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Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin und von
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Lymphotoxin-mRNA Aus der Literatur ist bekannt, daß gewisse Zellen
von Säugetieren nach geeigneter Stimulation in vitro in der Lage sind, sogenannte
Lymphotoxine zu produzieren (siehe beispielsweise Evans in Cancer Immunol. Immunother.
12, 181-190 (1983) und Granger et al. in Biology of the Lymphokines pp.
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141-180, Academic Press 1979). Hierbei stellt Lymphotoxin einer gegebenen
Species in vitro kein einheitliches Protein dar, vielmehr werden eine Reihe von
Subtypen beschrieben, die sich in Molekulargewicht, Ladung und Stabilität unterscheiden
(siehe beispielsweise Granger et al. in Biology of the Lymphokines pp. 141-180,
Academic Press 1979). Im humanen System werden beispielsweise vier Klassen von Lymphotoxinen
unterschieden, deren Molekulargewichte in den Bereichen von 10.000 bis 20.000 für
yLT, 35.000 bis 50.000 für ßLT, 70.000 bis 90.000 für «LT und 200.000 bis 600.000
für LT-Komplex liegen.
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Lymphotoxine besitzen die Fähigkeit, in vitro a) die maligne Transformation
von Zellen zu verhindern (siehe Evans et al. in Int. J. Cancer 27, 45-49 (1981)
und Ransom et al. in J. Natl. Cancer Inst. 69, 741-744 (1982)),
b)
cytostatisch oder sogar cytolytisch auf Tumor zellen zu wirken (siehe Evans et al.
in Immunopharmacology 3, 347-359 (1981)) und c) die Empfindlichkeit von Tumor zellen
gegenüber der zellulären Immunabwehr des Organismus zu steigern (siehe Evans et
al. in Cell. Immunol. 63, 1-15 (1981) und Ransom et al. in Int. J. Cancer 29, 451-458
(1982)).
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Desweiteren ist aus der Literatur bekannt, daß Lymphotoxin-Präparationen
im Tiermodell auch die Regression von Tumoren herbeiführen können (siehe Khan et
al. in Proc. Soc. Exptl.
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Biol. Med. 169, 291-294 (1982)). Lymphotoxine haben daher große Bedeutung
für die Prophylaxe und Therapie maligner Erkrankungen.
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Die bisher bekannt gewordenen Verfahren zur Gewinnung von Lymphotoxinen
gehen in den meisten Fällen von primären Zellen aus, z.B. von Leukozyten-Präparationen
aus peripherem Blut oder Tonsillen des Menschen (siehe Williams et al. in J. Immunol.
130, 518-520 (1983)), von Milzzellen von Mäusen (siehe Aksamit et al. in Infect.
Immun. 36, 1028-1035 (1982) und Trivers et al. in J. Immunol. 117, 130-135 (1976))
oder von Leukocyten aus der Bauchhöhle von syrischen Hamstern oder Meerschweinchen
(siehe beispielsweise Evans et al. in Int. J. Cancer 27, 45-49 (1981)). Hierbei
müssen diese Zellen erst durch Inkubation mit hochmolekularen Mitogenen, z.B. Phytohämagglutinin,
zur Produktion von Lymphotoxinen angeregt werden. So konnten auch bisher in den
Kulturüberstanden von B-Lymphocyten-Zellinien nur geringe Lymphotoxin-Aktivitäten
festgestellt werden (siehe Granger et al.
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in J. Immunol. 104, 1476 (1970) und Amino et al. in J.
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Immunol. 113, 1334-1345 (1974)).
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Da nach den bisher angewandten Methoden zur Produktion von Lymphotoxinen
nur geringe Mengen und in nur geringer Reinheit hergestellt werden konnten, konnten
die bisher hergestellten
Lymphotoxine weder bis zur Homogenität
gereinigt noch in ausreichenden Mengen für umfangreichere Untersuchungen der antineoplastischen
Wirkung am Tiermodell zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus konnte bisher
auch noch keine biologisch aktive Lymphotoxin-mRNA nachgewiesen werden; dies ist
jedoch die Voraussetzung für die molekulare Klonierung der Lymphotoxin-Gene mittels
der Methoden der Gentechnologie.
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Ter vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Lymphotoxin
sowie Lymphotoxin-mRNA in ausreichender Menge und Reinheit herzustellen.
