CZ283148B6

CZ283148B6 - Izolovaný byologicky aktivní lymfotoxin, jeho protilátka, nukleová kyselina, kodující tento lymfotoxin, a další látky jej obsahující

Info

Publication number: CZ283148B6
Application number: CS853930A
Authority: CZ
Inventors: Bharat Bhushan Aggarwal; Timothy Scott Bringman; Patrick William Gray; Glenn Evan Nedwin
Original assignee: Genentech Inc.
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1998-01-14
Also published as: ES543695A0; IE63487B1; JPS6156197A; FI852143A0; SK278333B6; HUT37814A; JP2804237B2; AU599303B2; IE930589L; DK171531B1; CZ393085A3; DE3587597T2; RO100383B1; EP0164965A3; FI852143L; IE851321L; AR245219A1; CA1340641C; EP0509553B1; DE3588225D1

Abstract

Lymfotoxin obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků 24 až 171 na obrázku 2A a není glykosylován nebo má variantní glykosylaci při srovnání s odpovídajícím přírodním lymfotoxinem z lidských lymfoidních buněk. Protilátka neutralizuje cytolytickou aktivitu lymfotoxinu a neobsahuje neneutralizující protilátky. Nulkeová kyselina koduje definovaný lymfotoxin a obsahuje DNA, která neobsahuje intron přítomný mezi nukleotidy 284 a 285 a je to s výhodou cDNA. Replikovatelný vektor obsahuje uvedenou nukleotidovou kyselinu. Heterologní buňka je transformována shora definovanou nukleotidovou kyselinou. ŕ

Description

Izolovaný biologicky aktivní lymfotoxin, jeho protilátka, nukleová kyselina, kódující tento lymfotoxin, a další látky jej obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká izolovaného biologicky aktivního lymfotoxinu, jeho protilátky, nukleové kyseliny, kódující tento lymfotoxin, a dalších látek jej obsahujících.

Dosavadní stav techniky

Lymfotoxin byl poprvé identifikován jako biologický faktor s protibuněčnou účinností na neoplastické (novotvarové) buněčné linie. Účinnost, která se popisuje jako lymfotoxinová, která se získává z lymfocytů stimulovaných mitogenem, je spojena se spektrem cytotoxických účinností od cytostázy jistých nádorových buněčných linií do význačné cytolýzy jiných transformovaných buněk. Lymfotoxinová účinnost je však charakterizována malou nebo žádnou protibuněčnou účinností na primární buněčné kultury atestované normální buněčné linie. Tato údajná diskriminační vlastnost lymfotoxinu vedla k in vivo studiím, z nichž vyplývá, že lymfotoxin může mít potenciální protinádorovou účinnost.

Lymfotoxin je termín, který se používá k popisu celé skupiny molekul. Lymfotoxinové molekuly byly identifikovány jako glykoproteiny, které se dělí na pět tříd podle molekulových hmotností, z nichž každá je dále ještě heterogenní, pokud jde o náboj Zdá se, že ve většině lymfocytových supematantů převládají lidská alfa (molekulová hmotnost 70 000 až 90 000) a lidská beta třída (molekulová hmotnost 25 000 až 50 000). Alfa třídy (podle molekulové hmotnosti) se podle náboje dělí do alespoň sedmi podtříd, zatímco beta třídy se děli na dvě různé podtřídy (G. Granger a spol. v Cellular Responses to Molecular Modulators, str. 287 až 310, ed. Mozes aspol, 1981). Byly identifikovány také komplexní (o molekulové hmotnosti větší než 200 000) a gama (molekulová hmotnost 10 000 až 20 000) formy lymfotoxinu. Různé formy a třídy lymfotoxinu se mezi sebou liší ve stabilitě a v kinetice jejich vzniku v kultuře. Při nízké iontové síle se mohou agregovat spolu s komplexní třídou. Třídy lymfotoxinů o nižší molekulové hmotnosti byly popsány jako relativně nestálé a slabě buněčně lytické při srovnání s třídami o vyšší molekulové hmotnosti [Hiserodt aspol.: Cell. Immun. 26, 211 (1976), Granger aspol. v Biochemical Characterisation of Lymphokines, 279 až 283, ed. De Weck a spol., 1980.]. Aktivita gama třídy nebyla pro svoji nestabilitu extenzivně studována [G. Granger a spol: Cellular Immunology 38, 388 až 402 (1978).]. Rovněž beta třída je v literatuře popsána jako nestabilní [Walker a spol.: J. Immunol. 116(3), 807 až 815 (březen 1976).].

Je třeba si uvědomit, že lymfokinová terminologie není jednotná. V současné době názvy, které jsou dávány produktům buněčných kultur, jsou většinou funkcí buněk, o nichž se předpokládá, že vyrábějí produkt a vytvářejí produkty v biologických zkouškách. Tyto produkty jsou však ve velkém měřítku chatrně charakterizovány. Příčin je několik: mnohé studie byly prováděny s částečně čistými preparáty, testy, které byly použity k charakterizování produktů, nejsou molekulárně specifické a v některých případech probíhají za značných obměn. Opravdová identita různých cytotoxických faktorů zůstane neznámá, pokud nebude existovat standardní terminologie, založená na zřetelně testovatelných rozlišujících vlastnostech, jako jsou například sekvence aminokyselin nebo imunní epitopy. Příklady dalších názvů, které jsou dávány produktům cytotoxické buněčné kultury, jsou nádorový nekrózový faktor, NK buněčný cytotoxický faktor, hemorhagický nekrózový faktor a makrofágový cytotoxinový nebo cytotoxický faktor.

USA patentová přihláška č. 608 316 (podáno 7. května 1984) a evropský patent 100 641 A (publikovaný 15. února 1984) popisují aminokyselinové sekvence lidského lymfotoxinu, který

- 1 CZ 283148 B6 byl izolován z lidské lymfoblastoidní buněčné linie RPMI-1788. Hayashi a spol. v evropském patentu 132 125 A (publikovaném 23. ledna 1985) popisují izolaci proteinu z králíka po stimulaci jeho retikuloendotheliálního systému. Bylo popsáno, že protein má protinádorovou účinnost a jeho N-terminální aminokyselinové sekvence je Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp5 Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Seu-Gln-Trp-Leu. Doprovázející USA patentová přihláška 628 059 (podáno 5. července 1984) popisuje čištění a rekombinantní syntézu cytotoxického lidského polypeptidů, který byl identifikován jako nádorový nekrózový faktor s N-terminální aminokyselinovou sekvencí: Val-Arg-Ser-Ser-SerArg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro. Ohnishi a spol. (USA patent io 4 481 137) popisují získání látky o molekulové hmotnosti 7 000 až 9 000, kterou pojmenovali CBx3, z kultury buněk BALL-1. Tato látka potlačuje růst nádorových buněk a má N-terminus Ala-Ala.

Podle Totha aGrangera [Mol. Immun. 16, 671 až 679 (1979).] ani odstranění sialové kyseliny z lymfotoxin-obsahujících lymfocytových supematantů neuramidazovým zpracováním, ani přidání N-acetyl-glukosaminu, galaktózy, laktózy, manózy, α-methylmanosidu nebo fukózy k supematantům nemá žádný vliv na in vitro lytickou aktivitu. Toth a spol. tudíž z toho vyvodili, že jednoduché cukry nehrají roli v účinnosti jejich lymfotoxinu. Toth a spol. však také pozorují, že sacharidy hrají důležitou roli při působení jiným lymfokinů. Z toho vyvozují závěr, že 20 nemohou vyloučit participaci složitějších forem oligosacharidů v cytotoxické aktivitě lymfotoxinů.

Proctor, Klostergaard aGranger [Clinical Research 30(1), 55A (1982).] uvádějí, že lidské lymfocyty, jestliže jsou aktivovány PHA za přítomnosti tunikamycinu (k inhibici adice N25 navázaných cukerných zbytků na lymfotoxinové molekuly), uvolňují biologicky inertní lymfotoxin. Podle těchto autorů imunochemické studie odhalily, že zatímco cukerný zbytek lymfotoxinu nebyl potřeba pro jeho transport nebo pro uvolnění aktivovaného lymfocytu v supematantu, byl cukr potřeba pro efektivní destrukci cílových buněk, protože cukr byl odpovědný za příslušnou konformaci molekul (molekuly) lymfotoxinu.

Další literatura, kterou by bylo možno prostudovat v souvislosti s touto přihláškou, zahrnuje: Evans: Cancer Immunol. Immunother. 12, 181 až 190 (1982), Lee a spol.: Cell. Immun. 48, 166 až 181 (1979), De Weck a spol. (ed.): Biochemical Characterization of Lymphokines, str. 279 až 312 (1980), Khan a spol. (ed.): Human Lymphokines, str. 459 až 477 (30. června 35 1982), Aggarwal a spol.: příspěvek na 3rd Intemational Lymphokine workshop in Haverford,

Pa., 1. až 5. září 1982, Ransom a spol.: Cancer Research 43, 5222 až 5227 (listopad 1983), Kuli a spol.: J. of Immun. 126(4), 1279 až 1283 (duben 1981), J. Sawada a spol.: Jap. J. Exp. Med. 46, 263 až 267 (1976), G. Granger a spol.: Cell Immun. 38, 388 až 402 (1978), J. Rundell a spol.: Immunopharmacology 3, 9 až 18 (1981), G. Granger a spol.: J. Lymphokine Res. 1, 45 až 49 40 (1982), N. Ruddke a spol.: Lymphokine Res. 2, 23 až 31 (1983), M. Mitsuhashi a spol.:

Britská patentová přihláška 2 106 117, H. Enomoto: Evropská patentová přihláška 87 087A, B. Williamson a spol.: P.N.A.S. USA 80, 5397 až 5401 (1983) a S. Wright a spol.: J. Immun. 126, 1516 až 1521 (1981).

Lymfotoxiny (nebo látky identifikované jako lymfotoxin), získávané zde z lymfocytové kultury, jsou přítomny v nízkých koncentracích, řádově 0,05 až 2.10⁶ jednotek na litr supematantu buněk RPMI-1788 nebo primárních lymfocytů. Získané množství je často značně proměnlivé a primární lymfocyty jsou drahé. Je tedy zapotřebí ekonomický způsob výroby lymfotoxinu [Yamato a spol.: J. of Biological Response Modifiers 3(1). 76 až 87 (1984).].

Podle předcházejících způsobů se nepodařilo vyrobit lymfotoxin, který je homogenní v aminokyselinové sekvenci, což je důležitá vlastnost pro použití jako léčivo. Lymfotoxin, který se izoluje z kultury buněčných linií, vykazuje heterogenitu na aminovém konci, možná díky

-2CZ 283148 B6 proteolytické procesí (viz shora citovanou USA přihlášku 608 316). Kultury primárních lymfocytů, např. z nosních mandlí nebo periferní krve, musí nutně obsahovat buňky mnoha donorů z důvodů ekonomických. Produkty těchto buněk budou však obrážet genetickou různost mezi donory, takže výsledný iymfotoxin může být ve skutečnosti směsí alelických typů. Podíly 5 a identity takových alel budou jeden od druhého zřejmě neznámé. Je tedy potřebný způsob výroby lymfotoxinu, který by byl jednotný, pokud jde o jeho aminokyselinovou sekvenci.

Předchozí způsoby jsou omezeny také tím, že se podle nich produkuje Iymfotoxin, který má primární aminokyselinové sekvence odpovídající lymfotoxinům, které se nacházejí v přírodě.

Substituce (náhrada), delece (vynechání) nebo inzerce (vložení) různých aminokyselin do těchto sekvencí by vyžadovaly rozsáhlé a nákladné chemické modifikace, pokud by se těchto modifikací vůbec dosáhlo. Jsou tedy zapotřebí způsoby, kterými by se snadno dosáhlo různých změn aminokyselinových sekvencí lymfotoxinu.

Ačkoliv protinádorové účinky a zřejmá terapeutická hodnota lymfotoxinové aktivity je v literatuře popisována od roku 1968, Iymfotoxin nebyl studován v extenzivních klinických protokolech nebo uveden na trh vzhledem k malým množstvím a heterogenní povaze lymfotoxinu, dostupného podle předcházejících způsobů. Jsou tedy zapotřebí způsoby, podle kterých by se ekonomicky vyráběla taková množství lymfotoxinu, kterých je zapotřebí pro 20 klinické studie.

V literatuře je popsáno králičí antisérum, které je schopné neutralizovat cytolytickou aktivitu různých cytotoxinů včetně látek, které byly identifikovány jako Iymfotoxin [Yamato aspol.: Cell. Immun. 38, 403 až 416 (1978), Gately a spol.: Cell. Immun. 27, 82 až 93 (1976), Hiserodt 25 aspol. J. Immun. 119(2), 274 až 380 (1977), Zacharchuk aspol.: P.N.A.S. USA 80, 6341 až 6345 (říjen 1983), Ruddle a spol.: Lymphokine Research 2(1), 23 až 31 (1983), Mannel a spol.: Infection and Immunity 33(1). 156 až 164 (1981), Wallach a spol.: The Biology of the Interferon Systém, ed. E. De Maeyer a spol., str. 293 až 302 (publikováno v září 1983) a Stone-Wolff a spol.: J. Exp. Med. 159, 828 až 843 (březen 1984). Jelikož je toto antisérum polyklonální, 30 obsahuje různé protilátky proti imunogenu lymfotoxinu. Kterákoliv nebo kterékoliv z těchto protilátek způsobují neutralizaci lymfotoxinové účinnosti. Sdělení v literatuře jsou obvykle nejasná, pokud jde o molekulární identitu látky, zodpovědné za lymfotoxinovou účinnost, která byla použita jako imunogen. To, co je pro diagnózu a imunoafmitní čisticí postupy potřeba, je monospecifická protilátka proti jasně a jednoznačně identifikované lymfotoxinové molekule.

Podstata vynálezu

Jedním předmětem vynálezu je izolovaný biologicky aktivní Iymfotoxin, který obsahuje sekvenci 40 aminokyselinových zbytků 24 až 171 na obrázku 2a, který není glykosylován nebo má variantní glykosylaci při srovnání s odpovídajícím lymfotoxinem z lidských lymfoidních buněk.

Izolovaný biologicky aktivní Iymfotoxin obsahuje s výhodou sekvenci s aminokyselinovými zbytky 1 až 171 na obrázku 1.

Specifická aktivita izolovaného biologicky aktivního lymfotoxinu je v rozsahu od 2 do 10.10⁸jednotek na mg proteinu.

Druhým předmětem tohoto vynálezu je protilátka, která neutralizuje cytolytickou aktivitu 50 lymfotoxinu a neobsahuje neneutralizující protilátky.

Protilátka je s výhodou monoklonální protilátka a je popřípadě značena detekovatelnou látkou. Detekovatelná látka znamená fluorescenční, chemiluminiscenční nebo radioisotopovou značku. Protilátka může být imobilizována na povrchu nebo na matrici.

-3CZ 283148 B6

Třetím předmětem vynálezu je nukleová kyselina kódující shora definovaný lymfotoxin. Nukleová kyselina s výhodou obsahuje DNA, která neobsahuje intron, přítomný mezi nukleotidy 284 a 285. Nukleovou kyselinou je výhodně cDNA.

Nukleová kyselina může být kovalentně označena detekovatelnou látkou.

Čtvrtým předmětem vynálezu je replikovatelný vektor, který obsahuje shora uvedenou nukleovou kyselinu. Je výhodné, je-li vektor replikovatelný v prokaryotech nebo eukaryotech.

Vektor, replikovatelný v prokaryotech, s výhodou obsahuje bakteriální promotor, odštěpitelně napojený na nukleovou kyselinu, kódující lymfotoxin. Je výhodné, kóduje-li nukleová kyselina v replikovaném vektoru napojení bakteriálního sekrečního leaderu a lymfotoxinu.

Výhodný replikovatelný vektor znamená pLTrpl nebo p20KLT.

