DE69923550T2

DE69923550T2 - Verfahren um Vorläuferzellen von Osteoklasten zu isolieren und ihre Differenzierung in Osteoklasten zu induzieren.

Info

Publication number: DE69923550T2
Application number: DE69923550T
Authority: DE
Inventors: Tomoko Kobe-shi MAEDA; Ryuji Ikoma-gun SUZUKI; Takahiro Kobe-shi OCHI
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1999-04-06
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-04-07
Also published as: ATE288477T1; WO1999053023A1; US6861257B1; AU3056299A; EP1070757A1; US20050003528A1; EP1070757B1; JP4271857B2; DE69923550D1; EP1070757A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen (Präosteoklasten) in Osteoklasten, das das Kultivieren der Präosteoklasten in Abwesenheit von akzessorischen Zellen umfasst; ein Verfahren zum Isolieren von Präosteoklasten, ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der Präosteoklasten oder Osteoklasten umfasst; und Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, die mit dem Screening-Verfahren erhalten werden können.
Hintergrund der Erfindung
Knochengewebe von Säugern wiederholen die Entwicklung und Resorption von Knochen. Das Gewebe wirkt als Mittelpunkt des Calciumstoffwechsels, um das Gleichgewicht zwischen Knochenentwicklung und -resorption in der Wachstumsperiode und auch nach der Reifeperiode aufrechtzuerhalten. Knochenentwicklung und -resorption werden durch Kreuzkopplung zwischen Osteoklasten und Osteoblasten gut austariert. Ein Ungleichgewicht zwischen Knochenentwicklung und -resorption führt jedoch zu stoffwechselbedingten Knochenkrankheiten, wie etwa Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Osteoarthrose, Verringerung der Knochenmenge durch Diabetes, viele Arten von Hormonstörungen, Ernährungsstörungen, Osteoperose und Osteomalazie. Die Zellpathogenese der meisten vorgenannten Störungen bleibt noch aufzuklären. Um das Problem zu lösen und Therapeutika für die stoffwechselbedingten Knochenkrankheiten zu finden, sind Verfahren zum Isolieren und Charakterisieren von Osteoklasten und Osteoblasten verlangt worden.
Die Isolierung von Osteoklasten von Mäusen oder Ratten ist gut untersucht worden. Vor kurzem berichteten Fujisawa et al., dass humane Osteoklasten von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen wurden [Annals of Rheumatic Diseases, 55, 816–822, (1996)]. In ihrer Untersuchung wurden humane Osteoklasten in Gegenwart einer Maus-Osteoblasten-ähnlichen Zelllinie gewonnen, da angenommen worden war, dass die Gegenwart von akzessorischen Zellen, wie etwa Osteoblasten oder Knochenmark-Stromalzellen, für die Differenzierung von Präosteoklasten in vitro unbedingt erforderlich sei. Es war vermutet worden, dass die akzessorischen Zellen eine wichtige Rolle für die Osteoklastogenese durch engen Kontakt mit Präosteoklasten spielen.
JP 7-194373 beschreibt hingegen ein Verfahren zur Differenzierung von Knochenmarkzellen in Osteoblasten, Osteoklasten oder Chondrozyten in einem Medium ohne Knochenmark-Stromalzellen oder Osteoblasten. Die Isolierung der Osteoklasten selbst war jedoch nicht gelungen. Um unter den vorgenannten Umständen den Mechanismus der Differenzierung von Präosteoklasten in Osteoklasten aufzuklären, mussten ein Verfahren zur Isolierung von Präosteoklasten und ein Verfahren zum Auslösen der Differenzierung in Osteoklasten entwickelt werden, das wenige Faktoren für die Differenzierung und insbesondere in Abwesenheit von akzessorischen Zellen benötigt.
Beschreibung der Erfindung
Im Ergebnis intensiver Untersuchungen zur Auslösung der Osteoklastogenese haben die Erfinder Erfindungen zu einem Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten in Osteoklasten, das das Kultivieren der Osteoklasten-Vorläuferzellen in Abwesenheit von akzessorischen Zellen umfasst; einem Verfahren zum Isolieren von Präosteoklasten; einem Präosteoklasten, der mit dem Isolierverfahren isoliert wird; einem Verfahren zum Differenzieren der nach dem Isolierverfahren isolierten Präosteoklasten in Osteoklasten; einem Osteoklasten, der mit dem Differenzierungsverfahren gewonnen werden kann; einem Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten; und einem Agens für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das mit dem Screening-Verfahren erhalten werden kann, gemacht.
