DE60319599T2

DE60319599T2 - Verfahren zur differenzierung einer mesenchym-stammzelle zu einer nervenzelle sowie die nervenzelle enthaltende pharmazeutische zusammensetzung gegen eine neurodegenerative krankheit

Info

Publication number: DE60319599T2
Application number: DE60319599T
Authority: DE
Inventors: Hyun-Soo Youngtong-dong Youngtong-gu Suwon-si KIM; Young-Mo Suwon-si KANG; Kyung-Bock Suwon-si LEE; Sang-Kyo Paldal-gu Suwon-si PARK; Sang-Kap Lee
Original assignee: FCB-Pharmicell Co Ltd Seongnam; Kim Hyun Soo Suwon; FCB-Pharmicell Co Ltd
Current assignee: FCB-Pharmicell Co Ltd Seongnam; Kim Hyun Soo Suwon; FCB-Pharmicell Co Ltd
Priority date: 2003-10-29
Filing date: 2003-10-29
Publication date: 2008-06-26
Also published as: AU2003273118A1; ATE388223T1; CA2543118A1; US7635591B2; JP4126060B2; EP1687413A4; EP1687413A1; EP1687413B8; WO2005040362A1; DE60319599D1; CA2543118C; US20070054399A1; EP1687413B1; DE60319599T8; AU2003273118B2; CN1860224A; JP2007528196A; HK1093755A1; CN100554409C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Differenzieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle durch Kultivieren in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, nach konfluentem Kultivieren der mesenchymalen Stammzelle als Vorbehandlung.
Stand der Technik
Da eine mesenchymale Stammzelle vor Kurzem erfolgreich aus einem Menschen isoliert worden ist, ist eine klinische Anwendung der mesenchymalen Stammzelle in den Blickpunkt gekommen. Insbesondere wird die mesenchymale Stammzelle in der klinischen Anwendung als Zelldonor bei der Zellersatztherapie verwendet. Die Zellersatztherapie wird zum effektiven Behandeln von Zelldefizienz, verursacht durch neurodegenerative Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit, bekannt als unheilbare Krankheiten, ischämischen und hämorrhagischen Schlaganfall, traumatische Erkrankung und Rückenmarksschädigung, die durch Zerstörung und permanente Funktionsstörung von Zellen in Geweben verursacht werden, vorgeschlagen.
Jedoch unterliegt die Zellersatztherapie Beschränkungen bei der praktischen Anwendung. Das heißt, dass es bei einem konventionellen Verfahren des Implantierens von Zellen, die vollständig in Donorgewebe differenziert sind, in Patienten schwierig ist, hinreichende Mengen an Zellen, die den Patienten zu verabreichen sind, zu erhalten.
Um die oben angesprochenen Probleme zu lösen, kann in der Zellersatztherapie das Differenzieren der mesenchymalen Stammzelle in eine gewebespezifische Zelle oder das Induzieren von Differenzierung nach Isolieren und Proliferieren der gewebespezifischen Stammzelle verwendet werden.
Das Implantieren einer neuralen Zelle, differenziert ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle eines Menschen, in einen anderen Menschen ist jedoch in der Praxis schwierig und bewirkt immunologische Reaktionen im Falle des Implantierens der neuralen Zelle zwischen männlichen und weiblichen Zellspendern.
Bis jetzt ist die Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle aus einer Ratte zu einer hämatopoetischen Zelle, einer Myocardzelle, einer Langerhans'schen Inselzelle und einer neuralen Zelle in vitro bewiesen worden. Studien, wie eine Studie über die Implantation eines Oligodendrocyten, differenziert ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle, in eine Ratte und dessen Steigerung („increasing it") zur Bildung von Myelin (Brüstle et al., Science 285: 754–756), eine Studie über die Implantation einer Insulin-sezernierenden Zelle, differenziert ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle, in eine diabetische Ratte und Regulation des Blutzuckerspiegels (Soria et al., Diabetes 49: 11157–162, 2000), eine Studie über die Implantation einer neuralen Zelle, differenziert ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle, in eine rückenmarksverletzte Ratte, wobei die Verbesserung der motorischen Störung in der rückenmarksverletzten (Ratte) bestätigt wurde (McDonald et al., Nat. Med. 5(12): 1410–1412, 1999) usw. spiegeln Verfahren des Implantierens von Zellen, die ausgehend von mesenchymalen Stammzellen differenziert werden, zum wirksamen Behandeln von Erkrankungen, die durch Defizienz an Zellen bedingt sind, wider.
Die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen ist vor Kurzem erreicht worden und eine Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu anderen Zellen außer neuralen Zellen in vitro bleibt noch zu beschreiben, so dass die klinische Anwendung von gewebespezifischen Zellen, differenziert ausgehend von mesenchymalen Stammzellen, für die Zellersatztherapie möglich, jedoch nicht praktisch durchführbar ist.
Obgleich angenommen wird, dass ein Verfahren des Differenzierens von mesenchymalen Stammzellen das bislang effektivste Verfahren zur Zellersatztherapie ist, besteht noch ein Risiko durch andere gemischte Zellen, und zwar aufgrund der niedrigen Effizienz der Differenzierung der mesenchymalen Zellen zu gewebespezifischen Zellen, wodurch bei Implantation in einen Patienten immunologische Reaktionen verursacht werden. Daher sind Studien zur Differenzierung für eine sichere klinische Anwendung erforderlich.
Ein Verfahren der Verwendung gewebespezifischer Stammzellen für die Zellersatztherapie weist auch Schwierigkeiten, wie Differenzierung zu unerwünschten Zellen aufgrund einer Modifikation des Differenzierungspotentials, wenn die gewebespezifische Stammzelle für lange Zeit kultiviert wird, und Abnahme der Proliferationsrate von Zellen auf. Darüber hinaus erfordern neurale Zellen zum Behandeln einer neurodegenerativen Erkrankung, wie Parkinson-Krankeit, Implantation. In Anbetracht dessen, dass neurale Zellen hauptsächlich durch Differenzieren und Proliferieren von neuralen Stammzellen aus dem fötalen Gehirn erhalten werden, da es schwierig ist, neurale Zellen direkt aus Patienten zu erhalten, ist das Implantieren von neuralen Zellen ein Nachteil. Etwa zwei fötale Gehirne werden benötigt, um einen Patienten in einem Fall wie oben zu behandeln. Das Implantieren der neuralen Zellen weist Schwierigkeiten, wie unzureichende Bereitstellung der neuralen Zellen und unethisches Handeln, Differenzierung der neuralen Stammzellen zu Astrocyten anstelle der neuralen Zellen und die Erzeugung einer immunologischen Reaktion, auf.
