CN1860224A - 使间充质干细胞分化成神经细胞的方法以及含有该神经细胞的用于神经退行性疾病的药物组合物 - Google Patents

使间充质干细胞分化成神经细胞的方法以及含有该神经细胞的用于神经退行性疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种将间充质干细胞分化并增殖成神经细胞的方法，该方法将间充质干细胞铺满培养后，再在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中进行培养。本发明提供了在时间、效率和成熟程度方面更加有效地将间充质干细胞或单核细胞分化并增殖成由神经元和星形胶质细胞组成的神经细胞的方法。

Description

使间充质干细胞分化成神经细胞的方法 以及含有该神经细胞的用于神经退行性疾病的药物组合物
技术领域
本发明是关于一种使间充质干细胞(mesenchymal stem cell)分化成神经细胞的方法，以及含有用该方法制备的神经细胞的用于神经退行性疾病的药物组合物。更具体地，本发明是关于这样一种使间充质干细胞细胞分化成神经细胞的方法，以及含有用该方法或其它可选择的方法制备的神经细胞的用于神经退行性疾病的药物组合物，该方法将间充质干细胞铺满培养(confluentculturing)一天后，再在含有表皮生长因子(epidermal growth factor)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor)的培养基中进行培养。
背景技术
近来由于间充质干细胞已经从人体中成功地分离出来，因而间充质干细胞的临床应用成为焦点。尤其是间充质干细胞作为细胞替代疗法(cellreplacement therapy)用细胞供体(cell donor)的临床应用。所述细胞替代疗法用于有效治疗由神经退行性疾病引起的细胞缺陷，所述神经退行性疾病例如公知不能治愈的疾病帕金森氏病(Parkinson′s disease)和阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)，由构成组织的细胞的破坏和永久性功能紊乱引起的缺血性和出血性脑中风、创伤疾病(traumatic disease)和脊髓损伤(spinal cordinjury)。
但是细胞替代疗法在实际应用有局限性。更确切地说，将完全分化成供体组织的细胞移植给病人的常规方法很难获得足够量的所述细胞给予病人。
为了解决上述问题，使间充质干细胞分化成组织特异性细胞、或者在分离和增殖所述组织特异性干细胞后诱导分化可以用作细胞替代疗法。
然而，将从一个人的间充质干细胞分化的神经细胞移植给另外一个人实际上很难，而且在雄性和雌性细胞供体之间移植神经细胞时引起免疫反应。
迄今为止，已经在培养瓶中证实了鼠的间充质干细胞分化成造血细胞、心肌细胞、胰岛(islet of Langerhans)和神经细胞。诸如有关在诱导间充质干细胞分化成少突胶质细胞作为产生髓磷脂的细胞之后，将少突胶质细胞移植到大鼠体内增强产生髓磷脂的研究(Brustle等，Science 285：754-756)；有关将从间充质干细胞分化的胰岛素分泌细胞移植到糖尿病大鼠体内，并调节血糖杠杆的研究(Soria等，Diabetes 49：11157-162，2000)；有关将从间充质干细胞分化的神经细胞移植到脊髓损伤大鼠体内，并证实改善脊髓损伤后的运动障碍的研究(McDonald等，Nat.Med.5(12)：1410-1412，1999)等，这些研究提出了移植从间充质干细胞分化的细胞，用于有效治疗由细胞缺陷引起的疾病的方法。
然而，最近才完成间充质干细胞的分离，所述间充质干细胞在培养瓶中分化成除神经细胞外的其它细胞已有报道，因此从间充质干细胞分化的组织特异性细胞用于细胞替代疗法的临床应用只是可能，但并不可行。
虽然从间充质干细胞分化的细胞用于细胞替代疗法的方法至今都被认为是最有效的方法，但是除了移植情况下病人仍然存在的免疫反应外，由于从间充质干细胞向组织特异性细胞的分化率低，还存在混有其它细胞的危险，因此安全的临床应用要求对精细分化(delicate differentiation)进行研究。
将组织特异性干细胞用于细胞替代疗法的方法也存在问题，例如：由于所述组织特异性干细胞长时间培养后分化能力(differentiation potential)的改变，分化成不需要的细胞，细胞增殖率下降。此外，用于治疗神经退行性疾病(如帕金森氏病)的神经细胞必须移植。考虑到由于所述神经细胞难于直接从病人获得，所述神经细胞主要通过分化和增殖从自胎儿大脑(fetalbrain)的神经干细胞获得，因此移植神经细胞不具优势。治疗上述情况的一个病人需要大约两个胎儿大脑。移植所述神经细胞存在问题，例如神经细胞供应不足以及违背伦理的行为，神经干细胞分化成星形胶质细胞多于神经细胞，产生免疫反应。
