DE19500498C2

DE19500498C2 - Matrixkörper für die Messung isometrischer Kraftparameter von Zellgewebe, Verfahren zum Herstellen des Matrixkörpers, Set für dieses Verfahren und Verwendung des Matrixkörpers zum Kultivieren von Kardiomyozyten

Info

Publication number: DE19500498C2
Application number: DE1995100498
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Med Eschenhagen; Elliot L Elson; Michael Kolodney; Tetsuro Wakatsuki
Original assignee: Individual
Current assignee: Medigene AG
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1995-01-10
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2015-01-11
Also published as: DE19500498A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Matrixkörper für die Messung isometri scher Kraftparameter von Zellgewebe, bestehend aus zwei platten förmigen, parallel angeordneten, in eine Spann- und Meßvorrichtung einhängbaren Halteteilen, einer dazwischen gespannten Matrix aus erstarrtem Kollagengel und darin eingebettetem, durch Kultivierung entstandenen Zellgewebe, wobei die Matrix mit den Halteteilen ver bunden ist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen des Ma trixkörpers, bei dem Kardiomyozyten in Kollagengel kultiviert wer den und Kontraktionen des Herzmuskelgewebes meßbar verfolgt werden können, wobei zunächst eine Kollagengelmatrix hergestellt wird, indem in einem sterilen Gefäß auf Eis Kollagenlösung, Pri märkulturmedium, das mit Pferdeserum angereichert ist und Hühn chenembryoextrakt enthält, und 0,1 M Alkalihydroxid zusammenge geben werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Set zum Herstellen eines Matrixkör pers aus Kollagengel und eingelagerten Zellkulturen für die Mes sung von isometrischen Kraftparametern von Muskelgewebe aus den Zellkulturen, für den oben genannten Matrixkörper und für das ge nannte Verfahren.

Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung des Matrixkörpers zum Kultivieren von Kardiomyozyten in Kollagengel.

Der Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht, geht aus folgenden Literaturstellen hervor.

A) Im Journal of Cell Biology, Vol. 117, Nr. 1, April 1992, Seiten 73 bis 82, 1992 (Kolodney und Wysolmerski) ist ein Verfahren be schrieben, bei dem Fibroblasten der 2. Zellpassage bzw. Endo thelzellen in Kollagengelen eingebracht und kultiviert und im Hinblick auf ihre Kontraktionskraft isometrisch gemessen wur den. Es handelt sich somit bei dem bekannten Verfahren um eine andere Fragestellung, nämlich darum, tonische (d. h. langsam auftretende und lang anhaltende) Kräfte an Nichtmuskelzellen zu messen. Die bei diesem Verfahren benutzte Meßvorrichtung ist horizontal angeordnet. Der Matrixkörper für die Messung isome trischer Kraftparameter von Zellgewebe, besteht dort aus zwei plattenförmigen, parallel angeordneten, in eine Spann- und Meß vorrichtung einhängbaren Halteteilen aus porösem Polyethylen, einer dazwischen gespannten Matrix aus erstarrtem Kollagengel und darin eingebettetem, durch Kultivierung entstandenen Zell gewebe, wobei die Matrix mit den Halteteilen dadurch verbunden ist, daß das erstarrte Kollagen mit dem darin enthaltenen Zell gewebe in die Poren der Haltekörper eingedrungen ist. Für schnelle Kraftfrequenzen reicht diese Bindung in der Regel nicht aus. Die horizontale Anordnung der Meßvorrichtung ist umständ lich, technisch aufwendig und störanfällig.
B) Im Journal of Biological Chemistry, Vol. 268, Seiten 23850 bis 55, 1993 (Kolodney und Elson) ist ein Verfahren beschrieben, bei dem ebenfalls Fibroblasten in Kollagengel eingebettet wer den, dann daraus Matrixkörper gebildet werden und an diesen Messungen vorgenommen werden. Es geht dort um die Frage, ob die unter Zugabe von Kälberserum beobachtete Zunahme der Kontraktionskraft bei diesen Fibroblasten mit einer Zunahme der Phosphorylierung von bestimmten regulatorischen Proteinen der Muskelfilamente einhergeht. Die Veröffentlichung zielt somit auf Mechanismen der Regulation der Kontraktionskraft in Nichtmus kelzellen. Bei diesem bekannten Verfahren wird zwar die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Grundvorrichtung beschrie ben, jedoch unterscheidet sich die Erfindung von dem bekannten Verfahren und der bekannten Vorrichtung in mehrfacher Weise, worauf später ins einzelne gehend eingegangen wird.
C) In der Zeitschrift "In Vitro Cell. Dev. Biol.", Seiten 28A: 199 bis 204, März 1992 (Souren et al.) ist lediglich beschrieben, daß Kardiomyozyten auf einer präformierten Matrix als Monoschicht wachsen und spontan schlagen. Die Veröffentlichung berichtet, daß es unter den untersuchten Bedingungen nicht gelang, Kar diomyozyten in der Matrix wachsen zu lassen. Die meßbaren Kräfte sind unter diesen Bedingungen derart klein, daß auswert bare Ergebnisse nicht erzielt werden. Außerdem ist das Zumi schen anderer Zelltypen nicht möglich. Aus alledem folgt, daß der Ansatz dieser Veröffentlichung für die vorliegende Erfindung nicht relevant ist.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist mehrteilig.