Demgemäß können, falls ein Behandlungsverfahren unter Verwendung einer neuralen Zelle, differenziert ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle, möglich ist, Probleme, wie Schwierigkeiten beim Erhalten hinreichender Zellen und der Erzeugung einer immunologischen Reaktion, gelöst werden. Ob eine mesenchymale Stammzelle als ein Mesoderm zu einer neuralen Zelle differenziert werden kann, ist noch fraglich, jedoch wurde vor Kurzem über Transdifferenzierung berichtet und die Möglichkeit der Differenzierung der mesenchymalen Stammzelle ist verbessert.
Bislang war bekannt, dass Hepatocyten nur zu einer spezifischen Klasse von Gewebezellen differenziert werden. Es ist beschrieben worden, dass mesenchymale Stammzellen in vitro Kolonien in einem Medium, umfassend Wachstumsfaktoren, wie basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor usw., bildeten (Kuznetsov et al., Br. J. Haematol. 97: 561, 1997; Van den Bos C et al., Human Cell 10: 45, 1997). Zusätzlich wurde etwa ein Drittel der zunächst verankerten Zellen mit mehrfachem Differenzierungspotential („multi-differentiative potential") zu desmoplastischen Zellen, wie Osteoblasten, Chondroblasten, Adipocyten usw., differenziert (Pttenger MF et al., Science 279: 1528, 1998), und Knochenmark stellte eine Quelle für eine myogene Vorläuferzelle zur Bildung neuer Muskeln dar (Ferrari G et al., Science 279: 1528, 1998).
Gemäß neuerer aufeinanderfolgender Studien wurde jedoch beschrieben, dass mesenchymale Stammzellen nicht nur zu desmoplastischen Zellen, sondern auch zu neuralen Zellen differenziert werden könnten. Es wurde zum Beispiel beschrieben, dass mesenchymale Stammzellen zu neuralen Zellen und Astrocyten differenziert werden konnten, indem in einem Medium, umfassend Retinsäure und BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), kultiviert wurde (Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurology 164: 247–256, 2000) und in neurale Zellen, indem in einem Medium, umfassend eine antioxidative Substanz, wie Mercaptoethanol, und DMSO (Dimethylsulfoxid), kultiviert wurde (Date Woodbury et al., J. Neuro. Res. 61: 364–370, 2000).
Wenn ein chemisches Reagenz wie DMSO zum Induzieren der Differenzierung verwendet wird, kann die Toxizität von DMSO jedoch die mesenchymalen Stammzellen verändern, so dass ein sichereres Verfahren erforderlich ist.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten ein sicheres und wirksames Verfahren des Differenzierens einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle und ersuchten um ein Patent, betreffend ein „Verfahren des Differenzierens einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle" unter dem koreanischen Patent Nummer 2001-21064 . Das Patent betrifft ein Verfahren zum Differenzieren und Proliferieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle durch Kultivieren in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor.
Das Verfahren zum Differenzieren und Proliferieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle weist Probleme nicht nur hinsichtlich einer niedrigen Rate bzw. Geschwindig keit, sondern auch etwa 80% Differenzierungseffizienz auf. Ferner ist ein Kultivieren für vier Wochen aufgrund einer niedrigen Differenzierungsrate erforderlich, wenn eine Zelle während Differenzierung und Proliferation kultiviert wird, so dass eine morphologische Änderung auftritt. Somit entstehen Schwierigkeiten, wie Kontamination und großer Bedarf an Reagentien, Ausrüstungsgegenständen und Zeit.
Das Verfahren im koreanischen Patent Nummer 2001-21064 schlägt die Möglichkeit vor, dass eine neurale Zelle, die ausgehend von einer mesenchymalen Stammzelle differenziert wird, verwendbar ist zum Behandeln von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer, Pick-Krankheit, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose, ischämischer und hämorrhagischer Hirnerkrankung. Jedoch müssen in vitro-Tests, Tierversuche oder klinische Versuche noch durchgeführt werden und somit muss die pharmakologische Wirkung der neuralen Zellen noch bestätigt werden.
Um die Probleme zu lösen, vervollständigten die Erfinder die vorliegende Erfindung, indem sie ein Verfahren zum Verbessern der Differenzierungsrate und -effizienz und einen Test der pharmakologischen Wirkung studierten.
Offenbarung der Erfindung
Technische Aufgabe
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Differenzieren und Proliferieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle durch Kultivieren in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, wobei die mesenchymale Stammzelle in dem Medium nach konfluentem Kultivieren der mesenchymalen Stammzelle kultiviert wird, bereitzustellen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine neurale Zelle, zum Behandeln einer neurodegenerativen Erkrankung, wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Pick-Krankheit, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose, ischämischer und hämorrhagischer Hirnerkrankung und einer traumatischen Erkrankung bzw. Schädigung des zentralen Nervensystems, wie eine Rückenmarksverletzung, wird ebenfalls beschrieben.
Technische Lösung
Hiernach wird die Erfindung detailliert beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Differenzieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einer neuralen Zelle durch konfluentes Kultivieren in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, bereit.
Die mesenchymalen Stammzellen werden üblicherweise zum kontinuierlichen Wachstum in einem Zustand der Aufrechterhaltung des Anteils der Zellen, die die Oberfläche des Mediums einnehmen, bei zahlenmäßig etwa 70% kultiviert. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die mesenchymalen Stammzellen jedoch kontinuierlich konfluent kultiviert, nachdem die Zellen die Oberfläche des Mediums vollständig eingenommen haben, was das Ziel („object") zum Induzieren von Differenzierung anstelle von Proliferation ist. Daher kann die Differenzierung schnell und wirksam durchgeführt werden, wenn die Stimulation der Differenzierung nach konfluentem Kultivieren gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet wird.
Vorzugsweise wird die mesenchymale Stammzelle für etwa 1 bis etwa 50 Stunden konfluent kultiviert und wird dann entsprechend in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor zu etwa 1 bis etwa 10.000 ng/ml und einen Hepatocytenwachstumsfaktor zu etwa 1 bis etwa 10.000 ng/ml, für eine Woche oder mehr kultiviert. Bevorzugter wird die mesenchymale Stammzelle für etwa 24 Stunden konfluent kultiviert und wird dann entsprechend in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor zu etwa 10 ng/ml und einen Hepatocytenwachstumsfaktor zu etwa 10 ng/ml, für eine Woche oder mehr kultiviert.
