DE102008036060A1 - Zellbasiertes Verfahren und Mittel zum Knochenaufbau - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro isolierten oder in vitro differenzierten Osteoklasten für den Knochenaufbau, insbesondere durch die in vivo Anwendung für das Auslösen des Knochenaufbaus durch die Anziehung von Osteoblasten und vorzugsweise auch vaskulären Zellen zu einem Ort eines Knochendefekts. Die Erfinder haben herausgefunden, dass Osteoklasten den Knochenaufbau regulieren können, indem sie chemotaktische Faktoren sezernieren und Osteoblasten und vaskulären Zellen zum Ort eines Knochendefekts locken. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Osteoklasten für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines medizinischen Produkts für den Knochenaufbau oder die Behandlung von Knochendefekten.

Description

  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, insbesondere das Gebiet der Chirurgie und Orthopädie, indem sie ein zellbasiertes Verfahren und Mittel zum Knochenaufbau zur Verfügung stellt.
  • Knochen bilden die hauptsächliche tragende Struktur des Körpers. Sie erhalten ihre Stabilität in erster Linie durch das Knochengewebe, aus dem sie bestehen. Knochen unterliegen einer Umbildung, um die Masse, die Form und die physikalischen Eigenschaften des Skeletts aufrechtzuerhalten. Zwei Haupttypen von Zellen, die knochenbildenden Osteoblasten und die knochenresorbierenden Osteoklasten tragen zu diesem Prozess bei, der kontinuierlich während des gesamten Lebens stattfindet. Die Knochenumbildung beruht dabei auf dem streng geregelten Zusammenspiel zwischen knochenbildenden Osteoblasten und knochenabbauenden Osteoklasten.
  • Das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und -abbau ist normalerweise streng kontrolliert. Unter pathologischen Bedingungen oder während der Alterung gerät es jedoch aus der Kontrolle und neigt vermehrt zum Abbau, was zu Osteoporose führt (Teitelbaum S. L. (2000) Bone resorption by osteoclasts. Science 289: 1504–1508; Harada S. and Rodan G. A. (2003) Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature 423: 349–355; Aguila H. L. and Rowe D. W. (2005) Skeletal development, bone remodeling, and hematopoiesis. Immunol Rev 208: 7–18.). Dieses strenge Gleichgewicht impliziert die Existenz von Mechanismen, die sowohl die Differenzierung von Osteoblasten und Osteoklasten koordinieren, wie auch ihre Zellwanderung zu den Orten, an denen sie ihre Funktion ausüben.
  • Osteoblasten kontrollieren die Osteoklastogenese, d. h. die Differenzierung von hämatopoetischen Osteoklasten-Vorläufern zu reifen, mehrkernigen Zellen (Boyle W. J. et al. (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature 423: 337–342). In Kombination mit Stromazellen kontrollieren sie den Knochenabbau durch die Expression des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (Macrophage-Colony Stimulating Factor oder M-CSF), der für die Proliferation von Osteoklasten-Vorläuferzellen benötigt wird, sowie des Rezeptors für die Aktivierung des NF-kB-Liganden (Receptor for Activation of NF-kB Ligand oder TNF-Familie, das die Differenzierung der RANKL), ein Mitglied der Osteoklasten auslöst (Teitelbaum S. L. (2000) Bone resorption by osteoclasts. Science 289: 1504–1508; Boyle W. J. et al. (2003) Osteoclast differentiation and activation. Nature 423: 337–342; Wagner EF (2002) Functions of AP1 (Fos/Jun) in bone development. Ann Rheum Dis 61 Suppl 2: ii40–42; Kawamata A. et al. (2008) JunD suppresses bone formation and contributes to low bone mass induced by estrogen depletion. J Cell Biochem 103: 1037–1045; Bruzzaniti A. and Baron R. (2006) Molecular regulation of osteoclast activity. Rev Endocr Metab Disord 7: 123–139; Teitelbaum S. L. (2007) Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol 170: 427–435).