Die Erfindung betrifft:

(1) ein Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten in Osteoklasten, das das Kultivieren der Präosteoklasten in Abwesenheit von akzessorischen Zellen umfasst;
(2) das unter (1) genannte Verfahren, das ein Kulturmedium verwendet, das aus IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder einem Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten besteht;
(3) das unter (1) oder (2) genannte Verfahren, das ein Kulturmedium verwendet, das einen Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen enthält;
(4) das unter (3) genannte Verfahren, bei dem der Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen ein Kulturüberstand aus Phytohämagglutinin-stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen ist;
(5) ein Verfahren zum Isolieren von Präosteoklasten, das 1- bis 3-wöchiges Kultivieren von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit in Abwesenheit von Zytokinen umfasst;
(6) das unter (5) genannte Verfahren, bei dem die Präosteoklasten durch Zugeben von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit zu einem essentiellen Medium für Säugerzellen in Abwesenheit von Zytokinen und durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren des Gemisches bei 35 bis 37°C in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5 bis 7% isoliert werden, um alle Zellen außer den Präosteoklasten zu zerstören;
(7) einen Präosteoklasten, der mit dem unter (5) oder (6) genannten Verfahren gewonnen werden kann;
(8) ein Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten, die nach dem unter (5) oder (6) genannten Verfahren gewonnen werden, in Osteoklasten, das das Kultivieren der Präosteoklasten in Abwesenheit von akzessorischen Zellen umfasst;
(9) das unter (8) genannte Verfahren, das ein Kulturmedium verwendet, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten enthält;
(10) das unter (8) oder (9) genannte Verfahren, das ein Kulturmedium verwendet, das einen Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen enthält;
(11) das unter (10) genannte Verfahren, bei dem der Kulturüberstand aus Mitogenstimulierten einkernigen peripheren Blutzellen ein Kulturüberstand aus Phytohämagglutinin-stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen ist;
(12) einen Osteoklasten, der mit dem unter einem der Punkte (1) bis (4) und (8) bis (11) genannten Verfahren gewonnen werden kann;
(13) ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der nach dem unter (5) oder (6) genannten Verfahren isolierten Präosteoklasten umfasst;
(14) ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der unter (7) genannten Präosteoklasten umfasst;
(15) ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der nach dem unter einem der Punkte (1) bis (4) und (8) bis (11) genannten Verfahren umfasst;
(16) ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der unter (12) genannten Osteoklasten umfasst;
(17) ein Agens für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das nach dem unter einem der Punkte (13) bis (16) genannten Verfahren gewonnen werden kann.

Eine der Erfindungen betrifft ein Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten in Osteoklasten, das das Kultivieren der Präosteoklasten in Abwesenheit von akzessorischen Zellen umfasst. In diesem Fall sind „akzessorische Zellen" Mesenchymzellen, die die Differenzierung von Präosteoklasten durch Erzeugen von Adhäsions- und Löslichkeitsfaktoren bewirken können. Beispiele für akzessorische Zellen sind Knochenmark- Stromalzellen, Osteoblasten (Osteoblast-ähnliche Zellen), Fibroblasten und Tumorzellen. „Osteoklasten-Vorläuferzellen" oder „Präosteoklasten" sind Zellen, die im Wesentlichen keine Fremdzellen enthalten. Konkret handelt es sich um humane Präosteoklasten. „Osteoklasten-Vorläuferzellen" oder „Präosteoklasten" sind auch hämatopoetische Stammzellen-abgeleitete Zellen, die in der Lage sind, unter entsprechenden Kulturbedingungen eine Differenzierung in Osteoklasten durchzuführen. „Osteoklasten" sind Zellen, die im Wesentlichen keine Fremdzellen enthalten. Konkret handelt es sich um humane Osteoklasten. „Osteoklasten" sind auch Zellen, die mehrkernig (N > 3) sind, positiv für Tartrat-beständige saure Phosphatase (TRAP) sind und eine Knochenresorption durchführen können.
