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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Pankreas in vitro, spezifischer ausgedrückt ein Verfahren zur Herstellung
von Pankreas in vitro, bei dem eine präsumtive (mutmaßliche)
ektodermale Region einer Vertebraten-Blastula mit Activin und zeitverzögert mit
Retinsäure
behandelt und dann kultiviert wird, ein Screening-Verfahren im Hinblick
auf eine Substanz, die wirksam ist bei der Diagnose und Behandlung
von Erkrankungen, die dem in vitro induzierten Pankreas zugeordnet
werden können,
sowie das Pankreas bei Verwendung des in vitro induzierten Pankreas.
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Technischer Hintergrund
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Jeder
mehrzellige Organismus beginnt seine Entwicklung durch Befruchtung
und wird als ein Individuum fertig gestellt, das verschiedene Gewebe
und ein gut ausbalanciertes System besitzt, indem es Zellteilung (Teilung)
und Zelldifferenzierung durchmacht. Der Differenzierungsprozess
ist hochgradig kompliziert, und es wird angenommen, dass wichtige
Interaktionen zwischen den Zellen, Induktionsphänomene genannt, in vielen Schritten
bei der Differenzierungsschicht stattfinden. Die „Aufdeckung
des Moleküls,
das die Morphogenese beherrscht",
wird dabei als am wichtigsten bezeichnet. Oft bzw. meistens werden
Amphibien-Embryonen als Materialien für diese Studien verwendet,
jedoch gelten die Grundregeln der Körperausbildung für alle Vertebraten
(Wirbeltiere) gemeinsam, und für
homologe Gene ist bekannt, dass sie eine recht ähnliche Funktion selbst unter
verschiedenen Spezies haben.
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Der
Amphibienembryo ist konventionell als ein extrem wertvolles Material
auf dem Gebiet der experimentellen Embryologie betrachtet worden,
mit dem viele Studien durchgeführt
wurden. Dies liegt daran, dass Amphibieneier eine äußere Befruchtung
und Entwicklung aufweisen, dass das große Ei Operationen am Embryo
möglich
macht und Veränderungen
im Zeitverlauf leicht beobachtet werden können. Die obere Blastoporuslippe
der Amphibien-Gastrula ist eine spezielle Region, und wenn sie in
die ventrale Seite eines anderen Embryos transplantiert wird, so
wird ein zweiter Embryo mit Kopf- oder Körper-Schwanzteil induziert.
Dies erklärt,
warum die obere Blastoporuslippe als „Organisator" bezeichnet wird,
als eine Region, die als Zentrum der Morphogenese fungiert, die
das Embryosystem festlegt. Es ist wohlbekannt, dass der Organisator
Zentralnerven induziert, indem er bei der Einstülpung des Urdarms funktionalisierend
auf das präsumtive
Ektoderm einwirkt, während
der Organisator selbst zu dorsalem Mesoderm und anteriorem Entoderm
differenziert.
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Auf
der anderen Seite ist das Pankreas ein endokrines Organ, das die
Histomorphologie und die Entwicklungsweise zeigt, die den meisten
Vertebraten gemein ist, nämlich
Säugern,
Vögeln,
Reptilien und Amphibien, und es ist gleichzeitig ein exokrines Organ.
Es ist bekannt, dass während
des Entwicklungsprozesses dorsale und ventrale Vorläufer (Primordien)
aus dem Entoderm entstehen, und diese fusionieren, um das Pankreas
zu bilden (Development 121, 1569–1580, 1995).
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Es
ist gesagt worden, dass beim Prozess der Embryogenese Mesoderm in
der Nachbarschaft des Entoderms vorkommt, und dass die Wirkung des
Mesenchyms auf das Entoderm notwendig für die Differenzierung des Pankreas
ist (Dev. Biol. 4, 242–255,
1962). Jüngste
Studien haben berichtet, dass eine Beteiligung des Notochords notwendig
für die
Ausbildung des Pankreas im Huhn ist, und dass das Notochord die
Expression von Shh im Entoderm in seiner Nähe unterdrückt, um das Pankreas zu differenzieren.
Es ist außerdem berichtet
worden, dass es das Entoderm der präsumtiven Pankreasregion ist,
das durch die Wirkung des Notochords zur Pankreas differenziert,
und dass sich die Differenzierung zur Pankreas nicht in Entoderm
findet, das sich abseits der präsumtiven
Pankreasregion befindet, auch dann nicht, wenn eine Coexistenz mit
dem Notochord gegeben ist (Development 124, 4243–4252, 1997, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95, 13036–13041, 1998,
Genes and Dev. 12, 1705–1713,
1998).
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Weiterhin
ist anhand von Forschung auf der Genebene berichtet worden, dass
Homeoboxgene, die als ipf-1 und pdx-1 bekannt sind und die im Pankreas-Primordium
der Maus exprimiert werden, essentiell für den Bildungsprozess des Pankreas
sind. Ein Genzielsteuerungs-Experiment
mit ipf-1 zeigte, dass der Mausembryo ohne dieses Gen im Hinblick
auf das Pankreas defektiv war (Nature 371, 606–609, 1994). Jedoch wurde das
Primordium des Pankreas auch dann ausgebildet, wenn dieses Gen defizient
war, und es wurde die Existenz Glucagon-positiver Zellen bestätigt (Development
122, 983–995,
1996). Zusätzlich
ist bekannt, dass die Zellen des vegetativen Pols der Xenopus-Blastula
sowohl XIHbox8 exprimieren, das einen Pankreas-spezifischen Transkriptionsfaktor darstellt,
sowie das Homologe von PDX-1 und IFABP, das einen Dünndarmepithelmarker
darstellt. Wenn jedoch das Signal des TGF-β-Systems an das Entoderm inhibiert
wird, so wird auch die Expression von XIHbox8 inhibiert (Development
122, 1007–1015,
1996).
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Auf
der anderen Seite ist es bekannt, dass Retinsäure ein regulatorischer Faktor
für die
embryonale Musterbildung entlang der anterior-posterioren Achse
ist (Nature 340, 140–144,
1989, Development 112, 945–958,
1991, Dev. Biol. 192, 1–16,
1997, Zool. Sci. 15, 879–886,
1998), und dass diese Retinsäure
anteriores neurales Gewebe des Xenopus-Embryos in ein posteriores
verwandelt und wirksam bei der Mesodermentwicklung ist (Genes Dev.
5, 175–187,
1991, Develop. Growth. Differ. 35, 123–128, 1993). Es ist außerdem berichtet
worden, dass die Behandlung mit Activin die meisten mesodermalen
Gewebe in den Zellen der animalen Kappe von Xenopus in einer Dosis-abhängigen Weise
induziert, wie etwa Notochord, Muskel, Mesenchym und Coelom-Epithel
(Roux's Arch. Dev.
Biol. 198, 330–335,
1990, Nature 347, 391–394,
1990, Roux's Arch.
Dev. Biol. 200, 230–233,
1991). Eine Veränderung
der Dosierung von Retinsäure
bei Co-Behandlung mit Activin erlaubt es den mesodermalen Geweben,
wie etwa Notochord, Muskel und Pronephros, die sich aus den Zellen
der animalen Kappe differenzieren, lateralisiert und posteriorisiert
zu werden (Develop. Growth. Differ. 35, 123–128, 1993).
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Was
die Wirkung von Retinsäure
auf die entodermalen Organe betrifft, so ist von Dixon et al. berichtet worden,
dass, wenn Xenopus-Embryonen im Entwicklungsstadium 22 bis 32 mit
Retinsäure
behandelt werden, die Morphologie der Verdauungsorgane, wie etwa
Därme,
Leber und Magen, anormal wird, jedoch ist auch berichtet worden,
dass das Pankreas von Xenopus-Embryonen
in den Entwicklungsstadien 22–32,
die mit Retinsäure
behandelt wurden, normal ausgebildet wird, und dass sich keine Wirkung
im Hinblick auf die Expression von XIHbox8, einem Entoderm-spezifischen
Marker, findet (Dev. Genes Evol. 208, 318–326, 1998).