Wenn die mesenchymale Stammzelle gemäß den oben genannten Bedingungen kultiviert wird, bilden einige mesenchymale Stammzellen nach etwa 4 Tagen eine Neuralzellkolonie und die Neuralzellkolonie proliferiert kontinuierlich, so dass nach etwa 1 Woche eine große Menge an neuralen Zellen gebildet sein kann.
Insbesondere wird die neurale Zelle, die in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, vollständig differenziert und für etwa 2 Wochen proliferiert wird, kontinuierlich ohne Änderung des Charakters der neuralen Zelle in einem Medium proliferiert, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst.
Eine für etwa 2 Wochen vollständig differenzierte neurale Zelle differenziert sich jedoch durch Kultivieren in einem Medium, das nur den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, derart, dass die Anzahl neuraler Zellen aufgrund des alleinigen Fortschreitens der Differenzierung der neuralen Zelle verringert wird. Daher ist ein Kultivieren der neuralen Zelle, die vollständig differenziert ist, in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, nach etwa 2 Wochen bevorzugt.
Die mesenchymale Stammzelle in der vorliegenden Erfindung kann durch Isolieren aus menschlichem Knochenmark erhalten werden. Eine hämatopoetische Stammzelle wird zu einer Blutzelle differenziert, wenn eine mononukleäre Zelle aus Knochenmark isoliert wird, so dass die mesenchymale Stammzelle durch ein Verfahren des Isolierens von lediglich der Stammzelle als eine uneingeschränkt proliferierende Zelle, die verbleibt, erhalten wird.
Das Kultivieren der gesamten mononukleären Zellen, isoliert aus Knochenmark nach dem oben genannten Verfahren ohne Isolierung der mesenchymalen Stammzellen von den mononukleären Zellen, zeigt das gleiche Ergebnis – Produktion einer großen Menge von neuralen Zellen – so dass die Verwendung der mesenchymalen Stammzellen alleine nicht erforderlich ist.
Wie oben erwähnt, werden, wenn die mesenchymalen Stammzellen in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, kultiviert werden, zahlenmäßig etwa 90% der mesenchymalen Stammzellen zu neuralen Zellen differenziert, zahlenmäßig etwa 70% der neuralen Zellen sind Neuronen, zahlenmäßig etwa 30% sind Astrocyten und keine davon sind Mikrogliazellen.
In der vorliegenden Erfindung umfassen die neuralen Zellen Neuronen, Astrocyten und Mikrogliazellen.
Die neuralen Zellen, die mittels des oben genannten Verfahrens der vorliegenden Erfindung ausgehend von mesenchymalen Stammzellen differenziert werden, können als pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung bei der Zellersatztherapie verwendet werden. Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die neuralen Zellen, hergestellt mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, zur Be handlung neurodegenerativer Erkrankungen, wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer, Pick-Krankheit, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose, ischämischer und hämorrhagischer Gehirnerkrankung, traumatischer Erkrankung bzw. Schädigung des zentralen Nervensystems und motorischer Störung durch Verletzung der Vertebra.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die neuralen Zellen zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung umfasst, kann verabreicht werden durch Formulierung in einer Einzeldosierung, die zur Verabreichung an Menschen geeignet ist, gemäß Verfahren auf dem pharmazeutischen Gebiet. Als nicht-orale Verabreichung ist die Injektion bevorzugt.
Zusätzlich zu den neuralen Zellen der pharmazeutischen Zusammensetzung kann die obige Formulierung einen oder mehrere inaktivierte Träger, der/die pharmazeutisch zulässig ist/sind, enthalten. Beispiele für die inaktivierten Träger umfassen Konservierungsmittel, schmerzkontrollierende Mittel, Solubilisierungsmittel, einen Stabilisator usw. bei einer Injektionsanwendung und einen Gasbildner („gasifier"), ein Bulking-Mittel, ein Gleitmittel („lubricant"), einen Stabilisator usw. bei einer topischen Anwendung.
Die pharmazeutische Formulierung kann für eine nicht-orale Verabreichung verwendet werden, zum Beispiel intravenöse, subkutane, intraperitoneale Verabreichung oder topische Anwendung.
Beispielsweise kann ein von Douglas Kondziolka (Pittsburgh, 1998) beschriebenes klinisches Verfahren verwendet werden. Das Verfahren umfasst das Öffnen des Schädels eines Patienten in einem Durchmesser von etwa 1 cm (von Erbsengröße) und Injizieren der Neuralzelllösung, gemischt mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), in 3 Stellen. In einem Verfahren des Injizierens der Neuralzelllösung werden zur Injektion eine Spritze mit langer Nadel und ein stereotaktischer Rahmen verwendet. Die neurale Zelle kann direkt oder durch bzw. über Vene und Arterie injiziert werden.
Vorzugsweise beträgt die Dosierung der neuralen Zellen etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ Zellen und kann gemäß der Art der Erkrankung, dem Schweregrad der Erkrankung, dem Dosierungsweg, dem Gewicht, Alter und Geschlecht des Patienten variieren.
Wie oben erwähnt, war es aus den früheren Erfindungen bekannt, dass mesenchymale Stammzellen durch Kultivieren in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, zu neuralen Zellen differenziert wurden. Es wurde jedoch erstmalig festgestellt, dass das Kultivieren gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, nach konfluenter Kultur als Vorbehandlung die Differenzierungsgeschwindigkeit innerhalb einer Woche, die Differenzierungsrate und den Reifegrad der neuralen Zelle verbessern kann.
Die vorliegende Erfindung verglich jede Menge der zu proliferierenden mononukleären Zellen, die aus dem Knochenmark isoliert wurden und zur neuralen Zelle differenziert wurden, im Falle des Kultivierens in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden und im Falle des Kultivierens in einem Medium, umfassend einen von dem epidermalen Wachstumsfaktor bzw. dem Hepatocytenwachstumsfaktor, ohne konfluente Kultur. Als Ergebnis begann sich im Falle des Kultivierens in dem Medium, das den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden die Neuralzellkolonie nach etwa einer Woche zu bilden und setzte das Proliferieren selbst nach etwa 2 Wochen fort. Die mononukleären Zellen wurden im Falle der Kultur in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasste, nicht zu neuralen Zellen differenziert und wurden früh differenziert und proliferierten im Falle des Kultivierens in dem Medium, das nur den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasste.
