FI93025B - Rekombinantti lymfotoksiini - Google Patents

Description

1 93025

Rekombinantti lymfotoksiini

Kyseessä oleva hakemus on jatko-osa U.S.S.N.

616 503:lle, joka jätettiin 31.5.1984. Kyseessä oleva 5 viite kuuluu läheisesti yhteen U.S.S.N. 608 316:n kanssa, joka jätettiin 7.5.1984 ja jonka otsikkona oli "Human Lymphotoxin", sekä U.S.S.N. 616 502:n kanssa, joka jätettiin 31.5.1984 ja jonka otsikko oli "Anti-Lymphotoxin".

Kyseessä oleva hakemus koskee lymfokiinejä. Eri-10 tyisesti se koskee lymfotoksiinia ja sen johdannaisia.

Lymfotoksiini identifioitiin ensin biologisena tekijänä, jolla oli solunvastaista aktiivisuutta kasvain-solulinjoja kohtaan. Lymfotoksiiniksi identifioitu ja mi-togeenien stimuloimista lymfosyyteistä saatu aktiivisuus 15 kytkeytyy sytotoksisten aktiivisuuksien sarjaan, joka ulottuu tiettyjen kasvainsolulinjojen solun kasvun ehkäisystä muiden transformoitujen solujen tunnusomaiseen solun hajaantumiseen. Kuitenkin, lymfotoksiini-aktiivisuudelle on ominaista vähäinen tai puuttuva solunvastainen aktiivi-20 suus tutkituilla primaarisilla soluviljelmillä tai normaaleilla solulinjoilla. Tämä lymfotoksiinin oletettu, eron tekevä solunvastainen aktiivisuus johti in vivo tutkimuksiin, jotka tuovat mieleen, että lymfotoksiinilla saattaa . olla tehokasta kasvaimenvastaista aktiivisuutta.

25 Lymfotoksiini on termi, jota on käytetty kuvaamaan molekyyliryhmää. Lymfotoksiinimolekyylit on identifioitu glykoproteiineiksi, jotka on jaettu viiteen molekyylipaino-luokkaan, joista kukin on heterogeeninen varauksen suhteen. Humaani alfa- (molekyylipaino 70-90 000) sekä beeta-• 30 (molekyylipaino 25 - 50 000) luokat näyttävät vallitsevan useimmissa lymfosyyttisupernatanteissa. Alfa-molekyyli-painoluokat voidaan varauksen perusteella erottaa ainakin seitsemään alaluokkaan, kun taas beeta-alaluokka on erotettu kahteen selvään alaluokkaan (G. Granger et ai. Mozes 35 et al.:n julkaisemassa julkaisussa, 1981, Cellular 2 93025

Responses to Molecular Modulators ss. 287 - 310). On identifioitu myös lymfotoksiinin kompleksinen (molekyyli-paino >200 000) sekä γ-muoto, molekyylipaino 10 - 20 000. Lymfotoksiinin erilaiset muodot ja luokat eroavat toisis-5 taan stabilisuutensa ja ilmaantumisen kinetiikan suhteen viljelmässä. Alhaisen ionivahvuuden vallitessa ne saattavat edelleen aggregoitua kompleksisen luokan kanssa. Lymfotok-siinien alempien molekyylipainoluokkien on julkaistu olevan suhteellisen epästabiileja ja heikosti soluja hajottavia 10 suurempiin molekyylipainoluokkiin verrattuina (Hiserodt et ai., 1976, "Cell. Immun." 26: 211; Granger et ai. De Week et ai.;n julkaisemassa julkaisussa, 1980 Biochemical Characterization of Lymphokines ss. 279 - 283). γ-luokan aktiivisuutta ei ole laajalti tutkittu sen epästabiliteetin 15 vuoksi (G. Granger et ai., 1978) "Cellular Immunology" 38: 388 - 402). Beeta-luokan on myös esitetty olevan epästabiilin (Walker et ai., "J. of Immun." 116 /3?: 807 - 815 /maaliskuu 1976?)·

Tulisi olla ymmärrettävää, että lymfokiinien termi-20 nologia ei ole yhtenäinen. Nykyisin soluviljelmien tuotteille annetut nimet ovat suurelta osalta solujen funktio, jonka uskotaan valmistavan tuote sekä tuotteiden tulos biologisissa määrityksissä. Kuitenkin nämä tuotteet jäävät suuressa laajuudessa huonosti karakterisoiduiksi, koska * 25 monia tutkimuksia on suoritettu osittain puhdistetuilla valmisteilla ja koska tuotteiden karakterisointiin käytetyt määritykset eivät ole molekyylispesifisiä ja joka tapauksessa ne ovat huomattavan vaihtelun kohteena. Erilaisten sytotoksisten tekijöiden todellinen identtisyys jää tunte- • 30 mattomaksi, koska puuttuu standarditerminologia, joka perustuu selvästi määritettäviin, erottaviin ominaisuuksiin, kuten esimerkiksi aminohapposekvensseihin tai immuuniepi-tooppeihin. Esimerkkejä muista nimistä, joita on annettu sytotoksisille soluviljelmätuotteille, ovat kasvainkuolio-35 tekijä (tumor necrosis factor), NK-solu-sytotoksinen tekijä (NK cell cytotoxic factor), verenvuotokuoliotekijä 3 93025 (hemorrhagic necrosis factor) sekä makrofaagi-solumyrkky (macrophage cytotoxin) tai sytotoksinen tekijä.

Käsiteltävänä oleva ja U.S.S.N. 608 316:ksi merkitty hakemus, joka on jätetty 7.5.1984, sekä EP 100 641A 5 (julkaistu 15.2.1984) kuvaavat humaani lymfoblastisolu- linjasta RPMI-1788 eristetyn humaanilymfotoksiinin amino-happos ekvens s e j ä.

Hayashi et ai., EP 132 125A (julkaistu 23.1.1985) kuvaavat proteiinin takaisinsaantia kaniinilta sekä sen 10 jälkeen tapahtuvaa kaniinin retikuloendoteliaali-järjes- telmän stimulaatiota. Proteiinilla tiedotettiin olevan kasvaimen vastaista aktiivisuutta, ja sen aminohapposekvenssi oli Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Seu-Gln-15 Trp-Leu.

Käsiteltävänä oleva ja yleisesti U.S.S.N. 628 059:ksi merkitty hakemus, joka on jätetty 5.7.1984, julkaisee sytotoksisen humaanipolypeptidin puhdistuksen ja rekombi-nantti-synteesin, polypeptidi on identifioitu kasvain-20 kuoliotekijäksi ja sen N-terminaalinen aminohapposekvenssi on Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro.

Ohnisni et ai. (US-patentti 4 481 137) julkaisevat saaneensa BALL-l-soluviljelmästä aineen, jonka molekyyli-25 paino on 7 - 9 000 ja joka on nimeltään CB , ja supressoi kasvainsolujen kasvua ja jolla N-pääte on Ala-Ala.

Tothin ja Grangerin mukaisesti, "Mol.Immun." 16: 671 - 679 (1979), sialihapon poistamisella lymfotok-siinia sisältävistä lymfosyyttisupernatanteista eikä N-30 asetyyli-glukosamiinin, galaktoosin, laktoosin, mannoosin, a-metyyli-mannosidin tai fukoosin lisäyksellä superna-tantteihin ollut mitään vaikutusta soluja hajoittavaan aktiivisuuteen in vitro. Toth et ai. päättelivät täten, ettei yksinkertaisilla sokereilla ollut mitään osuutta 35 kyseessä olevan lymfotoksiinin aktiivisuuteen. Kuitenkin

Toth et ai. havaitsivat myös, että sakkarideilla on tärkeä 4 93025 osuus muiden lymfokiinien toiminnassa, ja he päättelivät, että he eivät voi sulkea pois oligosakkaridien monimutkaisempien muotojen osallistumista lymfotoksiinin sytotoksi-seen aktiivisuuteen.

5 Myöhemmin Proctor, Klostergaard ja Granger ("Clinical Research", 1982, 30(1): 55A) tiedottivat, että ihmisen lymfosyytit, kun niitä aktivoitiin PHAilla tunika-mysiinin läsnäollessa (inhiboimaan N-kytkettyjen hiilihyd-raattiosasten lisäys lymfotoksiini-molekyyleihin), vapaut-10 tivat biologisesti inerttiä lymfotoksiinia. Näiden kir joittajien mukaan, immunokemialliset tutkimukset ilmaisivat, että vaikka lymfotoksiinin hiilihydraattiosaa ei tarvittu lymfotoksiinin kuljetukseen eikä sen vapautumiseen aktivoidun lymfosyytin avulla supernatanttiin, hiilihyd-15 raattia tarvittiin tehokkaaseen kohdesolun hajoittamiseen, koska hiilihydraattiosa vastasi lymfotoksiini-molekyyli(e)n sopivasta konformaatiosta.

Muuhun kirjallisuuteen, jota tulisi tutkia tässä yhteydessä, kuuluvat julkaisut, Evans, "Cancer Immunol.

20 Immunother." 12: 181 - 190 (1982); Lee et ai., "Cell.

Immun." 48: 166 - 181 (1979); De Week et ai. julkaisijat, (1980) Biochemical Characterization of Lymphokines ss.

279 - 312; Khan et ai. julkaisija (30.6.1982) Human Lymphokines ss. 459 - 477; Aggarwal et ai., Presentation 25 at the 3rd International Lymphokine Workshop in Haverford, PA., elokuu 1-5 1982; Ranson et ai., "Canser Research" 43: 5222 - 5227 (marraskuu 1983); Kull et ai., "J. of Immun." 126(4): 1279 - 1283 (huhtikuu 1981); J. Sawada, et ai., "Jpn. J. Epx. Med." 46: 263 - 267 (1976); G.

:30 Granger et ai., "Cell. Immunol." 38: 388 - 402 (1978); J. Rundell et ai., "Immunopharmacology" 3: 9-18 (1981); G. Granger et ai., "J. Lymphokine Res." 1: 45 - 49 (1982); N. Ruddle et ai., "Lymphokine Res." 2: 23 - 31 (1983); M. Mitsuhashi et ai., U.K. Patent Application 2 106 117; 35 H. Enomoto, European Patent Application 87 087A; B.

5 93025

Williamson et ai., "P.N.A.S. USA" 80:5397 - 5401 (1983) sekä S.Wright et ai., "J. Immunol." 126: 1516 - 1521 (1981).

Lymfotoksiini (tai aineet, jotka on identifioitu 5 lymfotoksiiniksi), joka on saatu tähän mennessä lymfosyyt- tiviljelmästä, on läsnä alhaisina konsentraatioina, suuruusluokaltaan 0,05 - 2xl06 yksikköä/1, RPMI-1788-solujen tai primaaristen lymfosyyttien supernatanteissa. Kootut määrät vaihtelevat usein huomattavasti, ja primaariset 10 lymfosyytit ovat kalliita. Tarvitaan taloudellista menetelmää lymfotoksiinin valmistamiseksi (Yamamoto et ai., "J. of Biological Response Modifiers" 3: /1? 76-87 /1984?).

Aiempien menetelmien mukaisesti myös epäonnistui 15 valmistaa lymfotoksiinia, joka on homogeeninen aminohappo-sekvenssin suhteen, mikä on tärkeä piirre lääkkeen käyttökelpoisuudelle. Solulinjaviljelmistä takaisin saadulla lymfotoksiinilla on heterogeenisuutta aminopäätteen suhteen, mikä luultavasti johtuu proteolyyttisestä toimin-20 nasta (katso yllä mainittu U.S.S.N. 608 316). Primaaristen lymfosyyttien, jotka on saatu esim. liikaa kasvaneesta nielun kattorisasta tai perifeerisestä verestä, viljelmien täytyy välttämättä, taloudellisista syistä, sisältää ; monien luovuttajien soluja. Kuitenkin näiden solujen 25 tuotteet tulevat heijastamaan luovuttajien piirissä val litsevaa geneettistä vaihtelua, niin että syntyvä lymfo-toksiini saattaa tosiasiassa olla alleelisten lajien seos. Ilmeisesti sellaisten alleelien osuudet ja identtisyydet tulevat olemaan tuntemattomia erästä erään. Tarvitaan • 30 menetelmää aminohapposekvenssinsä suhteen yhtenäisen lym fotoksiinin valmistamiseksi.

Aiemmat menetelmät rajoittuvat myös lymfotoksiinin valmistamiseen, jolloin tuotteen primaariset aminohappo-sekvenssit vastaavat luonnossa esiintyvän lymfotoksiinin 35 aminohapposekvenssejä. Erilaisten aminohappojen substituu- 6 93025 tio, deleetio tai insertio näissä sekvensseissä edellyttäisi laajoja ja kalliita kemiallisia modifikaatioita, jos sellaisia voisi suorittaa ollenkaan. Tarvitaan menetelmiä muunnosten aikaansaamiseksi lymfotoksiinin amino-5 happosekvensseihin.

Vaikka kirjallisuudessa on vuodesta 1968 lähtien esitetty tietoja lymfotoksiiniaktiivisuuden kasvaimenvas-taisista vaikutuksista ja ilmeisestä terapeuttisesta arvosta, lymfotoksiinia ei ole tutkittu laajoissa kliinisissä 10 kokeissa eikä siitä ole tehty kaupallista tuotetta, mikä johtuu aiempien menetelmien avulla saatavissa olevan lymfotoksiinin heterogeenisestä luonteesta. Tarvitaan menetelmiä kliinisiin tutkimuksiin riittävien lymfotoksiini-määrien taloudelliseksi valmistamiseksi.

15 Kirjallisuudessa on kuvattu kaniinin antiseerumia, joka pystyy neutraloimaan erilaisten sytotoksiinien syto-lyyttistä aktiivisuutta, lymfotoksiiniksi identifioidut aineet mukaan luettuina (Yamamoto et ai., "Cell. Immun." 38: 403 - 416 (1978); Gately et ai., "Cell. Immun." 27: 20 82 - 93 (1976); Hiserodt et ai., "J. of Immun." 119(2): 374 - 380 (1977); Zacharchuk et ai., "P.N.A.S. USA" 80: 6341 - 6345 (lokakuu 1983); Ruddle et ai., "Lymphokine Research" 2(1) 23 - 31 (1983); Mannel et ai., "Infection and Immunity" 33(1): 156 - 164 (1981); Wallac et ai.

25 E. De Maeyer et ai. julkaisijat The Biology of the Interferon System ss. 293 - 302 (julkaistu syyskuussa 1983) ja Stone-Wolff et ai., "J. Exp. Med" 159: 828 - 843 (maaliskuu 1984). Koska tämä antiseerumi on polyklonaali-nen, se sisältää lymfotoksiini-immunogeenia vastaan koh-• 30 distuvien vasta-aineiden moninaisuuden. Jokin tai useampi näistä vasta-aineista toimii "lymfotoksiini"-aktiivisuuden neutraloimiseksi. Edelleen, kirjallisuuden tiedot yleensä ovat epäselviä, mitä tulee immunogeeninä käytetystä lym-fotoksiiniaktiivisuudesta vastaavan aineen molekulaariseen 35 identtisyyteen. Diagnoosiin ja immunoaffiniteetti-puhdis- 7 93025 tusmenetelmiin tarvitaan monospesifistä vasta-ainetta, joka on suuntautunut selvästi ja yksiselitteisesti identifioitua lymfotoksiinimolekyyliä kohtaan. Kyseessä olevan keksinnön kohteena on tarjota käyttöön sellainen vasta-5 aine.

Lisäkohteena on edelleen antaa käyttöön taloudellisia syntetisoimismenetelmiä lymfotoksiinimuodolle, jonka rakenne on sellainen, että oleellisesti kaikkien lymfo-toksiini-molekyylien primaarinen aminohapposekvenssi on 10 sama.

Keksinnön eräänä toisena kohteena on saada aikaan ennalta määrättyjä muunnoksia lymfotoksiinimuodon aminohapposekvenssissä, tarkemmin sanottuna aminohappodelee-tioita, insertioita, substituutioita tai niiden yhdistel-15 miä.

Keksinnön kohteena on ollut toteuttaa proteiinin, jolla on lymfotoksiinin aktiivisuutta, onnistunut rekom-binanttiekspressio. Lymfotoksiini-lajia, jota kuvataan tässä yhteydessä aktiivisuutensa sekä luonnollisen että 20 vaihtoehtoisen aminohapposekvenssin termein, nimitetään vastedes lymfotoksiiniksi. Yllättäen on havaittu, ettei lymfotoksiinia koodittava DNA kestä vähäisiä määriä homologisissa soluissa ekspressoitunutta lymfotoksiinia, ja on todettu epävarmuus ajan suhteen, jolloin lymfotok-25 siinia koodittava lähetti-RNA tulee näkyviin homologisissa soluissa. On myös yllättävää, että biologisesti aktiivinen lymfotoksiini ekspressoituu rekombinantti-soluissa, jotka eivät glykosyloi lymfotoksiinia (tai joiden ei oleteta tekevän niin samalla tavalla kuin homologiset solut), 30 ja näin ekspressoidulla lymfotoksiinilla, joka saadaan takaisin, on oleellisesti yhtenäinen aminohapposekvenssi, ilman N-päätteessä tapahtunutta entsymaattista hydrolyysiä. Lymfotoksiinia koodittava DNA ilmentyy soluviljelmissä kopiomäärinä, jotka ylittävät 0,1 - 1χ10χ yksikköä/litra 35 viljelmää, josta solut on hajoitettu.

8 93025

Lymfotoksiini, jonka rekombinantti-isäntäsolu ilmentää, riippuu lymfotoksiinin koodaamiseen käytetystä DNA:sta tai sen prekursoreista sekä valitusta isäntäso-lusta. Tässä yhteydessä lymfotoksiinin synteesiin käyte-5 tyt nukleiinihapposekvenssit ovat uusia. Niille ovat ominaisia nukleotidisekvenssit, jotka eroavat alkuperäisestä tai luonnossa esiintyvästä sekvenssistä yhdellä tai useammalla, seuraavana mainituista tavoista: DNArssa ei ole introneita; humaanilymfotoksiinin ollessa kysymyk-10 sessä, läsnäoleva introni sijaitsee nukleotidien 284 ja 285 välissä (kuvio 2a); DNA ei sisällä vapaata nukleiinihappoa, joka koodittaa organismin, josta DNA on peräisin, muita proteiineja; lymfotoksiinia koodittava nukeliini-happo on kytketty vektoriin; ja/tai nukleiinihappo voi 15 hybridisoida lymfotoksiinia koodittavan nukleiinihapon edellyttäen, että sellaisella hybridisoivalla nukleiinihapolla ei ole luonnossa esiintyvän, lymfotoksiinia koodittavan DNA:n tai RNA:n nukleotidisekvenssiä.

Nukleiinihappojen mutantit, jotka koodittavat 20 lymfotoksiinia, ovat rekombinanttimanipulaatioiden tuote.