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Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Zellen des sogenannten T-Lymphocyten-Typs
von Affen, insbesondere der Gattung Saguinus, beispielsweise die Zellinien L-77/5,
A651, A2543, 70N2, 1022 und 1670, vorzugsweise jedoch die Zellinien 1022 und 1670,
die durch Infektion mit Viren, vorzugsweise mit Herpesviren wie Herpes virus saimiri
oder Herpes virus ateles, in vitro oder in vivo transformiert und zu permantem Wachstum
in Kultur befähigt wurden, in einem geeigneten Kulturmedium spontan, das heißt ohne
weitere Induktion, erhebliche Mengen an Lymphotoxin und Lymphotoxin-mRNA produzieren.
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Ferner wurde gefunden, daß durch Zusatz eines sogn. Stimulators zum
Kulturmedium, z.B. eines literaturbekannten Tumorpromotors wie einem Diterpen-Derivat,
vorzugsweise vom Tiglian- oder Daphnan-Typ, z.B. Mezerein oder eines Esters des
Phorbols, vorzugsweise 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat (siehe Diamond et al.
in Advances in Cancer Research Vol. 32, Seiten 1-74, Academic Press 1980 und Herker
in Carcinogenesis Vol. II, Mechanisms of Tumor Promotion and Cocarcinogenesis, Seiten
11-48, Raven Press, New York 1978), in einer Konzentration von 1-1000 ng/ml die
Produktion von Lymphotoxin und von Lymphotoxin-mRNA weiter gesteigert wird.
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Als Kulturmedien kommen hierbei die üblichen serumfreien und serumhaltigen
Kulturmedien in Betracht, beispielsweise Eagle's Minimum Essential Medium oder Roswell
Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI1640), denen jeweils fötales Kalbserum
und Antibiotica zugesetzt werden kann, vorzugsweise bis zu 10 % fötales Kalbserum,
Penicillin und Streptomycin.
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Bei der Produktion der Lymphotoxin-Proteine wird das erfindungsgemäße
Verfahren bevorzugt in der Weise durchgeführt, daß transformierte Zellen nach Zusatz
von 10 bis 100 ng/ml 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetat oder Mezerein als Stimulator
in einem serumhaltigen, unter bestimmten Bedingungen auch in einem serumfreien Kulturmedium,
z.B. in RPMI 1640, 1 bis 7 Tage, vorzugsweise jedoch 3 bis 4 Tage gehalten werden
und anschließend das so gebildete Lymphotoxin aus dem Kulturüberstand nach an sich
bekannten Methoden abgetrennt, konzentriert und gereinigt wird. Besonders vorteilhaft
wird dieses Verfahren jedoch in der Weise durchgeführt, daß die Zellen nach anfänglicher
Proliferation in einem serumhaltigen Medium in ein serumarmes, vorzugsweise jedoch
serumfreien Medium, übergeführt werden.
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Bei der Produktion der Lymphotoxin-mRNA wird das erfindungsgemäße
Verfahren bevorzugt in der Weise durchgeführt, daß transformierte Zellen nach Zusatz
von 10-100 ng/ml 12-0-tetra-decanoylphorbol-13-acetat oder Mezerein als Stimulator
in einem serumhaltigen Kulturmedium, z.B. in RPMI1640 und 10 % fötalem Kalbserum
6-48 Stunden, vorzugsweise 12 bis 24 Stunden inkubiert werden, anschließend die
Zellen abgetrennt werden und nach Zerstörung dieser die mRNA nach an sich bekannten
Verfahren isoliert wird.
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Bei der Isolierung der so gebildeten Zellkulturprodukte hat sich bei
der Reinigung des so erhaltenen Lymphotoxins die Chromatographie über porenkontrolliertes
Glas, welche erstmals
angewendet wurde, und, nach Zerstörung der
Zellmembranen und Entfernen der Zellkerne, bei der so erhaltenen Lymphotoxin-mRNA
die Extraktion beispielsweise mit Phenol als besonders geeignet erwiesen. Die weitere
Reinigung erfolgt mittels HPLC.
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Das so erhaltene Lymphotoxin mit einem Molekulargewicht von etwa 50.000
bis 60.000 ist, z.B. in wässriger isotonischer Lösung, zur Prophylaxe und zur Bekämpfung
von Tumorzellen geeignet.