因此如果有一种应用从间充质干细胞分化的神经细胞的治疗方法，诸如难以获得足够的细胞和产生免疫反应的问题则可以得到解决。作为中胚层的间充质干细胞能否分化成神经细胞仍然没有定论，但是最近报道了转分化(trans-differentiation)，增加了间充质干细胞分化的可能性。
以前已知肝细胞只分化成特定类别的组织细胞。据报道，在体外(invitro)，间充质干细胞在含有诸如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor)、转化生长因子(transforming growth factor)、表皮生长因子(epithermal growth factor)等的生长因子的培养基中形成集落(Kuznetsov等，Br.J.Haematol.97：561，1997；Van den Bos C等.，Human Cell 10：45，1997)。此外，具有多重分化(multi-differentiative)能力的第一锚定细胞(firstly anchoredcell)大约三分之一分化成促结缔组织增生性细胞(desmoplastic cell)，例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等(Pttenger MF等，Science 279：1528，1998)，骨髓为形成新肌肉的生肌前体细胞(myogenic precursor cell)的起源(Ferrari G等，Science 279：1528，1998)。
然而，根据近来连续的研究报道，所述间充质干细胞不仅可以分化为促结缔组织增生性细胞，而且可以分化为神经细胞。例如，据报道所述间充质干细胞通过在含有视黄酸和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophicfactor，BDNF)的培养基中培养分化成神经细胞和星形胶质细胞(Sanchez-Ramos等，Exp.Neurology 164：247-256，2000)；在含有抗氧化物质如巯基乙醇和二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的培养基中培养分化成神经细胞(Dale Woodbury等，J.Neuro.Res.61：364-370，2000)。
可是当化学试剂诸如二甲亚砜用于诱导分化时，二甲亚砜的毒性会改变所述间充质干细胞，因此需要更安全的方法。
本发明的发明人研究了一种使间充质干细胞分化成神经细胞的安全有效的方法，并且申请了专利“使间充质干细胞分化成神经细胞的方法”，即韩国专利2001-21064。该专利是关于通过在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养，使所述间充质干细胞分化和增殖成神经细胞的方法。
使间充质干细胞分化和增殖成神经细胞的方法存在的问题不仅在于速度慢，而且还在于分化率仅为80％。此外，由于在细胞分化和增殖培养过程中的分化速度低，需要四周的培养时间，因而形态发生了改变。因此，出现诸如污染以及大量消耗试剂、设备和时间的问题。
韩国专利2001-21064中的方法提出了从间充质干细胞分化的神经细胞用于治疗诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer)、皮克病(Pick′sdisease)、享廷顿病(Huntington′s disease)、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateral sclerosis)和缺血性和出血性脑病(ischemic and hemorrhagic braindisease)的神经退行性疾病的可能性，但是并没有进行体外实验、动物实验或临床实验，因此所述神经细胞的病理学作用尚未得到证实。
为了解决上述问题，发明人通过提高分化速度和分化率方面的研究以及药理作用实验，完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的目的之一是提供一种通过在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养，使所述间充质干细胞分化和增殖成神经细胞的方法，所述间充质干细胞铺满(confluent)培养后再在上述培养基中进行培养。
本发明的另一个目的是提供含有神经细胞的用于治疗神经退行性疾病以及创伤中枢神经系统疾病的药物组合物，所述神经退行性疾病诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、皮克病、享廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、缺血性和出血性脑病，所述创伤中枢神经系统疾病诸如脊髓损伤。