Weiterhin betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten in Osteoklasten, das ein Kulturmedium verwendet, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin (Kitaura, M. et al., J. Biol. Chem, 271, 13, 7725–7730, 1996), Eotaxin-2 (Forssmann, U. et al., J. Exp. Med., 185, 12, 2171–2176, 1997), Eotaxin-3 (humanes CC-Chemokin; die Nukleinsäuresequenz liegt bei der SEQ-ID-Nr. 1 vor, und die Aminosäuresequenz liegt bei der bei SEQ-ID-Nr. 2 vor) oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten enthält. IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2 und Eotaxin-3 können jeweils natürlich oder rekombiniert sein. Als das Kulturmedium, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten enthält, kein ein Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen verwendet werden. Als der Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen kann ein Kulturüberstand aus Phytohämagglutinin-stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren von Präosteoklasten durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit in Abwesenheit von Zytokinen. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von Präosteoklasten durch Zugeben von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit zu einem essentiellen Medium für Säugerzellen in Abwesenheit von Zytokinen und durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren des Gemisches bei 35 bis 37°C in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5 bis 7%, um alle Zellen außer den Präosteoklasten zu zerstören. Weiterhin betrifft die Erfindung Präosteoklasten, die nach diesem Verfahren gewonnen werden können.
„Peripheres Blut" ist peripheres Säugerblut, konkret gesagt, peripheres humanes Blut. Als peripheres Blut kann peripheres Blut von gesunden Spendern verwendet werden.
Als „Gelenkflüssigkeit" kann nicht nur Gelenkflüssigkeit von gesunden Spendern, sondern auch Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) verwendet werden.
Ein „essentielles Medium für Säugerzellen" ist eine isotonische Pufferlösung, die anorganische Salze, essentielle Aminosäuren oder deren Derivate und Vitamine und deren Derivate enthält, die verfügbar sind, damit Zellen überleben können. Beispiele für das „essentielle Medium für Säugerzellen" sind Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640 und AIM-V.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren von Präosteoklasten in Osteoklasten, das das Kultivieren, in Abwesenheit von akzessorischen Zellen, der Präosteoklasten umfasst, die durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren des peripheren Bluts oder der Gelenkflüssigkeit, wie vorstehend beschrieben, in Abwesenheit von Zytokinen isoliert werden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, das ein Kulturmedium verwendet, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten enthält. IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2 und Eotaxin-3 können jeweils natürlich oder rekombiniert sein. Als das Kulturmedium, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder ein aus einer Kombination aus zwei oder mehr dieser Komponenten bestehendes Gemisch enthält, kann ein Kulturüberstand aus Mitogenstimulierten einkernigen peripheren Blutzellen verwendet werden. Als der Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen kann ein Kulturüberstand aus . Phytohämagglutinin-stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen verwendet werden.
Als weitere Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Verwendung der Präosteoklasten oder Osteoklasten dieser Erfindung umfasst, und ein Agens für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das mit dem Screening-Verfahren gewonnen werden kann. Beispiele für „stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten" sind Osteoporose, rheumatoide Arthritis, Verringerung der Knochenmenge durch Diabetes, Osteoperose und Osteomalazie.
Beispiele für das „Verfahren zum Screenen von Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten" sind (1) ein Verfahren zum Messen der Hemmungsaktivität bei der Differenzierung von Präosteoklasten in Osteoklasten und (2) ein Verfahren zum Messen der Hemmungsaktivität bei der Knochenresorption durch Osteoklasten. Wenn eine als Therapeutikum in Frage kommende Verbindung eine Differenzierungshemmungsaktivität gegen die Präosteoklasten dieser Erfindung zeigt, ist die Verbindung als Antirheumatikum aussichtsreich. Und wenn eine als Therapeutikum in Frage kommende Verbindung eine Knochenresorptionshemmungsaktivität gegen die Osteoklasten dieser Erfindung zeigt, lässt das vermuten, dass die Verbindung zur Behandlung von Osteoporose infolge von übermäßiger Knochenresorption, Verringerung der Knochenmasse durch Diabetes, Osteomalazie o. Ä. zweckmäßig ist. Auf diese Weise kann unter Verwendung der Präosteoklasten oder Osteoklasten dieser Erfindung das Screenen nach Therapeutika für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten leicht in vitro durchgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 umfasst Mikroaufnahmen, die die mit May-Giemsa-Lösung gefärbten Präosteoklasten und Osteoklasten zeigen.
2 umfasst Mikroaufnahmen, die die TRAP-Aktivität in den Präosteoklasten und Osteoklasten zeigen.
3 umfasst Mikroaufnahmen, die die Resorptionsaktivität der Präosteoklasten und Osteoklasten zeigen, die unter Verwendung von Dentinscheiben untersucht wurde.
4 ist eine Mikroaufnahme, die Resorptionslöcher in einer Dentinscheibe zeigt, die von den Osteoklasten gebildet wurden.
