JP2991731B2 - 遺伝子発現の調節 - Google Patents
遺伝子発現の調節Info
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- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は遺伝子表現の調節に関する。
生体系中では、細胞の働きの多くは、細胞のゲノム中
で明確化された青写真に従う蛋白質によって、実行され
ている。遺伝子工学では、二つの主要な方法での組み換
えDNA技術を用いて、細胞の働きが変えられる。一番目
として、そこでは、特別な蛋白質生産のためのDNAコー
ドを修飾するか、またはコードを変更するか、または欠
失させる（そのため、その蛋白質はもはや生産されなく
なる）ことによるか、または全く新しいコード部分を挿
入する（それによって、通常細胞中では全く見られない
蛋白質が生産される）ことによって、細胞が生産する蛋
白質の種類が修飾される。二番目として、ある場合に
は、コードによって生産される蛋白質の量を増大させる
か減少させること、或いは細胞が蛋白質を生産する環境
を変化させることが、蛋白質のためのコード化を行なう
DNAに隣接するDNAを変化させることによって、可能とな
る。
で明確化された青写真に従う蛋白質によって、実行され
ている。遺伝子工学では、二つの主要な方法での組み換
えDNA技術を用いて、細胞の働きが変えられる。一番目
として、そこでは、特別な蛋白質生産のためのDNAコー
ドを修飾するか、またはコードを変更するか、または欠
失させる（そのため、その蛋白質はもはや生産されなく
なる）ことによるか、または全く新しいコード部分を挿
入する（それによって、通常細胞中では全く見られない
蛋白質が生産される）ことによって、細胞が生産する蛋
白質の種類が修飾される。二番目として、ある場合に
は、コードによって生産される蛋白質の量を増大させる
か減少させること、或いは細胞が蛋白質を生産する環境
を変化させることが、蛋白質のためのコード化を行なう
DNAに隣接するDNAを変化させることによって、可能とな
る。
本発明は主に二番目の種類の技術に関するものであ
り、細胞により蛋白質の生産を所望されるようにより容
易に調節し得る手段を提供するものである。
り、細胞により蛋白質の生産を所望されるようにより容
易に調節し得る手段を提供するものである。
遺伝子がそれらの表現を調節する調節領域を有してい
ることはよく知られている。模式的には、調節は、細胞
中に存在する蛋白質を転写の開始の上流にある短いDNA
配列（結合部位）上に結合させる手段を用いて行なわれ
ている。係合部位上への蛋白質の結合は、下流にある遺
伝子の表現を抑制もしくは促進し得る。この機構は多様
であり、ある場合にはメッセンジヤーRNAの生産を開始
させるRNAポリメラーゼが必要とする部位に、結合した
分子が重なるかそれを占領するかして、それによって表
現を阻止し、他方では、結合した蛋白質が抑止効果を有
する別の蛋白質の結合を阻止し得る。二者択一的に、蛋
白質の結合はRNAポリメラーゼの結合を容易にし、それ
によって遺伝子表現を誘発する。古典的な遺伝子調節
は、ラムダゲノム上の特定のDNA配列に結合しそして適
当な生理学上の条件下では遺伝子表現を抑制するか活性
化することのできる、バクテリオフアージのラムダプレ
ッサのそれである。文献（例えばBrent.R.およびPtashn
e、M.（1985）、Cell 43、729−736）中には、数多くの
例があり、これらは、DNA結合、蛋白質の二量化および
遺伝子転形が別々の機能であることを示している。
ることはよく知られている。模式的には、調節は、細胞
中に存在する蛋白質を転写の開始の上流にある短いDNA
配列（結合部位）上に結合させる手段を用いて行なわれ
ている。係合部位上への蛋白質の結合は、下流にある遺
伝子の表現を抑制もしくは促進し得る。この機構は多様
であり、ある場合にはメッセンジヤーRNAの生産を開始
させるRNAポリメラーゼが必要とする部位に、結合した
分子が重なるかそれを占領するかして、それによって表
現を阻止し、他方では、結合した蛋白質が抑止効果を有
する別の蛋白質の結合を阻止し得る。二者択一的に、蛋
白質の結合はRNAポリメラーゼの結合を容易にし、それ
によって遺伝子表現を誘発する。古典的な遺伝子調節
は、ラムダゲノム上の特定のDNA配列に結合しそして適
当な生理学上の条件下では遺伝子表現を抑制するか活性
化することのできる、バクテリオフアージのラムダプレ
ッサのそれである。文献（例えばBrent.R.およびPtashn
e、M.（1985）、Cell 43、729−736）中には、数多くの
例があり、これらは、DNA結合、蛋白質の二量化および
遺伝子転形が別々の機能であることを示している。
一つの種類の蛋白質調節子は、ダイマーとして二本鎖
DNAに対して結合する調節子から成っている。それらは
孤立性のドメインから成っている。一つの上述ドメイン
の部分は、特定のDNA部位（塩基の特定の配列によって
限定され、それらのいくつかの正確な性質は本質的なも
のでありそしていくつかは任意のものである）に対して
同系であり、それを認識するかまたはそれと相互作用を
生じる。どちらかのストランド中の塩基は、蛋白質のDN
Aと結合するドメインとの接触に関与し得るが、蛋白質
の結合部位は、その蛋白質の結合部位内のどちらかのDN
Aストランドの塩基配列によって、明瞭に限定されてい
る。ダイマーの形の二つの上記蛋白質モノマーは、二つ
の上記部位から成る座に対して結合する。単一の上記部
位は、ダイマーもしくはモノマーのどちらかの結合には
不充分である。これらの部位は隣接しており、そして同
一もしくは類似の限定する配列を一般に有しているが、
しかしそれはDNAの相補ストランド上である。従って、
相補ストランド上のこの二つの類似したDNA限定配列
は、間隙において反対の配向を有している。それ故、隣
接するDNA配列によって限定される結合座もしくは部位
は、２回回転対称を有している。
DNAに対して結合する調節子から成っている。それらは
孤立性のドメインから成っている。一つの上述ドメイン
の部分は、特定のDNA部位（塩基の特定の配列によって
限定され、それらのいくつかの正確な性質は本質的なも
のでありそしていくつかは任意のものである）に対して
同系であり、それを認識するかまたはそれと相互作用を
生じる。どちらかのストランド中の塩基は、蛋白質のDN
Aと結合するドメインとの接触に関与し得るが、蛋白質
の結合部位は、その蛋白質の結合部位内のどちらかのDN
Aストランドの塩基配列によって、明瞭に限定されてい
る。ダイマーの形の二つの上記蛋白質モノマーは、二つ
の上記部位から成る座に対して結合する。単一の上記部
位は、ダイマーもしくはモノマーのどちらかの結合には
不充分である。これらの部位は隣接しており、そして同
一もしくは類似の限定する配列を一般に有しているが、
しかしそれはDNAの相補ストランド上である。従って、
相補ストランド上のこの二つの類似したDNA限定配列
は、間隙において反対の配向を有している。それ故、隣
接するDNA配列によって限定される結合座もしくは部位
は、２回回転対称を有している。
原則的には、上記ダイマーを使って遺伝子表現の人工
的調節を工業的に行なうことは可能であるが、しかしこ
れは欠点を有している。
的調節を工業的に行なうことは可能であるが、しかしこ
れは欠点を有している。
上記対称DNA配列（例えば、これは20〜30の塩基対の
長さであってもよい）は、自然界では比較的まれであ
る。このような配列を有機体のゲノム中に挿入するの
は、使いづらく不便である。その上、遺伝子表現の制御
には限界がある。それは一つの因子、即ち蛋白質モノマ
ーの細胞濃度；のみに依存している。酵母、哺乳動物お
よび無脊椎動物の細胞中に人工工学的に導入された遺伝
子の表現を調節するための細菌性レプレッサのホモダイ
マーの使用はすでに示されている、Brent、R.およびPha
shne、M.（1984）Nature、312、612−615、Smith、G.M.
