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Bereich der
Erfindung
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Der
Bereich der vorliegenden Erfindung ist eine therapeutische Zusammensetzung,
welche imstande wäre,
Kardiogenese in nicht kardialem Gewebe zu induzieren. Im Besonderen
ist der Bereich der vorliegenden Erfindung ein Reagenz, welches
aus einem transformierenden Wachstumsfaktor-β-Protein und einem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Protein
besteht.
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Hintergrund
der Erfindung
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Es
wurde im Labor Dr. John Loughs demonstriert, dass die vorne und
seitlich liegenden Zellen der Entodermplatte der herzbildenden Region
(HFR) der Hühnerembryonen
in der 6. Entwicklungsstufe spezifisch imstande sind in explantiertem
präkardialem
Mesoderm Kardiogenese zu induzieren. Dieser Prozess manifestiert
sich durch die Entstehung eines vielschichtigen Bläschens rhythmisch
kontrahierender Zellen, welche sarkomeres α-Actin exprimieren (Sugi, Y.
und Lough, J., Dev. Dyn. 200: 155-162, 1994). Sugi und Lough berichteten
neulich, dass mit dem Entoderm assoziierte Faktoren, einschließlich der
Mitglieder der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Familie (FGFs 1, 2 und 4) sowie der
transformierenden Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Familien (Aktivin A), die kardiogenen
Effekte des HFR-Entoderms im präkardialen.
Mesoderm imitieren können
(Sugi, Y und Lough, J., Dev. Biol. 169:567-574, 1995). In einigen
Veröffentlichungen
wird eine Mischung, welche TGF-β und
FGF-β enthält, allgemein
diskutiert. So zum Beispiel Eisenberg et al, Circulation Research
78: 205-216, 1996,
Kimelman et al., Cell 5:869-877, 1987, Cummins et al, Dev. Cardiovasc.
Med. 147 : 17-30, 1993. Überdies
werden in WO 930/05823 im Namen von Baylink solche Mischungen allgemein erörtert.
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Ein
weiteres Dokument im Namen von Niswander et al., Nature: 361, 68-71,
1993 behandelt Gemische von FGF-4 und BMP-2, welche in der apikalen
ektodermalen Leiste der Mausgliedmasse exprimiert werden und zur
Stimulation bzw. zum Hemmen des Gliedmassenwachstums führen. Allerdings,
wenn es zusammen mit BMP-2 angewandt wird, übt FGF-4 laut diesem Artikel
eine hemmende Wirkung auf BMP-2 aus.
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Zum
Schluss wird noch erwähnt,
dass in WO 96/15224 eine Zusammensetzung aus verschiedenen Wachstumsfaktoren
beschrieben wurde, welche die Expression von Tyrosin-Hydroxylase
in Nervenzellen induziert und dass diese Kombination zur Behandlung
neurologischer Erkrankungen dienen könne. Nicht erwähnt wird
allerdings in diesem Dokument die Möglichkeit der Anwendung dieser
Zusammensetzung zwecks Induktion der Kardiogenese.
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Nach
dem gegenwärtigen
Wissensstand fehlt zurzeit eine Zusammensetzung, welche imstande
wäre mittels
spezifischer Proteine Kardiogenese in nicht kardialem Gewebe zu
induzieren.
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Enthüllung der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Anwendung einer kardiogenen
Zusammensetzung, welche aus einer Mischung von gereinigtem morphogenetischem
Knochenprotein 2 (BMP-2) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2)
besteht und zwecks Erzeugung eines Medikaments mit kardiogener Wirkung dienen
kann.
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann als eine Methode
zur Induktion von Kardiogenese in Zellen nicht kardialer Zelllinie
angewandt werden, in welcher die folgenden Schritte enthalten sind: Exposition
der Zellen einem Gemisch von gereinigtem morphogenetischem Knochenprotein-2
mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2) und Verfolgung der Entwicklung
von rhythmisch kontrahierenden Zellen, welche sarkomeres α-Aktin exprimieren.
Die Aussetzung kann entweder in vivo oder in vitro erfolgen.
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In
einer Ausführung
der vorliegenden Erfindung wird das Proteingemisch exogen auf Zellen
in vitro appliziert. In einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung
werden Zellen durch genetische Konstrukte transformiert, die morphogenetisches
Knochenprotein und Fibroblasten-Wachstumsfaktor kodieren. Diese
genetischen Konstrukte werden dann zur Expression kardiogener Proteine
veranlasst.
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Ein
wichtiger Bestandteil dieser Erfindung ist die Tatsache, dass die
Entstehung von Herzzellen aus nicht kardialem Gewebe induziert werden
kann.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die 1A und 1B zeigen
das Vorkommen von Kardiogenese in nicht präkardialen Mesodermzellen, die
mit BMP-2 und FGF-4 behandelt wurden. Zeichnung 1A stellt ein Diagramm
der herzbildenden Region (präkardiales
Gewebe) und das nicht präkardiale
Gewebe eines Vogelembryonen in der Entwicklungsstufe 6, dar. Zeichnung
1B ist eine graphische Darstellung des prozentualen Anteils der
resultierenden kontraktilen Explantate nach Behandlung mit FGF-4
bzw. BMP-2 verglichen mit dem entsprechenden Anteil nach Behandlung
mit dem Gemisch von FGF-4 und BMP-2.