Wenn die mesenchymalen Stammzellen oder die aus dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen zu den neuralen Zellen differenziert und proliferiert werden, induziert der epidermale Wachstumsfaktor demgemäß die Proliferation, der Hepatocytenwachstumsfaktor induziert die Differenzierung und die konfluente Kultur für etwa 24 Stunden stimuliert die schnelle Wirkung der Wachstumsfaktoren. Ausgehend von nur einem der Wachstumsfaktoren kann eine hinreichende Menge der neuralen Zellen nicht erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung werden die mesenchymalen Stammzellen oder die aus dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 2 Wochen nach konfluenter Kultur von etwa 24 Stunden kultiviert und dann werden die differenzierten und proliferierten Zellen als Einzelzellen abgetrennt und mit einem optischen Mikroskop untersucht. Im Ergebnis können Neuronen mit langen Axonen und kurzen Dendriten und Astrocyten mit nur kurzen Dendriten beobachtet werden.
Bei Durchführung einer immuncytochemischen Färbung der differenzierten und proliferierten Zellen, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens produziert werden, werden ein Neuronenmarker, wie NeuN, NSE und MAP-2, und ein Astrocytenmarker, wie GFAP, positiv gefärbt, was bestätigen kann, dass die differenzierten und proliferierten Zellen aus Neuronen und Astrocyten bestehen. Der Mikrogliazellmarker, wie OX-42, wird negativ gefärbt, was bestätigen kann, dass die Zellen nicht zu Mikrogliazellen differenziert werden.
Wenn die mesenchymalen Stammzellen oder die aus dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen konfluent für etwa 24 Stunden in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, kultiviert werden, sind nach etwa 2 Wochen zahlenmäßig etwa 90% der Zellen zu neuralen Zellen differenziert, zahlenmäßig etwa 70% der neuralen Zellen sind Neuronen, zahlenmäßig etwa 30% sind Astrocyten. Nachdem die mesenchymalen Stammzellen oder die mononukleären Zellen nach etwa 2 Wochen vollständig differenziert und proliferiert sind, behalten die mesenchymalen Stammzellen oder die mononukleären Zellen die Form von neuralen Zellen bei und proliferieren kontinuierlich in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst. In dem Medium, das nur den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, werden die mesenchymalen Stammzellen oder die mononukleären Zellen lediglich differenziert, so dass die mesenchymalen Stammzellen oder die mononukleären Zellen nicht kontinuierlich proliferieren.
Die mesenchymalen Stammzellen werden nur aus den mononukleären Zellen isoliert, so dass bestätigt wird, ob die neuralen Zellen, stammend bzw. abgeleitet aus den mononukleären Zellen im Knochenmark durch Kultivieren in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, ausgehend von den mesenchymalen Stammzellen differenziert werden. Die Stammzellen werden in hämatopoetische Stammzellen und die mesenchymalen Stammzellen, stammend aus den mononukleären Zellen im Knochenmark, klassifiziert. Die hämatopoetischen Stammzellen werden unter allgemeinen Kulturbedingungen leicht zu Blutzellen differenziert, so dass die Stammzellen, die nach etwa 1 bis etwa 2 Wochen kontinuierlich proliferiert werden, die mesenchymalen Stammzellen sein kön nen. Nach Isolieren der mesenchymalen Stammzellen alleine, die mehr als 20-mal subkultiviert werden können, wird das Experiment der Differenzierung zu zahlreichen Bindegeweben durchgeführt, so dass das Experiment bestätigen kann, dass die mesenchymalen Stammzellen die Fähigkeit der Differenzierung zu zahlreichen Bindegewebszellen besitzen. Im Ergebnis hat das Experiment bestätigt, dass die mesenchymalen Stammzellen zu zahlreichen Bindegewebszellen differenzieren können.
Es wird ferner bestätigt, dass die mesenchymalen Stammzellen zu neuralen Zellen und Astrocyten differenziert werden und in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor, proliferiert werden, und zwar durch das Experiment der Differenzierung und Proliferierung zu neuralen Zellen, optische Mikroskopie und Immuncytochemie, wie (an) den aus Knochenmark stammenden mononukleären Zellen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Fotographie einer verankerten Zelle, wenn eine aus Knochenmark stammende mononukleäre Zelle in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumfaktors bzw. etwa 20 ng/ml eines Hepatocytenwachstumsfaktors, für etwa 1 Woche nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden kultiviert wird, durch ein optisches Mikroskop (× 100).
2 zeigt eine Fotographie einer neuralen Zelle, wenn die aus Knochenmark stammende mononukleäre Zelle in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumsfaktors bzw. etwa 20 ng/ml eines Hepatocytenwachstumsfaktors für etwa 2 Wochen nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden kultiviert wird, durch ein optisches Mikroskop (× 100).
3 zeigt eine Fotographie der aus der aus Knochenmark stammenden mononukleären Zelle in 2 differenzierten und isolierten neuralen Zelle durch ein optisches Mikroskop; 3a zeigt ein Neuron und 3b zeigt einen Astrocyten.
4 zeigt eine Fotographie der aus der aus Knochenmark stammenden mononukleären Zelle in 2b differenzierten neuralen Zelle mittels Immuncytochemie. 4a zeigt eine hinsichtlich NSE positiv gefärbte Zelle, 4b zeigt eine Färbung hinsichtlich NeuN, 4c zeigt eine Färbung hinsichtlich GFAP und 4d zeigt eine Färbung hinsichtlich MAP-2.
5 zeigt eine Fotographie der differenzierten Zellen, wenn die aus Knochenmark stammenden mononukleären Zellen in einem Medium, das eine niedrige Konzentration an Glucose umfasst, kultiviert werden und die mesenchymalen Stammzellen isoliert und zu Osteoblasten (5a), Chondroblasten (5b) und Fettzellen (5c) differenziert werden, durch ein optisches Mikroskop.
6 zeigt eine Fotographie einer mesenchymalen Stammzelle, wenn die mesenchymale Stammzelle in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumsfaktors bzw. etwa 20 ng/ml eines Hepatocytenwachstumsfaktors, für etwa 1 Woche kultiviert wird, durch ein optisches Mikroskop.
7 zeigt eine Fotographie der proliferierten und differenzierten neuralen Zelle, wenn die mesenchymale Stammzelle in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml eines epidermalen Wachstumsfaktors bzw. etwa 20 ng/ml eines Hepatocytenwachstumsfaktors, für etwa 2 Wochen kultiviert wird, durch ein optisches Mikroskop.