他、（1988）、EMBO J.,7、3975−3982;Hu、M.C.−T.
およびDavidson、N.（1987）、Cell、48、555−556;Bro
wn、M.他、（1987）、Cell、49、603−612;Hu、M.C.−
ＴおよびDavidson、N.（1988）、Gene、62、301−313。
長さであってもよい）は、自然界では比較的まれであ
る。このような配列を有機体のゲノム中に挿入するの
は、使いづらく不便である。その上、遺伝子表現の制御
には限界がある。それは一つの因子、即ち蛋白質モノマ
ーの細胞濃度；のみに依存している。酵母、哺乳動物お
よび無脊椎動物の細胞中に人工工学的に導入された遺伝
子の表現を調節するための細菌性レプレッサのホモダイ
マーの使用はすでに示されている、Brent、R.およびPha
shne、M.（1984）Nature、312、612−615、Smith、G.M.
他、（1988）、EMBO J.,7、3975−3982;Hu、M.C.−T.
およびDavidson、N.（1987）、Cell、48、555−556;Bro
wn、M.他、（1987）、Cell、49、603−612;Hu、M.C.−
ＴおよびDavidson、N.（1988）、Gene、62、301−313。
これらの状況において、どちらかの蛋白質モノマーの
生産の水準を変化させることによって成される制御であ
ることを考慮すると、制御にヘテロダイマーを使用する
ことは有利である（以下を参照）。この場合、ホモダイ
マーもしくはヘテロダイマーによる遺伝子表現の抑制
は、標的となる遺伝子の上流への適当な結合部位の導入
に依存している。技術的な理由（例えば、同一細胞中で
６個の遺伝子のコピーを変える必要がある６倍体植物
中）、或いは倫理的な理由（例えば、人間のゲノム中）
のため、これは現在不可能であるという状況にあり、そ
してこのような状況下では、ヘテロダイマーによる制御
はより魅力的であり表現的な選択である。ヘテロダイマ
ーは二分子対称を必要としないため、二本鎖DNAの塩基
の適当数を伸長したいかなる部位も、隣接しそして二本
鎖DNAの相補ストランド上にある個々のモノマーのため
の部位を有するヘテロダイマーのための結合部位と見な
すことができる。従って、結合の特異性を適切に選択す
ることによって、原則的に、遺伝子そのものを修飾する
ことなく標的遺伝子の抑制部分中のいかなる特定のDNA
配列に対しても、適切なヘテロダイマーを向けさせるこ
とができる。例えば、遺伝子因子を遊離する、人のコル
チコトロピンの配列は、本明細書に詳しく記載するヘテ
ロダイマーのための結合部位である49位にあるDNA配列
５′ATTCAAGAATTTTGT3′（発表された配列中;Genbank D
atabaseにHUMCRFを参照）を有している。
生産の水準を変化させることによって成される制御であ
ることを考慮すると、制御にヘテロダイマーを使用する
ことは有利である（以下を参照）。この場合、ホモダイ
マーもしくはヘテロダイマーによる遺伝子表現の抑制
は、標的となる遺伝子の上流への適当な結合部位の導入
に依存している。技術的な理由（例えば、同一細胞中で
６個の遺伝子のコピーを変える必要がある６倍体植物
中）、或いは倫理的な理由（例えば、人間のゲノム中）
のため、これは現在不可能であるという状況にあり、そ
してこのような状況下では、ヘテロダイマーによる制御
はより魅力的であり表現的な選択である。ヘテロダイマ
ーは二分子対称を必要としないため、二本鎖DNAの塩基
の適当数を伸長したいかなる部位も、隣接しそして二本
鎖DNAの相補ストランド上にある個々のモノマーのため
の部位を有するヘテロダイマーのための結合部位と見な
すことができる。従って、結合の特異性を適切に選択す
ることによって、原則的に、遺伝子そのものを修飾する
ことなく標的遺伝子の抑制部分中のいかなる特定のDNA
配列に対しても、適切なヘテロダイマーを向けさせるこ
とができる。例えば、遺伝子因子を遊離する、人のコル
チコトロピンの配列は、本明細書に詳しく記載するヘテ
ロダイマーのための結合部位である49位にあるDNA配列
５′ATTCAAGAATTTTGT3′（発表された配列中;Genbank D
atabaseにHUMCRFを参照）を有している。
発明の要約 本発明はそれ自身、似ていないDNA結合ドメインを有
する似ていない蛋白質の対が得られるという我々の考え
を基とするものであるが、それにもかかわらず、これは
会合してヘテロダイマーを形成し、適当な非対称DNA結
合部位に対して結合し、それによって、隣接する遺伝子
の表現を調節するために用いられ得る。
する似ていない蛋白質の対が得られるという我々の考え
を基とするものであるが、それにもかかわらず、これは
会合してヘテロダイマーを形成し、適当な非対称DNA結
合部位に対して結合し、それによって、隣接する遺伝子
の表現を調節するために用いられ得る。
それ故本発明に従って、我々は、機能的蛋白質を表現
し得る遺伝子：それと有効に会合した上記遺伝子のため
の調節領域；相補助ストランド上の隣接する異なる第一
および第二DNA配列によって限定される上記調節領域内
の蛋白質結合部位：上記第一DNA配列に対して同系の第
一DNA結合ドメインを有する第一蛋白質モノマー；およ
び上記第二DNA配列に対して同系の第二DNA結合ドメイン
を有する第二蛋白質モノマー；会合してヘテロダイマー
を形成し得る上記第一および第二蛋白質モノマーを有
し：それによって上記ヘテロダイマーが上記蛋白質結合
部位に対して結合でき、従って上記遺伝子の表現を調節
し：上記蛋白質結合部位の回転対称性を有さないように
上記第一および第二DNA結合領域、並びに上記第一およ
び第二DNA配列が本質的に異なっている、ことから成る
細胞を提供する。
し得る遺伝子：それと有効に会合した上記遺伝子のため
の調節領域；相補助ストランド上の隣接する異なる第一
および第二DNA配列によって限定される上記調節領域内
の蛋白質結合部位：上記第一DNA配列に対して同系の第
一DNA結合ドメインを有する第一蛋白質モノマー；およ
び上記第二DNA配列に対して同系の第二DNA結合ドメイン
を有する第二蛋白質モノマー；会合してヘテロダイマー
を形成し得る上記第一および第二蛋白質モノマーを有
し：それによって上記ヘテロダイマーが上記蛋白質結合
部位に対して結合でき、従って上記遺伝子の表現を調節
し：上記蛋白質結合部位の回転対称性を有さないように
上記第一および第二DNA結合領域、並びに上記第一およ
び第二DNA配列が本質的に異なっている、ことから成る
細胞を提供する。
定義 本特許の目的のため： 会合 非共有相互作用を通して適合するモノマーから
蛋白質ダイマーを形成する能力；例えば静電的相互作
用、フアンデルワールスカ。
蛋白質ダイマーを形成する能力；例えば静電的相互作
用、フアンデルワールスカ。
異なる DNA結合部位内の相補ストランド上に存在するD
NA配列に関して、回転対称がないことを意味している。
NA配列に関して、回転対称がないことを意味している。
同系の 蛋白質モノマー中の特別なDNA結合ドメイン
が、特別なDNA部位（一本のストランド上のDNA配列によ
って限定されている）を認識するために必要な特異性
（そのアミノ酸配列内）を有しており、そのためその部
位に対して同系である。同系ではあるが、DNA結合ドメ
インが、相補ストランド上の反対配向にある相当するDN
A配列を有する部位に対し同時に結合するため正確な配
置の中で、ダイマーとして存在していない場合、該蛋白
質モノマーは実際上特定の結合を行うことができない。
が、特別なDNA部位（一本のストランド上のDNA配列によ
って限定されている）を認識するために必要な特異性
（そのアミノ酸配列内）を有しており、そのためその部
位に対して同系である。同系ではあるが、DNA結合ドメ
インが、相補ストランド上の反対配向にある相当するDN
A配列を有する部位に対し同時に結合するため正確な配