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Die bevorzugten
Ausführungen
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung einer kardiogenen Zusammensetzung,
welche aus einer Mischung von gereinigtem morphogenetischem Knochenprotein
2 (BMP-2) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) besteht und
zur Erzeugung eines Medikaments mit kardiogener Wirkung auf nicht
präkardiales
Gewebe, vorzugsweise auf humanes Gewebe, dient. Unter „Kardiogenese" verstehen wir die
Entwicklung von rhythmisch und synchron kontrahierenden, sarkomeres α-Aktin exprimierenden
Zellen aus Zellen, die nicht zur kardialen Zelllinie gehören. Vorzugsweise
kann eine Zelle als Herzzelle durch visuelle Beobachtung unter dem
Mikroskop identifiziert werden. Es wird anhand der weiter unten
angegebenen Beispiele demonstriert, dass ein sarkomeres α-Aktin erkennender
monoklonaler Antikörper
den bestätigenden
Nachweis für
die Expression von sarkomerem α-Aktin
durch Zellen liefern kann.
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Unter „nicht
präkardialem
Gewebe" verstehen
wir ein Gewebe, welches nicht Teil der kardialen Zelllinie ist.
Als Beispiel, sind die nachfolgend genannten Gewebe nicht präkardial:
Fibroblasten, aus denen Bindegewebe entsteht und Zellen, welche
sich zu anderen als aus dem Mesoderm stammenden Gebilden entwickeln, wie
etwa zu Skelettmuskulatur.
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In
einer der Ausführungen
enthält
die Zusammensetzung ein Mitglied der Unterfamilie des morphogenetischen
Knochenproteins, welches der transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β)-Familie
gehört
sowie einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). Beispielsweise enthält das Reagenz
ein Gemisch aus morphogenetischem Knochenprotein-2 (BMP-2) und FGF-4.
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Die
Zusammensetzung enthält
ein „gereinigtes" Gemisch von Proteinen.
Unter „gereinigt" verstehen wir, dass
die betreffenden Proteine von nativen und rekombinanten bakteriellen
Verunreinigungsquellen gereinigt wurden. Ein unbehandelter Zellextrakt
oder ein Proteingemisch gelten beispielsweise als „gereinigt" falls sie zur Erreichung
von fast 100 % Homogenität
individuell gereinigt wurden.
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Die
weiter unten im Abschnitt der Beispiele beschriebenen Versuche zeigen,
dass die Kombination aus BMP-2 und FGF-4, nicht aber jedes für sich allein,
Kardiogenese in nicht präkardialem
embryonalem Mesoderm der Vögel
induzieren kann. Nach unserer Vorstellung kann die Kombination von
Proteinmolekülen
und vielleicht auch andere Kombinationen von TGF-β mit Mitgliedern
der FGF-Familie, Kardiogenese in anderen nicht präkardialen
Geweben, wie etwa im humanen präkardialen
Gewebe, induzieren.
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Eine
typische Quelle des BMP-2 ist der Knochen oder auch das rekombinante
humane BMP-2, welches von Bakterien exprimiert wird.
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Die
Zusammensetzung der Erfindung kann auch andere therapeutisch nützliche
Faktoren, einschließlich
Wachstumsfaktoren, wie etwa Epidermis-Wachstumfaktor (EGF), transformierenden
Wachstumfaktor (TGF-α-Protein
und TGF-β Protein),
Aktivine, Inhibine und insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF), enthalten.
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Die
Wahl des Matrix-Materials richtet sich nach Biokompatibilität, Biodegradierbarkeit,
den mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinen und
der Oberflächenkompatibilität. Die Formulierung wird
der jeweiligen Anwendung angepasst. Als potentielle Grundsubstanzen
der Zusammensetzungen können biodegradierbare
und chemisch definierte Polymere dienen, wie etwa Polymere der Poly-Milchsäure, Polyglykol-Polyorthoester
und Polyanhydride. Andere potentiell in Frage kommenden Substanzen
sind biodegradierbare und biologisch deutlich definierbare Stoffe,
wie z. B. Kollagen. Ferner kann die Grundsubstanz aus reinen Proteinen
oder aus extrazellulärer
Matrix bestehen. Andere potentiell in Frage kommende Grundsubstanzen sind
nicht biodegradierbare und chemisch definierte Stoffe, wie zum Beispiel
gesintertes Hydroxyapatit, Bioglas, Aluminate und andere keramische
Stoffe. Der Grundstoff kann auch aus jeder beliebigen Kombination der
oben erwähnten
Stoffe oder aus anderen geeigneten Substanzarten bestehen und kann
in der Zusammensetzung und Bearbeitung so geändert werden, dass das Ausmaß der Poren,
die Größe und Form
der Partikel sowie die Biodegradierbarkeit entsprechend angepasst
werden.