下文对本发明进行详细描述。
本发明提供了一种通过在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养来使所述间充质干细胞分化成神经细胞的方法。
所述间充质干细胞通常在保持细胞占培养基表面约70数量％的状态下培养以持续生长。然而本发明的间充质干细胞在细胞完全占满培养基表面后持续铺满培养，目的在于诱导分化而不诱导增殖。因此，当根据本发明在铺满培养后实施分化刺激时，所述分化得以迅速有效地完成。
优选地，所述间充质干细胞铺满培养约1小时至50小时，然后分别在含有约1至10000纳克/毫升表皮生长因子和约1至10000纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养一周或者一周以上。
更优选地，所述间充质干细胞铺满培养约24小时，然后分别在含有约10纳克/毫升表皮生长因子和约10纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养一周或者一周以上。
当所述间充质干细胞在上述条件下培养时，约4天后一些间充质干细胞形成神经细胞集落(colony)，并且所述神经细胞集落持续增殖，因此能在大约一周后形成大量神经细胞。
特别地，在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中完全分化并增殖约两周的神经细胞，在只含有表皮生长因子的培养基中持续增殖，所述神经细胞的性质不改变。
然而，完全分化约2周的神经细胞，通过在只含有肝细胞生长因子的培养基中培养分化，这样以来，由于只进行神经细胞的分化，神经细胞的个数减少。因此优选在大约两周之后，在只含有表皮生长因子的培养基中培养所述完全分化的神经细胞，。
本发明的所述间充质干细胞可以通过从人类骨髓中分离获得。当从骨髓里分离出单核细胞时，造血干细胞分化成血细胞，因此所述间充质干细胞通过只分离作为剩余的无限增殖细胞的干细胞的方法获得。
然而，按上述方法培养从骨髓中分离出来的总的单核细胞，不将所述间充质干细胞从单核细胞中分离出来，显示出同样的结果，即产生了大量神经细胞，因此无需只使用所述间充质干细胞。
如上所述，当所述间充质干细胞在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养时，大约90数量％的间充质干细胞分化成神经细胞，大约70数量％的神经细胞为神经元，约30数量％的神经细胞为星形胶质细胞，并且没有分化成小胶质细胞。
在本发明中，所述神经细胞包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。
本发明中通过上述方法由间充质干细胞分化成的神经细胞，可以用作细胞替代疗法中治疗神经退行性疾病的药物组合物。因此，本发明提供了含有通过本发明的方法制备的神经细胞的用于治疗神经退行性疾病、创伤中枢神经系统疾病以及由脊椎损伤造成的运动障碍的药物组合物，所述神经退行性疾病诸如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、皮克病、享廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、缺血性和出血性脑病。
所述含有神经细胞的用于治疗神经退行性疾病的药物组合物，可以通过用制药领域中的常规方法制成适合给予人类的单位剂量而给药。优选注射作为非口服给药方式。
除了所述神经细胞的药物组合物外，上述制剂可以含有一种或多种制药学上允许的钝化载体(inactivated carrier)。钝化载体的实例包括作为注射用药(injection application)的防腐剂、镇痛控制剂(analgesic controller)、增溶剂、稳定剂等，作为局部用药(topical application)的气化剂(gasifier)、填充剂(bulking agent)、润滑剂、稳定剂等。
所述药物制剂可以用于非口服给药，例如静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药或局部给药。
例如，可以使用Douglas Kondziolka(匹斯堡，1998)公开的临床方法。所述方法包括切去1厘米直径豌豆大小的病人头盖骨，将混有汉克氏平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS)的所述神经细胞溶液注射到3个位置。在注射神经细胞溶液的方法中，使用具有长针以及定向结构(stereotactic frame)的注射器进行注射。所述神经细胞可以直接注射或者通过静脉和动脉注射。
优选所述神经细胞的剂量为约1×106至约1×109个细胞，并且可以依照疾病种类、疾病的严重程度、给药途径(dosage route)、病人的体重、年龄和性别进行改变。
