JPS62195285A - リンホトキシン発現ベクタ−及びそれを用いるリンホトキシンの製造方法 - Google Patents

リンホトキシン発現ベクタ−及びそれを用いるリンホトキシンの製造方法

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JPS62195285A
JPS62195285A JP61034962A JP3496286A JPS62195285A JP S62195285 A JPS62195285 A JP S62195285A JP 61034962 A JP61034962 A JP 61034962A JP 3496286 A JP3496286 A JP 3496286A JP S62195285 A JPS62195285 A JP S62195285A
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lymphotoxin
gene
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JP61034962A
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Kenji Yamashita
憲司 山下
Yasuhiro Ikenaka
康裕 池中
Toru Sumiya
徹 角谷
Hajime Kawarada
川原田　肇
Kiyoshi Watanabe
清 渡辺
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Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、プロモーター領域を含むリンホトキシン遺伝
子配列とそれを活性化するエンハンサ−配列から成るリ
ンホトキシン発現ベクター、該リンホトキシン発現ベク
ターによる動物培養細胞の形質転換細胞及び該形質転換
細胞を利用したリンホトキシンの製造方法に係る。
リンホトキシン（ＬＴ）は、癌細胞に対し選択的に毒性
を示し壊死させる作用をもち（Ｅｖａｎｓ　。
Ｃ！、Ｈ，ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、　　８７巻、８９８頁〕、制
癌剤としての応用が期待されている。
（、従来の技術） ＬＴは、ヒト或いはマウス等の動物のリンパ球細胞をフ
ィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ等のレクチン或
いはフォルボールエステルで刺激することにより誘導さ
れるリンホカインの一種である（Ｄｅｖｌｉｎ、　Ｊ、
　Ｊ、　（１９８４年）リンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏ
ｋｉｎｅｓ　）　、　９巻、３１３頁〕。ＬＴの蛋白化
学的研究はいくつかのグループで研究されているが、分
子量約２０，０００の成分がその最小単位であり、その
単位成分が会合したものや池の成分との複合体があると
されている〔ＡｇｇａｒＷａｌ　、　Ｂ、　Ｂ、ら（１
９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、２５９巻、６８６頁〕。
ＬＴは、フォルボールエステル、マイト−ジエン等で刺
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微量であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイト−ジエン等で刺激するとＬＴが誘導的に産
生されることが知られているが、生産能は用いる細胞の
能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは
言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ、大
腸菌でＬＴ様蛋白の生産が可能になった（　Ｇｒａｙ、
　Ｐ、　Ｗ、　　ら（１９８４年）ネイチャー　（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、　３１２巻、７２１頁〕。しかし微生物で
つくられるＬＴ様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合
成機構が多少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端
が天然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によって
つくられるＬＴ様蛋白は、天然のＬＴが糖鎖を有してい