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Bisher
ist eine spezifische Induktion eines spezifischen Organs in vitro
als extrem schwierig betrachtet worden, und obwohl das Pankreas
ein endokrines und exokrines Organ ist, das eine wichtige Rolle
in vivo spielt, so bleiben doch die komplexen Differenzierungs-
und Bildungsmechanismen des Pankreas unklar. Die vorliegenden Erfinder
haben berichtet, dass die Behandlung von Zellen der oberen Blastoporuslippe
der frühen Xenopus-Gastrula
mit Retinsäure
eine Pankreasbildung mit hoher Effizienz ermöglicht (Moriya, N et al.: Develop.
Growth. Differ. 42, 175–185,
2000). Jedoch verwendet dieses System Zellen der oberen Blastoporuslippe primär mit einer
autonomen Differenzierungsfähigkeit,
wodurch dieses Testsystem nach wie vor zu komplex ist, um den Mechanismus
der Pankreasdifferenzierung aufzuklären, obwohl dieses System das
Pankreas mit hoher Effizienz bilden kann. Die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht dann, ein Verfahren bereitzustellen, durch das
ein in vitro induziertes Pankreas, das es erlaubt, Erkenntnisse über die
Differenzierungs- und Bildungsmechanismen des Pankreas zu gewinnen,
und das daher nützlich
in der Entwicklungs-Technologie („Developmental Engineering") oder bei der künstlichen
Ausbildung von Organen („Organ
Engineering") ist,
ein Pankreas für
die Transplantation, wodurch bewertet werden kann, ob ein in vitro
induziertes Pankreas in der Praxis in vivo funktionieren kann oder
nicht, und ein in vitro induziertes Pankreas, das zur Entwicklung
von Diagnose und Behandlung pankreatischer Erkrankungen höherer Tiere
beiträgt,
künstlich
und effizient aus einer Gastrula unter Ausschluss der präsumtiven
Region des Pankreas induziert werden kann.
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Offenbarung der Erfindung
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Die
vorliegenden Erfinder haben eine intensive Studie durchgeführt, um
die oben genannte Zielsetzung aufzuklären, und sie haben entdeckt,
dass ein morphologisches und funktionelles Pankreas mit hoher Effizienz
in vitro auf die folgende Weise erzeugt werden kann. Eine präsumtive
ektodermale Region undifferenzierter Zellen der späten Blastula,
die naturgemäß irreguläre Epidermis,
jedoch kein Pankreas ausbildet, wenn sie in vitro kultiviert wird,
wurde aus der späten
Blastula von Xenopus ausgeschnitten, mit Activin behandelt, und
dann, nach drei bis fünf
Stunden, mit Retinsäure
behandelt. Diese Explantate werden einer stationären Kultur in Steinberg-Lösung, enthaltend BSA, unterzogen,
um dadurch das Entwicklungsschicksal in Richtung Pankreas umzukehren.
Die vorliegende Erfindung ist auf Basis dieser Erkenntnisse vollzogen
worden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft: ein Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas
in vitro, wobei ein Stück
von mutmaßlichem
Ektoderm einer Wirbeltier-Blastula oder -Gastrula in vitro mit Activin
und Retinsäure behandelt
und dann kultiviert wird, wobei die Behandlung mit Activin, gefolgt
von der Behandlung mit Retinsäure
nach einer vorbestimmten Zeitverzögerung, durchgeführt wird
und wobei die Wirbeltier-Blastula oder -Gastrula nicht menschlich
ist (Anspruch 1); das Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas
in vitro nach Anspruch 1, wobei die Behandlung mit Activin, gefolgt
von der Behandlung mit Retinsäure
nach drei bis 15 Stunden, durchgeführt wird (Anspruch 2); das
Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas in vitro nach Anspruch
1 oder Anspruch 2, wobei die Behandlung mit Activin eine stationäre Kulturbehandlung
mit Activin in einer Konzentration von 50 bis 150 ng/ml für 0,5 bis
zwei Stunden ist (Anspruch 3); das Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas
in vitro nach einem der Ansprüche
1 bis 3, wobei die Behandlung mit Retinsäure eine stationäre Kulturbehandlung
mit Retinsäure
in einer Konzentration von mehr als 10–5 M
für 0,5
bis zwei Stunden ist (Anspruch 4); das Verfahren zum Bilden von
Wirbeltier-Pankreas in vitro nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
wobei die Kultur danach eine stationäre Kulturbehandlung in einer
physiologischen Salzlösung
ist (Anspruch 5); das Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas
in vitro nach einem der Ansprüche
1 bis 5, wobei das Wirbeltier ein Tier ist, welches zu den Amphibien
gehört
(Anspruch 6); und das Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas
in vitro nach Anspruch 6, wobei das zu den Amphibien gehörende Tier
ein Xenopus ist (Anspruch 7).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Screening-Verfahren
hinsichtlich einer Substanz, die in der Lage ist, eine Unterfunktion
oder Fehlfunktion des Pankreas zu heilen, wobei das Pankreas durch
das Verfahren zum Bilden von Wirbeltier-Pankreas in vitro nach einem
der Ansprüche
1 bis 7 erhalten wird (Anspruch 8).
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Ansicht, die das Verfahren zeigt, ein Stück präsumtives Ektoderm eines Xenopus-Embryos
mit Activin und Retinsäure
zu behandeln.
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2 ist
eine Ansicht, die das Bild zeigt, das durch Lichtmikroskopie von
Geweben beobachtet wird, die in den Explantaten durch Behandlungen
verschiedener Art differenzieren.
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3 ist
eine Ansicht, die das Bild zeigt, das durch Lichtmikroskopie von
Explantaten beobachtet wird, die mit Activin und Retinsäure behandelt
wurden.
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4 ist
eine Ansicht, die die Expressionsmuster von Pankreas-spezifischen
Genen zeigt.
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5 ist
eine Ansicht, die die Immunhistochemie von Explantaten zeigt, die
mit Activin und Retinsäure behandelt
wurden.
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Beste Weise zur Durchführung der
Erfindung
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Es
gibt keine bestimmte Einschränkung
hinsichtlich des Verfahrens zur in vitro erfolgenden Bildung des
Vertebraten-Pankreas der vorliegenden Erfindung, solange es ein
Verfahren ist, bei dem ein Stück
präsumtives
Ektoderm, d. h. eine undifferenzierte Zelle der Vertebraten-Blastula,
in vitro mit Activin und Retinsäure
behandelt und dann kultiviert wird, wobei die Behandlung mit Activin
durchgeführt
wird, gefolgt von der Behandlung mit Retinsäure nach einer vorab festgelegten
zeitlichen Verzögerung,
und wobei die Vertebraten-Blastula oder -Gastrula nicht-human ist,
wodurch die Differenzierung und Induktion des Pankreas in vitro ermöglicht wird.
Neben dem in vitro induzierten Pankreas-Organ beinhaltet das Pankreas
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
der Pankreas-Bildung in vitro praktischerweise folgendes: ein Explantat
mit einer Expressionsfähigkeit
für ein
Pankreas-spezifisches molekulares Markergen, wie etwa ein Insulingen,
ein Homeoboxgen, wie etwa IPF1, PDX1 oder dergleichen, XIHbox8-Gen,
einen Pankreas-spezifischen
Transkriptionsfaktor und das Homologe von PDX1; ein Explantat mit
einer Zellmorphologie, die ähnlich
zu Pankreas in vivo ist, und ein Explantat mit einer Sekretionsdrüsenartigen
Struktur, die ähnlich
zu Pankreas in vivo ist.
