М гуанидин хидрохлорид, определят 100% лиза. Една единица лимфотоксин се определя като количеството, което е необходимо за 50% лизиране на клетките при гъстота 12 000 клетки на кладенче.

Културалнитс лизати не показват доловима цитолитична активност в посочения опит. Контролните лизати от култури, изразяващи гама интерферон от своя страна, показват интерферонова активност. Този резултат подсказва, че синтетичният ген не кодира активен лимфотоксин. Съществуват няколко обяснения на този факт. Първо, E.coli разгражда лимфотоксина, второ - лимфотоксиновият ген не се преписва в E.coli, трето - лимфотоксиновата информация не се превежда в E.coli и четвърто - белтъкът няма правилна последователност поради грешка в белтъчното секвениране, пето - 16-те аминокиселини от карбоксилния край или част от тях имат значение за активността или за правилната конфигурация на лимфотоксиновата молекула.

Пример 2. Процедура за получаване на комплементарна ДНК, кодираща лимфотоксин.

РНК се изолира ст култура на неприлепващата фракция на човешки кръвни лимфоцити, 48 ч след индукция с форбол миристат ацетат (10 нг/мл), стафилококов ентеротоксин В (1 г/мл) и тимозин а-1 /75/ . Тази култура показва активност до 400 ед.лимфотоксин / мл надутаечна течност. РНК се концентрира чрез адсорбция на имобилизиран олиго дТ, елюира се и комплементарната ДНК се приготвя чрез обратна транскрипция /76/. Обратната транскриптаза, с чиято помощ се прави копието комплементарна ДНК, се прилага по стандартните методи, след което се приготвя втора верига чрез Кленоу-обработка (отново по стандартните методи) и сДНК се обработва с S-1 нуклеаза за отстраняване на бримката. За да може с ДНК да се включва във вектор, краищата й се лигират към адаптор или свързваща последователност така, че да се създаде рестрикционен разпознавателен участък, или още по-добре лепливи краищата за даден рестрикционен разпознавателен участък. За тази цел се използва олигонуклеотидът:

5’ НО-ААТТЦАТГЦГТТЦТТАЦАГ ГТАЦГЦААГААТГТС-Р-5'

Посоченият олигонуклеотид се лигира към ДНК и тя отново се изолира чрез полиакриламидна гел електрофореза. Всеобщо достъпният фаг 2g!-10 или неговият еквивалент gl-ΙΙ (достъпен чрез АТСС), се разгражда с ЕсоР! и след това се изолира линейният фрагмент /77/. Снабденият със свързваща последователност обратен препис и линеаризираният фаг се лигират и със сместа се трансфектира E.coli С-600 или друг чувствителен гостоприемник. Приблизително 10 000 рекомбинантни фагови частици се засяват на петри с диаметър 15 см и се проверяват по хибридизационния метод /78,79/ с белязана по Р₃₂ проба, приготвена от сегмент А от фиг. 1а /80/.

За хибридизацията се използват двойни нитроцелулозни филтри и проба с активност 5Х10⁷ срм в 20% формамид. Филтрите се промиват двукратно с 0.3 М натриев ацетат, 0.03 М натриев цитрат и 0.1% натриев додецилсулфат при 37°С.

Два от фагите хибридизират с пробата и се пречистват от плаката. Пречистените фаги се хибридизират както със сегмент А, така и със сегмент В. Вложките комплементарна ДНК в двата хибридизиращи фага ALT1 и λ LT2 се субклонират в М13мр8 и секвенират /81/. Вложката в Л LT2 се оказа с големина 600 базови двойки и не съдържа 3' кодиращия участък на лимфотоксиновия ген. Вложката в Л LT2 обаче съдържа цялата кодираща област за левцил аминотерминалния лимфотоксин и в добавка и 650 базови двойки 3' непревеждан участък (съдържащ полиаденилиращ сигнал) и кодоните за 18 аминокиселини от аминокрая на левциловия вид. Тъй като това не е достатъчно да се получи цялата кодираща област на лимфотоксина, налага се приготвянето на допълнителна, белязана по Р₃₂ проба от ДНК вложката в Л LT 1 и се проверяват още 25 000 рекомбинатни 10 фаги /82/. Изолират се още 12 хибридизиращи фаги и последователността на най-дългата вложка е показана на фиг.2а /LT11/. Най-дългата отворена рамка за четене се провежда от първия АТГ-кодон. Цифрите над всяка линия се отнасят до положението на аминокиселините, а под линията-до положението на нуклеотидите. Левцилният остатък, отбелязан с “1”, показва първия секвениран остатък в левциловия аминотерминален лимфотоксин (фиг.1а) и вероятно е първият аминотерминален остатък и в зрелите лимфотоксинови видове. Първите 34 остатъка са сигнална последователност. Остатъците от 156-171 не произлизат от белтъчното секвениране, а са изведени от нуклеотидната последователност.

Пример 3. Конструиране на хибриден вектор за изразяване на левциламинотерминален лимфотоксин, съдържащ синтетичен ген и естествена с ДНК.

Конструкцията е показана на фиг.2б. Плазмидът pLTXBl (съдържащ неактивния синтетичен ген) се смила частично с EcoRI и PstI и се изолира фрагмент с големина 685 базови двойки, съдържащ ДНК кодираща 125 N-терминални остатъка на лимфотоксина. Частичното смилане с PstI се наложи поради присъствието на допълнителен разпознавателен участък при остатък 10 (фиг. 1а). Фрагмент ДНК с големина 301 базови двойки се изолира от λ LT1 чрез разграждане с EcoRI и PstI (разпознавателните участъци са при нуклеотиди 554 и 855 - фиг.2а). Фрагментите се изолират чрез електрофореза з 5% полиакриламиден гел и се елюират, след което се лигират с pBR 322, разграден с EcoRI и дефосфорилиран с бактериална алкална фосфатаза за намаляване на фоновата трансформация. Полученият изразяващ се плазмид - pLT τρπΐ, се характеризира по отношение на правилната ориентация и разположение на рестрикционните участъци чрез рестрикционен анализ и ДНК секвениране. Левцил аминотерминалният лимфотоксин е успешно изразен чрез трансформация на E.coli 31446 с pLT τρπΐ и култивиране на трансформантите при 37° за 4-6 часа в среда с тетрациклин до достигане на оптична плътност 1.0. Клетъчните лизати имат цитотоксична активност. Левциловият аминокрай на изразения лимфотоксинов вид се оказва заместен с блокиран метионилов остатък. Предполага се, че продуктът на тази синтеза е по-скоро формил метиониловия вид, отколкото метиониловия.

