DE60011284T2

DE60011284T2 - Transplantations/implantatsvorrichtung und ihre herstellungsmethode

Info

Publication number: DE60011284T2
Application number: DE60011284T
Authority: DE
Inventors: P. Shawn GROGAN; Pierre Mainil-Varlet; Werner Müller; Thomas Schaffner
Original assignee: Zimmer GmbH
Current assignee: Zimmer GmbH
Priority date: 1999-11-11
Filing date: 2000-11-13
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2020-11-14
Also published as: US8137689B1; PT1227824E; EP1099443A1; DE60011284D1; WO2001034166A1; EP1227824B1; AU784185B2; CA2390834A1; EP1227824A1; AU1124901A; ES2222242T3; JP2003513929A; ATE268182T1; DK1227824T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Transplantations-/Implantationseinrichtung gemäss dem Oberbegriff des ersten unabhängigen Anspruchs. Die Einrichtung wird in einen menschlichen oder tierischen Wirt transplantiert und dient insbesondere für in vivo-Lieferung einer vorbestimmten biologisch aktiven Zusammensetzung oder einer Mehrzahl von solchen Zusammensetzungen, welche wünschenswerter Weise entweder lokal oder systemisch in dem Wirt vorhanden ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren gemäss dem korrespondierenden unabhängigen Anspruch, wobei das Verfahren dazu dient, die Transplantations-/Implantationseinrichtung herzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Um Bedingungen zu reduzieren oder zu eliminieren, die durch erbliche oder degenerative Fehlfunktionen verursacht sind, zur Behandlung von Krankheiten, zur Verbesserung der Heilung nach einer Verletzung oder einem chirurgischen Eingriff, zur Modifizierung einer individuellen Entwicklung oder eines Wachstums oder für eine andere gewünschte, biologische Funktion werden Hormone, Wachstumsfaktoren, Aktivatoren, Hemmstoffe oder andere biologisch aktive Zusammensetzungen oder Faktoren Menschen oder Tieren verabreicht. Es ist bekannt, wie menschliche oder tierische Zellen genetisch aufzubauen sind, um zu ermöglichen, dass diese solche biologisch aktiven Zusammensetzungen produzieren und ausscheiden, und es ist auch bekannt, wie solche Zusammensetzungen Menschen oder Tieren bei einer Transplantation von lebenden Zellen verabreicht werden, die fähig sind oder fähig gemacht werden, diese Zusammensetzungen zu produzieren. Die Zellen, die transplantiert werden, um die gewünschten Zusammensetzungen in einem menschlichen oder tierischen Wirt zu liefern, können natürliche (genetisch nicht modifizierte) Zellen sein, die gewöhnlich von einem geeigneten Spender stammen oder sie können genetisch hergestellte Zellen sein, welche von einem Spender oder von dem Wirt selbst stammen. Verfahren zum Präparieren von Zellen, welche fähig sind, Sekrete zu produzieren und gewünschte biologisch aktive Zusammensetzungen zu überwachen, sind z.B. in den folgenden Publikationen beschrieben.

Using an in vitro retroviral vector delivery system. U Muller-Ladner et.al. (Arthritis Rheum 42: 490–497, 1999) berichtete über einen erfolgreichen Einsatz von Interleukin-10 (IL-10) in das Genom eines menschlichen Rheumatoidarthritis-Synovial-Fibroplasten. ER Lechman et. al. (J Immunol 15; 163 (4): 2202 – 2208, 1999) berichtete über einen direkten adenoviralen Gentransfer von viralem IL-10 in Kaninchenknie mit Versuchts-Arthritis. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die direkte, lokale intra-artikuläre Zugabe von vIL-10 Genen, artikuläre therapeutische Effekte haben können.

CH Evans und PD Robbins (Intern Med 38(3): 233–239, 1999) skizzieren auch mehrere Gene, welche antiarthritische Produkte verschlüsseln, die zu inneren oder äusseren Gelenkstellen transferiert werden können, wo deren Ausbreitung verschiedene Aspekte der Pathophysiologie der Arthritis dämpfen können. Diskutiert werden zwei Therapieprotokolle über das Arthritisgen, die in den USA und Deutschland unterwegs sind. Beide Studien umfassen den ex vivo-Transfer einer IL-1Ra cDNA zu einem metacarpophalangealen Gelenk von Patienten mit rheumatischer Arthritis.

RM Dharmavaram et. al. (Arthritis Rheum 42(7): 1433–42, 1999) waren dazu in der Lage, eine stabile Transfektion von menschlichen fötalen Knorpelzellen mit einem Typ II procollagenenb Minigen zu bewirken.