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Gegenüber dem Stand der Technik weist das erfindungsgemäße Verfahren
folgende Vorteile auf: 1. Es wird eine homogene Zellpopulation mit unbegrenzter
Lebensfähigkeit verwendet, deren Vermehrung in beliebigem Maßstab erweitert werden
kann, 2. die Lymphotoxin-Produktion in diesen Kulturen erfolgt spontan, das heißt
es müssen keine hochmolekularen Mitogene zugesetzt werden, 3. die Produktion von
Lymphotoxin kann durch niedermolekulare Stimulatoren weiter gesteigert werden, 4.
die Produktion von Lymphotoxin kann in serumfreiem Medium mit hohen Ausbeuten erfolgen;
man erhält somit ein hervorragendes Ausgangsmaterial für die weitere proteinchemische
Reinigung und 5. die aus den Zellen isolierte RNA zeigt unmittelbar nachweisbare
Lymphotoxin-mRNA-Aktivität und stellt somit ein hervorragendes Ausgangsmaterial
für die weitere Anreicherung dieser mRNA dar, was wiederum eine wesentliche Voraussetzung
für
die molekulare Klonierung der mRNA darstellt. Die klonierte Affen-Lymphotoxin-mRNA
kann wiederum nach bekannten Verfahren als Probe für die Isolierung der homologen
humanen Lymphotoxin-mRNA beziehungsweise der entsprechenden Gene verwendet werden.
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Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern,
ohne diese jedoch zu beschränken: Beispiel 1 Produktion von Lymphotoxin durch Herpesvirus-transformierte
Affen-T-Lymphocyten-Zellinien Die eingesetzten lymphoiden Zellinien wurden in Roswell
Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI 1640) mit Zusatz von 10 % fötalem Kalbserum,
Penicillin und Streptomycin in stationärer Kultur bei 370C in einer Atmosphäre aus
95 % Luft und 5 % Kohlendioxid gehalten und dreimal wöchentlich mit frischem Medium
verdünnt. In allen Experimenten wurden dichte Kulturen mit frischem Medium 1:2 bis
1:3 verdünnt, am nächsten Tag nochmals 1:3 verdünnt und jeweils 5 ml in einem Kulturfläschchen
angesetzt. Die Kulturüberstände wurden nach drei Tagen durch Zentifugieren gewonnen,
eingefroren und bis zum Test bei -200C gelagert.
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Die nachfolgende Tabelle enthält die in drei verschiedenen Kulturüberständen
jeder Zellinie ermittelten Lymphotoxin-Aktivitäten:
Zellinie Ursprung
Referenz Lymphotoxinaktivität (transformierendes RE/ml Herpesvirus = HV) Expt. 1
Expt. 2 Expt. 3 L-77/5 Saguinus oedipus - Lymphknoten A 1 3 1 eines tumortragenden
Tieres (HV saimiri) A 651 Saguinus oedipus - in vitro Trans- B 15 30 25 formation
von Lymphocyten (HV ateles) A 2543 Saguinus oedipus - in vitro Trans- B 90 56 48
formation von Lymphocyten (HV ateles) 70N2 Saguinus oedipus - Thymus A,C,D,E 56
47 50 eines tumortragenden Tieres (HV saimiri) 1022 Saguinus oedipus - Tumor D 580
480 630 (HV ateles) 1670 Saguinus nigricollis - Milz eines tumortragenden Tieres
A,C,E 88 83 77 (HV saimiri)
Referenzen: A = Fleckenstein et al.,
Int. J. Cancer 19, 546-554 (1977) B = Abb et al., Cancer Immunol. Immunother. 9,
219-226 (1980) C = Falk et al., Bacteriol. Proc. 38, 191 (1972) D = Johnson et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6391-6395 (1981) E = Kaschka-Dierich et al., J. Virol.
44, 295-310 (1982) Zur Produktion größerer Mengen von Zellen wurden an Stelle von
stationären Kulturen bewegte Kulturen verwendet. Dazu wurden die Zellen (zum Beispiel
der Linie 1670) zum Beispiel in RPMI 1640-Medium mit Zusatz von 10 % fötalem Kalbserum
in 1- oder 2-Liter Erlenmeyerkolben auf Rotationsschüttlern gezüchtet (0,5 1 Kultur
pro 1 l-Kolben; 1 1 Kultur pro 2 l-Kolben; 40 Umdrehungen pro Minute; 370C in normaler
Atmosphäre) und dreimal wöchentlich mit frischem Kulturmedium im Verhältnis 1:2
bis 1:3 verdünnt. Auf diese Weise ist die Produktion von Kulturüberstand in der
Größenordnung von 10-100 1 wöchentlich ohne weiteres möglich.