8 zeigt eine Fotographie der differenzierten neuralen Zelle in 6 mittels Immuncytochemie; 8a zeigt eine hinsichtlich NSE positiv gefärbte Zelle, 8b zeigt eine Färbung hinsichtlich NeuN, 8c zeigt eine Färbung hinsichtlich GFAP und 8d zeigt eine Färbung hinsichtlich MAP-2.
9 zeigt eine Fotographie eines Rattenhirnschnittes etwa 2 Wochen nachdem eine Ratte mit induzierter ischämischer Erkrankung eine venöse Injektion von etwa 3 × 10⁵ Zellen der neuralen Zellen aus der mesenchymalen Stammzelle erhielt, durch ein optisches Mikroskop; 9a zeigt eine Fotographie eines Rattenhirns vor Induktion einer lokalen ischämischen Erkrankung, 9b zeigt eine Fotographie eines Rattenhirns etwa 2 Wochen nach der venösen Injektion der neuralen Zellen nach Induktion einer lokalen ischämischen Erkrankung und 9c zeigt eine vergrößerte Fotographie des lokalen ischämischen Teils in 9b.
Bester Modus zur Ausführung der Erfindung
Hiernach wird der beste Modus der Erfindung im Detail beschrieben werden. Jedoch sollte verstanden werden, dass diese Beispiele nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, die vorliegende Erfindung jedoch nicht auf irgendeine Weise einschränken sollen.
<Beispiel 1> Isolierung von mononukleären Zellen in Knochenmark
Etwa 10 ml Knochenmark wurden aus dem Becken von gesunden Bewerbern erhalten und in Glasröhrchen, umfassend Heparin, aufbewahrt. Etwa 30 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) wurde zu etwa 10 ml des Knochenmarks gegeben, etwa 20 ml der ge mischten Lösung wurden langsam auf etwa 10 ml Ficoll-Paque^TM plus-Lösung (1,077 g/ml, Amersham Pharmacia Biotech) fließen gelassen und am Dichtegradienten bei 2.000 UpM für etwa 20 Minuten zentrifugiert. Die Schicht von mononukleären Zellen wurde zwischen einer oberen Schicht und der Ficoll-Paque^TM plus-Schicht gesammelt und bei 1.800 UpM für etwa 5 Minuten zentrifugiert. Somit wurden die mononukleären Zellen erhalten.
<Beispiel 2> Kultur der mononukleären Zellen
Die in Beispiel 1 hergestellten mononukleären Zellen wurden in Kulturkolben zu etwa 1 × 10⁶ Zellen/cm² inokuliert und nach etwa 4 Stunden wurden nichtverankerte Zellen durch Waschen mit einem neuen Basalmedium entfernt. Das verwendete neue Basalmedium war Williams-E-Medium (Gibco BRL), umfassend 3,5 M Hydrocortison (Sigma), fettsäurefreies Rinderserumalbumin (Gibco BRL), 50 ng/ml Linolsäure (Sigma), 0,1 M CuSO₄·5H₂O (Sigma), 50 pM ZnSO₄·7H₂O (Sigma), 3 ng/ml H₂·SeO₃ (Sigma), 1,05 mg/ml NaHCO₃ (Sigma), 1,19 mg/ml HEPES (Sigma), 100 U/ml Penicillin (Gibco BRL), 10 mg/ml Streptomycin (Gibco BRL) und 25 g/ml Amphotericin (Gibco BRL).
<Beispiel 3> Differenzierung der mononukleären Zellen zu neuralen Zellen ohne konfluente Kultur
Beispiel 3 bestätigte, ob die in Beispiel 2 kultivierten mononukleären Zellen in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors (Gibco BRL) und etwa 20 ng/ml des Heptocytenwachstumsfaktors (R&D Systems), ohne konfluente Kultur zu neuralen Zellen differenziert würden. Anschließend wurde das Differenzierungsmedium zweimal pro Woche gewechselt.
Wenn die mononukleären Zellen in dem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, wurde keine morphologische Änderung der mononukleären Zellen nach etwa 1 Woche beobachtet. Die Neuralzellkolonie erschien nach etwa 4 Wochen und proliferierte kontinuierlich. Neuronen mit langen Axonen und kurzen Dendriten und Astrocyten mit nur kurzen Dendriten wurden nach etwa 8 Wochen beobachtet. Ferner wurde ab etwa 8 Wochen bestätigt, dass Beispiel 3 unter Aufrechterhaltung der gleichen Morphologie sogar in einem Medium, das nur epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, proliferierte.
Im Gegensatz zum Kultivieren in dem Medium, das den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, wurde die mononukleäre Zelle in einem Medium, das nur einen epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, nicht zu neuralen Zellen differenziert und wurde in einem Medium, das nur den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, früh differenziert und somit wurde die mononukleäre Zelle nicht proliferiert.
Die unten stehende Tabelle 1 zeigt die Zahl proliferierter Zellen, nachdem die mononukleären Zellen in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 4 Wochen ohne konfluente Kultur kultiviert wurden, und Tabelle 2 zeigt das Proliferationsverhalten der Zellen, nachdem die in Tabelle 1 vorbehandelten Zellen in einem Medium, umfassend nur den epidermalen Wachstumsfaktor oder den Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 4 bzw. etwa 8 Wochen kultiviert wurden (die am Anfang inokulierte Zahl von Zellen beträgt etwa 1 × 10⁵).
<Beispiel 4> Differenzierung der mononukleären Zellen zu neuralen Zellen nach konfluenter Kultur
In Beispiel 4 wurde bestätigt, dass die in Beispiel 2 kultivierten mononukleären Zellen in einem Differenzierungsmedium, umfassend etwa 10 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors (Gibco BRL) und etwa 20 ng/ml des Hepatocytenwachstumsfaktors (R&D Systems), nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden zu neuralen Zellen differenziert wurden. Anschließend wurde das Differenzierungsmedium zweimal pro Woche gewechselt.
Wenn die mononukleären Zellen in dem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, begann die Neuralzellkolonie nach etwa 1 Woche zu erscheinen und proliferierte kontinuierlich (siehe 1). Wenn die mononukleären Zellen in dem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, wurden nach etwa 2 Wochen Neuronen mit langen Axonen und kurzen Dendriten und Astrocyten mit nur kurzen Dendriten beobachtet (siehe 2 und 3). Ferner wurde ab etwa 2 Wochen bestätigt, dass Beispiel 4 unter Aufrechterhaltung der gleichen Morphologie sogar in einem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, proliferiert.