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Vorzugsweise
wird das morphogenetische Knochenprotein mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor
im Molarverhältnis
0,881 zu 1,211 gemischt. Noch vorteilhafter werden sie in molarem
Verhältnis
gemischt. Es können
allerdings auch andere Mischungsverhältnisse Kardiogenese bewirken
und können
daher ebenfalls gebräuchlich
sein.
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Die
Dosierung wird vom behandelnden Arzt zu bestimmen sein und wird
sich nach verschiedenen Faktoren richten, welche die Wirkung der
Proteinzusammensetzung modifizieren, wie z. B. die gewünschte Quantität des zu
formenden Gewebes, der Ort der Schädigung, der Zustand des beschädigten Gewebes,
die Größe der Wunde,
die Art des beschädigten
Gewebes, das Alter und Geschlecht des Patienten bzw. der Patientin, seine
oder ihre Ernährungsart,
der Schweregrad einer etwa vorhandenen Infektion, der Zeitpunkt
der Behandlung sowie noch andere klinische Begebenheiten. Die Dosis
kann sowohl nach Art der Matrixsubstanz, welche in der Wiederherstellung
verwendet wird als auch nach der Art der angewandten Proteine in
der Zusammensetzung variieren. Der Zusatz von anderen bekannten
Wachstumsfaktoren, wie etwa IGF I (insulinartiger Wachstumsfaktor
I) zur endgültigen
Zusammensetzung kann ebenfalls die Dosierung beeinflussen.
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Potentiell
können
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch für die Behandlung
von Patienten mit Schädigung
oder Überbeanspruchung
des kardialen Gewebes angewandt werden. Die Zusammensetzung kann
als eine Hilfsmaßnahme
bei operativen Eingriffen angewandt werden, indem sie direkt an das
beschädigte
oder überbeanspruchte
Gewebe appliziert wird. Bei dieser Ausführung kann die Zusammensetzung
für sich
allein oder aber zusammen mit kultivierten, differenzierungsfähigen Zellen,
welche zu Kardio- oder Kardiomyozyten differenzieren können, angewandt
werden. Unter den Zellen, welche in einer solchen Ausführung nützlich sein
können,
sind kultivierte Kardio- oder Kardiomyozyten, Präkursoren der Kardio- oder Kardiomyozyten-Zelllinie,
Fibroblasten, embryonale Mesodermzellen und frühere embryonale Stammzellen, die
zu Mesoderm differenzieren können,
zu nennen.
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Wahlweise
kann die Zusammensetzung für
die Behandlung von autologen oder heterologen Zellen verwendet werden,
um ihr Wachstum, ihre Proliferation und Differenzierung und/oder
auch die Erhaltung einer Zelllinie von Kardio- oder Kardiomyozyten
zu fördern.
Die derart behandelten Zellen können
dann dem beschädigten
oder überbeanspruchten
Gewebe entweder alleine oder zusammen mit der Proteinzusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung zugeführt
werden.
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In
einer anderen Ausführung
können
DNA-Sequenzen, welche die Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren,
in fremde Zellen transfiziert werden und diese befähigen, BMP
und FGF zu produzieren. Die transfizierten BMP und FGF produzierenden
Zellen können
dann am Ort der Beschädigung
oder Überbeanspruchung
des Gewebes implantiert werden.
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Eine
entsprechende Grundsubstanz kann mit jeder der zuvor geschilderten
Ausführungen
zwecks Erhaltung der Zusammensetzung und/oder der Zellen am Ort
der Gewebsschädigung
oder -Überbeanspruchung angewandt
werden. Wahlweise kann eine zu injizierende Formulierung verwendet
werden, um die Zusammensetzung der Proteine bzw. der Zellen an den
Ort zu bringen. Das Gleiche kann auch als eine prophylaktische Maßnahme zur
Vorbeugung oder Minderung der Beschädigung bzw. Überbeanspruchung
des Gewebes angewandt werden.
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Beispiele
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1. Allgemein
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Weil
die Immunfärbung
zum Nachweis weiterer Wachstumsfaktoren der TGF-β-Familie im Entoderm der HFR ein provokatives
Expressionsmuster von Drosophila-Dekapentaplegic-ähnlichen
(dpp-like) Proteinen gezeigt hat, haben wir eine reverse Transskiptase/Polymerase-Kettenreaktion
(RT/PCR) mit degenerierten Primern als Screening zum Nachweis der
von diesen Zellen exprimierten dpp-ähnlichen Faktoren durchgeführt. Bei über 50 PCR-Ergebnissen,
die bisher sequenziert wurden, sind mehr als die Hälfte mit
dem Knochen morphogenetischen Faktor 2 (BMP-2) identisch.
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Ferner
untersuchten wir ob BMP-2 den kardiogenen Effekt des HFR-Entoderms
am präkardialen
Mesoderm imitieren kann sowie seine Fähigkeit, das präkardiale
Mesoderm zur kardialen Ziellinie zu respezifizieren. Wir berichten
hier, dass BMP-2 nicht imstande ist die Lebensfähigkeit weder des präkardialen
noch des nicht präkardialen
Mesoderms zu unterstützen,
falls es einem definierten Medium nur für sich alleine zugefügt wird.