Pátým předmětem vynálezu je heterologní buňka, transformovaná shora definovanou nukleovou kyselinou. Heterologní buňka může být s výhodou transformována shora uvedeným replikovatelným vektorem. Buňkou je s výhodou prokaryot.

Šestým a posledním předmětem tohoto vynálezu je izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin, v němž aminokyselinový zbytek v lymfotoxinové sekvenci podle obrázku 2a je a) vynechán, b) nahrazen jiným zbytkem nebo c) do sekvence podle obrázku 2a je vložen jiný zbytek s tím, že z tohoto variantního lymfotoxinu je vyloučen lymfotoxin, který má sekvenci 25 podle obrázku 2a s aminovými konci na Leu+1 nebo His+24. Zbytky -34 až -1 mohou být vynechány v izolovaném biologicky aktivním variantním lymfotoxinu, který dále může obsahovat inserci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku. Inzerce znamená s výhodou spojení polypeptidů s karboxylovým koncem lymfotoxinu.

V izolovaném biologicky aktivním variantním lymfotoxinu může být polypeptid napojen na lymfotoxin místem hydrolýzy proteolytickým enzymem. Variantní lymfotoxin může být s výhodou cytolyticky neaktivní před proteolytickou hydrolýzou.

Variantní lymfotoxin obsahuje s výhodou náhradu jednoho aminokyselinového zbytku nebo 35 deleci od 1 do 30 aminokyselinových zbytků, nebo inzerci jednoho aminokyselinového zbytku.

Náhrada znamená náhradu zbytku ze skupiny neutrálních nebo bazických aminokyselinových zbytků takovým zbytkem, který není členem skupiny, do které patří nahrazená aminokyselina.

Variantní lymfotoxin může být cytotoxický.

Uvedených cílů tohoto vynálezu bylo dosaženo úspěšnou rekombinantní expresí proteinu, který má lymfotoxinovou účinnost. Tento typ lymfotoxinu, který je zde popsán v termínech jeho účinnosti a přirozené nebo obměněné aminokyselinové sekvence, je zde dále označován jako lymfotoxin. Dna kódující lymfotoxin byly překvapivě identifikovány přes nepatrné hladiny 45 lymfotoxinu, expresované v homologních buňkách a přes nejistotu v čase, ve kterém se messenger-RNA (mRNA) kódující lymfotoxin objevuje v homologních buňkách. Překvapující bylo také to, že biologicky aktivní lymfotoxin je expresován v rekombinantních buňkách, které neglykosylují lymfotoxin (nebo u kterých se to neočekává tak jako u homologních buněk). Lymfotoxin, který se touto expresí získá, má v podstatě jednotnou aminokyselinovou sekvenci, 50 bez N-terminální enzymatické hydrolýzy. V buněčně kultuře dochází k expresi DNA kódující lymfotoxin v takovém počtu kopií, který převyšuje 0,1 až 1.10¹¹ jednotek na litr lyzátu kultury.

Lymfotoxin, který je rekombinantní hostitelskou buňkou expresován, závisí na DNA, která byla použita ke kódování lymfotoxinu nebo jeho prekurzorů, a také na vybrané hostitelské buňce.

-4CZ 283148 B6

Nukleokyselinové sekvence, které jsou zde použity pro syntézu lymfotoxinu, jsou nové. Jsou charakterizovány nukleotidovými sekvencemi, které se liší od původní nebo přírodní sekvence v jedné nebo ve více následujících možnostech: DNA neobsahuje introny, v případě lidského lymfotoxinu je intron přítomný mezi nukleotidy 284 a 285 (obrázek 2a). DNA neobsahuje 5 nukleovou kyselinu, kódující jiné proteiny organismu, z něhož DNA pochází; nukleová kyselina, kódující lymfotoxin, je ligována do vektoru; a/nebo nukleová kyselina je schopná hybrizace na nukleovou kyselinu kódující lymfotoxin, avšak s tím, že taková hybridizovaná nukleová kyselina nemá nukleotidovou sekvenci přírodní DNA nebo RNA kódující lymfotoxin.

Mutantní nukleové kyseliny, kódující lymfotoxin, jsou produktem rekombinantních manipulací. K tiché mutaci v 5' netranslované oblasti dochází proto, aby se zvýšila hladina exprese ve vybraných hostitelích, např. redukcí možnosti struktur m-RNA se spárovanými úseky a nespárovanými (smyčkami) úseky [stem and loop] v 5' oblastech nukleové kyseliny, nebo substitucí hostitelem preferovaných kodónů, nalezených v přírodních nukleokyselinových izolátech.

Spíše než tiché mutace umožňují mutace v nukleových kyselinách, které jsou represovány, přípravu lymfotoxinů, které mají aminokyselinovou sekvenci původního lymfotoxinu nebo primární sekvenci jeho variant s aminokyselinovými sekvencemi, lišícími se od původního lymfotoxinu. Mutantní lymfotoxin se izoluje jako takový, nebo je dále procesován hostitelskou 20 buňkou, takže se získá žádaný typ lymfotoxinu. Tyto nukleové kyseliny nebo nukleové kyseliny, které se s nimi hybridizují, nebo jejich fragmenty, se označí a použijí se v hybridizačních testech při identifikaci nebo určování genetického materiálu, kódujícího lymfotoxin.

Při syntéze lymfotoxinu se DNA, která kóduje lymfotoxin, liguje do vektoru, vektor se použije 25 pro transformaci hostitelských buněk, hostitelské buňky se kultivují a lymfotoxin se izoluje z kultury. Tento obecný postup se používá pro syntézu lymfotoxinu s aminokyselinovou sekvencí původního lymfotoxinu, nebo pro konstrukci nových lymfotoxinových variant podle konstrukce vektoru a podle hostitelské buňky, vybrané pro transformaci. Typy lymfotoxinů, které jsou schopné syntézy, zahrnují lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci, lymfotoxin 30 s histidylovou skupinou na aminovém konci, pre-lymfotoxin a lymfotoxinové varianty, mezi něž patří a) kondenzované proteiny, v nichž heterologní protein nebo polypeptid je vázán peptidovou vazbou na aminový a/nebo karboxylový konec aminokyselin lymfotoxinu, b) lymfotoxinové fragmenty, zvláště fragmenty pre-lymfotoxinu, v němž kterákoliv aminokyselina mezi -34 a +23 znamená aminokyselinu aminového konce fragmentu, c) lymfotoxinové mutanty, v nichž je 35 jeden nebo více aminokyselinových částí substituováno, vloženo nebo vynecháno, d) deriváty s methionylovou skupinou nebo s modifikovanou methionylovou skupinou (jako je například formylmethionylová skupina nebo jiné blokované methionylové skupiny) na aminovém konci, a/nebo e) neglykosylované nebo různě glykosylované typy všech předcházejících možností.

Jestliže savčí buňka je transformována nukleovou kyselinou, kódující lymfotoxin, která je odštěpitelné ligována na eukaryotický sekreční leader (signál) (včetně sekrečního signálu původního lymfotoxinu), nebo jestliže nukleová kyselina, která kóduje lymfotoxin, je odštěpitelné ligována ve vektoru na prokaiyotický nebo kvasinkový sekreční signál (leader), který je rozeznáván hostitelskou buňkou tak, že může být transformován (obvykle organismus, 45 z něhož byla signální sekvence získána), hostitel se vektorem transformuje, kultivuje a pak se lymfotoxiny s methionylovým aminovým koncem izoluji z kultury obvyklým způsobem.

Jestliže DNA, kódující lymfotoxin, je odštěpitelné ligována do vektoru bez sekreční signální sekvence a potom je použita pro transformaci hostitelské buňky, pak syntetizované lymfotoxiny 50 jsou na aminovém konci obvykle substituovány methionylovou skupinou nebo modifikovanou methionylovou skupinou, jako je například formylmethionylová skupina.

Byly získány postupy, podle nichž in vitro mutageneze nukleové kyseliny, která kóduje lymfotoxin, vede k expresi lymfotoxinových variant dříve nedostupných. Nejdříve dojde _5_ k expresi lymfotoxinu s methionylovou skupinou nebo s modifikovanou methionylovou skupinou na N-konci hostitelskou buňkou, transformovanou nukleovou kyselinou, kódující lymfotoxin, který je přímo expresován, tj. který není odštěpitelně vázán na sekreční signální sekvenci. Potom se po zavedení delece, substituce a/nebo inzerce do nukleové kyseliny, která kóduje lymfotoxin, 5 použije in vitro, místné specifická, předem stanovená nebo náhodná mutageneze. Tyto lymfotoxinové deriváty, získané expresí mutantní nukleové kyseliny, mají modifikované vlastnosti. A konečně se získávají nové typy lymfotoxinu jako neglykosylované nebo různě glykosylované lymfotoxiny. Neglykosylovaný lymfotoxin se vyrábí prokaryotickou expresí DNA, kódující lymfotoxin. Různě glykosylované typy lymfotoxinu jsou produktem 10 rekombinantní kultury v transformovaných vyšších eukaryotických, obvykle savčích, buňkách.

Lymfotoxin, který se zde vyrábí, se vyčistí od kultivačních supematantů nebo lyzátů imunoafinitní adsorpcí pomocí nesolubilizované lymfotoxin-neutralizující protilátky. Tato protilátka, která se nejefektivněji získává v monoklonální buněčné kultuře, vzniká v myších 15 imunizací lymfotoxinu adsorbovaného na kamenci (síranu hlinitodraselném).

Pro terapeutické použití se lymfotoxin podle tohoto vynálezu používá v kombinaci s fyziologicky neškodnými stabilizátory aexcipienty. Připravuje se ve sterilních dávkových formách, jako například lyofílizací, v dávkových nádobkách, nebo se skladuje ve stabilizovaných vodných 20 prostředcích. Pro implantaci do nádoru nebo do míst, z nichž byl nádor chirurgicky odstraněn, se používá lymfotoxin, obsažený v polymemí matrici. Tím se získá prostředek, který časem uvolňuje lymfotoxin, při čemž lymfotoxin je v daném místě lokalizován ve vysoké gradientově koncentraci. Terapeutické prostředky podle tohoto vynálezu se používají v terapeuticky efektivních dávkách implantačně, injekčně nebo infuzně živočichům, zvláště lidským pacientům, 25 s maligními nádory.

Obrázek la ukazuje DNA sekvenci a aminokyselinovou sekvenci, která se obecně pokládá za sekvenci, kódující lymfotoxinový fragment. Na obrázku lb je konstrukce syntetické DNA, kódující fragment na obrázku la. Obrázek 2a ukazuje úplnou aminokyselinovou sekvenci pro 30 pre-lymfotoxin ajejí kódující DNA plus 5' a 3' sousedící netranslované oblasti. Obrázek 2b ilustruje způsob konstrukce expresního vektoru lymfotoxinu s methionylovou a leucylovou skupinou na aminovém konci a jeho deriváty s methionylovou skupinou na aminovém konci. Obrázek 3 ukazuje způsob konstrukce expresního vektoru pro lymfotoxin s methionylovou a histidylovou skupinou na aminovém konci. Obrázek 4 popisuje aminokyselinové sekvence 35 lidského, myšího a hovězího lymfotoxinu a souhlasné části savčího lymfotoxinu. Obrázek 5a a obrázek 5b popisují konstrukci plazmidu, kódujícího spojení lymfotoxinu s bakteriální signální sekvencí.

Lymfotoxin je pro účely této přihlášky definován jako biologicky aktivní polypeptid, který má 40 oblast, představující podstatnou strukturní aminokyselinovou homologii s alespoň částí aminokyselinové sekvence lymfotoxinu, uvedené na obrázku 2a. Biologická účinnost je definována jako preferenční cytotoxická účinnost dále definovaná, imunologická zkřížená reaktivita s cytotoxickým lymfotoxinem nebo schopnost soutěžit s cytotoxickým lymfotoxinem o lymfotoxinové buněčné povrchové receptory. V posledních dvou příkladech nemusí být 45 lymfotoxin cytotoxický sám o sobě. Imunologicky zkřížené mutanty jsou užitečné jako imunogeny pro zvýšení anti-lymfotoxinu u zvířat, např. při přípravě činidel pro imunotesty, zatímco necytotoxické kompetitivní mutanty nacházejí použití jako značená reakční činidla v imunotestech kompetitivního typu pro biologicky aktivní lymfotoxin.

Preferenční cytotoxická účinnost je definována jako preferenční destrukce nebo inhibice růstu nádorových buněk in vivo nebo in vitro při srovnání s normálními buňkami za stejných podmínek. Destrukce nádorových buněk lyží in vitro nebo nekrózou in vivo je výhodným konečným bodem testu, i když je možno uspokojivě použít také cytostatické nebo antiproliferační vlastnosti. Vhodné testy pro detekci protibuněčných účinností lymfotoxinu jsou

-6CZ 283148 B6 popsány v následujících citacích: B. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem. 259(1). 686 až 691 (1984) a E. Carswell a spol: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72.3666 až 3670 (1975).

Lymfotoxinová specifická účinnost je zde definována spíše v termínech lyže cílové buňky než cytostáze. Jedna jednotka lymfotoxinu je definována jako množství, kterého je potřeba pro 50% lyži buněk, umístěných v každé jamce, jak bude dále popsáno v příkladu 1. Lze však použít i jiné způsoby stanovování cytotoxické účinnosti.

Pod pojmem podstatná strukturní homologie se obvykle míní, že více než asi 60 procent, obvykle více než 70 procent aminokyselinových zbytků v polypeptidů je shodných nebo zachovávají substituce odpovídajícím (odpovídajícími) zbytkem (zbytky) v sekvenci na obrázku 2a. Ne všechny sekvence lymfotoxinového polypeptidů potřebují být homologní se sekvencí na obrázku 2a. Je pouze třeba, aby byla s nějakou částí sekvence na obrázku 2a homologní pouze tak dlouhá část lymfotoxinového polypeptidů, aby získaný kandidát vykazoval požadovanou biologickou účinnost. Obvykle by homologie měla existovat pro oblasti od asi 20 do 100 aminokyselinových zbytků s tím, že pro maximální homologii může být zapotřebí zavést případné díry. Jestliže oblast homologní se sekvencí na obrázku 2a není některou z klíčových oblastí lymfotoxinu, tj. oblastí důležitou pro cytotoxickou účinnost, pak je pro polypeptid (aby ještě byl zahrnut v definici) požadována menší homologie. Za klíčové oblasti sekvence na obrázku 2a jsou považovány asi zbytky 162 až 171, 52 až 83 a 127 až 148.

Lymfotoxin je definován jako specifický lidský nádorový nekrózový faktor nebo jeho přírodní zvířecí analoga [D. Pennica a spol.: Nátuře 312, (20 až 27) (prosinec 1984), 724 až 729 aB. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem. 260(4), 2345 až 2354 (1985).].

Pojem strukturně podobný se vztahuje na dominantní vlastnosti aminokyselinových postranních řetězců, jako jsou například vlastnosti bázické, neutrální nebo kyselé, hydrofilní nebo hydrofobní anebo přítomnost či nepřítomnost sterické zábrany. Substituce jedné aminokyseliny za jinou, strukturně podobnou aminokyselinu, je odborníkům známa jako konzervativní substituce.

Významným faktorem, zajišťujícím identitu polypeptidů jako lymfotoxinu, je možnost antiséra, které je schopno v podstatě zneutralizovat cytolytickou účinnost v podstatě homogenního, lymfoblastoidního (nebo přírodního) lymfotoxinu a také v podstatě zneutralizovat cytolytickou účinnost příslušného polypeptidů. Je však třeba si uvědomit, že imunologická identita acytotoxická identita nejsou nutně koextenzivní. Neutralizující protilátka lymfotoxinu na obrázku 2a nemusí vázat příslušný protein, protože neutralizující protilátka je směrována k místu na lymfotoxinu, které pouze sousedí s oblastí, jež je rozhodující pro lymfotoxinovou cytotoxickou účinnost, ale které se účastní procesu jako neutralizující protilátka sterickou zábranou aktivního místa lymfotoxinu. Příslušný protein, mutovaný v této neškodné oblasti, by se nemusel dále vázat na neutralizující protilátku, byl by však lymfotoxinem v termínech podstatné homologie a biologické účinnosti.