るのに対し、糖鎖が結合していない。このように微生物
の蛋白合成系によってつくられたＬＴ様蛋白と天然のＬ
Ｔとは物質として明らかに異なり、治療薬として長期間
使用したり、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問
題が懸念される。
（発明が解決しようとする問題点） 蛋白のアミノ末端が天然のＬＴと同じで且つ糖鎖を有す
るＬＴを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。この場合、単に
ＬＴ遺伝子を動物培養細胞に導入してもＬＴの産生をみ
ることはできないと推定される。すなわちＬＴは誘導蛋
白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限されている
からである。実際に本発明者らは、プロモーター等の発
現の制御領域を含むＬＴ遺伝子を種々の培養細胞に導入
しても極めて微量しかＬＴの発現がみられないことを知
った。このことはＬＴの遺伝子を細胞に導入し、細胞に
効果的なＬＴ産生能を付与する為には、ＬＴの遺伝子に
何らかの改良を加える必要があることを示している。こ
の改良を加えることが本発明が解決しようとする主たる
問題点である。
１９８１年、　Ｂａｎｅｒｊｉらはウサギβ−グロビン
遺伝子の発現が、グロビン遺伝子配列の近くに接続した
ＳＶ４０のＤＮＡ複製起点近傍に存在する７２ベースペ
アー（ｂｐ　）繰り返し配列によって増強されることを
示した（　Ｂａｎｅｒｊｉ　、　Ｊ、ら（１９８１年）
セル（Ｃｅｌｌ）、　２７巻、２９９頁〕。
このＳＶ４０　７２ｂｐ繰り返し配列による遺伝子発現
の増強効果は、接続したこの配列の位置或いは方向にか
かわらず現われた。このような遺伝子の発現を増強させ
る比較的小さなりＮＡ配列は、エンハンサ−配列と呼ば
れており、ラウス・ザルコーマ・ウイルス（Ｒ８Ｖ）、
ポリオーマ・ウィルス、ボバイン・パピローマ・ウィル
ス等のゲノム中にも存在していることが知られた（　Ｇ
ｌｕｚｍａｎ　。
Ｙ、　ト５ｂｅｎｋ、　Ｔ、編、カレント・コミュニケ
ーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、コー
ルド・スプリングハーバ−・ラボラトリ−（１９８３年
）〕。また免疫グロブリン遺伝子にはイントロン中にエ
ンハンサ−の存在が知られている（同上）。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、エンハンサ−配列を利用してＬＴ遺伝子
の発現を増強できないかを検討した結果、通常休止の状
態にあるＬＴ遺伝子を活性化させたＬＴ発現ベクターの
開発に成功し、本発明に至った。
多（の遺伝子はイントロンを含むが、正常で機能のある
蛋白の発現の為には、イントロンの正しい位置でのスプ
ライシングが不可欠である。しかしインシュリン遺伝子
とＳＶ４０のプロモーター領域を結合し、ＣＯ８細胞に
導入した場合、異常なスプライシングが報告されている
（　Ｌａｕｂ、　Ｏ。
ら（１９８３年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２５８巻、６０４８頁）。
本発明によるＬＴの発現ベクターは、ＬＴ遺伝子の本来
のプロモーターを用いる為に、異常なスプライシングの
起る、すなわち異常な蛋白が発現する可能性を軽減させ
ることができるという特性を持っている。
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。
遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＬＴ発現ベクターを導入した細胞のＬＴ生産量は、
ＬＴ遺伝子のコピー数に相関があると考えられ、遺伝子
数の増加した細胞はＬＴの生産能が向上するものと期待
される。
本発明者らは、プロモーター領域を含むＬＴ遺伝子配列
とそれを活性化するエンハンサ−配列から成るＬＴ発現
ベクターに増幅可能な遺伝子を接続し、動物培養細胞に
導入後、適切な条件下で細胞を選択することにより、Ｌ
Ｔ高生産株の育種に成功し、本発明に至った。またこれ
らの細胞は無血清培地でもＬＴを生産し得る細胞であっ
た。
ＬＴの生産に無血清培地を用いることは、ＬＴの培地か
らの回収精製を容易にするばかりでなく、製品への血清
成分の混入を防ぐことになる。
以下に本発明を更に詳細に説明する。
（１）ＬＴ遺伝子のクローニング ＬＴをコードしている染色体遺伝子領域は、遺伝子のク
ローニング、制限酵素による解析或いは塩基配列の決定
等の結果、第１図に示したような構造を持っていること
が明らかになった。プロモーター領域を含むＬＴ遺伝子