Obwohl FGF-4 im präkardialen
Mesoderm Kardiogenese fördern
kann, konnte dieser Faktor keine Kardiogenese in nicht-kardialem
Mesoderm induzieren, wenngleich das Wachstum der Explantate durch
ihn aufrechterhalten werden konnte. Bezeichnenderweise jedoch hat
die Behandlung von nicht-präkardialem
Mesoderm mit der Kombination von FGF-4 und BMP-2 in einem hohen
Prozentsatz der Explantate Kardiogenese induzieren können, was
darauf hinweist, dass die Kombination dieser Wachstumsfaktoren imstande
ist, embryonale Zellen zur kardialen Zelllinie zu respezifizieren.
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2. Material
und Methoden
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Explantation und Kultur
des embryonalen Mesoderms:
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Hühnerembryonen
wurden nach den Kriterien von Hamburger und Hamilton (Hamburger,
V. und H. L. Hamilton, J. Morphol. 38:49-92, 1951) eingestuft. Die
ventrolaterale präkardiale
Mesodermplatte sowie das nicht präkardiale Mesoderm von der dorsalen
Hälfte
der Embryonen der 6. Entwicklungsstufe wurden durch Mikrodissektion
herausgelöst,
auf Lab-Tek-Kammer Objektträger
explantiert und nach der früher
beschriebenen Art in M199 kultiviert (Sugi, Y. und J. Lough, supra
1994; Sugi, Y. and J. Lough, supra, 1995). Wachstumsfaktoren wurden
gemäß den angegebenen
Endkonzentrationen zugegeben nachdem die Explantate am Fibronektin-Substrat
anhafteten. Das humane rekombinante FGF-4 stammte von R&D Systems. Das
humane rekombinante BMP-2 wurde vom Genetics Institute (Cambridge,
MA) zur Verfügung
gestellt. Das Medium, einschließlich
Wachstumsfaktoren, wurde täglich
erneuert.
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Immunhistochemie:
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Die
biochemische Differenzierung wurde immunhistochemisch überwacht,
indem ein monoklonaler Antikörper,
welcher sarkomeres α-Aktin
erkennt (Sigma, Kat. Nr. A-2172),
angewandt wurde; der sekundäre Antikörper war
mit fluoreszierendem Isothiocyanat (FITC) markiertes anti-Maus IgM
der Ziege (Cappel). Decapentaplegicähnliches Protein wurde mittels
eines polyklonalen Antikörpers
(1:1000) lokalisiert. Dieser Antikörper, welcher Drosophila-Decapentaplegic
erkennt, wurde von Dr. F. Michael Hoffmann (University of Wisconsin;
Panganiban, G.E.F., et al., Mol. Cell. Biol. 10:2669-2677, 1990)
zur Verfügung
gestellt. Die Kontrollen bestanden aus identisch verdünntem normalem
Kaninchenserum, das unter Auslassung des primären Antikörpers als primärer Antikörper diente.
Der sekundäre
Antikörper
war an FITC konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen IgG (1:500). Die
gesamten immunhistochemischen Verfahren, einschließlich der
Bestimmungen der 5'-Bromodeoxyuridin-Eingliederung,
wurden bereits früher
beschrieben (Sugi, Y. und J. Lough, supra, 1995).
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Reverse Transskriptase-Polymerase-Kettenreaktion
(RT/PCR):
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Aus
dem mittels Mikrodissektion ausgelösten Entoderm der 6. Stufe
wurde RNA unter Verwendung von RNAstat (Tel-Test, Inc.) mit 5 μg linearem
Polyakrylamid als Träger
gereinigt. Die Synthese von Komplementär-DNA erfolgte durch die Extension
von RNA nach Oligo-dT-Priming, welche von M-MLV-reverser Transskriptase
vermittelt wurde. Um die Abwesenheit von Kontaminierung durch Genom-DNA
sicher zu stellen, wurde gleichzeitig auch RNA nach Transskription
durch nicht-reverse Transskriptase mitgeführt. Degenerierte Primers dienten
zur Erkennung von konservierten Domänen der TGF-β-dpp-Unterfamilie.
Der Upstream-Primer war 5'-TGGAATTCGGITGGVAIGAYTGGAT-3' (96-fach degeneriert)
(SEQ ID NO: 1); Das reverse Komplement der Downstream-Zielsequenz
war 5'-GAGGATCCGGIACRCARCAIGCYTT-3' (128-fach degeneriert) (SEQ
ID NO: 2).
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Die
Komplementär-DNSäuren wurden
unter Anwendung von Thermus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase (Promega)
bei 40 Denaturationszyklen (94 °C,
1 Minute), Primer-Annealing (45 °C,
1,5 Minuten) und Extension (72 °C,
2 Minuten) amplifiziert. Die Komplementär-DNSäuren im zu erwarteten Produkt
mit 200 Basenpaaren wurden in pCRScript (Stratagene) geklont. Die
Identität
der geklonten Insertionssequenzen wurde durch Sequenzierung und
Vergleich mit der GenBank/EMBO-Datenbank gesichert.