置の中で、ダイマーとして存在していない場合、該蛋白
質モノマーは実際上特定の結合を行うことができない。
更に我々は、細胞中の遺伝子表現を調節する方法を提
供するものであり、この細胞は：機能的蛋白質を表現し
得る遺伝子：上記遺伝子と有効に会合した調節領域；お
よび相補ストランド上の隣接する異なるDNA配列によっ
て限定される上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し；
それぞれ第一および第二の異なるDNAドメインを各々が
有する第一および第二の異なる蛋白質モノマーを細胞中
に供給し、上記蛋白質結合部位に対して結合できそして
機能的蛋白質の表現を調節できるヘテロダイマーを、上
記モノマーが形成することができることから成る方法、
から成っている。
供するものであり、この細胞は：機能的蛋白質を表現し
得る遺伝子：上記遺伝子と有効に会合した調節領域；お
よび相補ストランド上の隣接する異なるDNA配列によっ
て限定される上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し；
それぞれ第一および第二の異なるDNAドメインを各々が
有する第一および第二の異なる蛋白質モノマーを細胞中
に供給し、上記蛋白質結合部位に対して結合できそして
機能的蛋白質の表現を調節できるヘテロダイマーを、上
記モノマーが形成することができることから成る方法、
から成っている。
本発明はまた、機能的蛋白質を表現するための遺伝
子；上記遺伝子と有効に会合した調節領域；および上記
調節領域内の蛋白質結合部位を有し；結合した時、機能
的蛋白質の表現を調節する第一および第二の異なる調節
蛋白質に対して結合のための相補ストランド上の隣接す
る異なる第一および第二のDNA配列によって蛋白質結合
部位が限定されること、から成る組み換え遺伝子系も含
むものである。
子；上記遺伝子と有効に会合した調節領域；および上記
調節領域内の蛋白質結合部位を有し；結合した時、機能
的蛋白質の表現を調節する第一および第二の異なる調節
蛋白質に対して結合のための相補ストランド上の隣接す
る異なる第一および第二のDNA配列によって蛋白質結合
部位が限定されること、から成る組み換え遺伝子系も含
むものである。
各場合共、遺伝子表現の調節は、機能的蛋白質生産の
促進もしくは抑制の両方を意味している。一般に、調節
領域は遺伝子の上流にあるが、場合によっては下流もし
くは遺伝子そのものの中に存在する。
促進もしくは抑制の両方を意味している。一般に、調節
領域は遺伝子の上流にあるが、場合によっては下流もし
くは遺伝子そのものの中に存在する。
我々の発明に従って、他のモノマーが存在していない
時、ヘテロダイマーの結合部位中にある同系の蛋白質結
合部位に対してどちらの蛋白質モノマーも結合しない；
即ち両方の蛋白質が存在していない場合いかなる遺伝子
調節も存在しない。
時、ヘテロダイマーの結合部位中にある同系の蛋白質結
合部位に対してどちらの蛋白質モノマーも結合しない；
即ち両方の蛋白質が存在していない場合いかなる遺伝子
調節も存在しない。
発明の詳細な説明 我々の発明は二つの重要な利点を有している。第１
に、調節子領域中に対称DNA結合部位を必要としないた
め、存在する遺伝子の調節領域において相当に広い適用
のための可能性を開くものである（上記調節子領域中に
DNA配列を挿入するかまたはそれを変化させるよりもむ
しろ、修飾した結合蛋白質を用いて）。第２に、２つの
異なる因子に直接応答して、そして示されるように、因
子のいかなる所要される組み合せにも間接的に応答し
て、調節される表現を提供するものである。
に、調節子領域中に対称DNA結合部位を必要としないた
め、存在する遺伝子の調節領域において相当に広い適用
のための可能性を開くものである（上記調節子領域中に
DNA配列を挿入するかまたはそれを変化させるよりもむ
しろ、修飾した結合蛋白質を用いて）。第２に、２つの
異なる因子に直接応答して、そして示されるように、因
子のいかなる所要される組み合せにも間接的に応答し
て、調節される表現を提供するものである。
ヘテロダイマーの各々の成分は、遺伝子によってそれ
自身が生産された蛋白質である。各々の上記遺伝子は外
因子（例えばエチレンのような小分子の存在、または温
度）に応答するか、或いは調節子蛋白質に応答して、そ
れ自身調節されてもよい。この調節子蛋白質は、異なる
ホモダイマー、第二ヘテロダイマーまたは同じヘテロダ
イマー（自己調節）であってもよい。第二ヘテロダイマ
ーは同様に調節されてもよい。このように原則として、
標的遺伝子の表現を調節するために望まれるいかに多く
の制御因子が使用され得るかがわかる。自ずと、各々の
制御因子用として、それを認識する適切な調節DNA配列
が利用できるに違いない。表現を促進するか抑制するた
めに調節が用いられ得るが、２つ以上の制御因子、或い
はいかなるそれらの組み合せの存在もしくは不在に応じ
て、標的遺伝子の表現が行なわれる。これは、ホモダイ
マーによる制御に比べて顕著な利点である、何故ならば
これは単一遺伝子の生産物であるからである。
自身が生産された蛋白質である。各々の上記遺伝子は外
因子（例えばエチレンのような小分子の存在、または温
度）に応答するか、或いは調節子蛋白質に応答して、そ
れ自身調節されてもよい。この調節子蛋白質は、異なる
ホモダイマー、第二ヘテロダイマーまたは同じヘテロダ
イマー（自己調節）であってもよい。第二ヘテロダイマ
ーは同様に調節されてもよい。このように原則として、
標的遺伝子の表現を調節するために望まれるいかに多く
の制御因子が使用され得るかがわかる。自ずと、各々の
制御因子用として、それを認識する適切な調節DNA配列
が利用できるに違いない。表現を促進するか抑制するた
めに調節が用いられ得るが、２つ以上の制御因子、或い
はいかなるそれらの組み合せの存在もしくは不在に応じ
て、標的遺伝子の表現が行なわれる。これは、ホモダイ
マーによる制御に比べて顕著な利点である、何故ならば
これは単一遺伝子の生産物であるからである。
従って、本発明は更に、機能的蛋白質を表現するため
の第一遺伝子；上記遺伝子と有効に会合した第一調節領
域；および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を有
し；該蛋白質結合部位が相補ストランドの上の隣接する
異なる第一および第二DNA配列によって限定されてお
り；第一蛋白質モノマーを表現するための第二遺伝子
で、上記蛋白質が上記第一DNA配列に対して同系の第一D
NA結合ドメインから成っており；そして、第二蛋白質モ
ノマーを表現するための第三遺伝子で、上記蛋白質が上
記第二DNA配列に対して同系の第二DNA結合ドメインから
成っており；これによって上記第二および第三遺伝子の
表現が上記第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよ
いこと、から成る原核生物もしくは真核生物の有機体の
ゲノムを提供することにある。
の第一遺伝子；上記遺伝子と有効に会合した第一調節領
域；および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を有
し；該蛋白質結合部位が相補ストランドの上の隣接する
異なる第一および第二DNA配列によって限定されてお
り；第一蛋白質モノマーを表現するための第二遺伝子
で、上記蛋白質が上記第一DNA配列に対して同系の第一D
NA結合ドメインから成っており；そして、第二蛋白質モ
ノマーを表現するための第三遺伝子で、上記蛋白質が上
記第二DNA配列に対して同系の第二DNA結合ドメインから
成っており；これによって上記第二および第三遺伝子の
表現が上記第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよ
いこと、から成る原核生物もしくは真核生物の有機体の
ゲノムを提供することにある。