  • Es gibt auch Hinweise darauf, dass Osteoklasten die Funktion der Osteoblasten kontrollieren können. Ephrin B2, das von Osteoklasten exprimiert wird, und der dazugehörige Ephrin B4 Rezeptor, der von Osteoblasten exprimiert wird, erlauben einen Signalaustausch in beide Richtungen (Zhao C. et al. (2006) Bidirectional ephrinB2-EphB4 signaling controls bone homeostasis. Cell Metab 4: 111–121). Signale, die durch Ephrin B4 in die Osteoblasten gelangen, erhöhen die knochenbildende Differenzierung. Signale, die über Ephrin B2 in Osteoklasten-Vorläuferzellen gelangen, unterdrücken hingegen die Osteoklasten-Differenzierung. Es wurde weiterhin berichtet, dass die v-ATPase V0 Untereinheit D2 nicht nur an der Osteoklastenfusion beteiligt ist, sondern auch die Sekretion von bislang unbekannten Faktoren durch Osteoklasten reguliert, die die Differenzierung von Osteoblastenvorläuferzellen zu reifen Zellen inhibieren (Lee S. H. et al. (2006) v-ATPase V0 subunit d2-deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation. Nat Med 12: 1403–1409).
  • Während der Entwicklung müssen Osteoblasten das Knorpelgewebe besiedeln, das durch Knochen ersetzt werden soll. Während des Erwachsenenalters erfordern die Knochenumbildung und -reparatur, dass Osteoblasten zu den Orten wandern, die neuaufgebaut werden müssen. Dieser zuletzt genannte Prozess erfordert auch die Mobilisierung ihrer Vorläuferzellen, die zusammen mit den mesenchymalen Stammzellen (mesenchymal stem cells oder MSC) in den (Stammzell-)Nischen des Knochenmarks angesiedelt sind (Li L. and Xie T. (2005) Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 605–631; Yin T. and Li L. (2006) The stem cell niches in bone. J Clin Invest 116: 1195–1201).
  • Von einer Fülle von Wachstumsfaktoren, die als rekombinante Proteine eingesetzt wurden, insbesondere BMPs, platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) und leukemia inhibitory factor (LIF), konnte gezeigt werden, dass sie in vitro chemotaktische Aktivität in Richtung verschiedener Zelltypen, einschließlich Osteoblasten und ihrer Vorläufer, zeigen (Fiedler J. et al. (2004) To go or not to go: Migration of human mesenchymal progenitor cells stimulated by isoforms of PDGF. J Cell Biochem 93: 990–998; Mayr-Wohlfart U. et al. (2002) Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 30: 472–477).
  • Verschiedene Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise der Platelet-derived Growth Faktor PDGF oder der Vascular endothelial growth factor VEGF, die chemotaktisch als Attraktanten von Osteoblasten bzw. Endothelzellen wirken, begünstigen bekannterweise den Prozess des Knochenaufbaus. Andere sind Schlüsselfaktoren bei der Regulation der Skelettentwicklung, wie z. B. die bone morphogenic Proteins (BMPs). Daher fanden diese Wachstumsfaktoren Einsatz bei der Verbesserung der Eigenschaften und Funktionalität von Biomaterialien. Einige andere wurden in Knochenoperationen als lösliche Komponenten verwendet. BMPs, die als rekombinante Proteine erhältlich sind, sind für verschiedene klinische Anwendungen registriert. Seit März 2007, also 17 Jahre nach der Entdeckung dieser Proteine, sind in den Vereinigten Staaten der OP1-Faktor für orthopädische Anwendungen und BMP2 für orale, maxillofaciale und implantologische Anwendungen zugelassen. Weiterhin gibt es Zusammensetzungen mit osteoinduktivem Effekt, die rekombinantes BMP2 und BMP7 enthalten (Inductos, INFUSEbonagraft, Osigraft). Der Einsatz von Osteoklasten als eine Quelle von Wachstumsfaktoren, die den Knochenaufbau fördern, würde daher eine alternative Lösung bereitstellen.
  • Diese Wachstumsfaktoren können genutzt werden, um das Nachwachsen, den Aufbau bzw. die Restrukturierung von Knochen in einem Patienten zu fördern. Es gibt viele Einflüsse auf Knochen, die einen solchen Aufbau von Knochen notwendig machen können. Knochen können, bedingt durch mechanische Belastung, brechen, was zu Frakturen führt. Primäre maligne Knochentumore, wie beispielsweise Sarkome (Osteosarkom, Ewing-Sarkom), oder sekundäre Metastasen, die von Tumoren in anderen Geweben stammen, können Knochengewebe zerstören (Osteolyse) und müssen oft operativ entfernt werden. Die Infektion von Knochengewebe durch Bakterien, Viren oder Pilze kann zu Osteomyelitis und einer anschließenden Zerstörung des Knochens führen. Das Ziehen oder der Verlust von Zähnen kann zu einem Schwund des Kieferknochens führen, der eine Befestigung von Implantaten oder Gebissen behindert.