Pro lymfotoxin, který byl získán kultivací lymfoblastoidních buněčných linií, byly stanoveny následující vlastnosti: molekulová hmotnost 20 000 nebo 25 000 podle stupně glykosylace aNterminální heterogenity; glykosylace na Asn +62 (obrázek 2a); tendence k agregaci, zvláště k organizování multimerů; izoelektrický bod asi 5,8; labilita na pH (ztráta více než 50 procent cytolytické aktivity po 24-hodinovém skladování v pufru hydrogenuhličitanu amonného při koncentraci 10 pg/ml při pH hladinách méně než asi 5 nebo více než asi 10); podstatná ztráta účinnosti po inkubaci ve vodném roztoku po dobu pěti minut při 80 °C. Podle molekulové hmotnosti byly identifikovány dva typy lymfoblastoidního lymfotoxinu. Typ lymfoblastoidního lymfotoxinu o molekulové hmotnosti 25 000 má na aminovém konci leucylovou skupinu. Polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence má molekulovou hmotnost 25 000, se nazývají lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci. Typ lymfoblastoidního lymfotoxinu

-7CZ 283148 B6 o molekulové hmotnosti 20 000 je charakteristický tím, že má na aminovém konci histidin. Odpovídající sekvence se pak nazývají lymfotoxin s histidylovou skupinou na aminovém konci. Je důležité, že tyto charakteristiky popisují nativní nebo divoký typ lidského lymfotoxinu, získaného z lymfoblastoidních buněčných kultur. Zatímco lymfotoxin zde definovaný zahrnuje 5 původní, glykosylovaný lymfotoxin, do rozsahu této definice mohou spadat i jiné podobné cytotoxické polypeptidy. Například glykosylace, obvykle spojená se zvířecím lymfotoxinem, může být modifikována při expresi v heterologní rekombinantní eukaryotické hostitelské buňce. Tím se získá modifikovaný lymfotoxin, jehož molekulová hmotnost nebo izoelektrický bod je mimo rozmezí, dané pro lidský lymfoblastoidní lymfotoxin. Lymfotoxin, který je úplně 10 neglykosylován, se vyrábí v rekombinantní bakteriální kultuře s molekulovou hmotností, izoelektrickým bodem a dalšími vlastnostmi, odpovídajícími modifikovanému. Post-translační procese pre-lymfotoxinu z prvých zvířecích typů v buněčné linii, která je odvozena od jiných zvířecích typů v buněčné linii, která je odvozena od jiných zvířecích druhů, může mít za výsledek jiné zbytky na aminovém konci, než je obvyklé u prvých zvířecích druhů. Podobně 15 i mutageneze, například, umožňuje měnit aminokyselinovou sekvenci aN-konec (N-terminus) lymfotoxinu, tím se modifikuje stabilita na pH, izoelektrický bod a podobné vlastnosti.

Překládaná aminokyselinová sekvence lidského lymfotoxinu je popsána na obrázku 2a. Povšimněme si, že tato sekvence zahrnuje presekvenci o 34 členech, o níž se předpokládá, že se 20 během procesu translatované transkripce v lidských buňkách odstraňuje (spolu se svými mutanty, prelymfotoxin), což vede ktomu, že se na aminovém konci tohoto typu objevuje leucylová skupina. Typ s histidylovou skupinou na aminovém konci je homologní s typem s leucylovou skupinou na aminovém konci až na to, že chybí prvních 23 aminokyselin z typu s leucylovou skupinou na aminovém konci. Všechny tři typy, tj. prelymfotoxin, lymfotoxin 25 s leucylovou skupinou na aminovém konci, rovněž tak jako methionylové, modifikované methionylové, mutantní a neglykosylované formy jsou zahrnuty v rozsahu pojmu lymfotoxin. Neglykosylované typy s leucylovou skupinou a s histidylovou skupinou na aminovém konci mají nižší molekulové hmotnosti než shora popsané homologní typy z lymfoblastoidních buněk.

Pre-lymfotoxin je typ lymfotoxinu, který je zahrnut v předcházející definici. Je charakterizován přítomností signálního (nebo leader) polypeptidu na aminovém konci molekuly. Nativní signální polypeptid lymfotoxinu se obvykle proteolyticky odštěpí z lymfotoxinu jako část sekrečního procesu, v němž je protein vylučován z buňky. Signální peptid může být mikrobiální nebo savčí (včetně nativního, presekvence se 34 zbytky), s výhodou je však signální peptid homologní 35 k hostitelské buňce. Některá spojení signál-lymfotoxin nejsou rozeznávána nebo procesována hostitelskou buňkou do lymfotoxinu bez met na N-konci. Taková spojení, obsahující mikrobielní signály, jsou užitečná, například jako lymfotoxinové imunogeny.

Poznamenejme, že výraz schopný nebo způsobilý cytotoxické aktivity znamená, že 40 lymfotoxin obsahuje polypeptidy, které mohou být převedeny, například enzymatickou hydrolýzou, z neaktivního stavu analogického zymogenu na polypeptidový fragment, který vykazuje žádanou biologickou aktivitu. Pojem schopný in vitro nebo in vivo cytotoxické aktivity je míněn tak, že zahrnuje necytotoxické polypeptidy, které mohou být převedeny, například enzymatickou hydrolýzou, z neaktivního stavu analogického zymogenu na 45 polypeptidový fragment, který vykazuje definovanou biologickou aktivitu. Tak inaktivní prekurzory budou spojené proteiny, ve ktetých je lymfotoxin vázán peptidovou vazbou na karboxylový konec jiného proteinu nebo polypeptidu. Sekvence na této peptidové vazbě nebo blízko ní je vybrána tak. aby byla citlivá na proteolytickou hydrolýzu, při níž se uvolní lymfotoxin, buď in vivo, nebo jako část výroby, in vitro. Typickými vazebnými sekvencemi jsou 50 lys-lys nebo arg-lys. Nelymfotoxinová složka, jako je například prolymfotoxin, je s výhodou homologní protein, takže minimalizuje imunogenicitu spojení. Homologní protein by měl být neškodný a neměl by se vázat na povrch buněk. Takto generovaný lymfotoxin pak bude vykazovat cytotoxickou účinnost, která je požadována definicí.

-8CZ 283148 B6

Zatímco lymfotoxin obvykle znamená lidský lymfotoxin, lymfotoxin z jiných zdrojů, například myši, vepřový, koňský nebo hovězí lymfotoxin také spadá pod definici lymfotoxinu, pokud jinak odpovídá standardům, které jsou shora popsány pro homologní oblasti a biologickou účinnost. Například bylo zjištěno, že hovězí a myší lymfotoxiny jsou značně (asi z osmdesáti procent) 5 homologní s lidským lymfotoxinem. Lymfotoxin není specifický typ, například lidský lymfotoxin je účinný na nádory a neoplastické buněčné linie u myší. Může tedy být lidský lymfotoxin nebo lymfotoxin z jednoho druhu použit v terapii jiného druhu živočicha.

Lymfotoxin zahrnuje také multimemí formy. Lymfotoxin spontánně agreguje do multimerů, obvykle do dimerů nebo vyšších multimerů. Multimery jsou toxické, podle toho jsou vhodné pro použití v terapii in vivo. V rekombinantních hostitelích dochází k expresi lymfotoxinu ve formě monomeru. Po vzniku má však lymfotoxin tendenci spontánně vytvářet multimery. Terapeuticky užitečné jsou homogenní multimery nebo směs různých multimerů.

Variantní lymfotoxiny zahrnují předem stanovené nebo cílené, tj. místně specifické, mutace molekuly z obrázku 2a nebo jiných fragmentů. Variantní lymfotoxiny jsou definovány jako polypeptidy, jinak odpovídající definovaným vlastnostem lymfotoxinu stím, že jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí, která se od sekvence na obrázku 2a liší buď vynecháním (delecí), substitucí nebo inzercí zbytků. Nelidské lymfotoxiny zde popsané a alely lidského lymfotoxinu jsou považovány za variantní lymfotoxiny, jelikož to jsou místně řízené mutanty, které nemají žádný přírodní protějšek. Cílem mutageneze je konstrukce takové DNA, která kóduje lymfotoxin shora uvedený, ale vykazující vlastnosti, které modifikují biologickou účinnost přírodního lymfotoxinu nebo usnadňují výrobu lymfotoxinu. Například mutací lysin +89 kodonu dojde k expresi histidinové skupiny v místě lysinové skupiny. Histidin +89 se už trypsinem (který obvykle štěpí vazby arg-X nebo lys-X proteinů) nehydrolyzuje. Očekává se, že proteázová rezistence poskytne mutantu větší biologický poločas, než je tomu v případě lymfotoxinu, který má sekvenci na obrázku 2a (nebo její fragment). Na histidin mohou být mutovány i jiné lysinové aarginové skupiny lymfotoxinu, například lysin +28, lysin +19 nebo arginin +15.

Jak bylo shora diskutováno, jisté oblasti molekuly lymfotoxinu vykazují podstatnou homologii s podobně aktivním proteinem, označeným jako nádorový nekrózový faktor. Aminokyselinové skupiny a bezprostředně sousedící tyto v podstatě homologní oblasti jsou výhodné pro mutagenezi, směrovanou k identifikace lymfotoxinových mutantů, které vykazují variantní 35 biologickou nebo cytotoxickou účinnost. Takové mutanty se připravují způsoby známými samy osobě a pak se testují na žádanou biologickou účinnost, například zvýšenou cytotoxicitu na novotvar nebo - v případě lymfotoxinových typů - jsou zamýšleny pro imunizaci zvířat, možnost získat mocnější imunní odpověď. Následují příklady takových variantních lymfotoxinů: ala +168 je mutován na aminokyselinu s větveným řetězcem (val, ile nebo leu), mezi thr +163 a val +164 40 je vložena hydrofobní aminokyselina (např. Val, ile nebo leu), thr +163 je substituován tyrosinem, ser +82 je substituován lysinem, ser +42 je substituován izoleucinem, leucinem, fenylalaninem, valinem nebo histidinem, lys +84 je substituován glutaminem, tryptofanem, serinem nebo histidinem, ser +82 je vynechán, na leu +171 je napojen hydrofobní di- nebo tripeptid, thr +163 je substituován asparagovou kyselinou nebo lysinem, mezi glu +127 a pro 45 +128 je vložen ala-lys, ser +70 je substituován lysinem nebo glycinem, thr +69 je substituován tyrosinem, lys +28 je substituován argininem nebo histidinem, his +32 je substituován argininem nebo lysinem, asp +36 je substituován prolinem, serinem threoninem, tyrosinem nebo glutamovou kyselinou, ser +38 je substituován tyrosinem, methioninem nebo glutamovou kyselinou, ser +61 je substituován threoninem, tyrosinem, histidinem nebo lysinem, gly +124 je 50 substituován asparagovou kyselinou, serinem nebo tyrosinem, his +135 je substituován argininem, lysinem, tyrosinem, tryptofanem nebo prolinem thr +142 je substituován asparagovou kyselinou a gin +146 je substituován lysinem nebo threoninem.

-9CZ 283148 B6

Zvláště žádoucí skupinou mutantů jsou ty mutanty, v nichž jsou vynechány methioninové skupiny +20, +120 a+133 v lidském lymfotoxinu nebo s výhodou jsou substituovány odpovídajícími skupinami, které se nacházejí v lymfotoxinech jiných typů, jako jsou například ty, které jsou popsány jinde v této přihlášce. Například met +20, +120 a +133 jsou substituovány 5 threoninem, serinem a valinem. Tyto aminokyseliny odpovídají skupinám v hovězím lymfotoxinu. Substituce se provádí způsobem, který je popsán v příkladu 9, až na to, že met +133 je mutován na val v dalším stupni mutageneze použitím fágu M13 Mp8 způsobem známým per se. Tato mutantní zvířecí hybridová lymfotoxinová DNA se používá místo DNA s leucylovou skupinou na aminovém konci (z příkladu 7) a expresuje se jako napojená. Známým postupem se ío bromkyanem štěpí signál STU z hybridního lymfotoxinu. Izoluje se maturovaný variantní lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci.

Jinými užitečnými variantními lymfotoxiny jsou takové lymfotoxiny, v nichž odpovídající skupiny lymfotoxinu jsou substituovány skupinami z nádorového nekrózového faktoru. Získají se 15 tak hybridní varianty nádorového nekrózového faktoru s lymfotoxinem. Reprezentativním příkladem je substituce prvních 8, 9 nebo 10 skupin maturovaného nádorového nekrózového faktoru (např. val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp) za prvních 27 skupin lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci. Tento variant je při přímé expresi v E.coli pravděpodobněji demethionylován naN-konci.

Zatímco místo mutace je předem stanoveno, není nutné, aby mutace sama byla předem determinována. Například při optimalizace přípravy mutantního lymfotoxinu s histidinem +89 se provádí náhodná mutageneze na kodonu pro lysin +89. Expresí se získají lymfotoxinové mutanty, které se testují na optimální kombinaci cytotoxické účinnosti a proteázové rezistence.

Lymfotoxin může obsahovat také inzerce, obvykle řádu asi od 1 do 10 aminokyselinových skupin, nebo delece asi 1 až 30 skupin. Pro konstrukci konečného plazmidu lze kombinovat substituce, delece, inzerce nebo jakékoliv jejich kombinace. Inzerce zahrnují také napojení na aminovém konci nebo na karboxylovém konci, např. hydrofobní rozšíření na karboxylovém 30 konci. S výhodou se však provádí jenom substituční mutageneze. Mutace v kódující DNA však zřejmě nesmí být umístěna v sekvenci čtecí oblasti a s výhodou nevytváří ani komplementární oblasti, které by mohly produkovat sekundární mRNA struktur. Extrakty vektorů transformované E.coli, které obsahují DNA kódující lymfotoxinové mutanty, které mají deleci posledních 16 aminokyselin na karboxylovém konci nebo prvních asi 33 skupin na aminovém konci 35 lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci, nevykazují žádnou cytotoxickou účinnost. Důvody pro chybějící účinnost však nejsou známy; mohou to být kterékoliv z těch důvodů, které jsou uvedeny v příkladu 1 níže.

Ne všechny mutace v DNA, která kóduje lymfotoxin, budou expresovány v konečném produktu 40 rekombinace buněčnou kulturou. Například hlavní skupinou DNA se substitučními mutacemi jsou takové DNA, v nichž sekreční leader (signál) na obrázku 2a byl substituován jiným sekrečním signálem, buď delecemi signálu o 34 skupinách nebo substitucí, která vymění většinu nebo celý původní signál, který má větší pravděpodobnost, že bude rozeznáván zamýšleným hostitelem. Například při konstrukci prokaryotického expresního vektoru je sekreční signál 45 z obrázku 2a vynechán ve prospěch signálu bakteriální alkalické fosfatázy nebo tepelně stabilního enterotoxinu II, u kvasinek signál z obr. 2a je substituován signálem kvasinkové invertázy, alfa faktoru nebo kyselinové fosfatázy. To však neznamená, že by lidský sekreční signál nebyl rozeznáván jinými hostiteli, než jsou lidské buněčné linie. Jestliže je sekreční signál rozeznáván hostitelem, pak napojený protein, sestávající z lymfotoxinu a signálu, je obvykle 50 štěpen na peptidové vazbě mezi signálem a lymfotoxinem při tom kroku, který vede k sekreci lymfotoxinu. I když je tedy mutantní DNA použita pro transformaci hostitele, výsledný lymfotoxin může být buď napojený nebo nativní lymfotoxin, což závisí na účinnosti hostitelské buňky v procesu napojení.