上記ゲノムは、上記第二遺伝子の上流に通常与えられ
ている第二調節領域を有していてもよく、上記第二調節
領域は、１個以上の調節子の存在または不在に応答し
て、上記第一蛋白質モノマーの生産を調節する働きを有
する。
ている第二調節領域を有していてもよく、上記第二調節
領域は、１個以上の調節子の存在または不在に応答し
て、上記第一蛋白質モノマーの生産を調節する働きを有
する。
更に、上記ゲノムは上記第三遺伝子の上流に通常与え
られている第三調節領域に有していてもよく、上記第三
調節領域は、第二調節領域に影響を与える調節子と同じ
か異なっていてもよい１個以上の調節子の存在または不
在に応答して、上記第二蛋白質モノマーの生産を調節す
る働きを有する。
られている第三調節領域に有していてもよく、上記第三
調節領域は、第二調節領域に影響を与える調節子と同じ
か異なっていてもよい１個以上の調節子の存在または不
在に応答して、上記第二蛋白質モノマーの生産を調節す
る働きを有する。
その上、上記調節子分子の少なくとも１個は、本発明
に従う組み換え遺伝子系によって生産される蛋白質分子
であってもよい。
に従う組み換え遺伝子系によって生産される蛋白質分子
であってもよい。
更に本発明は、各々異なる第一および第二DNA結合ド
メインを含む異なった第一および第二蛋白質モノマーを
会合させることによって形成された新規なヘテロダイマ
ー調節蛋白質ヘテロダイマーから成っており；これは、
隣接する異なる第一および第二DNA配列によって限定さ
れる蛋白質結合部位と会合して、上記第一および第二DN
A結合ドメインと同系である。興味が持たれている特定
のヘテロダイマーは、第一DNA結合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合ドメインがDNA
配列： ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］ に対して同系であり、そして更に詳細には、第一DNA結
合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合ドメインがDNA
配列： に対して同系である、ところのヘテロダイマー類であ
る。
メインを含む異なった第一および第二蛋白質モノマーを
会合させることによって形成された新規なヘテロダイマ
ー調節蛋白質ヘテロダイマーから成っており；これは、
隣接する異なる第一および第二DNA配列によって限定さ
れる蛋白質結合部位と会合して、上記第一および第二DN
A結合ドメインと同系である。興味が持たれている特定
のヘテロダイマーは、第一DNA結合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合ドメインがDNA
配列： ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］ に対して同系であり、そして更に詳細には、第一DNA結
合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合ドメインがDNA
配列： に対して同系である、ところのヘテロダイマー類であ
る。
該複合体は好適には、回転対称を有していない特定の
蛋白質結合部位として、DNA配列： ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］ またはその相補体を有しており、更に特別には、DNA配
列： またはその補体を有している。回転対称を有していない
上記蛋白質結合部位は、調節子領域の影響下表現される
遺伝子を含むDNA配列中に天然に存在し得るが、しかし
原則的には、上記蛋白質結合部位はまた、調節子領域の
影響下表現される遺伝子を含むDNA配列中に、異質のDNA
として合成的に導入することもできる。このようにし
て、適切な結合ヘテロダイマーが結合し得る、回転対称
を有していない公知の蛋白質結合部位を、該修飾した遺
伝子は有している。
蛋白質結合部位として、DNA配列： ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］ またはその相補体を有しており、更に特別には、DNA配
列： またはその補体を有している。回転対称を有していない
上記蛋白質結合部位は、調節子領域の影響下表現される
遺伝子を含むDNA配列中に天然に存在し得るが、しかし
原則的には、上記蛋白質結合部位はまた、調節子領域の
影響下表現される遺伝子を含むDNA配列中に、異質のDNA
として合成的に導入することもできる。このようにし
て、適切な結合ヘテロダイマーが結合し得る、回転対称
を有していない公知の蛋白質結合部位を、該修飾した遺
伝子は有している。
図の説明 図１は、本発明に従うヘテロダイマーと結合部位を図
式的に示しており、そして公知のダイマー／結合部位複
合体に対するその関係を示している。
式的に示しており、そして公知のダイマー／結合部位複
合体に対するその関係を示している。
図２は、２個の２分子対称オペレーター（434およびP
22）のDNA配列および３個の非対称ハイブリッド配列を
表わしている。
22）のDNA配列および３個の非対称ハイブリッド配列を
表わしている。
図３は、放射能標識した15、16および17の塩基対ハイ
ブリッドオペレーターおよび種々の蛋白質を用いたフイ
ルター結合試験の結果を図表を用いて示したものであ
る。
ブリッドオペレーターおよび種々の蛋白質を用いたフイ
ルター結合試験の結果を図表を用いて示したものであ
る。
図４は、DNアーゼＩを用いて部分的に開裂させ、そし
て電気泳動を行なった後の放射能標識したハイブリッド
オペレーターDNAのオートラジオグラフである。
て電気泳動を行なった後の放射能標識したハイブリッド
オペレーターDNAのオートラジオグラフである。
図５は、本発明において使用できる範囲のヘテロダイ
マー類を生じさせるために用いられる方法を要約したも
のである。
マー類を生じさせるために用いられる方法を要約したも
のである。
我々の発明は、全く一般的に適用できるものである
が、しかし更に、バクテリオフアージ434のレプレッサ
蛋白質を特に参考にして説明を行なう。
が、しかし更に、バクテリオフアージ434のレプレッサ
蛋白質を特に参考にして説明を行なう。
バクテリオフアージ434蛋白質は、アルフアらせん
（認識らせん）をＢ−型DNAの主要な溝に挿入すること
によって、特定のDNA配列（434オペレーター）に対して
結合する（Anderson他、1987）。この認識らせんは、多
くの原核生物およびいくつかの真核生物のDNA結合蛋白
質中に見られる保護された“らせん−反転−らせん”構
造の部分である（Sauer他、1982;Pabo and Sauer、198
4）。DNA結合の配列特異性が、レプレッサ蛋白質の認識
らせんの最外（溶媒にさらされた）面のアミノ酸配列中
に存在することが、数多くの実験によって示された。Wh
artonおよびPtashne（1985）は、434認識らせんのさら
された残渣をP22レプレッサのそれで置換することによ
って、バクテリオフアージ434のレプレッサの特異性をP
22レプレッサのそれに変化させることができた。434R
［アルフア３（P22R）］と名付けられた新しい蛋白質
は、認識らせんの溶媒にさらされた側の４個のアミノ酸
を除いて434のレプレッサと同じである。この新規な蛋
白質のDNA結合特異性は、P22のオペレーターのみを認識
し434のオペレーターを認識しないようになる。これは
図１に図式的に示されている。
（認識らせん）をＢ−型DNAの主要な溝に挿入すること
によって、特定のDNA配列（434オペレーター）に対して
結合する（Anderson他、1987）。この認識らせんは、多
くの原核生物およびいくつかの真核生物のDNA結合蛋白
質中に見られる保護された“らせん−反転−らせん”構
造の部分である（Sauer他、1982;Pabo and Sauer、198