5 umfasst Mikroaufnahmen, die die Resorptionsaktivität der Präosteoklasten und Osteoklasten zeigen, die unter Verwendung einer Hydroxyapatit-Sinterquarzscheibe untersucht wurde.
Ausführungsformen der Erfindung
Die humanen Osteoklasten der Erfindung können nach folgenden Verfahren gewonnen werden.
Isolierung von Präosteoklasten
Die Isolierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen umfasst (1) den Schritt des Abtrennens der Zellfraktion und (2) den Schritt des Isolierens der Präosteoklasten.
(1) Abtrennen der Zellfraktion
Präosteoklasten können aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern oder aus der Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen werden. Die Menge der zum Isolieren der Zellen benötigten Körperflüssigkeit beträgt für peripheres Blut von gesunden Versuchspersonen 50 bis 200 ml bzw. für Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis 1 ml bis mehrere zig ml. Bei Verwendung von peripherem Blut von gesunden Spendern wird das Blut in Gegenwart von Heparin oder einem alternativen gerinnungshemmenden Mittel gesammelt. Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) werden unter Ausschluss von Erythrozyten durch Schwerkraftzentrifugation, Ammoniumchlorid o. Ä. aus dem Blut gewonnen.
Wenn jedoch Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis verwendet wird, kann die Zellfraktion durch Zentrifugieren der Gelenkflüssigkeit, gegebenenfalls durch Zugabe eines essentiellen Mediums für Säugerzellen, wie etwa RPMI 1640, gewonnen werden.
(2) Isolierung der Präosteoklasten
Die gewonnene Zellfraktion wird mehrere Wochen, vorzugsweise 1–3 Wochen, in einem essentiellen Medium für Säugerzellen, wie etwa DMEM, bei 35–37°C, vorzugsweise 37°C, in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5–7% kultiviert. Diese Kultur zerstört alle Zellen außer den Präosteoklasten, und die Präosteoklasten können isoliert werden.
Isolierung der Osteoklasten
Die Isolierung der Osteoklasten umfasst (1) den Schritt des Herstellens eines Kulturmediums und (2) den Schritt des Auslösens der Differenzierung von Präosteoklasten in Osteoklasten.
(1) Herstellung des Kulturmediums
Das Medium wird durch Zugabe von Zytokinen zu einem essentiellen Medium für Säugerzellen, wie etwa AIM-V, hergestellt, um die Differenzierung auszulösen. Um eine bakterielle Verunreinigung zu vermeiden, wird das Medium vorzugsweise mit Antibiotika versetzt. Erfindungsgemäß sind IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2 und Eotaxin-3 Beispiele für die Zytokine, die eine die Differenzierung der Präosteoklasten auslösende Wirkung haben. Diese Zytokine können einzeln oder als Gemisch zugegeben werden.
(2) Auslösung der Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten
Die gewonnenen Präosteoklasten werden 48–96 Stunden in dem vorgenannten Medium bei 35–37°C kultiviert. Die Präosteoklasten werden durch Stimulation der vorgenannten Zytokine in Osteoklasten differenziert. Dadurch können die Osteoklasten isoliert werden.
Screenen nach Therapeutika für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten
Beispiele für das Verfahren zum Screenen nach Therapeutika für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten sind (1) ein Verfahren zum Messen der Hemmungsaktivität bei der Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten und (2) ein Verfahren zum Messen der Hemmungsaktivität bei der Knochenresorption durch die Osteoklasten.
(1) Verfahren zur Messung der Differenzierungshemmungsaktivität
Die mit der Erfindung gewonnenen Präosteoklasten werden beispielsweise als 1 × 10⁶ Zellen/Well hergestellt und auf einer 48-Well-Platte kultiviert. Bei der Kultivierung wird ein essentielles Medium für Säugerzellen, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2 oder Eotaxin-3 enthält, oder ein Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen verwendet. Eine als Therapeutikum in Frage kommende Verbindung wird in verschiedenen Konzentrationen in jedes Well gegeben, und die vorbereitete Platte wird 48–96 Stunden bei 37°C kultiviert. Am Ende der Kultivierungszeit werden die angehafteten Zellen fixiert und mit Tartrat-beständiger saurer Phosphatase (TRAP) gefärbt, die ein spezielles Marker-Enzym für Osteoklasten ist. In jedem Well werden die mehrkernigen (N > 3) und TRAP-positiven Zellen als Osteoklasten gezählt. Durch Berechnen des Ergebnisses als IC₅₀ kann die Differenzierungshemmungsaktivität der in Frage kommenden Verbindung gegen die Präosteoklasten beurteilt werden.