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Es
gibt keine spezielle Einschränkung
für den
oben erwähnten
Vertebraten, solange es ein Vertebrat mit einem Pankreas ist, das
zu einem nicht-menschlichen Säuger,
einem Vogel, Reptil oder einer Amphibie gehört. Nichtsdestoweniger ist
es so, dass auf einer Ebene, auf der Erkenntnisse über die
Differenzierungs- und Ausbildungsmechanismen des Pankreas erhalten
werden können,
die nützlich
bei der Entwicklungs-Technologie und der künstlichen Organerzeugung sind,
ein zu den Amphibien gehörendes
Tier, das relativ leicht zu handhaben ist, und bei dem bis zum jetzigen
Zeitpunkt über
Entwicklungs-Technologie und Organerzeugung ein reiches Wissen erhalten
wurde, spezifisch ein Xenopus, in besonderer Weise als ein bevorzugter
Vertebrat beispielhaft genannt werden kann. Die Tatsache, dass das
Pankreas in vitro durch die Verwendung undifferenzierter Zellen
von Xenopus, der ein Vertebrat ist, induziert werden kann, deutet
darauf hin, dass Pankreas in vitro unter Verwendung von ES-Zellen
induziert werden kann, die undifferenzierte Zellen von Säugern, einschließlich des
Menschen, sind.
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Als
die oben genannte Blastula kann eine mittlere bis späte Blastula
bevorzugt verwendet werden, und ein spezifisches Beispiel für eine solche
mittlere bis späte
Blastula ist die eines Xenopus im Entwicklungsstadium 8 bis 10.
Das Entwicklungsstadium dieses Xenopus kann anhand des zuvor beschriebenen
Kriteriums bestimmt werden (Nieuwkoop, P.D., Faber, J., 1956. Normal
Table of Xenopus laevis. North-Holland Pub. Co. Amsterdam).
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Bei
den oben genannten Behandlungsverfahren mit Activin und Retinsäure gibt
es keine spezielle Einschränkung,
solange es ein Behandlungsverfahren ist, bei dem ein präsumtives
Ektoderm, d. h. eine undifferenzierte Zelle der Vertebraten-Blastula,
in vitro mit Activin und Retinsäure
behandelt und dann kultiviert wird, wobei die Behandlung mit Activin
durchgeführt
wird, gefolgt von der Behandlung mit Retinsäure nach einer vorab festgelegten
zeitlichen Verzögerung,
und wobei die Vertebraten-Blastula oder -Gastrula nicht-human ist, wodurch
die Differenzierung und Induktion des Pankreas ermöglicht wird.
Bei der Behandlung mit Activin, gefolgt von der Behandlung mit Retinsäure nach
einer vorab festgelegten Zeitspanne, beträgt die vorab festgelegte Zeitspanne
bevorzugt drei bis 15 Stunden später,
bevorzugter drei bis fünf
Stunden später.
Die Behandlung mit Activin, gefolgt von der Behandlung mit Retinsäure nach
einer Zeitverzögerung
von drei bis 15 Stunden, insbesondere von drei bis fünf Stunden,
ermöglicht
es dem Pankreas, mit einer viel höheren Rate induziert zu werden.
Während
der Zeitverzögerung
ist es für
ein Stück
präsumtives
Ektoderm, das mit Activin behandelt wurde, bevorzugt, dass es der
stationären
Kultur in einer physiologischen Salzlösung unterzogen wird, bevorzugter
in einer physiologischen Salzlösung,
die BSA (fetales Rinderserum) enthält.
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Als
ein spezifisches Beispiel der Behandlung mit Activin kann eine stationäre Kulturbehandlung
mit Activin für
0,5 bis zwei Stunden bei einer Konzentration von 50 bis 150 ng/ml,
bevorzugt von 80 bis 120 ng/ml, angegeben werden. Weiterhin kann
als ein spezifisches Beispiel für
ein Behandlungsverfahren mit Retinsäure eine stationäre Kulturbehandlung
mit Retinsäure
für 0,5
bis zwei Stunden bei einer Konzentration von über 10–5 M,
bevorzugt von 10–4 M bis 10–3 M,
angegeben werden. Da Retinsäure
nicht wasserlöslich
ist, ist es bevorzugt, die Säure
zu verwenden, indem man diese zuerst mit Ethanol, Dimethylsulfoxid
(DMSO) und dergleichen löst und
dann mit physiologischer Salzlösung
verdünnt.
Zusätzlich
kann die Kultur bei der vorliegenden Erfindung nach der Behandlung
mit Aktivin und Retinsäure
durchgeführt
werden. Als spezifisches Beispiel der Kultur nach dieser Behandlung
kann eine stationäre
Kultur in einer physiologischen Salzlösung, bevorzugt in einer physiologischen
Salzlösung,
die BSA (fetales Rinderserum) enthält, für fünf bis 20 Stunden, bevorzugt
für acht bis
12 Stunden, durchgeführt
werden.
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Es
gibt keine bestimmte Einschränkung
hinsichtlich des in vitro induzierten Pankreas der vorliegenden Erfindung,
solange dieses durch das oben genannte Verfahren der Pankreas-Bildung in vitro
erhalten werden kann. Wie oben in Bezug genommen, sind außer dem
in vitro induzierten Pankreas-Organ ein Explantat mit einer Expressionsfähigkeit
für ein
Pankreas-spezifisches
molekulares Markergen, ein Explantat mit einer Zellmorphologie,
die ähnlich
zu Pankreas in vivo ist, und ein Explantat mit einer Sekretionsdrüsen-artigen
Struktur, die ähnlich
zu Pankreas in vivo ist, ebenfalls einbezogen. Weiterhin gibt es
im Bezug auf das Screening-Verfahren
der vorliegenden Erfindung keine spezielle Einschränkung, solange
es ein Screening-Verfahren
für eine Substanz
ist, die nützlich
für die
Diagnose, Behandlung oder dergleichen ist, wobei Pankreas verwendet
wird, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung in vitro
erhalten wurde, wie etwa eine Substanz, die befähigt ist zum Heilen einer Unterfunktion
oder Fehlfunktion des Pankreas, eine Substanz, die befähigt ist
zum Detektieren einer Unterfunktion oder Fehlfunktion des Pankreas,
und dergleichen. Das Screening nach einer Substanz, die die Funktion
des Pankreas verstärkt
oder supprimiert, kann z. B. durchgeführt werden, indem man eine
Testsubstanz in pankreatische Zellen eines in vitro induzierten,
durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Pankreas injiziert und
die Expressionsfähigkeit
von Markermolekülen,
wie etwa Insulin oder dergleichen, mit denen von Kontrollen vergleicht.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten in größerem Detail anhand der Beispiele
beschrieben, jedoch ist der technische Schutzumfang der Erfindung
nicht auf diese Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1. (Herstellung eines präsumtiven
Ektoderm-Teilstücks
einer späten
Xenopus-Blastula)
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Bei
den dorsalen Lymphsäcken
adulter männlicher
und weiblicher Xenopus laevis wurden jeweils Injektionen mit 600
IU an hCG (humanes Chorion-Gonadotropin; Gestron; Denka Seiyaku,
Japan) appliziert, und es wurden befruchtete Eier erhalten, indem
man diese Xenopuse miteinander verpaarte. Diese späten Blastulae
(Entwicklungsstadium 9) wurden in Steinberg-Lösung (SS: 58,00 mM NaCl, 0,67
mM KCl, 0,34 mM Ca(NO3)2,
0,83 mM MgSO4, 3,00 mM HEPES und 100 mg/l
Kanamycinsulfat; pH 7,4), enthaltend 4,5% Cystein-Hydrochlorid (pH
7,8), von ihrer Gelhülle
befreit, und dann wurden die Vitellinmembranen in der Steinberg-Lösung unter
Verwendung eines Paars von Uhrmacher-Pinzetten entfernt. Der so
erhaltene präsumtive Ektodermteil
der späten
Xenopus-Blastula wurde unter Verwendung einer Wolframnadel in eine
Größe von 0,4 mm × 0,4 mm
zerteilt.
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Beispiel 2 (Gewebe, die durch die simultane
Behandlung der Stücke
von präsumtivem
Ektoderm mit Activin/Retinsäure
für eine
Stunde ausdifferenzieren)
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Humanes
rekombinantes Activin A (Ajinomoto Co., Inc.) wurde in Steinberg-Lösung, enthaltend
0,1% Rinderserum-Albumin (BSA), mit einer Konzentration von 100
ng/ml gelöst,
und es wurde eine Activin-Lösung vorbereitet.