Toimimattomat mutaatiot lymfotoksiinia vastaavassa 5'-nukleiinihapossa, joka on luettu tai jota ei ole luettu, annetaan käyttöön lisäämään ilmentymisen tasoja valituissa . isännissä, esim. vähentämällä varsi- ja-kierukka-RNA- 25 rakenteiden todennäköisyyttä nukleiinihapon 5'-alueilla, tai korvaamalla luonnossa esiintyvistä nukleiinihappo-eristyksistä löydetyt kodonit isännän suhteen edullisilla kodoneilla.

Nukleiinihapoissa esiintyvät mutaatiot, jotka 30 ilmentyvät pikemminkin kuin ne, jotka eivät toimi, tekevät mahdolliseksi valmistaa lymfotoksiini-lajeja, joilla on alkuperäisen lymfotoksiinin aminohapposekvenssi tai sen variantin primaarinen sekvenssi aminohapposekvenssein, jotka eroavat alkuperäisestä lymfotoksiinista. Lymfotok-35 siinimutantti saadaan takaisin sellaisenaan tai isäntä- solun käsittelemänä halutun lymfotoksiinilajin saamiseksi.

93025 9 Nämä nukleiinihapot tai nukleiinihapot, jotka hybridisoituvat niiden jälkeen, tai niiden fragmentit merkataan ja käytetään hybridisaatio-määrityksissä lymfo-toksiinia koodittavan geneettisen materiaalin identifioin-5 tiin tai määrittämiseen.

Lymfotoksiinin synteesimenetelmissä DNA, joka koodittaa lymfotoksiinia, kytketään vektoriin, vektori käytetään isäntäsolujen transformointiin, isäntäsoluja viljellään ja lymfotoksiini otetaan takaisin viljelmästä.

10 Tätä yleistä menetelmää käytetään syntetisoitaessa lymfotoksiinia, jolla on alkuperäisen lymfotoksiinin aminohappo-sekvenssi , tai konstruoitaessa uusia lymfotoksiinin muunnoksia, riippuen vektorin konstruktiosta sekä transformaatioon valitusta isäntäsolusta. Lymfotoksiinilajeihin, 15 jotka voidaan syntetisoida kyseessä olevassa tapauksessa, sisältyy lymfotoksiini, jossa leusyyli on amino-päätteenä, lymfotoksiini, jossa histidyyli on amino-päätteenä, pre-lymfotoksiini sekä lymfotoksiinin muunnoksia mukaanluettuina (a) fuusioproteiinit, joissa heterologinen proteiini 20 tai polypeptidi on yhdistetty peptidisidoksella lymfotoksiinin amino- ja/tai karboksyylipään aminohappoihin, (b) lymfotoksiinifragmentit, erityisesti prelymfotoksiinin fragmentit, joissa mikä tahansa aminohappo välillä -34 ja +23 on fragmentin aminopäätteen aminohappo, (c) lymfotok-25 siinimutantit, joissa yksi tai useampia aminohappotähteistä on substituoitu, insertoitu tai niissä on tapahunut delee-tio, (d) johdannaiset, joissa metionyyli tai muunnettu metionyyli (kuten esimerkiksi formyylimetioniini tai muut suljetut metionyyli-lajit) on amino-päätteenä, ja/tai (e) 30 kaikkien edellä mainittujen glykosyloimattomat tai vaihtelevasti glykosyloidut lajit.

Jos' nisäkässolu transformoidaan lymfotoksiinin koo-dittavalla nukleiinihapolla, joka on toiminnallisesti kytketty eukaryoottiseen eritysjohdantojaksoon (alkuperäinen, 35 lymfotoksiinin erittymisestä vastaava johdantojakso mukaan- 10 93025 luettuna) tai jos lymfotoksiinia koodittava nukleiinihappo on toiminnallisesti kytketty vektorissa prokaryottiseen tai hiivan eritysjohdantojaksoon, jonka transformoitava isäntäsolu tunnistaa (tavallisesti organismi, josta joh-5 dantojakso on otettu), isäntä transformoidaan vektorilla ja viljellään, sitten lymfotoksiinilajit, jotka eivät tavallisesti sisällä aminopäässä metioniinia, saadaan viljelmästä takaisin.

Jos lymfotoksiinia koodittava DNA on toiminnalli-10 sesti kytketty vektoriin ilman eritysjohdantosekvenssiä ja sitten käytetty isäntäsolun transformointiin, syntetisoidut lymfotoksiini-lajit ovat yleensä substituoidut amino-päätteisellä metionyylillä tai muunnetulla metionyyli-tähteellä, kuten esimerkiksi formyylimetioniinilla.

15 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää lymfotoksiinien valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla sekä tarkoitukseen käyttökelpoisia nukleiinihappoja ja vektoreita.

Kuvataan, kuinka lymfotoksiinia koodattavan nukleiinihapon mutaatio in vitro johtaa lymfotoksiinivarianttien 20 ilmentymiseen, jotka eivät ole tähän mennessä olleet saatavilla. Ensinnäkin, N-terminaalisesti metionyyliä tai muunnettua metionyyliä sisältävä lymfotoksiini ekspressoituu isäntäsoluissa, jotka on transformoitu nukleiinihapolla, joka koodittaa lymfotoksiinia, joka ilmentyy suoraan, se 25 on, joka on toiminnallisesti kytketty eritysjohdantosek-venssiin.

Toiseksi, in vitro on käytetty sijainnin suhteen spesifisiä, ennalta määrättyjä tai satunnaisia mutaatioita saamaan aikaan deleetioita, substituutioita ja/tai inser-30 tioita nukleiinihappoon, joka koodittaa lymfotoksiinia.

Lymfotoksiinifuusiot saadaan aikaan tällä tavalla. Nukleiinihapon mutaation ekspression avulla saaduilla lymfotoksiini johdannaisilla on muunnettuja ominaisuuksia.

Lopuksi, glykosyloimattomia tai vaihtelevasti 35 glykosyloituja lymfotoksiineja annetaan käyttöön uusina lymfotoksiini-lajeina. Glykosyloimaton lymfotoksiini valmistetaan lymfotoksiinia koodittavan, prokaryoottisen eks il 93025 pression avulla. Vaihtelevasti glykosyloidut symfotoksiini-lajit ovat rekombinantti-viljelmän tuote transformoiduissa korkeammissa eukaryootti-, tavallisesti nisäkässoluissa.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu 5 lymfotoksiini puhdistetaan viljelmäsupernatanteista tai hajotetuista soluista immunoaffiniteettiadsorption avulla käyttämällä liukenematonta lymfotoksiinia neutraloitavaa vasta-ainetta. Tämä vasta-aine, joka tehokkaimmin valmistetaan monoklonaalisessa soluviljelmässä, saadaan aikaan 10 hiiressä immunisoimalla se aluminiumsulfaattiin adsorboidulla lymfotoksiinilla.

Kyseessä olevan keksinnön mukainen lymfotoksiini yhdistetään terapeuttista käyttöä varten fysiologisesti vaarattomaan stabiloimisaineeseen sekä täyteaineen kanssa, 15 ja se valmistetaan steriiliin annosmuotoon, esimerkiksi lyofilisoimalla annospulloissa tai varastoimalla se stabiloituina vesivalmisteina. Vaihtoehtoisesti, lymfotoksiini sisällytetään polymeerimatriisiin kiinnitettäväksi kasvaimeen tai leikkauskohtaan, josta kasvaimet on poistettu, 20 jolla tavalla saadaan aikaan lymfotoksiinin hidas vapautuminen paikallisena, korkeana konseitraatiogradienttina.

Koostumukset annostellaan terapeuttisesti tehokkaina annoksina implantaation, injektion tai infuusion avulla : eläimille, erityisesti ihmispotilaille, joilla on pahan- 25 laatuisia kasvaimia.

Kuvio la kuvaa DNA-sekvenssiä sekä sen lymfotoksiini-fragmenttia koodittavaa aminohapposekvenssiä.

Kuvio Ib havainnollistaa kuviossa la esitettyä fragmenttia koodittavan synteettisen DNA:n rakennetta.

30 Kuvio 2a esittää pre-lymfotoksiinin täydellistä aminohappo-sekvenssiä, sitä koodittavaa DNA:a sekä 5' -ja 3' - reunustavia, ei transloituja alueita.

Kuvio 2b valaisee menetelmää ekspressiovektorin konstruoimiseksi metionyyli-leusyyli-amino-päätteiselle 35 lymfotoksiinille sekä sen amino-päätteisiä metionyyli- johdannaisia.

12 93025

Kuvio 3 esittää menetelmää ekspressio-vektorin konstruoimiseksi metionyyli-histidyyli-aminopäätteiselle lymfotoksiinille.

Kuvio 4 esittää ihmisen, hiiren ja härän lymfotok-5 siinin aminohapposekvenssiä sekä yhteisiä nisäkkään lymfo-toksiinin tähteitä.

Kuviot 5a sekä 5b esittävät plasmidin rakennetta, joka koodittaa lymfotoksiinin ja bakteerin signaalisek-venssin yhteenliittymää.

10 Lymfotoksiini määritellään kyseessä olevan hakemuk sen tarkoituksiin biologisesti aktiivisena polypeptidinä, jossa on alue, joka havainnollistaa oleellisen, rakenteellisen aminohappohomologian ainakin osan kanssa kuviossa 2a esitettyä lymfotoksiinin aminohappo-sekvenssiä.

15 Biologinen aktiivisuus määritellään valikoivana, sytotok-sisena aktiivisuutena alla määritellyllä tavalla, immunologisena risti-reaktiivisuutena sytotoksisen lymfotoksiinin kanssa tai kykynä kilpailla sytotoksisen lymfotoksiinin kanssa lymfotoksiinin solunpintareseptoreista. Kah-20 dessa viimeksi mainitussa esimerkissä lymfotoksiinin ei sinänsä tarvitse olla sytotoksinen. Immunologisesti risti-reaktiiviset mutantit ovat immunogeeneina käyttökelpoisia anti-lymfotoksiinin muodostamiseksi eläimissä, esim. immunologisten määritysmenetelmien reagenssien val-25 mistamiseksi, kun taas ei-sytotoksisilla, kompetitiivi- silla mutanteilla on käyttöä merkattuina reagensseina tyypiltään kompetitiivisissä immunologisissa määrityksissä, biologisesti aktiivista lymfotoksiinia määritettäessä.

Valikoiva sytotoksinen aktiivisuus määritellään 30 kasvainsolujen valikoivana hajoamisena tai kasvun inhi-bitiona in vivo tai in vitro, samoissa olosuhteissa normaaleihin soluihin verrattuna. Kasvainsolujen tuhoaminen hajoittamalla solut in vitro tai kuolion avulla in vivo on määrityksen edullinen päätepiste, vaikka solun kasvua 35 ja lisääntymisaktiivisuutta on käytetty myös tyydyttävästi.

13 93025

Sopivia määritysmenetelmiä solunvastaisten lymfo-toksiinin aktiivisuuksien havaitsemiseksi kuvataan julkaisussa B. Aggarwal, et ai., 1984, "J. Biol. Chem." 259 (1), 686 - 691 sekä E. Carswell, et ai., 1975, "Proc. Natl.

5 Acad. Sei. USA" 72, 3666 - 3670.

Lymfotoksiinin spesifinen aktiivisuus määritellään kyseessä olevan hakemuksen yhteydessä kohdesolun hajoamisena pikemmin kuin solun kasvun ehkäisynä. Lymfotoksiinin yksikkö määritellään sellaisena lymfotoksiinin määränä, 10 joka tarvitaan kuhunkin kammioon esimerkissä 1 kuvatulla tavalla esisiirrostettujen kohdesolujen 50-%:iseen hajoamiseen. Kuitenkin hyväksytään sytotoksisen aktiivisuuden muut määritysmenetelmät.

Oleellisella, rakenteellisella homologialla tarkoi-15 tetaan yleisesti sanoen, että enemmän kuin 60 %, ja tavallisesti noin 70 % polypeptidin aminohappotähteistä on samoja tai kuviossa 2a esitetyssä sekvenssissä sijaitsevien, vastaavien tähteiden (vastaavan tähteen) säilyttäviä substituutioita.

20 Lymfotoksiinin polypeptidi-sekvenssin ei tarvitse olla kokonaan homologinen kuviossa 2a esitetyn sekvenssin kanssa. Ainoastaan osan siitä tulee olla homologinen jonkin osan kanssa kuviossa 2a esitettyä sekvenssiä edellyttäen, että ehdokkaalla on tarvittava biologinen aktiivi-25 suus. Yleisesti sanoen, homologia tulisi havainnollistaa noin 20 - 100 aminohappotähteelle, ymmärtäen kuitenkin, että satunnaisia aukkoja saatetaan kuitenkin käyttää homo-logian maksimoimiseksi.

Vähemmän homologiaa edellytetään määritelmän piiriin •t 30 kuuluvilta polypeptideiltä, jos kuvion 2a esittämän sek-venssin kanssa homologinen alue ei ole jokin lymfotoksiinin avainalueista, esim. sytotoksiselle aktiivisuudelle tärkeistä alueista. Kuvion 2a esittämän sekvenssin avainalueiden uskotaan olevan suunnilleen tähteet 162 - 171, 35 52 - 83 sekä 127 - 148.

1« 93025

Lymfotoksiinin määritellään spesifisesti sulkevan pois ihmisen kasvainkuoliotekijän (human necrosis factor) tai sen luonnossa esiintyvät eläinanalogit (D. Pennica et ai., "nature" 312: 20/27 joulukuu, 1984, ss. 724 - 729 5 sekä B. Aggarwal etal., "J. Biol. Chem." 260 /47: 2345 -2354 /1985?).

Rakenteellisesti samankaltainen tarkoittaa aminohap-posivuketjujen vallitsevia ominaisuuksia, kuten esimerk-kiksi emäksisyyttä, neutraaliutta tai happamuutta, hydro-10 fiilisyyttä tai hydrofobisuutta tai steerisen esteen poissa oloa. Rakenteellisesti samankaltaisen aminohapon korvaaminen toisella aminohapolla tunnetaan yleensä säilyttävänä substituutiona.

Merkittävä tekijä näytettäessä toteen polypeptidin, 15 kuten lymfotoksiinin identtisyyttä, on antiseerumin, joka pystyy oleellisesti neutraloimaan homogeenisen, lym-foblasti (eli luonnosta peräisin olevan) -lymfotoksiinin, kyky myös oleellisesti neutraloida kyseessä olevan polypeptidin sytolyyttinen aktiivisuus. Kuitenkin on ymmär-20 rettävä, että immunologinen identtisyys ja sytotoksinen identtisyys eivät välttämättä esiinny yhdessä. Kuvion 2a mukaisen 1ymfotoksiinin vasta-aine ei voi sitoa proteiini-ehdokasta, koska neutraloiva vasta-aine sattuu olemaan suunnattu lyrr.fotoksiinia kohtaan joka on vain naapurina 25 alueelle, joka on kriittinen lymfotoksiinin aktiivisuudelle, mutta joka toimii neutraloivana vasta-aineena estäen stee-risesti lymfotoksiinin aktiivisen kohdan. Proteiiniehdo-kas, joka on mutatoitunut tällä yhdentekevällä alueella, ei voi enää sitoa neutraloivaa vasta-ainetta, mutta se . 30 olisi kuitenkin lumfotoksiini oleellisen homologian ja biologisen aktiivisuuden muodossa esitettynä.

Lymfotoksiinilla, joka on saatu lymfoblastisolu-linjojen viljelmillä, on määritetty olevan seuraavat ominaisuudet: molekyylipaino 20 000 tai 25 000, riippuen 35 glykosylaation asteesta N-päätteen heterogeenisuudesta; 15 93025 glykosylointi Asn+62:ssa (kuvio 2a); aggregoitumistaipumus , erityisesti taipumus järjestäytyä multimeereiksi; isoelektrinen piste noin 5,8; pH:n suhteen epästabiili (sytolyyttisen aktiivisuuden häviäminen suurempi kuin 5 >50 %, kun säilytys on tapahtunut 24 tunnin ajan ammonium- bikarbonaatti-puskurissa, 10 ^ug/ml:n konsentraationa, pH-tason ollessa 5:n alapuolella tai suurempi kuin noin 10); oleelliset aktiivisuuden häviöt inkuboitaessa vesi-liuoksessa 5 minuutin ajan, 80°C:ssa. On identifioitu 10 kaksi lymfoblasti-lymfotoksiini-molekyylilajia. 25 000 daltonin lymfoblasti-lymfotoksiini-lajilla on aminopäät-teinen leusiini-tähde. Polypeptidejä, joiden primaarinen aminohapposekvenssi on 25 000 daltonia, ovat nimeltään leusyyli-amino-päätteisiä lymfotoksiineja. Lymfoblasti-15 lymfotoksiineille, jotka ovat 20 000 daltonin (da) tyyppiä, on ominaista aminopäätteinen histidiini, ja vastaavia sekvenssejä nimitetään histidyyli-amino-päätteiseksi lymfotoksiiniksi. On tärkeää havaita, että nämä ominaisuudet kuvaavat alkuperäistä sekä villiä humaanilymfo-20 toksiini-tyyppiä, jotka on saatu lymfoblasti-soluviljel-mistä. Samalla kun tässä yhteydessä määritellyn lymfo-toksiinin piiriin kuuluu alkuperäinen, glykosyloitu lymfo-toksiini, muut läheiset sytotoksiset polypeptidit kuuluvat määritelmän piiriin. Esimerkiksi, glykosylaatiota, 25 joka tavallisesti liittyy eläinlymfotoksiiniin, saatetaan modifioida ilmentymisen avulla heterologisessa, eukaryoottisessa rekombinantti-isäntäsolussa, jolloin saadaan aikaan muunnettu lymfotoksiini, joka kooltaan ei kuulu molekyylipainojen piiriin tai jonka isoelektrinen *. 30 piste on sama kuin ihmisen lymfoblastilymfotoksiinilla.

Lymfotoksiinia, joka on kokonaan glykosyloimatonta, valmistetaan rekombinantti-bakteeriviljelmässä, ja molekyyli-painoltaan, isoelektriseltä pisteeltään ja muilta ominaisuuksiltaan se vastaa muunnettua lymfotoksiinia. Lisäksi 35 pre-lymfotoksiinin translaation jälkeisessä valmistuksessa ensimmäisistä eläinlajeista, solulinjassa, joka on peräi- ie 93025 sin toisilta eläinlajeilta, saattaa olla tuloksena erilainen amino-päätteinen tähde kuin tavallisesti on laita. Samalla tavalla, tässä yhteydessä käyttöön annettu mutaatio esimerkiksi tekee mahdolliseksi muuttaa lymfotoksiinin 5 aminohapposekvenssiä ja N-päätettä, jolloin pH-stabiilisuus, isoelektrinen piste yms. sellainen muuttuvat.