Пример 4. Имуноафинитетно пречистване на лимфотоксина.

Миша моноклонална клетъчна линия, изразяваща антилимфотоксин (пример 8) се култивира ин виво в мишка и се пречиства от асцитната течност чрез йонообменна хроматография. Анионно обменният елюат се куплира с активирана с цианоген бромид Сефароза при концентрация 2 мг/мл смола.20 мл колона се уравновесява последователно с

TBS (съдържащ 0.05 М Трис-HCI, pH 7.0; 0.15 М натриев хлорид; 2мМ ЕДТА), с елюационен буфер (0.1 М оцетна киселина, pH 4, 150 мМ натриев хлорид) и накрая с TBS. Лизата от E.coli (получен с ултразвук и предварително избистрен с центрофугиране) се преципитира с 40% наситен амониев сулфат и се натоварва на колоната със скорост един колонен обем на час. След продължително промиване с TBS, съдържащ 0.05% TWEEH-20, специфично свързаният материал се елюира с елюиращ буфер, pH веднага се нагласява на 7.8 с 0.1 обем 1м Трис-HCI, pH 8,5 и се съхранява при 4°С. Специфичната активност на пречистения лимфотоксин е 2 - 10 Х10⁷ ед/мг, измерени по описания метод.

Елюатът съдържа повечето от активността, натоварена на колоната. Поголямата чест от общия белтък на елюата се придвижва като единична ивица както при редуциращи, така и при нередуциращи условия в Д-полиакриламидна гел електрофореза. Подвижността на тази ивица отговаря на приблизително 18 000 далтона, което отговаря на очакваната стойност 18 664 далтона за неглюкозилирания левцил аминотерминален лимфотоксинов вид, изведена от аминокиселинната последователност. Пречистеният рекомбинантен лимфотоксин се изпробва за цитолитична активност ин витро и антитуморна активност ин виво.

Пример 5. Биологична активност ин виво на рекомбинантния лимфотоксин.

Рекомбинантният и лимфобластоидният лимфотоксини се изпитват в ин виво теста за туморна некроза. Саркома тип МетнА /а/ се присажда на чувствителни мишки от линия BALB/C х C57Bl/6fL или CB6fL и след 7-10 дни туморите се инжектират с получен съгласно пример 4 лимфотоксин, с лимфобластоиден лимфотоксин (приготвен и пречистен, както е описано), като се оставят неинжектирани контроли. След 20-24 часа животните се убиват, туморите се отделят и се изследват хистологично за размера на некрозата. Както е показано на таблица 1, както рекомбинантният, така и лимфобластоидният лимфотоксин причиняват значителна некроза на МетнА /а/ саркома ин виво. Контролите не показват некроза.

Таблица 1

Некроза на МетанА/а/ саркома ин виво, причинена от рекомбинантен и естествен лимфотоксин

Въздействие	Брой на мишките със степен на некроза
+++ ++ +
1 Контрола Буфер		3
Лимфобл .лимфотоксин
25 000 ед.	4	-
Лимфобл .лимфотоксин
10 000 ед.	4	-
Рекомб.лимфотоксин
200 000 ед.	14 2 2	-
Рекомб.лимфотоксин
25 000 ед.	3	1
Рекомб.лимфотоксин
10 000 ед.	3 - 1	-
2 Контрола Буфер	- - -	9

Лимфобластоидният лимфотоксин се инжектира разтворен в буфер 1 /0-01 М ТрисHCI, 0.05 М /NH₄/₂HCO₃, pH 8.0), а ре- ²⁵комбинантният - в буфер 2 /0.15 М натриев хлорид, 0.1 М натриев ацетат и 0.1 м Трие HCI, pH 7.8).

Липсата на въглехидрати в рекомбинантния лимфотоксин не повлиява на 30 биологичната активност, тъй като специфичната активност при него (2-10х10⁷ ед/мг) е почти същата, както при намерената при лимфобластоидния /4x10’ ед/мг/.

Рекомбинантната лимфотоксинова 35 активност показва също термочувствителност, подобна на естествения лимфотоксин инактивиране на водните разтвори след нагряване на 80°С за 1 час.

Пример 6. Създаване на вектор за 40 изразяването на метионил хистидил аминотерминален лимфотоксин.

Конструирането на плазмид, който изразява в E.coli метионил хистидил аминотерминален лимфотоксин, е показано на фиг.З. 45 Един синтетичен олигонуклеотид се внася в плазмида по такъв начин, че да изразява началният метионинов кодон, съседен до хистидиловия кодон на хистидил аминотерминалния лимфотоксин (остатък 24 от 50 фиг.2а). Това се постига, като се изолира векторен фрагмент с големина 4630 базови двойки от плазмида рЬТтрп1 след разграждане с Хва1 и Clal препаративна 1% агарозна електрофореза и електроелюиране. ВамН1 Clal фрагмент с големина 570 базови двойки се изолира от ρΐ Ττρπΐ по същия начин. Двата олигонуклеотида са получени по описани методи и се смесват с олигонуклеотидите 6,7,52 и 53, показани на фиг.1а. Приблизително по 50 рмол от всеки нуклеотид се обработват с полинуклеотид киназа, както е опсисано в пример 1. Олигонуклеотидите се свързват и след това лигират със смес от 570 ВамН1 Clal и 4630 Хва1 - Clal векторни фрагменти. Лигационната смес се трансформира в E.coli АТСС 31446 и рекомбинантните колонии се селекционират на основата на тетрациклиновата им устойчивост. От един от трансформантите е получен плазмидът p20KLT. Той се характеризира чрез рестрикционен анализ и ДНК секвениране.