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3. Ergebnisse
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Immunhistochemische Lokalisierung
des DPP-ähnlichen
Proteins im Entoderm der HFR:
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Zur
Feststellung ob Drosophila Decapentaplegic-ähnliche Proteine mit dem HFR-Entoderm
assoziiert waren, wurde das Muster der anti-dpp-Immunfärbung aus
kultiviertem HFR-Entoderm mit dem des explantierten präkardialen
Mesoderm verglichen. Die peripheren Zellen des HFR-Entoderms zeigten
eine intensive Färbung,
welche weder im präkardialen
Mesoderm noch in mit normalem Kaninchenserum gefärbten Kontrollexplantaten zu
beobachten war.
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Der RT/PCR Nachweis von
BMP-2 im HFR-Entoderm:
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Da
dpp zu 75% mit BMP 2 und 4 homolog ist, konnte angenommen werden,
dass die oben beschriebenen Antigene diese Faktoren, oder aber auch
andere Mitglieder der TGF-β-dpp-Untergruppe
repräsentieren. Um
dpp-mRNAs zu identifizieren, welche vom HFR-Entoderm exprimiert
werden, wurde RT/PCR-Screening durchgeführt, wobei degenerierte, auf
die konservierten Domänen
dieser Untergruppe gezielten Primers verwendet wurden. Es wurde
ein einziges 200 Basenpaare messendes PCR-Produkt, welches die voraussichtliche
Größe der dpp
cDNAs aufweist, geklont und sequenziert, um auf diese Weise die
dpp-ähnlichen,
vom HFR-Entoderm exprimierten Faktoren zu identifizieren. Unter
den ungefähr
50 bis heute sequenzierten cDNAs waren über die Hälfte im Bezug auf die Strecke
von 162 Basen, welche den Nukleotiden 800 – 962 des Hühnerhomologs entsprechen und
die durch Primers spezifisierte Domäne repräsentieren, mit BMP-2 identisch (Francis,
P.H., et al., Development 120:209-218, 1994). Es wurde kein neues
oder bereits bekanntes Mitglied der dpp-Untergruppe identifiziert.
Obwohl die übrigen
geklonten cDN-Säuren
zueinander ähnliche
Sequenzen zeigten, waren diese mit keinen in der Datenbank vorhandenen
homolog. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass BMP-2 das hauptsächliche
Mitglied der vom HFR-Entoderm exprimierten dpp-Gruppe ist.
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BMP-2 und FGF-4 induziert
Kardiogenese in nicht präkardialem
Mesoderm (kein Teil der Erfindung):
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Aufgrund
dieser Ergebnisse war es von Interesse zu bestimmen, ob BMP-2, falls
allein in einem definierten Medium enthalten, den kardiogenen Effekt
des HFR-Entoderms
auf präkardiales
Mesoderm ausüben kann.
Im Gegensatz zu FGF (Sugi, Y. und J. Lough, supra 1995; Zhu, X.,
et al., "Evidence
for fibroblast growth factor 1 and 4 participation in paracrine
and autocrine mechanisms that regulate embryonic heart development", eingereicht zur
Veröffentlichung),
konnte BMP-2 weder das Überleben
noch die Differenzierung des präkardialen
Mesoderms unterstützen.
Allerdings konnte erwartungsgemäß durch
die Einbeziehung von FGF-4 zusammen mit BMP-2 terminale Kardiogenese
im präkardialem
Mesoderm bewirkt werden.
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Die 1A und
B zeigen das Entstehen von Kardiogenese in nicht-präkardialem
Mesoderm, welches mit BMP-2 und FGF-4 behandelt wurde. Nicht präkardiales
Mesoderm wurde aus der dorsalen Hälfte der Embryonen in Stufe
6 explantiert und unter Anwesenheit von FGF-4 und/oder BMP-2 bei
den angegebenen Konzentrationen kultiviert. Während weder FGF-4 noch BMP-2
für sich
allein kardiogene Differenzierung in den Explantaten herbeiführen konnte,
zeigten binnen 1 bis 2 Tagen die meisten Explantate, welche mit
beiden Wachstumsfaktoren zusammen behandelt wurden, mehrschichtige
Anordnung von Zellen mit rhythmischer Kontraktion. Zu 1B:
die Zahlen in Klammern bedeuten die Anzahl der experimentellen Wiederholungen, die
in den insgesamt fünf
Experimenten mit jeweils um die fünf Replikationen der Explantate
durchgeführt
wurden. Das Vorkommen der Differenzierung (40 – 60 %) war bei jeder Versuchswiederholung ähnlich.
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Wie
in 1A dargestellt, wurden diese Bestimmungen an nicht
präkardialem
Mesoderm, welches aus der dorsalen Hälfte der Embryonen in Stufe
6 explantiert wurde, durchgeführt.
