DE19843234A1 - Differenzierte Herzzellen mit pathologischen Merkmalen als in vitro-Modell für Herzerkrankungen - Google Patents
Differenzierte Herzzellen mit pathologischen Merkmalen als in vitro-Modell für HerzerkrankungenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Herzzellen mit pathologischen Merkmalen, ihre Entwicklung aus embryonalen Stammzellinien und ihre Verwendung, insbesondere als vitro-Modell für Herzerkrankungen (z. B. Arrhythmie, Hypertrophie, Ischämie). Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Pharmakologie und die Medizin (Kardiophysiologie). DOLLAR A Die Erfindung hat zum Ziel, durch geeignete Wahl der Differenzierungsbedingungen Zellinien mit pathologischen Merkmalen zu gewinnen, die für spezifische Anwendungen in der Pharmakologie (Screening von Wirkstoffen) und der Medizin (Entwicklung von Therapiestrategien) dienen können. DOLLAR A Differenzierte Herzzellen aus embryonalen Stammzellinien als in vitro-Modell für Herzerkrankungen (Arrhythmie, Hypertrophie, Ischämie) werden gemäß der Erfindung durch embryoid body Differenzierung von ES-Zellen, EC-Zellen oder EG-Zellen von Vertebraten (einschließlich des Menschen) in der Massenkultur ('mass culture'), im hängenden Tropfen ('hanging drop') oder mit Hilfe anderer Verfahren erhalten, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß während der Differenzierung Agenzien zugesetzt oder Kulturbedingungen gewählt werden, die das normale Differenzierungsprogramm dahingehend verändern, daß ein verändertes Entwicklungsprogramm aktiviert wird, so daß Herzzellen differenziert werden, die pathologische Merkmale aufweisen.
Description
Die Erfindung betrifft Herzzellen mit pathologischen Merkmalen,
ihre Entwicklung aus embryonalen Stammzellinien und ihre
Verwendung, insbesondere als in vitro-Modell für Herzerkrankungen
(z. B. Arrhythmie, Hypertrophie, Ischämie). Anwendungsgebiete der
Erfindung sind die Pharmakologie und die Medizin
(Kardiophysiologie).
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), embryonale Karzinomzellen
(EC-Zellen) und embryonale Keimzellen (aus primordialen
Keimzellen etablierte EG-Zellen) differenzieren, wenn sie in
dreidimensionalen Aggregaten, sogenannten "embryoid bodies" (EBs)
kultiviert werden, in funktionelle Herzzellen in vitro. Es
handelt sich bei diesen ES-, EC- oder EG-Zellen um permanente
Zellinien, die sich durch Eigenschaften undifferenzierter
embryonaler Zellen auszeichnen und die nach Entwicklung in der
Zellkultur funktionelle Eigenschaften differenzierter Zellen
ausprägen.
Für aus ES-Zellen differenzierte Herzzellen konnte nachgewiesen
werden, daß diese im Hinblick auf Genexpression und funktionelle
Eigenschaften den spezialisierten Zellen des Atriums, des
Ventrikels und des Schrittmacherzentrums entsprechen. Die
Herzzellen reagieren mit charakteristischen chronotropen Effekten
auf kardiotrope Agenzien (Wobus et al. 1991, Differentiation
(1991) 48: 173-182; Wobus et al., In vitro Cell. Dev. Biol. 1994,
425 [siehe Patentschrift DD 299 439/B5]). Ein kürzlich
entwickeltes Verfahren ermöglicht die computergestütze Erfassung
chronotroper Effekte für Routineuntersuchungen pharmakologischer
Eigenschaften von herzaktiven Verbindungen (Pich et al., Bioforum
20: 536-540, 1997).
Die Wahl der Kulturbedingungen bestimmt die Effizienz der
Herzzelldifferenzierung sowie das Differenzierungsmuster, d. h.,
durch exogene Einflüsse kann das Differenzierungsprogramm
moduliert und die Differenzierungsinduktion in einen bestimmten
Herzzelltyp erreicht werden. So wurde z. B. für die spezifische
Induktion in ventrikuläre Zellen die zeitabhängige Behandlung mit
einer bestimmten Konzentration des Differenzierungsinduktors
Retinsäure (RA) als effektive Differenzierungsinduktion ermittelt
(Wobus et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 29, 1525-39, 1997).
Die Erfindung hat zum Ziel, durch geeignete Wahl der
Differenzierungsbedingungen Zellinien mit pathologischen
Merkmalen zu gewinnen, die für spezifische Anwendungen in der
Pharmakologie (Screening von Wirkstoffen) und der Medizin
(Entwicklung von Therapiestrategien) dienen können.