Пример 7. Приготвяне на цитотоксични лимфотоксинови слети варианти.

Плазмид, съдържащ ДНК, кодираща лимфотоксин, слят с бактериален белтък се конструира чрез клониране на последователността, която кодира бактериалната сигнална последователност, съседна на структурния ген за лимфотоксина. Последователността на гена за термоустойчивия ентеротоксин на E.coli е известна /88/ и се знае, че тя кодира и една сигнална последователност от 23 аминокиселини, която насочва секрецията на ентеротоксина в периплазматичното пространство на E.coli.

Плазмидът pW.\I501 съдържа гена на термоустойчивия ентеротоксин. Част от ДНК, която кодира ентеротоксина, се извлича от плазмида по следната процедура. Най-напред pWM501 се разгражда с Rsal и се изолира ДНК фрагмент с големина 550 базови двойки. Този фрагмент се лигира към фага М13мр8, който предварително е разграден с Smal. С лигираната ДНК се трансформира E.coli JM101, щам, който се продава като специфичен гостоприемник на фага М12мр8. Изолират се стерилните петна и с помощта на стандартните методи от E.coli, инфектиран с фага М13мр8, се изолира двуверижна форма на STII Rsa. Чрез прилагане на описаната методика за субклониране с помощта на фага М13мр8 се изолира 550 б.д.фрагмента, съдържащ водещия STII ген, но вече снабден със серия рестрикционни участъци, произлизащи от фага. ST1I Rsa дериватът след това се разгражда с EcoRI и Pstl и се получава ДНК фрагмент с големина, малко по-голяма от 550 б.д.

EcoRI - Pstl фрагментът се клонира в рВР322. Това се извършва като най-напред векторът се разкъсва с EcoRI и с Pstl и след това се лигира с EcoRI - Pstl ДНК фрагмента. ДНК сместа се използва за трансформиране на E.coli АТСС 31446, след което се селекционират тетрациклин устойчивите колонии. Един плазмид, изолиран от една подобна колония се означава pSTII-частичен.

Посоченият плазмид се разгражда с Мн11 и ВамН1 и се изолира фрагмент с големина 180 б.д., който съдържа Шайн-Далгарновата последователност на STII, сигналната последователност на STII и първите 30 кодона на зрелия ST1I ген. ДНК фрагментът с големина 180 б.д. се лигира е плазмид, съдържащ триптофановия промотор. Подобен плазмид, означен рНСН207-1, е описан в литературата /84/. При един производен на споменатия плазмид, рНСН207-1 EcoRI участъкът, намиращ се на 5' края на триптофановия промотор, е запълнен с ДНК полимераза 1 и тъпите му краища са съединени чрез лигиране /85/.

Посоченият производен плазмид, съдържащ триптофановия промотор, се използва в настоящето изобретение. Той се разгражда с Хва1 и след това се обработва с ДНК пол 1 в присъствие на четирите д!ЧТР, за да се запълни едноверижният участък. Получената последователност се разгражда с ВамН1 и се изолира фрагмент, съдържащ вектора. Този векторен фрагмент се свързва след това с 180 б.д. сигнален фрагмент на ТП, изолиран, както е посочено. С получената лигационна смес се трансформира E.coli АТСС 31446 и се селекционират ампицилин устойчивите колонии. От една от тях се изолира един плазмид, означен като STII-водещ.

М13 фаг, носещ ТП кодиращите последователности, се създава чрез свързване на фрагмента с големина 180 б.д. от pSTII-водещия плазмид с отворен чрез Хва1 и BamHI М13мр10 фаг. Получената по този начин фагова ДНК, наречена pSTII-совалка, се характеризира чрез рестрикционен анализ и чрез ДНК секвениране. Последователностите, кодиращи LT ентеротоксина, се въвеждат в този вектор чрез свързване на Hpal-EcoRI 700 б.д. фрагмента от рЬТтрп1 с разградения с Smal-EcoRl pSTIIсовалков плазмид. Получаната фагова ДНК М13STII-LT се характеризира и използва за мутагенеза по следния начин: праймерът 5' р ЦАААТГЦЦТАТГЦАЦТГЦЦАГГЦГТАГГ се обработва с киназа и се смесва с матрицата / M13-STII-LT/ в присъствие на лигазен буфер и на разградена с XBal-EcoRI М13мр10 ДНК /86/. Сместа се нагрява до 95°С и след това се охлажда най-напред до стайна температура за 30 мин и след това в лед за още 30 мин. Прибаваят се четирите деоксинуклеотид трифосфата, заедно с ATP, Т4 ДНК лигаза и големия (Кленов) фрагмент на E.coli ДНК полимераза I. Цялата смес се инкубира при 14°С за 1 ч и след това се използва за трансформиране на компетентни E.coli 1MI01, щам, достъпен на пазара, или някой друг подходящ М13 гостоприемник. Правилно мутагенизираните фаги се разпознават чрез хибридизационен отбор с помощта на 32Р белязана проба. Фагите се характеризират чрез ДНК секвенционен анализ. От подобни фаги се приготвят репликативни форми и от тях се изолира Xeal-EcoRI фрагмент с големина 761 б.д., който съдържа сигналната последователност от STII, съседна на кодиращата последователност за левцил аминотерминалния лимфотоксин. Тази ДНК се литра с фрагмент от ρ20ΚΙ Т, получен чрез разграждане с Хва1ВамН1 (4285 б.д.) и с 375 б.д. ЕсоИ1-ВамН1 фрагмент от рВР322. Полученият плазмид pST18LT се характеризира чрез ДНК секвениране и рестрикционен анализ. Приготвя се и друга подобна конструкция, която съдържа ДНК, кодираща сливането на сигналния аминокрай на STI1 с кодиращата последователност на хистидиновия остатък на хистидил аминотерминалния лимфотоксин. Получените плозмиди се трансформират в E.coli АТСС 31446, след което отново се изолират плазмидите pSTIT18 и pSTIT16. Потвърдено е, че те кодират сливането с ТП чрез рестрикционен анализ и ДНК секвениране. E.coli, трансформирани с плазмидите pSTIT18 и pSTIT16, синтезират сливания на STH сигналната последователност с левцил аминотерминалния и хистидил аминотерминалния лимфотоксини, отговарящи по молекулно тегло на очакванията. Лизатите от E.coli, съдържащи споменатите слети белтъци, имат цитотоксична активност.