(2) Verfahren zum Messen der Knochenresorptionshemmungsaktivität
Die mit der Erfindung gewonnenen Osteoklasten werden beispielsweise als 1 × 10⁶ Zellen/Well hergestellt und auf einer Dentinscheibe in einem essentiellen Medium für Säugerzellen auf einer 48-Well-Platte kultiviert. In jedes Well wird eine als Therapeutikum in Frage kommende Verbindung in verschiedenen Konzentrationen gegeben, und die Zellen werden 48–96 Stunden bei 37°C kultiviert. Am Ende der Kultivierungszeit wird die Dentinscheibe mit Hematoxylin gefärbt. Die Osteoklasten resorbieren Hydroxyapatit, und die resorbierten Teile (Resorptionslöcher) werden bei erfolgter Knochenresorption durch die Hematoxylinfärbung sichtbar gemacht. Die Bildung von Resorptionslöchern in der Dentinscheibe wird mikroskopisch oder elektronenmikroskopisch untersucht. Es kann aber auch die Änderung der Calciumkonzentration im Kulturüberstand untersucht werden. Durch Berechnen des Ergebnisses als IC₅₀ kann die Knochenresorptionshemmungsaktivität der in Frage kommenden Verbindung gegen die Osteoklasten beurteilt werden.
Die Hemmungsaktivität bei der Osteoklastenbildung ist ein wichtiger Indikator für die Beurteilung der Antirheuma-Aktivität. Eine Verbindung, die eine Differenzierungshemmungsaktivität gegen Präosteoklasten hat, ist somit als Antirheumatikum aussichtsreich. Osteoporose wird durch eine übermäßige Knochenresorption verursacht. Eine Verbindung, die eine Knochenresorptionshemmungsaktivität gegen Osteoklasten hat, ist somit als Therapeutikum für Osteoporose aussichtsreich.
Beispiele
Beispiel 1: Isolierung der humanen Osteoklasten aus Gelenkflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis
(1) Abtrennung der Zellfraktion
Gelenkflüssigkeit wurde von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen. Die Gelenkflüssigkeit wurde in Rohren bei 4°C aufbewahrt. Die folgenden Verfahren wurden in der Regel unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Gelenkflüssigkeit wurde in einer Menge von 1 ml bis mehrere zig ml zur gleichen Menge Medium RPMI 1640 (Gibco BRL, #22400 o. Ä.) gegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 1000–2000 U/min bei 4°C zentrifugiert, um eine Zellfraktion, die Granulocyten und Lymphozyten enthält, zu gewinnen.
(2) Isolierung der Präosteoklasten
Die gewonnene Zellfraktion wurde mehrere Wochen in DMEM-Medium (Gibco BRL, #12430-21 o. Ä.), das mit 10 Vol.-% fetalem Kälberserum (FCS) versetzt worden war, in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5–7% bei 37°C kultiviert. Während der Kultivierungszeit starben alle Zellen außer den Präosteoklasten, und nur die Präosteoklasten überlebten (1 und 2).
(3) Herstellung des Mediums
Das Medium wurde zur Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten hergestellt. 400 ml Medium AIM-V (Gibco BRL, #87-0112) wurden mit 60 ml Medium RPMI 1640 (Gibco BRL, #22400), 40 ml humanem T-STIM (10 BRMP/ml; BRMP = Bezugsreagens Biological Modifier Program Jurkat IL-2), 50 ml 10-%igem FCS (das vorher durch 30-minütiges Erhitzen bei 56°C inaktiviert worden war) und Antibiotikum (100 Einheiten Penicillin und 100 μg Streptomycin je ml; Gibco BRL, #15140-015 o. Ä.) versetzt und als Medium A verwendet. Humanes T-STIM ist ein Kulturüberstand aus mit Phytohämagglutinin stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen (humanes T-STIM mit PHA, Becton Dickinson, #40045).
(4) Auslösung der Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten
Die im Beispiel 1(2) gewonnenen Präosteoklasten wurden 48–96 Stunden bei 37°C mit dem im Beispiel 1(3) beschriebenen Medium A stimuliert. Unter diesen Kultivierungsbedingungen wurde die Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten untersucht (1, 2).
(5) Identifizierung des differenzierungsauslösungsfähigen Zytokins
Humanes T-STIM enthält verschiedene Zytokine. Um das Zytokin zu identifizieren, das die Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten stimuliert, wurde die Differenzierung durch Modifizieren der Gehalte an dem im Beispiel 1(3) beschriebenen Medium A untersucht.