- 10CZ 283148 B6

Jinou větší skupinou DNA mutantů, která není expresována jako lymfotoxinové varianty, jsou nukleotidové substituce, které zvyšují expresi, primárně vynecháním spárovaných a nespárovaných (smyčkových) [stem and loop] ůseků v transkribované mRNA) viz doprovázející USA patentová přihláška 303 687, zahrnutá zde jako odkaz), nebo poskytují 5 kodóny, které jsou snadněji transkribovány vybraným hostitelem, např. dobře známé preferenční kodóny E.coli pro E.coli expresi.

Mutantní nukleová kyselina se připravuje způsoby, známými per se [A. Hui a spol.: The EMBO Joumal 3(3), 623 až 629 (1984), J. Adelman a spol.: DNA 2(3), 183 až 193 (1983), anglická 10 patentová přihláška 2 130 219A, G. Winter a spol.: Nátuře 299, 756 až 758 (1982) a R. Wallace a spol.: Nucleic Acids Research 9(15). 3647 až 3656 (1981).]. Tyto způsoby zahrnují mutagenezi fágu M13, syntézu mutantního lymfotoxinového genu, jak je popsána v příkladu 1 a v dalších příkladech, nebo jiné způsoby, které jsou nebo budou známé odborníkům.

Nukleovou kyselinou, která kóduje lymfotoxin, je jakákoliv DNA nebo RNA sekvence, která kóduje polypeptid, který je v rámci zde uvedené definice lymfotoxinu, ať už její nukleotodové sekvence odpovídají nebo neodpovídají sekvencím, nalezeným v přírodě. Navíc, nukleová kyselina spadá do rozsahu zde uvedeného, to jest schopnosti hybridizace za alespoň nízkoselektivních podmínek na nukleovou kyselinu, kódující lymfotoxin, i když hybridizující nukleová kyselina nekóduje protein, který jinak vyhovuje požadavkům na lymfotoxin. Příkladem posledního by mohla být zkouška, že (díky krátké délce polypeptidu, který kóduje) není schopná exprese biologicky aktivního lymfotoxinu. Nukleová kyselina, kódující lymfotoxin, nebo hybridizovatelná, se vyrábí organickou syntézou způsobem, který je v podstatě uveden v příkladu 1, nebo se získává z přírodních zdrojů vyzkoušením genomových nebo cDNA knihoven, jak je 25 uvedeno v příkladech.

Lymfotoxin podle tohoto vynálezu se připravuje obvykle postupem, při němž se hostitel transformuje vektorem, který nese nukleovou kyselinu, kódující žádaný lymfotoxin. Vektorem je konstrukce replikabilní DNA. Vektory jsou používány pro amplifikaci DNA nebo pro expresi 30 DNA, která kóduje lymfotoxin. Expresním vektorem je konstrukce DNA, v níž sekvence DNA, kódující lymfotoxin, je odštěpitelně spojena s vhodnou regulační sekvencí, schopnou uskutečnit expresi lymfotoxinu ve vhodném hostiteli. Mezi takové regulační sekvence patří transkripční promotor, případná operátorová sekvence pro regulaci transkripce, sekvence, kódující vhodná ribosomální vazebná místa mRNA, a sekvence, které regulují terminaci transkripce a translace.

Vektorem může být plazmid, virus (včetně fága) nebo integrovatelný fragment DNA, tj. fragment, který je integrovatelný do hostitelova genomu rekombinací. Jakmile se jednou transformuje do hostitele, vektor se replikuje a funguje nezávisle na hostitelském genomu, nebo se v některých případech může do jeho genomu integrovat. V této přihlášce jsou někdy pojmy 40 plazmid a vektor používány vzájemně zaměnitelně, jelikož plazmid je v současné době nejobvykleji používanou formou vektoru. Avšak všechny další formy vektorů, které mají stejnou funkci a které jsou nebo budou známé odborníkům z odborné literatury, jsou vhodné i pro použití zde.

Vhodné vektory obsahují replikon a kontrolní sekvence, které jsou odvozeny od typů, slučitelných s hostitelem zamýšlené exprese. Transformované hostitelské buňky jsou takové buňky, které byly transformovány nebo transfektovány lymfotoxinovými vektory, konstruovanými pomocí techniky rekombinantní DNA. Transformované hostitelské buňky pravidelně expresují lymfotoxin. Expresovaný lymfotoxin se buď ukládá intracelulámě, nebo se sekretuje do periplazmového prostoru nebo kultivačního supematantu, což závisí na vybrané hostitelské buňce.

Oblasti DNA jsou odštěpitelně napojeny (jestliže mezi nimi existuje funkční vztah) mezi sebou. Například DNA presekvence nebo sekvenčního signálu jsou odštěpitelně napojeny na DNA

- 11 CZ 283148 B6 u polypeptidů, jestliže je expresována jako preprotein, který participuje při sekreci polypeptidů;

promotor je odštěpitelně napojen na kódující sekvenci, jestliže kontroluje transkripci sekvence;

nebo vazebné místo ribosomu je odštěpitelně napojeno na kódující sekvenci, jestliže je umístěno tak, že dovoluje translaci. Odštěpitelně navázán obvykle znamená styčný a v případě sekrečních signálů styčný a ve čtecí formě.

Vhodnými hostitelskými buňkami jsou prokaryoty, kvasinky nebo vyšší eukaryotické buňky. Mezi prokaryoty patří gramnegativní nebo grampozitivní organismy, například E.coli nebo Bacilli. Mezi vyšší eukaryotické buňky patří buněčné linie savců připravené tak, jak bude dále 10 popsáno. Výhodnou hostitelskou buňkou je kmen E.coli W3110 (ATCC 27 325), rezistentní na fágy, který je popsán v příkladech, i když vhodné jsou i jiné prokaryoty, jako je například E.coli B, E.coli X1776 (ATCC 31 537), E.coli 294 (ATCC 31 446), typy Pseudomonas nebo Serratia Marcesens.

Výhodný pro expresi lymfotoxinu je systém prokaryotický hostitel - vektor. Mnoho vhodných mikrobiálních vektorů je dostupných. Mikrobiální vektor obvykle obsahuje počátek replikace, rozeznávaný zamýšleným hostitelem, promotor, který bude fungovat v hostiteli, a fenotypický selekční gen, například gen, kódující proteiny, propůjčující antibiotickou rezistenci nebo dodávající auxotrofní požadavek. Pro jiné hostitele se sestavují podobné konstrukce. E.coli se typicky transformuje plazmidem pBR322, plazmidem odvozeným od typu E.coli [E. Bolívar aspol.: Gene 2, 95 (1977).]. Plazmid pBR322 obsahuje geny ampicilinové atetracyklinové rezistence, čímž je dostupný snadný prostředek pro identifikaci transformovaných buněk.

Expresní vektory musí obsahovat promotor, který je rozpoznáván hostitelským organismem, ale nikoliv klonujícími vektory. Promotor je obvykle homologní k zamýšlenému hostiteli. Mezi promotory, které se nejobecněji používají při konstrukci rekombinantní DNA, patří βlaktamázový (penicilinázový) a laktózový promotorový systém [Chang a spol.: Nátuře 275, 615 (1978) a Goeddel a spol.: Nátuře 281, 544 (1979).] a tryptofanový promotorový systém (trp) [Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) a přihlášková publikace evropského patentového úřadu 36 776.] a tac-promotor [H. De Boer a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 21 až 25 (1983).]. I když tyto promotory jsou nejčastěji používány, vhodné jsou i jiné známé mikrobiální promotory. Podrobnosti, týkající se jejich nukleotidových sekvencí, které byly publikovány, umožňují zručnému pracovníkovi odštěpitelně je ligovat na DNA kódující lymfotoxin v plazmidových vektorech [Siebenlist a spol.: Cell 20, 269 (1980.).] a DNA kódující lymfotoxin. V dnešní době je výhodným vektorem derivát pBR322, obsahující promotor E.coli alkalické fosfatázy s trp Shine-Dalgamo sekvencí. Promotor a Shine-Dalgamo sekvence jsou odštěpitelně napojeny na DNA, kódující lymfotoxin, tj. jsou situovány tak, aby podporovaly transkripci lymfotoxinové mRNA z DNA.

Vedle prokaryotů se vektory, kódujícími lymfotoxin, transformují také eukaryotické mikroby, jako jsou například kvasinkové kultury. Saccharomyces cerevisiae, neboli obyčejné pekařské kvasnice, jsou nejobecněji používané nižší eukaryotické hostitelské mikroorganismy, i když je běžně dostupno mnoho jiných kmenů. Kvasinkové vektory obvykle obsahují počátek replikace z dvoumikronového kvasinkového plazmidu nebo samostatně se replikující sekvenci (ARS), promotor, DNA kódující lymfotoxin (včetně lidského pre-lymfotoxinu), sekvence pro polyadenylaci a terminaci transkripce a selekční gen. Vhodným plazmidem pro expresi lymfotoxinu v kvasinkách je plazmid YRp7 [Stinchcomb aspol.: Nátuře 282, 39 (1979), Kingsman aspol.: Gene 7, 141 (1979) aTschemper aspol.: Gene 10, 157 (1980).]. Tento plazmid již obsahuje trpí gen, který poskytuje selekční znak (markér) mutantnímu kmeni kvasinek, který nemá schopnost růst v tryptofanu, například ATCC č. 44 076 nebo PEP4-1 [Jones: Genetics 85, 12 (1977).]. Přítomnost oblasti trpí v genomu kvasnicové hostitelské buňky tak poskytuje účinné okolí pro detekci transformace růstem za nepřítomnosti tryptofanu.

- 12CZ 283148 B6

Mezi vhodné promotorové sekvence v kvasinkových vektorech patří promotory pro metalothionein, 3-fosfogIycerátkinázu [Hitzeman a spol.: J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980).] a jiné glykolytické enzymy [Hess a spol.: J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968) aHolland a spol. Biochemistry 17, 4900 (1978).], jako jsou například enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát5 dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát-dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukózo-6-fosfátisomeráza, 3-fosfoglycerát-mutáza, pyruvátkináza, triosofosfát-izomeráza, fosfoglukózoizomeráza a glukokináza. Vhodné vektory a vhodné promotory pro použití při expresi kvasinkami jsou dále popsány R. Hitzemanem a spol.: Publikace evropského patentového úřadu č. 73 657. Jinými promotory, které mají další výhodu transkripce regulované podmínkami růstu, 10 jsou promotor oblastí alkohol-dehydrogenázy 2, izocotychrom C, kyselinová fosfatáza, degradativní enzymy, spojené s metabolizmem dusíku, shora uvedený metalothionein a glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenáza a také enzymy, které jsou zodpovědné za využití maltózy a galaktózy. Při konstrukci vhodných expresních plazmidů se terminační sekvence, spojené s těmito geny, také ligují do expresního vektoru 3' sekvence kódujících lymfotoxin. Tím 15 se zajistí polyadenylace mRNA a terminace.

Vedle mikroorganismů mohou být jako hostitelé také použity kultury buněk, které jsou odvozeny od mnohabuněčných organismů. Ty však nejsou výhodné, neboť až dosud byly s mikroby, které expresi poskytují lymfotoxin, získány vynikající výsledky. V principu lze pracovat s jakoukoliv 20 kulturou vyšších eukaryotických buněk, ať už jde o kulturu obratlovců nebo nikoliv. Největší zájem se soustřeďuje na buňky obratlovců. V posledních letech se množení buněk obratlovců v kultuře (tkáňová kultura) stalo rutinní záležitostí [Tissue Culture, Academie Press, ed. Kruše aPatterson, 1973]. Příklady užitečných hostitelských buněčných linií jsou buňky VĚRO aHeLa buňky, buněčné linie vaječníků čínského křečka a buněčné linie WI38, BHK, COS-7 aMDCK. 25 Expresní vektory pro tyto buňky obsahují obvykle (jestliže je to nutné) počátek replikace, promotor, který je umístěn proti směru genu, který má být získán expresí, spolu s ribosomovým vazebným místem, místo střihu RNA (jestliže se používá intron obsahující genomová DNA), polyadenylační místo a transkripční sekvence terminace.

Transkripční a translační regulační sekvence v expresních vektorech, které jsou určeny pro použití u transformovaných buněk obratlovců, se často získávají z virových zdrojů. Tak například používané promotory jsou obvykle odvozeny od Polyoma, Adenovirus 2 a nejvýhodněji od typu Simian Virus 40 (SV40). Tyto promotory jsou zvláště užitečné, protože se snadno získávají z viru jako fragment, který obsahuje také SV40 virový počátek replikace 35 [Fiers a spol.: Nátuře 273, 113 (1978).]. Lze použít také menší nebo větší SV40 fragmenty za předpokladu, že obsahují sekvenci o přibližně 250 párech nukleotidů (párech bází) od místa Hind III k místu Bgl I, umístěnou ve virovém počátku replikace. Dále je také možné a často žádoucí využít lidský genomový promotor, řídicí a/nebo signální sekvence, obvykle spojené s lymfotoxinem, za předpokladu, že takové řídicí sekvence jsou slučitelné se systémy 40 hostitelských buněk.

Počátek replikace se může získat buď konstrukcí vektoru, který by zahrnul exogenní počátek, jako například takový, který lze odvodit od SV40 nebo od jiného virového zdroje (napr. Polyoma, Adenovirus, VSV nebo BPV), nebo se může získat replikačním chromozomálním 45 mechanismem hostitelské buňky. Jestliže je vektor integrován v chromozomu hostitelské buňky, pak je často druhá možnost postačující. Transformací vyšších eukaryotických buněk lidskou prelymfotoxinovou DNA se připraví lymfotoxin s methionylovou skupinou na aminovém konci.

Při výběru výhodné hostitelské savčí buňky pro transfekci vektorů, které obsahují DNA sekvence, kódující jak lymfotoxin, tak dihydrofolát-reduktázu (DHFR), je vhodné vybrat hostitele podle toho, jaký typ DHFR proteinu se použije. Jestliže se používá DHFR protein divokého typu pak je výhodné vybrat takovou hostitelskou buňku, která je deficitní na DHFR; to umožní použít DHFR kódující sekvence jako markéru pro úspěšnou trasfekci do selektivního média s nedostatkem hypoxanthinu, glycinu a thymidinu. V tomto případě je patřičnou

- 13CZ 283148 B6 hostitelskou buňkou buněčná linie vaječníků čínského křečka, deficitní na DHFR aktivitu, která se připraví a namnoží způsobem, popsaným Urlaubem a Clasinem: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA)

77. 4216 (1980). Naopak, jestliže se jako řídicí sekvence použije DNA kódující DHFR protein s nízkou vazebnou afinitou k methotrexátu (MTX), pak není nutné používat buňky, rezistentní na

DHFR. Jelikož mutantní DHFR je rezistentní na MTX, lze použít médium, obsahující MTX jako prostředek selekce za předpokladu, že hostitelské buňky samy jsou na MTX citlivé. Většina eukaryotických buněk, které jsou schopny absorbovat MTX, jsou citlivé na methotrexát. Jednou z takových užitečných buněčných linií je linie CHO, CHO-K.1 (ATCC č. CCL 61).

ío Transformované hostitelské buňky jsou takové buňky, které byly transformovány nebo transfektovány lymfotoxinovými vektory, zkonstruovanými technikami rekombinantní DNA. Transformované hostitelské buňky obvykle expresují lymfotoxin. Expresovaný lymfotoxin se obvykle ukládá intracelulámě.

Lymfotoxin z rekombinantní kultury nesekretujících buněk se izoluje lyží buněk a odstraněním částečkovitého materiálu odstředěním nebo podobným způsobem. Buňky, které vylučují lymfotoxin, se od kultivačního supematantu oddělí odstřeďováním. Kontaminovaný roztok s lymfotoxinem se pak vyčistí způsoby shora popsanými, nebo imunoafinitně podle toho, jak je to pospáno níže v příkladu 4. Lymfotoxin se vyčistí do stupně, který je vhodný pro 20 farmakologické použití. Vyčištěný lymfotoxin se umístí do konvenčních dávkových forem, např. fiol nebo injekcí. Používá se směs variantních lymfotoxinů, např. směs cytotoxických mutantních lymfotoxinů. Lymfotoxin se pro dlouhodobé skladování lyofilizuje. Může se také skladovat ve vodných roztocích se stabilizátory a excipienty, například v izotonických solných roztocích. Pacientům se lymfotoxin podává způsobem, který popsal B. Aggarwal a spol.: Evropská 25 patentová přihláška 100 641.