Пример 8. Методи за създаване на моноклонални миши антитела, способни да неутрализират лимфотоксина.

Пречистеният лимфобластен лимфотоксин, получен съгласно пример 1, се диализира срещу буфериран с фосфат натриев хлорид /PBS/. Към диализата, който съдържа 200 /гг/мл лимфотоксин, се прибавя глутаралдехид до концентрация 70 мМ, сместа се инкубира за 2 ч на стайна температура, добавя се глутаралдехид за достигане на крайна концентрация 140 мМ, инкубацията продължава още 6 ч и сместа отново се диализира срещу PBS . 50 г от получения по този начин “полилимофотоксин” заедно с 0.5 мл адювант на Фройнд се инжектират мишки (щам BALB/ С) подкожно. След една седмица, мишките получават допълнително още 50 itr полилимфотоксин и 0.5 мл пълен адювант на Фройнд, половината мускулно, а остатъкаинтраперитонеално. След 7 дни се събира серумът и се изпитва за антилимфотоксинова активност чрез слайза-пробата.

Елайза-тестът се изпълнява по следния начин: в микротитърните кладенчета найнапред се поставя буфериран разтвор на пречистен лимфотоксин, така че стените на кладенчетата да се покрият с около 100 нг лимфотоксин. Неадсорбираните количества се изсмукват от кладенчетата. След това към всяко кладенче се прибавя по 50 μ.τ от съответното разреждане на изследвания материал, заедно със 100 рл PBS, съдържащ 5 мг/мл говежди серумен албумин и се инкубира за 2 ч при стайна температура, промива се с PBS, съдържащ 0.05% TWEEH 20 и към всяко кладенче се прибавя 100 мл конски серум, съдържащ пероксидазно белязани кози антимиши ИГГ в PBS-BSA буфер. След 1 ч инкубация всяко кладенче се промива с PBS, съдържащ 0.05% TWEEH 20 и след това с фосфатен буфер, рН 5.0, съдържащ 0.1 мг о-фенилен диамин/мл и воден 30% Н₂О₂ (в съотношение 4 мл от 30% Н₂О₂на 10 мл субстратен разтвор) се прибавя към всяко кладенче. Инкубирането продължава 30 мин и реакцията се спира с добавяне на 50 мл 2.5 М сярна киселина, след което се измерва поглъщането при 492 нм. Кладенчетата, показали поглъщане, превишаващо 1 опт.ед., се приемат за антилимфотоксинположителни.

Пробите се изпитват и за способността им да неутрализират цитолитичната активност на лимфотоксина в опита с мишки от линия I 929. Серумите, събрани от имунизирани животни или хибридомните супернатанти, се разреждат, колкото е необходимо, в среда RPN1I-1640, съдържаща 10% фетален говежди серум и около 100 лимфотоксинови единици/ мл, след което се платират в микротитърни кладенчета, съдържащи L 929 клетки. Неутрализиращите антитела се откриват по това, че потискат способността на лимфотоксина да лизира клетките.

Животните, имунизирани с обработени сглутаралдехид лимфотоксини, натрупват антитела, които са активни в Елайза-теста, но нямат неутрализираща активност.

За имунизиране на мишки от същата линия се приготвя суспензия, съдържаща 100 мг лимфотоксин и 1 мл от 1-64% разтвор на алумина (AI /ОН/₃). Мишките се инжектират по 100 мл от суспензията вътремускулно и с 400 мл интраперитонеално. След една седмица животните се инжектират венозно с 10 мг неполимеризиран и неадсорбиран лимфобластен лимфотоксин, разреден в 100 мл PBS. Проба, разредена 1/80 и взета след три дена, показва присъствие на лимфотоксин неутрализиращи антитела.

От подобни животни се взема с.тезката и 3x10’ хомогенизирани клетки се сливат с 5х10⁷ миши мисломии клетки, след което се поставят в микротитърни плаки, като всяко кладенче съдържа среда НАТ и по около 3000 перитонеални макрофаги /86/. Хибридомите от кладенчетата, които съдържат супернатанти, положителни в Елайза-теста, се култивират в 1 мл обем среда ДМЕМ, обогатена с 20% фетален телешки серум, 10% НСТС-135 среда, 5x10⁵ М меркаптоетанол и НАТ, разпределена в микротитърни кладенчета с разчет по една клетка на кладенче. В супернатантите от подобни култури се търси след това неутрализираща активност. Статистически, около 2% от Елайза положителните хибридоми, получени след имунизацията с алумина, синтезират неутрализиращи антитела. Високоафинитетните лимфотоксинови антитела се подбират от тази група хибридоми.

Пример 9. Специфична мутагенеза на лимфотоксина.

Методът, описан в пример 3, се повтаря точно и в този пример с тази разлика, че синтетичният олигонуклеотид има последователност 5'ЦТЦААЦТЦТГЦАЦЦЦА 3', а неговата комплементарна верига (сегмент 53) 3'АГАЦГТГГГТЦГТЦГТ 5’.