Kuviossa 2a esitetään humaanilymfotoksiinille aminohapposekvenssiä, jolle translaatio on suoritettu. Huomaa, että tähän sekvenssiin sisältyy 34 tähdettä esisekvenssiä, 10 jonka uskotaan poistuvan humaanisoluissa, muokattaessa normaalisti transkriptiotuotetta, jolle translaatio on suoritettu (tässä yhteydessä, yhdessä sen mutanttien, "pre-lymfotoksiinin" kanssa), jolloin tuloksena on leu-syyli-aminopäätteinen laji. Histidyylin amino-päätteenä 15 sisältävä laji on homologinen leusyylin amino-päätteenä käsittävälle lajille, paitsi että leusyyli-amino-terminaa-lisen lajin 23 ensimmäistä aminohappoa puuttuvat. Kaikki kolme lajia, esim. pre-lymfotoksiini, leusyyli-amino-terminaalinen lymfotoksiini sekä histidyyli-amino-päättei-20 nen lymfotoksiini, samoin kuin niiden metionyyli-, modifioitu metionyyli-, mutantti- ja glykosyloimattomat muodot sisältyvät lymfotoksiinin piiriin. Glykosyloimatto-malla leusyyli- ja histidyyli-amino-päätteisillä lajeilla on alhaisemmat molekyylipainot kuin edellä on kuvattu lym-25 foblastisoluista saatujen homologisten lajien suhteen.

Pre-lymfotoksiini on lymfotoksiini-laji, joka sisältyy edellä esitetyn määritelmän piiriin. Sille on ominaista signaali- (tai johdanto-) polypeptidi molekyylin amino-päätteessä. Yleisesti sanottuna, lymfotoksiinin ·. 30 alkuperäinen signaali-polypeptidi pilkkoutuu proteolyyt- tisesti lymfotoksiinista eritystapahtuman osana, jossa proteiini erittyy solusta. Signaali-peptidi saattaa olla mikrobi- tai nisäkäsperäinen (alkuperäinen, 34-tähde-esisekvenssi mukaanluettuna), mutta se on mieluummin 35 isäntäsolulle homologinen signaali. Joitakin signaali- 17 93025 lymfotoksiini-fuusioita isäntäsolu ei tunnista tai "prosessoi" N-päätteiseen, metionyylittomaan lymfotok-siiniin. Sellaisilla yhteenliittymillä, jotka sisältävät mikrobiperäisiä signaaleja, on käyttöä esimerkiksi 5 lymfotoksiini-immunogeeneina.

Huomattakoon, että ilmaus "mahdollinen" sytotoksi-sesta aktiivisuudesta tarkoittaa, että lymfotoksiiniin sisältyy polypeptidejä, jotka voidaan esim. entsymaatti-sen hydrolyysin avulla zymogeenille analogisesta, inak-10 tiivisesta tilasta muuttaa polypeptidi-fragmentiksi, jolla on toivottu biologinen aktiivisuus. Ilmauksen "mahdollinen" sytotoksisesta aktiivisuudesta in vitro tai in vivo, tarkoituksena on sulkea piiriinsä ei-syto-toksiset polypeptidit, jotka voidaan muuttaa, esim. entsy-15 maattisen hydrolyysin avulla, inaktiivisesta, zymogee nille analogisesta tilasta polypeptidifragmentiksi, jolla on määriteltävissä oleva biologinen aktiivisuus. Tyypillisesti, inaktiiviset prekursorit tulevat olemaan fuusio-proteiineja, joissa lymfotoksiini on peptidisidok-20 sella karboksyyli-päästään sidottu toiseen proteiiniin tai polypeptidiin. Tähän peptidisidokseen rajoittuva tai sen lähellä sijaitseva sekvenssi on valittu siten, että se on herkkä proteolyyttiselle hydrolyysille, jotta lymfotoksiini vapautuu, joko in vivo tai osana valmistus-25 menetelmää, in vitro. Tyypillisiä kytkentä-sekvenssejä ovat lys-lys tai arg-lys. Ei-lymfotoksiini-komponentti, kuten esimerkiksi pro-lymfotoksiini, on edullisesti homologinen proteiini, niin että se vähentää fuusion immuuni-geenisuutta. Homologisen proteiinin tulisi olla vaaraton 30 eikä sen tulisi sitoutua solunpintoihin. Täten aikaan saadulla lymfotoksiinilla tulee sitten olemaan määriteltävissä oleva vaadittu sytotoksinen aktiivisuus.

Vaikka lymfotoksiinilla tavallisesti tarkoitetaan ihmisen lymfotoksiinia, hiireltä, sioilta, hevoselta 35 tai härältä saatu lymfotoksiini sisältyy lymfotoksiini- ie 93025 määritelmän piiriin, sikäli kuin se noudattaa yllä kuvattuja normeja homologisten alueiden ja biologisen aktiivisuuden suhteen. Esimerkiksi, härän ja hiiren lymfo-toksiinien on havaittu olevan erittäin homologisia (noin 5 80 %:isesti) humaanilymfotoksiinin kanssa. Lymfotoksiini ei ole lajispesifinen, esim. humaanilymfotoksiini on aktiivinen hiiren kasvaimia ja neoplastisia solulinjoja kohtaan. Siitä syystä yhdestä lajista saatua lymfotoksii-nia voidaan käyttää toisen lajin hoidossa.

10 Lymfotoksiiniin sisältyy myös multimeeri-muotoja.

Lymfotoksiini aggregoituu spontaanisti multimeereiksi, tavallisesti dimeereiksi tai korkeammiksi multimeereiksi. Multimeerit ovat sytotoksisia ja sen mukaisesti ne soveltuvat käytettäviksi terapiaan in vivo. Lymfotoksiini ilmen-15 tyy rekombinantti-isännissä monomeerinä. Kuitenkaan lym-fotoksiinilla ei ole jälkeenpäin taipumusta muodostaa spontaanisti multimeerejä. Homogeeniset multimeerit tai erilaisten multimeerien seokset ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia.

20 Lymfotoksiinivariantteihin sisältyy ennalta mää rättyjä tai kohdistettuja, esim. paikan suhteen spesifisiä, kuvion 2a esittämän molekyylin tai sen fragmenttien mutaatioita. Lymfotoksiinivariantit määritellään polypeptideinä, joilla muutoin on lymfotoksiiniin mää-25 ritellyt ominaisuudet, paitsi että niille on ominaista aminohapposekvenssi, joka eroaa kuviossa 2a esitetystä sekvenssistä, joko tähteiden pois jättämisen, substituution tai insertion suhteen. Tässä yhteydessä kuvattuja ei-humaanilymfotoksiineja sekä humaanilymfotoksii-30 nin alleeleja pidetään varianttilymfotoksiineina, koska ne ovat paikkakohtaisia mutantteja, joilla ei ole mitään luonnossa esiintyvää kaksoiskappaletta. Mutaation kohteena on konstruoida DNA, joka koodittaa yllä esitetyn määritelmän mukaista lymfotoksiinia, mutta jolla on omi-35 naisuuksia, jotka muuntavat luonnossa esiintyvän lymfo- 19 93025 toksiinin biologista aktiivisuutta tai helpottavat lymfo-toksiinin valmistusta. Esimerkiksi lysiini +89 kodoni läpikäy mutaation, jotta histidiini-tähde ilmentyy lysiini-tähteen tilalla. Histidiini +89 ei enää hydrolysoidu 5 trypsiinillä (joka yleensä pilkkoo proteiinit arg-X- tai lys-X-sidoksen kohdalta). Proteaasiresistenssin odotetaan antavan mutantille suuremman biologisen puoliintumisajan kuin on laita lymfotoksiinin suhteen, jolla on kuvion 2a mukainen sekvenssi (tai sen fragmentti). Muut lymfotok-10 siinin lysiini- ja arginiini-tähteet saattavat mutantoi-tua histidiiniksi, kuten esimerkiksi lysiini +28, lysiini +19 tai arginiini +15.

Kuten yllä on esitetty, tietyillä lymfotoksiini-molekyylin alueilla on oleellista homologiaa samalla tavoin 15 aktiivisen proteiinin kanssa, jota merkitään kasvainkuo-liotekijäksi (tumor necrosis factor). Aminohappotähteet näissä pääkohdittain homologisissa sekä niitä välittömästi reunustavissa alueissa ovat edullisia mutaatiolle, jotka kohdistuvat lymfotoksiinimutanttien identifiointiin, 20 joilla on poikkeavaa biologista tai sytotoksista aktiivisuutta. Sellaisia mutantteja valmistetaan sinänsä tunnetuin menetelmin, ja ne seulotaan halutun biologisen aktiivisuuden suhteen, esimerkiksi lisääntyneen sytotoksisuuden suhteen, tiettyä käsiteltävää kasvainta kohtaan tai, 25 eläinten immunisointiin tarkoitetun 1ymfotoksiini-lajin ollessa kysymyksessä, kyvyn suhteen saada aikaan voimakkaampi immuunivaste. Esimerkkejä sellaisista lymfotoksiini-varianteista ovat seuraavat: Ala=168 on läpikäynyt mutaation haaraketjuiseksi aminohapoksi (vai, ile tai leu); 30 hydrofobinen aminohappo (esim. phe, vai, ile tai leu) on insertion avulla sijoitettu thr+163:n ja val+164:n väliin; tyrosiinilla on korvattu thr+163; lysiinillä on korvattu ser+82; ser+42 on korvattu isoleusiinilla, leusiinilla, fenyylialaniinilla, valiinilla tai histidiinillä; lys+84 35 on korvattu glutamiinilla, tryptofäänillä, seriinillä 20 93025 tai histidiinillä; ser+82 on poistettu; leu+171:een on liitetty hydrofobinen di- tai tri-peptidi; thr+163 on korvattu asparagiinihapolla tai lysiinillä; ala-lys on insertion avulla sijoitettu glu+127:n ja pro+128:n väliin; 5 ser+70 on korvattu lysiinillä tai glysiinillä; thr+69 on korvattu tyrosiinilla; lys+28 on korvattu arginiinilla tai histidiinillä; his+32 on korvattu arginiinilla tai lysiinillä; asp+36 on korvattu proliinilla, seriinillä, treoniinilla, tyrosiinilla tai glytamiinihapolla; ser+38 10 on korvattu tyrosiinilla, metioniinilla tai glutamiini-hapolla; ser+61 on korvattu treoniinilla, tyrosiinilla, histidiinillä tai lysiinillä; gly+124 on korvattu asparagiinihapolla, seriinillä tai tyrosiinilla; his+135 on korvattu arginiinilla, lysiinillä, tyrosiinilla, trypto-15 faanilla tai proliinilla; thr+142 on korvattu asparagiinihapolla; ja gln+146 on korvattu lysiinillä tai treoniinilla.

Erittäin halutun mutanttien ryhmän muodostavat mutan-tit, joista metioniini-tähteet humaanilymfotoksiini-20 tähteistä +20, +120 ja +133 on poistettu, tai, mieluimmin, ne on substituoitu vastaavilla tähteillä, joita esiintyy muiden lajien lymfotoksiineissa, kuten esimerkiksi sellaisissa, joita kuvataan kyseessä olevan hakemuksen . yhteydessä muualla. Esim. met+20, +120 ja +133 substituoi- 25 daan vastaavasti treoniinilla, seriinillä ja valiinilla.

Nämä ovat härän lymfotoksiinin vastaavat tähteet. Substituutio saadaan aikaan esimerkissä 9 kuvatulla tavalla, paitsi että met+133 käy läpi mutaation val:ksi mutaation seuraavan vaiheen avulla, jossa käytetään Ml3 faagia si-* 30 nänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti. Tätä eläinlaji- hybridilymfotoksiini-DNA-mutaattia käytetään esimerkin 7 leusyylin amino-päätteenä käsittävän DNA:n tilalla, ja ilmentyy fuusiona. Tunnettuja menetelmiä noudattamalla syanogeenibromidia käytetään STII-signaalin lohkaisemi-35 seen hybridilymfotoksiinista, ja takaisin saadaan kypsä, leysyylin amino-päätteenä sisältävä lymfotoksiini.

2i 93025

Muita käyttökelpoisia lymfotoksiinivariantteja ovat ne, joissa kasvainkuoliotekijästä saadut tähteet korvaavat vastaavat lymfotoksiini-tähteet hybridien, kasvainkuolioteki jä-lymfotoksiini-varianttien valmistamiseksi.

5 Tyypillinen esimerkki on korvata leusyyliamino-päätteisen lymfotoksiinin ensimmäiset 27 tähdettä kypsän kasvainkuolioteki jän ensimmäisillä 8:11a, 9:llä tai 10:llä tähteellä (esim. val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp-). Tämän muunnoksen on todennäköisemmin oltava sellaisen, 10 josta N-terminaalisesti on poistettu metionyyli E. colissa tapahtuvassa suorassa ekspressiossa.

Niin kauan kuin mutaatio-kohta on ennalta määrätty, on tarpeetonta, että mutaatio sinänsä on ennalta määrätty. Esimerkiksi histidiini +89 lymftoksiini-mutantin tehon 15 optimoimiseksi, aikaansaadaan umpimähkäinen mutaatio ly-siini +89:n kodonissa ja ilmentyneet lymfotoksiini-mutan-tit seulotaan sytotoksisen aktiivisuuden ja proteaasire-sistenssin optimiyhdistelmän suhteen.

Lymfotoksiini saattaa myös sisältää insertioita, 20 tavallisesti noin 1-10 aminohappotähteen, tai noin 1-30 tähteen deleetioita. Substituutiot, deleetiot, insertiot tai mikä tahansa alayhdistelmä saatetaan yhdistää lopullisen rakenteen saamiseksi. Insertioihin sisältyvät amino-• ja karboksyyli-päätteiset yhteenliittymät, esim. karbok- 25 syyli päähän lisätty hydrobobinen pidennys. Mieluummin kuitenkin suoritetaan ainoastaan substituutiomutaatio. Ilmeisesti, koodittavassa DNA:ssa sijaitsevia mutaatioita ei tule sijoittaa lukuraamin ulkopuolelle ja mieluummin ei muodosteta komplementaarisia alueita, jotka voisivat 30 valmistaa sekundaarisen mRNA-rakenteen. E. colin uutteilla, jotka on transformoitu vektoreilla, jotka sisältävät DNA:a, joka koodittaa lymfotoksiini-mutantteja, joista puuttuu ainakin 16 karboksi-päätteistä aminohappoa tai joilta puuttuvat leusyyli-amino-päätteisen lymfotoksiinin ensim-35 mäiset 33 aminopäätteistä tähdettä, ei ole sytotoksista 22 9 3 0 2 5 aktiivisuutta. Kuitenkaan syitä aktiivisuuden puuttumiseen ei tunneta, ja ne voivat olla mitkä hyvänsä esimerkissä 1 alempana esitetyistä syistä.

Kaikki mutaatiot DNA:ssa, joka koodittaa lymfotok-5 siinia, eivät ilmenny rekombinantti-soluviljelmän viimeisessä tuotteessa. Esimerkiksi, DNA-substituutio-mutanttien pääluokan muodostavat ne DNA:t, joissa kuvion 2a esittämä erityssignaali on korvattu erilaisella erityssignaalilla, joko deleetioin 34, tähde-signaalin sisällä tai substi-10 tuutioin, jotka vaihtavat useimmat tai kaikki alkuperäiset signaalit signaaliksi, jonka aiottu isäntä todennäköisemmin tunnistaa. Esimerkiksi konstruoitaessa prokaryoottista ekspressiovektoria, kuvion 2a mukaiselle erityssignaalille suoritetaan delleetio bakteeriperäisen alkalisen fosfa-15 taasin tai lämmön suhteen kestävän enterotoksiini II:n signaalien hyväksi ja hiivalla kuvion 2a mukainen signaali korvataan hiivan invertaasi-, alfa-tekijä- tai hapanfos-fataasi-signaalien hyväksi. Tämä ei merkitse kuitenkaan sitä, etteivät muut isännät kuin humaanisolulinjat tun-20 nista ihmisperäistä eritys-signaalia, kun isäntä "tunnistaa" erityssignaalin, yhteenliittynyt proteiini, joka käsittää lymfotoksiinin ja signaalin, tavallisesti pilkotaan signaali-lymfotoksiini-peptidisidoksen kohdalta sa-. massa tapahtumassa, joka johtaa lymfotoksiinin erittymi- 25 seen. Täten, vieläpä vaikka DNA-mutanttia käytetään isännän transformaatioon, muodostuva lymfotoksiini-tuote saattaa olla joko yhteenliitetty tai alkuperäinen lymfotok-siini, riippuen isäntäsolun tehokkuudesta fuusio-tapahtumassa.

• 30 Eräs toinen DNA-mutanttien pääluokka, jotka eivät ilmenny lymfotoksiinivariantteina, ovat nukleotidisubsti-tuutiot, jotka on tehty ilmentymisen lisäämiseksi, ensisijaisesti välttämällä stem-loop-rakenteita transkriboidussa mRNAjssa (katso käsittelynalaista patenttihakemusta 35 U.S.S.N. 303 687, joka on tähän yhteyteen liitetty viit- 23 93025 teenä) tai antamaan käyttöön kodoneja, jotka valittu isäntä voi helpommin transkriboida, esim. hyvin tunnetut E. colin etusija(preference)-kodonit E. colin ilmentymistä varten.

5 Nukleiinihappomutantti valmistetaan sinänsä tunne tuin menetelmin (A. Hui et ai., 1984, "the EMBO Journal" 3(3): 623 - 629; J. Adelman et ali., "DNA" 2(3): 183 - 193; U.K. Patent Application 2 130 219A; G. Winter et ai., 1982, "Nature" 299: 756 - 758; sekä R. Wallace et ai., 1981, 10 "Nucleic Acids Research" 9(15): 3647 - 3656). Näihin menetelmiin sisältyy M13 faagimutaatio, lymfotoksiinin mutant-tigeenin synteesi esimerkissä 1 ynnä seuraavissa esimerkeissä kuvatulla tavalla tai muiden tunnettujen menetelmien mukaisesti.

15 Lymfotoksiinia koodittava nukleiinihappo on mikä tahansa DNA tai RNA, joka koodittaa polypeptidiä, joka kuuluu tässä yhteydessä määritellyn lymfotoksiinin piiriin, joko sen nukleotidisekvenssit vastaavat tai eivät vastaa luonnossa esiintyviä sekvenssejä. Lisäksi keksinnön 20 piiriin kuuluu nukleiinihappo, joka voi hybridisoitua, ainakin vähemmän ankarissa olosuhteissa, lymfotoksiinia koodittavaan nukleiinihappoon, vaikkakaan hybridisoituva nukleiinihappo ei koodita proteiinia, joka muutoin täyttää lymfotoksiinille määritellyt vaatimukset. Esimerkkinä 25 viimeksi mainitusta olisi koetin, joka polypeptidin, jota se koodittaa, lyhyyden vuoksi ei pysty ekspressoimaan biologisesti aktiivista lymfotoksiinia. Nukleiinihappo, joka koodittaa lymfotoksiinia tai voi sen lisäksi hybridisoitua, valmistetaan orgaanisen synteesin avulla, pää-. 30 piirteissään esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, tai se saadaan luonnossa esiintyvistä lähteistä tutkimalla geeni- tai cDNA-kirjastoja esimerkeissä kuvatulla tavalla.