Zunächst soll ein Matrixkörper erzielt werden, der es erlaubt, iso metrische Messungen der Kraftparameter von Muskelzellgewebe in einer Weise durchzuführen, die stets reproduzierbare Werte liefert,
Zur Lösung dieses Teile der Aufgabe ist der Matrixkörper erfin dungsgemäß durch die Merkmale des Patentanspruches 1 gekenn zeichnet.

Bevorzugte Ausführungsformen sind durch die Merkmale der zuge hörigen Unteransprüche gekennzeichnet.

Die Erfindung soll auch ein Verfahren zur Herstellung des Matrixkörpers zum Kultivieren von Kardio myozyten in Kollagengel angeben, bei dem Matrixkörper aus einer Kollagengelmatrix entstehen, die eine einfache Handhabung für die weitere Behandlung ermöglichen und reproduzierbare verwertbare Ergebnisse der Messung an Muskelzellgewebe gewährleisten.

Zur Lösung dieses Teiles der Aufgabe ist das Verfahren erfindungs gemäß durch die Merkmale des Anspruches 8 gekennzeichnet.

Im Rahmen der Erfindung besteht ferner die Aufgabe, ein Set zum Herstellen des Matrixkörpers aus Kollagengel und eingelagerten Zellkulturen für die Messung von isometrischen Kraftparametern von Muskelgewebe aus den Zellkulturen anzugeben, mit dem Ziel, eine gezielte und schnelle Herstellung der Kollagengelmatrixkörper zu ermöglichen.

Zur Lösung dieses Teiles der Aufgabe ist das Set erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruches 11 gekennzeichnet.

Die Ausrüstung des Sets kann durch ein Formular für ein ausführli ches Protokoll ergänzt sein.

Die zur Aufgabe der Erfindung ferner gehörende Verwendung des Matrixkörpers zum Kultivieren von Kardiomyozyten ist Gegenstand des Anspruches 13.

Die in der Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendeten und nachfolgend angegebenen Begriffe haben im Sinne der Erfin dung folgende Bedeutungen:

1. Kollagenlösung: Kollagen Typ I, gelöst in einer organischen schwachen Säure, wie z. B. 0,02 M Essigsäure (z. B. ein Präparat der Fa. Upstate Biotechnology, Lake Placid, USA, das sich als besonders rein erwiesen hat).
2. Hühnchenembryoextrakt: Ein marktübliches Produkt (z. B. Gibco BRL 061-05115G).
3. Kollagenase Typ 2: gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlö sung (PBS), Endkonzentration 144 U/ml, z. B. Clostridium histo logicum (z. B. ein Präparat der Fa. Bibby Dunn, Asbach, in einer spezifischen Aktivität von 144 U/mg) Die Verwendung einer ge testeten Charge wird dringend empfohlen, andererseits ist sicher auch eine geringfügig abweichende Konzentration erfolgreich verwendbar.
4. Primärkulturmedium I: 2-fach konzentriertes synthetisches Kul turmedium: Es besteht aus 20 Teilen 10× konzentriertem Stan dardkulturmedium mit 45.000 mg/l Glukose, mit Phenolrot, ohne Natriumbikarbonat, ohne Glutamin, (z. B. Dulbeccos Minimal Es sential Medium = 2×DMEM Nr. 042-02501H der Fa. Gibco BRL, Eggenstein), 20 Teilen während 30 Minuten bei 56°C inaktivier tem Pferdeserum (z. B. Gibco BRL), 4 Teilen Rohextrakt aus Hühnchenembryonen (z. B. Gibco BRL, Nr. 061-05115G), 2 Teilen einer Standardlösung von Streptomycin (10.000 µg/ml) und Pe nicillin G (10.000 U/ml), 10 Teilen einer Standardlösung von 7,5% Natriumbikarbonat und 44 Teilen sterilem Wasser.
5. Primärkulturmedium II: es besteht aus einem einfach konzen trierten synthetischen Standardkulturmedium mit niedrigem Glu kosegehalt (1000 mg/l) und enthält kein Phenolrot (z. B. Dulbec cos Minimal Essential Medium =DMEM Nr. 041-01880H der Fa. Gibco BRL, Eggenstein) mit Zusatz von 10 Teilen während 30 Minuten bei 56°C inaktiviertem Pferdeserum (z. B. Gibco BRL) zwei Teilen Rohextrakt aus Hühnche nembryonen und einem Teil einer Standardlösung von Strep tomycin (10.000 µg/ml) und Penicillin G (10.000 U/ml) auf 100 Teile Medium.
6. Trypsin 0.25% und EDTA 0,1% (Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz), gelöst in PBS (ein entsprechendes Präparat bringt die Fa. Boehringer, Mannheim auf den Markt).
7. Alkalihydrogenlösung: Eine sterile, ca. 0,1 M Lösung von Natri um, Kalium oder Ammonium.
8. Stammlösungen für eine modifizierte Tyrode-Lösung: Stamm I {2,99 M NaCI, 0,134 M KCI, 45 mM CaCl₂, 26 mM MgCl₂ in Aqua bidestillata (A.bidest.)}, Stamm II (595 mM NaHCO₃ in A.bidest.), Stamm III (42 mM NaH₂PO₄ in A.bi-dest), sowie ge eignete Mengen Glukose, Ascorbinsäure und EDTA - (Ethylendiamaintetraessigsäure-Dinatriumsalz).
9. Tyrode-Lösung: Zum Ansetzen der modifizierten Tyrode-Lö sung werden z. B. 40 ml Stamm I, 38 ml Stamm II, 10 ml Stamm III und 1 g Glukose, 50 mg Ascorbinsäure und 18,6 mg EDTA auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml gebracht und vor dem Gebrauch mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid ausreichend begast. (Die Zusammensetzung der Tyrode-Lösung ist Standard und kann in etlichen Veröffentlichungen nachgelesen werden.) Die Art und Weise, die Tyrode Lösung zusammenzusetzen, und der Gebrauch der so modifizierten Tyrode-Lösung im Rahmen der Erfindung zur Kontraktionskraftmessung von Kollagematrices mit Muskel gewebe ist neu und bringt wesentliche Vorteile.