Модифицираните олигонуклеотиди се свързват с останалите и се лигират в експресионния вектор, описан в пример 6. Този вектор съдържа едно заместване от 2 б.д., което променя лизин + кодона от лизин в хистидин. Хистодиновият мутант се изразява след трансформация E.coli АТСС 31446.

Други участъковоспецифични мутанти се приготвят по същия начин, като се предпочита кодоните, предназначени за селекция, да не се въвеждат в EcoPl рестрикционния участък, тъй като това би довело до необходимостта от извършване на частично EcoPl разграждане, както е в пример 3. Избягва се също въвеждане на допълнителни Хва! или НшдШ участъци във фрагмент А (фиг. 16), ВамН1 или НшдШ във фрагмент В или Ншд1П и BgHI във фрагмент С. Във всички случаи това би наложило прилагането на частично разграждане и би довело до създаване на делеционни, а не на заместени мутации.

Пример 10. Идентификация на геномни ДНК, кодиращи миши и говежди лимфотоксини. Аминокиселинна последователност на миши и говежди лимфотоксини.

Гените на говеждия и мишия лимфотоксин се изолират от генни библиотеки. Един фрагмент човешка комплементарна ДНК /600 б.д. Rvull EcoRI/ се бележи с ³²Р посредством никтранслация и се използва като проба за проверка на миша геномна -ДНК библиотека (М600 миши геномна библиотека в -Харон4А /67/ и независимо на говежди ДНК геномна библиотека /ЕР 88622А/. Хибридизацията се извършва в 20% формамид, а филтрите се промиват двукратно във воден разтвор на 0.3 М натриев хлорид, 0.03 М натриев цитрат и 0.1 SDS. Няколко фага се хибридизират с човешката лимфотоксинова проба и се изолират /78/. От тях се приготвя фагова ДНК /78/, която след това се разгражда с рестрикционни ендонуклеази и се анализира чрез Съдърн хибридизация. Един EcoRI фрагмент с големина 3500 б.д. миша ДНК и един EcoRI фрагмент с големина 2200 б.д. се хибридизира с човешката проба. Тези фрагменти се клонират в рВР 322 и след това се секвенират /81/. Изведената от тези резултати белтъчна последователност на мишия и говеждия лимфотоксини, заедно с последователността на чавешкия лимфотоксин за сравнение са показани на фиг.4.

Пример 11. Изразяване на лимфотоксин в дрожди под контрола на АДН промотор.

Плазмидът pL Ττρπΐ се разгражда с Хва1, за да се превърне в линейна форма в Хва1 участъка, разположен точно до лимфотоксиновия стартов кодон. Хва! лепливите краища се запълват с Кленоу фрагмент и един EcoRI адаптор с последователност:

ОН

5' ААТТЦЦЦГГГ 3’

-ГГГЦЦЦ -Р 5’ 3’ ОН се лигира към тъпите краища на плазмида, като подаващите се 5’хидроксилни краища се фисфорилират с помощта на полинуклеотидкиназа. С лигационната смес след това се трансформират E.coli АТСС 31446. От ампицилинустойчивите колонии се получават две серии плазмиди, носещи SP вложката в обратна ориентация по данни от рестрикционния анализ. Плазмидите се пречистват и се използват за трансформация на дрождени щамове, носещи τρπΐ мутацията (например дрождения щам РН218, АТСС

44076) за изолиране на трп* фенотип. Плазмидите, при които стартовият кодон на сегмента SP е разположен в съседство с промотора за алкохол дехидрогеназата, успешно изразяват лимфотоксин в дрожди след тяхната трансформация. От екстракти от такива дрождени трансформанти се изолира лимфотоксин. Стабилността на плазмидите може много да се повиши при използването им в промишлен мащаб, ако се използват плазмиди, съдържащи 2 микроновото репликационно начало вместо хромозомното репликационно начало от pFRPn /87/.

Пример 12. Изразяване на лимфотоксин в клетки от млекопитаещи.

LT11 (пример 2) се разгражда с EcoRI и фрагментът, който кодира лимфотоксина (обратния транскрипт) се изолира. Плазмидът pEHER (ЕР 117 060А) също се разгражда с EcoRI, след което се обработва с телешка алкална фосфатаза и се лигира с обратния транскрипт от LT11. Полученият плазмид се размножава в E.coli АТСС 31446 /ЕР 117 060А/ и се означава съответно pEHERLT I и pEHERLT II. Тези плазмиди съдържат лимфотоксиновата ДНК в обратна ориентация по данни от рестрикционния анализ на полиакриламидна гел електрофореза. Плазмидите се използват за трансфекция и селекция на СНО flHFR-flUX-Bl 1, СНО 1 и Ltk клетки.

Клетките от тъканните култури се трансфектират, като се смесват 1 μτ от pEHERLT I и pEHERLT II с 10 μτ носеща ДНК от плъх в общ обем 250 мл, 0.25 М СаС1₂, последвано от прибавяне на капки на 250 мл HEPES (280 м.М натриев хлорид, 1.5 мМ двунатриев фосфат, 50 мМ HEPES, pH 7.1). След 30 мин на стайна температура разтворът се прибавя към клетки от тъканна култура, растящи в 60 мм пластмасови петри за тьканни култури. Използват се клетки СНО 1, СНО ДНГР-ДиХ-ВП и Ltk . Петритата съдържат по 3 мл хранителна среда за съответния гостоприемник.

За клетките от линии СНО 1 и СНО flHFR ДиХ-В11, средата е Нам F-12 (Гибко), обогатена с 10% телешки серум, 100 μ/мл пеницилин, 100 мг/мл стрептомицин и 2 //мМ I -глутамин. За Ltk^- клетките, средата е Игл, модифицирана от Дюлбеко (ДМЕМ), обогатена по същия начин.