Kyseessä olevan keksinnön mukainen lymfotoksiini valmistetaan menetelmällä, johon yleensä välttämättä 35 sisältyy isännän transformaatio vektorilla, jossa on haluttua lymfotoksiinia koodittava nukleiinihappo. Vekto- 24 9 3 0 2 5 rilla on replikoituva DNA-rakenne. Vektoreita käytetään tässä yhteydessä DNA:n laajentamiseen tai lymfotoksiinia koodittavan DNA:n ekspressioon. Ekspressiovektori on DNA-rakenne, jossa lymfotoksiinia koodittava DNA-sekvenssi 5 on toiminnallisesti liitetty sopivaan säätelysekvenssiin, joka pystyy saamaan aikaan lymfotoksiinin ekspression sopivassa isännässä. Sellaisiin kontrollisekvensseihin sisältyy transkriptionaalinen säätelyalue(promoottori), valinnainen operaattorisekvenssi transkription kontrol-10 lointiin, sekvenssi, joka koodittaa sopivaa mRNArn ribo-somaalista sitoutumiskohtaa sekä sekvenssit, jotka säätelevät transkription ja translaation päättymistä.

Vektori saattaa olla plasmidi, virus tai liitettävissä oleva DNA-fragmentti (esim. rekombinaation avulla 15 isäntään liitettävissä oleva geeniaines). Kun vektori on transformoitu sopivaan isäntään, vektori replikoituu ja toimii riippumattomana isännän geeniaineksesta, tai se saattaa, joissakin tapauksissa, integroitua geeniainekseen itseensä. Kyseessä olevassa hakemuksessa "plasmidia" ja 20 "vektoria" käytetään joskus erotuksetta, vaikka plasmidi on tällä hetkellä yleisimmin vektorista käytetty muoto. Kuitenkin kaikki muut vektoreiden muodot, jotka ovat toiminnaltaan samanarvoisia ja jotka ovat tai tulevat . olemaan tutkimustyössä tunnettuja, soveltuvat tässä yhtey- a 25 dessä käytettäviksi.

Sopivat vektorit sisältävät replikonin ja kontrolli-sekvenssejä, jotka ovat peräisin lajeilta, jotka sopivat yhteen aiotun ekspressioisännän kanssa. Tranformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka on transformoitu tai trans-.' 30 fektoitu lymfotoksiinivektoreilla, jotka on konstruoitu rekombinantti-DNA-tekniikkaa käyttämällä. Transformoidut isäntäsolut tavallisesti ilmentävät lymfotoksiinia. Eks-pressoitu lymfotoksiini jää solun sisään tai se eritetään periplasmiseen tilaan tai viljelmän supernatanttiin, vali-35 tusta isäntäsolusta riippuen.

Il 25 93025 DNA-alueet ovat toteuttamiskelpoisesta kytkettyjä, kun ne ovat toiminnallisesti yhteen kuuluvia. Esim., esi-sekvenssiä tai eritysjohdantosekvenssiä vastaava DNA on toteuttamiskelpoisesti kytketty polypeptidiä vastaavaan 5 DNA:an, jos se ilmentyy preproteiinina, joka osallistuu polypeptidin erittymiseen? promoottori on toteuttamiskelpoisesti kytketty koodaavaan sekvenssiin, jos se säätelee sekvenssin transkriptiota; tai ribosomin sitoutumiskohta on toiminnallisesti kytketty koodaavaan sekvenssiin, 10 jos se sijaitsee siten, että se sallii translaation.

Yleisesti sanottuna, toteuttamiskelpoisesti kytketty tarkoittaa viereistä ja, erityssekvenssin ollessa kysymyksessä, viereistä ja lukuvaihetta.

Sopivat isäntäsolut ovat prokaryootteja, hiivasoluja 15 tai korkeampia eukaryoottisia soluja. Prokaryootteihin kuuluu gram-negatiivisia tai gram-positiivisia organismeja, esimerkiksi E. coli tai Bacilli. Korkeampiin eukaryootti-siin soluihin kuuluu aikaansaatuja, nisäkäsperäisiä solu-linjoja alla esitetyn kuvauksen mukaisesti. Edullinen 20 isäntäsolu on faagien suhteen resistentti E. colin W3110 (ATCC 27 325)-kanta, jota kuvataan esimerkeissä, vaikka muut prokaryootit, kuten esimerkiksi E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537), E. coli 294 (ATCC 31 446), pseudo-. monas-lajit tai Serratia marcescens soveltuvat.

25 Lymfotoksiinin ekspressioon ovat edullisia prokary- oottiset isäntä-vektori-järjestelmät. Sopivia mikrobipe-räisiä vektoreita on runsaasti saatavilla. Yleisesti sanottuna, mikrobiperäinen vektori sisältää replikaation alun, jonka aiottu isäntä tunnistaa, promoottorin, joka • 30 toimii isännässä sekä fenotyyppisen valintageenin, esimer kiksi geenin, joka koodittaa proteiineja, jotka antavat antibioottiresistenssin tai täydentävät auksotrofista vaatimusta. Samanlaisia rakenteita valmistetaan muita isäntiä varten E. coli transformoidaan tyypillisesti käyt-35 tämällä pBR322:a, plasmidia, joka on peräisin eräältä 26 93025 E. coli-lajilta (Bolivar, et ai., 1977, "Gene" 2:95). pBR322 sisältää geenejä ampisilliini- ja tetrasykliini-resistenssiä varten ja antaa täten käyttöön helppoja keinoja transformoitujen solujen identifioimiseksi.

5 Ekspressiovektoreiden täytyy sisältää promoottori, jonka isäntäorganismi tunnistaa, mutta jota kloonausvek-toreiden ei tarvitse tunnistaa. Promoottori on yleensä homologinen aiotulle isännälle. Promoottoreihin, joita useimmin käytetään yhdistelmä-DNA-rakenteessä, kuuluu 10 β-laktamaasi (penisillinaasi) sekä laktoosipromoottori-järjestelmiä (Chang et ai., 1978, "Nature", 275: 615; ja Goeddel et ai., 1979, "Nature" 281: 544), tryptofaani (trp)-promoottorijärjestelmä (Goeddel et ai., 1980, "Nucleic Acids Res. " 8: 4057 sekä EPO App. Pubi nro 15 36 776) ja tac-promoottori /H. De Boer et ai., "Proc.

Nat'l. Acad. Sei. U.S.A:" 80: 21 - 25 (1983),7- Vaikka nämä ovat yleisimmin käytetyt, muut tunnetut, mikrobi-peräiset promoottorit ovat sopivia. Yksityiskohtia niitä koskevista nukleotidisekvensseistä on julkaistu, mikä 20 tekee asiantuntijoille mahdolliseksi kytkeä ne lymfotok- siinia koodittaviin plasmidivektoreihin (Siebenlist et ai., 1980, "Cell" 20: 269) sekä lymfotoksiinia koodittavaan DNA:an. Tällä hetkellä edullinen vektori on pBR322-johdannainen, joka sisältää E. colin alkalisen fosfataasin pro-25 moottorin Shine-Dalgarno-sekvenssin kanssa. Promoottori ja Shine-Dalgarno-sekvenssi ovat toiminnallisesti kytketyt lymfotoksiinia koodittavaan DNA:an, esim. ne sijaitsevat niin, että ne edistävät lymfotoksiini-mRNA:n transkriptiota DNA:sta.

: 30 Prokaryoottien lisäksi eukaryoottiset mikrobit, kuten esimerkiksi hiivaviljelmät transformoituvat lvmfo-toksiinia koodattavilla vektoreilla. Saccharomyces cerevisiae, eli tavallinen leipomohiiva, on yleisimmin käytetty alempien eukaryoottisten isäntämikro-organis-35 mien joukossa, vaikka monia muita kantoja on yleisesti 27 93025 saatavilla. Hiivavektorit sisältävät yleensä replikaation alun 2 mikronin hiivaplasmidista tai itsenäisesti replikoitavan sekvenssin (ARS), promoottorin, lymfotoksiinia koodittavan DNA:n (humaani pre-lymfotoksiini erityisesti 5 mukaan luettuna), sekvenssejä polyadenylointia sekä transkription päättymistä varten ja valintageenin. Lymfotoksii-nin ekspressiolle sopiva geeni hiivassa on YRp7, (Stinchcomb et ai., 1979, "Nature", 282: 39; Kingsman et ai., 1979, "Gene", 7: 141; Tschemper et ai., 1980, 10 "Gene", 10: 157). Tämä plasmidi sisältää jo trpl-geenin, joka antaa käyttöön valintamarkkerin hiivan mutanttikan-nalle, jolta puuttuu kyky kasvaa tryptofaanissa, esimerkiksi ATCC nro 44076:a tai PEP4-l:a varten (Jones, 1977, "Genetics", 85:12): trpl-vaurion läsnäolo hiivaisäntä-15 solun perintötekijöissä antaa sitten käyttöön tehokkaan ympäristön transformaation havaitsemiseksi tryptofaanin poissaollessa.

Sopiviin promoottorisekvensseihin hiivavektoreissa sisältyvät promoottorit metallotioneiinille, 3-fosfogly-20 seraattikinaasille (Hitzeman et ai., 1980, ”J. Biol.

Chem.", 255: 2073) tai muille glykolyyttisille entsyymeille (Hess et ai., 1968, "J. Adv. Enzyme Reg.", 7: 149; sekä Holland et ai., 1978, "Biochemistry", 17: 4900), . kuten esimerkiksi enolaasille, glyseraldehydi-3-fosfaatti- 25 dehydrogenaasille, heksokinaasille, pyruvaattidekarboksi- laasille, fosfofruktokinaasille, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasille, 3-fosfoglyseraattimutaasille, pyruvaatti-kinaasille, triosifosfaatti-isomeraasille, fosfoglukoosi-isomeraasille sekä glukokinaasille. Hiivassa tapahtuvaan : 30 ilmentymiseen sopivia vektoreita ja promoottoreita kuva taan edelleen R. Hitzemanin et ai. julkaisussa, et ai.

EPO Pubin, nro 73 657.

Muut promoottorit, joilla on kasvutekijöiden sääte-lemän transkription lisäetu, ovat promoottorialueet alko-35 holidehydrogenaasi 2:lie, isosytokromi C:lle, happamelle fosfataasille, hajoittaville entsyymeille, jotka kytkey- 28 9 3 0 2 5 tyvät typen metaboliaan, sekä edellä mainitulle metallo-tioneiinille ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaa-sille samoin kuin entsyymeille, jotka vastaavat maltoosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä. Sopivia ekspressioplasmi-5 deja konstruoitaessa, näihin geeneihin kytkeytyvät pääte-sekvenssit liitetään myös lymfotoksiinia koodittavien sekvenssien ekspressiovektori 3:een, jotta annetaan käyttöön mRNA:n polyadenylaatio ja päätös.

Isäntinä voidaan myös käyttää mikro-organismien 10 lisäksi soluviljelmiä, jotka ovat peräisin monisoluisista organismeista. Tämä ei kuitenkaan ole edullista, koska tähän saakka on saatu mainioita tuloksia lymfotoksiinia ekspressoivilla mikrobeilla. Kuitenkin periaatteessa mikä tahansa korkeampi eukaryoottinen soluviljelmä, joka on 15 peräisin joko vertebraatti- tai invertebraattiviljelmästä, on sopiva. Mielenkiinto on kuitenkin ollut suurinta verte-braattisoluja kohtaan, ja vertebraattisolujen lisäämisestä viljelmissä (kudosviljelmä) on tullut viime vuosina rutiininomainen menetelmä /Tissue Culture, Academic Press, 20 Kruse ja Patterson, julkaisijat (1973/7· Käyttökelpoisten isäntäsolulinjojen esimerkkejä ovat VERO- ja HeLa-solut, kiinalaisen hamsterin munasarjan solulinjat (CHO) sekä WI38-, BHK-, COS-7- ja MDCK-solulinjät. Sellaisten solujen ekspressiovektoreihin tavallisesti sisältyy (jos * 25 on tarpeellista) replikaation alkukohta, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin yläpuolella, yhdessä ribosomin sitoutumiskohdan kanssa, RNA:n sitoutumiskohta (jos käytetään intronin sisältävää geeni-DNA:a), polyadenylaatio-kohta sekä transkriptionaalinen päätesekvenssi.

. 30 Ekspressiovektoreissa sijaitsevat, transkription ja translaation kontrollisekvenssit transformoivissa ver-tebraattisoluissa tapahtuvaa käyttöä varten saadaan usein virusperäisistä lähteistä. Esimerkiksi, yleisesti käytetyt promoottorit ovat peräisin polyomasta, Adenovirus 35 2:lta ja mieluiten Simian -virus 40:sta (SV40). Aikaiset ja myöhäiset promoottorit ovat erityisen käyttökelpoisia, 29 9 3 0 2 5 koska molemmat saadaan viruksesta fragmenttina, joka sisältää myös SV40-virukselta peräisin olevan replikaation alkukohdan (Fiers et ai., 1978, "Nature"; 273: 113). Voidaan myös käyttää pienempiä tai suurempia SV40-fragment-5 teja, edellyttäen että niihin sisältyy suunnilleen 250 bp- sekvenssi, joka ulottuu Hind ΙΙΙ-kohdasta Bgl I-kohtaa kohti, joka sijaitsee replikaation virusperäisessä alkukohdassa. Edelleen on myös mahdollista ja usein myös toivottavaa käyttää hyväksi humaanigeenistöön sisältyvää 10 promoottori-, kontrolli- ja/tai signaalisekvenssejä, jotka normaalisti liittyvät lymfotoksiiniin, sillä edellytyksellä että sellaiset kontrollisekvenssit ovat isäntäsolu-systeemin kanssa yhteensopivia.

Replikaation alkukohta saatetaan antaa käyttöön 15 joko konstruoimalla vektori, johon sisältyy eksogeeninen alkukohta, esimerkiksi se saattaa olla peräisin SV40- tai muusta viruslähteestä (esim. Polyoma, Adenovirus, VSV tai BPV), tai sen antaa käyttöön isäntäsolun kromosomaalinen replikaatiomekanismi. Jos vektori yhdistetään isäntäsolu-20 kromosomiin, viimeksi mainittu on usein riittävä. Lymfo- toksiinia valmistetaan usein ilman amino-päätteistä metio-nyyliä, transformoimalla korkeampia eukaryoottisia soluja humaani-pre-lymfotoksiini-DNA:11a.

, Edullista nisäkäsisäntäsolua valittaessa transfek- 25 tiota varten, joka suoritetaan vektoreilla, jotka käsittävät sekä lymfotoksiinin että dihydrofolaattireduktaasia (DHFR) koodittavia DNA-sekvenssejä, on sopivaa valita isäntä käytetyn DHFR-proteiinin mukaisesti. Jos käytetään tyypiltään villiä DHFR-proteiinia, on edullista valita isäntä-• 30 solu, jolta puuttuu DHFR ja joka täten tekee mahdolliseksi DHFR:a koodattavan sekvenssin käytön onnistuneen transfek-tion markkerina selektiivisessä elatusaineessa, josta puuttuvat hypoksantiini, glysiini sekä tymidiini. Tässä tapauksessa sopiva isäntäsolu on kiinan hamsterin munasarja-35 solulinja (CHO), josta puuttuu DHFR-aktiivisuus, joka on 30 93025 valmistettu ja joka lisääntyy Urlaubin ja Chain kuvaamalla tavalla, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sei." (USA) 77: 4216.

Toisaalta, jos DHFR-proteiinia, jolla on alhainen sitoumisaffiniteetti metoreksaattia (MTX) kohtaan, koo-5 dittavaa DNA:a käytetään kontrollointisekvenssinä, ei ole tarpeellista käyttää DFRrlle resistenttejä soluja.

Koska DHFR-mutantti on resistentti MTX:lie, MTX:a sisältävää elatusainetta voidaan käyttää valintakeinona edellyttäen, että isäntäsolut itse ovat MTX:lie herkkiä.

10 Useimmat eukaryoottiset solut, jotka voivat absorboida MTX:a, näyttävät olevan herkkiä metotreksaanille. Eräs sellainen käyttökelpoinen solulinja on CHO-linja, CHO-K1 (ATCC nro CCL 61).

Transformoidut isäntäsolut ovat soluja, jotka ovat 15 transformoituja tai transfektoituja yhdistelmä-DNA-tek-niikkaa käyttämällä konstruoiduilla lymfotoksiinivekto-reilla. Transformoidut isäntäsolut tavallisesti ekpressoi-vat lymfotoksiinia. Ilmentynyt lymfotoksiini jää tavallisesti säilytettäväksi solunsisäisesti.

20 Lymfotoksiini saadaan takaisin ei erittävien solujen rekombinanttiviljelmistä hajottamalla solut ja poistamalla partikkeliaines sentrifugoimalla yms. tavalla. Lymfotok-siinia erittävät solut erotetaan viljelmäsupernatantista sentrifugoimalla. Kontaminoitunut lymfotoksiiniliuos 25 puhdistetaan sitten yllä viitatuin menetelmin tai esimerkissä 4 alla kuvatun immunoaffiniteettimenetelmän mukaisesti. Lymfotoksiini puhdistetaan sellaiseksi, että se soveltuu farmakologiseen käyttöön, ja se saatetaan sopiviksi annosmuodoiksi, esim. pulloihin tai ruiskuihin.

30 Mieluiten lymfotoksiini lyofilisoidaan pitkiä varastointi-' aikoja varten tai se saatetaan panna vesiliuokseen stabili- saattoreiden ja täyteaineiden kanssa, esimerkiksi isotoniseen keittosuolaliuokseen, ja antaa potilaille B.

Aggarwal et ai.:n kuvaamalla tavalla, European Patent 35 Application 100641.

31 93025

Lymfotoksiinikoostumuksia annetaan kasvaimia kantaville eläimille. Antaminen suoritetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti, esim. laskimonsisäisenä, intraperito-neaalisena, ihonalaisena, lihaksensisäisenä, vammansisäi-5 senä, steriileiden lymfotoksiiniliuosten infuusioina tai ruiskeina tai alla kuvattuja, hidastettuja vapautumis-järjestelmiä käyttäen. Lymfotoksiinia annetaan vaurion-sisäisesti, esim. suorana injektiona kiinteisiin kasvaimiin. Hajapesäkkeisten kasvaimien, kuten esimerkiksi leu-10 kemian ollessa kysymyksessä, annostelu suoritetaan mieluummin laskimonsisäisesti tai lymfajärjestelmään. Vatsa-elinten kasvaimia, kuten esimerkiksi munarauhassyöpää käsitellään edullisesti vatsaontelonsisäisen infuusion avulla, käyttämällä vatsakalvodialyysilaitteistoa sekä 15 vatsakalvon kanssa yhteen sopivia liuoksia. Tavallisesti kuitenkin lymfotoksiini annetaan jatkuvana infuusiona, vaikka bolusinjektio hyväksytään.