如上所述，在先申请中已知所述间充质干细胞通过在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养，能分化成神经细胞。但是根据本发明首次发现，在铺满培养作为预处理之后，然后在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养，可以在一周内加快所述神经细胞的分化速度、提高神经细胞的分化率和成熟程度。
本发明分别对比了在铺满培养约24小时后再在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养的情况下与没有经过铺满培养而在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养的情况下，从骨髓中分离以增殖和分化成神经细胞的单核细胞的量。结果，在铺满培养约24小时后再在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养的情况下，所述神经细胞集落在大约一周时开始形成，并且甚至在约两周后仍继续增殖。所述单核细胞在只含有表皮生长因子的培养基中培养时没有分化成神经细胞，并且在只含有肝细胞生长因子的培养基中培养时在初期分化并增殖。
因此，当得自骨髓的所述间充质干细胞或单核细胞分化增殖成神经细胞时，所述诱导增殖的表皮生长因子、所述诱导分化的肝细胞生长因子和24小时铺满培养激发生长因子的快速效应。仅一种生长因子得不到足够量的神经细胞。
在本发明中，得自骨髓的所述间充质干细胞或单核细胞在铺满培养约24小时后再在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养两周，然后将分化并增殖的细胞分离成单细胞并用光学显微镜观察。结果，可以观察到具有长轴突和短树突的神经元以及只具有短树突的星形胶质细胞。
通过对根据本发明的分化和增殖的细胞进行免疫细胞化学染色，神经元标记例如神经特异性核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管联合蛋白-2(MAP-2)以及星形胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色呈阳性，证实分化和增殖的细胞由神经元和星形胶质细胞组成。少突胶质细胞标记例如OX-42染色呈阴性，证明所述细胞未分化成少突胶质细胞。
当得自骨髓的所述间充质干细胞或单核细胞在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中铺满培养约24小时，大约2周后，约90数量％的细胞分化成神经细胞，约数量70％的神经细胞为神经元，约30数量％的神经细胞为星形胶质细胞。在所述间充质干细胞或单核细胞完全分化并增殖两周后，所述间充质干细胞或单核细胞维持神经细胞的形状，并且持续在只含有表皮生长因子的培养基中增殖。在只含有肝细胞生长因子的培养基中，所述间充质干细胞或单核细胞只分化，因此所述间充质干细胞或单核细胞不继续增殖。
为了证实通过在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养骨髓单核细胞而得到的神经细胞是否由间充质细胞分化而来，只从单核细胞中分离所述间充质干细胞。干细胞分为造血干细胞和由骨髓单核细胞得到的所述间充质干细胞。造血干细胞在普通的培养条件下很容易分化成为血细胞，因此在约1周至约2周后持续增殖的干细胞可能是间充质干细胞。只将传代培养超过20次的间充质干细胞分离之后，进行向多种结缔组织分化的实验，以便该实验可以证实所述间充质干细胞具有分化成多种结缔组织细胞的能力。实验结果证明，所述间充质干细胞可以分化成多种结缔组织细胞。
此外，通过将例如得自骨髓的单核细胞分化增殖成神经细胞的实验、光学显微镜和免疫细胞化学实验，证实所述间充质干细胞分化成神经细胞和星形胶质细胞，并且在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中增殖。
附图说明
图1展示了锚定细胞通过光学显微镜(×100)的照片，其中得自骨髓的单核细胞在铺满培养约24小时后，分别在含有约10纳克/毫升表皮生长因子和约20纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养大约1周；
图2展示了神经细胞通过光学显微镜(×100)的照片，其中得自骨髓的单核细胞在铺满培养约24小时后，分别在含有约10纳克/毫升表皮生长因子和约20纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养大约2周；
图3展示了图2中由得自骨髓的单核细胞分化和分离的神经细胞通过光学显微镜的照片；图3a展示了神经元；图3b展示了星形胶质细胞；