След 3 до 6 ч средата се отсранява и клетките се промиват с 20% глицерол в буфериран с фосфатен буфер физиологичен разтвор.

За селекция на трансфектираните гостоприемни клетки, те се трипсинизират след 2-дневно култивиране (обработка със стерилен трипсин 0.5 мг/мл, съдържащ 0.2 мг/мл ЕДТА) и около ЗхЮ⁵ клетки се поставят в 10 мм плаки за тьканни култури със селективна среда. За dhfr клетки средата е F-12 Гибко без глицин, хипоксантин и тимидин (среда GHT ). За ДНЕК⁺ клетки в нормалната среда се прибавя 100-1000 мМ метотрексат. Контролите се култивират при същите условия, но без плазмиди и с плазмида рЕД11 /ЕР 117 060А/, съдържащ нормални flHFR. Колониите, произлизащи от клетки, които са погълнали и изразяват flHFR плазмидите, се появяват след 1-2 седмици. Идентифицират се трансформантите, които изразяват зрял лимфотоксин.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за получаване на лимфотоксин, характеризиращ се с това, че се получава нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксин, вмъква се нуклеиновата киселина във възпроизвеждащ се вектор, трансформира се клетка с вектора, култивира се клетката, за да се натрупа лимфотоксин в културата, и лимфотоксинът се извлича от културата.
2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че трансформираната клетка е дрожди или клетка от бозайник, нечовешка клетка, нуклеиновата киселина кодира човешки прелимфотоксин и лимфотоксинът с гликозилация се извлича от културата.
3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетката е прокариот.

4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът е вариант на лимфотоксина прелимфотоксин със следната аминокиселинна последователност и нейната кодираща ДНК, включително и 5’ и 3' ограничаващите непревеждани участъци.

3 < o p- СЛ >— Ol< r— CD ’σιδ E o ·- < E CD no p- O.CJ X CJ «С < CD CD )— 1- > CD ο (— 3 CD o -p cs CL CD Ο E )- 3 CD O 4J CD Ε ο 0) P- CM Ф h- E CD N DCS Ф I- CM Ф b- Ο-<_5 r— CJ Σ. < 1- P- 00 «С —1 CD Ο < 3 CS И CD 3 CJ E CJ O <c 01 CD Ε Ο αυ Ф P<— o 35 Φ P—1 CJ )- < E CD a. cd 35 ε < f-~ 1— O CJ 3 CD O CJ E CD C CD X Ο Ό h— E CJ Φ P- E CJ Ф CD — <c Ρ < > CS <X CJ -J CJ Cl CJ tn Ι- CD CD •Ρ CD 3 CD m cj E < »— CJ Ε CD E CD φ ι- QJ |— •r- <Z Φ CJ Ό )- a>cj a> cd Ε < r- CJ X CJ 00 p- >· CD cn p- 00 Ι- ο O 3 CS X CD C CJ P P E CJ Ε o ο . ф 1— —- << СЛ «С <c < Φ )— X CD Φ CD ο ο ρ- 1 — CJ CD CJ -J CJ )- «Γ <n <C 3 CD.O CTP- O C CD.O 3 CJ O <0 <D,O 3 CD CD Ф P in E CD •Ct -- < O Φ )- σ> — cj in Φ P 1— t— CJ —< < CJ CD CD CO —1 CJ < CD M- =J CD 1— CD *>CD <0 CJ <л CD E >— 3 CD cd r— CD r~“ M 35 Φ o Φ )- )- 1 CT CD < CD 00 )- —1 CJ Г“ ο 3 CD E P- E CJ C )- O CJ O P- CD φ P- X CJ Φ CD m «ί E CD E CJ CD CD CD r— CJ p- < in c «С <c ex CD ex CD 3 1— E CD CD CJ C CD E >- r- cd Ρ- Φ J— >— < E CJ «5 Φ CD Ί3 p- ο f « r— CJ CD CJ CL CJ 00 1- > CD V_J CD 3 CJ <0 CJ CL CJ E CD in 1— CS Φ p- r- CJ </l <c Φ CD ·— < CD r- CJ < CD < CD 00 < 1- h- X CD )— CD 3 CJ COP 3δ CD CD Q 3 CD <0 CD Ο Φ CJ 8 1___ OU r<— CJ e-H ·— CJ < CD «— E> < CD r-1 X X•-И a. p- CD O in cj Е «С Φ p- E CD <Л < O CJ CD Ш ·<- Ф CJ —* J— Φ CD >»*5 E EJ CS CS CD SZ CJ CZ) Ι- *“· C 00 h- —I «е CX CD 3 < Ο t~ 3 CJ Φ CD >>CD f-*· E CJ o Φ )— E CJ Φ P- -C )— >>« cd — CJ CL CJ -J CJ CL 1- CD CD )— P- )- E CJ E < in CJ >“>)— Е 1- C CD <£ -C CJ X CD.O ·— «— CD.O Ф CD «— <C CS P < P- < o X CJ CD CD <Λ 00 I- CD CJ CD CM CO 1 )— O cu 3 CJ <0 p* ext— Ф CD E CD CJ CM X CD Φ p- I~~ CJ <n «< jc ί- Φ CD CJ CD Ι- ) -p < _J CJ < CS < CD α. Ι- 00 Ι- *>cj >><J O <0 Ι- C CD Ο — CD Ε CJ Ο r- CD >— cs οο »— CJ >— «С CO <0 1— Φ CJ CD tn cd CD CD < CD CD CD =* CD tn ρ- P- CD «Λ p- Ο Ι- 3 CD r— <5 ω CD CJ >5 CD Ε CJ Ф f— П5 )- X )- < CJ P- > CD CX CJ _J CJ > CD CL p- CJ CS >— CD >>)- in <r φ CD C CD 3 CD h— « t— >— CD ft — < Φ p- CD CJ x- > CD CD CD -J <£ CD ID -iCJ cn<D Ο Ι- 3 CJ <0 CJ E CD C CD CJ E CD Ε CJ Φ P- r- CJ Φ CD *— nt CJ 1 <σ <C £X CJ —J CJ < CD 00 )- CD cj r* CS o <r 3 CJ E CJ СЯ1- E CD ·— CD CD $- CJ »—< Φ p- x cj E CD >>< <0 1— CJ Q.CJ -J CJ P- <c < CD )- )- CD X— CJ 3 CJ E CJ O CLOD r- CD 8.32 —< CD CD CJ Φ )- Φ CD in in < CD <0 i— CD CD CD «— CJ СЯ CD 00 < 5» CD Φ CJ C CD in CJ E CD Φ CD 01 p- t x r- r— c — < X CD XT Ι- ·— O-t— ctcd X CJ I- < Ο. P- X o < 1— з CJ|8 Г0 CJ ,O <0 CJ ID C CD E E)(S 10 CD )— φ P-«—< «— CJ Γ- CJ CM >><«*· r— CD P CD CD г- CD ra cs «X CD И⁴* < CD СЯР- >>CD 3 1— Г0 < Ф CD 3 CD E CD r— CD Φ I- f- CD >— 1— Φ p- CD Ь-Η «0 CJ CT CD -J CJ < CD »-< < -J CD