配列とは、少くとも第１図に示したＴＡＴＡボックスを
含む制御領域から第１エクソン乃至第４エクソンを含む
遺伝子配列を指す。
ＬＴをコードする染色体ＤＮＡ配列は、ヒトＤＮＡから
クローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細
胞培養細胞或いは組織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（
Ｂ１１ｎ、　Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシ
ツズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、
　）　、　３巻、２３０（頁〕により調製される。ＬＴ
遺伝子のクローニングに用いるベクターは０ｈａｒｏｎ
　２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢＲ３２２
に代表されるプラスミドベクター或いはｐＨ０７９に代
表されるコスミツドなどが利用できるが、一般的には、
高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるλファー
ジをベクターとして用いる遺伝子操作法が用いられる。
すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、
λフアージＤＮＡの置換可能領域の代りに挿入し、リコ
ンビナントファージＤＮＡをつくる。
次にインビトロパッケージングの手法を用い、感染性の
あるファージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともに
プレートにまき、組換え型ファージのプラークを形成さ
せる（　Ｅｎｑｕｉｓｔ、　Ｌ、ら（１９７９年）メソ
ツズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８巻、２８１頁：Ｈｏｒ
ｎ、Ｂ、（１９７９年）メソツズ・イン・エンザイモロ
ジー、６８巻、２９９頁〕。ＬＴをコードするＤＮＡ断
片を持つ組換え型ファージのプラークの検出には、ｃＤ
ＮＡや合成りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダ
イゼーションの手法（ＷＯｏ、　８．Ｌ、Ｃ，（１９７
９年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、３
８９頁：　Ｓ　Ｚ　Ｏ５Ｚａｋ　ｓＪ、Ｗ、ら（１９７
９年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、４
１９頁〕が利用できる。またＬＴの遺伝子を持つ組換え
型ファージは、プラークハイブリダイゼーションによっ
て選択されたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養
することにより大量に調製できる。また組換え型ファー
ジのＤＮＡはフェノール法等により調製できる（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、Ｔ、ら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ
ａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　）。
（２）−ＬＴ発現ベクター ＬＴは誘導蛋白であり、ヒト白血球細胞を種々のマイト
−ジエン等で刺激することにより誘導される。現在マイ
ト−ジエンの刺激が、どのような形でＬＴの遺伝子に働
き、ＬＴを誘導するかは不明であるが、そのような誘導
機構のない細胞にＬＴのプロモーター領域を含む遺伝子
を導入してもＬＴの生産は微弱なものであった。この事
はＬＴのプロモーターは、ＬＴの非生産細胞ではメツセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成を効率よく行なわな
い休止の状態であることを示している。
本発明者らはＬＴのプロモーターを活性化するために、
エンハンサ−配列を利用したＬＴ発現ベクターの構築を
行った。エンハンサ−は細胞特異性があることが知られ
ているが、宿主細胞中でＬＴプロモーターを活性化する
エンハンサ−であればどのようなエンハンサ−でも利用
できる。たとえばＳＶ４０の７２ｂｐ繰り返し配列、ポ
リオーマ・ウィルスのエンハンサ−、ボバイン・パピロ
ーマ・ウィルスのエンハンサ−、アデノウィルスのエン
ハンサ−、ラウス・ザルコーマ・ウイルスのエンハンサ
−１免疫グロブリンのエンハンサ−等が利用できる。ま
たエンハンサ−の挿入位置と方向性は、ＬＴプロモータ