  • Nach anfänglichen Hoffnungen hat sich jedoch von mehreren rekombinanten Wachstumsfaktoren herausgestellt, dass sie das Knochenwachstum nur sehr schlecht induzieren. VEGF ist ein Beispiel, das sehr ineffizient für den Knochenaufbau ist, aller Wahrscheinlichkeit nach bedingt durch die chemischen Verfahren, die zur Absorption dieser Wachstumsfaktoren und zur „Funktionalisierung” der Biomaterialien verwendet werden. Neben den technischen und wissenschaftlichen Hindernissen bezüglich der Anwendung solcher rekombinanten Proteine bleiben die hohen Kosten die größte Hürde für eine breite klinische Anwendung.
  • Die knochenbildenden Osteoblasten können bis zum heutigen Tage nur in vitro durch die Isolation von mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmark mittels eines schwerwiegenden operativen Eingriffs erhalten werden. Dies belastet den Patienten, der vielleicht bereits an den Auswirkungen einer ernsthaften Krankheit wie z. B. einem Knochentumor leidet, zusätzlich.
  • Das Problem liegt vermutlich darin, die Wachstumsfaktoren und Zellen an jene Orte zu leiten, wo sie benötigt werden.
  • Es ist immer noch unklar, welche Zelltypen in der Knochenmatrix die Faktoren sezernieren, die in der Lage sind, knochenbildende Zellen anzulocken, welche Wachstumsfaktoren in diesem Zusammenhang ihre Funktion ausüben und wie die Wanderung der knochenbildenden Zellen mit dem Knochenabbau in Einklang gebracht wird.
  • Die Identifizierung solcher Zellen und der Faktoren, die sie einsetzen, ist höchst wünschenswert, denn sie könnten verwendet werden, um Osteoblasten an den Ort zu locken, wo der Aufbau von Knochenmaterial notwendig ist, z. B. Knochenschädigungen, Knochenbrüche usw.
  • Knochenerkrankungen entwickeln sich zu einem der hauptsächlichen Gesundheitsprobleme in unseren entwickelten Gesellschaften. Jährlich erfordern etwa eine Million skeletaler Defekte den Einsatz von Knochentransplantaten, die eine bedeutende Herausforderung für die Knochenchirurgie darstellen und verschiedene medizinischen Felder betreffen. Zum Beispiel führen zwei in unserer Bevölkerung weitverbreitete Arten von Krebs (Brust- und Prostatakrebs) zu Knochenmetastasen und Frakturen in den betroffenen Knochen. Millionen von Knochenbrüchen, die auf Osteoporose zurückgehen, wurden weltweit jährlich gemeldet, und der demographische Wandel sagt einen dramatischen Anstieg an osteoporotischen Frakturen voraus.
  • Daher besteht weiterhin ein Bedarf an neuentwickelten Verfahren für den Knochenaufbau.
  • Aufgabe dieser Erfindung ist daher, ein Verfahren und Mittel für den Knochenaufbau zur Verfügung zu stellen.
  • Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass Osteoklasten den Knochenaufbau regulieren können, indem sie chemotaktische Faktoren sezernieren und Osteoblasten und vaskulären Zellen zum Ort eines Knochendefekts locken. Die Erfinder fanden heraus, dass reife Osteoklasten, aber jedoch nicht ihre Vorläuferzellen, verschiedene Wachstumsfaktoren sezernieren, die am Knochenaufbau und/oder der Knochenvaskularisierung beteiligt sein können. Insbesondere wurde gefunden, dass reife Osteoklasten PDGF-bb sezernieren, das durch den PD3F/PDGF Rezeptor beta (PD3F/PDGF receptor beta oder PDGFR-beta) auf der Oberfläche von Osteoblasten erkannt wird und die Osteoblasten-Chemotaxis reguliert.
  • Die Aufgabe wird daher gelöst durch die Verwendung von in vitro isolierten oder in vitro differenzierten Osteoklasten für den Knochenaufbau, insbesondere durch die in vivo Anwendung für das Auslösen des Knochenaufbaus durch die Anziehung von Osteoblasten und vorzugsweise auch vaskulären Zellen zu einem Ort eines Knochendefekts. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Osteoklasten für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines medizinischen Produkts für den Knochenaufbau oder die Behandlung von Knochendefekten.