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Die Produktioin von Lymphotoxin in 1670-Zellen war über lange Zeiträume
hinweg stabil: nach 9 Monaten in kontinuierlicher Kultur war keine signifikante
Abnahme der Lymphotoxin-Aktivität in den Kulturüberständen feststellbar.
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Charakterisierung des Lymphotoxins: a) Zum biologischen Nachweis von
Lymphotoxin-Aktivität wurde folgende Nachweismethode verwendet (modifiziert nach
Trivers et al. in J. Immunol. 117, 130-135 und Evans in Cell.
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Immunol. 63, 1-15 (1981)): Transformierte Mauszellen der Zellinie
L929 wurden über Nacht mit 1 microCurie 3H-Thymidin/ml Kulturmedium (bevorzugt Eagle's
Minimum Essential Medium mit 10% fötalem Kalbserum) kultiviert, dann trypsinisiert
und in frischem Kulturmedium mit 5 % fötalem Kalbserum suspendiert. Je 0,5 ml dieser
Suspension mit etwa 30.000 Zellen wurden in Kulturschalen (Durchmesser 16 mm) pipettiert
und 3-6 Stunden inkubiert. Anschließend wurden serielle Verdünnungen der zu testenden
Probe aufgetragen und drei Tage inkubiert (alle Inkubationen bei 370C). Die Radioaktivität
in den Kulturüberständen wurde schließlich im Flüssigszintillationszähler gemessen.
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Die nachfolgende Abbildung zeigt den Nachweis der Lymphotoxin-Aktivität
eines Kulturüberstandes von 1670-Zellen.
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Jede Verdünnung wurde parallel in 4 Kultur schalen getestet.
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Nur die Mittelwerte wurden angegeben, die Standardabweichung betrug
bei den ersten drei Verdünnungen 3-4 %, bei der höchsten Verdünnung 6 %. Der in
diesem Experiment verwendete Kulturüberstand wurde in mehreren hundert Ampullen
eingefroren und als Referenzstandard in allen Lymphotoxintests mitgeführt; seine
Aktivität wurde willkürlich mit 100 Referenz-Einheiten pro Milliliter (RE/ml) angenommen:
CPM
IN 0.1 ML KULTURUEBERSTAND
VERDUENNUNG
Kulturüberstand von 1670-Zellen Kontrollen (Medium) Zum Vergleich wurden Kulturüberstände
einer Reihe von menschlichen T-Lymphocyten-Zellinien (MOLT-4, 1301, JURKAT, Karpas-45,
CCRF-CEM und CCRF-HSB-2) in dem oben angeführten biologischen Lymphotoxin-Test untersucht.
In keinem Fall konnte eine signifikante Steigerung der 3H-Thymidin-Freisetzung gegenüber
unbehandelten Kontrollen nachgewiesen werden.
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b) Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Lymphotoxin-Aktivität
in Kulturüberständen der Zellinie 1670 wurde durch folgende Experimente vorgenommen:
Stabilität
gegenüber thermischer Belastung Stabilität gegenüber saurem pH-Wert Stabilität gegenüber
Frieren/Tauen Stabilität gegenüber Natriumdodecylsulfat (SDS) Stabilität gegenüber
reduzierenden Agentien (2-Mercaptoethanol) Molekulargewichtsbestimmung durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der Stabilitätsprüfungen: Behandlung
Lymphotoxin-Aktivität in Prozent des Kontrollwertes 560C - 5 Stunden 68 % 5 Zyklen
Frieren/Tauen 108 % pH 2.0 - 24 Stunden bei 40C <1 % 0,1 % SDS - 1 Stunde bei
370C 15 % 0,1 M 2-Mercaptoethanol -- 1 Stunde bei 370C 15 % Die Aktivität ist sehr
stabil gegenüber Erhitzen und mehrere Zyklen von Frieren/Tauen, relativ labil gegenüber
SDS und Mercaptoethanol, und wird bei pH 2 innerhalb von 24 Stunden vollkommen zerstört.