➀ Herstellung des Mediums
Die folgenden 16 Arten des Mediums (B–R) wurden unter Verwendung der nachstehenden Zytokine allein oder als Gemisch als anstelle des im Medium A (Beispiel 1(3)) enthaltene humane T-STIM hergestellt. Die anderen Stoffe als humanes T-STIM, also die Medien AIM-V und RPMI 1640, 10% FCS und Antibiotikum (100 Einheiten Penicillin und 100 μg Streptomycin je ml; Gibco BRL, #15140-015 o. Ä.), waren die Gleichen, die im Medium A enthalten waren.

– Medium B: 0,5–5 ng rekombiniertes humanes IL-1 (R & D Systems, #201-LB, #200-LA o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium C: 50–200 Einheiten rekombiniertes humanes IL-2 (R & D Systems, #202-IL o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium D: 2–10 ng rekombiniertes humanes IL-3 (R & D Systems, #401-ML-010 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium E: 50–200 Einheiten rekombiniertes humanes IL-4 (Genzyme, #2181-01 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium F: 10–20 ng rekombiniertes humanes IL-6 (R & D Systems, #206-IL o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium G: 10–20 ng rekombiniertes humanes IL-6 (R & D Systems, #206-IL o. Ä.) je ml + 100–300 ng rekombinierter löslicher humaner IL-6-Rezeptor (R & D Systems, #227-SR o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium N: 5–20 ng rekombiniertes humanes IL-7 (Genzyme, #1587-00 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium I: 1–4 ng rekombiniertes humanes IL-11 (R & D Systems, #218-IL o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium J: 2,5–100 ng rekombiniertes humanes M-CSF (R & D Systems, #216-MC-010 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium K: 1–5 ng rekombiniertes humanes GM-CSG (R & D Systems, #215-GM-010 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium L: 2–10 ng rekombiniertes humanes IL-3 (R & D Systems, #403-ML-010 o. Ä.) je ml + 5–20 ng rekombiniertes humanes IL-7 (Genzyme, #1587-00 o. Ä.) + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium M: 5–20 ng rekombiniertes humanes IL-7 (Genzyme, #1587-00 o. Ä.) je ml + 1–5 ng rekombiniertes humanes GM-CSF (R & D Systems, #215-GM-010 o. Ä.) + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium N: 2–10 ng rekombiniertes humanes IL-3 (R & D Systems, #403-ML-010 o. Ä.) je ml + 5–20 ng rekombiniertes humanes IL-7 (Genzyme, #1587-00 o. Ä.) + 1–5 ng rekombiniertes humanes GM-CSF (R & D Systems, #215-GM-010 o. Ä.) + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium P: 10–1000 ng rekombiniertes humanes Eotaxin (R & D Systems, #220-EO o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium Q: 10–1000 ng rekombiniertes humanes Eotaxin-2 (R & D Systems, #343-E2 o. Ä.) je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum.
– Medium R: 10–1000 ng rekombiniertes humanes Eotaxin-3 je ml + 400 ml Medium AIM-V + 60 ml Medium RPMI 1640 + 50 ml FCS + Antibiotikum. [Eotaxin-3 wurde in den humanen Genomsequenzdaten (H RG356E01) gefunden, die vom Washington University Genome Sequence Center veröffentlicht wurden, eine Exson-Sequenz, die mutmaßlich eine signifikante Homologie zeigt, aber ein anderes Chemokin-Protein als die bekannten CC-Chemokine codiert. Bei der Sequenz wurde cDNA von Eotaxin-3 gewonnen, das bei der SEQ-ID-Nr. 1 vorliegt. Es wurden rekombinierte Baculoviren, die die Sequenz enthalten, hergestellt, um Insektenzellen zu infizieren, dann wurde das rekombinierte Eotaxin-3-Protein vom Kulturüberstand gereinigt.]

➁ Auslösung der Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten
Die im Beispiel 1(2) gewonnenen Präosteoklasten wurden 48–96 Stunden bei 37°C in den vorgenannten Medien B–N kultiviert. Eine Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten wurde in den Medien D, H, K, M, N, P, Q und R beobachtet. In den Medien B, C, E, F, G, I und J erfolgte jedoch keine Differenzierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 und Gemische daraus in der Lage sind, die Differenzierung der Präosteoklasten auszulösen. Und es wurde bestätigt, dass IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11 und M-CSF nicht in der Lage sind, die Differenzierung der Präosteoklasten auszulösen.