All-trans-Retinsäure-Pulver
(CAT#R2625, Sigma) wurde zunächst
in Ethanol bis auf eine Konzentration von 10–2 M
gelöst,
und diese Ethanollösung
wurde, wenn die Stücke
des präsumtiven
Ektoderms behandelt wurden, in der oben genannten Activin-Lösung verdünnt, und
zwar auf jede der in Tabelle 1 angezeigten Konzentrationen, um jede
der gemischten Lösungen
aus Activin/Retinsäure
herzustellen, und diese wurden im unten beschriebenen Versuch verwendet.
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Die
Stücke
an präsumtivem
Ektoderm, die in Beispiel 1 ausgeschnitten wurden, wurden behandelt,
indem man sie für
eine Stunde in einer gemischten Lösung aus Activin/Retinsäure, hergestellt
wie oben beschrieben, ruhen ließ,
gefolgt von zweimaligem Waschen mit Steinberg-Lösung,
enthaltend 0,1% BSA, wonach man die Stücke in der gleichen Lösung für zehn Tage
bei 20°C
kultivierte (siehe temporäre
Behandlung in
1). Die kultivierten Explantate
wurden mit Bouin-Lösung
fixiert, gefolgt von einer Entwässerungsbehandlung
mit einer Ethanol- und Xylen-Reihe,
und diese Explantate wurden dann in Paraffin eingebettet und in
6 μm-Schnitte
geschnitten. Diese Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt, und
die Gewebe, die differenzierten, wurden unter einem Lichtmikroskop
betrachtet und untersucht. Weiterhin wurden die unbehandelten Stücke an präsumtivem
Ektoderm ebenfalls in derselben Weise unter Verwendung eines Lichtmikroskops
beobachtet und untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
| Behandlungszeit
[h] | 1 |
| Konzentration
an Activin [ng/ml] | 100 |
| Konzentration
an Retinsäure
[M] | 0 | 10–7 | 10–6 | 10–5 | 10–4 |
| Anzahl
der Proben | 31 | 29 | 33 | 30 | 31 |
| Atypische
Epidermis | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Epidermis | 30
(97) | 25
(86) | 28
(85) | 26
(87) | 25
(81) |
| Neuralgewebe | 12
(39) | 12
(41) | 15
(45) | 10
(33) | 5
(16) |
| Notochord | 4
(13) | 2
(7) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Muskel | 25
(81) | 26
(90) | 18
(55) | 6
(20) | 1
(3) |
| Pronephrostubulus | 7
(23) | 6
(21) | 11
(33) | 20
(67) | 19
(61) |
| Mesenchym | 31
(100) | 26
(90) | 28
(85) | 24
(80) | 23
(74) |
| Coelom-Epithel | 15
(48) | 16
(55) | 21
(64) | 20
(67) | 23
(74) |
| Knorpel | 5
(16) | 7
(24) | 3
(9) | 1
(3) | 0
(0) |
| Pharynx-Epithel | 12
(39) | 18
(62) | 23
(70) | 19
(63) | 23
(74) |
| Darmepithel | 0
(0) | 0
(0) | 2
(6) | 5
(17) | 7
(23) |
| Pankreas | 0
(0) | 1
(3) | 0
(0) | 2
(7) | 5
(16) |
| Dotterreiche
Zelle | 18
(58) | 20
(69) | 24
(73) | 16
(53) | 14
(45) |
| Die Zahlen
in Klammem zeigen die Prozentsätze
an. |
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Die
oben gezeigten Ergebnisse offenbarten, dass die unbehandelten Stücke des
präsumtiven
Ektoderms vier Tage nach dem Beginn der Kultur atypische Epidermis
ausbildeten (siehe 2A). Weiterhin,
wenn die Stücke
des präsumtiven
Ektoderms nur mit Activin (100 ng/ml) behandelt wurden, so differenzierten
sich dorsal-mesodermale und anterior-entodermale Gewebe, wie etwa
Notochord, Muskel, Pharynx-Epithel und dergleichen. Neurale Gewebe,
für die
gemutmaßt
wird, dass sie sekundär
durch das dorsale Mesoderm induziert wurden, wurden ebenfalls teilweise
detektiert (siehe Tabelle 1 und 2B).
Bei der Behandlung mit gemischten Lösungen von Activin/Retinsäure wurde
herausgefunden, dass, wenn die Konzentration an Retinsäure gesteigert
wurde, die Bildungsrate an Notochord, gefolgt von der Bildungsrate
an Muskel, abnahm (Tabelle 1). Derweil nahm die Bildungsrate an
Pronephrostubulus zu und erreichte die maximale Rate, wenn die Konzentration
an Retinsäure
10–5 bis
10–4 M
betrug (mehr als 60%). Weiterhin, wenn die Konzentration an Retinsäure gesteigert
wurde, so wurde die Differenzierung des Darmepithels etwas gefördert (23%
bei 10–4 M). Was
die Bildung des Pankreas betrifft, so wurde Differenzierung detektiert,
wenn die Konzentration an Retinsäure
hoch war, jedoch betrug ihr Mengenverhältnis nur 16% (bei 10–4 M).
Wie gerade beschrieben, veränderte sich
das Differenzierungsmuster der mesodermalen Gewebe aufgrund der
Wirkung der Konzentration der Retinsäure stark, wenn Retinsäure zu Activin
hinzugegeben wurde, jedoch zeigten sich kaum Veränderungen beim Differenzierungsmuster
entodermaler Gewebe. Es ist zu beachten, dass in 2B „not" Notochord darstellt
und „neu" Neuralgewebe darstellt.
Der Größenbalken
entspricht 100 μm.
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Referenzbeispiel 1 (Gewebe, die durch
simultane und kontinuierliche Behandlung der Stücke des präsumtiven Ektoderms mit Activin/Retinsäure differenzieren)
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Auf
Basis der Ergebnisse aus Beispiel 2, da die Wirkung der Retinsäurebehandlung
im Differenzierungsmuster der mesodermalen Gewebe zu finden war,
kann geschlussfolgert werden, dass Retinsäure in der Zeitspanne wirkte,
als das Schicksal des Mesoderms in jedem der mesodermalen Gewebe
(Notochord, Muskel, Pronephrostubulus und dergleichen als Beispiele)
determiniert wurde. Im Gegensatz dazu ist berichtet worden, dass
bei der normalen Entwicklung jedes entodermale Gewebe im Vergleich
zur Bildung jedes mesodermalen Gewebes später ausgebildet wird (Nieuwkoop,
P.D. und Faber, J.; (1956) Normal table of Xenopus laevis (Daudin)
(Amsterdam: North-Holland Publishing Company). Es kann folglich
angenommen werden, dass die Determinierung der Differenzierung für jedes
entodermale Gewebe im Vergleich zur Determinierung jedes mesodermalen
Gewebes in einer späteren
Phase erfolgt. Jedoch kann diese Phase nicht exakt in vitro spezifiziert
werden. Folglich, um die Wirkung zu eliminieren, die durch die Behandlungszeit
und den -Zeitpunkt bewirkt wird, wurde eine kontinuierliche Behandlung
mit einer gemischten Lösung
von Activin/Retinsäure
wie folgt durchgeführt.