CD CD < CD < CD C o 3 CD F- 3 CD CD CD *— < Φ Ι- CD CD < 5 < CD CD ο CD CD CD F- CD < F- s CD CD 0.0 O Ob CD CJ 1— CD F- v> «X F- *-» CD CD CD < < < CD < CD .-4 < CD C CD F— 4— CD I— CD F- CD I- F- < >^< Φ CD F CD CD F· CD CD Г- CD ft CD < CD < CD CD O CD CD CD CD >— CD CD F- < CD F- $ < C CD iD CD CD CD CD CD — < r- CD CD CD h— CD CD CD O «X CD CD CD CD < CD CD < CD h- CD < U CD Λ>δ < CD < F- CD CD -C CD CD CD 1— 5 CD < F- < CD CD F- CD CD CD CD F- CD CD F- CD 3 CD Φ F- F- C < < CD ω f- -C F- < CD CD CD CD -J o £F F- CD CD CD CD CD CD CD < < CD < Ф CD < »— CD CD CD CD £. F- CD < CD CD < < CD CD IO CL F- F- CD H- CD CD CD CD CD CD < < CD Ф CD CD F* CD 1— < CD < -C J— Λ F- F- < l·- CD F- ' CD CX. F- 5» CD < F- CD F- CD CD CD CD H* < < CD σ> o U F- CD F* »-4 CD h- CD CD ·— CD -C CD h- f~ ex CD F- s F- < CD F- < CD < o F- F- CD CD < CD J— < CD CD Ό F- U F* CD CD UJ CD F- h- < r~ CD Φ CD F- CD l·— CD < CD < CD <n <x CD «X CD 5 CD CD F— < CD < CD >>CD O F- M,Q CD O 5iS CD O CD.O CD F CD <|<n < m CD 1П <|in <>n CD CD a. cd CD Г⁴* <00 < σ> CD O < »—< < Г4 CD < CD CD 1-4 CD —· U> CD O U CD CD CD CD CD F- < 40 CJ CD CD J— CD CD CD CD X CD Ml/) < »— F- CD CD CD F- CD f— < < CD CD U CD 3 CD 1— CD CD CD < CD >»< Φ F~ F- CD CD CD CD O 1— F- —1 CD CD < CD CD < 5 CD CD t < CD CD r- CD «X CD CD < < Φ b- « h- CD CD < < CD CD X < > CD «X CD < F- < CD < < CD CD CD CD u cd D < CD CD CD < < < Φ CD Φ F- O F- »— < CD CD 1/) F- -J CD ^П 1— CD J— a CD Ю F- $ CD < c5 CD U> CD i/» CD < CD CD < $ ·*- <ζ •r- < CD CD CD CD CD X CD X CD k— F- F- CD CD CD »- < CD CD < < 3 CD O CD < CD CD CD < CD Φ F- S- CD < F- CD >— CD CD -J CD a. cd F- CD 5 F— CD CD < CD CD >— CD Q. CD Φ CD < CD CD CD < CD F CD F- h- F- < CD CD F- ί- ·“» «X F— F- CD < CD < CD F- CD < < Ο CD >>CD < F- < < CD CD U CD r- CD CD CD CD CD 5 < CL CD CD CD $ < . CD CD CD < < »- CD F· Ct»— < CD CD < < < (Λ < CD F- F- CD F- CD CD CD «X CD < CD CD < < CD CD CD CD CD < CD C CD V < CD < CD CD >- < r~ <X JE cd 1— CD F~ CD § CD CD CD b- < < $ CD < F $ 1— CD CD < 3 Q D O И CD CD CD 3 CD CD Φ 1— v> CD -r- < < CD Ι- CD CD D U Cl ^4 X CD < F- Ο CD < CD CD F- >— $ CD < >><3 U CD CD < CD < Ι- *- CD -C CD F- CD CD CD Ο CD CD ,o F- < tg SiS оЮ Sg $g o < kn U CD CD CO F- O) CD O CD —ι CD CM V CD Ш Ф CD F- CD < «-4 F- ^4 < »-4 Cl CD </> F- FF· CD CD CD < s $ U H- 5 < CD CD F- CD CD CD >>< Ф F- < CD < < < < F- ь- __J CD 1— t— CD CD CD CD