RE Kingston skizziert viele Standardprotokolle über das Transfizieren und Übertragen von Säugetierzellen (Current Protocols in Molecular Biology, 1: Chapter 9: 9.0.1–9.0.5, 1998).
Eine Transplantation von adenoviral übertragenen allogenetischen Knorpelzellen in künstliche Knorpeldefekte in vivo wurde berichtet durch VM Baragi et. al. (Osteoarthritis Cartilage 5(4): 275–282, 1997). Diese Knorpelzellen wurden mit einem rekombinanten Adenovirus übertragen, welcher das Gen für Escherichia Coli Beta-Galaktosidase (Ad.RSVntlacZ) enthielt, um die übertragenen Zellen zu detektieren.
Die Hauptprobleme, welche entstehen, wenn transplantierte lebende Zellen für die Lieferung von gewünschten biologisch aktiven Zusammensetzungen zu einem Wirtsystem oder Gewebe verwendet werden, werden verursacht durch die Schwierigkeit der Erzeugung und Aufrechterhaltung (insbesondere auf einer Langzeitbasis) von lokalen Bedingungen, in welchen die transplantierten Zellen fähig sind, zu überleben und die gewünschte biologisch aktiven Zusammensetzungen zu produzieren und auszuscheiden, und von denen die Zusammensetzungen auf den Wirt in einer zufriedenstellenden Art und Weise übertragen werden können. Dies umfasst Prävention vor oder zumindest Reduktion von ungünstigen Reaktionen bei dem Wirt, im Falle von transplantierten heterologen oder homologen Zellen insbesondere Prävention oder Dämpfung von Immunreaktionen bei dem Immunsystem des Wirts. Um diese Probleme zu lösen und um insbesondere die Probleme der Immunreaktion zu lösen, wurden verschiedene Lösungen vorgeschlagen.
Gemäss JF Markmann et. al. (Transplantation 49: 272–277, 1990) wird die Oberfläche der Zellen, die implantiert werden, für eine Immunmodulation geändert.
Gemäss beispielsweise P. Aebischer et. al. (Brain Res: 560 (1–2): 43–49, 1991), MY Fan et. al. (Diabetes 39: 519–522, 1990), KA Heald et. al. (Transplantation P26: 1103–1104, 1994), L Lévesque et. al. (Endocrinology 130: 644–650, 1992) oder Z-P Lum et. al. (Diabetes 40: 1511–1516, 1991) werden die Zellen, die implantiert werden, zur Immunisolation eingekapselt. Das bedeutet, dass eine Immundämpfung durch Veränderung einer Immunerkennung und Zurückweisung durch Separierung der transplantierten Zellen von dem Immunsystem des Wirts mit Hilfe von künstlichem Sperrmaterial, wie z.B. semipermeablen Membranen, Hohlfasereinrichtung, Hydrogels, Alginatkapseln, einer polyanionischen Colloidmatrix usw. vermieden wird. Jedoch sind all diese Stoffe nicht vollständig innert und sie können einen Fremdkörper und/oder Entzündungsreaktion hervorrufen, aus der ein Überwachstum von fibrösem Gewebe resultiert, welches die Diffusionseigenschaften der Einrichtungen vermindern kann.
JP Vacanti (US Patent Nr. 5,741,685 ) und J-M Pollok et. al. (Pediatr Surg Int 15: 164–167, 1999) beschreiben die Verwendung einer gewebeerzeugten Kapsel von Knorpelzellen zur Immunoisolation von epitelischen Zellen von Langerhan'schen Inseln. Epitelische Zellen werden gesammelt und in einer Polymermatrix immobilisiert. Gleichzeitig werden Knorpelzellen in Monoschichten zur starken Vermehrung gezüchtet. Die zusammenfliessende Schicht von ausgedehnten Knorpelzellen wird dann zum Umhüllen der Polymermatrix verwendet, welche die epitelischen Zellen beinhaltet. Gemäss Pollok wurden epitelische Zellen, von Ratten genommen, in einer Membran eingekapselt, welche Rinderknorpelzellen beinhalten, und deren Verhalten wurden über 30 Tage in vitro beobachtet. Keine Immunreaktion des Rindergewebes gegen die Rattenzellen wurde beobachtet und die Knorpelzellen waren noch nach den 30 Tagen am Leben. Die Einrichtung, welche die in der Matrix eingekapselten epitelischen Zellen umfasste, schied noch nach den 30 Tagen Insulin aus, jedoch in einem reduzierten Umfang, verglichen mit der Zeit unmittelbar nach der Einkapselung.
Die Immunoisolationsmethode gemäss Vacanti und Pollok et. al. basiert auf der Kenntnis der immunoprivilegierten Eigenschaften der Knorpelzellenmatrix und verwendet diese Eigenschaften zum Erzeugen einer immunoisolierenden Barriere zwischen alogenischen und xenogenischen epitelischen Zellen und dem Immunsystem des Wirts.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Transplantations-/Implantationseinrichtung zu schaffen, die für die Transplantation oder die Implantation in einen menschlichen oder tierischen Wirt geeignet ist und für die Lieferung von zumindest einer vorbestimmten biologisch aktiven Zusammensetzung und/oder für zumindest eine andere biologische Funktion dient. Die Einrichtung muss geeignet sein, die gewünschte Funktion über einen vorbestimmten Zeitraum, insbesondere über einen langen Zeitraum nach der Transplantation durch Schaffung und Aufrechterhaltung geeigneter Bedingungen für die Zellen oder künstlichen Partikeln, welche in der Einrichtung enthalten sind und welche für die gewünschte Funktion verantwortlich sind, und durch Vermeidung oder Reduzierung ungünstiger Reaktionen des Wirtsystems, insbesondere Reaktionen des Wirte-Immunsystems oder ungünstige Fremdkörperreaktionen des Wirte-Gewebes, in welches die Einrichtung implantiert wird, aufrecht zu erhalten.
Es ist ferner eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Transplantationseinrichtung zu schaffen.
Diese Aufgaben werden durch die Transplantationseinrichtungen und durch das Verfahren zum Herstellen von diesen erreicht, wie sie in den entsprechenden Ansprüchen definiert sind.
Die erfindungsgemässe Einrichtung umfasst ein lebendes, knorpeliges Gewebe, welches durch Knorpelzellen hergestellt und aufrecht erhalten wird. Ferner umfasst sie lebende Zellen oder künstliche Partikel einer Grösse, die vergleichbar ist mit der Grösse der Zellen, wobei die Zellen oder Partikel für die gewünschte Funktion (insbesondere Lieferung einer biologischen aktiven Zusammensetzung) verantwortlich sind. Die Zellen oder Partikel sind in einer Matrix von knorpeligen Gewebe immobilisiert. Die Zellen, welche geeignet sind, eine vorbestimmte biologisch aktive Zusammensetzung herzustellen und auszuscheiden, sind bevorzugt die geeignet aufgebauten Knorpelzellen, welche Knorpelzellen gleichzeitig verantwortlich sind für die Herstellung und die Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix der Einrichtung.