Die Stücke
des präsumtiven
Ektoderms, die in Beispiel 1 ausgeschnitten wurden, wurden in der
gemischten Lösung
von Activin/Retinsäure,
die gemäß obiger
Beschreibung hergestellt wurde, bei 20°C für 10 Tage kultiviert (siehe
kontinuierliche Behandlung in
1). Diese
Explantate, die kultiviert wurden, wurden in derselben Weise wie
in Beispiel 2 angefärbt,
und die Gewebe, die differenzierten, wurden beobachtet und unter
Verwendung eines Lichtmikroskops untersucht. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
| Konzentration
an Activin [ng/ml] | 100 |
| Konzentration
an Retinsäure
[M] | 0 | 10–9 | 10–8 | 10–7 | 10–6 | 10–5 |
| Anzahl
der Proben | 10 | 11 | 10 | 12 | 11 | 10 |
| Atypische
Epidermis | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Epidermis | 9
(90) | 11
(100) | 10
(100) | 10
(83) | 10
(91) | 5
(50) |
| Neuralgewebe | 10
(100) | 8
(73) | 3
(30) | 7
(58) | 7
(64) | 0
(0) |
| Notochord | 3
(30) | 3
(27) | 1
(10) | 2
(17) | 0
(0) | 0
(0) |
| Muskel | 10
(100) | 11
(100) | 9
(90) | 10
(83) | 9
(82) | 2
(20) |
| Pronephrostubulus | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 7
(64) | 5
(50) |
| Mesenchym | 9
(90) | 11
(100) | 10
(100) | 11
(92) | 11
(100) | 9
(90) |
| Coelom-Epithel | 4
(40) | 2
(18) | 3
(30) | 5
(42) | 8
(73) | 7
(70) |
| Knorpel | 1
(10) | 1
(9) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Pharynx-Epithel | 5
(50) | 7
(64) | 8
(80) | 9
(75) | 9
(82) | 9
(90) |
| Darmepithel | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 2
(20) |
| Pankreas | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Dotterreiche
Zelle | 5
(50) | 3
(27) | 4
(40) | 7
(58) | 4
(36) | 9
(90) |
| Die Zahlen
in Klammem zeigen die Prozentsätze
an. |
-
Wie
aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, nahm die Bildungsrate
von Notochord und Muskeln ab, und die Bildungsrate von Pronephrostubulus
nahm zu, wenn die Konzentration an Retinsäure zunahm, wobei dies bei
der kontinuierlichen Behandlung mit der gemischten Lösung von
Activin/Retinsäure
(Tabelle 2) in der gleichen Weise der Fall war wie bei der Behandlung
für eine
Stunde. Bei einer Retinsäurekonzentration
von 10–5 M
wurde die Ausbildung von Pharynx-Epithel mit einer niedrigen Rate
(20%) detektiert, jedoch fand keine Differenzierung von Pankreas
statt. Es wurde weiterhin entdeckt, dass bei der Behandlung mit Retinsäure bei
einer Konzentration von 10–4 M alle Explantate
während
des Kulturzeitraums abstarben. Mittlerweile ist von den vorliegenden
Erfindern berichtet worden, dass, wenn eine obere Blastoporuslippe
einer frühen
Gastrula ausgeschnitten wird und dann mit Retinsäure für ein bis drei Stunden behandelt
wird, das vorab festgelegte Schicksal der Zellen verändert und
Pankreas gebildet wird (Moriya, N et al.; Develop. Growth. Differ.
42, 175–185,
2000). In diesem Fall ist es zum Zeitpunkt, an dem die Behandlung
mit Retinsäure
beginnt, so, dass die obere Blastoporuslippe bereits auf dorsales
Mesoderm/anteriores Entoderm hin ausgerichtet ist. Wenn jedoch das
Stück des
präsumtiven
Ektoderms in der oben beschriebenen Weise behandelt wird, würde es gleichzeitig
durch die Wirkung einer hohen Konzentration von Activin (Induktion
zu dorsalem Mesoderm/anteriorem Entoderm") und durch die Wirkung von Retinsäure beeinflusst.
In einem solchen Fall wird angenommen, dass die präsumtiven
ektodermalen Zellen nicht zu einem dorsalen Mesoderm/anterioren
Entoderm werden können
und dass laterales Mesoderm induziert wird (Moriya, N. et al.; Develop.
Growth. Differ. 35, 123–128,
1993). Weiterhin gibt es die Möglichkeit,
dass die Pankreas-induktive Wirkung von Retinsäure nur bei Zellen wirksam
ist, die bereits in Richtung dorsales Mesoderm/anteriores Entoderm
geleitet wurden.
-
Beispiel 3 (Gewebe, die durch die mit
Zeitverzögerung
erfolgende Behandlung der Stücke
des präsumtiven Ektoderms
mit Activin/Retinsäure
differenzieren)
-
Es
wurde eine Zeitverzögerung
zwischen der Behandlung mit Activin und der Behandlung mit Retinsäure bereitgestellt,
sodass die Wirkung von Retinsäure
zum ersten Mal empfangen werden kann, nachdem die Differenzierung
zu dorsalem Mesoderm/anteriorem Entoderm durch die Wirkung von Activin
festgelegt wurde. Die Stücke
von präsumtivem
Ektoderm, die in Beispiel 1 ausgeschnitten worden waren, wurden
für eine Stunde
in einer Lösung
mit 100 ng/ml an Activin belassen, zweimal mit Steinberg-Lösung, enthaltend
0,1% BSA, gewaschen und dann in Steinberg-Lösung mit 0,1% BSA nur jeweils
für die
Zeitverzögerung
belassen, die in Tabelle 3 angegeben ist. Nach dem Verstreichen
der Zeitverzögerungspanne
wurden die Stücke
des präsumtiven
Ektoderms für
eine Stunde in Retinsäurelösung mit
10
–4 M
belassen, zweimal mit Steinberg-Lösung mit
0,1% BSA gewaschen und dann in Steinberg-Lösung mit 0,1% BSA für zehn Tage
bei 20°C
kultiviert (siehe zeitverzögerte
Behandlung in
1). Diese Explantate, die kultiviert worden
waren, wurden in derselben Weise angefärbt wie in Beispiel 2, und
die Gewebe, die differenzierten, wurden unter einem Lichtmikroskop
beobachtet und untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
| Behandlungsdauer
mit Activin [h] | 1 | 1b) |
| Zeitverzögerung [h] | - a) | 0 | 3 | | 5 | 15 | 25 | - |
| Behandlungsdauer
mit Retinsäure
[h] | 1 | - |
| Anzahl
der Proben | 59 | 65 | 31 | | 35 | 38 | 33 | 65 |
| Atypische
Epidermis | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) |
| Epidermis | 45
(76) | 48
(74) | 13
(42) | | 18
(51) | 28
(74) | 29
(88) | 59
(91) |
| Neuralgewebe | 5
(8) | 0
(0) | 0
(0) | | 0
(0) | 1
(3) | 1
(3) | 32
(49) |
| Notochord | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | | 2
(6) | 5
(13) | 17
(52) | 34
(52) |
| Muskel | 3
(5) | 8
(12) | 12
(39) | | 8
(23) | 23
(61) | 16
(48) | 37
(57) |
| Pronephrostubulus | 38
(64) | 39
(60) | 10
(32) | | 4
(11) | 2
(5) | 0
(0) | 5
(8) |
| Mesenchym | 47
(80) | 53
(82) | 27
(87) | | 30
(86) | 38 (100) | 32
(97) | 59
(91) |
| Coelom-Epithel | 40
(68) | 38
(58) | 22
(71) | | 15
(43) | 28
(74) | 19
(58) | 28
(43) |
| Knorpel | 0
(0) | 1
(2) | 0
(0) | | 0
(0) | 0
(0) | 0
(0) | 12
(18) |
| Pharynx-Epithel | 50
(85) | 59
(91) | 30
(97) | | 27
(77) | 32
(84) | 29
(88) | 37
(57) |
| Darmepithel | 11
(19) | 24
(37) | 19
(61) | | 29
(83) | 9
(24) | 3
(9) | 3
(5) |
| Pankreas | 20
(34) | 27
(42) | 25
(81) | | 29
(83) | 8
(21) | 1
(3) | 0
(0) |
| Dotterreiche
Zelle | 37
(63) | 37
(57) | 29
(94) | | 23
(66) | 18
(47) | 18
(55) | 29
(45) |
| Die Zahlen
in Klammem zeigen die Prozentsätze.
a)
Simultane Behandlung mit Activin/Retinsäure
b) Behandlung mit
Activin alleine |
-
Wie
aus den oben gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, differenzierten
die Pronephrostubuli mit hoher Effizienz, wenn eine gleichzeitige
Behandlung mit Activin (100 ng/ml) und Retinsäure (10–4 M)
erfolgte oder wenn mit einer Zeitverzögerung von 0 Stunden behandelt
wurde (d. h. die Behandlung mit Retinsäure unmittelbar nach der Behandlung
mit Activin erfolgte) (siehe Tabelle 3 und 2C).