图4展示了图2中由得自骨髓的单核细胞分化的神经细胞的免疫细胞化学照片；图4a展示了NSE阳性染色细胞；图4b展示了NeuN；图4c展示了GFAP；图4d展示了MAP-2；
图5展示了分化的细胞通过光学显微镜的照片，其中得自骨髓的单核细胞在含有低浓度葡萄糖的培养基中培养，并且将所述间充质干细胞分离并分化成成骨细胞(图5a)、成软骨细胞(图5b)和脂肪细胞(图5c)；
图6展示了间充质干细胞通过光学显微镜的照片，其中所述间充质干细胞分别在含有约10纳克/毫升表皮生长因子和约20纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养大约1周；
图7展示了增殖和分化的神经细胞通过光学显微镜的照片，其中所述间充质干细胞分别在含有约10纳克/毫升表皮生长因子和约20纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养大约2周；
图8展示了图6中分化的神经细胞的免疫细胞化学照片；图8a展示了NSE阳性染色细胞；图8b展示了NeuN；图8c展示了GFAP；图8d展示了MAP-2；
图9展示了诱导有缺血性疾病的大鼠静脉注射大约3×105个源自间充质干细胞的神经细胞大约2周后，大鼠脑切片通过光学显微镜的照片；图9a展示了诱导局部缺血性疾病前的大鼠脑照片；图9b展示了诱导缺血性疾病后，静脉注射神经细胞大约2周的大鼠脑照片；图9c展示了图9b局部缺血部位的放大照片。
具体实施方式
以下将详细描述本发明的最佳实施方式。但是应当明白提供下列实施例只是为更好地解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1骨髓单核细胞的分离
从健康志愿者的骨盆中取得大约10毫升骨髓并保存在含有肝素的玻璃试管中。向大约10毫升骨髓中加入大约30毫升磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，将大约20毫升该混合溶液缓慢加在大约10毫升Ficoll-PaqueTM plus(1.077克/毫升，Amersham Pharmacia Biotech)溶液上，并在2000转/分下密度梯度离心约20分钟。收集上层和Ficoll-PaqueTM plus层之间的单核细胞层，并在1800转/分下离心约5分钟。
这样就只获得了单核细胞。
实施例2单核细胞的培养
在培养瓶中以大约1×106个细胞/平方厘米孵育实施例1制备的单核细胞，4个小时后，用新鲜基础培养基冲洗除去未锚定的细胞。所述新鲜基础培养基为Williams’E培养基(Gibco BRL)，所述Williams’E培养基含有3.5M氢化可的松(Sigma)、无脂肪酸的牛血清白蛋白(Gibco BRL)、50纳克/毫升亚麻酸(Sigma)、0.1M CuSO4·5H2O(Sigma)、50pM ZnSO4·7H2O(Sigma)、3纳克/毫升H2SeO3(Sigma)、1.05毫克/毫升NaHCO3(Sigma)、1.19毫克/毫升N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)(Sigma)、100单位/毫升青霉素(Gibco BRL)、10毫克/毫升链霉素(Gibco BRL)和25克/毫升两性霉素(Gibco BRL)。
实施例3未经铺满培养的单核细胞向神经细胞的分化
实施例3证实了实施例2培养的单核细胞不经过铺满培养，是否在含有约10纳克/毫升的表皮生长因子(Gibco BRL)和约20纳克/毫升的肝细胞生长因子(R&D systems)的培养基中分化成神经细胞。然后所述分化培养基每周更换两次。
所述单核细胞在分化培养基中培养时，大约一周后未检测到该单核细胞的形态变化。所述神经细胞集落在大约4周后出现，并且持续增殖。大约八周后观察到具有长轴突和短树突的神经元和只具有短树突的星形胶质细胞。此外，实施例3证实从大约8周开始即使在只含有表皮生长因子的培养基中仍保持相同形态增殖。
与在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养相反，在只含有表皮生长因子的培养基中所述单核细胞没有分化成神经细胞，并且在只含有肝细胞生长因子的培养基中所述单核细胞在早期分化并且因此没有增殖。
下表1中展示了所述单核细胞未经铺满培养，在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养大约4周后细胞增殖的数目。表2展示了在表1中预处理的细胞分别在只含有表皮生长因子或肝细胞生长因子的培养基中培养大约4周和大约8周后的细胞增殖行为(早期接种的细胞数为约1×105)。
实施例4铺满培养后单核细胞向神经细胞的分化
实施例4证实了实施例2培养的单核细胞经过大约24小时的铺满培养后，在含有约10纳克/毫升的表皮生长因子(Gibco BRL)和约20纳克/毫升的肝细胞生长因子(R&D systems)的培养基中分化成神经细胞。然后所述分化培养基每周更换两次。