4）。DNA結合の配列特異性が、レプレッサ蛋白質の認識
らせんの最外（溶媒にさらされた）面のアミノ酸配列中
に存在することが、数多くの実験によって示された。Wh
artonおよびPtashne（1985）は、434認識らせんのさら
された残渣をP22レプレッサのそれで置換することによ
って、バクテリオフアージ434のレプレッサの特異性をP
22レプレッサのそれに変化させることができた。434R
［アルフア３（P22R）］と名付けられた新しい蛋白質
は、認識らせんの溶媒にさらされた側の４個のアミノ酸
を除いて434のレプレッサと同じである。この新規な蛋
白質のDNA結合特異性は、P22のオペレーターのみを認識
し434のオペレーターを認識しないようになる。これは
図１に図式的に示されている。
図１において、434レプレッサ蛋白質は、らせん３を
用いてオペレーターDNAに対してホモダイマーとして結
合する。434レプレッサらせんアルフア３の溶媒にさら
された残渣を、P22レプレッサ（黒で示されている）の
それで置換すると、得られるレプレッサはP22オペレー
ターに対してのみ結合する（Wharton and Phashne、198
5）。434レプレッサと434R［アルフア３（P22R）］レプ
レッサとは、ダイマーの接触に関しては同一であるた
め、それらは、各々の蛋白質の一つのモノマーを有する
混合ダイマー（ヘテロダイマー）を形成することができ
る。このようなヘテロダイマーは、434オペレーターの
半分とP22オペレーターの半分とを有するハイブリッド
オペレーターを特異的に認識することができる。これは
図１に図式的に示されている。
用いてオペレーターDNAに対してホモダイマーとして結
合する。434レプレッサらせんアルフア３の溶媒にさら
された残渣を、P22レプレッサ（黒で示されている）の
それで置換すると、得られるレプレッサはP22オペレー
ターに対してのみ結合する（Wharton and Phashne、198
5）。434レプレッサと434R［アルフア３（P22R）］レプ
レッサとは、ダイマーの接触に関しては同一であるた
め、それらは、各々の蛋白質の一つのモノマーを有する
混合ダイマー（ヘテロダイマー）を形成することができ
る。このようなヘテロダイマーは、434オペレーターの
半分とP22オペレーターの半分とを有するハイブリッド
オペレーターを特異的に認識することができる。これは
図１に図式的に示されている。
図１で示されるように、434および434R［アルフア３
（P22R）］のレプレッサは、それぞれ434およびP22オペ
レーターに対して結合する。これらの二つの蛋白質の間
の相違は、認識らせんのDNA結合表面にのみあるため、
これらの蛋白質は、示されるように、ハイブリッドオペ
レーターを認識することができるヘテロダイマーを形成
することができる。このようなハイブリッドオペレータ
ーは、二分子対称、即ちレプレッサホモダイマーの結合
のために必要とされる特徴、を全く有していない。二つ
のホモダイマー認識部分は異なる長さ（434に関しては1
4個の塩基対（bp）およびP22に関しては18bp）を有して
いるため、そして単に二個の半分のオペレーターを結合
させるだけで、機能を有するヘテロダイマー結合部位が
得られるかどうかが明確でないため、我々は三つの可能
な結合部位を作り上げた。これらの部位の一つ（16bpハ
イブリッドオペレーター）を、434の半分にした部位を
直接P22の半分にした部位に融合させることによって作
り出した。他の二つの部位は、16bpハイブリッド部位の
中心に一つの塩基を挿入（17bp部位）するか欠失（15bp
部）させること以外は上記の融合と同じにした。これら
の部位を、これらが派生した434とP22の部位と一緒に図
２に示す。P22および434オペレーターに関する配列を示
した図２においては、結合の機能に対して必須であると
考えられる塩基のみが示されている。他の塩基は“X"で
示されている。
（P22R）］のレプレッサは、それぞれ434およびP22オペ
レーターに対して結合する。これらの二つの蛋白質の間
の相違は、認識らせんのDNA結合表面にのみあるため、
これらの蛋白質は、示されるように、ハイブリッドオペ
レーターを認識することができるヘテロダイマーを形成
することができる。このようなハイブリッドオペレータ
ーは、二分子対称、即ちレプレッサホモダイマーの結合
のために必要とされる特徴、を全く有していない。二つ
のホモダイマー認識部分は異なる長さ（434に関しては1
4個の塩基対（bp）およびP22に関しては18bp）を有して
いるため、そして単に二個の半分のオペレーターを結合
させるだけで、機能を有するヘテロダイマー結合部位が
得られるかどうかが明確でないため、我々は三つの可能
な結合部位を作り上げた。これらの部位の一つ（16bpハ
イブリッドオペレーター）を、434の半分にした部位を
直接P22の半分にした部位に融合させることによって作
り出した。他の二つの部位は、16bpハイブリッド部位の
中心に一つの塩基を挿入（17bp部位）するか欠失（15bp
部）させること以外は上記の融合と同じにした。これら
の部位を、これらが派生した434とP22の部位と一緒に図
２に示す。P22および434オペレーターに関する配列を示
した図２においては、結合の機能に対して必須であると
考えられる塩基のみが示されている。他の塩基は“X"で
示されている。
図２に、15bp、16bpおよび17bpのハイブリッドオペレ
ーターのDNA配列を示す。16bpオペレーターは、434の半
分にした部位に対して直接融合させた一つのP22の半分
にした部位を有している。他の二つの部位は、該部位の
中心に一つの塩基を加えるかそこから乗り除くかするこ
とによって作られた。
ーターのDNA配列を示す。16bpオペレーターは、434の半
分にした部位に対して直接融合させた一つのP22の半分
にした部位を有している。他の二つの部位は、該部位の
中心に一つの塩基を加えるかそこから乗り除くかするこ
とによって作られた。
ヘテロダイマー類は、試験管内で434および434R［ア
ルフア３（P22R）］レプレッサを混合することによって
作られた。該混合物は、標準フイルター結合技術を用い
てオペレーターの結合を分析した。詳細については以下
の実験操作で示す。簡単に言えば、興味が持たれている
オペレーターを含有する短いDNA配列に放射能標準を行
ない、蛋白質の調合量を増大させるながら混合し、これ
のオペレーター結合に関する評価を行なう。短時間培養
した後、DNAと蛋白質の混合物を、ニトロセルロースフ
イルターを通して、蛋白質はフイルター上に保持される
が、DNAはそれを通過する条件下で、濾過を行う。特に
蛋白質と結合した放射能を有するいかなるDNAもまたフ
イルター上に保持され、シンチレーシヨン算出によって
分析できる。保持された放射能を有するDNAの百分率
は、従って、蛋白質/DNA結合のための敏感な分析法とし
て用いることができる。
ルフア３（P22R）］レプレッサを混合することによって
作られた。該混合物は、標準フイルター結合技術を用い
てオペレーターの結合を分析した。詳細については以下
の実験操作で示す。簡単に言えば、興味が持たれている
オペレーターを含有する短いDNA配列に放射能標準を行
ない、蛋白質の調合量を増大させるながら混合し、これ
のオペレーター結合に関する評価を行なう。短時間培養
した後、DNAと蛋白質の混合物を、ニトロセルロースフ
イルターを通して、蛋白質はフイルター上に保持される
が、DNAはそれを通過する条件下で、濾過を行う。特に
蛋白質と結合した放射能を有するいかなるDNAもまたフ
イルター上に保持され、シンチレーシヨン算出によって
分析できる。保持された放射能を有するDNAの百分率
は、従って、蛋白質/DNA結合のための敏感な分析法とし
て用いることができる。
フイルター−結合分析法を用いて、我々はまず最初
に、16bpハイブリッドオペレーター部位（正確に融合し