  • Die Osteoklasten werden erfindungsgemäß als natürliche Fabriken verwendet, um chemotaktische Faktoren oder Wachstumsfaktoren zu produzieren, die auf Osteoblasten oder deren Vorläufer (mesenchymale Stromazellen) wie auch auf andere Zelltypen wirken, und werden ihre Chemoattraktion zu den Orten, wo Knochen neu gebildet werden muss, begünstigen. Daher wird es nicht notwendig sein, die rekombinanten Wachstumsfaktoren selbst herzustellen.
  • Der Begriff Knochenaufbau umfasst insbesondere die Umbildung bzw. Restrukturierung, die Reparatur und die Regeneration von Knochen, die im Fall von Frakturen (einschließlich Risse, wie auch osteoporotische Frakturen), skeletale Defekte, Verlust von Knochen aufgrund von Krebs, Operationen, Knochenkrankheiten oder anderen Ursachen notwendig sind. Der Begriff umfasst auch die Wiederherstellung von Knochen im Fall von Knochenatrophie. Ein Beispiel dafür ist die Atrophie des Kieferknochens nach dem Verlust eines oder mehrerer Zähne.
  • Der Begriff Knochendefekt schließt insbesondere jeden Knochen mit einer Schädigung oder einem zumindest teilweisen Verlust der Funktion ein, einschließlich nicht nur Knochenbrüche, sondern auch geschrumpfter oder atrophischer Knochen.
  • Der Begriff Osteoklast schließt erfindungsgemäß in vitro isolierte Zellen, Zelllinien und besonders bevorzugt in vitro differenzierte Zellen ein.
  • Die Verwendung von Osteoklasten eröffnet vorteilhaft einen einfachen, nichtinvasiven Weg zum Erhalt von Zellen, die für den Knochenaufbau verwendet werden können.
  • Im Gegensatz zu Osteoblasten sind Osteoklasten leicht erhältlich durch in vitro Differenzierung, ausgehend von einer Blutprobe, insbesondere durch die Isolierung von mononukleären Zellen, bevorzugt Monozyten wie Makrophagen, aus dem Blut des Patienten. Durch die Verwendung von Monozyten können Osteoklasten leicht in vitro durch die Zugabe von Macrophage colony stimulating factor (M-CSF) und Receptor for activation of NF-kB ligand (RANK-L) zum Zellkulturmedium erhalten werden.
  • M-CSF kontrolliert die Proliferation von Osteoklasten-Vorläuferzellen (Monozyten, Makrophagen), wohingegen der Receptor for activation of NF-kB ligand (RANK-L) ihre Differenzierung zu reifen, funktionellen Osteoklasten kontrolliert. Der Differenzierungsprozess kann durch die Verwendung von rekombinantem MCSF und RANK-L nun rasch in vitro reproduziert werden.
  • Eine Blutprobe kann schnell und ohne größere Belastung des Patienten erhalten werden 500 ml Blut sind ausreichend, um 5–10 mg Osteoklasten innerhalb von weniger als 5 Tagen zu erhalten.
  • Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist daher die Verwendung von Osteoklasten, wobei die Osteoklasten ausgehend von isolierten autologen Vorläuferzellen erhalten werden, also Zellen, die einige Tage zuvor von dem Patienten isolierten wurden, der behandelt werden soll. Diese Vorläuferzellen sind vorzugsweise mononukleäre Zellen, die aus einer Blutprobe dieses Patienten erhalten wurden. Um die Zellen zu gewinnen, wird Blut aus der Vene eines Spenders (aus einer peripheren Vene oder durch einen zentralen Venenkatheter) entnommen, und mononukleäre Zellen werden mittels Standardverfahren isoliert. Dies kann sogar durch Aphärese geschehen. Die Isolierung via Aphärese hat den Vorteil, dass rote Blutkörperchen und Plasma dem Spender wieder zurückgeführt werden können.
  • Die Erfindung stellt damit vorteilhaft eine Strategie zum Knochenaufbau zur Verfügung, die auf autologen Zellen basiert und nichtinvasiv ist. Das Konzept, das der Erfindung zugrundeliegt, beruht auf der Aktivierung und Rekrutierung des endogenen Knochenreparatursystems des Patienten zu dem Ort eines Knochendefekts.