Bekanntlich lösen bei der Differenzierung, die die Gegenwart von akzessorischen Zellen erfordert, IL-1, IL-6, IL-11 und M-CSF die Differenzierung der Präosteoklasten in Osteoklasten aus. Bisher ist jedoch nicht klar gewesen, dass die Differenzierung durch die Stimulierung von Präosteoklasten oder akzessorischen Zellen ausgelöst wird.
Andererseits wird bei der Differenzierung von Präosteoklasten in dieser Erfindung, die keine Gegenwart von akzessorischen Zellen erfordert, klar, dass IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2 und Eotaxin-3 ein Differenzierungsauslösungsvermögen haben. IL-1, IL-6, IL-11 oder M-CSF bewirken jedoch keine Differenzierung.
Beispiel 2: Isolierung von humanen Osteoklasten aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern
(1) Abtrennung der Zellfraktion
Gesunden Spendern wurden 50–200 ml peripheres Blut in Gegenwart von Heparin oder einem alternativen gerinnungshemmenden Mittel entnommen. Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) wurden durch Schwerkraftzentrifugation unter Verwendung von Ficollpaque (Pharmacia Biotech) gewonnen. 10⁷ PBMC-Zellen je ml wurden im Medium RPMI 1640, das 10 Vol.-% FCS enthielt, suspendiert, dann wurden 1–1,5 ml Zellsuspension je Schale auf 60-mm-Petrischalen 1–2 Stunden bei 37°C in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5–7% kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die nichthaftenden Zellen mit dem Medium RPMI 1640, das 10 Vol.-% FCS enthielt, bei 37°C von der Schale gespült. Die an der Schale haftenden Zellen wurden mit kaltem (4°C) serumfreien Medium RPMI 1640 gewaschen, dann wurden die Zellen als Monozyten des peripheren Bluts (etwa 3–8% aller PBMC) gesammelt.
(2) Isolierung der Präosteoklasten
Die gewonnenen Monozyten (0,5–1 × 10⁶/ml) wurden wie im Beispiel 1(2) im Medium DMEM (Gibco BRL, #12430-21 o. Ä.), das mit 10% FCS versetzt war, mehrere Wochen bei 37°C in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5–7% kultiviert. Während der Kultivierungszeit starben alle Zellen außer den Präosteoklasten, und nur die Präosteoklasten überlebten. Bei Kokultivierung der peripheren Blutmonozyten und der Synovialstützzellen, die von Patienten mit rheumatoider Arthritis gewonnen wurden, stieg die Proliferationswirkung der Präosteoklasten. Dabei wurde das gleiche Medium wie im Beispiel 1(2) verwendet.
(2) Auslösung der Differenzierung
Die Präosteoklasten wurden 48–96 Stunden mit dem im Beispiel 1(3) beschriebenen Medium A stimuliert. Es fand eine Differenzierung der Präosteoklasten statt, und es wurden Osteoklasten erhalten.
Anhand der folgenden Prüfbeispiele wurde bestätigt, dass die in den Beispielen 1(4) und 2(3) gewonnenen Zellen Osteoklasten waren.
Prüfbeispiele
(1) Morphologische Untersuchung
Die Zellen wurden mit May-Giemsa-Lösung gefärbt und mikroskopisch untersucht. Die gefärbten Präosteoklasten und Osteoklasten sind in 1 als Mikroaufnahmen gezeigt. Das Ergebnis hat bestätigt, dass die Präosteoklasten vor der Differenzierung eine Monozytartige Morphologie hatten und die Osteoklasten mehrkernige (über 3–100) Riesenzellen waren.
(2) TRAP-Färbung
Die Präosteoklasten vor der Differenzierung und die Osteoklasten nach der Differenzierung wurden mit einem TRAP-Färbekasten (Sigma Co.; TRAP: Tartrat-beständige saure Phosphatase) gefärbt und mit einem Mikroskop untersucht. Die Zellen vor der Differenzierung (Präosteoklasten) und die Zellen nach der Differenzierung (Osteoklasten) sind in 2 als Mikroaufnahmen gezeigt. Die Figuren zeigen, dass die Zellen vor der Differenzierung (Präosteoklasten) TRAP-positiv waren und die Zellen nach der Differenzierung (Osteoklasten) insbesondere um die Kerne TRAP-positiv waren.