Das lebende knorpelige Gewebe privilegiert nicht nur bevorzugt betrachtete Immunoreaktionen, sondern beweist auch die gute Eignung zum Erhalt von Zellen, welche eine vorbestimmte Funktion ausführen, zum Liefern von Zusammensetzungen, welche produziert und durch diese Zellen in das Wirte-System ausgeschieden werden, und zur Verhinderung von Fremdkörper, Entzündung oder abnormalen Wachstumsreaktionen des Wirte-Gewebes, wie dies bei Implantationen von künstlichem Material bekannt ist.
Anders als bei den Einrichtungen gemäss Vacanti und Pollok et. al. (siehe oben) dienen die Knorpelzellen der erfindungsgemässen Einrichtung nicht nur der Abschirmung von implantierten Zellen vor Wirtereaktionen, sondern sie produzieren auch und halten aufrecht eine geeignete Matrix zur Immobilisierung der transplantierten Zellen oder künstlichen Materialien und liefern sofort ein Umfeld, welches für ihre Lebensfähigkeit und Funktionalität geeignet ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die nachfolgenden Zeichnungen stellen das Beispiel am Ende der vorliegenden Beschreibung dar und stellen die Fähigkeit der geeignet transfizierten Knorpelzellen dar, ein menschliches Wachstumshormon (hGH) während einer in vitro Kultur auszuscheiden.
1 zeigt das kumulative menschliche Wachstumshormon conc. (ng/mL) aus Medien von einschichtig kultivierten Rattenknorpelzellen, die mit einem pXGH5 Plasmid transfiziert wurden;
2 zeigt das menschliche Wachstumshormon conc. (ng/mL) aus Medien von zu Pellets kultivierten Rattenknorpelzellen, welche mit pXGH5 Plasmid folgend auf die Pelletformation transfiziert wurden;
3 zeigt die kumulativen menschlichen Wachstumshormonkonzentrationen (ng/mL) aus Medien von einschichtig kultivierten Rattenknorpelzellen, die mit pXGH5 zu unterschiedlichen Zeiten transfiziert wurden, im Anschluss an die Transfizierung und Dex-Behandlung;
4 zeigt die menschlichen Wachstumshormonkonzentrationen (pg/mL) aus Medien von zu Pellets geformten kultivierten Rattenknorpelzellen (5.2×10⁵ Zellen pro Pellet) transfiziert mit pXGH5 zu unterschiedlichen Zeiten im Anschluss an die Pelletfonnation und Dex-Behandlung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck Knorpelzelle wird in der vorliegenden Beschreibung dazu benutzt, um Zellen zu benennen, die fähig sind, eine extrazelluläre Matrix herzustellen und aufrecht zu erhalten, welche die hauptsächlichen Eigenschaften von natürlichen Knorpeln (umfassend Typ II Collagen und Proteoglykane) besitzt. Die Zellen stammen von knorpeligem Gewebe oder sie sind hergestellt durch in vitro Differenzierung von Stammzellen.
Der Ausdruck knorpeliges Gewebe wird in der vorliegenden Beschreibung dazu verwendet, ein Gewebe zu umschreiben, welches lebende Knorpelzellen und eine extrazelluläre Matrix umfasst, die durch die lebenden Knorpelzellen hergestellt und aufrecht erhalten wird. Das knorpelige Gewebe der erfinderischen Einrichtung wird in vitro ausgehend von lebenden Knorpelzellen hergestellt, indem z.B. das Verfahren gemäss dem Europäischen Patent Nr. 0 922 093 angewendet wird, welches in der vorliegenden Beschreibung durch Bezugnahme beinhaltet ist, oder durch ein anderes 3D Kultursystem.
Die lebenden Knorpelzellen des knorpeligen Gewebes der erfindungsgemässen Einrichtung sind autolog, homolog oder heterolog. Sie sind eingebettet in die extrazelluläre knorpelige Matrix der Einrichtung, wobei die Matrix durch diese Knorpelzellen produziert und aufrecht erhalten wird. Immobilisiert in der extrazellulären Matrix umfasst die erfindungsgemässe Einrichtung genetisch hergestellt oder natürliche Zellen und/oder künstliche Partikel, welche für die gewünschte Funktion verantwortlich sind. Diese immobilisierten Zellen können auch autolog, homolog oder heterolog sein und können z.B. zur Produktion und Ausscheidung von zumindest einer vorbestimmten biologisch aktiven Zusammensetzung dienen. Die künstlichen Partikel können z.B. Biosensoren in der Form von Nanomaschinen sein und können z.B. dazu dienen, um eine vorbestimmte metabolische Aktivität zu beobachten.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Einrichtung sind die Knorpelzellen, welche das knorpelige Gewebe produzieren und aufrecht erhalten, selbst oder zumindest ein Teil von diesen genetisch so konstruiert, dass sie dazu fähig sind, nicht nur das knorpelige Gewebe zu produzieren und aufrecht zu erhalten, sondern auch zumindest eine vorbestimmte biologisch aktive Zusammensetzung durch eine geeignete genetische Technik zu produzieren und auszuscheiden.
Zusätzlich zu ihren bekannten privilegierten Immuneigenschaften beweist die knorpelige Matrix , welche vor und nach einer Implantation durch die lebenden Knorpelzellen aufrecht erhalten wird, dass sie optimale Eigenschaften zum Aufrechterhalten der Vitalität und des Produktionsvermögens von Zellen auf einer Langzeitbasis, die fähig sind, die gewünschten Zusammensetzungen zu produzieren und auszuscheiden, und zur Lieferung der Zusammensetzungen an das Wirt-System oder Gewebe hat. Ein Grund für dieses könnte die Tatsache sein, dass Knorpelzellen, insbesondere künstlichen Knorpel, signifikant länger leben verglichen mit anderen Zelltypen, dass sie eine limitierte Nährstoffzufuhr benötigen und dass sie fähig sind, auf natürliche Weise die knorpelige Matrix aufrecht zu erhalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Produzieren einer erfindungsgemässen Transplantations-/Implantationseinrichtung umfasst die Stufen:

– Bereitstellung einer geeigneten Anzahl an lebenden Knorpelzellen:
– genetisches Herstellen von zumindest Teilen der Knorpelzellen oder Mischen der Knorpelzellen mit anderen Typen von natürlichen oder genetisch hergestellten Zellen oder Mischen der Knorpelzellen mit künstlichen Partikeln, welche eine Grösse aufweisen, die vergleichbar mit der Grösse der Zellen ist, oder Kombination von zumindest zwei der genannten Stufen der Herstellung oder Mischung;
– Unterwerfen der Knorpelzellen oder der Mischung, welche die Knorpelzellen beinhaltet, dreidimensionalen Kulturbedingungen für in vitro Produktion von knorpeligem Gewebe.

Die Einrichtung, die nach den o.g. drei Verfahrensstufen hergestellt wird, wird dann in den Wirt transplantiert oder implantiert.
Als Quelle der Knorpelzellen können Gelenk-, Rippen-, Nasen- oder Ohrknorpel eines Spenders oder eines Wirtes abgeerntet werden oder die Zellen können von Augenlinsen von fötalem oder erwachsenen menschlichem oder tierischem Ursprung oder von einer Bandscheibe mit ihrem annulus pulpusus abgeleitet werden. Die Knorpelzellen und weitere natürliche oder genetisch hergestellte Zellen von anderen Zelltypen, welche für die Produktion der Mischung von Zellen benutzt werden, können beide von dem Wirt oder von einem Spender oder von unterschiedlichen Individuen abstammen.
Ein Beispiel von künstlichen Partikeln, welche mit den Knorpelzellen vermischt werden, sind Biosensoren in der Form von Nanomaschinen, wie beschrieben z.B. bei BA Cornell et. al. (Nature 1997 Juni 5; 387 (6633): 555–557).
Abhängig von der Grösse des benötigten Transplantats kann eine Stufe einer starken Vermehrung der Knorpelzellen in vitro (Einschichtkultur) erforderlich werden (bevor und/oder nach der Stufe der genetischen Erzeugung der Knorpelzellen).
Insbesondere für eine erfindungsgemässe Einrichtung, welche homologe oder heterologe Zellen umfasst, ist es vorteilhaft, Zellen nahe der Oberfläche des in vitro kultivierten Knorpelgewebes zu entfernen.
Eine Eigentransplantateinrichtung gemäss der Erfindung und bestimmt als eine Liefereinrichtung für Interleukine wird insbesondere durch die folgenden Verfahrensstufen hergestellt:

– Aberntung des knorpeligen Gewebes des menschlichen oder tierischen Wirts (insbesondere durch Knorpelbiopsie), Herstellung der Knorpelzellen des Gewebes entsprechend standardgemässen ersten Kulturpräparationsverfahren und Ausbreiten der Knorpelzellen in einer Einschichtkultur;
– Genetische Herstellung der Knorpelzellen in der Einschicht, um ihnen zu ermöglichen, Interleukine (insbesondere gemäss dem Verfahren, beschrieben in der Publikation, oben erwähnt, von Muller-Ladner, 1999, Lechmann et. al. 1999 oder Evans und Robbins, 1999) zu produzieren und auszuscheiden;
– Kultivierung der hergestellten Knorpelzellen in vitro, um eine dreidimensionale knorpelige Matrix (insbesondere gemäss der EP 0 922 093 ) zu produzieren, und Screening des Aufbaus der Menge des produzierten Interleukin.

Beispiele von Standardverfahren zum Sammeln und Herstellen von Knorpeln von Schlachthaustieren werden bei Pollok et. al. 1999 beschreiben. Um Knorpel durch Biopsie (menschliche) zu ernten, siehe insbesondere M. Brittbert et. al. (New England Journal of Medicine 331(14); 889–895, 1994) und T Minas und L Peterson (Clin Sports Med 18 (1): 13–44 v–vi, 1999). Beispiele und Standardherstellung von primären Kulturen von intakten Knorpel sind insbesondere bei Kandel et. al. (Biochim. Biophys. Acta. 1035: 130, 190) und bei Pollok et. al. 1999 beschrieben. Standardkultursysteme und Ausstattung werden für die Stufe der Einschichtausdehnung verwendet.
Gemäss der US-5919702 sind Pre-Chondrocyten, welche von einer Nabelschnur, insbesondere von der Whartonschen Sulze, isoliert sind, eine weitere Quelle für die Knorpelzellen, welche bei der erfindungsgemässen Methode verwendet werden.
Eine Auswahl von Verfahren zum Einbringen von genetischen Produkten in Zellen und zur Beobachtung der Übertragungseffizienzen sind bei Kingston (1998) beschrieben.
Verfahren von dreidimensionalen Kulturen zum Herstellen einer erfindungsgemässen Einrichtung sind in dem Europäischen Patent 0922093 beschrieben. Standardausrüstungen (insbesondere ELISA) und Protokolle, geliefert von vielen Herstellern, werden dazu benutzt, um die Lieferung eines vorbestimmten Produkts (insbesondere von Interleukinen) bei in vitro Bedingungen vor dem Implantieren der Einrichtung zu messen.
Die erfindungsgemässe Einrichtung ist insbesondere für eine lokale Verabreichung von biologisch aktiven Zusammensetzungen anwendbar, insbesondere implantiert in ein Gelenk, und zur Lieferung von morphogenetische Faktoren oder Wachstumsfaktoren zur Wiederherstellung eines Knorpeldefekts oder von Interleukinen, um eine Entzündung einzudämmen. Oder sie ist anwendbar für eine systemische Verabreichung, insbesondere implantiert in ein Blutgefäss oder abdominale Kavität und zur Lieferung von insbesondere Somatropin und Insulin. Die erfindungsgemässe Einrichtung ist für permanente Lieferung anwendbar, insbesondere für Lieferung während einer sehr langen Zeit oder sie kann nach einer begrenzten Lieferperiode entfernt werden.
Weitere Beispiele von Anwendungen der erfindungsgemässen Einrichtung sind:

– Zulieferung von Hormonen (oder Korrektur von Hormonlevels), wie beispielsweise Insulin für Diabetes oder Parathyroidhormon bei Hypocalzemie;
– Erhöhung des Wachstums eines Tierbestandes durch Zugabe von Somatotropin;
– Erhöhung der Wundheilung durch Freisetzung der Reifung und Wachstumsfaktoren wie BMP für eine Behandlung von Pseudoarthrose;
– Zugabe von fehlendem Hormon oder Faktor, wie beispielsweise Koagulationsfaktoren bei Hämophilie oder Dopamin bei parkinsonsche Krankheit;
– Zugabe von therapeutischen Mitteln, wie beispielsweise ziliarneutrophischer Faktor (CNTF) für die Behandlung von menschlichen neurodegenerativen Krankheiten, wie beispielsweise amyotropher Lateralsklerose (ALS);
– Zugabe von Aktivatoren oder Inhibitoren von Angiogenese zur Tumorbehandlung und Wundheilung;
– Vorsehen eines lebenden Substrats für Biosensoren, welche methabolische Aktivitäten messen und Hormonfreigabe steuern.

Die Hauptvorteile der erfindungsgemässen Transplantationseinrichtung und des Verfahrens zum Herstellen von ihr sind folgende:

– Die Zellen, welche die Matrix produzieren und aufrecht erhalten, können von demselben Typ (Knorpelzellen) sein, wie diejenigen, welche das vorbestimmte Produkt produzieren.
– Die Matrix der Einrichtung hat Erbstabilitätseigenschaften, geeignet für Implantationsverfahren.
– Die verwendete Kulturtechnik, um das Transplantat herzustellen, ist technisch weniger aufwendig, verglichen mit Techniken, welche Kapselverfahren für künstliche Sperren umfassen.
– Die Kulturtechnik, welche Cokulturen von Knorpelzellen und anderen Zellen verwendet, ist technisch weniger aufwendig, verglichen mit dem Protokoll, beschrieben insbesondere bei Pollok et. al. (1999).
– Die erfindungsgemässe Einrichtung ist länger haltbar als bekannte Gentransfermodelle, welche durch das Problem der Abnahme der Produktion des transfizierten Gens über die Zeit begrenzt ist, und die erfindungsgemässe Einrichtung kann entfernt werden, wenn dies erforderlich ist.