  • In der erfindungsgemäßen Verwendung werden die Osteoklasten dem Patienten lokal verabreicht. Sie werden bevorzugt in der Nähe des Knochendefektes verabreicht, d. h. direkt an den Ort des Knochendefekts oder in seiner Nähe. Da die erfindungsgemäße Aufgabe der Osteoklasten darin besteht, andere Zellen, insbesondere Osteoblasten und/oder ihre Vorläufer, zu rekrutieren, ist es vorteilhafterweise nicht notwendig, die Osteoklasten exakt an dem Ort des Knochendefekts zu verabreichen. Die Rekrutierung zu dem Ort des Knochendefekts funktioniert auch in dem Fall, dass die Osteoklasten in seiner Nähe verabreicht werden.
  • Überraschenderweise benötigen die Osteoklasten keine wechselseitige Kommunikation (crosstalk) mit anderen Zellen, um die chemotaktischen Faktoren und die Wachstumsfaktoren zu sezernieren und die Osteoblasten und vorzugsweise auch vaskulären Zellen an den Ort des Knochendefekts zu locken. Die Osteoklasten können daher erfindungsgemäß ohne die Zugabe irgendwelcher anderen Zellen verabreicht werden. Insbesondere die Zugabe von Osteoblasten ist für die Erfindung nicht notwendig (da diese in vivo rekrutiert werden). Auch ist die Zugabe von rekombinanten Wachstumsfaktoren oder Chemokinen zu der Osteoklastenzubereitung nicht notwendig. Folglich enthält die Osteoklastenzubereitung bevorzugt keine rekombinanten Wachstumsfaktoren oder Chemokine. Sie kann jedoch Spuren von RANK-L und M-CSF enthalten, die eingesetzt wurden, um reife Osteoklasten zu erhalten.
  • Die Erfindung umfasst auch eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Medizinprodukt umfassend Osteoklasten für den Zweck des Knochenaufbaus.
  • Die Osteoklasten werden vorzugsweise verabreicht in Form von Suspensionen oder eingebettet in Gele (wie z. B. ein Hydrogel oder ein Xerogel) oder in Knochenzement oder sogar in ein Implantat, die verwendet werden, um fehlenden Knochen zu rekonstruieren.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren für die Behandlung eines Lebewesens, vorzugsweise eines Säugetiers mit einem Knochendefekt, umfassend die Schritte
    • a.) Isolierung von Blut von dem Lebewesen und Anreicherung von Monozyten
    • b.) Differenzierung von Monozyten in Osteoklasten (wie oben beschrieben),
    • c.) Verabreichung der Osteoklasten erhalten aus Schritt b.) an das Lebewesen an oder nahe dem Ort des Knochendefekts.
  • Die Erfindung wird näher erläutert durch die folgenden Figuren und Ausführungsbeispiele, ohne durch diese beschränkt zu werden.
  • 1 zeigt die chemotaktische Antwort von Osteoblasten und Osteoblastenvorläuferzellen auf Faktoren, die von Osteoklasten sezerniert werden.
  • Migrationsindex von murinen prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen (A) und davon abstammenden Osteoblasten (diff MC3T3-E1) (C) als Antwort auf konditionierte Medien von Raw264,7 Zellen (weisse Quadrate bzw. Säulen) und davon abstammende Osteoklasten (schwarze Kreise bzw. Säulen). Chemotaxis von prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen (B) und davon abstammenden Osteoblasten (D) durch konditionierte Medien von primären Osteoklasten („OCs”) und ihren Vorläufern. Als Vergleichsbeispiel wird die chemotaktische Aktivität von konditionierten Medien, die nach 2 und 4 Tagen von Raw264.7-Zellen („Raw”) und davon abstammenden Osteoklasten („OCs”) gesammelt worden sind, gezeigt. Gezeigt werden die Mittelwerte und die Standardabweichung von vier unabhängigen Experimenten, die in Triplikaten durchgeführt wurden. P-Werte von ANOVA-Tests gleich oder kleiner 0.05 wurden als signifikant gewertet und mit einem Asterisken (*) gekennzeichnet.
  • 2 zeigt, dass von Osteoklasten sezerniertes PDGF-bb Osteoblasten-Chemotaxis auslöst
  • Die Effizienz des Knock-Down von PDGF-bb (A), VEGFc (C) und LIF (E) in von Raw264.7-Zellen abstammenden Raw264Osteoklasten wurde durch quantitative RT-PCR bestimmt. Die Knockdown-Effizienz betrug 74%, 71% bzw. 70% (p < 0,00001, ANOVA). Gezeigt wird die Chemoattraktion von prä-osteoblastischen MC3T3-Zellen durch verschiedene Verdünnungen von konditionierten Medien von von Raw264.7-Zellen abstammenden Osteoklasten, die mit Kontroll-siRNA behandelt worden waren (weisse Kreise), oder von Raw264.7-Zellen abstammenden Raw264Osteoklasten (schwarze Kreise), in denen die Expression 01, ANvon PDGF-bb (B), VEGFc (D) und LIF (F) ausgeschaltet worden war (p < 0,00OVA).