ーが活性化でき、ＬＴの成熟型ｍＲＮＡの合成を阻害し
ない位置と方向であればどのような位置と方向であって
もかまわない。
また組み込むエンハンサ−の数とその種類も、ＬＴプロ
モーターを活性化するものでｈればその数と種類を問わ
ない。本明細書実施例中に記載されているプラスミドｐ
ＬＴ−Ｒ３は、ＬＴ遺伝子のＴＡＴＡボックスの約８０
０ｂｐ５’側上流にラウス・ザルコーマ・ウイルスのエ
ンハンサ−配列ヲ正の方向に３つ有するＬＴ発現ベクタ
ーである。
プロモーター領域を含むＬＴ遺伝子配列とそれを活性化
するエンハンサ−配列から成るリンホトキシン発現ベク
ターとしては、そのベクターが大量に調製できるような
プラスミドやファージＤＮＡなどのレプリコンであるこ
とが望ましい。またベクターを導入した細胞のみを選択
的に増殖させる為には、選択マーカー遺伝子を同−ＤＮ
Ａ配列上に持つベクターが適切である。動物細胞での選
択マーカー遺伝子としてはＥｃｏｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ　。
Ｒ，Ｃ，ら（１９８０年）サイエンス、２０９巻。
１４２２頁〕、ｎｅｏ　（５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、　
Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル・オフ・モレキュラー
・アンド・アプライド・ジエネテイツクス（Ｊ、　Ｍｏ
ｌ。
Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　）　、　１巻、３２７頁〕
、ｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ　、　Ｍ、ら（１９８０年）
プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス・ニーニスニー・７７巻、３５６
７頁）などの遺伝子が用いられる。
ＬＴ発現ベクターによるＬＴ耐性細胞の形質転換細胞の
ＬＴ生産量は、形質転換細胞に含まれるＬＴ遺伝子のコ
ピー数に相関がある。ＬＴ遺伝子のコピー数の多い、す
なわちＬＴの生産性の高い細胞は、増幅可能な遺伝子を
有するＬで発現ベクターを導入後、単細胞分離或いは増
幅可能な遺伝子の増幅した細胞が選択的に増殖する条件
で細胞を選択することにより分離することができた。増
幅可能な遺伝子としてはジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子
、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、メタ
ロチオネイン遺伝子が利用できる。
またその池の増幅可能な遺伝子（５ｔａｒｋ　、　Ｇ、
　Ｒ。
とＷａｈｌ、　Ｇ、Ｍ、　（１９８４年）アニュアル・
レビュー・オフ・バイオケミストリー、５３巻、４４７
頁〕も利用できる。ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有
するＬＴ発現ベクターの形質転換細胞からジハイドロ葉
酸還元酵素遺伝子の増幅した細胞は、形質転換後１？ｉ
１Ｍ以上の濃度のメソトロキセートを含む培地で選択さ
れ得る。選択された細胞はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝
子ばかりでなく、ＬＴ遺伝子も増幅している場合が多い
。同様にメタロチオネイン遺伝子は重金属で、またアス
パラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子はＮ−（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ　）　−Ｌ　−ａｓｐａｒｔ
ａｔｅ　（Ｐ　ＡＬ　Ａ　）で遺伝子が増幅した細胞が
分離できる。
（３）発現ベクターによる形質転換株の分離細胞へのＬ
Ｔ発現ベクターの導入法として、トランスフェクション
効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉｇｌｅｒ
　、　Ｍ、ら（１９７７年）セル。
１１巻、　２２３頁）、マイクロインジェクション法（
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　、　Ｗ、　Ｆ、ら（１９８０年）プ
ロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−
・オフ・サイエンス・ニーニスニー、７’１巻。
５３９９頁〕、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ　、　Ｗ、ら