(3) Knochenresorptionsaktivität
Die Präosteoklasten wurden auf Dentinscheiben unter die Differenzierung auslösenden Bedingungen (Beispiel 1(4)) kultiviert, dann wurden die Dentinscheiben mit Hematoxylin (Sigma Co.) gefärbt und mit einem Mikroskop untersucht. 3 zeigt die Oberflächen der Scheiben als Mikroaufnahme. Die Präosteoklasten vor der Differenzierung hatten keinen Einfluss auf die Dentinscheiben. Die Osteoklasten nach der Differenzierung resorbierten jedoch Calciumphosphat, und die Resorptionslöcher auf den Scheiben waren stark mit dem Farbstoff gefärbt. Die von den Osteoklasten resorbierten Dentinscheiben wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop untersucht. 4 zeigt die Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme. Die Bildung der Resorptionslöcher ist in der Mitte der Aufnahme zu erkennen. Die Resorption von Calciumphosphat führte zur Entstehung der Löcher, und außen wurden Kollagenfasern freigelegt.
Dann wurden die Präosteoklasten auf Calciumphosphat-Sinterquarzscheiben (Osteologic^TM, Sumisho Pharma) differenziert, und die Scheiben wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop untersucht. 5 zeigt die Phasenkontrastmikroskop-Aufnahme. Die Präosteoklasten vor der Differenzierung hatten keinen Einfluss auf die Calciumphosphat-Sinterquarzscheiben. Es wurde jedoch eine Resorption (der transparente Bereich der Scheibe) durch die Osteoklasten nach der Differenzierung beobachtet.
Die im Prüfbeispiel gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass die Zellen vor der Differenzierung Präosteoklasten waren und die Zellen nach der Differenzierung Osteoklasten waren.
Anwendungsmöglichkeiten in der Industrie
Erfindungsgemäß können Osteoklasten von ein und demselben Individuum wiederholt gewonnen werden, und dadurch kann die pathophysiologische oder immunologische Untersuchung der Osteoklasten durch ihre Verwendung erfolgen. Das Screenen nach in Frage kommenden Verbindungen, die zur Behandlung von stoffwechselbedingten Knochenkrankheiten zweckmäßig sind, kann unter Verwendung der Osteoklasten-Vorläuferzellen oder Osteoklasten der Erfindung erfolgen. Es ist beispielsweise effektiv, eine Verbindung zu verwenden, die durch Screenen nach der Knochenresorptionshemmungsaktivität gegen die Osteoklasten erhalten wird und ein Knochenresorptionshemmungsvermögen gegen die Osteoklasten zeigt, um stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, wie etwa Osteoporose durch übermäßige Knochenresorption, Verringerung der Knochenmenge durch Diabetes und Osteomalazie, zu behandeln.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Differenzieren von humanen Osteoklasten-Vorläuferzellen in humane Osteoklasten, das das Kultivieren der Osteoklasten-Vorläuferzellen in Abwesenheit von akzessorischen Zellen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, das ein Kulturmedium verwendet, das IL-3, IL-7, GM-CSF, Eotaxin, Eotaxin-2, Eotaxin-3 oder ein Gemisch aus zwei oder mehr dieser Komponenten enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ein Kulturmedium verwendet, das einen Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kulturüberstand aus Mitogen-stimulierten einkernigen peripheren Blutzellen ein Kulturüberstand aus Phytohämagglutinin-stimulierten humanen einkernigen peripheren Blutzellen ist.
In-vitro-Verfahren zum Isolieren von Osteoklasten-Vorläuferzellen, das 1- bis 3-wöchiges Kultivieren von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit in Abwesenheit von Zytokinen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Osteoklasten-Vorläuferzellen durch Zugeben von peripherem Blut oder Gelenkflüssigkeit zu einem essentiellem Medium für Säugerzellen in Abwesenheit von Zytokinen und durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren des Gemisches bei 35 bis 37°C in Luft mit einem CO₂-Gehalt von 5 bis 7% isoliert werden, um alle Zellen außer den Osteoklasten-Vorläuferzellen zu zerstören.
Verfahren zum Differenzieren von humanen Osteoklasten-Vorläuferzellen in humane Osteoklasten nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die humanen Osteoklasten-Vorläuferzellen Osteoklasten-Vorläuferzellen sind, die mit dem Verfahren von Anspruch 5 oder 6 isoliert wurden.
In-vitro-Verfahren zum Screenen nach Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Isolierung der Osteoklasten-Vorläuferzellen nach dem Verfahren von Anspruch 5 oder 6 aufweist.
In-vitro-Verfahren zum Screenen nach Agenzien für stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten, das die Gewinnung der Osteoklasten mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.