Im Gegensatz zu einer Kultur in dem Medium, das den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, wurden die mononukleären Zellen in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, nicht zu neuralen Zellen differenziert und wurden in dem Medium, das nur den Hepatocytenwachstumsfaktor umfasst, früh differenziert und proliferierten somit nicht.

Tabelle 1 zeigt die Zahl proliferierter Zellen, nachdem mononukleäre Zellen in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 2 Wochen nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden kultiviert wurden. Tabelle 2 zeigt die Zahl von Zellen, die eine Proliferation durchführten, nachdem Zellen in dem Medium, umfassend nur den epidermalen Wachstumsfaktor oder den Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 4 bzw. etwa 8 Wochen kultiviert wurden, wie vorbehandelt (die Zahl am Anfang inokulierter Zellen beträgt etwa 1 × 10⁵). [Tabelle 1]

Vorbehandlung	Zeit (Woche)	Zahl inokulierter Zellen	nur HGF	nur EGF	EGF und HGF
nicht-konfluente Kultur	4	7,5 × 10⁷	nicht proliferiert	1 × 10⁵	2,0 × 10⁵
konfluente Kultur	2	7,5 × 10⁷	nicht proliferiert	1,2 × 10⁵	1,8 × 10⁵

[Tabelle 2]

Vorbehandlung	Zeit (Woche)	nur HGF	nur EGF	EGF und HGF
nicht-konfluente Kultur	4	nicht proliferiert	2 × 10⁵	2 × 10⁵
nicht-konfluente Kultur	8	nicht proliferiert	5 × 10⁵	1 × 10⁵
konfluente Kultur	4	nicht proliferiert	2 × 10⁵	1,7 × 10⁵
konfluente Kultur	8	nicht proliferiert	5 × 10⁵	1,3 × 10⁵

<Beispiel 5> Immunocytochemie I
Die in den Beispielen 3 und 4 differenzierten Zellen wurden zu etwa 1 × 10⁴ Zellen/cm² auf der Oberfläche eines Deckglases angeheftet. Nachfolgend wurden die Zellen mit 0,1 M Phosphatpuffer für etwa 5 Minuten gewaschen, mit 0,1 M Phosphatpuffer, umfassend 4 Gew.-% Paraformaldehyd, für etwa 15 Minuten fixiert und zweimal für etwa 15 Minuten mit 0,1 M PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) gewaschen. Anschließend wurden die fixierten Zellen mit 0,1 M PBS, umfassend 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,2 Gew.-% Triton X-100, für etwa 5 Minuten behandelt, ein erster Antikörper wurde zu den fixierten Zellen gegeben und die fixierten Zellen und der erste Antikörper wurden für etwa 16 Stunden umgesetzt. Als der erste Antikörper wurden verwendet: anti-humane neuronspezifische Enolase-(NSE; Chemicon), anti-humanes NeuN-(Chemicon), anti-humanes Tubulin III-(Sigma), anti-humanes saures Gliafaserprotein-(GFAP; Sigma) und anti-humanes MAP-2-(Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2) Antikörper. Nach Umsetzung mit dem ersten Antikörper wurde der nichtgebundene erste Antikörper entfernt und die Zellen, umgesetzt mit dem ersten Antikörper, wurden zweimal mit 0,1 M PBS, umfassend 0,5 Gew.-% BSA, für etwa 5 Minuten gewaschen. Ein zweiter Antikörper wurde zu den mit dem ersten Antikörper umgesetzten Zellen gegeben und die Zellen mit dem zugegebenen zweiten Antikörper wurden für etwa 30 Minuten inkubiert. Die inkubierten Zellen wurden anschließend zweimal mit 0,1 M PBS, umfassend 0,5 Gew.-% BSA, für etwa 15 Minuten gewaschen. Der Vectastain Elite ABC-Kit (Vector Laboratory Inc.), umfassend Avidin-Biotin, wurde verwendet und mit den inkubierten Zellen für etwa 30 Minuten umgesetzt. Die umgesetzten Zellen wurden zweimal für etwa 5 Minuten mit 0,1 M PBS gewaschen und mit DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid, wasserfrei, Sigma) als farbentwickelndes Substrat für etwa 5 Minuten umgesetzt. 0,1 M PBS wurde zu den mit DAB für etwa 5 Minuten umgesetzten Zellen gegeben, um die Reaktion zu stoppen und die Zellen, die die Reaktion quenchen, wurden zweimal für etwa 5 Minuten mit der 0,1 M PBS gewaschen. Der Reaktant wurde getrocknet und mit destilliertem H₂O gewaschen. Der getrocknete Reaktant wurde dann mit destilliertem H₂O, 70 Gew.-%, 80 Gew.-%, 95 Gew.-% und 100 Gew.-% Ethanol in dieser Folge entwässert und fixiert.
Als ein Ergebnis der Immuncytochemie zeigt 4, dass die differenzierten Zellen hinsichtlich eines Neuronenmarkers, wie NeuN, NSE, MAP-2 und Tubulin III, und hinsichtlich eines Astrocytenmarkers, wie GFAP, positiv gefärbt wurden, wohingegen die differenzierten Zellen hinsichtlich eines Mikrogliamarkers, wie OX-42, negativ gefärbt wurden. Das Ergebnis zeigte, dass die mononukleären Zellen nicht nur morphologisch, sondern auch biochemisch in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, zu Neuronen und Astrocyten differenziert wurden, die mononukleären Zellen jedoch nicht zu Mikrogliazellen differenziert wurden.

Die mononukleären Zellen wurden in einem Medium, umfassend nur den epidermalen Wachstumsfaktor, einem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, bzw. einem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, nach konfluentem Kultivieren für etwa 24 Stunden kultiviert. Nachfolgend wurden die differenzierten Zellen mittels Immuncytochemie gefärbt, um ein Verhältnis der Neuronen (positiv gefärbt hinsichtlich NeuN, NSE, MAP-2 und Tubulin III) und der Astrocyten (positiv gefärbt hinsichtlich GFAP) zu beobachten. Das Ergebnis ist in Tabelle 3 gezeigt. [Tabelle 3]

	Zeit (Woche)	NSE	NeuN	GFAP	Map 2	negative Zellen
nur EGF	4	0,9%	0,8%	1,2%	-	89%
EGF + HGF	2	10%	25%	4%	-	70%
EGF + HGF	4	56%	75%	24%	-	20%
EGF + HGF nach konfluenter Kultur für 24 Stunden	2	62%	88%	31%	11%	10%

Wie in Tabelle 3 gezeigt, waren, wenn die mononukleären Zellen in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, für etwa 2 Wochen nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden kultiviert wurden, zahlenmäßig etwa 80% der Zellen zu neuralen Zellen differenziert; zahlenmäßig etwa 70% der neuralen Zellen sind Neuronen und zahlenmäßig etwa 30% sind Astrocyten.