（１９８０年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、
７７巻、２１６Ｂ頁〕等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保
有している微生物のプロトプラストが用いられている。
本発明者らが宿主として試用した動物培養細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＯＯ）
から入手可能なハムスター由来の細胞であるが、本明細
書に示されているＬＴの製造法を用いれば、少なくとも
を椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常及び変異細胞
、ウィルスによる形質転換細胞等において活性あるＬＴ
を産生ずることが可能である。また宿主細胞は、生産目
標濃度以上のＬＴに対して耐性を示す細胞であることが
望ましい。
プロモーター領域を含むリンホトキシン遺伝子配列とそ
れを活性化するエンハンサ−配列から成るリンホトキシ
ン発現ベクターを導入し、ＬＴを産生ずるようになった
細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地
ばかりでなく、全く血清を含まない無血清培地でもＬＴ
を産生ずる事　。
を見い出した。ＬＴの生産に無血清培地を用いる事はＬ
Ｔの培地からの回収精製をより容易にするばかりでなく
、製品への血清成分の混入を防ぐことになる。
（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ芙験指針」に従って行った
。また実施例中のフテージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う諸操作は下記の雑誌、成書を参
考とした。
１、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号、（１９８１年
）臨時増刊　遺伝子操作（共立出版）２、遺伝子操作実
験法、高木東歌編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著（１９８２年
）　講談社 ４、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ！ｌｏｎｉｎｇ　ａ　
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　、　Ｔ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）ｃｏｌａ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５巻、　
Ｌ＋＋Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年）　Ａｃａｄ
ｅｍｉｃｒｅｓｓ ６、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｕｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　６８巻、　ＲａＷｕ編（１９７９年）　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ実施例１ ＬＴ遺伝子のクローニング ＬＴ遺伝子はヒト正常白血球ＤＮＡから、λフアージベ
クターを用いインビトロパッケージングとプラークハイ
ブリダイゼーションの手法によりクローニングした。Ｌ
Ｔ遺伝子のクローニングに関しては特願昭６０−１４７
３７１に詳述した。
第１図に示したＥｃｏＲＩ２Ｊキロベース（Ｋｂ　）断
片及びＢａｍＨｌ　４．２　Ｋｂ断片をそれぞれｐＵ。
９にサブクローニングし、ｐＬＴＥ２．３及びｐＬＴＢ
４．２を作製した。ｐＬＴＥ２．３とｐＬＴＢ４．２の
作製については特願昭６０−２８０７４４に詳述した。
ｐＬＴＥ２．８及びｐＬＴＢ４．２に含まれるＬＴ遺伝
子の制限酵素解析及び塩基配列の決定を行った結果、Ｌ
Ｔ遺伝子は第１図に示したような構造をもつことが明ら
かになった。ＬＴ遺伝子の塩基配列については特願昭６
０−２３０７４４に記述した。
実施例２ ＬＴ発現ベクターの作製 ＬＴ発現ベクターｐＬＴ−几１　、　ｐＬＴ−Ｒ２。
ｐＬＴ−Ｒ８及びｐＬＴ　−Ｒ８ｄｈｆｒは下記の（１
）及び（２）の各ステップに従って作製した。
（１）ｐＬＴの作製 ｐｓＶ１２は第２図に示した方法にて作製した。
すなわち特願昭６０−１５２８１０に詳述したプラスミ
ドｐ８ＶｅＥａｌｌＨｉｎｄＩをＥｃｏＲｌ及びＢａｍ
ＨＩで切断し、切断末端をＤＮＡポリメラーゼで修復後