Haluttaessa lymfotoksiini annostellaan implantoi-dusta, hitaasti luovuttavasta valmisteesta. Esimerkkeihin 20 proteiineille, joilla on lymfotoksiinidimeerin tai -trimee-rin molekyylipaino, soveltuvista järjestelmistä kuuluvat L-glutamiinihapon ja γ-L-glutamaatin kopolymeerit (U. Sidman et ai., 1983, "Biopolymers" 22 (1): 547 - 556), poly-(2-hydroksietyyli-metakrylaatti) (R. Langer et ai., 25 1981, "J. Biomed. Mater. Res. 15: 167 - 277 sekä R. Langer, 1982, "Chem. Tech." 12: 98 - 105) tai etyleenivinyyliase-taatti (R. Langer et ai.. Id.). Lymfotoksiinia sisältävät valmisteet implantoidaan leikkauskohtiin, joista kasvaimet on poistettu. Vaihtoehtoisesti lymfotoksiini kapse-30 loidaan semipermeaabeleihin mikrokapseleihin tai liposo-meihin kasvaimeen suoritettavaa injektiota varten. Tämä annostelutapa soveltuu erityisesti, kun kysymyksessä ovat kasvaimet, joita ei voida leikata, esimerkiksi aivokasvainten käsittelyyn.

35 Annosteltavan lymfotoksiinin määrä riippuu esimer kiksi annostelutiestä, kysymyksessä olevasta kasvaimesta 32 93025 sekä potilaan tilasta. Hoitavalle lääkärille on välttämätöntä määrittää annoksen tiitteri ja muuntaa annostelu-tietä tarvittaessa, jotta saadaan optimaalinen sytotoksi-nen aktiivisuus kohteena olevaa kasvainta vastaan, kuten 5 esimerkiksi voidaan määrittää kasvaimen biopsian avulla tai oletetuille syöpämarkkereille, kuten esimerkiksi kar-sinoembryonaaliselle antigeenille soveltuvilla diagnostisilla määritysmenetelmillä, ottaen huomioon suurilla annoksilla tavattu rekombinanttitoksisuus. Tavallisesti 10 rekombinanttilymfotoksiini-annosten hiirellä, jotka ovat noin 50 - 200 ^ug/kg ruumiinpainoa/päivä, laskimonsisäisesti annettaessa, on havaittu olevan pääpiirteissään myrkyttömiä ja tehokkaita in vivo. Ilmeisesti annosohjeet vaihtelevat eri eläimillä.

15 Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyt töön menetelmä lymfotoksiinia neutraloivan vasta-aineen saamiseksi. Neutraloiva vasta-aine määritetään vasta-aineeksi, joka pystyy immunologisesti sitomaan kyseessä olevan keksinnön yhteydessä määritellyn lymfotoksiinin 20 siten, että se tuntuvasti vähentää lymfotoksiinin aktiivisuutta sytostaattisissa tai sytolyyttisissä lymfotoksiinin aktiivisuusmäärityksissä, kuten esimerkiksi alla kuvatussa hiiri L929:llä suoritetussa määrityksessä. Se seikka, että vasta-aine pystyy neutraloimaan lymfotoksii-25 niaktiivisuuden, ei tarkoita, että vasta-aineen pitää sitoutua suoraan lymfotoksiinin aktiiviseen tai reseptoria sitovaan kohtaan. Vasta-aine saattaa tuntuvasti neutraloida lymfotoksiinin aktiivisuutta, jos se steerisesti sitoutuu alueeseen, joka on viereinen kriittiselle kohdal-30 le, esim. konformaation kannalta viereinen eikä välttä-: mättä viereinen aminohapposekvenssin kannalta katsottuna.

Yritettäessä valmistaa neutraloiva, monoklonaalinen vasta-aine lymfotoksiinia vastaan, näytti vaikealta immunisoida hiiriä sillä tavalla, että lymfotoksiinia neutraloiva 35 vasta-aine syntyy tai se herätetään eläimissä. Immuni-.· sointi lymfoblastiperäisellä lymfotoksiinilla eikä glu- 33 95025 tardehydin kanssa ristiinkytketyllä lymfotoksiinilla tuottanut mitään havaittavaa määrää neutraloivaa vasta-ainetta immunisoidun hiiren seerumissa, ei vaikka hiirtä käsiteltiin ei neutraloivalla anti-lymfotoksiini-vasta-5 aineella, joka voitiin havaita immunologisessa entsyymi-määrityksessä. Kuitenkin, lymfotoksiini-aluna (aluminium-hydroksidi tai aluminiumoksidi, A^O^* 31^0) -adsorptio-kompleksi synnyttää neutraloivan vasta-aineen vieläpä eläimissä, joiden on epäonnistunut kehittää aktiivisuutta 10 ennen alunakompleksilla suoritettua immunisointia. Alunan valmistus ja sen käyttö antiseerumin valmistuksessa on julkaistu kirjassa C. Williams, et ai., julkaisijat, 1967, Methods in Immunology and Immunochemistry I, ss.

197 - 229.

15 On suoritettu neutraloivaa vasta-ainetta valmista vien, eläimiltä saatujen pernasolujen fuusio hiiren myelo-masolujen kanssa. Keskimäärin on ollut kloonattava noin 50 - 100 kloonia yhden kloonin identifioimiseksi, joka syntetisoi neutraloivaa vasta-ainetta. Kloonien seulonta-20 menetelmä halutun aktiivisuuden suhteen on rutiinimainen ja kuuluu tavanomaisten taitojen piiriin ja jonka voi helposti toistaa vähäisin vaivannäöin.

Immunisoidusta eläimestä saatu seerumi, plasma tai IgG-jakeet sekä immunoglobuliinit, jotka ovat erit-25 tyneet hybridoma-soluista, jotka on kehitetty immunisoitujen eläinten perna- ja lymfasoluista, tyydyttävät keksinnön mukaisen käytön. Edullisessa patentin suoritusmuodossa neutraloiva vasta-aine saadaan oleellisesti muusta hybridoma-viljelmässä esiintyvästä anti-lymfotoksiini-30 vasta-aineesta vapaana.

! Neutraloiva vasta-aine tehdään liikkumattomaksi adsorboimalla se pintoihin, esimerkiksi muoviin, kuten polystyreeniin, tai sitomalla kovalenttisesti sideaineisiin, kuten syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharoseen. 35 Sitten sitä käytetään immunologisiin määrityksiin tai 34 93025 immunoaffiniteetin avulla suoritettavaan puhdistukseen. Koska vasta-aine on neutraloiva vasta-aine, on mitä sopivinta adsorboida se ja ilmaista biologisesti aktiivinen lymfotoksiini tai sen fragmentit. Vasta-aine on erityisen 5 käyttökelpoinen immunoradiometrisissä ("sandwich”), immuno logisissa määritysmenetelmissä yhdessä ei neutraloivan anti-lymfotoksiini, monokloonisen vasta-aineen tai poly-klonaalisen antiseerumin kanssa, joka sisältää ei neutraloivan anti-lymfotoksiinin. Immunologinen määritvs suori-10 tetaan käyttämällä joko neutraloivaa tai ei neutraloivaa vasta-ainetta merkattuna komponenttina, mikä merkkaus on tehokas havaittavan aineen kanssa, kuten esimerkiksi fluo-roiva, kemiluminoiva tai radioisotooppileimaus, tunnettujen menetelmien mukaisesti. Kompetitiivisiä lymfotok-15 siinin määritysmenetelmiä varten lymfotoksiini merkataan samalla tavalla. Kloramiini-T:n avulla suoritettu radio-jodeeraus soveltuu sekä lymfotoksiini- että lymfotoksiinin vasta-aine-merkkiaineen valmistukseen, tai käytetään menetelmiä, joita on kuvattu julkaisussa J. Klostergaard et 20 ai., "Mol. Immun." 18: 455 (1980).

Esimerkkien yksinkertaistamiseksi, tiettyihin usein esiintyviin menetelmiin viitataan pikakirjoitusilmaisuin.

Plasmideja merkitään pienellä kirjaimella p, joka . on ensiksi ja/tai jota seuraavat suuret kirjaimet ja/tai 25 numerot. Kyseessä olevassa keksinnössä käytettyjä aloitus-plasmideja on kaupallisesti saatavissa, niitä on julkisesti saatavissa rajoittamattomasti tai ne voidaan konstruoida sellaisista saatavissa olevista plasmideista julkaistujen menetelmien mukaisesti. Muut samanarvoiset plasmidit ovat 30 tutkimustyössä tunnettuja ja ovat selviä työn suorittajalle.

DNA:n "hajottaminen" (digestion) tarkoittaa DNA:n pilkkomista entsyymillä, joka vaikuttaa ainoastaan DNA:n tiettyihin kohtiin. Sellaisia entsyymejä nimitetään rest-35 riktioentsyymeiksi, ja kohdat, joille ne ovat spesifisiä, 35 93025 ovat nimeltään restriktiokohtia. "Osittainen" hajottaminen tarkoittaa epätäydellistä hajottamista restrik-tioentsyymin avulla, esim. olosuhteet on valittu siten, että tuloksena on joidenkin, mutta ei kaikkien restriktio-5 endonukleaasille alttiiden kohtien pilkkoutuminen DNA- substraatissa. Erilaiset restriktioentsyymit, joita tässä yhteydessä käytetään, ovat kaupallisesti saatavissa, ja käytettiin niiden reaktio-olosuhteita, kofaktoreita sekä muita vaatimuksia, jotka entsyymin toimittaja oli 10 ilmoittanut, Restriktioentsyymejä merkitään tavallisesti lyhennyksin, jotka koostuvat isoista kirjaimista, joita muut kirjaimet seuraavat ja sitten yleensä numerosta, joka edustaa mikro-organismia, josta kukin restriktioentsyymi on alunperin otettu. Yleensä käytetään noin 1 ^ug plasmi-15 dia tai DNA-fragmenttia noin yhden yksikön kanssa entsyymiä noin 20 ^ulissa puskuriliuosta. Valmistaja määrää tarkoin tietyille restriktioentsyymeille sopivat puskurit ja substraatin määrät. Tavallisesti käytetään noin 1 tunnin inkubaatioaikoja 37°C:ssa, mutta niitä saatetaan muuttaa 20 toimittajan ohjeiden mukaisesti. Inkuboinnin jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolilla ja kloroformilla, ja hajotettu nukleiinihappo saadaan takaisin vesijakeesta saostamalla se etanolilla, Restriktioentsyymillä suoritettua hajottamista seuraa harvoin 5' -päätteisten fosfaat-25 tien hydrolyysi bakteeriperäisellä alkalisella fosfataa- silla, jotta estetään DNA-fragment!n kahden, restriktion avulla leikatun pään yhtyminen renkaaksi tai muodostamasta silmukkaa, mikä estäisi toisen DNA-fragmentin insertion restriktio-kohtaan. Jollei muuten ole mainittu, plasmi-30 dien hajottamista ei seuraa 5' -päätteisen fosforin poistaminen. Defosforylaation menetelmät ja reagenssit ovat tavanomaisia (T. Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning ss. 133 - 134): DNA:n tietyn fragmentin "takaisin saaminen" tai 35 "eristäminen" restriktio-hajotustuotteesta tarkoittaa 36 93025 hajotustuotteen erottamista polyakryyliamidigeelielektro-foreesin avulla, kiinnotavan fragmentin identifiointia vertaamalla sen liikkuvuutta markkeri-DNA-fragmenttien, joiden molekyylipaino tunnetaan, liikkuvuuteen, poista-5 maila halutun fragmentin sisältävä geelipala ja erottamalla DNA geelistä. Tämä menetelmä on yleisesti tunnettu. Esimerkiksi katso R. Lawn et ai., 1981, "Nucleic Acids Res." 9: 6103 - 6114, sekä D. Goeddel et ai., 1980, "Nucleic Acids Res." 8:4057.

10 "Southern Analysis" on menetelmä, jolla DNA-sekvens- sien läsnäolo hajotustuotteessa tai sen DNA:a sisältävä koostumus varmistetaan hybridisaation avulla tunnettuun merkattuun oligonukleotidiin tai DNA-fragmenttiin. Kyseessä olevan keksinnön yhteydessä, jollei muutoin ole mainittu, 15 Southern-analyysi tarkoittaa hajotustuotteen erottamista 1 %:isella agaroosilla, denturointia js siirtämistä nitro-selluloosalle E. Southernin menetelmän avulla, E. Southern, 1975, "J. Mol. Biol." 98:503-517, sekä hybridisaatiota T. Maniatisin et ai.:n kuvaamalla tavalla, 1978, "Cell" 20 15:687-701.

"Transformaatio" tarkoittaa DNA:n viemistä organismiin, niin että DNA replikoituu, joko kromosomin ulkopuolisena aineksena tai kromosomin kokonaisuuden osana. Jol-. lei muuten ole mainittu, tässä yhteydessä E. colin trans- 25 formaatioon käytetty menetelmä on CaCl^-menetelmän, jonka Mandel et ai. ovat julkaisseet, 1970, "J. Mol. Biol." 53:154.

"Sidonta" tarkoittaa menetelmää, jossa muodostetaan fosfodiesterisidos kaksisäikeisten nukleiinihappofragment- • 30 tien väliin (T. Maniatis et ai., Id., s. 146). Ellei muu- ten mainita, sidonta suoritetaan tunnettuja puskureita ja olosuhteita käyttäen 10 yksiköllä T4 DNA-ligaasia ("sitojaa") 0,5 ^ug:a kohti noin ekvimolaarista määrää sidottavia DNA-fragmentteja.

35 DNA:n "valmistaminen" transformanteista tarkoittaa • palsmidi-DNA:n eristämistä mikrobiviljelmästä. Ellei muu- 37 93025 ten ole mainittu, käytetään Maniatis et ai.:n alka-lista/SDS-menetelmää, Id. s. 90.

"Oligonukleotidit" ovat lyhyitä, yksi- tai kaksi-säikeisiä polydeoksinukleotidejä, jotka syntetisoidaan 5 kemiallisesti menetelmän avulla, joka on liitetty viitteenä esimerkkiin 1, ja sitten ne puhdistetaan polyak-ryyliamidigeeleillä.

Kaikki kirjallisuuslainaukset on vartavasten liitetty viitteinä.

10 Esimerkki 1

Lymfotoksiinin sekvensointi ja puhdistus Humaanilymfoblastisolulinja RPMI-1788 (ATCC nro CCL-156) kasvatettiin 15 litran vetoisissa pyörivissä 5 pulloissa 4 x 150 solun solutiheyteen millilitrassa, 15 käyttämällä seerumitonta elatusainetta (RPMI-1640). Lymfo-toksiini indusoitiin 10 - 20 -kertaiseksi (500 - 1000 lymfotoksiiniyksikköön millilitraa kohti, alla kuvatulla tavalla määritettynä) yli perustasojen sisällyttämällä 20 ng/ml forbolimyristaattiasetaattia seerumittomaan 20 RPMI-1640-elatusaineeseen. 65 tunnin mittaisen viljelyn jälkeen solut koottiin suodattamalla, ja suodoksen lymfo-toksiiniaktiivisuus absorboitiin lasipalloihin, joilla oli määrätty huokoskoko (Electronucleonics) ja jotka oli-; vat pylväässä (5 cm x 20 cm), tasapainotettiin 5mM fos- 25 faattipuskurilla (pH 7,4) sekä eluoitiin 50 %:isella ety- leeniglykolilla, joka oli 5mM fosfaattipuskurissa (pH 7,4). Kaikkiin puskureihin koko puhdistuksen ajan sisällytettiin 0,1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), proteaasi-inhibiittoria sekä 1 mN natriumatsidia ; 30 mikrobikasvun inhiboimiseksi. Lasipalloista saatu eluaatti sisälsi 84 000 yksikköä lymfotoksiinia/mg proteiinia.

Tämän jälkeen seurasi DEAE-selluloosakromatografia, len-tiililektiini-Sepharose-kromatografia ja preparatiivinen, alkuperäinen PAGE, B. Aggarwal et al.:n kuvaamalla tavalla, 35 1984, "J. Biol. Chem." 259 (1) : 686 - 691. Sytotoksisesta 38 93025 aktiivisuudesta vastaavan proteiinin homogeenisuus määritettiin SDS-PAGE:n avulla, käänteisfaasi HPLC:llä Lichrosorb RP-18-pylväässä sekä aminopääte-sekventoinnin avulla.

Tämä lymfotoksiinivalmiste sisälsi enemmän kuin 5 95 paino-% leusyyli-amino-päätteistä lymfotoksiinia, jonka likimääräinen molekyylipaino on 25 000 SDS-PADE:llä määritettynä. N-terminaalisen leusyyli-tyyppisen proteiinikompo-nentin teoreettinen molekyylipaino on 18 664 daltöniä; jäljelle jäävä, likimäärin 6 500 daltonin osa oli liitty-10 nyt glykosyyli-sivuketjuun Asn+62:n kohdalla ja mahdollisesti muihin 0:n välityksellä kytkettyihin sokeritähteisiin. Kudosviljelmäsupernatantti sisälsi tämän tyypin oletettuja multimeerejä (60 000 DA TSK-HPLC:llä määritettynä tai 64 000 Da Sephadex G-100 kromatografiän perusteella).

15 Jäljelle jäävä 5 %:n osa lymfotoksiiniseosta oli N-päätteisesti histidyylityyppiä, jonka molekyylipaino oli noin 20 000. Molemmilla tyypeillä on suurin piirtein sama sytolyyttinen aktiivisuus, ainakin niissä vaihtelu-rajoissa, jotka ovat luontaiset hajotettujen hiiren fibro-20 blastisolujen alla kuvatuille määritysmenetelmille.

Koskemattomien lymfotoksiinimolekyylien käsittely trypsiinillä tuotti ainoastaan joitakin fragmentteja. His-tidyyli-amino-päätteinen lymfotoksiini hajotettiin kahteen fragmenttiin aminohappojen 89 ja 90 välistä, kun taas 25 leusyyli-amino-päätteisen lymfotoksiinin trypsiinikäsittely tuotti neljä fragmenttia, jotka oli pilkottu asemissa 15 ja 16, 19 ja 20 sekä 89 ja 90.

Mikrosekventointi Edmanin hajoitustekniikalla tuotti koskemattoman molekyylin sekä trypsiinikäsittelyllä saatu-30 jen fragmenttien sekvenssiä koskevaa tietoa.