所述单核细胞在分化培养基中培养时，神经细胞集落在大约一周后开始出现，并且持续增殖(参见图1)。在所述单核细胞在分化培养基中培养时，大约2周后观察到具有长轴突和短树突的神经元和只具有短树突的星形胶质细胞(参见图2和图3)。此外，实施例4证实从大约2周开始即使在只含有表皮生长因子的培养基中仍保持相同形态增殖。
与在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养相反，在只含有表皮生长因子的培养基中所述单核细胞没有分化成神经细胞，并且在只含有肝细胞生长因子的培养基中所述单核细胞在早期分化并且因此没有增殖。
下表1中展示了所述单核细胞经过大约24小时的铺满培养后，在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养大约2周后细胞增殖的数目。表2展示了细胞分别在只含有表皮生长因子或肝细胞生长因子的培养基中培养大约4周和大约8周作为预处理后，细胞增殖的数目(早期接种的细胞数为约1×105)。
表1
预处理   时间(周)   接种的细胞数   只含有肝细胞生长因子   只含有表皮生长因子   表皮生长因子和干细胞生长因子
  未铺满培养   4   7.5×107   没有增殖   1×105   2.0×105
  铺满培养   2   7.5×107   没有增殖   1.2×105   1.8×105
表2
预处理   时间(周)   只含有肝细胞生长因子 只含有表皮生长因子   表皮生长因子和干细胞生长因子
  未铺满培养   4   没有增殖   2×105   2×105
  8   没有增殖   5×105   1×105
铺满培养   4   没有增殖   2×105   1.7×105
  8   没有增殖   5×105   1.3×105
实施例5免疫细胞化学I
将实施例3和实施例4分化的细胞以大约1×104个细胞/平方厘米粘附在盖玻片表面。随后，上述细胞用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤约5分钟，用含有4重量％低聚甲醛的0.1M磷酸缓冲液固定大约15分钟，然后用0.1M的PBS(磷酸盐缓冲生理盐溶液)洗涤两次约15分钟。然后所述固定的细胞用含有0.1重量％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和0.2重量％tritonX-100的0.1M的PBS处理大约5分钟，向固定的细胞中加入第一抗体，并且使所述固定的细胞和第一抗体反应大约16小时。对于第一抗体，可以使用抗人神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE，Chemicon)、抗人NeuN(Chemicon)、抗人微管蛋白III(anti-human tubulin III)(Sigma)、抗人胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，Sigma)以及抗人微管联合蛋白-2(microtubule-associated protein-2，MAP-2)抗体。与第一抗体反应后，除去未结合的第一抗体，将与第一抗体反应的细胞用含有0.5重量％BSA的0.1M的PBS洗涤两次，每次大约5分钟。向与第一抗体反应的细胞加入第二抗体，将添加有第二抗体的细胞孵育大约30分钟。然后用含有0.5重量％BSA的0.1M的PBS洗涤孵育的细胞两次，每次大约15分钟。使用包括抗生物素蛋白-生物素的Vectastain Elite ABC试剂盒(VectorLaboratory Inc)与所述孵育细胞反应大约30分钟。反应的细胞用0.1M的PBS洗涤两次，每次大约5分钟，并与作为显色底物的3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride dehydrate，DAB，Sigma)反应大约5分钟。向与DAB反应大约5分钟的细胞中加入0.1M的PBS以终止该反应，用0.1M的PBS洗涤结束反应的细胞两次，每次大约5分钟。干燥反应物，并用蒸馏水洗涤。所得的干燥反应物按蒸馏水、70重量％乙醇、80重量％乙醇、95重量％乙醇和100重量％乙醇的顺序脱水并固定。
图4展示了免疫细胞化学结果，所述分化的细胞在诸如NeuN、NSE、MAP-2和微管蛋白III的神经元标记以及如GFAP的星形胶质细胞标记中染色呈阳性，但是所述分化的细胞在如OX-42的小胶质细胞标记中染色呈阴性。结果显示所述单核细胞在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中不仅在形态上而且在生物化学上分化成神经元和星形胶质细胞，但是所述单核细胞不能分化成小胶质细胞。