CTCGATGAAGCCCAATAAACCTCTTTTCTCTGAAAAAAAAAAAAA

13Ό0

5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът се извлича абсолютно свободен от хомогенни протеини, които са неидентифицирани или присъстват в неизвестни количества.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът има специфична активност от около 2 до 10 х 10⁷ед/мг протеин.
7. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът е прелимфотоксин.
8. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът е негликозилиран.
9. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът е вариант лимфотоксин, където аминокиселинният остатък в лимфотоксиновата последователност съгласно претенция 4 е отпаднал, заместен с друг остатък, или друг остатък е вмъкнат в последователността съгласно претенция 4 при условие, че този вариант лимфотоксин изключва лимфотоксин с последователност съгласно претенция 4 с аминокраища при Leu+Ι или His+23.
10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин е човешки алел от последователността от претенция 4.
11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се това, че вариантът лимфотоксин е животински лимфотоксин.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин е говежди лимфотоксин.
13. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че остатъци -34 до -1 от лимфотоксин са били отстранени и допълнително се включва най-малко един аминокиселинен остатък.
14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че включването е сливане на полипептид с карбокси С-край на лимфотоксин.
15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че полипептидът се слива с лимфотоксина чрез хидролизния участък на протеолитичен ензим.
16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че участъкът е лизлиз или лиз-арг.
17. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът е цитологично неактивен преди протеолитичната хидролиза.
18. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че хидрофобен диили трипептид се слива с Leu+171.
19. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че ала-лиз последователността е включена между Fty+127 и Рго+128.
20. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че хидрофобен аминокиселинен остатък е включен между thr+163 и Val+164.
21. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че поне един аминокиселинен остатък от последователност съгласно претенция 4 е заменен с друг.
22. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че остатъците -34 до -1, включително тези съгласно претенция 4, са земестени с метионил или формилметионил.
23. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че остатъци -34 до +22 включително са заместени с метионил или формилметионил.
24. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че остатъците -34 до -1 са отстранени и (а) хистидил замества лизил +89;

(б) валил, изолевцил или левцил заместват ала нил +163;

(в) тирозил замества треонил +163;

(г) лизил замества серил +82;

(д) изолевцил, левцил, фениаланил, валил или хистидил заместват серил +42;

(е) глутамил, триптофанил, серил или хистидил заместват лизил +84;

(ж) аспартил или лизил заместват треонил +163:

(з) лизил или глицил заместват серил +70;

(и) тирозил замества треонил +69;

(й) аргинил или хистидил заместват лизил +28;

(к) аргинил или лизил заместват хистидил +32;

(л) пролил, серил, треонил, тирозил или глутанил заместват аспартил +36;

(м) тирозил, метионил или глутамил заместват серил +38;

(н) треонил, тирозил. хистидил или лизил заместват серил +61 ;

(о) аспартил, серил или тирозил заместват глицил +124;

(п) аргинил, лизил, тирозил, триптофанил или пролил заместват хистидил +135;

(р) аспартил замества треонил +142; или (с) лизил или треонил заместват глутамил +146.
25. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин е животинско-човешки лимфотоксин.
26. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че метиониловите остатъци +20, +120 и +133 са заместени съответно с треонил, серил и валилови остатъци.
27. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин съдържа фрагмент от фактора на туморната некроза.
28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че първите 27, 26 или 25 остатъци от аминокрая на левцил аминотерминалния лимфотоксин са заместени съответно с полипептид, избран от групата val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp; val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser или val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro.
29. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин съдържа заместване на една единствена аминокиселина.
30. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин съдържа едно единствено отстраняване от 1 до около 30 аминокиселинни остатъци.
31. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин съдържа включване на един единствен аминооста.т5«.
32. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че заместването, отстраняването или добавката са локализирани в около 30 остатъка от левцил +1.
33. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин съдържа заместване, предварително определено на аминокиселинен остатък в рамките на 25 остатъка от карбоксилния край на аминокиселината.
34. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че заместването е заместване на остатък от класовете неутрален, кисел или основен аминокиселинен остатък с такъв, който не принадлежи към класа на заместваната аминокиселина.
35. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че вариантът лимфотоксин е цитотоксичен.
36. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина, кодираща лимфотоксин, е избрана от групата (а) кодираща лимфотоксин ДНК, свободна от непревеждани вместени последователности; (б) кодираща лимфотоксин ДНК, която е лишена от ДНК участъци, кодиращи други белтъци от организма, от който ДНК произхожда; и (в) нуклеинова киселина, способна да хибридизира с нуклеинова киселина, кодираща лимфотоксина, при условие, все пак, че хибридизиращата нуклеинова киселина е лишена от нуклеотидната последователност на естествената ДНК или РНК, кодиращи лимфотоксина.
37. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина кодира човешки лимфотоксин.
38. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че ДНК е свободна от наличието на интрон между нуклеотиди 284 и 285.
39. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина е с ДНК.
40. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина е ковалентно белязана със субстанция, която може да се открие.
41. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че нуклеиновата киселина кодира един вариант лимфотоксин.
42. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че възпроизвеждащият се вектор съдържа ДНК съгласно претенция 36.
43. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че векторът се възпроизвежда в прокариоти.
44. Метод съгласно претенция 42, характеризиращ се с това, че векторът се възпроизвежда в еукариоти.
45. Метод съгласно претенция 43, характеризиращ се с това, че векторът допълнително съдържа бактериален промотор, оперативно свързан към нуклеиновата киселина, кодираща лимфотоксин.
46. Метод съгласно претенция 36, характеризиращ се с това, че ДНК кодира сливане на бактериален секреторен лидер и лимфотоксин.
47. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че хетероложна клетка се трансформира с нуклеиновата киселина.
48. Метод съгласно претенция 1, характеризаращ се с това, че една клетка от млекопитаещо се трансформира с вектора.
49. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че клетката е прокариот.
50. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че рекомбинантната клетъчна култура съдържа левцил аминотерминален лимфотоксин.
51. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че лимфотоксинът взаимодейства чрез контактуване на антитяло на лимфотоксин с екстракт на клетъчна култура при условия, при които лимфотоксинът се адсорбира върху него, отделя се адсорбиралото лимфотоксин антитяло от екстракта на културата и лимфотоксинът се отделя от антитялото.