Die Zellen dieser Region sind zu extraembryonalem Mesoderm und zum
Mesoderm der Lateralplatte vorbestimmt, welches nicht kardiogen
ist. (Zusammenfassender Bericht: Nicolet, G., Adv. Morphopenesis
9:231-262, 1971). Wie aus der 1B ersichtlich,
konnte weder FGF-4 noch BMP-2 allein die Entstehung von kontraktilen
Explantaten in nicht präkardialem
Mesoderm einleiten. Zellen, welche nur mit BMP-2 kultiviert waren
lösten
sich vom Kulturgefäß ab und
haben nicht überlebt.
Die Behandlung mit FGF-4 allein konnte zwar die Proliferation fördern, was durch
die Inkorporierung von 5'-Bromodeoxyuridine
nachgewiesen werden konnte, Differenzierung wurde aber nie beobachtet.
Bemerkenswerterweise jedoch hat die kombinierte Anwesenheit von
FGF-4 und BMP-2 kardiogene Differenzierung in über der Hälfte aller nicht präkardialen
Mesodermexplantate (1B) bewirkt und diese ließ sich durch
die Entstehung eines mehrschichtigen Bläschens mit rhythmisch kontrahierenden
Zellen sowie durch die Differenzierung von sarkomerem α-Aktin nachweisen.
Weil die Differenzierung des nicht präkardialen Mesoderms, im Gegensatz
zu präkardialem
Mesoderm, wo die Differenzierung bereits am ersten Tag zu beobachten
ist, in vitro nicht vor dem zweiten Tag zu sehen war (1B),
wird angenommen, dass in den Explantaten des nicht präkardialen
Mesoderms noch ein vorbereitender Respezifizierungsschritt erforderlich ist.
Diese Ergebnisse sprechen für
eine synergistische Wirkung der Wachstumsfaktoren auf die Induktion
der Kardiogenese in Zellen, welche nicht für die kardiale Linie vorbestimmt
sind.
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4. Diskussion
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Zusätzlich zur
Verifizierung unserer früheren
Ergebnisse, die gezeigt haben, dass dem HFR-Entoderm eine spezifische
Wirkung auf die terminale Differenzierung eigen ist (Sugi, Y. und
J. Lough, supra, 1994), haben Schultheiss, et al. (Schultheiss,
T.M., et al., Development 121: 4203-4214, 1995) auch darüber berichtet,
dass HFR-Entoderm
embryonale Zellen zu kardiogener Zelllinie respezifizieren vermag.
Hinsichtlich dieser letzten Feststellung muss unsere Beobachtung,
dass das HFR-Entoderm
nicht imstande war das dorsale, nicht präkardiale Mesoderm zu respezifizieren
(Sugi, Y. und J. Lough, supra, 1994), offensichtlich auf einer zu
niedrigen Konzentration der entodermalen Faktoren beruht haben,
welche durch die Platzierung der Explantate, anstatt in unmittelbarer
Nähe, an
der gegenüberliegenden
Seite des Kulturgefäßes, verursacht
war. Die hier erörterten Befunde,
welche die Induktion der Kardiogenese in nicht präkardialem
Mesoderm durch die kombinierte Wirkung von Wachstumsfaktoren BMP-2
und FGF-4 (beide werden im HFR-Entoderm exprimiert), stimmen auch mit
der Fähigkeit
der HFR-Entoderms Zellen zur kardiogenen Zelllinie zu respezifizieren überein.
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Wir
haben bereits früher
festgestellt, dass das HFR-Entoderm drei Mitglieder der FGF-Familie
(FGF 1, 2, und 4) exprimiert und dass jeder von ihnen die Differenzierung
von präkardialem
Mesoderm unterstützt (Sugi,
Y. und J. Lough, supra, 1995; Zhu, X., et al., supra, in Druck,
Developmental Dynamics). Darüber
hinaus zeigten Versuche mit Natriumchlorat, die spezifisch dazu
bestimmt waren, die Bindung von FGF an ihre entsprechenden Rezeptoren
zu blockieren, dass die FGF-Signalisierung für die durch Entoderm vermittelte
Kardiogenese unentbehrlich ist (nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Indes, weil die Hauptrolle des FGF die Regulation der Proliferation
des präkardialen
Mesoderms zu sein scheint, ist die Mitwirkung mit „differenzierenden" Faktoren, wie etwa
BMP-2, möglicherweise
zur Induktion der Differenzierung zu Kardiomyozyten notwendig. So
interpretiert, würden
unsere Beobachtungen, dass isoliertes präkardiales Mesoderm bei Kulturbedingungen
nur mit FGF alleine differenzieren kann, eine frühere, bereits vor der Explantierung
aus dem Embryo erfolgte BMP-Signalisierung dieser Zellen bedeuten.