Sekvenssiä koskevaa lisätietoa antoivat lymfotoksiinin fragmentit, jotka saatiin karboksipeptidaasi P:llä sekä kymotrypsiinillä suoritetun hajottamisen avulla, etik-kahapolla suoritetulla uuttamisella ja syanogeenibromidilla 35 aikaansaadulla pilkkomisella. Tällä menetelmällä määritet tiin humaanilymfotoksiinin lähes koko sekvenssi. Amino- 39 95025 päätteestä määritettiin 156 viereistä tähdettä. Tämän sekventointia koskevan informaation perusteella oli selvää, että kahden lymfotoksiinilajin välinen ero perustui 23 amino-päätteisen tähteen sijaintiin leusyyli-amino-5 päätteisissä lajeissa, mitä ei havaittu histidyyli-amino- päätteisissä lajeissa. Karboksi-päätteinen sekvenssi ensimmäisten kolmen tähteen toisella puolella todettiin vaikeiksi määrittää tällä alueella sijaitsevien tiettyjen peptidisidosten sekä tähteiden hydrofobisen luonteen vuoksi. 10 Suunniteltiin synteettinen geeni, joka koodaisi proteiinisekvenssin mikro-sekventoinnin määrittelemässä laajuudessa. Rakennettu geeni sisälsi yleisen E. colin kodoni-kaiteleen, tämä merkitsee, ettei sekvenssissä käytetty harvoin käytettyjä E. colin kodoneita. Edulliset 15 humaanikodonit toimivat sijaisina siellä, missä mikään E. colin kodoni-kaistale ei ollut näkyvä. Tämä kaistale valittiin auttamaan ilmentymistä E. colissa ja myös siten, että synteettinen geeni olisi käyttökelpoinen koettimena luonnossa esiintyvän DNA-sekvenssin identifioimiseksi 20 humaani-cDNA:sta tai geenikirjastoista. Sekvenssiin rakennettiin ainutlaatuiset restriktio-kohdat Xbal, BamHI,

Hindlll sekä Bglll, fragmenttien rakentamisen helpottamiseksi ja geenin tulevan manipulaation mahdollistamiseksi.

58 alkuperäistä oligomeeriä, jotka suunniteltiin 25 synteettistä lymfotoksiinigeeniä varten, syntetisoitiin kiinteä faasi-fosfiittimenetelmällä, jonka ovat esittäneet M. Matteucci et ai., 1981, "J. Amer. Chem. Soc." 103: 3185 - 3190 sekä S. Beaucage et ai., 1981., 1981, "Tet. Letters" 22: 1859 - 1862. Näiden oligomeerien koko ulot-30 tuu 16 emäksestä 20 emäkseen, ja se on esitetty kuviossa ' la. Limittäin menevät osat oligomeerien välillä olivat kuuden emäksen pituisia ja ne rakennettiin ainutlaatuisiksi. Koko geeni koottiin kuviossa Ib esitetyllä tavalla.

Geeni rakennettiin kolmessa erillisessä osassa.

35 Ensimmäinen, segmentti A, oli 117 emäsparia pitkä, ja se . edusti leusyyli-aminopäätteisten lajien amino-terminaali- 40 93025 sen pään 51-koodittavaa aluetta. Segmentti B edusti lymfo-toksiinimolekyylin keskiosaa koodittavaa DNA:a, ja se oli pituudeltaan 145 emäsparia. Segmentin C, joka oli pituudeltaan 217 emäsparia, uskottiin koodittavan lymfotoksii-5 nin karboksi-päässä kaikkia aminohappotähteitä, 16 lukuun ottamatta. Oligomeerit, joita tarvitaan kunkin segmentin syntetisointiin, puhdistettiin elektroforeesin avulla ja sitten ne poolattiin. Kullekin oligomeerille valittu suhteellisen pieni koko (se on 16 - 20 emästä) valittiin vir-10 heiden vähentämiseksi synteesissä.

Oligomeerien kukin ryhmä fosforyloitiin reaktiossa, joka sisälsi 20 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 10 mM MgC^^, 20 mM ditiotreitolia, 0,5 mM ATP:a sekä 15 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia 50 ^ul:n tilavuudessa; reaktioon 15 sisältyi arviolta 50 pikomoolia kutakin oligomeeriä. 30 minuutin kuluttua 37°C:ssa, reaktioseosta kuumennettiin 65°C:een kinaasiaktiivisuuden tuhoamiseksi, ja sitten sen annettiin hitaasti jäähtyä 20°C:een noin yhden tunnin pituisena aikana. Sitten fosforyloidut oligomeerit sidot-20 tiin lisäämällä 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia ja reaktion annettiin tapahtua kahden tunnin ajan 20°C:ssa. DNA-ligaasi inaktivoitiin lämmön avulla, ja sen jälkeen sidottuja oligo-meerejä uutettiin 3 tunnin ajan 37°C:ssa restriktioendo-. nukleaasien kanssa, jotka tunnistivat rakennetut terminaa- 25 liset kohdat (e.g. Xbal ja BamHI segmentille A). Kutakin segmenttiä vastaavat fragmentit eristettiin 7 %:isella polyakryyliamidilla suoritetulla elektroforeesilla. Fragmentit, joilla oli oikea liikkuvuus, identifioitiin kunkin segmentin suhteen värjäämällä etiniumbromidilla sekä elekt-”*: 30 roeluoimalla geelistä. pFIFtrp69 (D. Goeddel et ai., 1980, "Nature" 287: 411 - 416 tai Crea et ai., European Patent Application 0048970) hajotettiin Xbal:n ja BamHI:n avulla, ja suuri vektorifragmentti eristettiin 6 %:isella polyak-ryyliamidigeelielektroforeesilla. Noin 50 ng segmentti A:a 35 sidottiin pFIFtrp69-fragmenttiin. Samalla tavalla segmentti 4! 93025 b sidottiin BamHIrlla sekä HindIII:lla hajotettuun pBR322:een ja segmentti C sidottiin Hindlllrlla ja BglII:lla hajotettuun pLeIFA-125-1:een (D. Geoddel et ai., 1980, "Nuc. Acids Res." 8: 4057 - 4073). Sidontareaktioseos trans-5 formoitiin E. coli ATCC 31446:een, ja syntyvät rekombi- nanttiplasmidit karakterisoitiin restriktioendonukleaasi-analyysin avulla ja DNA:a sekventoivalla Maxamin ja Gilbertin kemiallisella hajottamismenetelmällä. Viisi kuudesta segmentti A-kloonista sisälsi suunnitellun sekvenssin.

10 Eristettiin neljä segmentti B-plasmidia ja neljä segmentti C-plasmidia, ja kaikilla näillä inserteillä oli oikeat sekvenssit. Kukin segmentti eristettiin hajottamalla restrik-tioendonukleaaseilla, jotka tunnistivat terminaaliset kohdat, ja sitten ne sidottiin plasmidivektoriin pFIFtrp69, joka 15 oli käsitelty XBaI:llä ja BglII:lla. Syntyvä rekombinantti-plasmidi, pLTXBl karakterisoitiin sekventoimalla insertoi-tu XbaI-BglII-fragmentti, joka sisälsi kuviossa la esitetyn sekvenssin.

Sen seikan määrittämiseksi, valmistaisiko synteet-20 tinen geeni todella biologisesti aktiivista lymfotoksiinia, kasvatettiin E. coli pLTXBl:n transformantteja minimaalisessa elatusaineessa, sellaisissa olosuhteissa, joissa trp-promoottorin tukahduttava vaikutus poistuu ja jotka sallivat synteettisen lymfotoksiinigeenin ekspression. Viljelmiä : 25 kasvatettiin l,0:n optiseen tiheyteen 550 nanometrissä, ja ne koottiin sentrifugoimalla. Solusaostuma lietettiin yhteen kymmenesosatilavuuteen, ja sitten solut rikottiin äänikäsittelyn avulla.

Lymfotoksiinin aktiivisuus määritettiin muunnetulla 30 solun hajottavalla menetelmällä, jonka B. Spofford on julkaissut 1974, "J. Immunol." 112: 2111. Lyhyesti sanottuna, hiiri L-929:n fibroblastisoluja kasvatettiin mikrotiitteri-levyillä aktinomysiini D:n läsnäollessa. 12 - 18 tunnin kuluttua kuhunkin kammioon lisättiin 0,125 ml sarjana lai-35 mennettua näytettä, joka oli määritettävä lymfotoksiinin 42 93025 suhteen. 18 tunnin kuluttua levyt pestiin ja lymfotoksii-nilla indusoitu solujen hajoaminen havaittiin levyihin tarttumisena värjäämällä levyt kristallivioletin 1 %:isella liuoksella, joka oli metanoli:vesi -seoksessa (1:4 ti-5 lav./tilav:). Värjäytyksen voimakkuus havaittiin sekä visuaalisesti että spektrofotometrisesti 450 nm:n absorbans-silla että 570 nm:n transmissiolla , käyttämällä Dynatech-spektrofotometria. Soluille, jotka oli siirrostettu viljely-elatusaineen kanssa yksinään, määrättiin hajoaminen 0 %:ksi, 10 kun taas ne, joiden kanssa oli 3M guanidiinihydrokloridia, antoivat päätepisteenä 100 %:isen hajoamisen. Yksi lymfo-toksiiniyksikkö määritetään määränä, joka tarvitaan, jotta 50 %:a kuhunkin kammioon siirrostetusta 12 000 solusta hajoaa. On huomattava, että muita sytotoksisen aktiivisuuden 15 määritysmenetelmiä voidaan myös käyttää. Katso esimerkiksi B. Aggarwal et ai., julkaisussa "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, julkaisija A. Goldstein, Spring Symposium an Health Sceinces, George Washington Univ.

Medical Center (the A549-solulinja, joka luetaan tähän ma-20 teriaaliin kuuluvaksi, on saatavissa ATCC:stä CLL185:nä). Solujen hajoamistuotteet eivät ilmaisseet havaittavissa olevaa sytolyyttistä aktiivisuutta yllä kuvatuissa hiiren soluilla suoritetuissa määrityksissaä. γ-interferonia eks-pressoivista viljelmistä saadut kontrollihajoamistuotteet ' 25 sisälsivät γ-interferoniaktiivisuutta. Tämä tulos antaa aiheen olettaa, että synteettinen geeni ei koodannut aktiivista lymfotoksiinia. Tälle oli usein mahdollisia selityksiä. Esimerkiksi: (1) E. coli hajotti lymfotoksiinin, (2) lymfotoksiinigeeniä ei transkriboitu E. colissa, (3) lymfo-. 30 toksiini-viestille ei suoritettu translaatiota E. colissa, (4) proteiinilla ei ollut sopivaa sekvenssiä, mikä johtuu proteiinisekventoinnin virheestä tai (5) 16 tähteen muodostama karboksi-päätteinen sekvenssi tai osa siitä oli itseasiassa välttämätön aktiivisuudelle tai lymfotoksiinimole-35 kyylin sopivalle konfiguraatiolle.

43 93025

Esimerkki 2

Menetelmä lymfotoksiinia koodattavan cDNA:n saamiseksi RNA eristettiin ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttien ei-adherentista solujakeesta 48 tunnin kuluttua forbo-5 limyristaattiasetaatin (10 ng/ml), stafylokokkiperäisen enterotoksiini B:n (1 ^ug/ml) sekä tymosiini a-l:n kanssa suoritetun induktion jälkeen (S. Berger et ai., 1979, "Biochemistry" 18: 5143 - 5149). Tämä viljelmä valmisti 400 yksikköä lymfotoksiinin aktiivisuutta/ml supernatanttia. 10 tia. mRNA konsentroitiin adsorption avulla, joka suoritettiin liikkumattomaksi tehtyyn oligo-dT:een, eluoitiin ja cDNA valmistettiin käänteistranskription avulla P. Gray et ai., 1982, "Nature" 295: 503 - 508): Käänteistranskrip-taasia käytettiin lähetti-RNA:n cDNA-kopion valmistamiseksi 15 standardi-menetelmin, toinen säie valmistettiin (myös standardimenetelmin) Klenow-käsittelyn avulla, ja cDNA:a käsiteltiin S-l-nukleaasilla hiusneulasilmukan poistamiseksi. Tämän cDNA:n insertoimiseksi vektoriin, päät sidottiin adaptoriin tai yhdistäjään siten, että muodostui 5'- ja 20 3'-restriktioentsyymikohtia tai, mieluummin, kohesiivisia

päätteitä ennalta määritettyä restriktioentsyymikohtaa varten. Tähän tarkoitukseen käytettiin oligonukleotidi 5ΉΟ-AATTCATGCGTTCTTACAG

GTACGCAAGAATGTC-P 5’. Oligonukleotidi liitettiin * 25 cDNA:an, cDNA eristettiin uudelleen polyakryyliamidigeeli- elektroforeesin avulla. Xgtll:a, joka on julkisesti saatavissa (tai sen kanssa pääpiirteissään ekvivalenttista ygtll:a, joka on saatavissa ATCC:sta) uutettiin EcoRI:lla, ja takaisin saatiin lineaarinen fragmentti (M. Wickens . 30 et ai., 1978, "J. Biol. Chem." 253: 2483 - 2495). Yhdis tetty käänteistranskription tuote ja ygtl0:n hajotuksen tuote liitettiin yhteen, ja yhdistämistuotetta käytettiin E. coli C-600:n transfektointiin tai muuhun isännän suhteen herkkään γ-faagi-infektointiin. Arviolta noin 10 000 35 rekombinanttifaagia siirrostettiin 15 cm:n levylle ja seulottiin epätäsmällisellä täplähybridisaatiomenetelmällä 44 93025 (T. Maniatis et ai., 1978, "Cell" 15: 687 - 701 sekä P.

Gray et ai., "PNAS" 80: 5842 - 5846) käyttämällä P:lla merkattua koetinta, joka oli valmistettu kuvion la esittämästä segmentti A:sta J. Taylorin et al.:n menetelmällä, 5 1976, "Biochem. Biophys. Acta" 442: 324 - 330, jossa käy tettiin vasikan kateenkorvan DNA-primereita (PL Bio-chemicals). Kaksinkertaiset niroselluloosasuodattimet hyb-ridisoitiin low stringency-menetelmällä, käyttäen koetti- 7 men 5 x 10 iskua minuutissa, 20 %:isessa formamidissa.

10 Suodattimet pestiin kaksi kertaa 0,3 M natriumkloridilla, 0,03 M natriumsitraatissa sekä 0,1 %:isessa natriumdodesyy- lisulfonaatissa (SDS) 37°C:ssa.

Kaksi faagia hybridisoitiin koettimen kanssa ja puhdistettiin täpläpuhdistuksen avulla (plaque purifield).

15 Puhdistettu faagi hybridisoitiin sekä segmentti A-koettimen kanssa että segmentistä B valmistetun koettimen kanssa.

Kahden hybridisoivan faagin, yLTl ja yLT2, cDNA-insertit alakloonattiin M13mp8:aan ja sekventoitiin dideoksi-ketjun päättämismenetelmällä (A. Smith, 1980, "Methods in Enzymo- 20 logy" 65: 560 - 580). LT2:ssa sijaitseva insertti oli vain 600bp, eikä se sisältänyt koko 3'-koodittavaa aluetta lym- fotoksiinia varten. yLTl:ssä sijaitseva insertti sisälsi koko koodittavan alueen leusyyli-amino-päätteiselle lymfo- , toksiinille sekä 650 bp 31-transloitumattoman alueen (joka 25 sisältää polyadenylaation yhtäpitävyyssignaalin) sekä ko- donit 18 aminohappoa varten, jotka ovat leusyyli-päätteelle amino-terminaalisia. Koska tämä ei muodosta koko lymfotok- 32 siinia koodittavaa aluetta, valmistettiin P:llä merkattu koetin yLTl:n cDNA-insertista, ja sitä käytettiin seulomaan : 30 lisäksi tuleva 25 000 rekombinantti ygtlO-faagi suurella tarkkuudella (katso T. Huynh et ai., 1984, in Practical Approaches in Biochemistry IRL Press, Oxford). Eristettiin kaksitoista hybridisoivaa faagia, ja pisimmän insertin, joka on yLTll:sta, sekvenssi on esitetty kuviossa 2a. Pisim-35 mälle, avoimelle lukuraamille suoritettiin translaatio aloittamalla· ensimmäisestä havaitusta ATG:stä. Numerot 45 93025 kukin rivin yläpuolella tarkoittavat aminohapon asemaa ja numerot kunkin rivin alapuolella tarkoittavat nukleotidin asemaa. Leusyyli-tähde, joka on merkitty "l":ksi, tarkoittaa leusyyli-aminopäätteisen lymfotoksiinin ensim-5 mäistä sekventoitua tähdettä (kuvio la) , ja se on luulta vasti lymfotoksiinin kypsän tyypin ensimmäinen aminotermi-naalinen tähde. Ensimmäiset 34 tähdettä edustavat signaa-lisekvenssiä. Tähteet 156 - 171 eivät olleet määritettävissä lymfotoksiinin proteiinisekventoinnin avulla, mutta 10 sen sijaan ne voitiin lukea nukleotidisekvenssistä.

Esimerkki 3

Synteettinen geeni/luonnonvarainen cDNA-ekspressio-vektorihybridin rakentaminen leusyyli-amino-terminaalista lymfotoksiinia varten 15 Tämä rakenne on esitetty kuviossa 2b, pLTXBlra (joka sisälsi inaktiivisen synteettisen geenin) hajotettiin osittain EcoRI:llä ja Pstl:llä, ja saatiin takaisin 685 bp-fragmentti, joka sisälsi lymfotoksiinin 125 N-ter-minaalista tähdettä koodittavan DNA:n. Muodostettiin osit-20 täinen Pstl-hajotustuote tähteessä 10 sijaitsevan, lisäksi tulevan Pstl-kohdan vuoksi (kuvio la). 301 bp-fragmentti, joka sisälsi lymfotoksiinin 51 C-terminaalista aminohappoa koodittavan DNA:n, eristettiin hajottamalla yLTl:n alakloo-nattu cDNA EcoRI:llä ja Pstl:llä (nämä kohdat on esitetty * 25 kuviossa 2a nukleotidiasemissa 554 ja 855). Nämä fragmentit eristettiin 5 %:isella polyakryyliamidilla suoritetun elektroforeesin sekä elektroeluution avulla. Fragmentit yhdistettiin pBR322:een, joka oli uutettu EcoRIsllä ja joka oli defosforyloitu bakteeriperäisellä alkalisella fosfataasilla . 30 taustatransformanttien vähentämiseksi. Syntyvää ekspressio- plasmidia, pLTtrpl, karakterisoitiin sopivan suuntauksen ja sekvenssin suhteen restriktioendonukleaasi-hajotuksen ja DNA-sekventoinnin avulla. Leusyyli-amino-päätteinen lymfotoksiini ekspressoitiin transformoimalla E. coli 35 31446 pLTrpl:llä ja viljelemällä transformantteja elatus- 46 95025 aineessa, joka sisälsi tetrasykliiniä, 37°C:ssa, 4-6 tunnin ajan, kunnes saavutettiin optinen tiheys, 1,0. Solujen hajoamistuotteet sisälsivät sytotoksista aktiivisuutta. Ekspressoidun lymfotoksiinityypin leusyyliamino-5 päätteen havaittiin olevan suljetun metionyyli-tähteen substituoima. Tämän synteesin tuotteen uskotaan olevan formyylimetionyyli- pikemmin kuin metionyyli-tyyppiä.

Esimerkki 4

Lymfotoksiinin immunoaffiniteettipuhdistus 10 Anti-lymfotoksiinia erittävä hiiren monoklonaalinen solulinja (esimerkki 8) kasvatettiin hiiressä ja puhdistettiin ascites-nesteestä ioninvaihtokromatografiän avulla. Anioninvaihtoeluaatti kytkettiin syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharoseeii®/ konsentraationa 2 mg/ml hartsia.