Beispiel:
Chondrozyten, welche von Gelenkknorpeln von Ratten stammen, werden in geeigneter Weise transfiziert, um fähig zu sein, ein menschliches Wachstumshormon (hGH) auszuscheiden. Die Knorpelzellen werden dann in Pellets kultiviert. Menschliche Wachstumshormonkonzentrationen werden in den Kulturmedien beobachtet. Es ist bekannt, das Dexamethason eine erhöhte Produktion von hGH induzieren kann, aufgrund der Existenz der glukocorticoid verstärkten Sequenzen in dem pXGH5-Plasmid (Selden et. al. 1986). Dexamethason wurde als molekularer Schalter getestet.
Gewebesammlung und Kulturtechniken: Knorpel wurde aseptisch von dem Kniegelenk einer zwölf Monate alten Wistar Ratte genommen und anschliessend in 2,5 mg/10 mL Collagenase P (Roche) in HAM-F12 (Gibco BRL) mit 5% FBS (HyClone), Insulin (250 μg/mL; Gibco BRL) und Vitamin C (12.5 μg/mL; Fluka) bei 37°C in einem geschüttelten Wasserbad für 12 Stunden digeriert. Die digerierte Suspension wurde durch ein Zellsieb (100 μm; Falcon) pipetiert, gewaschen in PBS (pH 7.4) und gezählt. Zellen wurden in einer Dichte von 930,000 Zellen pro cm² in T25 Glaskolben (Falcon) ausgebracht und durften bei 37°C in 4 mL HAM-F12 versetzt mit 10% FBS, Insulin, Vitamin C, Penicillin (100,0000 IE/mL; Sigma), Streptomycin (10,000 μg/mL: Sigma) und Amphotericin B (250 μg/mL; Sigma) expandieren. Den Zellen wurde erlaubt, bis 80% bis 90% Zusammenfluss zu expandieren, und dann wurden sie 1×EDTAT/Trypsin (Gibco BRL) ausgesetzt und nachfolgend dreimal passaget.
Transfektionen: Das Plasmid pXGH5 mit dem menschlichen Wachstumshormon (hGH) Einsatz wurde bei der Transfektion (siehe Selden et.al. 1986) benutzt. Das Plasmid wurde in E.coli HB101 (Promega) verstärkt und nachfolgend unter Verwendung einer Plasmidextraktionseinrichtung (Qiagen) gereinigt. Einen Tag vor den Transfektionen wurden die Knorpelzellen wieder ausgebracht bei einer Dichte zwischen 50% und 80% Zusammenfluss in HAM-F12 mit 10% FBS, aber ohne andere Additive. Am folgenden Tag wurde FuGENE 6 (Roche) und das gereinigte Plasmid DNA (1 μg) zu 100 μL von HAM-F12 ohne andere Additive zugegeben, wie im Herstellerhandbuch detailliert aufgeführt. Diese Mischung wurde in die zugeordneten T25 Glaskolben, welche die Rattenknorpelzellen beinhalteten, zugegeben. Scheintransfektionen mit nur FuGENE 6 wurden auch durchgeführt. Proben von 200 μL wurden von den Medien der transfizierten und kontrolliert nicht transfizierten Zellen in einer Einschicht zu unterschiedlichen Zeitintervallen nachfolgend auf die Transfektion entnommen. Diese Proben wurden bei –20°C bis Zur Bewertung der hGH-Konzentrationen aufbewahrt, wobei ein ELISA Testbausatz (Roche) benutzt wurde, welcher nicht mit dem Ratten GH übers Kreuz reagierte.
Dreidimensionale Kulturen: Transfizierte Zellen wurden von zusammenfliessenden Glaskolben getrennt, wie oben ausgeführt, gezählt und in 1.5 mL Eppendorf Röhrchen aufgeteilt in einer Dichte von 6.3×10⁵ Zellen. Diese Röhrchen wurden dann zentrifugiert bei 1000 g für fünf Minuten, um ein Pellet zu formen. Alle Röhrchen wurden unter Standardkulturbedingungen inkubiert und die Medien wurden auch über die Zeit getestet, von Änderungen in den hGH-Levels abzuschätzen.
Dexamethason Behandlung: Sowohl Monoschicht as auch 3-D Pelletkulturen (5.2×10⁵ Zellen pro Pellet) wurden Dexamathason (Dex,Sigma) ausgesetzt, bei Konzentrationen bei 0.1 μM, 0.01 μM und 0.001 μM für 24 Stunden, um die Wirkung von Dex auf die hGH Abgabe zu studieren.
Ergebnisse: Rattenknorpelzellen, welche mit pXGH5 transfiziert wurden, produzierten hGH in Grössenordnungen von 200 ng/mL in zwei Tagen und akkumulierten bis 1.200 ng/mL in 10 Tagen (1). Transfizierte Rattenknorpelzellen in Pelletkultur (6.3×10⁵ Zellen/Pellets) gaben hGH in das Kulturmedium auch ab, in einem Spitzenwert zwischen Tag 1 und 4 von ungefähr 300 ng/mL. Danach wurde eine Reduktion festgestellt auf eine Grössenordnung nahe zu 100 ng/mL am Tag 8 der Pelletkultur (2). Die Zugabe von Dex zu Monolayer-Knorpelzellen, bei allen Konzentrationen getestet, erhöhte die Produktion von hGN (3 T=Tage nach der Transfektion, Dex=Tage nach dem Aussetzen von Dex: (0.1 μM, 0.01 μM und 0.001 μM)). Ferner hielt Dex bei Konzentrationen von 0.1 μM und 0.01 μM eine höhere hGH Konzentration in dem Medium von Pellets aufrecht, welche transfizierte Rattenknorpelzellen kultivierten, verglichen mit Kontrollen (4, P=Tage nach der Pelletformation; Dex=Tage nach dem Dex Aussatz: (0.1 μM, 0.01 μM und 0.001 μM)).
REFERENZEN:

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Claims

Transplantations-/Implantationseinrichtung für die Lieferung zumindest einer vorherbestimmten, biologisch aktiven Zusammensetzung zu einem menschlichen oder tierischen Wirtssystem und/oder für eine andere biologische Funktion innerhalb des Wirtssystems, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung ein knorpeliges Gewebe einer knorpeligen, extrazellulären Matrix und lebende Knorpelzellen umfasst, welche die extrazelluläre Matrix erzeugen und aufrechterhalten, und dass sie ferner lebende Zellen und/oder künstliche Partikel einer gleichen Grösse wie die Knorpelzellen umfasst, wobei die Zellen oder Partikel für das Ausscheiden der zumindest einen vorherbestimmten Zusammensetzung oder für die andere biologische Funktion verantwortlich sind, wobei die Zellen und/oder Partikel mit den Knorpelzellen in der extrazellulären Matrix festgelegt sind, welche ihre unmittelbaren Umgebung bildet.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Knorpelzellen autologe Knorpelzellen sind, welche von dem Wirt stammen.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Knorpelzellen heterolog oder homolog sind und von einem Spender stammt.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, welche in der Lage sind, die zumindest eine biologisch aktive Zusammensetzung zu erzeugen und auszuscheiden, genetisch konstruiert sind.
Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, welche in der Lage sind, die zumindest eine biologisch aktive Zusammensetzung zu erzeugen und auszuscheiden, genetisch konstruierte Knorpelzellen sind.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die künstlichen Partikel Biosensoren sind.
Verfahren zum Herstellen einer Transplantationseinrichtung für die Lieferung zumindest einer vorherbestimmten, biologisch aktiven Zusammensetzung zu einem menschlichen oder tierischen Wirtssystem und/oder für zumindest eine andere biologische Funktion innerhalb des Wirtssystems, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte: das Bereitstellen einer geeigneten Anzahl von lebenden Knorpelzellen; die genetische Konstruktion zumindest eines Teils der Knorpelzellen oder das Mischen der Knorpelzellen mit anderen Arten von natürlichen oder genetisch konstruierten Zellen oder das Mischen der Knorpelzellen mit künstlichen Partikeln, welche eine Grösse aufweisen, die mit der Grösse von Zellen vergleichbar ist, oder das Kombinieren von zumindest zweier der genannten Schritte des Konstruierens oder Mischens; das Unterwerten der Knorpelzellen oder der Mischung, welche die Knorpelzellen enthält, dreidimensionaler Kulturbedingungen für eine in vitro Herstellung eines knorpeligen Gewebes.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Bereitstellens der Knorpelzellen das Gewinnen von natürlichem knorpeligen Gewebe von dem Wirt oder von einem Spender, das Unterwerten des gewonnenen Gewebes einer primären Kulturvorbereitung und das Entwickeln der Knorpelzellen des gewonnenen Gewebes in einer einschichtigen Kultur umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Knorpelzellen aus künstlichem Knorpel, Rippenknorpel, Nasenknorpel, Ohrknorpel, Augenlinsen oder Bandscheiben stammen.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie lebende Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Interleukine zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Hemmung von Entzündungen anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, ein Hormon zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Ergänzung und Korrektur des Wirtsniveaus des Hormons anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Insulin zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung von Diabetes anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Nebenschilddrüsenhormon zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung von Hypokalziämie anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Somatotropin zu erzeugen und auszuscheiden, und beim vermehrenden Wachstum von Viehbestand anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Reifungs- oder Wachstumsfaktoren zu erzeugen und auszuscheiden, und bei zunehmender Wundheilung anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, BMP (knochenbildende Proteine) zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung von Pseudoarthrose anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, einen Gerinnungsfaktor zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung von Hämophilie anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Dopamin zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, ziliarneurotrophische Faktoren (CNTF) zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Behandlung von menschlichen Nervendegenerationskrankheiten anwendbar ist, insbesondere bei amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Zellen umfasst, welche in der Lage sind, Inhibitoren von Angiogenese zu erzeugen und auszuscheiden, und bei der Tumorbehandlung und der Wundheilung anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Biosensoren umfasst und bei der Messung einer spezifischen metabolischen Aktivität anwendbar ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Biosensoren umfasst und bei der Steuerung der Hormonabgabe anwendbar ist.