Lymfotoxinové prostředky se podávají živočichům, kteří mají nádory. Způsob podávání je shodný se známými způsoby podávání, např. intravenózně, intraperitoneálně, podkožně, intramuskulámě, vnitřní infuzí nebo injekcí sterilních roztoků lymfotoxinů, a nebo lze použít 30 i níže popsaného systému s pomalým uvolňováním lymfotoxinů. Lymfotoxin se podává do místa poškození, tj. přímo injekcí do pevných nádorů. V případě rozsetých nádorů, jako je například leukémie, je výhodné podávat lymfotoxin intravenózně nebo do lymfatického systému. Nádory orgánů v břišní dutině, jako je například rakovina vaječníků, se s výhodou léčí intraperitoneálně infuzí použitím prostředků pro peritoneální dialýzu atomu odpovídajících roztoků. Obvykle se 35 však lymfotoxin podává kontinuálně infuzí, i když je přijatelné i podávání bolus injekcí. Je žádoucí, aby byl lymfotoxin podáván ve formě implantovatelných prostředků, které jej pomalu uvolňují. Příklady vhodných systémů pro proteiny, které mají molekulovou hmotnost, odpovídající dimerům nebo trimerům lymfotoxinů, jsou kopolymery L-glutamové kyseliny a gama ethyl-L-glutamátu [V. Sidman a spol.: Biopolymers 22(1), 547 až 556 (1983).], poly-(240 hydroxyethyl-methakrylát) [R. Langer a spol.: J. Biomed. Mater. Res. 15, 167 až 277 (1981) anebo v ethylen-vinylacetátu [R. Langer a spol.: Chem. Těch. 12. 98 až 105 (1982).] tamtéž.]. Prostředky, obsahující lymfotoxin, se implantují do míst, z nichž byly nádory chirurgicky odstraněny. Lymfotoxin se také používá v polopropustných mikrotobolkách nebo liposomech pro injekční podání do nádoru. Tento způsob podávání je zvláště užitečný u chirurgicky 45 neodstranitelných nádorů, např. u mozkových nádorů.

Množství lymfotoxinů, které se při podávání používá, závisí například na způsobu podávání, na typu nádoru a na stavu pacienta. Bude nutné, aby terapeuti stanovili dávku a modifikovali způsob podávání tak, jak je žádoucí pro získání optimální cytotoxické účinnosti na cílový nádor; to lze 50 stanovit například biopsii nádoru nebo diagnostickými testy na údajné rakovinné znaky, jako je například karcinoembryonní antigen, z pohledu jakékoliv rekombinantní toxicity ve zvýšené dávce. Dávkování rekombinantního lymfotoxinů u myší v dávkách od 50 do 200 pg/kg tělesné

- 14CZ 283148 B6 hmotnosti/den při intravenózním podávání je obvykle v podstatě netoxické a účinné in vivo. Režim dávkování se bude zřejmě u různých zvířat lišit.

Podle této přihlášky byl objeven způsob získávání protilátky, neutralizující lymfotoxin.

Neutralizující protilátka je definována jako protilátka, která je schopna imunologicky vázat lymfotoxin (takový lymfotoxin, který je definován ve smyslu této přihlášky) takovým způsobem, že v podstatě sníží jeho účinnost v testech cytostatické nebo cytolytické účinnosti lymfotoxinu, jako je například dále popsaný test myšího L929. Skutečnost, že protilátka je schopna zneutralizovat účinnost lymfotoxinu však neznamená, že se protilátka musí vázat přímo na 10 aktivní lymfotoxin nebo na receptorové vazebné místo. Protilátka může ještě v podstatě neutralizovat účinnost lymfotoxinu i tehdy, jestliže se stericky naváže na oblast, která sousedí s kritickým místem, tj. sousedí se míní ve smyslu konformačního sousedství a nikoliv nutně z hlediska sousedství v aminokyselinové sekvenci.

Při pokusech přípravy neutralizující protilátky (monoklonální) proti lymfotoxinu se ukázalo, že je obtížné imunizovat myši tak, aby se ve zvířatech vytvářela nebo aby se zvýšila hladina protilátky, neutralizující lymfotoxin. Ani imunizace lymfoblastoidním lymfotoxinem ani lymfotoxinem zkříženě svázaným s glutaraldehydem nevedla k vytvoření jakéhokoliv detekovatelného množství neutralizující protilátky v séru imunizovaných myší, i když se 20 nezvýšilo množství ne-neutralizující anti-lymfotoxinové protilátky, detekovatelné enzymovým imunotestem. Avšak imunizace s adsorpčním komplexem: lymfotoxin - oxid hlinitý (AI2O3.3H2O) vedle ke zvýšení neutralizující protilátky, i když před imunizací tímto komplexem získání jakékoliv aktivity u zvířat bylo neúspěšné. Příprava oxidu hlinitého a jeho použití při výrobě antiséra je popsána v Methods in Immunology and Immunochemistry I, strana 197 až 25 229, ed. C. Williams a spol. (1967).

Buňky ze sleziny ze zvířat, produkujících neutralizující protilátky, byly spojeny s buňkami myšího myelomu. V průměru muselo být testováno 50 až 100 klonů, aby se získal jeden klon, který syntetizuje neutralizující protilátku. Způsob testování klonů na žádanou účinnost je rutinní 30 záležitost, dobře známá zručným odborníkům, která je dobře reprodukovatelná s minimálním experimentálním úsilím.

Lze zde použít sérum, plazmu nebo IgG frakce z imunizovaných zvířat, stejně jako imunoglobuliny, sekretované hybridomy, generovanými ze slezinových nebo lymfatických buněk 35 imunizovaných zvířat. Ve výhodném uspořádání se neutralizující protilátka získá v podstatě čistá bez dalších antilymfotoxinových protilátek z hybridomové kultury.

Neutralizující protilátka se imobilizuje adsorpcí na povrchu, např. termoplastů, jako je například polystyren, nebo se kovalentně naváže na matrice, jako je například Sepharosa, aktivovaná 40 bromkyanem. Potom se použije pro imunotesty nebo pro imunoafmitní čištění. Jelikož protilátka je neutralizující protilátkou, používá se pro adsorpcí nebo detekci biologicky účinného lymfotoxinu nebo jeho fragmentů. Protilátka je zvláště užitečná v imunoradiometrických (sandwich) imunotestech s ne-neutralizující antilymfotoxinovou monoklonální protilátkou nebo polyklonálním antisérem, které obsahuje ne-neutralizující protilymfotoxin. Imunotest se 45 provádí tak, že se jako značená složka používá buď neutralizující nebo neneutralizující protilátka. Značení se provádí nějakou detekovatelnou sloučeninou, jako je například fluorescenční, chemiluminiscenční nebo radioizotopové označení způsoby, známými z odborné literatury. Pro lymfotoxinové imunotesty kompetitivního typu se lymfotoxin označí stejným způsobem. Pro přípravu jak lymfotoxinu, tak lymfotoxinové protilátky se značeným atomem, je 50 vhodná radiojodace chloraminem T nebo způsob, který popisuje J. Klostergaard a spol.: Mol. Immun. 18, 455 (1980).

Pro zjednodušení příkladů bude nyní na některé často se vyskytující způsoby odkazováno krátkými vysvětleními.

- 15CZ 283148 B6

Plazmidy jsou označovány malým p, za kterým následují velká písmena a/nebo číslice. Výchozí plazmidy, používané v tomto popisu, jsou komerčně dostupné, jsou veřejně dostupné bez jakýchkoliv restrikčních omezení, nebo je lze z takových dostupných plazmidů publikovanými způsoby zkonstruovat. Vedle toho jsou v odborné literatuře známé ekvivalentní plazmidy, jak je zřejmé normálnímu odborníkovi.

Pojem štěpení DNA se týká katalytického štěpení DNA enzymem, který působí na jistých místech v DNA. Takové enzymy se nazývají restrikční enzymy. Místa, na která jsou tyto enzymy specifické, se nazývají restrikční místa. Pojem částečné štěpení znamená neúplné rozštěpení restrikčním enzymem, tj. štěpení probíhá za takových podmínek, že některá místa (ne všechna) v DNA substrátu jsou štěpena danou restrikční endonukleázou. Různé restrikční enzymy, které se zde používají, jsou komerčně dostupné. Při jejich používání se postupovalo podle návodu dodavatelů enzymů, pokud jde o reakční podmínky, katalyzátory a další požadavky. Restrikční enzymy jsou obvykle označeny zkratkami, které se skládají z velkého písmena, po němž následuje další písmeno (písmena) a potom obvykle číslo, reprezentující mikroorganismus, z něhož byl restrikční enzym původně získán. Obvykle se pracuje s asi 1 mikrogramem plazmidů nebo fragmentu DNA a asi 1 jednotkou enzymu v asi 20 μΐ pufrovaného roztoku. Množství příslušných pufrů a substrátů pro ten který restrikční enzym jsou dána výrobcem. Obvykle se pracuje při inkubační době asi 1 hodinu při teplotě 37 °C, ale oboje se může měnit podle instrukcí dodavatelů. Po inkubaci se protein odstraní extrakcí fenolem a chloroformem a štěpená nukleová kyselina se z vodné fáze izoluje vysrážením ethanolem. Po štěpení restrikčním enzymem následuje někdy hydrolýza terminálního 5' fosfátu bakteriální alkalickou fosfatázou, aby se zabránilo tomu, a by se restrikčně rozštěpené konce fragmentu DNA zcirkularizovaly, nebo aby vytvořily uzavřenou smyčku, což by pak překáželo inzerci jiného fragmentu DNA do restrikčního místa. Pokud není jinak uvedeno, nenásleduje po štěpení plazmidů defosforylace na 5' konci. Pro defosforylaci se používají konvenční postupy a činidla [T. Maniatis a spol.: Molecular Cloning, str. 133 až 134 (1982).].

Pojem izolace daného fragmentu DNA z restrikčního štěpení znamená, že se rozštěpená část oddělí elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, fragment, o který se zajímáme, se identifikuje srovnáním jeho pohyblivosti s fragmenty označené DNA o známé molekulové hmotnosti, odstraní se sekce gelu, která obsahuje žádaný fragment a gel sám se oddělí od DNA. Tento postup je všeobecně známý. Viz například R. Lawn a spol.: Nucleic Acids Res. 9, 6103 až 6114 (1981) a D. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).

Southemova analýza je způsob, kterým je přítomnost sekvencí DNA v rozštěpené části nebo v prostředku, obsahujícím DNA, potvrzena hybridizací na známý fragment značeného oligonukleotidu nebo DNA. Southemova analýzy bude znamenat rozdělení rozštěpených fragmentů na 1% agaróze, denaturaci a přenesení na nitrocelulózu způsobem podle E. Southema: J. Mol. Biol. 98, 503 až 517 (1975) ahybridizaci tak, jakji popsal T. Maniatis a spol.: Cell 15, 687 až 701 (1078).

Pojem transformace znamená zavedení DNA do organismu tak, že DNA je schopna replikace, a to buď jako mimochromozomální prvek, nebo jako integrální Část chromozomu. Pokud není jinak uvedeno, pak způsob, použitý v této přihlášce pro transformaci E.coli, je způsob s chloridem vápenatým podle Mandela a spol.: J. Mol. Biol. 53, 154 (1970).

Pojmem ligace se označuje tvoření fosfodiesterových vazeb mezi dvěma fragmenty dvouvláknové nukleové kyseliny (T. Maniatis a spol.: tamtéž str. 146.). Pokud není jinak uvedeno, provádí se ligace za použití známých pufrů a za známých podmínek s deseti jednotkami T4 DNA ligázy (ligáza) a 0,5 pg přibližně ekvimolámích množství fragmentů DNA, které mají být ligovány.

- 16CZ 283148 B6

Pod pojmem příprava DNA z transformantů se rozumí izolace plazmidové DNA z mikrobiální kultury. Pokud není jinak uvedeno, může se použít alkalický /SDS způsob podle Maniatise a spol.: tamtéž, str. 90.

Pojem oligonukleotidy znamená krátké jednovláknové nebo dvouvláknové polydeoxynukleotidy, které se chemicky syntetizují podle způsobu, uvedeného v citaci v příkladu 1, načež se vyčistí na polyakrylamidových gelech.

Všechny citace literatury jsou zde výslovně zahrnuty jako odkazy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čištění a sekvenování lymfotoxinu

Lidská lymfoblastoidní buněčná linie RPMI-1788 (ATCC č. CCL-156) se nechá růst v patnáctilitrové vibrující baňce do buněčné hustoty 4.10⁵ buněk/ml za použití bezsérového kultivačního média (RPMI-1640). Lymfotoxin byl indukován 10 až 20-krát (na 500 až 1000 jednotek lymfotoxinu na mililitr; stanoveno níže popsaným způsobem) nad základní hladiny přidáním 20 ng/ml myristan-acetátu forbolu v bezsérovém médiu RPMI-1640. Po 65 hodinách kultivace se buňky odfiltrují, lymfotoxinová účinnost ve filtrátu se absorbuje na koloně (5 cm x 20 cm) se skleněnými kuličkami o kontrolované velikosti pórů (Electronucleonics), ekvilibruje se 5 mM fosfátového pufru (pH 7,4) a eluuje se 50% ethylenglykolem v 5 mM fosfátového pufru (pH 7,4). Pro inhibici mikrobiálního růstu se do všech pufrů během čištění přidá roztok 0,1 mM fenylmethyl-sulfonyl-fluoridu (PMSF), inhibitoru proteázy a 1 mM azidu sodného. Eluát ze skleněných kuliček obsahoval 84 000 jednotek lymfotoxinu na mg proteinu. Následovala chromatografie na DEAE celulóze, chromatografie na Sepharose lektinu z čočky a preparativní nativní PAGE, jak popisuje B. Aggarwal a spol.: J. Biol. Chem. 259(1), 689 až 691 (1984). Homogenita proteinu, odpovědného za cytotoxickou účinnost, byla stanovena SDS-PAGE, HPLC na koloně s Lichrosorbem RP-18 na obrácených fázích a aminoterminální sekvenací.

Tento lymfotoxinový přípravek obsahoval více než 95 hmotnostních procent lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci s molekulovou hmotností přibližně 25 000 na SDSPAGE. Teoretická hmotnost (molekulová hmotnost) proteinové složky s leucylovou skupinou na N-konci je 18 664. Zbývajících přibližně 6500 se připisuje glykosylovanému postrannímu řetězci na Asn +62 a snad i dalším cukerným zbytkům, navázaným přes atom kyslíku. Supematant tkáňové kultury obsahoval údajné multimery tohoto typu (molekulová hmotnost 60 000 podle TSK.-HPLC nebo 64 000 podle chromatografie na Sephadexu G-100).

Zbývajících 5 procent lymfotoxinové směsi byly typy s histidylovou skupinou na N-konci s molekulovou hmotností asi 20 000. Oba typy vykazovaly v podstatě tutéž cytolytickou aktivitu, alespoň v rámci omezení dále popsaného testu lyže vyšších fibroblastových buněk.

Trypsinové štěpeni původních molekul lymfotoxinu poskytlo pouze několik fragmentů. Lymfotoxin s histidylovou skupinou na aminovém konci byl rozštěpen mezi aminokyselinami v poloze 89 a 90 na dva fragmenty. Totéž štěpení lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci poskytlo štěpením mezi polohami 15 a 16, 19 a 20 a 89 a 90 čtyři fragmenty.

Mikrosekvenací Edmanovou degradační technikou byly získány informace o sekvenci molekuly a také o produktech, získaných trypsinovým štěpením.