Trotz des erbrachten Beweises, wonach die Zusammenarbeit zwischen
Aktivin und den FGFs die Regulation der Induktion vom Xenopus-Mesoderm
zu bewirken vermag (Cornell, R. und D. Kimelman, Development 120:453-462,
1994; LaBonne C. und M. Whitman, Development 120:463-472, 1994), deuten
unsere präliminären Befunde
darauf hin, dass Aktivin bei der Unterstützung der Differenzierung des
nicht präkardialen
Mesoderms das BMP-2 nicht ersetzen könne. Ferner, obwohl FGF-4 und
BMP-2 in der apikalen ektodermalen Leiste der Maus-Extremitätknospen
exprimiert werden und das Wachstum der Extremität durch sie stimuliert bzw.
gehemmt wird (Niswander L. and G.R. Martin, Nature 361:68-71, 1993), kann der
inhibitorische Effekt des BMP-2 auf das Wachstum als Ergebnis seiner
differenzierenden Eigenschaft angesehen werden. Abschließend wiesen
Pourquie et al. (1995) neulich darauf hin, dass die BMPs eine differenzierende
Potenz besitzen können.
Die Autoren konnten zeigen, dass BMP-4 Myotomzellen zur Zelllinie
der Skelettmyozyten spezifizieren (Pourquie, O., et al., Cell 84:461-472,
1995).
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5. Prophetische
Ergebnisse aus Tierexperimenten
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Es
wird erwartet, dass die laufenden Versuche am Kaninchenmodell bestätigen werden,
dass die Kombination aus morphogenetischem Knochenprotein (BMP)
und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), im Gegensatz zu jedem dieser
Faktoren allein, einen signifikanten Schutzeffekt auf den Herzmuskel
nach experimentell eingeleitetem vorübergehendem ischämischem
Geschehen auszuüben
imstande ist.
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Rationale:
Das Rationale dieser Experimente ist wie folgt: Bei der Einleitung
der Ischämie
und der anschließenden
Reperfusion an isolierten Rattenherzen erwies sich der unmittelbar
zuvor applizierte grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF;
FGF-2) für
sich allein als die Wiederherstellung der Funktion fördernd (Padua,
R.R., et al., Mol. Cell Biochem. 143:129-135, 1995). Dieser herzschützende Effekt
wurde durch eine direkt in das Koronargefäßsystem injizierte Dosis von
10 μg FGF-2
pro Rattenherz erreicht. Darüber
hinaus konnte neulich gezeigt werden, dass die FGF-2-Behandlung
bei Hunden eine Minderung der Ausmaße von Myokardinfarkten bewirkt
hat, u. zw. 7 Tage nach Reperfusion ohne hämodynamischen Effekt bzw. Hinweis
auf Neovaskularisierung. Dieser herzschützende Effekt wurde durch eine
intrakoronare Dosis von 10 μg FGF-2
pro Hundesherz vor der Reperfusion erreicht (Horrigan, M.C.G., et
al., Circulation 94: 1927 – 1933, 1996).
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Osteogenes
Protein-1 (hOP-1) ist ein Mitglied der TGF-β-Superfamilie und ist nahe mit
BMP verwandt. Die intravenöse
Gabe von hOP-1 vor der Reperfusion in der Dosis von 20 μg pro Versuchstier
hat den Reperfusionsschaden nach 24 Stunden in einem in vivo durchgeführten Versuch
am Rattenmodell der Koronarischämie
und Reperfusion mindern können
(Lefer, A.M., et al., J. Mol. Cell Cardiol. 24:585-593, 1992).
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FGF-4
+ BMP-2: Wir haben kürzlich
entdeckt, dass die Kombination von FGF-4 oder FGF-2 mit BMP-2 in
embryonalen Mesodermzellen, die nicht dazu vorbestimmt sind zur
kardiogenen Zelllinie zu differenzieren, die Differenzierung zu
einem vielschichtigen Bläschen
mit einem Hohlraum herbeibringen vermochte, dessen Zellen synchron
und rhythmisch kontrahieren. Das Bläschen ähnelt einem mikroskopischen
Herzen in vitro. Die Behandlung mit FGF-4 (oder FGF-2) allein, bzw.
mit BMP-2 allein, zeigte keinen Effekt (Lough, J., et al., Developmental
Biology 178:198-202, 1996). Aufgrund dieses Ergebnisses nehmen wir
an, dass BMP im Embryo die Aufgabe der Zellrekrutierung für die kardiogene
Zelllinie erfüllt,
während
FGF notwendig ist, diese Zellen während der kardialen Differenzierungsbahn
zu unterstützen.
Anders als in der embryonalen Situation sind die Herzzellen des
Erwachsenen weder zur Entwicklung noch zum Wachstum fähig. Daher
kann ein während einer
Beschädigung,
wie etwa bei Myokardinfarkt, aufgetretener Ausfall oft katastrophale
Folgen haben. Die Ursache bzw. die Ursachen für die Unfähigkeit der kardialen Myozyten
zu wachsen oder zu regenerieren sind unbekannt. Wir sehen die hauptsächliche
Ursache für
die Unfähigkeit
der Herzzellen des Erwachsenen zu wachsen oder zu regenerieren im
Fehlen von Wachstumsfaktoren, wie FGF und BMP, in einem funktionell
wirksamen Zusammenspiel.