た434とP22の半分にした部位を有する）のみが特に、43
4および434R［アルフア３（P22R）］レプレッサの混合
物によって保持されることを確認した。我々は更に、ホ
モダイマー（434または434R［アルフア３（P22R）］）
のどちらも16bpハイブリッド部位と結合しないことを認
識した。レプレッサのヘテロダイマーは特に、強い親和
力でハイブリッド部位に対して結合している。フイルタ
ー結合の結果に関しては図３を参照。
に、16bpハイブリッドオペレーター部位（正確に融合し
た434とP22の半分にした部位を有する）のみが特に、43
4および434R［アルフア３（P22R）］レプレッサの混合
物によって保持されることを確認した。我々は更に、ホ
モダイマー（434または434R［アルフア３（P22R）］）
のどちらも16bpハイブリッド部位と結合しないことを認
識した。レプレッサのヘテロダイマーは特に、強い親和
力でハイブリッド部位に対して結合している。フイルタ
ー結合の結果に関しては図３を参照。
図３は、放射能標識した15、16および17bpハイブリッ
ドオペレーターおよび種々の蛋白質調合を用いたフイル
ター結合実験の結果を示している。ヘテロダイマーに関
する結果が、DNA添加以前にヘテロダイマーの形成を許
す予備培養を行ったものまたは行なわないものの、434
および434R［アルフア３（P22R）］レプレッサの1:1の
混合物を用いて、得られた。この結果は、まず最初に、
異なったDNA結合特性を有する二つの同族のモノマーか
ら作られるヘテロダイマーがハイブリッドオペレーター
部位に対して結合できることを示している。ヘテロダイ
マーが形成すると、混合物中の両方のレプレッサホモダ
イマーのそれとは異なる新規なDNA結合特性が生じる。
ハイブリッド認識部位に対するヘテロダイマーの結合に
関する追加的証拠が、DNアーゼＩ保護実験から得られ：
これは実験操作中に記載したように行なった。ハイブリ
ッドオペレーターを有するプラスミドpAD16のEcoR I −
Hind IIIは、Hind III部位に５′−末端標識されてお
り、順次希釈した混合レプレッサ調合剤を用いて培養し
た。各々の反応中のヘテロダイマーの濃度は、コース
１、レプレッサなし;2、1.6mM;3、3.1nM;4、6.2nM;5、1
2.5mM;6、50mM;7、100mMであった。Ａ＋Ｇの印を付けた
コースは、Maniatis他（1982）に記載されているように
プリンで開裂させた同様のDNA断片である。ハイブリッ
ドオペレーターの配列を図２に示したが、、断片上の43
4およびP22の半分に部位の位置に印をつけた。この結果
は、特に期待した通り、レプレッサの混合物がオペレー
ターを認識し結合することを示している。保護された領
域（23bp）の大きさは、単一結合部位に対する単一の43
4または434R［アルフア３（P22R）］レプレッサダイマ
ーの結合に関して見られる大きさに相当している（Whar
ton他、1984:Wharton and Ptashne、1985）。同様の条
件下で、434または434R［アルフア３（P22R）］レプレ
ッサ単独に関しては、いかなる足跡も見られなかった
（データは示されていない）。
ドオペレーターおよび種々の蛋白質調合を用いたフイル
ター結合実験の結果を示している。ヘテロダイマーに関
する結果が、DNA添加以前にヘテロダイマーの形成を許
す予備培養を行ったものまたは行なわないものの、434
および434R［アルフア３（P22R）］レプレッサの1:1の
混合物を用いて、得られた。この結果は、まず最初に、
異なったDNA結合特性を有する二つの同族のモノマーか
ら作られるヘテロダイマーがハイブリッドオペレーター
部位に対して結合できることを示している。ヘテロダイ
マーが形成すると、混合物中の両方のレプレッサホモダ
イマーのそれとは異なる新規なDNA結合特性が生じる。
ハイブリッド認識部位に対するヘテロダイマーの結合に
関する追加的証拠が、DNアーゼＩ保護実験から得られ：
これは実験操作中に記載したように行なった。ハイブリ
ッドオペレーターを有するプラスミドpAD16のEcoR I −
Hind IIIは、Hind III部位に５′−末端標識されてお
り、順次希釈した混合レプレッサ調合剤を用いて培養し
た。各々の反応中のヘテロダイマーの濃度は、コース
１、レプレッサなし;2、1.6mM;3、3.1nM;4、6.2nM;5、1
2.5mM;6、50mM;7、100mMであった。Ａ＋Ｇの印を付けた
コースは、Maniatis他（1982）に記載されているように
プリンで開裂させた同様のDNA断片である。ハイブリッ
ドオペレーターの配列を図２に示したが、、断片上の43
4およびP22の半分に部位の位置に印をつけた。この結果
は、特に期待した通り、レプレッサの混合物がオペレー
ターを認識し結合することを示している。保護された領
域（23bp）の大きさは、単一結合部位に対する単一の43
4または434R［アルフア３（P22R）］レプレッサダイマ
ーの結合に関して見られる大きさに相当している（Whar
ton他、1984:Wharton and Ptashne、1985）。同様の条
件下で、434または434R［アルフア３（P22R）］レプレ
ッサ単独に関しては、いかなる足跡も見られなかった
（データは示されていない）。
新規な特異性を有するホモダイマー類（および結果と
して新規な特異性を有するヘテロダイマー類）を生じさ
せ得る数多くの方法がある。これらは図５に要約してあ
る。簡単に言えば、DNA結合蛋白質の特異性は、ひどく
二量化を変化させることなしに、DNA認識のらせんに対
する特定の変化、認識らせんに対する無作為の変化、或
いは二量化ドメインを保持しながらのDNA認識ドメイン
の完全な置換、によって変更させることができる。最も
簡単な場合として、本明細書中に図示的に示した434
（アルフア３［P22R］）レプレッサを生じさせるために
用いたように、一つのレプレッサからのDNAに接触させ
る残渣を、二番目のレプレッサのそれらで置換するため
に用いることができる（Wharton and Ptashen、1986参
照）。新規な特異性を有するホモダイマー類は、数多く
の方法、例えばWharton and Ptashne、1987;Youderian
他、1983参照、によって作ることができる。ホモダイマ
ーのDNA結合特異性もまた、DNA結合ドメインを別の蛋白
質のそれに変化させることによって変えることができ
る。この方法は、Lin他、1988によって、細菌性レプレ
ッサ蛋白質（ラムダレプレッサ）の二量化接触を保持し
ているが酵母GAL4蛋白質のDNA結合特異性を有している
蛋白質（GAL4（１−74）＋ラムダＲ（112−236））を生
じさせるために用いられた。
して新規な特異性を有するヘテロダイマー類）を生じさ
せ得る数多くの方法がある。これらは図５に要約してあ
る。簡単に言えば、DNA結合蛋白質の特異性は、ひどく
二量化を変化させることなしに、DNA認識のらせんに対
する特定の変化、認識らせんに対する無作為の変化、或
いは二量化ドメインを保持しながらのDNA認識ドメイン
の完全な置換、によって変更させることができる。最も
簡単な場合として、本明細書中に図示的に示した434
（アルフア３［P22R］）レプレッサを生じさせるために
用いたように、一つのレプレッサからのDNAに接触させ
る残渣を、二番目のレプレッサのそれらで置換するため
に用いることができる（Wharton and Ptashen、1986参
照）。新規な特異性を有するホモダイマー類は、数多く
の方法、例えばWharton and Ptashne、1987;Youderian
他、1983参照、によって作ることができる。ホモダイマ
ーのDNA結合特異性もまた、DNA結合ドメインを別の蛋白
質のそれに変化させることによって変えることができ
る。この方法は、Lin他、1988によって、細菌性レプレ