Es wurde entdeckt, dass bei einer Zeitverzögerung von drei bis fünf Stunden
die Bildungsrate von Pronephrostubuli gering war, und dass die Bildungsrate
von Pankreas mit über
80% am höchsten
war (siehe Tabelle 3, 2D). Es wurde
herausgefunden, dass Notochord und Pharynx-Epithel mit einer zeitlichen
Verzögerung
von mehr als 15 Stunden differen zieren (siehe Tabelle 3, 2E). Jedoch war die Bildungsrate des Pankreas
bei einer zeitlichen Verzögerung
von weniger als drei Stunden oder mehr als 15 Stunden gering (Tabelle
3). Die Betrachtung durch das Lichtmikroskop zeigte, dass sich zwei
oder mehr Zellen ansammelten, um eine Sekretionsdrüsen (Acinus)-artige
Struktur in dem Pankreas mit einer Zeitverzögerung von drei bis fünf Stunden
anzuzeigen, und Zellen mit einem klaren lumenartigen Raum im Zentrum
fanden sich unter diesen Zellgruppen. Es wurde weiterhin entdeckt,
dass diese Pankreata ähnlich
zu Pankreas von normalem Embryo waren, da der Nukleus dieser Pankreata
an der basalen Seite des Acinus positioniert war, die Nachbarschaft
des Zentrums des Acinus gut mit Eosin angefärbt wurde und ein „Racemose-Zellaggregat" ausgebildet wurde
(2D).
-
Basierend
auf diesen Erkenntnissen, legt die Tatsache, dass die Differenzierung
zu Pankreas erfolgt, indem man eine Zeitverzögerung bereitstellt, nahe,
dass es für
die präsumtiven
ektodermalen Zellen, die gerade durch Activin in Richtung dorsales
Mesoderm/anteriores Entoderm geleitet wurden, drei bis fünf Stunden dauert,
um die gesamte Präparation
für die
Erlangung der Pankreas-induktiven Wirkung von Retinsäure wirksam
zu machen. Es kann angenommen werden, dass die Wirkung von Retinsäure vor
dieser Zeitspanne die Determinierung von mesodermalen Geweben beeinflussen
würde,
die gerade erfolgt, und dass die Determinierung von entodermalen
Geweben nach dieser Zeitspanne abgeschlossen sein würde. Daher
wird angenommen, dass die Pronephrostubuli bei der Behandlung mit
einer Zeitverzögerung
von ein bis drei Stunden induziert wurden, dass das Pankreas mit
einer Zeitverzögerung
von drei bis fünf
Stunden induziert wurde, und dass Notochord und Pharynx-Epithel
mit einer Zeitverzögerung
von mehr als fünf
Stunden in derselben Weise gebildet wurden, als wenn keine Behandlung
mit Retinsäure
erfolgt wäre.
Es ist zu beachten, dass in 2C, 2D und 2E „not" Notochord repräsentiert, „neu" Neuralgewebe repräsentiert, „pro" Pronephrostubulus repräsentiert, „pan" Pankreas repräsentiert, „int" Darmepithel (Intestinalepithel)
repräsentiert
und „pha" Pharynx-Epithel
repräsentiert.
Der Größenbalken
entspricht 100 μm.
-
Des
weiteren zeigte die Beobachtung durch Lichtmikroskopie, dass das
Pankreas, die in den oben genannten Explantaten differenzierte,
von Darmepithel umgeben ist, das sich verdickt hat. Das entodermale
Epithel setzt sich in einem normalen Embryo vom Mund bis hin zum
Anus fort, und seine Morphologie verändert sich kontinuierlich.
Der Pharynx und der Dann sind beide entodermale Epithelien, jedoch
ist es bekannt, bzw. wird im Pharynx-Epithel gezeigt, dass die Höhe der Zellen
niedrig ist, und eine Morphologie besteht, bei der würfelförmige Zellen
in Reihe angeordnet sind, während
es im Darmepithel so ist, dass die Höhe der Zellen groß ist, und
das Epithel aus großen,
in Reihe angeordneten Zellen zusammengesetzt ist (Chalmers, A.D.
und Slack, J.M.W.; Dev. Dyn. 212, 509–521, 1998). Basierend auf
der Dicke des Epithels als einem Kriterium, wurden diejenigen mit
einem „Höhe/Breite-Verhältnis" der Zellen von weniger
als drei als „Pharynx-Epithel" klassifiziert, und
diejenigen mit einem Verhältnis
von größer als
drei wurden als „Darmepithel" gezählt. Es
ist entdeckt worden, dass Retinsäure
die Ausbildung von Pharynx-Epithel
unterdrückt,
das durch die Behandlung mit Activin induziert wurde, und dass Pankreas
und Darm induziert werden, wenn eine Zeitverzögerung von fünf Stunden
zwischen der Behandlung mit Activin und der Behandlung mit Retinsäure bereitgestellt
wird. Es ist bekannt, dass beim normalen Embryo und beim adulten
Körper
von Xenopus der Pharynx im anterioren Bereich des Embryos positioniert
ist, Pankreas und Zwölffingerdarm
im hinteren Teil des Pharynx in Nachbarschaft zueinander vorliegen,
und dass das Pankreas mit dem Zwölffingerdarm
verbunden ist, um Verdauungsenzym zu sekretieren.
-
Es
ist aus vorherigen Beschreibungen bekannt, dass frühe Xenopus-Embryonen
Kopfdefiziente Embryonen wurden, wenn sie mit Retinsäure behandelt
wurden (Durston, A. J. et al.; Nature 340, 140–144, 1989), dass Retinsäure den
anterioren molekularen Marker unterdrückt und den posterioren Marker
induziert (Ruizi Altaba, A. und Jessell, T.; Development 112, 945–958, 1991,
Ruizi Altaba, A. und Jessell, T.; Genes. Dev. 5, 175–187, 1991,
Lopez, S. L. und Carrasco, A. E.; Mech. Dev. 36, 153–164, 1992,
Kolm, P. J. et al.; Dev. Biol. 192, 1–6, 1997), und dass Retinsäure und
ihr Rezeptor im posterioren Teil des Embryos lokalisiert sind (Ellinger-Ziegelbauer,
H. und Dreyer, C.; Genes. Dev. 5, 94–104, 1991, Chen, Y. et al.;
Dev. Biol. 161, 70–76,
1994). Aufgrund dieser Erkenntnisse kann angenommen werden, dass
das durch eine hohe Konzentration von Activin induzierte anteriore
Entoderm (das zu Pharynx differenziert, wenn anschließend nichts
unternommen wird), durch Retinsäure
posteriorisiert wurde, und dass Pankreas und Darmepithel gebildet
wurden. in der Tabelle scheint die Bildungsrate an Pharynx-Epithel
hoch zu sein, auch wenn mit einer hohen Konzentration an Retinsäure behandelt
wurde, zumal die Fälle,
bei denen nur wenig an Pharynx-Epithel in den Explantaten gefunden wurde,
auch mitgezählt
wurden. Bei der tatsächlichen
Beobachtung der Gewebe wurde sehr viel mehr an Darmepithel als coexistent
mit Pankreas und differenzierend gefunden, als es bei Pharynx-Epithel
der Fall war (2D).
-
Darüber hinaus
gab es einen Bericht bezüglich
der Wirkung von Retinsäure
auf das Entoderm des Xenopus-Embryos (Zeynali, B. und Dixon, K.