所述单核细胞分别在只含有表皮生长因子的培养基中培养，在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养，以及铺满培养大约24小时后在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养。随后，所得分化的细胞通过免疫细胞化学染色以观察神经元(NeuN、NSE、MAP-2和微管蛋白III阳性染色)和星形胶质细胞(GFAP阳性染色)的比率。结果如表3所示。
表3
  时间(周)   NSE   NeuN   GFAP   MAP-2   阴性细胞
  只含有表皮生长因子   4   0.9％   0.8％   1.2％   .   89％
  表皮生长因子和干细胞生长因子   2   10％   25％   4％   .   70％
  表皮生长因子和干细胞生长因子   4   56％   75％   24％   .   20％
  约24小时铺满培养后，表皮生长因子和干细胞生长因子 2 62％ 88％ 31％ 11％ 10％
如表3所示，当所述单核细胞铺满培养大约24小时后在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中分化2周后，大约80数量％的细胞分化成神经细胞；约70数量％的神经细胞为神经元，约30数量％的神经细胞为星形胶质细胞。
实施例6间充质干细胞的分离和培养
为了证实所述间充质干细胞是否分化成神经细胞，从得自骨髓的单核细胞中分离所述间充质干细胞，并进行分化能力实验。
在培养瓶中接种1×106细胞/平方厘米的实施例2中培养的所述单核细胞，并在约37℃的温度下于CO2培养箱中孵育。使用添加有10重量％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的低浓度葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium，DMEM，Gibco BRL)作为培养基。在培养所述单核细胞约1周至约2周后，所述单核细胞为了传代培养而完全增殖，并且所述单核细胞传代培养20次后持续增殖。
所述得自骨髓的单核细胞组包括白细胞、淋巴细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和干细胞。所述干细胞可以分化成白细胞、淋巴细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等。所述干细胞指造血干细胞和间充质干细胞。所述造血干细胞形成诸如红细胞、白细胞和淋巴细胞的血细胞，在一般培养基中不能持续增殖，并且分化成成熟细胞，因此持续增殖的细胞为间充质干细胞。
实施例6通过加入多种细胞因子，以考察确定上述得到的细胞是否具有间充质干细胞的分化能力。即测试分化成诸如成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的结缔组织的可能性。
为了分化成成骨细胞，用100mM的地塞米松、10mM磷酸甘油、50nM抗坏血酸-2-磷酸酯以及10重量％胎牛血清(FBS)孵育上述得到的添加有多种细胞因子的细胞。为了分化成成软骨细胞，所述孵育的细胞在1500转/分下离心10分钟以使该孵育的细胞形成小球，然后在无血清的状态下，向所述小球中加入100nM地塞米松和10纳克/毫升转化生长因子-3(TGF-3)。为了转化成脂肪细胞，用0.5mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、1mM地塞米松、10克/毫升胰岛素和10nM消炎痛(indomethacine)孵育上述得到的添加有多种细胞因子的细胞(Pittenger等，Science 284：143-147，1999)。向每种细胞的分化可以分别通过下列方法证实：在成骨细胞中进行碱性磷酸酯酶着色(Jaiswal等，J.Cell Biochem.64(2)143-147，1999)，在成软骨细胞中通过甲苯胺蓝反向PCR(RT-PCR)进行II型胶原(type II collagen)着色(Mackay等，Tissue Eng.4(4)：415-428，1998)以及在脂肪细胞中进行油红O着色。
结果见图5a、图5b和图5c，均为阳性染色。体外培养的所述间充质干细胞仍然具有分化成诸如成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的结缔组织的能力。
实施例7未经铺满培养的所述间充质干细胞向神经细胞的分化
为了证明实施例6分离的所述间充质干细胞不经过铺满培养是否能分化成神经细胞，将在含有10重量％FBS的低葡萄糖浓度DEME中体外培养的所述间充质干细胞，在含有约10纳克/毫升的表皮生长因子和约20纳克/毫升的肝细胞生长因子的分化培养基中按照实施例3的方法培养8周。