    Figure 00090001
    in B zeigt die Reversion des PDGF-bb Knockdown in Osteoklasten: konditionierte Medien von siRNA-behandelten Osteoklasten wurden mit 10 ng/ml rekombinantem menschlichen PDGF-bb ergänzt. Datenpunkte repräsentieren den Durchschnitt aus 5 Experimenten.
  • Ausführungsbeispiel 1: Osteoklasten sezernieren Faktoren, die Osteoblasten anlocken
  • Alle Zelllinien stammen von ATCC (Rockville, MD, USA). Murine prä-osteoblastische MC3T3-E1-Zellen wurden in α-MEM, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS), gehalten. Murine myeloide Raw264.7 Zellen wurden kultiviert in hochglucosehaltigem DMEM, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS). Primäre Osteoblasten-Vorläuferzellen wurden aus dem Knochenmark langer Knochen von acht Wochen alten C57BL/6J-Mäusen erhalten. Nach der Aufreinigung über einen Dichtegradienten (Eurobio) wurden sie in α-MEM kultiviert, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS). Lösliches rekombinantes RANKL stammte von Abcys (Paris, Frankreich) oder wurde in Pichia Hefe wie beschrieben (Czupalla C. et al. (2006) Proteomic analysis of lysosomal acid hydrolases secreted by osteoclasts: implications for lytic enzyme transport and bone metabolism. Mol Cell Proteomics 5: 134–143) hergestellt. Rekombinantes humanes PDGF-bb stammte von PeproTech EC (London, UK), humanes rekombinantes M-CSF von Prospec Tany TechnoGene (Rehovot, Israel).
  • Um zu zeigen, dass Osteoklasten in vitro Signale an Osteoblasten geben können, wurden Zellsysteme der Osteoklastogenese oder der Osteoblastogenese verwendet. Zunächst wurden murine Monozyten-/Makrophagen-artige Raw264.7 Zellen mit dem osteoklastogenen Cytokin RANKL dazu angeregt, in vitro zu reifen Osteoklasten zu differenzieren, wie von Czupalla C. et al. (2006) beschrieben. Primäre Osteoklasten-Vorläufer von murinem Knochenmark und davon abstammende Osteoklasten, die durch die Differenzierung in Gegenwart von M-CSF und RANKL erhalten wurden (Bonnelye E. et al. (2008) Dual effect of strontium ranelate: stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation and resorption in vitro. Bone 42: 129–138), wurden ebenfalls eingesetzt.
  • Die konditionierten Medien von Osteoklasten wurden alle 24 h gesammelt, zentrifugiert, mit 20 mM HEPES pH 7,2 gepuffert und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
  • Als Zweites wurden murine prä-osteoblastische MC3T3-E1-Zellen genutzt, die in vitro auf die Stimulation mit chemischen Cocktails, enthaltend 10–7M Dexamethason, 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerophosphat in α-MEM, innerhalb von 15 Tagen zu reifen Osteoblasten ausdifferenzieren.
  • Um zu überprüfen, ob die konditionierten Medien von Raw264.7 Zellen oder von Raw264.7 Zellen stammenden Osteoklasten prä-osteoblastische MC3T3-E1Zellen oder von MC3T3-E1 abstammende Osteoblasten anlocken können, wurde der „Boyden chamber assay” verwendet, um die Chemotaxis zu bestimmen. 1A zeigt, dass die chemotaktische Aktivität von Raw264.7 gegenüber MC3T3-E1 Zellen eher niedrig war. Ihre chemotaktische Aktivität stieg jedoch mit der Zeit an, wenn sie auf Stimulation mit RANKL hin zu Osteoklasten differenzierten.