15 Pylväs, jonka tilavuus oli 20 ml, tasapainotettiin peräkkäin TBS:llä (joka sisälsi 0,05 M Tris-HCl:a, pH 7,0, 0,15 M natriumkloridia sekä 2 mM EDTA:a); sitten eluutio-puskurilla (joka sisälsi 0,1 M etikkahappoa; pH 4,5, 150 mM natriumkloridia); sekä lopuksi TBS:llä. pLTtrpl:llä 20 transformoiduista, äänen avulla rikotuista E. colin soluista, 40 %:isella ammoniumsulfaattikyllästyksellä saatu saostuma (aiemmin kirkastettu sentrifugoimalla) lietettiin 0,1 M Tris-HCL:ään, pH 7,4, ja 5 mM EDTAsaan sekä panostettiin pylvääseen, nopeudella yhden pylvään tilavuus tun-' 25 nissa. TBSrllä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:a, suoritetun

perusteellisen pesun jälkeen, spesifisesti sidottu materiaali eluoitiin eluutiopuskurilla, jonka pH välittömästi säädettiin 7,8:ksi 0,1 tilavuudella 1 M Tris-HCl:a, pH

8,5, ja varastoitiin 4°C:ssa. Tämän puhdistetun lymfotok- 7 ; 30 siinin spesifinen aktiivisuus oli 2-10x10 yksikköä/mg, yllä esitetyllä hiiren L-929-menetelmällä määritettynä.

Eluaatti sisälsi suurimman osan pylvääseen panostetusta aktiivisuudesta. Pääosa eluaatin kokonaisproteii-nista vaelsi yksinkertaisena nauhana sekä pelkistävissä 35 että ei pelkistävissä olosuhteissa, SDS-polyakryyliamidi- 47 93025 geelielektroforeesissa. Tämän vyöhykkeen liikkuvuus vastaa molekyylipainoa noin 18 000, joka on sopusoinnussa glykolysoimattoman, leusyyli-amino-päätteisen lymfotoksii-nin ennustetun molekyylipainon arvon, 18 664, kanssa, joka 5 perustuu pääteltyyn aminohapposekvenssiin. Sen biologisen aktiivisuuden edelleen karakterisoimiseksi, puhdistettu lymfotoksiini tutkittiin sytolyyttisen aktiivisuuden suhteen in vitro sekä kasvaimen vastaisen aktiivisuuden suhteen in vivo.

10 Esimerkki 5

Rekombinanttilymfotoksiinin biologinen aktiivisuus in vivo

Rekombinantti- sekä lymfoblasteista peräisin oleva lymfotoksiini tutkittiin in vivo kasvainkuoliomäärityksen 15 avulla. MethA(a)- sarkoomia kasvatettiin 7-10 päivän ajan herkissä hiirissä /BALB/C x C57Bl/6fl tai CB6fl7r ja kasvaimiin injektoitiin sitten välittömästi esimerkin 4 mukaista lymfotoksiinia, lymfoblastilymfotoksiinia (valmistettu ja puhdistettu yllä kuvatulla tavalla) tai kont-20 rollinäytteitä. 20 - 24 tunnin kuluttua hiiret tapettiin, kasvaimet poistettiin ja arvioitiin histologisesti nekroosin laajuuden suhteen. Kuten taulukossa 1 on esitetty sekä rekombinantti- että lymfoblastilymfotoksiini aiheuttivat MethA(a)-sarcoman huomattavan nekroosin in vivo. Kontrolli-25 näytteet eivät indusoineet MethA(a)-sarkoomien nekroosia.

« 48 9 3 0 2 5

Taulukko 1

Rekombinenttl- ja luonnonvaraisella lymfotoksiinilla aikaansaatu MethA(a):n nekroosi

Hiirien lukumäärä 5 ...

Särcoma-kuolion arviointi , +++ ++ + - Käsittely --- — --- ---

Puskuri 1 kontrolli - - - 3

Lymfoblastilymfotoksiini, 25 000 yksikköä 4 10 Lymfoblastilymfotoksiini, 10 000 yksikköä 4 - - ~

Rekombinanttilymfotoksiini 200 000 yksikköä 14 2 2

Rekombinanttilymfotok- 15 siini, 25 000 yksikköä 3 - - 1

Rekombinanttilymfotok- siini, 10 000 yksikköä 3 - 1

Puskuri 2 kontrolli - 9

Lymfoblastilymfotoksiini ruiskutettiin puskuriin 20 1 liuotettuna (0,01 M Tris-HCl, 0,05 M (NH4)2HC03, pH 8,0) ja rekombinanttilymfotoksiini ruiskutettiin puskuriin 2 liuotettuna (0,15 M NaCl, 0,1 M natriumasetaatti ja 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8).

• Hiilihydraatin puuttuminen rekombinanttilymfotok-25 siinista ei näytä vaikuttavan biologiseen aktiivisuuteen, koska rekombinanttiviljelmän valmistaman lymfotoksiinin aktiivisuus 2 - 10 x 10^ yksikköä/mg) on suunnilleen sama kuin lymfoblastilymfotoksiinille ilmoitettu aktiivisuus 7 (4 x 10 yksiköä/mg).

• Rekombinanttilymfotoksiinin aktiivisuus ilmaisi myös lämpölabiliteettiä, samankaltaista kuin luonnonvaraisella lymfotoksiinilla, esim. inaktivoitumista vesiliuoksessa, 80°C:ssa yhden tunnin ajan suoritetun kuumennuksen jälkeen.

49 93025

Esimerkki 6

Ekspressiovektori metionyyli-histidyyli-amino-päätteisen lymfotoksiinin konstruoimiseksi

Rakenne plasmidille, joka ohjaa E. colissa metio-5 nyyli-histidyyli-aminoterminaalisen lymfotoksiinin eks pressiota, on esitetty kuviossa 3. Synteettinen oligo-nukleotidi insertoitiin ekspressioplasmidiin siten, että se koodittaa metioniini-aloituskodonia, joka on histidyy-li-amino-päätteisen lymfotoksiinin histidyyli-kodonin 10 vieressä (tähde 24 kuviossa 2a). Tämä suoritettiin eristämällä 4630bp-vektorifragmentti pLTtrpl:stä Xbal- ja Clal-uuton avulla, preparatiivisella 1 %:isella agaroosigeeli-elektroforeesilla sekä elektroeluution avulla. Samalla tavalla eristettiin pLTtrplrstä 570 bp BamHI-Clal-frag-15 mentti, joka sisälsi suurimman osan lymfotoksiinia koodit- tavasta sekvenssistä. Aiemmin esitetyin menetelmin syntetisoitiin kaksi synteettistä oligonukleotidiä, ja ne sekoitettiin kuvion la mukaisten oligonukleotidien 6, 7, 52 ja 53 kanssa. Noin 50 pikomoolia kutakin oligonukleo-20 tidiä käsiteltiin polynukleotidikinaasilla, esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Oligonukleotidejä käsiteltiin lämmön avulla (annealed), ja sitten ne sidottiin seoksen kanssa, jossa oli 570 bp BamHI-Clal-fragmentti sekä 4630 . bp Xbal-Clal-vektorifragmentti. Sidosseos transformoitiin 25 E. coli ATCC 31446:een, ja rekombinantit valittiin tetra- sykliiniresistenssin perusteella. Plasnidi p20KLT saatiin takaisin eräästä transformantista. Plasmidi p20KLT karakterisoitiin restriktioentsyymin ja DNA-sekvenssianalyysin avulla.

30 Esimerkki 7

Sytotoksisen lymfotoksiinifuusiomuunnoksen valmistaminen

Plasmidi, joka sisältää DNA:a, joka koodittaa lymfotoksiinin yhdistelmää bakteeriperäisen proteiinin 35 kanssa, konstruoitiin kloonaamalla sekvenssi, joka koo-• dittaa bakteeriperäistä signaalisekvenssiä, joka sijait- so 93025 see lyxnfotoksiinin rakennegeenin vieressä. Geenin sekvenssi E. colin läxnpöstabiilia enterotoksiinia II (STII) varten on karakterisoitu (R.N. Picken et ai., 1983, "Intection and Immunity" 42: 269 - 275), ja se koodittaa 23 aminohap-5 posignaalisekvenssiä, joka suuntaa STII:n erittymisen E. colin periplasmiseen tilaan.

Plasmidi pWM501 (Picken et ai., 1983, "Infection and Immunity" 42 /17: 269 - 275) sisältää lämpöstabiilin enterotoksiini (STII)-geenin. Osa DNA:sta, joka koodittaa 10 STII-geeniä, saatiin tekaisin pWM501:stä käyttämällä seu-raavia vaiheita. pWM501 hajotettiin Rsalillä, ja 550 bp DNA-fragmentti eristettiin. Tämä geenifragmentti sidottiin faagi M13mp8:aan (J. Messing et ai., julkaisussa in the Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, 15 julk. A. Walton, Elsevier, Amsterdam /1981/ss. 143 - 153), joka oli aiemmin hajotettu Smal:lla. Sidottua DNA:a käytettiin transformoimaan E. coli JM101, joka on kaupallisesti saatavissa oleva kanta Ml3-faagin kanssa suoritettavaa käyttöä varten. Tulokseksi saatiin selvien täplien muodos-20 tuminen. Kaksisäikeinen M13mp8 STII Rsa-johdannainen eristettiin E. coli JMl01:stä, joka oli infektoitu tällä faa-gilla standardimenetelmiä käyttäen (J. Messing et ai. lainattu teoksessa). Käyttämällä juuri kuvattua M13mp8 ala-kloonausmenetelmää faagin käyttöön antamat, erilaisten 25 restriktioendonukleaasien sarjat sitovat noin 550 emäs-pari fragmentin, joka sisältää STII-johdantogeenin. M13mp8 STII RSA-johdannainen hajotetaan sitten EcoRI:llä ja Pstl:llä ja eristetään DNA-fragmentti, joka on vähän suurempi kuin 550 bp DNA-fragmentti.

30 EcoRI-Pstl-fragmentti alakloonattiin pBR322:een.

Tämä suoritettiin hajottamalla pBR322 EcoRI:llä ja Pstl:llä sekä eristämällä vektori. Eristetty vektori sidottiin EcoRI-Pstl DNA-fragmenttiin. Tätä DNA:a käytettiin E. coli ATCC 31446:n transformaatioon, ja valittiin tetrasykliinille 35 resistentit pesäkkeet. Plasmidi eristettiin resistentistä E. colin pesäkkeestä ja se nimitettiin pSTII-osaksi.

51 93025 pSTII-osa hajotettiin Mnll:llä ja BamHI:llä, ja eristettiin 180 bp fragmentti, joka sisältää STII Shine-Dalgarno-sekvenssin, STII-signaalisekvenssi sekä kypsän STII-geenin 30 ensimmäistä kodonia. 180 bp DNA-fragmentti 5 sidottiin plasmidiin, joka sisältää trp-promoottorin. Yhtä sellaista plasmidia, pHGH207-l, on kuvattu aiemmin (H. de Boer et ai., 1982, julkaisussa Promoters: Structure and Function, julkaisijat R. Rodreguez et al. Chamberlin,

Praeaer jul. New York, NY, ss. 462 - 481). Tässä esimerkissä 10 käytettiin tämän plasmidin johdannaista, pHGH207-l*, jossa EcoRI kohta 5' trp-promoottoriin nähden oli muutettu EcoRI*:ksi täydentämällä DNA-polymeraasi I:llä (DNA pol I) ja yhdistämällä tasapäiset päät sidonnan avulla, trp-promoot-torin sisältämä plasmidi hajotettiin DNA pol I:llä ja kai-15 kiila neljällä dNTP:llä esiin pullistuvan sekvenssin täydentämiseksi. Sitten DNA-valmiste hajotettiin BamHI:llä ja vektorin sisältävä fragmentti eristettiin. Sitten tämä vektorifragmentti sidottiin 180 bp STII signaalin sisältävään DNA-fragmenttiin, joka oli edellä eristetty. Sidonta-20 seos käytettiin E. coli ATCC 31446:n transformaatioon ampi-silliiniresistenssin aikaansaamiseksi. STII-johdannoksi nimitetty plasmidi eristettiin ampisilliinille resistentistä peräkkeestä.

STII:ä koodittavia sekvenssejä sisältävä M13 faagi 25 konstruoitiin ensin sitomalla pSTII-johdannon 180bp Xbal-BamHI fragmentti Xbal:een ja BamHI:een, joita oli uutettu M13mpl0:lla. Syntyvää faagi DNA:a, pSTII-sukkulaa (pSTII-shuttle) karakterisoitiin restriktioendonukleaasianalyysin avulla sekä nukleotidisekventoinilla. Sitten tähän vekto-30 riin liitettiin LT:a koodittavat sekvenssit sitomalla pLTtrpl:n Hpal-EcoRI 700 bp fragmentti Sma-EcoRI-kohdasta hajotettuun pSTII-sukkulan replikoituvan muotoiseen (RF, kaksisäikeinen) DNA:aan; Smal ja Hpal kohdat ovat molemmat tasapäisiä ja yhteensidottuja (mikä johtaa molempien kohtien 35 häviämiseen). Syntyvä faagi DNA, M13-STII-LT, karakterisoitiin ja käytettiin sitten mutaatioon seuraavasti: aluke 52 93025 (primer) 5'p CAAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG käsiteltiin kinaasilla ja sekoitettiin templaatin (M13-STII-LT) kanssa ligaasipuskurin ja Xbal-EcoRI-kohdasta hajotetun Ml3mpl0 RF DNA:n läsnäollessa (DNA:n valmistuksen edistämiseksi 5 J.P. Adelman et al.:n kuvaamalla tavalla, 1983, "DNA" 2: 183 - 193); seosta kuumennettiin 95°C:een, ja sitten sen annettiin jäähtyä hitaasti huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, ja sitten se pantiin jäiden päälle 30 minuutiksi.

Kaikki neljä deoksinukleotiditrifosfaattia lisättiin sitten 10 yhdessä ATP:n, T4 DNA-ligaasin ja E. coli DNA polymeraasi I:n suuren fragmentin (Klenow) kanssa. Seosta inkuboitiin yhden tunnin ajan 14°C:ssa, ja sitten se käytettiin trans- fektoimaan vaadittu E. coli JM101, joka on kaupallisesti saatavissa oleva kanta, tai jokin muu M13 faagin isäntä.

15 Oikein mutantoitu faagi identifioitiin hybridisaatioseu- 32 lonnan avulla käyttämällä koettimena p-radiomerkattua primeria. Syntyvä faagi ST-LT-mut karakterisoitiin DNA-sekvenssi-analyysin avulla. DNA:n replikoituva muoto valmistettiin tästä faagista, ja sitä käytettiin 761 bp Xbal-20 EcoRI-fragmentin eristämiseen, joka sisälsi DNA:n, leu- syyli-amino-päätteisen lymfotoksiinin koodittavan sekvenssin vieressä sijaitsevaa STII-signaalisekvenssiä varten.

Tämä DNA sidottiin Xbal-BamHI:llä hajotetun p20KLT:n (suuri 4285 bp vektorifragmentti) sekä pBR322:n 375 bp 25 EcoRI-BamHI-fragmentin kanssa. Syntyvää plasmidia, pST18LT, karakterisoitiin restriktiokartoituksen ja DNA-sekventoin-nin avulla. Valmistettiin samanlainen rakenne, joka koo-ditti STII-signaalin amino-pään liittymisen histidyyli-amino-päätteisen lymfotoksiinin histidiini-tähteeseen.

30 Muodostuvat plasmidit pSTLT18 ja pSTLTl6. Restriktioent-syymianalyysiä ja dideoksisekventointia käyttäen niiden varmistettiin koodittavan STII-fuusiota. E. coli, joka oli transformoitu plasmideilla pSTL18 tai pSTLTlö, syntetisoi STII-signaalisekvenssi-fuusiot leusyyli-amino-terminaali-35 sen ja histidyyli-amino-terminaalisen lymfotoksiinin kanssa, 53 93025 mikä geelielektroforeesin avulla määritettiin yhtäpitäväksi lasketun molekyylipainon kanssa. E. colin solujen hajoamistuotteilla, jotka sisälsivät näitä fuusioproteii-neja, oli sytolyyttistä aktiivisuutta.

5 Esimerkki 8

Hiiren monoklonaalisen vasta-aineen valmistusmenetelmä

Puhdistettu lymfoblasti lymfotoksiini, joka saatiin esimerkissä 1, dialysoitiin fosfaattipuskurikeittosuolaa 10 (PBS) vasten. Dialysaatti sisälsi 200 ^ug lymfotoksiinia millilitrassa. Dialysaattiin lisättiin glutaraldehydiä konsentraatioksi 70 mM glutaraldehydiä, seosta inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, glutaraldehydiä lisättiin, jotta sen kokonaiskonsentraatioksi tuli 140 mM, inkuboin-15 tia jatkettiin vielä 6 tunnin ajan, ja sitten seos dialysoitiin PBS:a vastaan. 50 ^ug:n avulla ristikytkettyä lymfotoksiinia (tässä yhteydessä myöhemmin, "polylymfotoksiini") sekä 0,5 ml Freundin adjuvanttia ruiskutettiin hiireen (kanta BALB/c) ihonalaisesti. Yhden viikon kulut-20 tua hiiri boosterimmunisoitiin 50 ^,ug:lla polylymfotoksii-nia sekä 0,5 ml :11a Freundin epätäydellistä adjuvanttia, puoleksi lihaksensisäisesti ja puoleksi vatsaonteloon.

Seerumi koottiin 7 päivän kuluttua ja määritettiin anti-lymfotoksiiniaktiivisuuden suhteen ELISA-määrityksen avulla.

• 25 ELISA-määritys suoritettiin seuraavasti: Puhdistetun lymfotoksiinin puskuroitu liuos pantiin mikrotiitterikam-mioihin ja kunkin kammion annettiin peittyä noin 100 ng:lla lymfotoksiinia. Adsorboitumaton lymfotoksiiniliuos imettiin pois kammioista. 50 ^ul sopivasti laimennettua koe-30 näytettä yhdistettiin 100 ^ul:n kanssa PBS:a, joka sisälsi * 5 mg/ml härän seerumin albumiinia (PBS-BSA-puskuri) ja lisättiin kuhunkin kammioon, inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20, 100 ^ul piparjuuriperoksidaasilla 35 merkattua vuohen anti-hiiri-IgG:a PBS-BSA-puskurissa li- « 54 93025 sättiin kuhunkin kammioon ja inkuboitiin yhden tunnin ajan. Kukin kammio pestiin PBSrllä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:a sekä sitraattifosfaattipuskuria, pH 5, joka sisälsi 0,1 mg O-fenyleenidiamiinia/ml (substraattiliuos), ja 5 Η2©2:η 30 %:ista vesiliuosta (suhteessa 4 ^ul 30 %:ista tilav./tilav. H2C>2:a 10 ml:ssa substraattiliuosta) lisättiin kuhunkin kammioon. Kammiota inkuboitiin 30 minuutin ajan, reaktio pysäytettiin 50 ^ul:llä 2,5 M rikkihappoa, adsorbanssi mitattiin 492 nm:ssä. Kammiot, joiden adsor-10 banssi oli suurempi kuin 1 O.D., katsottiin anti-lymfotok-siini-positiivisiksi.