E.; Dev. Genes. Evol. 208, 318–326,
1998). Der Xenopus-Embryo wurde mit Retinsäure behandelt, und die Ausbildung
des Gastrointestinaltrakts wurde danach bewertet; dabei fand sich
eine Abnormität
bei der Morphologie des Gastrointestinaltrakts, jedoch wurde die
Ausbildung des Pankreas als normal ermittelt. Es kann geschlussfolgert
werden, dass der Grund, warum die Retinsäure die Bildung des Pankreas
hier nicht beeinflusst, dann besteht, dass die Behandlung erst im
Entwicklungsstadium 22 bis 32 durchgeführt wurde und die Wirkung auf
den gesamten Embryo berücksichtigt
wurde. Die vorliegenden Erfinder führten eine Retinsäurebehandlung
an vollständigen
Embryonen von der Zeitspanne der Blastula bis hin zur Gastrula durch.
Diese Embryonen wurden Kopf-defiziente Embryonen, jedoch wurde die
Defizienz und Hypertrophie, die für entodermale Organe spezifisch
ist, nicht gefunden, und Pankreas wurde in vivo nicht spezifisch
induziert. Jedoch war die physische Beziehung jedes der entodermalen
Organe anormal, und die entodermalen Organe wurden in der anterioren
und posterioren Achsenrichtung in angehäufter Weise gebildet. Basierend
auf diesen Tatsachen kann geschlussfolgert werden, dass Retinsäure nicht
die Wirkung besitzt, Pankreas in spezifischer Weise zu induzieren,
sondern die Differenzierung des Pankreas durch die Wirkung einer
Posteriorisierung der entodermalen Zellen induzierte.
-
Zweitens
wurden die Stücke
des präsumtiven
Ektoderms, die in Beispiel 1 herausgeschnitten worden waren, in
derselben Weise behandelt, wie oben beschrieben, mit einer Zeitverzögerung von
fünf Stunden,
und das Explantat, das für
10 Tage bei 20°C
kultiviert wurde, wurde in Puffer I (3% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd,
0,1 M Cacodylat; pH 7,4) für
einen Tag vorfixiert. Dieses Explantat, das fixiert wurde, wurde
mit Puffer I gewaschen, für
zwei Stunden mit Puffer II (1% OsO4, 0,1
M Cacodylat; pH 7,4) fixiert, mit Puffer II gewaschen, dann mit
einer Ethanol- und Acetonreihe entwässert und in Epoxyharz eingebettet.
Dieses Explantat, das eingebettet wurde, wurde in dünne Scheibchen
geschnitten, mit Uranylacetat und Bleicitrat doppelt angefärbt und dann
unter einem Transmissionselektronenmikroskop (JEM-2000X; JOEL) betrachtet
(siehe 3). Als Ergebnis wurde in den Explantaten eine
exokrine Drüsen-artige
Struktur gefunden, in der sich verschiedene Zellen ansammelten.
Im Zentrum dieser Zellgruppen befand sich ein Raum, der wie ein
Lumen aussah (3A), und an der entgegengesetzten
Seite des Raums, d. h. an der basalen Seite der acinösen Zelle,
wurde der Nukleus gefunden, und viele elektronendichte sekretorische
Granula (0,2 bis 1,0 μm
im Durchmesser) existierten in den Zellen an der Seite dieses Raums.
Es wurde aufgedeckt, dass diese Strukturen sehr ähnlich zu der exokrinen Drüse und den
exokrinen Granula des Pankreas normaler Embryonen sind (Lozano,
M.T. et al.; Gen. Corp. Endocrinol. 114, 191–205, 1999). Zusätzlich wurden
Zellen bestätigt,
die zwei Typen abweichender sekretorischer Granula neben den vorstehend
genannten beinhalten. Eine war eine Zelle, die elektronendichte sekretorische
Granula (0,1 bis 0,3 μm
Durchmesser) beinhaltet, wobei diese ähnlich zu der Glucagon-produzierenden
Zelle der pankreatischen Langerhansinsel war (Leone, F. et al.;
L. Embryol. Exp. Morph. 36, 711–724,
1976, Lozano, M. T. et al.; Gen. Comp. Endocrinol. 114, 191–205, 1999)
(3B). Die andere wurde als eine Zelle
ermittelt, die einen elektronendichten Kern in dem sekretorischen
Granulum (0,2 bis 1,0 μm Durchmesser)
enthielt und die ähnlich
zu einer Insulin-produzierenden Zelle war (Leone, F. et al.; L.
Embryol. Exp. Morph. 36, 711–724,
1976, Lozano, M. T. et al.; Gen. Corp. Endocrinol. 114, 191–205, 1999)
(3C). Die Größenbalken in 3A, 3B und 3C entsprechen
5, 1 bzw. 1 μm. „lu" entspricht Lumen,
der Pfeil in 3A repräsentiert
ein exokrines Granulum, der Pfeil in 3B repräsentiert
das Glucagon-produzierende zellartige sekretorische Granulum, und
der Pfeil in 3C repräsentiert
das Insulin-produzierende zellartige sekretorische Granulum.
-
Beispiel 4 (Expression pankreasspezifischer
Gene)
-
Die
Stücke
an präsumtivem
Ektoderm, die in Beispiel 1 ausgeschnitten wurden, wurden in derselben Weise
behandelt wie in Beispiel 3, mit einer Zeitverzögerung von fünf Stunden,
sie wurden für
drei Tage bei 20°C
kultiviert, und die Expression von Insulin, das ein pankreasspezifisches
Gen ist, (Henry, G. L. et al.; Development 122, 1007–1015, 1996)
und XIHbox8 (Lemaire, P. et al.; Development 125, 2371–2380, 1998)
wurden durch ein zuvor beschriebenes Verfahren (Yokota, C. et al.;
J. Biochem. 123, 339–346,
1998) untersucht. Eine mRNA wurde aus dem Explantat, das kultiviert
worden war, extrahiert, und cDNA wurde unter Verwendung einer reversen
Transkriptase (GIBCO BRL) synthetisiert. Ein μl der cDNA (2 μg/μl), die erhalten
worden war, wurde der PCR unterzogen, und die Expressionsmuster
von Insulin, welches ein pankreasspezifisches Gen ist, und von XIHbox8
(Homologes von PDX1) wurden untersucht. EF-1α (Elongationsfaktor 1a) wurde
als eine Beladungskontrolle verwendet. Die Kombination der Primer
jedes Gens bei der PCR-Reaktion, die verwendet wurden, war wie folgt:
Insulin [Insulin-F: 5'-ATGGCTCTATGGATGCAGTG-3' (Seq. ID No. 1),
Insulin-R: 5'-AGAGAACATGTGCTGTGGCA-3' (Seq. ID No. 2)], XIHbox8 [XIHbox8-F:
5'-CCTACAGCAACCCCTTGGTA-3' (Seq. ID No. 3),
XIHbox8-R: 5'-GGGCTCTTGTGTAGGCTGTC-3' (Seq. ID No. 4)],
EF-1α [EF-1α-F: 5'-TTGCCACACTGCTCACATTGCTTGC-3' (Seq. ID No. 5),
und EF-1α-R:
5'-ATCCTGCTGCCTTCTTTTCCACTGC-3' (Seq. ID No. 6)].
-
Sechsundsiebzig μl an DDW,
10 μl an
10 × Ex-Puffer,
8 μl an
2,5 mM dNTPs (Gemisch), 0,5 μl
an 5U/μl ExTaq
und 0,5 μl
an 100 μM
von jedem der oben genannten Primer wurden zu 5 μl der oben genannten cDNA (20
ng/μl) hinzugegeben,
und die PCR-Reaktion wurde mit einer Gesamtmenge von 100 μl durchgeführt. Das Thermocycler-Programm,
das aus einem Zyklus, bestehend aus Denaturierung für 4 Minuten
bei 94°C
nur beim ersten Mal, gefolgt von der thermischen Denaturierung für 30 Sekunden
bei 94°C,
Verlängerung
für eine Minute
bei 58°C
und dann Annealing (Hybridisierung) für eine Minute bei 72°C bestand,
wurde 23- bis 30-mal wiederholt. Abschließend wurde eine Hybridisierung
für neun
Minuten bei 72°C
durchgeführt.