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Die Experimente zur thermischen und pH-Stabilität sowie gegenüber
Frieren/Tauen wurden mit dem Standard-Kulturüberstand von unbehandelten 1670-Zellen
in Gegenwart von 10 %
fötalem Kalbsserum durchgeführt. Die anderen
beiden Experimente wurden mit einem über porenkontrolliertes Glas (siehe Beispiel
4) konzentrierten und angereicherten Kulturüberstand von mit Mezerein (20 ng/ml;
siehe Beispiel 4) behandelten 1670-Zellen durchgeführt (Proteingehalt 1-2 mg/ml),
der nach der Inkubation mit SDS beziehungsweise Mercaptoethanol mit kompletten Kulturmedium
(10 % Kalbsserum) 50fach verdünnt wurde.
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Die Bestimmung des Molekulargewichts der Lymphotoxin-Aktivität aus
1670-Zellen erfolgte durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC - siehe
nachfolgende Abbildung): RELATIVE CYTOTOXIZITÄT
RETENTIONSZEIT (MINUTEN) 200 microliter eines über porenkontrolliertes Glas konzentrierten
Kulturüberstandes unbehandelter 1670-Zellen wurden mittels HPLC auf einer Anlage
der Fa. WATERS aufgetrennt (2 Säulen I-125; 20 mM Natriumphosphat pH 7, 1 M NaCl,
0,1 % Tween 20 (Polyoxyethylen-sorbitan-monolaureat,n = 20, M.G.: etwa 1200), 25
% (v/v) Propylenglykol; 0,5 ml pro Minute).
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0,5 ml - Fraktionen wurden aufgefangen und getestet. Als Eichproteine
zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden Serumalbumin, Ovalbumin, Trypsinogen
und Lysozym im selben System aufgetrennt. Die Analyse zeigte einen einzigen Aktivitätspeak
bei einem Molekulargewicht von etwa 55.000.
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c) Die wachstumshemmende Wirkung von Kulturüberständen der -Zellinie
1670 wurde an einer Reihe von transformierten (Tumor-) Zellinien untersucht. In
diesen Versuchen wurden die Tumorzellen (kultiviert in Eagle' s Minimum Essential
Medium mit 10 % fötalem Kalbserum, Penicillin und Streptomycin) in Kulturschalen
angesetzt (50.000 Zellen pro Schale mit 3 cm Durchmesser) und einige Stunden später
mit Medium oder dem Standard-Kulturüberstand der Zellinie 1670 versetzt (Endkonzentration
16 RE/ml; 3 ml/Schale). Nach 3 oder 4 Tagen Inkubation bei 370C wurde die Zellzahl
pro Schale bestimmt (in allen Experimenten wurden jeweils zwei Schalen parallel
mit Lymphotoxin bzw. Medium angesetzt). Bei drei Zellinien wurde die Zellzahl täglich
bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle bzw. Abbildung dargestellt:
Spezies
Zellinie Inkubationsdauer Zellzahl /3 cm-Kulturschale (Tage) (10E-5 x Zellen/Schale)
Kontrolle Lymphotoxin Mensch Hela 4 8,1 0,6 Hep-2 3 9,3 2,1 A-549 4 10 3,4 Affe
GL-V3 3 5,6 4,5 Vero 3 6,3 5,3 Maus L929 4 8,5 3,1 IT22 3 13 4,0 B16 4 19 4,9 Kaninchen
RK13 3 4,6 3,5
10-4 = ZELLEN PRO SCHALE
BEHANDLUNGSZEIT (TAGE)
Diese zeigen, daß Kulturüberstände aus 1670-Zellen
die Vermehrung von Tumor zellen verschiedener Spezies hemmen können.
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Diese Eigenschaft ist charakteristisch für Lymphotoxine (Evans in
Cancer Immunol. Immunother. 12, 181-190 (1983)); sie unterscheidet diese Gruppe
von Proteinen insbesondere von den Interferonen, die ebenfalls das Wachstum von
Tumorzellen hemmen können, im allgemeinen jedoch spezies-spezifisch sind, wobei
insbesondere Humaninterferon auf Mausellen sehr wenig oder überhaupt nicht aktiv
sind.