ッサ蛋白質（ラムダレプレッサ）の二量化接触を保持し
ているが酵母GAL4蛋白質のDNA結合特異性を有している
蛋白質（GAL4（１−74）＋ラムダＲ（112−236））を生
じさせるために用いられた。
DNA結合特異性を変化させてもレプレッサ蛋白質の二
量化ドメインをひどく変化させないため、それ故、新規
な特異性を有する範囲のヘテロダイマー類を生じさせる
目的で、これらの変化させた特異性を有するホモダイマ
ー類をそれぞれ互いに組み合わせて、または親のホモダ
イマーと組み合わせて、用いることができる（図５の下
半分を参照）。
量化ドメインをひどく変化させないため、それ故、新規
な特異性を有する範囲のヘテロダイマー類を生じさせる
目的で、これらの変化させた特異性を有するホモダイマ
ー類をそれぞれ互いに組み合わせて、または親のホモダ
イマーと組み合わせて、用いることができる（図５の下
半分を参照）。
実験操作 蛋白質精製 434R［アルフア３（P22R）］レプレッサを、先に示さ
れたように、プラスミドpRW219を有する細胞から精製し
た（Wharton and Ptashen、1985）。434レプレッサを、
Anderson他（1984）の方法によって精製した。両方の蛋
白質の活性を分析したところ＞85％の活性を有してい
た。
れたように、プラスミドpRW219を有する細胞から精製し
た（Wharton and Ptashen、1985）。434レプレッサを、
Anderson他（1984）の方法によって精製した。両方の蛋
白質の活性を分析したところ＞85％の活性を有してい
た。
ハイブリッドオペレーターのクローン化 Sal Ｉに適合性を有する末端に側面を接したハイブ
リッドオペレーターを有する二本鎖合成オリゴノヌクレ
オチドを、プラスミドpuC18のSal Ｉの部位中にクロー
ン化させて、プラスミドpAD15、pAD16およびpAD17を生
じさせた。プラスミドpAD16のポリリンカー領域を、プ
ラスミドpEMBL8+（Dente他、1985）中に再クローン化さ
せて、pDV50を得た。大腸菌株RZ1032（ATCC39737;Kunke
l、1985）からの一本鎖pDV50 DNAの調製および引き続
く変異誘発を、ZollerおよびSmith（1982）が記載した
ように行なった。ChenおよびSeeburgの方法（1985）を
用いたプラスミド配列を行なうことによって、全てのオ
ペレーター配列の立証を行なった。
リッドオペレーターを有する二本鎖合成オリゴノヌクレ
オチドを、プラスミドpuC18のSal Ｉの部位中にクロー
ン化させて、プラスミドpAD15、pAD16およびpAD17を生
じさせた。プラスミドpAD16のポリリンカー領域を、プ
ラスミドpEMBL8+（Dente他、1985）中に再クローン化さ
せて、pDV50を得た。大腸菌株RZ1032（ATCC39737;Kunke
l、1985）からの一本鎖pDV50 DNAの調製および引き続
く変異誘発を、ZollerおよびSmith（1982）が記載した
ように行なった。ChenおよびSeeburgの方法（1985）を
用いたプラスミド配列を行なうことによって、全てのオ
ペレーター配列の立証を行なった。
フイルター結合 ハイブリッドオペレーターを、約80−bp EcoR I−Hi
nd III断片として、相当するプラスミドから切り取り、
そして（Maniatis他、1982）されるように、ポリヌクレ
オチドキナーゼおよび32p−dATPを用いて、EcoR Iもし
くはHind IIIの端のどちらかに、高い特定活性になるよ
うに、５′−末端標識を行なった。ントロセルロースフ
イルター結合分析法（Riggs他、1968）を以下に示す。
標識したオペレーターの断片を、400μの50mMカコジ
ル酸二ナトリウム（pH8）、10mM塩化マグネイウム、0.1
mM EDTA二ナトリウム、音波処理したにわとりの血液DN
A5ug/mlを含有する塩化カリウム（CB緩衝液）50mM、お
よび50ug/mlのBSA中で、最終濃度が＜20pMになるよう
に、レプレッサと一緒に培養した。434および434R［ア
ルフア３（P22R）］レプレッサを氷上で希釈して、CB緩
衝液（＋BSA）中1uMの濃度とし、そしてこの希釈した蛋
白質の一定分量を同比率で混合して“ヘテロダイマーサ
ンプル”を得た。希釈した三つの蛋白質のサンプルを、
対応する結合反応物に直ちに加え、1.5mM〜100mMの最終
的範囲のレプレッサ濃度を得た。結合を生じさせるため
室温で15分間培養した後、このサンプルを、CB緩衝液に
予め浸けておいた24mmニトロセルロースフイルター（Mi
llipore、タイプHA0.45um）を通して濾過した。標識し
たオペレーターDNAの保持を、フイルターのCerenkov算
出を行なうことによって測定した。レプレッサを含有し
ていないサンプルを勘定に入れて、背景レベルの保持
（常に６％以下）を得て、これを測定値から差し引い
た。
nd III断片として、相当するプラスミドから切り取り、
そして（Maniatis他、1982）されるように、ポリヌクレ
オチドキナーゼおよび32p−dATPを用いて、EcoR Iもし
くはHind IIIの端のどちらかに、高い特定活性になるよ
うに、５′−末端標識を行なった。ントロセルロースフ
イルター結合分析法（Riggs他、1968）を以下に示す。
標識したオペレーターの断片を、400μの50mMカコジ
ル酸二ナトリウム（pH8）、10mM塩化マグネイウム、0.1
mM EDTA二ナトリウム、音波処理したにわとりの血液DN
A5ug/mlを含有する塩化カリウム（CB緩衝液）50mM、お
よび50ug/mlのBSA中で、最終濃度が＜20pMになるよう
に、レプレッサと一緒に培養した。434および434R［ア
ルフア３（P22R）］レプレッサを氷上で希釈して、CB緩
衝液（＋BSA）中1uMの濃度とし、そしてこの希釈した蛋
白質の一定分量を同比率で混合して“ヘテロダイマーサ
ンプル”を得た。希釈した三つの蛋白質のサンプルを、
対応する結合反応物に直ちに加え、1.5mM〜100mMの最終
的範囲のレプレッサ濃度を得た。結合を生じさせるため
室温で15分間培養した後、このサンプルを、CB緩衝液に
予め浸けておいた24mmニトロセルロースフイルター（Mi
llipore、タイプHA0.45um）を通して濾過した。標識し
たオペレーターDNAの保持を、フイルターのCerenkov算
出を行なうことによって測定した。レプレッサを含有し
ていないサンプルを勘定に入れて、背景レベルの保持
（常に６％以下）を得て、これを測定値から差し引い
た。
DNアーゼＩ保護実験 音波処理した5ug/mlのにわとりの血液DNAおよび50ug/
mlのBSAを含有するCB緩衝液をレプレッサ結合およびND
アーゼＩ開裂反応用として用いる以外はJohnson他、（1
979）によって示されるのと同様に、DNアーゼＩ保護実
験を実質上行なった。ハイブリッドオペレーターを含有
するDNAの断片を調製し、そしてフイルター結合のため
に上述したように標識をつけた。
mlのBSAを含有するCB緩衝液をレプレッサ結合およびND
アーゼＩ開裂反応用として用いる以外はJohnson他、（1
979）によって示されるのと同様に、DNアーゼＩ保護実
験を実質上行なった。ハイブリッドオペレーターを含有
するDNAの断片を調製し、そしてフイルター結合のため
に上述したように標識をつけた。
参考例 Anderson、J.E.,Ptashne、M.,およびHarrison、S.C.（1
987）、Nature、326、846−852。
987）、Nature、326、846−852。
Pabo、C.O,およびSauer、R.T.（1984）Ann.Rev.Bioche
m.53、293−321。
m.53、293−321。
Sauer、R.T.,Yocum、R.R.,Doolittle、R.F.,Lewis、M.