- 17CZ 283148 B6

Další informace o sekvenci byly získány z fragmentů lymfotoxinu, připravených štěpením karboxypeptidázou P, chymotrypsinem, kyselinou octovou a bromkyanem. Tímto způsobem byla stanovena téměř úplná sekvence lidského lymfotoxinu. Bylo určeno 156 sousedících zbytků na aminovém konci. Z těchto sekvenčních informací vyplynulo, že rozdíl mezi těmito dvěma typy je v přítomnosti 23 zbytků na aminovém konci v typech s leucylovou skupinou na aminovém konci, přičemž tyto zbytky nebyly nalezeny v typech s histidylovou skupinou na aminovém konci. Prokázat přítomnost karboxylové terminální sekvence za prvními třemi zbytky je obtížné, protože v této oblasti jsou přítomny peptidové vazby a protože zbytky mají hydrofobní povahu.

Byl navržen syntetický gen, který by kódoval sekvenci proteinu v rozsahu daném mikrosekvenováním. Navržený protein s výhodou obsahuje obvykle výhodné kodóny E.coli. To znamená, že vzácně používané kodóny E.coli nebyly v sekvenci použity. Pokud nebyla zřejmá výhodnost kodónu E.coli, pak byly použity lidské výhodné kodóny. Touto výhodností se 15 dosáhlo exprese v E.coli a také toho, že syntetický gen by mohl být užitečný jako sonda k identifikaci přírodní DNA sekvence z knihoven lidských cDNA nebo z genomových knihoven. Pro konstrukci fragmentů a pro další manipulaci s genem byla navržena pro sekvenci restrikční místa Xbal, BamHI, HindlU a BglII.

Padesát osm původních oligomerů, které byly navrženy pro syntetický lymfotoxinový gen, bylo syntetizováno fosforitanovou metodou v pevné fázi podle M. Matteucciho a spol.: J. Amer. Chem. Soc. 103, 3185 až 3190 (1981) aS. Beaucageho a spol.: Tetr. Letters 22, 1859 až 1862 (1981). Velikost těchto oligomerů se pohybovala mezi 16 a 20 bázemi (viz obrázek la). Oligomery se překrývaly v délce 6 bází. Celý sestavený gen je uveden na obrázku lb. Gen byl zkonstruován ze tří oddělených částí. První část, segment A, měl délku 117 párů nukleotidů a představoval 5' kódující oblast aminového konce s leucylovou skupinou na aminovém konci. Segment B, který měl délku 145 párů nukleotidů, představuje DNA kódující střední část lymfotoxinové molekuly. O segmentu C o délce 217 párů nukleotidů se předpokládá, že kóduje až na 16 aminokyselinových zbytků celý karbonylový konec lymfotoxinu. Oligomery, které byly potřebné pro syntézu každého segmentu, byly vyčištěny elektroforézou a spojeny. Aby chyby při syntéze byly co nejmenší, byly vybrány oligomery o relativně malé velikosti (tj. 16 až 20 párů nukleotidů).

Každá skupina oligomerů byla fosforylována v reakci, která obsahovala 20 mM Tris-HCl 35 (pH7,5), 10 mM chloridu hořečnatého, 20 mM dithiothreitolu, 0,5 mM ATP a 15 jednotek

T4 polynukleotid.kinázy v objemu 50 μΐ. Reakce obsahovala přibližně 50 pmol každého oligomerů. Po 30 minutách při teplotě 37 °C byla aktivita kinázy zničena zahřátim na 65 °C. Směs se nechala během jedné hodiny pomalu ochladit na 20 °C. Fosforylované oligomery byly ligovány přidáním 10 jednotek T4 DNA ligázy. Reakce se nechá probíhat dvě hodiny při 20 °C.

DNA ligáza se zahřátim dezaktivuje. Ligované oligomery se štěpily tři hodiny při 37 °C restrikčními endonukleázami, které rozeznávají navržená koncová místa [např. Xbal a BamHI u segmentu A). Fragmenty každého segmentu se izolují elektroforézou na sedmiprocentním polyakrylamidovém gelu. Pro každý segment se identifikují vybarvením ethidium-bromidem fragmenty o přesné pohyblivosti a elektroeluují se z gelu. Plazmid pFlFtrp69 [D. Goeddel a spol.: Nátuře 287, 411 až 416 (1980) nebo Crea a spol.: evropská patentová přihláška 0 048 970.] se rozštěpí působením Xbal a BamHI. Elektroforézou na 6% polyakrylamidovém gelu se izoluje velký vektorový fragment. Do fragmentu pFIFtrp69 se liguje asi 50 ng segmentu A. Podobné se segment B liguje do plazmidu pBR322, rozštěpeného BamHI a HindlII, a segment C do plazmidu pLeIFA-125-1, rozštěpeného působením HindlII a BglII [D. Goeddel a spol.: Nucleic Acids Research 8, 4057 až 4073 (1980).]. Ligační reakční směsi se transformují do E.coli ATCC 31 446. Výsledné rekombinantní plazmidy se charakterizují analýzou restrikčními endonukleázami a sekvenováním DNA metodou chemické degradace podle Maxama a Gilberta. Pět ze šesti klonů segmentů A obsahovaly žádanou sekvenci. Byly izolovány čtyři

- 18CZ 283148 B6 plazmidy ze segmentu B a čtyři plazmidy ze segmentu C a všechny tyto inzerty měly správné sekvence. Každý segment byl izolován rozštěpením restrikčními endonukleázami, které rozeznávaly koncová místa a potom byly ligovány do plazmidového vektoru pFIFtrp69, rozštěpeného působením Xbal aBglII. Výsledný rekombinantní plazmid pLTXBl byl 5 charakterizován sekvenováním vloženého fragmentu Xbal-BglII, který obsahoval sekvenci, uvedenou na obrázku 1 a.

Pro stanovení toho, zda syntetický gen bude skutečně produkovat biologický účinný lymfotoxin, se E.coli transformanty nechají růst v minimálním médiu za podmínek dereprese trp promotoru ío a exprese genu syntetického lymfotoxinu. Kultury se nechají růst do optické hustoty 1,0 při

550 nm a izolují se odstředěním. Buněčné pelety se suspendují v jedné desetině objemu, načež se lyžují sonikací.

Aktivita lymfotoxinu se stanoví modifikovaným testem buněčné lyže podle B. Spofforda: 15 J. Immunol. 112. 2111 (1974). Ve stručnosti - myší fibroblastové buňky L-929 se nechají růst na mikrotitrovacích destičkách za přítomnosti aktinomycinu D. Po 12 až 18 hodinách se do každé jamky přidá 0,125 ml seriálově zřeďovaného roztoku, který se testuje na lymfotoxin. Po 18 hodinách se destičky promyjí. Lyže buněk, indukovaná lymfotoxinem, se stanoví obarvením destiček 1% roztokem krystalové violeti ve směsi methanolu s vodou (v poměru 1 : 4, objemové 20 díly). Intenzita zabarvení byla pozorována jak vizuálně, tak spektrometricky při 450 nm a 570 nm pomocí spektrofotometru Dynatech. U buněk, které byly do mikrotitrovací jamky vysety jenom společně s kultivačním médiem, došlo k 0% lyži, zatímco u buněk, které byly vysety spolu s roztokem 3M hydrochloridu guanidinu, byla v konečném stadiu pozorována 100% lyže. Jedna jednotka lymfotoxinu je definována jako množství lymfotoxinu, kterého je potřeba k lyži 50 % 25 buněk z 12 000 buněk, vysetých do každé jamky. Poznamenejme, že lze použít také jiné testy cytotoxické účinnosti. Viz například: B. Aggarwal a spol. v Thymic Hormones and Lymphokines, ed. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington University Medical Center, 1983 (buněčná linie A549, která je v tomto materiálu citovaná, je dostupná z ATCC pod označením CCL185). Kultivační lyzáty nevykazovaly ve shora popsaném 30 testu na myších buňkách žádnou cytotoxickou účinnost. Kontrolní lyzáty z kultur, které expresi poskytují gama interferon, neobsahují gama interferonovou aktivitu. Z tohoto výsledku lze usoudit, že syntetický gen nekóduje aktivní lymfotoxin. Pro to existuje několikero vysvětlení. Například: 1) E.coli degraduje lymfotoxin, 2) gen lymfotoxinu se netranskribuje v E.coli, 3) lymfotoxinová informace se nepřenáší do E.coli, 4) protein nemá patřičnou sekvenci díky 35 chybě v sekvenci proteinu, nebo 5) sekvence 16 zbytků na karboxylovém konci nebo její část je skutečně nutnou podmínkou pro účinnost příslušné konfigurace molekuly lymfotoxinu.

Příklad 2

Postup získání cDNA, kódující lymfotoxin

RNA se izoluje z kultury neadherentní buněčné frakce lymfocytů lidské periferní krve po 48 hodinách od indukce myristát-acetátem forbolu (10 ng/ml), stafylokokovým enterotoxinem B 45 (1 pg/ml) athymosinem a-1 [S. Berger aspol.: Biochemistry 18, 5143 až 5149 (1979).]. Tato kultura produkuje aktivitu 400 jednotek lymfotoxinu na mililitr supematantu. mRNA se zkoncentruje adsorpcí na imobilizovaný oligodT, eluuje se a cDNA se připraví reverzní transkripcí [P. Gray a spol.: Nátuře 295, 503 až 508 (1982).]. Pro přípravu cDNA kopie mRNA standardními způsoby se použije reverzní transkriptáza. Druhé vlákno se připraví (také 50 standardními způsoby) Klenowovým zpracováním. cDNA se zpracuje s S-l nukleázou, čímž se odstraní vlásenková smyčka. Po vložení této cDNA do vektoru se konce ligují k adaptéru nebo linkeru, takže se vytvoří 5' a 3' místa pro restrikční enzymy nebo s výhodou kohezivní konce pro

- 19CZ 283148 B6 místa předem stanovených restrikčních enzymů. Pro tento účel byl použit oligonukleotid

5' HO-AATTCATGCGTTCTTACAG

GTACGCAAGAATGTC-P 5’.

Oligonukleotid se liguje k cDNA. cDNA se reizoluje elektroforézou z polyakrylamidového gelu. Obecně dostupný fág XgtlO (nebo jeho vpodstatě ekvivalent, fág Xgtll, který je dostupný z ATCC) se rozštěpí působením EcoRI. Izoluje se lineární fragment [M. Wickens a spol.: J. Biol. Chem. 253, 2483 až 2495 (1978).]. Napojený reverzní transkript a štěp XgtlO se ligují. Ligační směs se použije pro transfekci E.coli C-600 nebo jiného známého hostitele, podléhajícího infekci fágu λ. Na 15 cm desku se vyseje přibližně 10 000 rekombinantních fágů, které se testují nízkoselektivní hybridizační metodou přes jednotlivé plaky [T. Maniatis a spol.: Cell 15, 687 až 701 (1978) aP. Grey a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 80, 5842 až 5846.] za použití ³²Pznačené sondy, připravené ze segmentu A na obrázku la způsobem podle J. Taylora a spol.: Biochem. Biophys. Acta 442, 324 až 330 (1976), v němž se používají DNA primery telecího brzlíku (PL Biochemicals). Duplikátní nitrocelulózové filtry se hybridizují nízkoselektivní metodou sondou (5.10⁷ impulzů za minutu) ve 20% formamidu. Filtry se promyjí dvakrát 0,3M chloridem sodným, 0,03M citranem sodným a 0,1% roztokem dodecylsulfonátu sodného (SDS) při 37 °C.

Sondou byly hybridizovány dva fágy; fágy byly přečištěny přes jednotlivé plaky. Vyčištěné fágy se hybridizovály jak sondou segmentu A, tak sondou, připravenou ze segmentu B. cDNA inzerty ze dvou hybridizováných fágů, XLTl aXLT2, byly subklonovány do M13mp8 asekvenovány dideoxy-řetězovou terminační metodou [A. Smith: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 (1980).]. Inzert ve ŽLT2 obsahoval pouze asi 600 párů nukleotidů a neobsahoval celou 3' kódující oblast lymfotoxinu. Inzert v XLTl obsahoval úplnou kódující oblast lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci, spolu s 650 páry nukleotidů 3' netranslované oblasti (obsahující souhlasný polyadenylační signál) akodóny pro 18 koncových aminokyselin na leucylovém konci. Jelikož to není kódující oblast celého lymfotoxinu, byla z cDNA inzertu LT1 připravena další sonda, značená ³²P, a použita k testování dalších 25 000 rekombinantních fágů XgtlO při vysoké selektivitě (viz T. Huynh a spol. v Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press, Oxford, 1984.). Bylo izolováno 12 dalších hybridizovaných fágů. Sekvence nejdelšího inzertu z XLTl 1 je uvedena na obrázku 2a. Nejdelší otevřená čtecí oblast byla translatována, a to počínaje prvním pozorovaným ATG. Čísla nad řádkou označují polohu aminokyseliny, čísla pod řádkou označují polohu nukleotidu. Leucylový zbytek, který je označen 1, znamená první zbytek, sekvenovaný z lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci (obr. la) a také první zbytek z aminového konce maturovaných typů lymfotoxinu. Prvních 34 zbytků reprezentuje signální sekvenci. Zbytky 156 až 171 nebylo možné určit sekvenací lymfotoxinu, byly však odvozeny od sekvence nukleotidů.

Příklad 3

Konstrukce expresního vektoru hybridního syntetického genu /přírodní cDNA pro lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci/

Tato konstrukce je uvedena na obrázku 2b. Plazmid pLTXBl (obsahující neaktivní syntetický gen) se částečně rozštěpí působením EcoRI a Pstl. Izoluje se fragment o 685 párech nukleotidu, který obsahuje DNA, kódující 125 zbytků na N-konci lymfotoxinu. Fragment byl dále částečně rozštěpen účinkem Pstl, protože na zbytku 10 (obrázek la) existuje další Pstl místo. Fragment se 301 párem nukleotidů, který obsahuje DNA, kódující 51 aminokyselinu lymfotoxinu na C-konci, byl izolován po rozštěpení subklonované cDNA z fágu XLTl působením EcoRI a Pstl (tato místa jsou uvedena na obrázku 2a: polohy nukleotidů 554 a 855). Tyto fragmenty se izolují elektroforézou na 5% polyakrylamidu a elektroelucí. Tyto fragmenty byly ligovány do plazmidu

-20CZ 283148 B6 pBR322, který se rozštěpí působením EcoRI a defosforyluje bakteriální alkalickou fosfatázou. Tím se sníží množství vedlejších tranformantů. Výsledný expresní plazmid byl charakterizován, pokud jde o příslušnou orientaci a sekvenci, štěpením restrikční endonukleázou a sekvenováním DNA. Lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci byl expresován transformací 5 E.coli 31446 plazmidem pLTtrpí s kultivací transformantů v prostředí, které obsahovalo tetracyklin, po dobu 4 až 6 hodin při teplotě 37 °C do dosažení optické hustoty 1,0. Buněčné lyzáty obsahovaly cytotoxickou účinnost. Bylo zjištěno, že aminový konec s leucylovou skupinou expresovaných lymfotoxinů je substituován blokovaným methionylovým zbytkem. Předpokládá se, že produktem této syntézy je spíše formyl-methionylový než methionylový typ.

Příklad 4

Imunoafinitní vyčištění lymfotoxinu

Myší monoklonální buněčná linie, sekretující antilymfotoxin (příklad 8), byla vyčištěna od kapaliny ascitů chromatografií na iontoměniči. Eluát z anexu byl zpracován se Sepharosou, aktivovanou bromkyanem v koncentraci 2 mg/ml pryskyřice. Kolona o objemu 20 ml byla ekvilibrována postupně TBS (obsahujícím 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M chloridu sodného 20 a 2 mM ethylendiaminotetraoctové kyseliny), potom eluována pufrem (obsahujícím 0,1 M kyseliny octové, pH = 4,5, 150 mM chloridu sodného) s konečně TBS. Sraženina, která se získá vysrážením (40% nasyceným síranem amonným) sonikovaného lyzátu E.coli, transformované pLTtrpí (předem vyčeřeného odstřeďováním), se suspenduje v 0,1 M Tris-HCI, pH 7,4 a 5 mM ethylendiaminotetraoctové kyseliny a naplní se do kolony rychlostí jeden objem kolony za jednu 25 hodinu. Následuje intenzivní promývání TBS, který obsahuje 0,05 % Tweenu 80. Elucí pufrem se eluoval specificky navázaný materiál. Okamžitě bylo upraveno pH na hodnotu 7,8 přidáním 0,1 objemu 1M Tris-HCl, pH 8,5, a roztok skladován při 4 °C. Specifická aktivita takto vyčištěného lymfotoxinu byla 2 až 10.10⁷ jednotek/mg (měřeno shora uvedeným testem na myším L-929).