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Die vorstehend erwähnten menschlichen T-Lymphocyten-Zellinien sowie
die transformierten (Tumor-)Zellinien sind literaturbekannt.
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Beispiel 2 Steigerung der Lymphotoxin-Produktion in Affen-T-Lymphocyten-Zellinien
durch Diterpen-Verbindungen Dichte Kulturen wurden mit frischem Medium 1:2 bis 1:3
verdünnt, am nächsten Tag nochmals 1:3 verdünnt und jeweils 5 ml derselben Stammkultur
in drei Fläschchen aufgeteilt. Die Stimulatoren wurden zugegeben (Stammlösungen
100 microgramm/ml in Dimethylsulfoxid) und die Kulturen wurden drei Tage inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, die Überstände eingefroren
und bei -200C bis zum Lymphotoxintest aufbewahrt.
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Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung von zwei ausgewählten Diterpen-Tumorpromotoren,
nämlich 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetat (TPA) und Mezerein, auf die Lymphotoxin-Produktion
in ausgewählten Affen-T-Lymphocyten-Zellinien:
| Zellinie Experiment Konzentration Lymphotoxin-Aktivität im
Überstand (RE/ml) |
| (ng/ml) Kontrolle TPA Mezerein |
| 1670 1 20 83 520 270 |
| 2 20 77 210 76 |
| 3 100 88 340 370 |
| 70N2 1 20 56 310 280 |
| 2 20 47 120 240 |
| 3 100 50 65 92 |
| 4 100 12 130 160 |
| A651 1 20 260 360 370 |
| 2 100 130 320 270 |
| A2543 1 20 56 140 190 |
| 2 100 48 190 180 |
| L77/5 1 20 3 36 86 |
| 2 100 1 38 35 |
| 1022 1 100 480 760 930 |
| 2 100 630 700 610 |
Beispiel 3 Produktion von Lymphotoxin in serumfreiem Medium Nach
der Proliferation der Zellen auf serumhaltigem Medium (analog Beispiel 2) wurden
die Zellen auf serumfreies Medium übergeführt.
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-Die nachfolgende Tabelle zeigt einen Vergleich der Lymphotoxin-Produktion
in 1670-Zellen analog Beispiel 1 jeweils in serumhältigen und serumfreien Medium
in Gegenwart von 20 ng Mezerein/ml:
| Experi- Serumgehalt Lymphotoxin- Protein- Spez. |
| ment des Mediums Aktivität gehalt Akti- |
| ( % ) (RE/ml) (mg/ml) vität |
| (RE/mg) |
| 1 10 370 5 74 |
| 2 10 180 5 36 |
| 3 10 270 r 5 54 |
| 4 0 140 0.050 2.800 |
| 5 0 72 0.053 1.400 |
| 6 @ 0 160 0.044 3.700 |
Die Proteinbestimmung wurde nach der Methode von Bradford (siehe Anal. Biochem.
72, 298 (1976)) durchgeführt.
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Beispiel 4 Konzentration und Reinigung von Lymphotoxin aus 1670-Zellen
durch Chromatographie über Säulen aus porenkontrolliertem Glas 1670-Zellen wurden
in RPMI-1640 Medium mit 10 % fötalem Kalbserum in rotierenden Erlenmeyerkolben gezüchtet
(0.5 1 Kultur in einem 1 l-Kolben, Rotationsgeschwindigkeit 40 Umdrehungen pro Minute).
Zellen aus gut wachsenden Kulturen wurden durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen
und in serumfreiem RPMI-1640-Medium mit Zusatz von 20 ng/ml Mezerein resuspendiert.
Die Suspension wurde in 150 cm2-Plastikkulturflaschen (200 ml pro Flasche) drei
Tage lang stationär gehalten, anschließend wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation
und Filtration gewonnen.
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Derartig hergestellte Kulturüberstände wurden über 10 ml porenkontrolliertes
Glas chromatographiert (Porendurchmesser: 350 Angstroem, Korngröße: 120-200 mesh;
Säulendurchmesser: 9 mm, Flußgeschwindigkeit: 140 ml/Stunde). Anschließend wurde
die Säule mit 10 mM Natrium-Phosphatpuffer pH 7.2/1.5 M NaCl gewaschen und schließlich
mit dem gleichen Puffer in 50 % Ethylenglykol (v/v) eluiert.