およびPabo、C.O.（1982）、Nature、298、447−451。
およびPabo、C.O.（1982）、Nature、298、447−451。
Wharton、R.P.およびPtashne、M.（1985）、Nature、31
6、601−605。
6、601−605。
Anderson、I.E.（1984）The ７Å Structure of ａ
434 Repressor−operator Complex（Ph.D.Thesis、
Harvard University）。
434 Repressor−operator Complex（Ph.D.Thesis、
Harvard University）。
Dente、L.Cesareni、G.and Cortese、R.（1983）Nucle
ic Acids Res.11、1645−1655。
ic Acids Res.11、1645−1655。
Kunkel、T.A.（1985）Prco.Natl.Acad.Sci.USA、82、48
8−492。
8−492。
Wharton、R.P.,Brown、E.L.およびPtashne、M.（1984）
Cell、38、361−369。
Cell、38、361−369。
Chen、E.Y.およびSeeberg、P.H.,（1985）DNA、４、165
−170。
−170。
Riggs、A.D.,Bourgeois、S.,Newby、R.F.,およびCohn、
M.,（1968）J.Mol.Biol.34、365−368。
M.,（1968）J.Mol.Biol.34、365−368。
Zoller、M.J.,およびSmith、M.（1982）Nucleic Acids
Res.10、6487−6500。
Res.10、6487−6500。
Johnson、A.D.,Meyer、B.J.,およびPtashne、M.（197
9）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、5061−5065。
9）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76、5061−5065。
Maniatis、T.,Fritsan、E.F.and Sambrook、J.（198
2）“Molecular Cloning、Ａ Laboratory Manual"
（Cold Spring Harbor、New York）。
2）“Molecular Cloning、Ａ Laboratory Manual"
（Cold Spring Harbor、New York）。
Lin、Y.S.他、（1988）Cell、54、659−664。
Wharton、R.P.およびPtashne、M.（1986）、Trends Bi
ochem.Sci.11、71−73。
ochem.Sci.11、71−73。
Wharton、R.P.およびPtashne、M.（1987）、Nature、32
6、881−891。
6、881−891。
Youderian他、（1983）、Cell、35、777−783。
フロントページの続き (72)発明者 ホリス，メルビン イギリス国チエシヤー・アルダリイエツ ジ・ミアサイド （番地なし） アイシ ーアイ・フアーマシユーチカル・デイビ ジヨン内 (72)発明者 ピオリ，デビツド イギリス国チエシヤー・アルダリイエツ ジ・ミアサイド （番地なし） アイシ ーアイ・フアーマシユーチカル・デイビ ジヨン内 (72)発明者 バレンズエラ，ダリオ アメリカ合衆国マサチユセツツ州サマー ビル・ピアソンアベニユー57 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 5/00 - 5/28 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】（ｉ） 相補ストランド上の隣接する相互
に異なる第一および第二DNA配列によって特定される蛋
白質結合部位を含んでなるDNAと、 （ii） 自然の形態にない相互に異なる第一蛋白質モノ
マーと第二蛋白質モノマーから形成され、かつ （ａ） 第一蛋白質モノマーが前記第一DNA配列に対し
て同系の第一DNA結合ドメインを含んでおり、そして （ｂ） 第二蛋白質モノマーが前記第二DNA配列に対し
て同系の第二DNA結合ドメインを含む、 ヘテロダイマー調節蛋白質と、 が会合した複合体。 - 【請求項２】第一DNA結合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合ドメインがDNA
配列： ［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧで
ある］ に対して同系である請求の範囲１に記載の複合体。 - 【請求項３】第一DNA結合ドメインがDNA配列： に対して同系であり、そして第二DNA結合部位がDNA配
列： に対して同系である請求の範囲２に記載の複合体。 - 【請求項４】蛋白質結合部位がDNA配列： ［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧで
ある］ 或いはその相補体を含んでなる請求の範囲１〜３のいず
れか１つに記載の複合体。 - 【請求項５】蛋白質結合部位がDNA配列： 或いはその相補体を含んでなる請求の範囲３に記載の複
合体。 - 【請求項６】（ｉ） 機能的蛋白質を発現するための遺
伝子、 （ii） 前記遺伝子と操作的に会合した調節領域、 （iii） 前記調節領域内の蛋白質結合部位であって、
相補ストランド上の隣接する相互に異なる第一および第
二DNA配列によって特定され、自然の形態にない相互に
異なる第一蛋白質モノマーと第二蛋白質モノマーから形
成され、かつ （ａ） 第一蛋白質モノマーが前記第一DNA配列に対し
て同系の第一DNA結合ドメインを含んでおり、そして （ｂ） 第二蛋白質モノマーが前記第二DNA配列に対し
て同系の第一DNA結合ドメインを含む、 ヘテロダイマー調節蛋白質を結合することができる蛋白
質結合部位（該蛋白質結合部位は前記ヘテロダイマーが
結合した場合に、前記遺伝子の発現を調節する）、 （iv） 第一DNA配列に対して同系の第一DNA結合ドメイ
ンを含んでなる第一蛋白質モノマーを発現するための第
二遺伝子、ならびに （ｖ） 第二DNA配列に対して同系の第二DNA結合ドメイ
ンを含んでなる第二蛋白質モノマーを発現するための第
三遺伝子 を含んでなり、そして前記第一蛋白質および第二蛋白質
が自然の形態にないヘテロダイマーを形成することによ
り、前記第二遺伝子および第二遺伝子が前記機能的蛋白
質を発現するための遺伝子の発現を調節するように作用
することを特徴とする細胞。 - 【請求項７】第一および第二DNA配列が請求の範囲２〜
５のいずれか１つに特定されるものである請求の範囲６
に記載の細胞。 - 【請求項８】前記蛋白質結合部位に結合したヘテロダイ
マーの存在が機能的蛋白質の生産を阻害することにより
前記遺伝子の発現を調節する請求の範囲６または７に記
載の細胞。 - 【請求項９】前記蛋白質結合部位に結合したヘテロダイ
マーの存在が機能的蛋白質の生産を促進することにより
前記遺伝子の発現を調節する請求の範囲６または７に記
載の細胞。 - 【請求項１０】第二調節領域が、前記第二遺伝子につい
て提供され、１種以上の調節剤の存在または不存在に応
じて前記第一蛋白質モノマーの生産を調節するように作
用する請求の範囲６〜９のいずれか１つに記載の細胞。 - 【請求項１１】第三調節領域が、前記第三遺伝子につい
て提供され、請求の範囲10に記載されている１種以上の
調節剤と同一または異なっていてもよい調節剤の存在ま
たは不存在に応じて前記第二蛋白質モノマーの生産を調
節するように作用する請求の範囲６〜10のいずれか１つ
に記載の細胞。 - 【請求項１２】（ｉ） 機能的蛋白質を発現するための
遺伝子、 （ii） 前記遺伝子と操作的に会合した調節領域、およ
び （iii） 前記調節領域内の蛋白質結合部位であって、
相補ストランド自然の形態にない相互に異なる第一蛋白
質モノマーと第二蛋白質モノマーから形成され、かつ （ａ） 第一蛋白質モノマーが前記第一DNA配列に対し
て同系の第一DNA結合ドメインを含んでおり、そして （ｂ） 第二蛋白質モノマーが前記第二DNA配列に対し
て同系の同一DNA結合ドメインを含む、ヘテロダイマー
調節蛋白質を結合することができる蛋白質結合部位、を
含んでなる細胞において、 前記の相互に異なる第一蛋白質モノマーおよび第二蛋白
質モノマーを含むヘテロダイマーを細胞に供給し、該ヘ
テロダイマーをその蛋白質結合部位に結合させ、そして
機能的蛋白質の発現を調節することを特徴とする細胞に
おける機能的蛋白質の発現の調節方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888807683A GB8807683D0 (en) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | Regulation of gene expression |
| GB8807683.1 | 1988-03-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03503601A JPH03503601A (ja) | 1991-08-15 |
| JP2991731B2 true JP2991731B2 (ja) | 1999-12-20 |
Family
ID=10634427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1504171A Expired - Lifetime JP2991731B2 (ja) | 1988-03-31 | 1989-03-31 | 遺伝子発現の調節 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5554510A (ja) |
| EP (1) | EP0338690B1 (ja) |
| JP (1) | JP2991731B2 (ja) |
| AT (1) | ATE141102T1 (ja) |
| AU (1) | AU629208B2 (ja) |
| CA (1) | CA1338620C (ja) |
| DE (1) | DE68926918T2 (ja) |
| DK (1) | DK234790D0 (ja) |
| GB (1) | GB8807683D0 (ja) |
| HU (1) | HUT55051A (ja) |
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| NZ (1) | NZ228568A (ja) |
| WO (1) | WO1989009256A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA892401B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0747485B1 (en) * | 1989-11-06 | 1998-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Production of proteins using homologous recombination |
| ES2151463T5 (es) * | 1989-12-22 | 2012-10-29 | Merck Serono Sa | Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos |
| US5272071A (en) * | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
| US5521066A (en) * | 1993-09-13 | 1996-05-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Periplasmic membrane-bound system for detecting protein-protein interactions |
| AR021484A1 (es) * | 1998-09-10 | 2002-07-24 | Pioneer Hi Bred Int | Nuevos receptores de ecdisona y metodos de uso de los mismos |
| US7803982B2 (en) | 2001-04-20 | 2010-09-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | T1R3 transgenic animals, cells and related methods |
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1988
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