  • Nach vier Tagen RANKT-induzierter Differenzierung zeigte das konditionierte Medium von von Raw264,7 abstammenden Osteoklasten eine klare chemotaktische Aktivität gegenüber MC3T3-E1 Zellen, wie durch den Migrationsindex von murinen prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen (1A) als Antwort auf die konditionierten Medien von Raw264,7 (weisse Quadrate) und von davon abstammenden Osteoklasten (schwarze Kreise) demonstriert wird. Diese Aktivität wurde auch beobachtet mit dem konditionierten Medium von Osteoklasten, die von Knochenmarksvorläufern abstammten, welche mit M-CSF und RANKL stimuliert worden waren, wie durch die Chemotaxis von prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen (1B) durch konditionierte Medien von primären Osteoklasten und ihren Vorläufern gezeigt wird.
  • Das konditionierte Medium der von Raw264.7 abstammenden Osteoklasten zeigte ebenfalls eine chemotaktische Aktivität gegenüber von MC3T3-E1 Zellen abstammenden Osteoblasten, wenn auch nur in einem geringeren Ausmaß, wie durch den Migrationsindex der MC3T3-E1 Zellen abstammenden Osteoblasten (diff MC3T3-E1)(C) als Antwort auf konditionierte Medien von Raw264.7 Zellen (weiße Quadrate) und davon abstammenden Osteoblasten (schwarze Kreise) gezeigt (1C). Der chemotaktische Index der konditionierten Medien von reifen Osteoklasten war zweifach höher gegenüber prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen, verglichen mit von MC3T3-E1 Zellen abstammenden Osteoblasten. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den konditionierten Medien von primären Osteoklasten erhalten, die von Knochenmarksvorläuferzellen abstammten (1D).
  • Die Ergebnisse bestätigen, dass Osteoklasten, die von Raw264.7 Zellen oder primären Knochenmarksvorläuferzellen abstammen, während ihrer Differenzierung die Fähigkeit erlangen, chemotaktische Faktoren zu sezernieren, die Osteoblasten-Vorläuferzellen und, in einem geringeren Ausmaß, reife Osteoblasten anlocken können.
  • Ausführungsbeispiel 2: Von Osteoklasten sezerniertes PDGF-bb vermittelt Osteoblasten-Chemotaxis.
  • Eine si-RNA-basierte Strategie wurde verwendet, um den oder die chemotaktischen Faktor(en) zu identifizieren, die durch reife Osteoklasten sezerniert werden. Von Raw264.7-Zellen abstammende Osteoklasten wurden zunächst in der Gegenwart von siRNA-Sonden elektroporiert. Dazu wurden zunächst Raw264.7-Zellen in der Gegenwart von RANKL zu Osteoklasten differenziert. Nach 2–3 Tagen wurden sie durch Inkubation in PBS mit 0,5 mM EDTA abgelöst. Vorgefertigte stealth RNAi oder scrambled RNAi Duplexe wurden in Osteoklasten elektroporiert. Elektroporierte Zellen wurden in mit RANKL supplementiertem Medium resuspendiert und 48 h in Kultur gehalten.
  • Konditionierte Medien wurden gesammelt und Osteoklasten wurden verarbeitet, um die Gesamt-RNA zu isolieren und den Proteingehalt zu bestimmen. Murine prä-osteoblastische MC3T3-E1-Zellen oder chemisch differenzierte Osteoblasten wurden mit Stealth siRNA duplex Oligonucleotiden transfiziert, unter der Verwendung von Interferon als Transfektionsreagenz. Nach 48h wurden die Zellen geerntet und die Effizienz des Knockdowns durch quantitative RT-PCR bestimmt. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und mit DNase-I behandelte RNA wurde revers transkribiert. Quantitative RT-PCR wurde mit einem Stratagene Mx4000 QPCR system und dem Brilliant SYBR Green QPCR Kit gemäß Herstellerangaben (Stratagene, La Jolla, CA) durchgeführt. Quantitative RT-PCR-Analysen wurden dreifach wiederholt, und die Ct-Werte wurden mittels GAPDH normalisiert.