Eluát, který obsahoval největší část aktivity, byl nanesen na kolonu. Většina proteinu byla eluována jako jediný pás za jak redukujících, tak neredukujících podmínek elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu. Pohyblivost tohoto pásu odpovídá molekulová hmotnosti přibližně 18 000, cožje v souhlasu s předpověděnou hodnotou 18 664 pro neglykosylovaný 35 lymfotoxin s leucylovou skupinou na aminovém konci podle odvozené aminokyselinové sekvence. Pro další charakterizování jeho biologické účinnosti byl vyčištěný rekombinantní lymfotoxin testován in vitro na cytolytickou účinnost a in vivo na protinádorovou účinnost.

Příklad 5

Biologická účinnost rekombinantního lymfotoxinu in vivo

Rekombinantní a lymfoblastoidní lymfotoxin byl testován testem nekrózy nádoru in vivo.

Sarkomy MethA(a) byly kultivovány 7 až 10 dnů v přecitlivělých myších [BLAB/c x 057Bl/6fl nebo CD6fl]. Přímo do nádorů byl pak injekčně podán lymfotoxin z příkladu 4, lymfoblastoidní lymfotoxin (připravený a vyčištěný jak shora popsáno) nebo kontrolní vzorek. Po 20 až 24 hodinách byly myši usmrceny, nádory odstraněny a histologicky zjištěn rozsah nekrózy. Jak je uvedeno v tabulce 1, jak rekombinantní, tak lymfoblastoidní lymfotoxin způsoboval značnou 50 nekrózu sarkomu MethA(a) in vivo. Kontrolní vzorky nezpůsobovaly nekrózu sarkomů MethA(a).

-21 CZ 283148 B6

Tabulka 1

Nekróza sarkomu MethA(a) in vivo působením rekombinantního a přírodního lymfotoxinu podáváno:_______________________________________počet myší s nekrózou sarkomu +++ ++ + kontrolní pufr 1 lymfoblastoidní lymfotoxin 25 000 jednotek lymfoblastoidní lymfotoxin 10 000 jednotek rekombinantní lymfotoxin 200 000 jednotek rekombinantní lymfotoxin 25 000 jednotek rekombinantní lymfotoxin 10 000 jednotek kontrolní pufr 2

2 2-

- -1

-1

Lymfoblastoidní lymfotoxin byl podáván injekčně rozpuštěný v pufru 1 (0,001 M Tris-HCl, 0,05 M uhličitanu amonného, pH 8,0). Rekombinantní lymfotoxin byl podáván injekčně rozpuštěný v pufru 2 (0,15 M chloridu sodného, 0,1 M octanu sodného a 0,1 M Tris-HCl o pH 7,8).

Zdá se, že nepřítomnost cukru na rekombinantním lymfotoxinu neovlivňuje biologickou účinnost, jelikož specifická účinnost lymfotoxinu, produkovaného rekombinantní kulturou (2 až 10.10⁷ jednotek na mg), je přibližně stejná jako u lymfoblastoidního lymfotoxinu (4.10⁷ jednotek na mg).

Účinnost rekombinantního lymfotoxinu je termolabilní, podobně jako účinnost přírodního lymfotoxinu, tj. po zahřátí jednu hodinu na 80 °C dochází k inaktivaci vodného roztoku.

Příklad 6

Konstrukce expresního vektoru pro lymfotoxin s methionylovou a histidylovou skupinou na aminovém konci

Konstrukce plazmidu, která řídí expresi lymfotoxinu s methionylovou a histidylovou skupinou na aminovém konci v E.coli, je znázorněna na obrázku 3. Syntetický oligonukleotid byl vložen do expresního plazmidu tak, aby kódoval iniciační methioninový kodón, přilehlý k histidylovému kodónu lymfotoxinu s histidylovou skupinou na aminovém konci (zbytek 24 na obrázku 2a). Ten byl získán izolací vektorového fragmentu o 4630 párech nukleotidů z plazmidu pLTtrpl štěpením Xbal aClal, preparativní elektroforézou na 1% agarosovém gelu a elektroelucí. BamHI-Clal fragment o 570 párech nukleotidů, který obsahuje většinu sekvence, kódující lymfotoxin, byl také izolován z plazmidu pLTtrpl stejným způsobem. Způsoby shora uvedenými byly syntetizovány dva syntetické oligonukleotidy a smíchány s oligonukleotidy 6, 7, 52 a 53 z obrázku la. Přibližně 50 pmol každého oligonukleotidu bylo zpracováno s polynukleotidkinázou, jak je to popsáno v příklad 1. Oligonukleotidy byly anelovány a potom ligovány se směsí BamHI-Clal fragmentu o 570 párech nukleotidů a Xbal-Clal vektorového fragmentu o 4630 párech nukleotidů. Ligační směs byla transformovaná do E.coli ATCC 31446. Rekombinanty byly vybrány na základě rezistence na tetracyklin. Plazmid p20KLT byl izolován z jednoho z transformantů. Plazmid p20KLT byl charakterizován restrikčním enzymem a sekvenční analýzou DNA.

-22CZ 283148 B6

Příklad 7

Příprava cytotoxické lymfotoxinové napojené varianty

Plazmid, který obsahuje DNA, kódující napojení lymfotoxinu na bakteriální protein, byl zkonstruován klonováním sekvence, která kóduje bakteriální signální sekvenci, přilehlou k strukturnímu genu lymfotoxinu. Byla charakterizována sekvence genu tepelně stabilního enterotoxinu II (ST II) z E.coli [R. N. Picken a spol.: Infection and Immunity 42, 269 až 275 10 (1983).]. Sekvence kóduje signální sekvenci o 23 aminokyselinách, která řídí sekreci STU do periplazmového prostoru E.coli.

Plazmid pWM501 [Picken a spol.: Infection and Immunity 42( 1), 269 až 275 (1983).] obsahuje gen tepelně stabilního enterotoxinu (STII). Část DNA, která kóduje gen STII, byla izolována 15 zplazmidu pWM501 následujícím postupem: Plazmid pWM501 se rozštěpí působením Rsal.

Izoluje seframnet DNA o 550 párech nukleotidů. Tento fragment se liguje s fágem M13mp8 [J. Messing a spol.: Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam, str. 143 až 153 (1981).], který byl před tím rozštěpen působením Smál. Ligovaná DNA se použije pro transformaci E.coli JM101, komerčně 20 dostupného kmene pro použití s fágem MI3. Izolují se jasné plaky. Z E.coli JM101, infektované tímto fágem, se standardními postupy [J. Messing a spol.: viz citace] izoluje dvouvláknový M13mp8 STII Rsa derivát. Použitím právě popsaného subklonování M13mp8 se nyní pomocí míst různých restrikčních endonukleáz naváže fragment o asi 550 párech nukleotidů, který obsahuje signální gen STII. Derivát M13mp8 STII Rsa se pak rozštěpí působením EcoRI 25 a Pstl. Izoluje se tak DNA fragment nepatrně větší než 550 párů nukleotidů.

Fragment EcoRI-Pstl byl subklonován do plazmidu pBR322. To bylo provedeno tak, že plazmid pBR322 byl rozštěpen působením EcoRI a Pstl. Izoluje se vektor. Tento izolovaný vektor byl ligován s EcoRI-Pstl fragmentem DNA. Tato směs DNA se použije pro transformaci E.coli 30 ATCC 31446. Vyberou se kolonie, které jsou rezistentní na tetracyklin. Plazmid byl izolován z rezistentní kolonie E.coli a označen jako částečný pSTII.

Částečný pSTII se rozštěpí účinkem Mnll aBamHI. Byly izolovány: fragment o 180 párech nukleotidů, obsahující STII Shine-Dalgamo sekvenci, signální sekvenci STII a prvních 30 35 kodonů maturovaného genu STII. Fragment o 180 párech nukleotidů se liguje s plazmidem, který obsahuje trp promotor. Jeden takový plazmid, plazmid pHGH207-l, byl již dříve v literatuře pospán [H. de Boer a spol.: Promotores: Structure and Function, ed. R. Rodriguez a spol.; Chamberlin, Praeger Pub., New York, NY, str. 462 až 481 (1982).]. V tomto případě byl použit derivát tohoto plazmidu, plazmid pHGH207-l⁺, v němž EcoRI místo 5' ktrp promotoru bylo 40 převedeno na EcoRI⁺ doplněním DNA polymerázou I (DNA poli) a připojením zarovnaných konců ligací [S. Cabilly a spol.: Proč. Hati. Aacad. Sci. (USA) 81, 3273 až 3277 (1984).]. Plazmid, který obsahuje trp promotor, byl rozštěpen působením Xbal, zpracován s DNA poli a čtyři dNTP doplnily přečnívající sekvenci. DNA preparát byl rozštěpen působením BamHI. Izoluje se fragment, který obsahuje vektor. Tento vektorový fragment se pak liguje se shora 45 izolovaným DNA fragmentem, který obsahuje signál STII o 180 párech nukleotidů. Ligační směs se použije pro transformaci E.coli ATCC 31446 na ampicilinovou rezistenci. Plazmid, který je označen jako signál STII (STII-leader), se izoluje z kolonie, rezistentní na ampicilin.

Fág M13, který obsahuje sekvence, kódující STII, se nejdříve zkonstruuje ligací fragmentu Xbal50 BamHI o 180 párech nukleotidů ze signálu pSTII do ml3mpl0, rozštěpeného působením Xbal a BamHI. Výsledná fágová DNA, pSTII-pro více hostitelů, byla charakterizována analýzou restrikčními endonukleázami a sekvenováním nukleotidů. LT kódující sekvence byly pak zavedeny do tohoto vektoru ligací fragmentu Hpal-EcoRI o 700 párech nukleotidů z pLTtrpl s replikativní formou (RF, dvouvláknová) DNA pSTII pro více hostitelů, štěpené Smal-EcoRI.

-23 CZ 283148 B6

Obě místa Smál i Hpal mají zarovnané konce ajsou spolu ligována (z toho vyplývá ztráta obou míst). Výsledná fágová DNA, M13-STII-LT, se charakterizuje a pak se použije pro mutagenezi následujícím způsobem: primer 5' p CAAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG se zpracuje s kinázou, za přítomnosti ligasového pufru se smíchá stemplátem (M13-STII-LT) aM13mplO 5 RF DNA, rozštěpenou působením Xbal-EcoRI [pro podporu primeru jak popisuje J. P. Adelman a spol.: DNA 2, 183 až 193 (1983).]; směs se zahřeje na 95 °C, nechá se anelovat třicet minut za teploty místnosti a pak se umístí na třicet minut na led. Potom se přidají všechny čtyři deoxynukleotid-trifosfáty spolu sATP, T4 DNA ligázou a velkým fragmentem (Klenowovův fragment) E.coli DNA polymerázy I. Směs se inkubuje jednu hodinu při 14 °C. Pak se použije io pro transfekci kompetentní E.coli JM101, komerčně dostupného kmene, nebo jiného hostitele fágu M13. Správně hybridizovaný fág byl identifikován hybridizačním testováním za použití primeru, označeného ^{30 * 32}P, jako sondy. Výsledný fág ST-LT-mut byl charakterizován sekvenční analýzou DNA. Z tohoto fágu se připraví replikativní forma DNA. Ta se použije pro izolaci DNA, obsahující fragment Xbal-EcoRI o 761 páru nukleotidů pro signální sekvenci STII, 15 přilehlou ke kódující sekvenci lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém konci. Tato

DNA se liguje s p20KLT, rozštěpeným působením Xbal a BamHI (velký vektorový fragment o 4285 párech nukleotidů), a fragmentem plazmidu pBR322, rozštěpeným působením EcoRI a BamHI (o 375 párech nukleotidů). Výsledný plazmid pST18LT byl charakterizován restrikčním zmapováním a sekvenací DNA. Podobná konstrukce se připraví tak, že se zakóduje 20 napojení STII signálu na aminovém konci na histidinový zbytek lymfotoxinu s histidylovou skupinou na aminovém konci. Výsledné plazmidy se tranformují do E.coli ATCC 31446. Izolují se plazmidy pSTLT18 apSTLTló. Analýzou restrikčními enzymy a dideoxy-sekvenací bylo potvrzeno, že kódují napojení STII. E.coli, transformovaná plazmidem pSTLT18 nebo pSTLT16, syntetizuje napojení signální sekvence STII a lymfotoxinu s leucylovou skupinou na aminovém 25 konci a s histidylovou skupinou na aminovém konci, což je v souhlasu s vypočtenou molekulovou hmotností (podle gelové elektroforézy). E.coli lyzáty, které obsahují toto napojení peptidů, vykazují cytotoxickou aktivitu.

Příklad 8

Způsob přípravy monoklonální myší protilátky, schopné neutralizovat lymfotoxin

Vyčištěný lymfoblastoidní lymfotoxin, který se získá v příkladu 1, se dialyzuje proti solnému 35 roztoku, pufrovanému fosforečnanem (PBS). Dialyzát obsahoval 200 pg lymfotoxinu na ml.

K dialyzátu se přidá tolik glutareldehydu, aby jeho koncentrace byly 70 mM. Směs se inkubuje 2 h za teploty místnosti, přidá se další glutaraldehyd do koncentrace 140 mM a v inkubaci se pokračuje dalších 6 hodin. Směs se pak dialyzuje proti PBS. Směs 50 pg lymfotoxinu, zkříženě navázaného na glutaraldehyd (zde nazývaný polylymfotoxin), a 0,5 ml Freundova úplného 40 adjuvantu se podá injekčně myším (kmen BALB/c). Po 1 týdnu byly myši imunizovány druhou injekcí, obsahující 50 pg polylymfotoxinu a 0,5 ml Freundova neúplného adjuvantu, polovina byla podána intramuskulámě, druhá polovina do peritoneální kavity. Po sedmi dnech bylo izolováno sérum. Sérum se testuje na antilymfotoxinovou účinnost testem ELISA. Test ELISA se provádí následujícím způsobem: Pufrovaný roztok vyčištěného lymfotoxinu se umístí do 45 mikrotitrovacích jamek. Každá jamka se pokryje asi 100 ng lymfotoxinu. Roztok, který se neadsorbuje do jamek, se odebere. Příslušné zředěný testovaný roztok (50 pl) se spojí 100 pl PBS, který obsahuje 5 mg/ml hovězího sérumalbuminu (PBS-BSA pufr), směs se přidá do každé jamky, inkubuje se dvě hodiny za teploty místnosti, promyje se PBS, obsahujícím 0,05 % Tweenu 20, do každé jamky se přidá 100 pl křenovou peroxidázou označeného antimyšího 50 kozího IgG v PBS-BSA pufru a inkubuje se jednu hodinu. Každá jamka se promyje PBS, který obsahuje 0,05 % Tweenu 20, potom se do každé jamky přidá citráto-fosforečnanový pufr (pH 5), obsahující 0,1 mg o-fenylendiaminu na ml (substrátový roztok), a vodný 30% peroxid vodíku [v dávce 4 pl 30% peroxidu vodíku (objemové díly) na 10 ml substrátového roztoku]. Jamky se

-24CZ 283148 B6 inkubují třicet minut. Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 2,5M kyseliny sírové. Změří se absorbance při 492 nm. Jamky, které vykazují absorbanci větší než 1 (optická hustota), byly považovány za účinné proti lymfotoxinu.