、Ｔ　４ＤＮＡリガーゼで結合しｐｓＶｅＢａｌＩＨｉ
ｎｄｌＡＢａｍＥｃｏを作製した。次にｐｓＶｅＢａｌ
ｌＨｉｎｄｌａＢａｍＥｃｏの５ａ１１部位をＥｃｏＲ
１リンカ−（ＧＧＡＡＴ’ｌ’ＣＯ）を用い、ＥｃｏＲ
１部位に改め、ｐｓＶｅＢａｌＩＨｉｎｄｎｌ−Ｅｃｏ
ＲＩを作製した。次にｐ　Ｓ　ＶｅＢａｌ　ｌ　Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ−ＥｃｏＲｌのＢｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄｌ１１
部位にｐＵｏ　１２のマルチクローニング部位を有する
ＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ断片を導入しｐＳＶ１２を作
製した。
ｐＬＴは第３図に示した手順により作製した。
すなわちｐＬＴＢ２．８に含まれるＬＴ遺伝子を有する
ＢｃｏＲｌ２．３Ｋｂ断片をｐＳＶ１２のＥｃｏＲ１部
位に挿入しｐＬＴを作製した。
（２）宛現ベクターｐＬＴ−Ｒ１，ｐＬＴ　−Ｒ２，ｐ
ＬＴ−Ｒ（及びｐＬＴ−Ｒ３ｄｈｆｒの作製ｐＬＴ−Ｒ
１，ｐＬＴ−Ｒ２，ｐＬＴ−Ｒ３は第４図に示した手順
により作製した。すなわちｐｎｓｖｃａｔ（ＡＴＯＯよ
り入手、Ａ’ｒＯＯ３７１５２）のＮｒｕ）部位をＥｃ
ｏＲＩリンカ−（ＧＧＡＡ’ｌ”ｆ’ｏｏ）を用いＥｃ
ｏＲＩ部位に改め、ｐＲ８Ｖｃａｔ　（ＥｃｏＲＩ　）
を作製した。次にｐＲ８Ｖｃａｔ（ＥｃｏＲＩ　）をＥ
ｃｏＲ１切断し、Ｒ８Ｖのエンハンサ−配列を含むＥＣ
０ＲＩ約ａ　ｏ　ｏ　ｂｐ断片を、ＢｃｏＲｌで部分切
断したｐＬＴのＥｃｏ１１部位に挿入し、ｐＬＴ−Ｒ１
，ｐＬＴ−Ｒ２及びｐＬＴ−Ｒ３を作製した。
またｐｓＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＯＣ！　　８７１４５）の
Ｐｖｕ１部位をＢａｍＨｌリンカ−を用いてＢａｍＨ１
部位に改めたプラスミドｐ　ＳＶ　２　ｄｈｆｒＢ　ヲ
ＢａｍＨＩ切断し、ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有
するＢａｍＨ１断片をＢａｍＨｌで部分切断したｐＬＴ
−Ｒ３のＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＬＴ−Ｒ３ｄｈｆ
ｒを作製した（第５図）。
実施例３ ＬＴ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＬＴの生産 ＬＴ発現ベクターｐＬＴ−Ｒ１，ｐＬＴ−Ｒ２゜ｐＬＴ
−几３及びｐＬＴ　−Ｒ３ｄｈｆｒをＢ　ＨＫ　−２１
ＣＣ−１３）を宿主として、Ｗｉｇｌｅｒらの方法〔Ｗ
ｉｇｌｅｒら、（１９７７年）セル、１１巻、２２３頁
〕に準じて形質転換を行った。プラスミド−リン酸カル
シウム共沈殿物を予め５％ＦＯ８を含む培地で生育させ
た細胞（２Ｘ１０５細胞／　３　ｍｌ培地／直径６Ｌニ
アＲ培養皿）に加え、４時間後に培地を更新し、４８時
間後に培地に含まれるＬＴをＬ９２９細胞を標的細胞と
する細胞致死効果で測定した（　Ｒｕｆｆ　、　Ｍ、　
Ｒ，とＧｉｆｆｏｒｄ　、　Ｇ、　Ｂ、　（１９８１年
）リンホカインズ、２巻、２３５頁〕。すなわち９６穴
マルチデイツシユに２Ｘ１０’細胞／ｗｅｌ１７’１０
０　ｔｔ（！培地で１日培養後、培養液を除き、アクチ
ノマイシンＤＩμｇ／ｍｌ、５％牛脂児血清（７０８）
を含むイーグルＭＥＭ培地で種々の濃度に希釈したサン
プルを１００μｌ加え、２０時間後の細胞の変性致死効
果を測定した。ＬＴＩユニットは５０％の致死率を与え
る濃度とした。下表に示すようにＲ８Ｖのエンハンサ−
配列を有するベクターを導入したＢＨＫ細胞は几Ｓｖの
エンハンサ−を有さないベクターに比べ高単位のＬＴを
生産した。
次にｐＬＴ−Ｒ３或いはｐＬＴ−Ｒ３ｄｈｆｒを導入し
たＢＨＫ−２１（Ｃ−１８）の培地を５％Ｆｏｓ。
２５　ｐｇ／ｘｔミコフェノール酸、２５０　ｔｔｙ／
ｓｌｉサンチン、０．１μｇ／Ｗｔアミノプテリンを含
むＭＥＭ培地に換え、約８週間培養した。生じたコロニ
ーを分離し、２４穴マルチウエルプレートに生育させ７
２時間後の培地に含まれるＬＴｆｆｉを測定した。
下表に示すように分離した形質転換細胞はＬＴを産生じ
た。
分離した形質転換細胞のうちＬＴを産生した代表的な５
株についての結果を示した。
実施例４　形質転換株のメソトロキセート（Ｍｔｘ　）
による選択 実施例３で得られたｐＬＴ−Ｒ８ｄｈｆｒによる形質転
換細胞を、それぞれ直径１０ｃｍのディツシュに１０８
乃至３　Ｘ　１０’細胞植え、１ｎＭ、５０ｎＭ。
１５０７！Ｍ、５００？１ＭのＭｔＸ　を含む培地で約
１ケ月培養し、種々の濃度のＭｔｘに対して耐性を示す