  • Die konditionierten Medien von siRNA-behandelten Osteoklasten wurden auf ihre chemotaktische Aktivität hin überprüft. Die chemotaktische Antwort wurde jeweils dreifach gemessen unter Verwendung einer 48-Loch-Boyden-mikrochemotaktischer Kammer (Falk W. et al. (1980) A 48-well micro chemotaxis assembly for rapid and accurate measurement of leukocyte migration. J Immunol Methods 33: 239–247). Die unteren Kammern der Apparatur wurden entweder mit Wachstumsfaktoren in α-MEM mit 20 mM HEPES pH 7,2 oder mit konditioniertem Medium von Raw 264,7 Zellen oder davon abstammenden Osteoklasten befüllt, und mit einer Polycarbonatmembran mit 5 μm Poren (NeuroProbe Inc. Gaithersburg MD, USA) überdeckt. Zellen (0.35 × 105 MC3T3-E1, 0.45 × 105 differenzierte Osteoblasten oder 0.25 × 105 7F2 Zellen) in 50 μl α-MEM wurden in den oberen Kammern zugefügt. Nach einer Inkubation von 3,5 h bei 37°C wurde die Membran abgenommen. Die Zellen an der oberen Oberfläche wurden durch vorsichtiges Abkratzen entfernt, und Zellen, die auf die andere Seite der Membran gewandert waren, wurden mit 3% Paraformaldehyd fixiert, mit Toluidinblau (Sigma, Germany) gefärbt und gezählt. Der chemotaktische Index (CI) repräsentiert das Verhältnis zwischen der durchschnittlichen Zahl an Zellen, die unter den gegebenen Bedingungen wandern, und der durchschnittlichen Zahl an Zellen, die unter Kontrollbedingungen wandern.
  • Wie in 2 gezeigt, konnte die Expression von PDGF-bb, VEGFc oder LIF in von Raw264.7-Zellen abstammenden Osteoklasten durch siRNA effizient (≈80%) reduziert werden.
  • Eine Reduktion der PDGF-bb Expression in von Raw264.7-Zellen abstammenden Osteoklasten führte bei jeder getesteten Konzentration zu einer ≈50% Reduktion der Fähigkeit ihres konditionierten Mediums, prä-osteoblastische MC3T3-E1-Zellen anzulocken. Die verbleibende chemotaktische Aktivität der prä-osteoblastischen MC3T3-E1 Zellen durch konditionierte Medien von siRNA-behandelten Osteoklasten spiegelt höchstwahrscheinlich die Anwesenheit von geringen Mengen PDGF-bb wieder, die immer noch durch diese Zellen sezerniert wird.
  • Zusätzlich konnte dieser Verlust an chemotaktischer Aktivität nach dem PDGF-bb knockdown durch die Zugabe von rekombinanten PDGF-bb geheilt werden, die zu derselben chemotaktischen Aktivität wie konditionierte Medien von nicht mit siRNA behandelten Osteoldasten (2B) führte. Im Gegensatz dazu blieb eine 80% Reduktion der Expression von VEGFc oder LIF ohne Effekt auf die Chemotaxis von MC3T3-E1 Zellen (2C–F). Da rekombinantes CCL9, IL1ra und Twgs1 die chemotaktische Aktivität von MC3T3-E1 Zellen (Daten nicht gezeigt) nicht modifizierte, wurden sie nicht weiter berücksichtigt. Wir schließen aus diesen Ergebnissen, dass PDGF-bb, das von von Raw264.7-Zellen abstammenden Osteoklasten sezerniert wird, als wirksames chemotaktisches Agens gegenüber präosteoblastischen MC3T3-E1-Zellen wirkt.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (8)

  1. Verwendung von in vitro isolierten oder in vitro differenzierten Osteoklasten für den Knochenaufbau.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Osteoklasten in vivo in einem Säugetier in der Nähe einer Stelle eines Knochendefekts verabreicht werden.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Osteoklasten durch die in vitro Differenzierung von Vorläuferzellen, die von einem Patienten isoliert wurden, erhalten werden und demselben Patienten in der Nähe einer Stelle mit einem Knochendefekt verabreicht werden.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Vorläuferzellen Monozyten sind, die aus dem peripheren Blut des Patienten erhalten wurden.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Osteoklasten Osteoblasten und/oder vaskuläre Zellen zu der Stelle des Knochendefekts locken.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Knochendefekt eine Fraktur, ein skeletaler Defekt oder Knochenverlust, bedingt durch Atrophie, Knochenerkrankung, Krebs, Operation oder andere Ursachen, ist.
  7. Pharmazeutische Zubereitung oder Medizinprodukt enthaltend Osteoklasten zur Verwendung für den Knochenaufbau.
  8. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder pharmazeutische Zubereitung oder Medizinprodukt gemäß Anspruch 7, wobei die Osteoklasten in Form einer Suspension oder eingebettet in Gele (wie z. B. ein Hydrogel oder Xerogel) oder Knochenzemente oder ein Implantat verabreicht (zur Verfügung gestellt) werden.
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