Testované vzorky byly testovány také na schopnost neutralizovat cytolytickou aktivitu lymfotoxinu v testu na myších L 929. Sérum, které se získá z imunizovaných zvířat nebo hybridomových supematantů, se zředí (podle potřeby) médiem RPM1-1640, které obsahovalo 10% fetálního (plodového) hovězího séra a asi 100 lymfotoxinových jednotek na mililitr a vyseje se do mikrotitrovacích jamek, které obsahují kultivované buňky L929, jak je obvyklé io v cytolytických testech. U kontrolních byly všechny buňky lyžovány. Neutralizující protilátka byla prokázána tím, že nedošlo k lyži buněk L929 účinkem lymfotoxinu.

U zvířat, která byla imunizována lymfotoxinem, zpolymerovaným s glutaraldehydem, došlo ke zvýšení protilátek, které byly aktivní v testu ELISA. Nebylo však zjištěno žádné sérum, které by 15 mělo neutralizující účinnost.

Pro imunizace stejných myší byla použita suspenze, která obsahuje 100 pg lymfotoxinu a 1 ml

1,64% (hmotností díly : objemovým dílům) suspenze hydroxidu hlinitého. Myším bylo injekčně podáno 100 μΐ suspenze intramuskulámě a 400 μΐ intraperitoneálně. Po jednom týdnu bylo 20 myším intravenózní injekcí podáno 10 pg nezpolymerovaného a neadsorbovaného lymfoblastoidního lymfotoxinu ve 100 μΐ pufru PBS. Testováním zvířecího séra (se zředěním 1/80) o tři dny později byla prokázána přítomnost protilátky, neutralizující lymfotoxin. Těmto zvířatům byly odebrány sleziny. 3.10⁷ buněk sleziny se spojí s 5.10⁷ buněk myšího myelomu a vysejí se do mikrotitrovacích jamek, které obsahují médium HAT a asi 3000 peritoneálních makrofágů na 25 mikrotitrovací jamku, podle postupu, popsaného S. Fazekasem a De St. Grothem: J. Immunol.

Methods 35, 1 až 21 (1980). Hybridomy ze supematantu jamek, které byly pozitivní ve shora uvedeném testu ELISA, byly kultivovány v 1 ml média DMEM s 20 % fetálního telecího séra, 10% média NCTC-135, 3.10'⁵ M β-merkaptoethanolu a HAT, rozděleny do mikrotitrovacích jamek podle statistického průměru jedna buňka na jamku a kultivovány v jednom nebo pěti 30 mililitrech stejného média. Supematanty se po kultivaci testují na neutralizující protilátku.

Neutralizující protilátka byla syntetizována asi 2 % (statisticky) hybridomy (pozitivními v testu ELISA) z imunizace hydroxidem hlinitým. Z této skupiny hybridomů se popřípadě vybere protilátka s vysokou afinitou na lymfotoxin.

Příklad 9

Místně specifická mutageneze lymfotoxinu

V tomto příkladu se postupuje přesně podle způsobu z příkladu 3 s tím, že segment 6 syntetického oligonukleotidu byl modifikován tak, že obsahuje sekvenci 5' CTCAACTCTGCACCCA 3' ajeho doplňkové vlákno (segment 53) bylo modifikováno na sekvenci 3' AGACGTGGGTCGTCGT 5’. Modifikované oligonukleotidy se anelují se zbývajícími oligonukleotidy a pak se ligují do expresního vektoru způsobem, popsaným 45 v příkladu 6. Tento vektor obsahuje substituce 2 párů nukleotidů, které změnily lysin+28 v kodónu na histidin. Po transformaci E.coli 31446 dojde k expresi histidinového mutantu.

Jiné místně řízené mutanty se připravují stejným způsobem, s výhodou se vyberou kodóny tak, aby se nezavedlo EcoRI restrikční místo, které by vyžadovalo pro štěpení pLTXBl v příklad 3 50 částečné rozštěpení působením EcoRI. Mutací by se také neměla zavádět další Xbal nebo BamHI místa do fragmentu A (viz obrázek lb), BamHI nebo HindlII místa do fragmentu B nebo Hind III či BglII místa do fragmentu C. Pro patřičně sestavení mutantu pLTXBl jsou potřebná jiná

-25CZ 283148 B6 částečná štěpení; štěpením se získají spíše deleční mutanty (tj. mutanty s delecemi) než substituční mutanty (tj. mutanty se substitucemi), které jsou cílem v tomto případě.

Příklad 10

Identifikace genomové DNA, kódující myší a hovězí lymfotoxin.

Sekvence aminokyselin myšího a hovězího lymfotoxinu

Geny myšího a hovězího lymfotoxinu byly izolovány z bank genomových λ. Fragment cDNA lidského lymfotoxinu (PvuII-EcoRI o 600 párech nukleotidů) se označí ³²P zářezovou translací a použije se jako sonda pro hledání v bance myší genomové DNA [kmen M 600 myší genomové DNA λ Charon4A, T. Maniatis aspol.: Molecular Clonig, 31 (1982).] a nezávisle v bance hovězích genomových DNA (evropský patent 68622A). Hybridizace se provádí za nízké selektivity ve 20% formamidu [Gray a Goeddel: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 80, 5842 až 5846 (1983).]. Filtry byly promyty dvakrát vodným roztokem 0,03M chloridu sodného, 0,03M citranu sodného a 0,1% SDS. Přes jednotlivé plaky bylo vyčištěno několik fágů, hybridizováných sondou lidského lymfotoxinu [T. Maniatis aspol.: Cell 15, 687 až 701 (1978).], která byla štěpena restrikčními endonukleázami a analyzována Southemovou hybridizací. EcoRI fragment myší DNA o 3500 párech nukleotidů a EcoRI fragment hovězí DNA o 2200 párech nukleotidů byly hybridizovány sondou lidského lymfotoxinu. Tyto fragmenty DNA se klonují do plazmidu pBR322 a pak se sekvenují podle A. J. H. Smithe: Methods in Enzymology 65, 560 až 580 (1980). Na obrázku 4 je uvedena odvozená proteinová sekvence myšího a hovězího lymfotoxinu; pro srovnání je uvedena také sekvence lidského lymfotoxinu.

Příklad 11

Exprese lymfotoxinu v kvasinkách za reguluce ADH promotorem

Plazmid pLTtrpl se rozštěpí působením Xbal. Tím se plazmid otevře v místě Xbal, které se nachází právě vedle iniciačního kodónu lymfotoxinu. Kohezivní konec Xbal se zarovná Klenowovým fragmentem E.coli DNA polymerázy I se čtyřmi dMTP. K zarovnanému fragmentu plazmidu se liguje EcoRI adaptor

OH

5' ^AATTCCCGGG pGGGCCC-P 3'OH

3'

5' a přečnívající 5' hydroxylový konec se fosforyluje polynukleotid-kinázou. Ligační směs se použije k transformaci E.coli ATCC 31446 a plazmidu pLTtrplRl, který podle restrikční analýzy obsahuje další místo EcoRI vedle počátečního (iniciačního) kodónu lymfotoxinu. Izoluje se plazmid pLTtrplRl, ten se rozštěpí působením EcoRI a izoluje se fragment SP, který obsahuje DNA lymfotoxinu.

Plazmid pFRPn (evropský patent 60057A) se působením EcoRI rozštěpí, pro zabránění recirkularizace se zpracuje s alkalickou fosfatázou, liguje se na fragment SP lymfotoxinu (za použití T4 DNA ligázy) a ligační směs se použije pro transformaci E.coli ATCC 31446. Kolonie, které jsou rezistentní na ampicilin, poskytly 2 série plazmidu s SP inzerty s opačnými

-26CZ 283148 B6 orientacemi, jak ukazuje restrikční analýza elektroforézou na agarosových gelech. Plazmidy se vyčistí od E.coli transformantů a použijí se pro transformaci kvasinek s trpí mutací (například kvasinkový kmen RH218) (tento kmen je volně uložený v ATCC č. 44076) na fenotyp trp*. Bylo nalezeno, že plazmidy orientované tak, že iniciační kodón segmentu SP je umístěn vedle 5 fragmentu promotoru alkohol-dehydrogenázy, transformují kvasinky tak, že dochází k expresi lymfotoxinu. Lymfotoxin se izoluje z extraktů kvasinkových transformantů. Stabilitu plazmidu při fermentaci ve velkém měřítku lze zlepšit tím, že se použije expresní plazmid, který obsahuje dvoumikronový počátek replikace místo pFRPn chromozomálního počátku replikace (ars 1), a slučitelný hostitelský kmen [J. Beggs: Nátuře 275, 104 až 109 (1978).].

Příklad 12

Exprese lymfotoxinu v savčích buňkách

Fág λ LT11 (příklad 2) se rozštěpí působením EcoRl. Izoluje se fragment DNA (reverzní transkript), který obsahuje lymfotoxin. Plazmid pEHER (evropský patent 117060A) se rozštěpí působením EcoRl, působí se na něj telecí střevní alkalickou fosfatázou a liguje se s reverzním transkriptem (s EcoRl) fágu λ LT11. Výsledné plazmidy, které byly vykultivovány v E.coli 20 ATCC 31446 (evropský patent 117060A), se označí pEHERLT I a pEHERLT II. Obsahují DNA lymfotoxinu s opačnou orientací, jak ukazuje restrikční analýza na polyakrylamidových gelech.

Tyto plazmidy se použijí pro transfekci a selekci buněk CHO DHFR-DUX-B11, CHO1 a Ltk'.

Buňky tkáňové kultury se transfektují smícháním 1 pg plazmidu pEHERLT I nebo pEHERLT Π, 25 shora připravených, s 10 pg krysí DNA o objemu 250 pl, 0,25 M CaCL, přikape se 250 pl pufrovaného solného roztoku HEPES (280 nm chloridu sodného, 1,5 mM hydrogenfosforečnanu sodného, 50 ml HEPES, pH 7,1). Po třiceti minutách za teploty místnosti se tento roztok přidá k buňkám tkáňové kultury, které rostou v 60mm plastických miskách pro tkáňovou kulturu. Používají se buňky CHO 1, CHO DHFR-DUX-B 11 a Ltk'. Misky obsahují 3 ml kultivačního 30 média, odpovídajícího hostitelské buňce. Pro buňky CHO1 a CHO DHFR-DUX-B11 se jako médium používá Ham F-12 (Gibco) médium, doplněné 10 procenty telecího séra, 100 pl penicilinu na mililitr, 100 pg/ml streptomycinu a 2 nM L-glutaminu. Pro buněčné linie Ltk' se používá Dubelccem modifikované Eaglovo médium (DMEM), doplněné stejným způsobem, jako shora uvedeno. Po 3 až 16 hodinách se médium odstraní. Buňky se promyjí 20% glycerolem 35 v solném roztoku, pufrovaném fosforečnanem. Na každou desku se přidá médium a buňky se inkubují další dva dny.

Výběr (selekce) transfektovaných buněk se provádí trypsinizací buněk po dvoudenní kultivaci (což zahrnuje zpracování buněk s 0,5 mg/ml sterilního trypsinu, který obsahuje 0,2 mg/ml 40 ethylendiaminotetraoctové kyseliny) a přidání asi 3.1Ο⁵ buněk k lOmm deskám tkáňové kultury se selektivním médiem. Pro buňky dhfr' se připraví médium (F-12 GIBCO) bez glycinu, hypoxanthinu a thymidinu (GHT^- médium). Pro hostitelské buňky DHFR* se k normálnímu kultivačnímu médiu přidává methotrexát (100 až 1000 nM). Kontrolní pokusy se provádí za podmínek transfekce bez plazmidu a s plazmidem pFD-11 (evropský patent 117060A), 45 obsahujícím normální DHFR. Kolonie, které vzniknou z buněk a které expresí poskytují DHFR plazmid, jsou zřejmé během jednoho až dvou týdnů. Identifikují se transformanty, které expresí poskytují maturovaný lymfotoxin.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný biologicky aktivní lymfotoxin, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků 24 až 171 na obrázku 2a, který není glykosylován, nebo má variantní glykosylaci při srovnání s odpovídajícím přírodním lymfotoxinem z lidských lymfoidních buněk.
2. Izolovaný biologicky aktivní lymfotoxin podle nároku 1, který obsahuje sekvenci s aminokyselinovými zbytky 1 až 171 na obrázku I.
3. Izolovaný biologicky aktivní lymfotoxin podle nároku 1, který má specifickou aktivitu od 2 do 10.10⁸ jednotek na mg proteinu.
4. Protilátka, která neutralizuje cytolytickou aktivitu lymfotoxinu podle nároku 1 a která neobsahuje neneutralizující protilátky.
5. Protilátka podle nároku 4, která znamená monoklonální protilátku.
6. Protilátka podle nároku 4 nebo 5, která je značena detekovatelnou látkou.
7. Protilátka podle nároku 6, v němž detekovatelná látka znamená fluorescenční, chemiluminiscenční nebo radioizotopovou značku.
8. Protilátka podle nároku 4, která je imobilizována na povrchu nebo na matrici.
9. Nukleová kyselina, kódující lymfotoxin podle nároku 1.
10. Nukleová kyselina podle nároku 9, která obsahuje DNA, která neobsahuje intron, přítomný mezi nukleotidy 284 a 285.
11. Nukleová kyselina podle nároku 10, kterou je cDNA.
12. Nukleová kyselina podle nároku 9, která je kovalentně označena detekovatelnou látkou.
13. Replikovatelný vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 9.
14. Replikovatelný vektor podle nároku 13, který je replikovatelný v prokaryotech.
15. Replikovatelný vektor podle nároku 13, který je replikovatelný v eukaryotech.
16. Replikovatelný vektor podle nároku 14, který dále obsahuje bakteriální promotor, odštěpitelně napojený na nukleovou kyselinu, kódující lymfotoxin. ^{17 18 19 20}
17. Replikovatelný vektor podle nároku 14, v němž nukleová kyselina kóduje napojení bakteriálního sekrečního leaderu a lymfotoxinu.
18. Replikovatelný vektor podle nároku 13, v němž vektor znamená pLTrpl.
19. Replikovatelný vektor podle nároku 13, v němž vektor znamená p20K.LT.
20. Heterologní buňka, transformovaná nukleovou kyselinou podle nároku 9.

-28CZ 283148 B6
21. Heterologní buňka, transformovaná vektorem podle nároku 13.
22. Buňka podle nároku 21, kterou je prokaryot.
23. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin, v němž aminokyselinový zbytek v Iymfotoxinové sekvenci podle obrázku 2a je a) vynechán, b) nahrazen jiným zbytkem, nebo c) do sekvence podle obrázku 2a je vložen jiný zbytek stím, že z tohoto variantního lymfotoxinu je vyloučen lymfotoxin, který má sekvenci podle obrázku 2a s aminovými konci na Leu+1 nebo His+24.
24. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, v němž jsou zbytky -34 až -1 vynechány a který dále obsahuje inzerci alespoň jednoho aminokyselinového zbytku.
25. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 24, v němž inserce znamená spojení polypeptidů s karboxylovým koncem lymfotoxinu.
26. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 25, v němž polypeptid je zapojen na lymfotoxin místem hydrolýzy proteolytickým enzymem.
27. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 26, v němž variantní lymfotoxin je cytolyticky neaktivní před proteolytickou hydrolýzou.
28. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, který obsahuje náhradu jednoho aminokyselinového zbytku.
29. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, který obsahuje jednu deleci od 1 do 30 aminokyselinových zbytků.
30. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, který obsahuje inzerci jednoho aminokyselinového zbytku.
31. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, v němž náhrada znamená náhradu zbytku ze skupiny neutrálních nebo bázických aminokyselinových zbytků takovým zbytkem, který není členem skupiny, do které patří nahrazená aminokyselina.
32. Izolovaný biologicky aktivní variantní lymfotoxin podle nároku 23, který je cytotoxický.