Nach der PCR wurde das Amplifikationsprodukt mittels Agarosegel
(1,5%)-Elektrophorese isoliert, und es wurde mittels Southern-Hybridisierung
detektiert (4). Als eine Negativkontrolle
wurde EF-1α verwendet,
wobei die RT-PCR unter einer Bedingung durchgeführt wurde, bei der der Faktor
für die
reverse Transkription eliminiert worden war.
-
Anhand
des Ergebnisses der oben beschriebenen 4 kann gesagt
werden, dass die Expression dieser Gene nicht bei den unbehandelten
Explantaten und bei den alleine mit Retinsäure behandelten Explantaten
zu finden war (Spuren 1 und 3 von 4), und
ihre Expression wurde bei den Explantaten, die mit Activin alleine
behandelt worden waren, nur ein wenig indu ziert (Spur 2 von 4).
Jedoch wurde aufgedeckt, dass die Explantate, die gleichzeitig mit
Activin und Retinsäure
behandelt worden waren, diese Gene exprimierten (Spur 4 von 4),
und dass diejenigen, die mit Activin und, mit einer Zeitverzögerung von
fünf Stunden,
mit Retinsäure
behandelt worden waren, eine höhere
Expression zeigten (Spur 5 von 4). Darüber hinaus
war es im Bezug auf diejenigen, die mit Activin und Retinsäure mit
einer Zeitverzögerung
von 25 Stunden behandelt worden waren, so, dass ihre Expression
im Vergleich geringer war als in dem Fall, bei dem eine Zeitverzögerung von
fünf Stunden
vorlag (Spur 6 von 4). Basierend auf diesen Ergebnissen
wurde herausgefunden, dass es nur eine geringe Wahrscheinlichkeit
gibt, dass sich Pankreas in spezifischer Weise differenziert, wenn
eine Behandlung alleine mit Activin erfolgt, und dass Pankreas durch
die Behandlung mit Activin und Retinsäure mit hoher Effizienz gebildet
wird.
-
Beispiel 5 (Immunhistochemie von Explantaten,
die mit Activin und Retinsäure
behandelt wurden)
-
Die
Stücke
des präsumtiven
Ektoderms, die in Beispiel 1 ausgeschnitten wurden, wurden in derselben Weise
wie in Beispiel 3 mit einer Zeitverzögerung von 5 Stunden behandelt
und wurden für
10 Tage bei 20°C kultiviert.
Das Explantat wurde in Puffer III [0,1 M 3-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS),
2 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 3,7% Formaldehyd]
fixiert, mit physiologischer Salzlösung (PBS) gewaschen, gefolgt
von Blocken mit PBS, enthaltend 1% BSA, das 2% entrahmte Milch enthielt.
Dieses Explantat, das geblockt worden war, wurde für eine Nacht
in einer Lösung
von Anti-Insulin-(Meerschweinchen-IgG)-Antikörper (Antikörperverdünnung = 1:1000, CAT#A0564,
Dako Corporation; oder Antikörperverdünnung =
1:1000, CAT#4010-01, Linco Research Inc.) oder mit Anti-Glucagon-(Maus-IgG)-Antikörper (Antikörperverdünnung =
1:2000, CAT#G-2654, Sigma) belassen und dann mit PBS gewaschen.
-
Das
Explantat, das mit dem oben genannten primären Antikörper umgesetzt worden war,
und das Explantat, das nicht mit dem primären Antikörper umgesetzt worden war und
das als Kontrolle verwendet wurde, wurden jeweils unter Verwendung
eines Anti-Meerschweinchen-IgG-Antikörpers, der
mit alkalischer Phosphatase markiert war (Antikörperverdünnung = 1:500; CAT#61-4622;
Zymed Laboratories Inc.) oder eines Anti-Maus-IgG-Antikörpers, der
mit alkalischer Phosphatase markiert war (Antikörperverdünnung = 1:500, CAT#AQ160A,
Chemicon International Inc.) umgesetzt und dann mit PBS gewaschen.
Die Explantate, die mit diesen sekundären Antikörpern umgesetzt worden waren,
wurden alle in einem alkalischen Phosphatase-Puffer, [100 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20 (oberflächenaktives
Mittel)], unter Einbeziehung von Nitrobenzoesäure (NIB) und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphorsäure (BCIP)
als einem Substrat, blau gefärbt.
Die Explantate wurden wiederum mit Bouin-Lösung fixiert und dann in einer
Ethanol- und Xylenreihe entwässert.
Diese Explantate wurden in Paraffin eingebettet, in dünne Scheiben
von 10 μm
geschnitten und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (JEM-2000X;
JOEL) (siehe 5) betrachtet.
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Bezugnehmend
auf die Ergebnisse, die in 5, wie oben
beschrieben, gezeigt sind, war es bei den Kontrollen, die nur mit
dem sekundären
Antikörper
(Anti-Meerschweinchen-IgG-Antikörper, markiert
mit alkalischer Phosphatase, oder Anti-Maus-IgG-Antikörper, markiert
mit alkalischer Phosphatase) umgesetzt wurden, so, dass keines der
Teile in den Explantaten angefärbt
wurde, wenn beliebige von diesen verwendet wurden (5A, 5D). Wenn jedoch der primäre Antikörper ein
Anti-Insulin-Antikörper
war, so wurden einige angefärbte
Regionen in den Explantaten bestätigt
(5B, 5C).
Weiterhin, wenn der primäre
Antikörper
ein Anti-Glucagon-Antikörper war,
so wurde ebenfalls die Anfärbung
von Teilen bestätigt
(5E und 5F).
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde herausgefunden, dass Insulin
und Glucagon in den Explantaten synthetisiert wurden, und dass endokrine
Drüsen
in den Explantaten differenzierten, wenn man diese mit Activin und,
mit einer Zeitverzögerung
von fünf
Stunden, mit Retinsäure
behandelte. Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert
werden, dass das in vitro gebildete Pankreas Eigenschaften ähnlich denjenigen
eines normalen Pankreas besitzt, nicht nur morphologisch, sondern
auch funktionell.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ein in vitro induziertes Pankreas, das es erlaubt,
Erkenntnisse bezüglich
der Differenzierungs- und Bildungsmechanismen von Pankreas zu erlangen,
die nützlich
sind für die
Entwicklungstechnologie und künstliche
Organentwicklung, ein Pankreas für
die Transplantation, durch das bewertet werden kann, ob ein in vitro
induziertes Pankreas in der Praxis in vivo funktionieren kann oder nicht,
und ein in vitro induziertes Pankreas, das zur Entwicklung von Diagnose
und Behandlung von Pankreasstörungen
höherer
Tiere beiträgt,
künstlich
und effizient aus einer Keimschichtregion, abgesehen von der präsumtiven
Region des Pankreas, induziert werden. Durch die Verwendung dieses
Verfahrens ist es möglich, nach
Genen zu suchen, die an der Bildung des Pankreas beteiligt sind,
und die Analyse der verschiedenen Gene für die Bildung des Pankreas,
die erhalten wurden, ist möglich,
und die Verwendung dieser Gene ermöglicht einen Beitrag zur Entwicklung
von Gentherapie und Gendiagnose.
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Weiterhin,
durch Transplantieren dieser Organe (Pankreata), die in vitro gebildet
wurden, gibt es eine Möglichkeit
zur Entwicklung einer Therapie für
Neugeborene, die mit Insulinmangel geboren werden, und für Erkrankungen,
an denen diese Gene beteiligt sind. Wiederum weiterhin, nach Auswachsen
zum Erwachsenen, ist die Aktivität
des Pankreas, wie etwa Insulin, von entscheidender Wichtigkeit für mit der
Lebensweise in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, wie etwa Diabetes
und dergleichen, und es gibt eine Möglichkeit zur Entwicklung von
Therapien für
die durch Diabetes und andere funktionelle Veränderungen des Pankreas verursachten
Erkrankungen. SEQUENZPROTOKOLL