コロニーを分離した。２４大マルチウエルプレートに生
育させ、培地を５％ＦＣ８を含む培地或いは血清を含ま
ない培地に更新し、７２時間後の培地に含まれるＬＴ量
を測定した。下表に示すようにＭｔＸで選択した細胞か
らは親株よりも高いＬＴ生産性を示す株が得られた。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒトＬＴ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を示す
模式図、第２図はプラスミドｐｓＶ１２作製の模式図、
第３図はプラスミドｐＬＴ作製の模式図、第４図はプラ
スミドｐＬ’Ｉ’−Ｒ１、ｐＬＴ　−Ｒ２およびｐＬＴ
−Ｒｏｌ１作製の模式図、第５図はプラスミドｐＬＴ−
Ｒ３ｄｈｆｒ作製の模式図である。 第１図中、ＥｃｏＲＩ　、ＢａｍＨｌは夫々の制限酵素
の認識部位を示す。Ｅ−Ｉ、Ｅ−１，Ｅ−１及びＥ−ｆ
ｆは夫々ＬＴ遺伝子の第１エクソン、第２エクソン、第
３エクソン及び第４エクソンを示す。 第２〜５図中、Ｂｇ１皿、Ｐｖｕｌ、ＥｃｏＲＩ＊Ｂａ
ｍＨＩ　、　Ｂａｌ　Ｉ　、　Ｈｉｎｄｌｌｌ及び５ａ
ｌｌは夫々の制限酵素の認識部位を示す。Ａｍｐ　　は
アノピシリン耐性遺伝子、ＳＶｅはＳＶ４０ウィルスの
初期遺伝子プロモーター領域、ｐＡはＳＶ４０由来のポ
リＡ付加シグナル領域、ＢＣＯｇｐｔは大腸菌のグアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＬＴはヒ
トＬＴ遺伝子、ｄｈｆｒはジハイドロ葉酸還元酵素遺云
子、ｅはＲ８Ｖ　（ラウス・ザルコーマ・ウイルス）由
来のエンハンサ−領域、Ｃａｔはクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を示す。

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）プロモーター領域を含むリンホトキシン遺伝子配
    列とそれを活性化するエンハンサー配列から成るリンホ
    トキシン発現ベクター。
  2. （２）エンハンサー配列が、ウイルスのゲノムに由来す
    るエンハンサー配列である特許請求の範囲第１項記載の
    リンホトキシン発現ベクター。
  3. （３）エンハンサー配列が、レトロウイルスのゲノムに
    由来するエンハンサー配列である特許請求の範囲第１項
    記載のリンホトキシン発現ベクター。
  4. （４）エンハンサー配列が、ラウス・ザルコーマ・ウイ
    ルスのゲノムに由来するエンハンサー配列である特許請
    求の範囲第１項記載のリンホトキシン発現ベクター。
  5. （５）増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列が、同一のＤＮＡ
    鎖上に存在する特許請求の範囲第１項乃至第４項の何れ
    かの項記載のリンホトキシン発現ベクター。
  6. （６）増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の
    遺伝子である特許請求の範囲第５項記載のリンホトキシ
    ン発現ベクター。
  7. （７）リンホトキシン発現ベクターが、プラスミドｐＬ
    Ｔ−Ｒ１、ｐＬＴ−Ｒ２、ｐＬＴ−Ｒ３またはｐＬＴ−
    Ｒ３ｄｈｆｒの何れかである特許請求の範囲第１項乃至
    第６項の何れかの項記載のリンホトキシン発現ベクター
    。
  8. （８）プロモーター領域を含むリンホトキシン遺伝子配
    列とそれを活性化するエンハンサー配列から成るリンホ
    トキシン発現ベクターによる動物培養細胞の形質転換細
    胞。
  9. （９）エンハンサー配列が、ウイルスのゲノムに由来す
    るエンハンサー配列である特許請求の範囲第８項記載の
    形質転換細胞。
  10. （１０）エンハンサー配列が、レトロウイルスのゲノム
    に由来するエンハンサー配列である特許請求の範囲第８
    項記載の形質転換細胞。
  11. （１１）エンハンサー配列が、ラウス・ザルコーマ・ウ
    イルスのゲノムに由来するエンハンサー配列である特許
    請求の範囲第８項記載の形質転換細胞。
  12. （１２）リンホトキシン発現ベクターが、同一のＤＮＡ
    鎖上に増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列を有するリンホト
    キシン発現ベクターである特許請求の範囲第８項乃至第
    １１項の何れかの項記載の形質転換細胞。
  13. （１３）形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