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Versuchsplan: Allgemein
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Betreffend
Herzschonung sind wir uns keiner experimentellen Studien bewusst,
welche die Rolle von BMP per se, sei es alleine oder zusammen mit
anderen Wachstumsfaktoren, in der Erhaltung der Herzfunktion oder
in der Verschonung des Myokards bei Ischämie und Reperfusion untersucht
hätten.
Dies ist aber der Zustand bei Patienten nach einem Herzinfarkt und
auch bei solchen, die eine elektiv verursachte Ischämie erleiden,
wie zum Beispiel während
einer Bypass-Operation oder einer Angioplastie. Wir erwarten, dass
durch die Kombinierung von BMP-2 und FGF-2, der oben beschriebene
herzschützende
Effekt des FGF-2 gestärkt
werden kann. Dementsprechend wird von uns der physiologische Vorteil
der Behandlung mit kombinierten Wachstumsfaktoren bei prä-ischämischer,
aerobischer Herzfunktion und bei der post-ischämischen Erholung untersucht,
indem wir ein Protokoll anwenden, welches routinemäßig im Labor
eines der Erfinder, Dr. John Baker's, angewandt wird. Das Versuchsmodell
arbeitet mit einem isolierten Kaninchenherzen, welches einem Zyklus von
Ischämie
und Reperfusion unterzogen wird. Die Wiederherstellung der Herzfunktion
nach dem Ischämie/Reperfusion-Insult
wird als Endpunkt für
die Bestimmung der Wirksamkeit der kombinierten Wachstumsfaktorbehandlung
dienen. Die Grundlage dieses herzschützenden Effekts wird auf der
Zellular- und Molekularebene untersucht, indem unter Anwendung von
der im Dr. Lough's
Labor üblichen
Routine festgestellt wird, ob erneutes Wachstum und Differenzierung
der Myozyten auftreten,
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Versuchsplan: Spezifisch
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Versuche
werden randomal in vier Gruppen ausgeführt, wobei festgestellt werden
soll, ob BMP-2 synergistisch den herzschützenden Effekt des FGF-2 verstärkt. Die
vier Versuchsgruppen sind wie folgt:
Gruppe 1: Kontrolle mit
Trägersubstanz
(physiologische Kochsalzlösung
ohne Wachstumsfaktoren) –
intravenös appliziert.
Gruppe
2: BMP-2 (80 μg/kg
i. v.) allein
Gruppe 3: FGF-2 (40 μg/kg i. v.) allein
Gruppe
4: BMP-2 (80 μg/kg
i. v.) kombiniert mit FGF-2 (40 μg/kg
i. v.)
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Die
Dosierung und die vorgesehene Applikationsart stützen sich auf veröffentlichte
Berichte, welche einen herzschützenden
Effekt von FGF- und BMP-verwandten
Wachstumsfaktoren bewiesen haben (1 – 3). Jede Gruppe wird aus
acht (8) unreifen, 7 bis 10 Tage alten Kaninchen bestehen. In diesem
neonatalen Entwicklungszustand ist das Herz völlig funktionstüchtig und
besteht aus Myozyten, welche kürzlich
ihre normale Proliferation beendet haben. In allen Gruppen wird
die Behandlung 24 Stunden vor der Exzision des Herzens erfolgen,
damit genug Zeit für
die Entwicklung des (vermutlich) prophylaktischen Effekts dieser
Wirkstoffe auf das Herz bleibt. Vierundzwanzig Stunden nach der
Behandlung wird die Aorta kanüliert
und die Perfusion des isolierten Herzens mit Bikarbonat-Puffer bei
39°C nach
Langendorff unter konstantem Druck sofort eingeleitet. Im linken
und rechten Ventrikel werden mit Kochsalzlösung gefüllte Latex-Ballons zur Messung
der entwickelten Druckverhältnisse
platziert. Die Herzen werden während
einer 30-minütigen Ausgleichsperiode
perfundiert, während
welcher Zeit die biventrikuläre
Funktion und der Koronarfluß unter
stabilen Bedingungen aufgezeichnet werden. Die Herzen werden 30
Minuten lang durch Flussstopp bei 39°C einer globalen Ischämie ausgesetzt
und nach der Ischämieperiode
wird die Herzfunktion wieder unter stabilen Bedingungen aufgezeichnet. Auf
diese Weise dient jedes Herz als seine eigene Kontrolle. Die Wiederherstellung
der Herzfunktion wird als Prozent seiner präischämischen Werte ausgedrückt. Die
Ergebnisse werden durch Vergleich der präischämischen und post-ischämischen
Funktion innerhalb der mit Wachstumsfaktoren behandelten Gruppen
(Gruppen 2 – 4)
mit der Kontrollgruppe (Gruppe 1) ausgewertet.
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Industrielle
Anwendbarkeit
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Die
vorliegende Erfindung ist eine therapeutische Zusammensetzung, welche
imstande ist, Kardiogenese in nicht kardialem Gewebe zu induzieren.
Die Zusammensetzung ist eine gereinigte Mischung aus transformierendem
Wachstumsfaktor-β-Protein
und Fibroblasten-Wachstumsfaktor.
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