结果与从得自骨髓的单核干细胞分化的神经细胞相同；大约1周后未检测到形态变化，所述神经细胞集落大约4周后出现，并且在大约5周后持续增殖。实施例7证实，大约8周后即使在只含有表皮生长因子的培养基中仍保持相同形态增殖。
实施例8铺满培养后间充质干细胞向神经细胞的分化
为了证明实施例6分离的所述间充质干细胞是否分化成神经细胞，将在含有10重量％FBS的低葡萄糖浓度DEME中体外培养的所述间充质干细胞铺满培养约24小时后，在含有约10纳克/毫升的表皮生长因子和约20纳克/毫升的肝细胞生长因子的分化培养基中按照实施例4的方法培养2周。
结果与从得自骨髓的单核干细胞分化的神经细胞相同；大约1周后未检测到形态变化，并且大约2周后持续增殖(参见图6和图7)。实施例8证实，大约2周后即使在只含有表皮生长因子的培养基中仍保持相同形态增殖。
实施例9免疫细胞化学II
实施例7和实施例8中分化的细胞按照实施例5的方法通过免疫细胞化学染色。结果与从得自骨髓的单核干细胞分化的神经细胞相同；从间充质干细胞分化的神经细胞在诸如NeuN、NSE、MAP-2和微管蛋白III的神经元标记以及如GFAP的星形胶质细胞标记中染色呈阳性(图8a、图8b、图8c和图8d)。在进行铺满培养作为预处理的情况下，结果显示所述间充质干细胞分化成神经元和星形胶质细胞，并且与没有进行铺满培养作为预处理的情况相比，分化速度加快了两倍，分化率提高了80％至90％。
实施例10
为了证明从间充质干细胞分化来的神经细胞功能与人类神经细胞功能是否相当，通过当将所述神经细胞移植到动物损伤部位时，所述神经细胞到达并修复损伤部位实现实施例10。
为了诱导公知的人类普通的神经退行性疾病——缺血性脑病，切开实验大鼠的脑部，中部脑动脉结扎1小时，然后再次松开，以便使实验大鼠脑在大脑皮层局部患上缺血性疾病。然后静脉注射约3×105个按照实施例8的方法制备的神经细胞。所述注射的神经细胞用半乳糖苷酶(LacZ)染色以区别于其它细胞。
静脉注射一周后，对实验大鼠的脑进行切片，并通过光学显微镜观察。结果见图9；图9a展示了诱导局部缺血性疾病前的大鼠脑照片；图9b展示了诱导缺血性疾病后，静脉注射神经细胞大约2周的大鼠脑照片；图9c展示了图9b局部缺血部位的放大照片。
如图9a和图9b所示，明显证明了正常脑和缺血性脑的区别。特别是检测到在图9b和图9c中染色淡的细胞用LacZ染色很浓。因此，所述神经细胞选择性到达损伤部位。也就是说，所述间充质干细胞正常分化成神经细胞，并且该神经细胞定位在合适的部位。因此在本发明中分化的神经细胞对神经退行性疾病有作用。
工业实用性
如上说述，本发明提供了使间充质干细胞或单核细胞分化和增殖成由神经元和星形胶质细胞组成的神经细胞的方法，该方法在时间、效率和成熟程度这些方面更加有效，本发明还提供了足够量的神经细胞以制备用于治疗神经退行性疾病的药物组合物。由于在细胞中使用天然化合物，因此该方法安全并且在临床应用中没有问题。由于从病人骨髓得到大量神经细胞，因此该方法能提供足够量的神经细胞而且不会产生免疫反应。

Claims (8)

1、一种使间充质干细胞分化增殖成神经细胞的方法，该方法将间充质干细胞铺满培养后，再在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中进行培养。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞铺满培养1小时至50小时，然后在含有1至10000纳克/毫升表皮生长因子和1至10000纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养一周以上。
3、根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞铺满培养24小时，然后在含有10纳克/毫升表皮生长因子和20纳克/毫升肝细胞生长因子的培养基中培养一周以上。
4、根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述间充质干细胞在含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基中培养2周，然后将所述含有表皮生长因子和肝细胞生长因子的培养基换成只含表皮生长因子的培养基。
5、根据权利要求4所述的方法，其中，所述间充质干细胞得自人类骨髓。
6、根据权利要求4所述的方法，其中，所述间充质干细胞为得自人类骨髓的包括间充质干细胞的单核细胞。
7、通过权利要求1-6中任意一项所述的方法分化的神经细胞在治疗创伤中枢神经系统疾病或脊髓损伤中的应用。
8、一种治疗创伤中枢神经系统疾病或脊髓损伤的方法，该方法包括将通过权利要求1-6中任意一项所述的方法分化的神经细胞给予包括人类在内的哺乳动物。
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