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Die folgende Tabelle gibt die Ergebnisse von zwei derartigen Experimenten
wieder:
Volumen Lymphotoxin Protein Spezifische Aktivität (ml)
(RE/ml) % (mg/ml) RE/mg Experiment 1 Probe 2.800 162 100 0.044 3.700 Durchlauf 2.800
13 8 - -Waschfraktion 10 96 <1 - -Eluat 20 17.300 76 2.0 8.650 Experiment 2 Probe
2.500 141 100 0.050 2.800 Eluat 17 8.600 41 1.6 5.400
Beispiel
5 Nachweis von Lymphotoxin-mRNA-Aktivität in RNA-Präparationen aus 1670- und 1022-Zellen
Die Zellen wurden in 800 ml Zellkulturmedium mit 10 % fötalem Kalbserum bei einer
Zelldichte von etwa 5 x 105 Zellen/ml suspendiert und mit 20 ng Mezerein/ml versetzt.
20 stunden später wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in einem geeigneten
Puffer (zum Beispiel 10 mM Tris.HCl pH 7.4, 140 mM NaCl, 1,5 mMol MgC12) gewaschen
und in 10 ml Lyse-Puffer (zum Beispiel 10 mM Tris.HCl pH 8.4, 140 mM NaCl, 1,5 mM
MgC12, 0.5 % Nonidet-P 40 [nichtionisches Detergens, Warenzeichen der Firma SHELL]
suspendiert. Nach zehnminütiger Inkubation im Eisbad wurde die Suspension kurz geschüttelt
und die Zellkerne durch Zentrifugation entfernt.
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Aus dem Überstand der Zentrifugation (= Cytoplasma) wurde durch an
sich bekannte Verfahren, zum Beispiel durch Extraktion mit Phenol (siehe Aviv et
al. in Proc. Natl. Acad. Sci.
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USA 69, 1408-1412 (1977)) die RNA isoliert. Sie wurde schließlich
in Wasser gelöst (Konzentration etwa 3-5 mg/ml) und mittels an sich bereits bekannter
Verfahren in Xenopus laevis - Oocyten translatiert (siehe beispielsweise Colmann
et al. in Cell 17, 517-526 (1979), Hitchcock et al. in Anal.
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Biochem. 109, 338-344 (1980) und Contreras et al. in Anal.
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Biochem. 113, 185-187 (1981)). Die Translationsprodukte wurden im
biologischen Test auf ihre Lymphotoxin-Aktivität überprüft.
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Die folgende Tabelle zeigt die aufgefundene cytotoxische Aktivität
in Oocytenüberständen im Vergleich zu RNA-Präparationen aus MOLT-4 Zellen, einer
humanen T-Lymphocytenzellinie, deren Kulturüberstände keine nachweisbare Lymphotoxin-Aktivität
aufweisen, sowie Überständen von unbehandelten Oocyten:
| Präparat Radioaktivität im Überstand (cpm/100 microliter) |
| Verdünnung der Oocyten - Überstände |
| 1 : 12 1 : 42 1 : 147 1 ; 514 |
| Kontrollen (nicht injizierte |
| Oocyten) 2.200 2.300 2.100 2.500 |
| 2.400 2.200 1.800 3.000 |
| MOLT-4 RNA Expt. 1 1.600 2.400 1.700 2.200 |
| Expt. 2 1.700 2.300 1.600 1.800 |
| 1670-RNA Expt. 1 4.700 4.700 3.600 2.800 |
| Expt. 2 4.300 3.800 3.300 2.600 |
| Expt. 3 3.200 2.800 2.800 |
| Kontrollen 4.400 3.300 - - |
| 1670-RNA Expt. 1 6.100 5.000 - - |
| 1670-RNA Expt. 2 6.600 5.100 - - |
| 1022-RNA Expt. 1 7.000 5.000 - - |
Die Tabelle zeigt, daß alle drei RNA-Präparationen aus 1670-Zellen
sowie eine RNA-Präparation aus 1022-Zellen in bis zu 147-facher Verdünnung eine
signifikante Steigerung der freigesetzten Radioaktivität bewirkten, während RNA
aus MOLT-4-Zellen keine derartige Aktivität aufweist. Diese Experimente zeigen,
daß in RNA-Präparationen aus 1670- und 1022-Zellen biologisch aktive Lymphotoxin-mRNA
enthalten ist.