Die Erfindung wird gemäß den Patentansprüchen realisiert, das zu
schützende Verfahren zeichnet sich durch folgende Schritte aus:
- 1. ES-Zellen, EC-Zellen oder EG-Zellen von Vertebraten werden in an sich bekannter Weise in embryoähnlichen Aggregaten, den sogenannten "embryoid bodies" (EBs) differenziert. Dabei spielt es keine Rolle, ob die embryoid body-Differenzierung in der Massenkultur ("mass culture") oder in anderen Kulturverfahren, z. B. im hängenden Tropfen, erfolgt.
- 2. Während der Differenzierung werden gemäß der Erfindung Agenzien zugesetzt oder Kulturbedingungen gewählt, die das normale Differenzierungsprogramm dahingehend verändern, daß ein verändertes Entwicklungsprogramm aktiviert wird, so daß Herzzellen differenziert werden, die pathologische Merkmale entwickeln. Durch Wahl bestimmter Induktoren (z. B. extrazelluläre Matrixfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren) können z. B. vorwiegend Schrittmacherzellen mit arrhythmischen Aktionspotentialen differenziert werden. Andere Versuchsbedingungen können zur Entwicklung vorwiegend von Herzzellen mit Eigenschaften hypertropher Zellen führen, eine Entwicklung, die z. B. mit einer Reaktivierung der Expression fetaler Gene verbunden ist.
- 3. Die EBs werden nach einer geeigneten Zeit, in der Regel nach 5 bis 7 Tagen der Suspensionskultur, auf adhäsive Unterlagen gebracht, wo sie anheften und neben epithelialen und anderen Zellen Areale spontan pulsierender Herzzellen auswachsen.
- 4. Zur Entwicklung von arrhythmisch schlagenden Herzzellen aus
ES-Zellen (es kann jede beliebige ES-Zellinie eingesetzt werden)
wurde die Behandlung der differenzierenden EBs erfindungsgemäß
mit einem komplexen Gemisch aus extrazellulären Matrixproteinen
und Wachstumsfaktoren (MATRIGEL) nach dem folgenden Verfahren
eingesetzt. Dabei kann jedes Verfahren der EB-Differenzierung
eingesetzt werden, das eine genügend hohe Ausbeute an spontan
schlagenden Herzzellen ergibt (siehe Anmerkung unter 1):
Versuchablauf zur Entwicklung arrhythmisch pulsierender Herzzellen, schematisch dargestellt in Abb. 1 mit einem gewählten Beispiel von 5 Tagen der EB-Differenzierung und Plattierung.- a) ES-Zellen (z. B. n = 600 Zellen) der Linie Rl oder anderer ES-, EC- oder EG-Zellinien werden im hängenden Tropfen in 20 µl Differenzierungsmedium für die Dauer von 2-3 Tagen und anschließend für die Dauer von 2 bis 6 Tagen (in der Regel von 3-4 Tagen) in Suspensionskultur in bakteriologischen Petrischalen kultiviert. ISCOVE-Medium (Gibeo, BRL) wird mit L-Glutamin, nichtessentiellen Aminosäuren, Monothioglycerol und 20% fötalem Kälberserum supplementiert. Es ist prinzipiell jedes Medium geeignet, das eine genügend hohe Ausbeute an spontan pulsierenden Herzzellen ergibt.
- b) 5 bis 7 Tage alte EBs (in der Regel werden 5 Tage alte EBs
plattiert) werden auf Gewebekulturschalen plattiert, die vorher
mit 10 µg/ml Matrigel (z. B., MATRIGEL®"Brand", = basement
membrane matrix, Collaborative Biomedical Products) beschichtet
wurden. Das eingesetzte Matrigel hat im einzelnen die folgende
Zusammensetzung:
Zusammensetzung von Matrigel Komponente MATRIGEL Matrix Laminin (mg/mg Protein) 0,81 Collagen IV (mg/mg Protein) 0,45 Heparan Sulfate 0,025 AL=L<Proteoglycan (mg GAG/mg Protein) Entactin (mg/mg Protein) 0,12 EGF (ng/ml) 0,5-1,3 IGF-1 (ng(ml) 15,6 PDGF (pg/ml) 12 NGF (ng/ml) <0,2 TGF-beta (ng/ml) 2,3 % Protein-Gel 80
Nach wenigen Tagen der Kultur wachsen differenzierte Zellen,
einschließlich spontan pulsierender Herzzellen, aus den EBs aus.