<Beispiel 6> Isolierung und Kultur der mesenchymalen Stammzellen
Um zu bestätigen, ob die mesenchymalen Zellen zu neuralen Zellen differenziert wurden, wurden die mesenchymalen Zellen aus den aus Knochenmark stammenden mononukleären Zellen isoliert und ein Versuch hinsichtlich ihres Differenzierungspotentials wurde durchgeführt.
Die in Beispiel 2 kultivierten mononukleären Zellen wurden zu etwa 1 × 10⁶ Zellen/cm² in einen Kulturkolben inokuliert und bei einer Temperatur von etwa 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Als Medium: Gibco BRL (DMEM) niedriger Glucosekonzentration, wobei dem Medium zu etwa 10 Gew.-% fötales Rinderserum (FBS) zugesetzt wurde. Nach Kultivieren der mononukleären Zellen für etwa 1 bis etwa 2 Wochen waren die mononukleären Zellen vollständig für eine Subkultur proliferiert und die mononukleären Zellen setzten das Proliferieren nach 20 Subkultivierungen fort.
Die aus dem Knochenmark stammende Gruppe mononukleärer Zellen enthält Leukozyten, Lymphozyten, Osteoblasten, Chondroblasten, Muskelzellen, Fibroblasten, Fettzellen und Stammzellen. Die Stammzellen können zu den Leukozyten, Lymphozyten, Osteoblasten, Chondroblasten, Muskelzellen, Fibroblasten, Fettzellen usw. differenziert werden. Die Stammzellen deuten auf hämatopoetische Stammzellen und mesenchymale Stammzellen. Die hämatopoetischen Stammzellen der Bildung von Blutzellen, wie Erythrozyten, Leukozyten und Lymphozyten, werden nicht kontinuierlich in einem normalen Kulturmedium proliferiert und werden zu reifen Zellen differenziert, so dass die kontinuierlich proliferierenden Zellen die mesenchymalen Stammzellen sind.
Zur Bestätigung wurde in Beispiel 6 untersucht, ob die oben erhaltenen Zellen das Differenzierungspotential der mesenchymalen Stammzellen besitzen, indem Arten von Cytokinen zugegeben wurden. Das heißt, dass die Möglichkeit der Differenzierung zu Bindegeweben, wie Osteoblasten, Chondroblasten und Fettzellen, getestet wurde.
Zur Differenzierung zu Osteoblasten wurden die oben erhaltenen Zellen mit zugegebenen Arten von Cytokinen in 100 mM Dexamethason, 10 mM Glycerinphosphat, 50 nM Ascorbat-2-phosphat und 10 Gew.-% fötalem Rinderserum (FBS) inkubiert. Zur Differenzierung zu Chondroblasten wurden die inkubierten Zellen bei 1.500 UpM für etwa 10 Minuten zentrifugiert, so dass die inkubierten Zellen ein Pellet bildeten, und anschließend wurden 100 nM Dexamethason und 10 ng/ml TGF-3 in serumfreiem Zustand zu dem Pellet gegeben. Zur Differenzierung zu Fettzellen wurden die oben erhaltenen Zellen mit zugesetzten Arten von Cytokinen mit 0,5 mM 1-Methyl-3-isobutylxanthin, 1 mM Dexamethason, 10 g/ml Insulin und 10 nM Indomethacin (Pittenger et al., Science 284: 143–147, 1999) inkubiert. Eine Differenzierung zu jeder Zelle bzw. jedem Zelltyp wurde mittels Alkalische-Phosphatase-Färbung bei Osteoblasten (Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64(2) 143–147, 1999), Typ II-Kollagen-Färbung RT-PCR, Toluidinblau, bei Chondroblasten (Mackay et al., Tissue Eng. 4(4): 415–428, 1998) bzw. Ölrot-O-Färbung bei Fettzellen bestätigt.
Als Ergebnis waren alle positiv gefärbt, wie in den 5a, 5b und 5c gezeigt. Die ex vivo kultivierten mesenchymalen Stammzellen wiesen noch Differenzierungspotential zu Bindegeweben, wie Osteoblasten, Chondroblasten und Fettzellen, auf.
<Beispiel 7> Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen zu neuralen Zellen ohne konfluente Kultur
Um zu bestätigen, ob die in Beispiel 6 isolierte mesenchymale Stammzelle zu neuralen Zellen differenzierte, wurden die mesenchymalen Stammzellen, kultiviert ex vivo in DMEM mit niedriger Glucosekonzentration, dem 10 Gew.-% FBS umfassenden DMEM, in dem Differenzierungsmedium, das etwa 10 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors und etwa 20 ng/ml des Hepatocytenwachstumsfaktors umfasst, gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 für 8 Wochen ohne konfluentes Kultivieren kultiviert.
Das Ergebnis war das gleiche, da sich neurale Zellen aus den aus Knochenmark stammenden mononukleären Stammzellen differenzierten; eine morphologische Änderung wurde nach etwa 1 Woche nicht detektiert und die Neuralzellkolonie erschien nach etwa 4 Wochen und proliferierte kontinuierlich nach etwa 5 Wochen. Nach etwa 8 Wochen wurde in Beispiel 7 eine Proliferation bei gleicher Morphologie sogar im Falle des Kultivierens in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, bestätigt.
<Beispiel 8> Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen zu neuralen Zellen nach konfluenter Kultur
Um zu bestätigen, ob die in Beispiel 6 isolierten mesenchymalen Stammzellen zu neuralen Zellen differenzierten, wurden die mesenchymalen Stammzellen, kultiviert ex vivo in DMEM mit niedriger Glucosekonzentration, dem 10 Gew.-% FBS umfassenden DMEM, in dem Differenzierungsmedium, das etwa 10 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors und etwa 20 ng/ml des Hepatocytenwachstumsfaktors umfasste, gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 für etwa 2 Wochen nach konfluenter Kultur für etwa 24 Stunden kultiviert.