    子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
    れた細胞である特許請求の範囲第１２項記載の形質転換
    細胞。
  14. （１４）増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素
    の遺伝子である特許請求の範囲第１２項記載の形質転換
    細胞。
  15. （１５）形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃
    度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
    た細胞である特許請求の範囲第１４項記載の形質転換細
    胞。
  16. （１６）形質転換細胞の由来が、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１
    ３）である特許請求の範囲第８項乃至第１５項の何れか
    の項記載の形質転換細胞。
  17. （１７）プロモーター領域を含むリンホトキシン遺伝子
    配列とそれを活性化するエンハンサー配列から成るリン
    ホトキシン発現ベクターによる動物培養細胞の形質転換
    細胞を培養し、リンホトキシンを生成せしめ、これを採
    取することを特徴とするリンホトキシンの製造方法。
  18. （１８）エンハンサー配列が、ウイルスのゲノムに由来
    するエンハンサー配列である特許請求の範囲第１７項記
    載の製造方法。
  19. （１９）エンハンサー配列が、レトロウイルスのゲノム
    に由来するエンハンサー配列である特許請求の範囲第１
    ７項記載の製造方法。
  20. （２０）エンハンサー配列が、ラウス・ザルコーマ・ウ
    イルスのゲノムに由来する特許請求の範囲第１７項記載
    の製造方法。
  21. （２１）リンホトキシン発現ベクターが、同一のＤＮＡ
    鎖上に増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列を有するリンホト
    キシン発現ベクターである特許請求の範囲第１７項乃至
    第２０項の何れかの項記載の製造方法。
  22. （２２）形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
    子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
    れた細胞である特許請求の範囲第２１項記載の製造方法
    。
  23. （２３）増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素
    の遺伝子である特許請求の範囲第２１項記載の製造方法
    。
  24. （２４）形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃
    度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
    た細胞である特許請求の範囲第２３項記載の製造方法。
  25. （２５）形質転換細胞の由来が、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１
    ３）である特許請求の範囲第１７項乃至第２４項の何れ
    かの項記載の製造方法。
  26. （２６）培養に用いる培地が無血清培地である特許請求
    の範囲第１７項乃至第２４項の何れかの項記載の製造方
    法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0164965A2 (en) * 1984-05-31 1985-12-18 Genentech, Inc. Lymphotoxin, nucleic acid encoding it, vectors incorporating the nucleic acid and cells transformed therewith, methods of obtaining lymphotoxin, and lymphotoxin neutralizing antibody
JPS6112288A (ja) * 1983-12-27 1986-01-20 ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクタ−

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