- a) Die Matrigel-Behandlung wird als Überschichtung ("overlay") während der folgenden Kulturtage im Abstand von 1 bis 3 Tagen bis zu 4 mal wiederholt. Dabei wird das Medium entfernt und frisches Differenzierungsmedium, das Matrigel enthält, den Kulturen zugesetzt. Bereits eine einmalige Gabe von Matrigel führte zu einer Erhöhung der Herzzell-Differenzierung, einem verlängerten Zeitmuster schlagender Herzzellen im Differenzierungsverlauf sowie zu einer Zunahme des Anteils arrhythmisch pulsierender Herzzellen, im Vergleich zu solchen Kulturen, die ohne Matrigel kultiviert wurden (= Kontrolle). Eine viermalige wiederholte Gabe von Matrigel erhöhte die Effizienz der Herzzelldifferenzierung sowie den Anteil arrhythmisch pulsierender Herzzellen im Vergleich zur Kontrolle. So sind in den Matrigel-behandelten Kulturen 26 Tage nach Plattierung 5 Tage alter embryoid bodies (= 5 + 26d, siehe Abb. 2) 45.0% arrhythmisch pulsierende Areale vorhanden, während in den Kontrollen nur 12.5% arrhythmisch pulsierende Areale - bei wesentlich geringerer Herzzelldifferenzierungeffizienz (siehe Abb. 2) - vorhanden sind.
Während in den Kontrollzellen der Anteil an spontan schlagenden
Herzzellen etwa am Tag 36 nach Plattierung 5 Tage alter EBs gegen
Null geht, enthalten die Matrigel-induzierten Kulturen in etwa 60
bis 70% der EBs spontan schlagende Areale mit Herzzellen, d. h.,
es sind noch Zellen mit Schrittmacheraktivität vorhanden. Diese
Zellen zeigen jedoch vorwiegend arrhythmische Aktionspotentiale
mit z. T. hohen Pulsations-Frequenzen.
Obwohl in den Kontrollkulturen auch einzelne Areale spontan
pulsierender Herzzellen arrhythmische Pulsationsfrequenzen
zeigen, ergibt erst die Matrigel-Induktion die für die
Screeninguntersuchungen der pharmakologischen Wirkung von Anti-
Arrhythmika erforderliche Anzahl von arrhythmisch schlagenden
Herzzellen.
- a) In Versuchen mit isolierten Herzzellen konnte gezeigt werden, daß Matrigel den Anteil der Zellen mit Schrittmacheraktivität signifikant erhöhte und die Differenzierung in spezialisierte Herzzellformen hemmte, so daß der Induktion von Herzzellen in arrhythmisch pulsierende Herzzellen durch Matrigel offenbar eine fehlerhafte Entwicklung der Zellen mit Schrittmacheraktionspotentialen (pacemaker action potentials) zugrundeliegt, d. h., es differenzieren offensichtlich weniger Zellen in spezialisierte Herzzellen, z. B. Ventrikelzellen.
- b) die Erfassung der Schlagfrequenz erfolgt mit Hilfe des Imaging-Systems LUCIA "Heart" (Nikon). Dabei werden Helligkeitsunterschiede in Frequenzmuster überführt und die Werte computergestützt digitalisiert und erfaßt.
- c) die Matrigel-induzierten Herzzellen werden dann eingesetzt, um die Wirksamkeit von Anti-Arrhythmika zu untersuchen. Dabei entspricht das Vorgehen prinzipiell dem im Patent DD 299 439/B5 beschriebenen Verfahren einer kumulativen Wirkstoffzugabe und einer Messung der die Schlagfrequenz normalisierenden Effekte mit Hilfe des Imaging-Verfahrens (siehe Abb. 3 und 4).
Damit steht erstmals ein Herzzellmodell zur Verfügung, das
geeignet ist, die Wirkung von Anti-Arrhythmika in vitro zu
testen.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt
werden, um andere pathologische Veränderungen in den
differenzierten Herzzellen zu erzielen, um daraus weitere in
vitro-Modelle für Hetzkrankheiten zu entwickeln:
Die exogene Gabe von Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder Hormonen auf differenzierende EBs bzw. die Überexpression in ES-Zellen von Genen, die TNF-alpha oder andere Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren oder Hormone kodieren, und nachfolgende Herzzelldifferenzierung kann zur Entwicklung von Herzzellen mit hypertrophen Eigenschaften führen, was mit einer Reaktivierung der Expression fetaler Gene (z. B. β-MHC, ANF, smooth muscle Aktin, c-fos, c-jun u. a. "immediate early genes") einhergeht.
Die exogene Gabe von Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder Hormonen auf differenzierende EBs bzw. die Überexpression in ES-Zellen von Genen, die TNF-alpha oder andere Zytokine bzw. Wachstumsfaktoren oder Hormone kodieren, und nachfolgende Herzzelldifferenzierung kann zur Entwicklung von Herzzellen mit hypertrophen Eigenschaften führen, was mit einer Reaktivierung der Expression fetaler Gene (z. B. β-MHC, ANF, smooth muscle Aktin, c-fos, c-jun u. a. "immediate early genes") einhergeht.
Weiterhin können durch Unterversorgung mit Nährstoffen
(Glukoseentzug) oder Sauerstoffmangel ischämische Reaktionen in
den differenzierenden Herzzellen ausgelöst werden.