Das Ergebnis war das gleiche, da sich neurale Zellen aus den aus Knochenmark stammenden mononukleären Stammzellen differenzierten; eine morphologische Änderung wurde nach etwa 1 Woche nicht detektiert und die Zellen proliferierten nach etwa 2 Wochen kontinuierlich (siehe 6 und 7). Nach etwa 2 Wochen wurde in Beispiel 8 eine Proliferation bei der gleichen Morphologie sogar im Falle des Kultivierens in dem Medium, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst, bestätigt.
<Beispiel 9> Immuncytochemie II
Die in den Beispielen 7 und 8 differenzierten Zellen wurden mittels Immuncytochemie wie im Verfahren von Beispiel 5 gefärbt. Das Ergebnis war gleich, da sich neurale Zellen aus den aus Knochenmark stammenden mononukleären Stammzellen differenzierten; die aus der mesenchymalen Stammzelle differenzierten neuralen Zellen waren positiv gefärbt hinsichtlich eines Neuronenmarkers, wie NeuN, NSE, MAP-2 und Tubulin III, und hinsichtlich eines Astrocytenmarkers, wie GFAP (8a, 8b, 8c und 8d). Im Falle der Durchführung einer konfluenten Kultur als Vorbehandlung zeigte das Ergebnis, dass mesenchymale Stammzellen zu Neuronen und Astrocyten differenziert wurden und dass die Differenzierungsrate bzw. Differenzierungsgeschwindigkeit 2-mal schneller war und die Effizienz der Differenzierung um 80% bis 90% erhöht war gegenüber dem Fall ohne Durchführung der konfluenten Kultur als Vorbehandlung.
<Beispiel 10> (für Referenzzwecke)
Um zu bestätigen, ob die Funktion der aus den mesenchymalen Stammzellen differenzierten neuralen Zellen gleich der Funktion von humanen neuralen Zellen war, wurde Beispiel 10 durchgeführt, indem ein geschädigter Teil erhalten und fixiert wurde, wobei die neuralen Zellen in den geschädigten Teil des Tiers implantiert wurden.
Um eine ischämische Hirnerkrankung, bekannt als verbreitete neurodegenerative Erkrankung beim Menschen, im Hirn einer Versuchsratte zu induzieren, wurde die mittlere Gehirnarterie durchtrennt, für 1 Stunde abgeschnürt („fastened") und wiederum geöffnet bzw. gelöst, so dass das Gehirn der Versuchsratte eine lokale ischämische Erkrankung im Cerebrum Cortex erhielt. Anschließend wurden die mittels des Verfahrens von Beispiel 8 hergestellten neuralen Zellen (intra)venös zu etwa 3 × 10⁵ Zellen injiziert. Die injizierten Zellen waren, um sie von anderen Zellen zu unterscheiden, mit LacZ gefärbt.
1 Woche nach der venösen Injektion wurde das Gehirn der Versuchsratte geschnitten und durch ein optisches Mikroskop untersucht. Das Ergebnis ist in 9 gezeigt; 9a zeigt eine Fotographie des Rattenhirns vor Induktion einer lokalen ischämischen Erkrankung, 9b zeigt eine Fotographie des Rattenhirns 2 Wochen nachdem die neuralen Zellen nach Induktion der lokalen ischämischen Erkrankung venös injiziert wurden und 9c zeigt eine vergrößerte Fotographie des lokalen ischämischen Teils in 9b.
Wie in den 9a und 9b gezeigt, wurde ein Unterschied zwischen normalem und ischämischem Gehirn klar bestätigt. Insbesondere wurde festgestellt, dass Zellen, schwach gefärbt in den 9b und 9c, stark mit LacZ gefärbt wurden. Demgemäß gelangten die neuralen Zellen selektiv zum geschädigten Teil. Das heißt, dass die mesenchymalen Stammzellen normal zu neuralen Zellen differenziert wurden und die neuralen Zellen in einem geeigneten Teil lokalisiert wurden. Daher sind die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung differenzier ten neuralen Zellen für neurodegenerative Erkrankungen nützlich.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben erwähnt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren und Proliferieren einer mesenchymalen Stammzelle oder einer mononukleären Zelle zu einer neuralen Zelle, bestehend aus einem Neuron und einem Astrocyten, bereit, das hinsichtlich Zeit, Effizienz bzw. Wirksamkeit und Reifegrad effektiver ist, sowie eine hinreichende Menge von neuralen Zellen zum Erzeugen pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung. Aufgrund der Anwendung einer natürlichen Verbindung in einer Zelle ist das Verfahren sicher und weist geringe Schwierigkeiten bei der klinischen Anwendung auf. Das Verfahren hat Auswirkungen hinsichtlich geringer Immunreaktion und liefert eine hinreichende Menge an neuralen Zellen aufgrund des Erhaltens einer großen Menge von neuralen Zellen aus dem Knochenmark eines Patienten.

Claims

Verfahren zum Differenzieren und Proliferieren einer mesenchymalen Stammzelle zu einem Neuron oder einem Astrocyten, umfassend die zwei Stufen des: (1) konfluenten Kultivierens der mesenchymalen Stammzelle als eine Vorbehandlung und dann (2) Kultivieren der mesenchymalen Stammzelle in einem Medium, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen Hepatocytenwachstumsfaktor.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mesenchymale Stammzelle für mehr als eine Woche in einem Medium, umfassend etwa 1 bis etwa 10.000 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors und etwa 1 bis etwa 10.000 ng/ml des Hepatocytenwachstumsfaktors, nach konfluentem Kultivieren der mesenchymalen Stammzelle für etwa 1 bis etwa 50 Stunden kultiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mesenchymale Stammzelle für mehr als 1 Woche in einem Medium, umfassend etwa 10 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors und etwa 20 ng/ml des Hepatocytenwachstumsfaktors, nach konfluentem Kultivieren der mesenchymalen Stammzelle für etwa 24 Stunden kultiviert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die mesenchymale Stammzelle für etwa 2 Wochen in dem Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, kultiviert wird und dann das Medium, umfassend den epidermalen Wachstumsfaktor und den Hepatocytenwachstumsfaktor, durch ein Medium ausgetauscht wird, das nur den epidermalen Wachstumsfaktor umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die mesenchymale Stammzelle eine aus Knochenmark erhaltene mononukleäre Zelle ist.