Koenäytteet määritettiin myös kyvyn suhteen neutraloida lymfotoksiinin sytolyyttinen aktiivisuus hiiri L929:llä suoritetussa kokeessa. Seerumi koottiin immuni-15 soiduista eläimistä, tai hybridomasupernatantit liuotet tiin tarvittavaan RPMI-1640-elatusaineeseen, joka sisälsi 10 % härän sikiön seerumia ja noin 100 yksikköä lymfotok-siinia millilitrassa, ja siveltiin mikrotiitterikammioihin, jotka sisälsivät viljeltyjä L929-soluja, samalla tavalla 20 kuin tavanomaisessa sytolyysimäärityksessä. Kontrollissa kaikki solut hajosivat. Neutraloiva vasta-aine havaittiin lymfotoksiinin epäonnistumisena hajottaa L929-soluja.

Glutaraldehydillä polymeroidulla lymfotoksiinilla immunisoidut eläimet muodostivat vasta-aineita, jotka oli- * 25 vat aktiivisia ELISA-määritysmenetelmässä, mutta mitään seerumia neutraloivaa aktiivisuutta ei havaittu.

Valmistettiin suspensio, joka sisälsi 100 ^ug lym-fotoksiinia ja 1 ml:n 1,64 paino-%:ista/tilavuus aluminium-hydroksidi/lAl(OH)3_? suspensiota ja käytettiin saman hii-30 ren immunisointiin. Hiiri ruiskutettiin lihaksensisäisesti 100 ^ul:lla ja vatsaontelonsisäisesti 400 ^ul:lla samaa suspensiota. Yhden viikon kuluttua hiireen ruikutettiin laskimonsisäisesti 10 ^ug polyrneroimatonta ja adsorboima-tonta lymfoblastilymfotoksiinia, joka oli 100 ^ul:ssä PBS:a. 35 Koe, joka suoritettiin kolme päivää myöhemmin 1/80 laimen- ss 93025 nuksella eläimen seerumia, ilmaisi lymfotoksiinia neutraloivan vasta-aineen läsnäolon.

7 Tästä eläimestä poistettiin perna. 3 x 10 perna- 7 solua fuusioitiin 5 x 10 hiiren myelomasolun kanssa ja 5 siirrostettiin mitrotiitterikammioihin, jotka sisälsivät HAT-elatusainetta ja noin 3 000 vatsakalvosta peräisin olevan makrofaagin kanssa/mikrotiitterikammio, S. Fazekas De St. Grothin menetelmän mukaisesti, 1980, "J. Immunol. Meth." 35: 1 - 21. Hybridomia, kammioista, jotka sisälsi-10 vät supernatantteja, jotka olivat positiivisia yllä esitetyssä ELISA-määritysmenetelmässä, jotka oli kasvatettu 1 ml:n tilavuudessa DMEM-elatusainetta, jossa oli 20 % vasikansikiönseerumia, 10 % NCTC-135-elatusainetta, —5 5 x 10 M beeta-merkaptoetanolia sekä HAT:a, levitettiin 15 mikrotiitterikammioihin, statistisesta keskimäärin yksi solu kammiota kohti, ja sitten niitä viljeltiin 1 tai 5 ml:n tilavuudessa samaa elatusainetta. Sen jälkeen super-natantit määritettiin neutraloivan vasta-aineen suhteen. ELISA-määritysmenetelmässä, positiivisista hybridomasoluis-20 ta, jotka oli saatu aluminiumhydroksidi-immunisaatiosta, statistisesti noin 2 % syntetisoi neutraloivaa vasta-ainetta. Tästä hybridomasolujen ryhmästä valittiin lymfo-toksiinivasta-aine, jolla oli valinnaisesti korkea affiniteetti .

* 25 Esimerkki 9

Mutaatiokohdan suhteen spesifinen lvmfotoksiinin mutaatio

Esimerkin 3 mukaista menetelmää noudatettiin tarkasti tässä esimerkissä, paitsi että synteettisen oligonukleotidin • · 30 segmenttiä 6 modifioitiin siten, että se sai sekvenssin ' 51CTCAACTCTGCACCCA3’ ja sen komplementaarinen säie (segment ti 53) muunnettiin siten, että sen sekvenssiksi tuli 3’AGACGTGGGTCGTCGT51.

Modifioidut oligonukleotidit käsiteltiin lämmön 35 avulla (annealed) jäljelle jääviksi oligonukleotideiksi • ja sidottiin ekspressiovektoriin esimerkissä 6 kuvatulla 56 93025 tavalla. Tämä vektori sisältää 2 bp substituution, joka muutti lysiini +28-kodonin lysiinistä histidiiniksi. Histi-diinimutantti ekspressoidaan E. colin ATCC 31446 transformaatiossa.

5 Muita sijainnin suhteen määrättyjä mutantteja val mistettiin samalla tavalla, mieluummin valikoimalla kodo-nit, niin, ettei lisätty EcoRI-restriktiokohtaa, joka edellyttäisi osittaista EcoRI-restriktiohajotusta pLTXBl:n hajottamisessa, jota kaivattiin esimerkissä 3. Mutaatioiden 10 ei tulisi lisätä myöskään uusia Xbal- tai BamHI-kohtia fragmenttiin B tai Hindlll- tai Bglll-kohtia fragmenttiin C. Osittaiset hajottamiset edellyttävät muuten sopivasti asennettavaa pLTXBl-mutanttia; täydellinen hajottaminen tuottaisi poistomutantin pikemmin kuin substituutiomutantin, 15 joka on kohteena tässä tapauksessa.

Esimerkki 10

Hiiren ja härän lymfotoksiinia koodittavan geeni-DNA;n identifiointi; hiiren ja härän lymfotoksiinin aminohapposekvenssi 20 Hiiren ja härän lymfotoksiinigeenit eristettiin geeni-X-kirjastoista. Humaanilymfotoksiini cDNA-fragmentti 32 (PvuII-EcoRI, 600bp) radiomerkattiin P-nick-translaation avulla, ja käytettiin koettimena hiiren geeni-DNA-X-kirja-, ston (M600-kannan geeni-DNA XCharon4A:ssa, T. Manitias 25 et ai., Molecular Cloning, s. 31, 1982) ja, itsenäisesti, härän geeni-DNA-kirjaston (EP 88622A) seulomiseksi.

Hybridisaatio suoritettiin alhaisella täsmällisyydellä 20 %:isessa formamidissa (Gray and Goeddel "P.N.A.S. USA" 80: 5842-5846 /1983?), ja suodattimet pestiin kaksi kertaa • 30 0,3M natriumkloridin vesiliuoksessa, 0,03M natriumsitraa- tissa ja 0,1 %:isessa SDSrssä, Useille faageille, jotka oli hybridisoitu humaanilymfotoksiinikoettimen kanssa, suoritettiin plakki-puhdistus (T. Maniatis et ai., "Cell" 15: 687 - 701 ^19787)/ hajotettiin restriktioendonukleaasil-35 la ja analysoitiin Southern-hybridisaation avulla. Hiiren • · 57 93025 DNA:n 3500 bp EcoRI-fragmentti ja härän DNA:n 2200bp EcoRI-fragmentti hybridisoitiin humaanilymfotoksiinikoet-timen kanssa. Nämä DNA-fragmentit alakloonattiin plasmi-diin pBR322, ja sitten ne sekventoitiin dideoksi-ketju-5 päättämismenetelmällä (A.J.H. Smith Methods in Enzymology 65: 560 - 580 /Ϊ98θ7)· Kuviossa 4 on esitetty hiiren ja härän lymfotoksiinin päätelty proteiinisekvenssi humaani-lymfotoksiiniin verrattuina.

Esimerkki 11 10 ADH-promoottorin säätelyn alainen lymfotoksiinin ekspressio hiivassa

Plasmidi pLTrpl hajotetaan Xbal:llä plasmidin avaamiseksi Xbal-kohdasta, juuri proksimaalisesti lymfotoksiinin aloituskodoniin nähden. Xbal kohesiiviset päät tehdään 15 tasapäisiksi E. coli DNA-polymeraasil:n Klenow-fragmentilla neljän dNTPrn kanssa. EcoRI-adaptori

OH

5' LAATTCCCGGG 3' rGGGCCC-P 5'

3' OH

20 kytketään tasapäiseen plasmidifragmenttiin, esiin pistävät 5'-hydroksyyli-päätteet fosforyloidaan käyttämällä polynuk-leotidikinaasia, sidontaseosta käytetään transformoimaan E. coli ATCC 31446, ja restriktioanalyysin avulla identi-25 fioidaan plasmidi pLTtrplRl, joka sisältää ylimääräisen

EcoRl-kohdan proksimaalisesti lymfotoksiinin aloituskodoniin nähden. Plasmidi pLTtrplRl eristetään, hajotetaan EcoRl:llä ja takaisin saadaan lymfotoksiini-DNA:a sisältävä fragmentti SP.

3q Plasmidi pFRPn (EP 60 057A) hajotetaan EcoRl:llä, käsitellään alkalisella fosfataasilla renkaan uudelleen-muodostumisen estämiseksi, sidotaan SP-lymfotoksiini-frag-menttiin T4 DNA-ligaasia käyttäen, ja sitten s.idontaseos käytetään E. coli ATCC 31446:n transformointiin. Ampisil-25 liinille resistentit pesäkkeet tuottavat kaksi plasmidien sarjaa, joissa on SP-insertti vastakkaisesti suuntautuneena „ «025 kuin oli määritetty restriktioanalyysin avulla agaroosi-elektroforeesigeeleillä. Plasmidit puhdistetaan E. coli-transformanteista, ja niitä käytetään transformoimaan hiiva, jolla on trpl-mutaatio (esimerkiksi hiivakanta RH218, 5 rajoittamaton ATCC säilytysnumero 44076) trp+-fenotyypiksi. Löydetään plasmidit, jotka ovat orientoituneet siten, että segmentin SP aloituskodoni sijaitsee alkoholidehydroge-naasi-promoottorifragmentin vieressä, ja niitä käytetään hiivan transformoimiseksi lymfotoksiiniekspressiota varten. 10 Lymfotoksiini saadaan takaisin hiivatransformanttien uut teista. Plasmidien stabilisuutta suuressa mittakaavassa suoritettavissa fermentaatioissa voidaan parantaa käyttämällä ekspressioplasmidia, joka sisältää 2 mikronin rep-likaation alun pFRPn-kromosomaalisen replikaation alun 15 (ars 1) sijasta ja joka sopii yhteen isäntäkannan kanssa (J. Beggs, 1978, "Nature" 275: 104 - 109).

Esimerkki 12

Lymfotoksiinin ekspressio nisäkässoluissa ALT11 (esimerkki 2) hajotetaan EcoRlrn kanssa, ja 20 takaisin saadaan lymfotoksiinia sisältävä DNA-fragmentti (käänteistranskription tuote). Plasmidi pEHER (EP 117 060A) hajotetaan EcoRl:llä, käsitellään vasikansuoliston alkali-sella fosfataasilla ja liitetään XLTllin käänteistranskrip-. tiotuotteeseen, joka on EcoRlrn kytkemä. Syntyvät plasmidit 25 kasvatetaan E. coli ATCC 31446:11a (EP 117 060A), ja ne merkitään pEHERLT I:ksi ja pEHERLT II:ksi. Ne sisälsivät lymfotoksiini-DNA:n vastakkaisessa suuntauksessa kuin oli määritetty polyakryyliamidigeeleillä suoritetun restriktioanalyysin perusteella. Näitä plasmideja käytetään transfek- • 30 toimaan sekä valitsemaan CHO DHFR-DUX-B11-, CHO 1- ja • ^ ‘ Ltk -soluja.

Kudosviljelmäsolut transfektoidaan sekoittamalla 1 ^ug pEHERLT I:ä tai pEHERLT II:a, jotka edellä oli valmistettu, 10 ^,ug:n kanssa rotan kantaja-DNA:a, 250 ^ul:n 35 tilavuudessa 0,25 M CaC^sa, minkä jälkeen lisättiin pisa- • 59 93025 roittain 250 ^ul HEPES-puskuroitua keittosuolaliuosta (280 mM MaCl, 1,5 mM Na^C^, 5 0 mM HEPES, pH 7,1). 30 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa, liuos lisätään kudosvil-jelmäsoluille, jotka kasvatetaan 60 mm:n muovisissa kudos-5 viljelmämaljoissa. Käytetään CHO 1-, CHO DHFR-DUX-Bll-sekä Ltk -soluja. Maljat sisältävät 3 ml isäntäsolulle sopivaa elatusainetta.

CHO 1- ja CHO DHFR-DUX-Bll-soluille soveltuva elatus-aine on Ham F-12 elatusaine (Gibco), jota on täydennetty 10 10 %:isella vasikanseerumilla, 100 ^u/ml penisilliiniä, 100 ^,ug:llä/ml streptomysiiniä sekä 2 ^umM:lla L-glutamiinia. Ltk--solulinjalle sopiva elatusaine on Dulbeccon modifioima Eaglen elatusaine (DMEM), jota on täydennetty yllä kuvatulla tavalla.

15 3-16 tunnin kuluttua elatusaine poistetaan ja soluja pestään 20 %:isella glyserolilla, joka on valmistettu fosfaatilla puskuroituun keittosuolaan. Tuoretta elatusainetta lisätään kullekin levylle, ja levyjä inkuboidaan vielä 2 päivän ajan.

20 Transfektoitujen solujen valinta suoritetaan käsit telemällä soluja trypsiinillä 2 vuorokauden mittaisen kasvatuksen jälkeen (mihin kuuluu solujen käsittely 0,5 mg:lla/ml steriiliä trypsiiniä, joka sisältää 0,2 mg/ml EDTAra) ja lisäämällä noin 3 x 10^ solua 10 mm:n 25 kudosviljelmälevyille selektiivisen elatusaineen kanssa.

dhfr -soluja varten elatusaine on formulaatio elatusainees-ta (F-12 GIBCO), josta puuttuu glysiini, hypoksantiini ja tyrniini (GHT -elatusaine): DHFR+-soluja varten normaaliin elatusaineeseen lisätään metotreksaattia (100 - 1000 mM) .

30 Kontrollit ajetaan käyttämällä transfektio-olosuhteita, joissa ei ole plasmidia läsnä sekä plasmidin pFD-11 kanssa (EP 117 060A), joka sisältää normaalin DHFR:n. Pesäkkeet, jotka ovat peräisin soluista, jotka poimitaan ja ekspres-soivat DHFR-plasmidia, ovat näkyvissä 1-2 viikon sisällä.

35 Kypsää lymfotoksiinia ekspressoivat transformantit identifioidaan.

Claims (21)

93025

1. Menetelmä lymfotoksiinin valmistamiseksi, jolla lymfotoksiinilla on kuviossa 2a esitetty aminohapposek- 5 venssi, sen variantin tai fragmentin valmistamiseksi, jolla variantilla tai fragmentilla on kuviossa 2a esitetyn proteiinin biologinen aktiivisuus, tai niiden fuusiotuot-teiden valmistamiseksi, jotka lymfotoksiiniaktiivisuuden omaavan proteiinin lisäksi sisältävät bakteeriproteiinia; 10 yhdistelmä-DNA-tekniikalla, tunnettu siitä, että a) valmistetaan lymfotoksiinia koodaava nukleiinihappo ; b) konstruoidaan vektori lymfotoksiinin ekspressiota varten liittämällä toiminnallisesti vaiheen a) nukleii- 15 nihappo vektoriin, joka sisältää transkriptionaalisen pro-moottorisekvenssin ja lymfotoksiinia koodaavan nukleiinihapon transkription ja translaation lopetuksen säätelysek-venssit; c) transformoidaan bakteeri-isäntä vaiheen b) vek- 20 torilla; d) viljellään vaiheen c) isäntäsolua; e) annetaan lymfotoksiinin akkumuloitua viljelmään; ja . f) otetaan lymfotoksiini talteen viljelmästä, va- 25 linnaisesti käyttäen vasta-ainetta, joka neutraloi lymfotoksiinin sytolyyttisen aktiivisuuden ja jossa ei ole ei-neutraloivia vasta-aineita.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nukleiinihappo koodaa ihmisen • 30 prelymfotoksiinia ja lymfotoksiini, joka on vaihtelevasti * glykosyloitu, otetaan talteen soluviljelmästä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ryhmät -34 - -1 on poistettu lymfotoksiinivariantista ja että se lisäksi sisältää ai- 35 nakin yhden aminohapon insertin. • li . 61 93025

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että insertti on polypeptidin fuusio lymfotoksiinin karboksyylipäätteen kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että polypeptidi liitetään lymfo- toksiiniin proteolyyttisen entsyymin hydrolyysikohdan kautta.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohta käsittää lys-lys:n tai 10 lys-arg:n.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuvion 2a ryhmät -34 - -1 on korvattu metionyylillä tai formyylimetionyylillä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että ryhmät -34 - +22 on korvattu metionyylillä tai formyylimetionyylillä.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lymfotoksiinivariantti käsittää asemassa +28 olevan lysiinin korvaamisen histidiinil- 20 lä.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lymfotoksiinivariantissa substituutio, deleetio tai insertio sijaitsee alueella, joka leusyyli+1:stä laskettuna käsittää noin 30 ryhmää. '25

11. Nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se sisältää kuviossa 2a esitetyn nukleotidien 251 ja 694 välisen sekvenssin ja koodaa lymfotoksiinia, jossa ei ole välisekvenssejä, joille ei suoriteta translaatiota, eikä sen organismin, josta

30 DNA on peräisin, muita proteiineja koodaavaa DNA:ta.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se sisältää kuviossa 2a esitetyn nukleotidien 182 ja 694 välisen sekvenssin. 93025

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se sisältää kuviossa 2a esitetyn nukleotidien 80 ja 694 välisen sekvenssin.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, 5 tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen lymfotok- siinia.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että DNA:ssa ei ole intronia nukleotidien 284 ja 285 välissä.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se on cDNA.

17. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se on kovalenttisesti leimattu määritettävissä olevalla aineella.

18. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että se koodaa lymfotoksiiniva-rlanttia.

19. Replikoituva vektori lymfotoksiinin ekspressiota varten, tunnettu siitä, että se sisältää pa- 20 tenttivaatimuksen 11 mukaisen nukleiinihapon, joka on transkriptionaalisen promottorisekvenssin ja lymfotoksii-nia koodaavan nukleiinihapon transkription ja translaation lopetuksen säätelysekvenssin säätelyn alla.

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen vektori, 25 tunnettu siitä, että se lisäksi käsittää bakteeriperäisen promoottorin, joka on toiminnallisesti liitetty lymfotoksiinia koodaavaan nukleiinihappoon.

21. Patenttivaatimuksen 17 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA koodaa lymfotoksiinin ja 30 bakteeriperäisen erityssignaalin fuusion. 63 93025