Das ES-Zelldifferenzierungsmodell pathologischer Herzzellen ist
geeignet, im Vorfeld der Etablierung von Therapiestrategien für
ischämische Veränderungen kardiovaskulärer (aber auch neuronaler)
Gewebe und Organe oder von hypertrophen Herzzellen die Bedeutung
intrazellulärer Signalwege zu analysieren und effiziente
Behandlungsstrategien für den Einsatz am Menschen zu erarbeiten.
Das Verfahren ist in der Zukunft besonders dann geeignet, wenn
zur Herzzelldifferenzierung embryonale Stammzellen des Menschen,
die z. B. aus primordialen Keimzellen etabliert werden können,
eingesetzt werden.
Claims (8)
1. Differenzierte Herzzellen aus embryonalen Stammzellinien als
in vitro-Modell für Herzerkrankungen (Arrhythmie, Hypertrophie,
Ischämie) durch embryoid body Differenzierung von ES-Zellen, EC-
Zellen oder EG-Zellen von Vertebraten (einschließlich des
Menschen) in der Massenkultur ("mass culture"), im hängenden
Tropfen ("hanging drop") oder mit Hilfe anderer Verfahren,
dadurch gekennzeichnet, daß während der Differenzierung Agenzien
zugesetzt oder Kulturbedingungen gewählt werden, die das normale
Differenzierungsprogramm dahingehend verändern, daß ein
verändertes Entwicklungsprogramm aktiviert wird, so daß
Herzzellen differenziert werden, die pathologische Merkmale
aufweisen.
2. Differenzierte Herzzellen nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß extrazelluläre Matrixfaktoren und
Wachstumsfaktoren zugesetzt werden, die zu einem atypischen
Entwicklungsverlauf der Herzzelldifferenzierung, verbunden mit
der Differenzierung einer erhöhten Anzahl von Schrittmacherzellen
und in der Folge zu Herzzellen mit arrhythmischen
Aktionspotentialen führen.
3. Differenzierte Herzzellen nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß durch die exogene Gabe von Zytokinen,
Wachstumsfaktoren oder Hormonen auf differenzierende EBs bzw. die
Überexpression in ES-Zellen von Genen, die TNF-alpha, Zytokine
bzw. Wachstumsfaktoren oder Hormone kodieren, und nachfolgende
Herzzelldifferenzierung dieser transgenen ES-Zellen vorwiegend
Herzzellen mit hypertrophen Eigenschaften differenziert werden
(Re-Expression fetaler Gene, z. B. beta-MHC, ANF, SM-Aktin,
Aktivierung von c-fos, c-jun).
4. Differenzierte Herzzellen nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß durch Unterversorgung mit Nährstoffen
(Glukoseentzug) oder Sauerstoffmangel Herzzellen mit
Eigenschaften ischämischer Zellen differenziert werden.
5. Verfahren zur Herstellung differenzierter Herzzellen nach
Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß nach an sich
bekannten Verfahren erhaltene 5-7 Tage alte embryoid bodies auf
Gewebekulturen plattiert werden, die vorher mit einem komplexen
Gemisch aus extrazellulären Matrixproteinen und Wachstumsfaktoren
(MATRIGEL) beschichtet wurden, und die Matrigelbehandlung während
der folgenden Kulturtage im Abstand von 1-3 Tagen als
Überschichtung wiederholt wird.
6. Verwendung der differenzierten Herzzellen nach Anspruch 1, 2
und 5 als in vitro-Modell für Arrhythmien, dadurch
gekennzeichnet, daß potentielle Anti-Arrhythmika den pulsierenden
Herzzellen kumulativ zugegeben werden und die die Schlagfrequenz
betreffenden normalisierenden Effekte gemessen werden.
7. Verwendung der differenzierten Herzzellen nach Anspuch 1 und 3
als in vitro Modell zur Entwicklung von Therapiestrategien gegen
kardiale Hypertrophie.
8. Verwendung der differenzierten Herzzellen nach Anspuch 1 und 4
als in vitro Modell zur Entwicklung von Therapiestrategien gegen
Ischämie.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998143234 DE19843234A1 (de) | 1998-09-09 | 1998-09-09 | Differenzierte Herzzellen mit pathologischen Merkmalen als in vitro-Modell für Herzerkrankungen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19843234A1 true DE19843234A1 (de) | 2000-03-23 |
Family
ID=7881701
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| DE1998143234 Ceased DE19843234A1 (de) | 1998-09-09 | 1998-09-09 | Differenzierte Herzzellen mit pathologischen Merkmalen als in vitro-Modell für Herzerkrankungen |
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|---|---|
| DE (1) | DE19843234A1 (de) |
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1998
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