Die Erfindung unterscheidet sich von dem Verfahren der Veröffentli chung B in folgenden Punkten:

1. Anstelle von Fibroblasten wird Muskelzellgewebe, insbesondere Kardiomyozyten, eingesetzt.
2. Es liegt hier eine andere Fragestellung vor, nämlich insbesonde re, ob es möglich ist, isometrische Kräfteparameter an Muskel zellgewebe vorzunehmen.
3. Unter anderem ist die Verbindung zwischen Matrix und Haltetei len erheblich zugfester.
4. Es wird ein anderes Kulturmedium eingesetzt. Der Glukosegehalt ist von 4000 mg/l auf 1000 mg/l gesenkt, Phenolrot ist wegge lassen, es wird inaktiviertes Pferdeserum anstelle des foetalen Kälberserums eingesetzt und es wird Glutamin weggelassen. Diese Veränderungen sind für das Anwachsen der Muskelzellen, insbesondere der Kardiomyozyten notwendig.
5. Die Reihenfolge der Substanzzugabe wurde geändert. Während bei den Fibroblasten erst die Zellen und dann die Lauge zu dem Kollagen gegeben wird, ist durch die Erfindung festgestellt wor den, daß bei den sehr viel empfindlicheren Muskelzellen, insbe sondere bei Kardiomyozyten, erst sehr sorgfältig für die Neutral lisation der sauren Kollagenlösung gesorgt werden muß, bevor die Zellen zugegeben werden. Es zeigte sich, daß die Zeit den noch ausreicht, bevor das Kollagen durch die Neutralisation er starrt.
6. Das Medium des Organbades, in dem die Messung der isometri schen Kontraktionskraft vorgenommen wird, wurde vom Hepes- Puffer zu einer physiologischeren modifizierten Tyrode-Lösung verändert, da Muskelzellen, insbesondere Kardiomyozyten, emp findlich auf Hepes reagieren.
7. Es wurde die kontinuierliche Begasung des Organbadmediums mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid eingeführt. Dies stabi lisiert den pH-Wert der Tyrode-Lösung und sorgt für die essen tielle Sauerstoffversorgung der Muskelzellen, insbesondere der Kardiomyozyten, und damit für die notwendige Stabilität der Versuchsbedingungen.
8. Es wurde eine Elektrode entwickelt, die die kontinuierliche elektrische Stimulation und gleichzeitige Aufhängung der Kolla gengelmatrix mit den Muskelzellen, insbesondere den Kardiomy ozyten; im Organbad erlaubt (Stimulations- und Halteelektrode).

Das durch die Erfindung vorgeschlagene Set, das im Laborsprach gebrauch "Versuchskit" bezeichnet wird, stellt gewissermaßen eine Zusammenstellung aller Materialien dar, die für die Herstellung von zur Messung der isometrischen Kontraktionskraft geeigneten Kolla gengelmatrixkörpern benötigt werden, so daß die Erfindung ohne umfangreiche Vorarbeiten (Festlegung der benötigten Materialien und Gerätschaften, Beschaffung derselben etc.) durchgeführt wer den kann. Diese Komponenten sind nämlich entweder auf dem Markt nicht erhältlich oder, wenn sie auf dem Markt erhältlich sind, so sind sie für die Anwendung der Erfindung als besonders geeignet getestet worden. Einzelne Komponenten des "Versuchskits" sind ei gens für die Behandlung von Muskelzellen, insbesondere von Kar diomyozyten, entwickelt bzw. getestet worden und weichen von den in den Vorveröffentlichungen A) und B) beschriebenen Verfahrens komponenten deutlich ab.

Als Zellkulturschale kommen insbesondere runde Glasschalen mit einem Durchmesser von 10 cm in Frage, wie sie an sich be kannt und üblich sind. Das Material, der Hersteller oder die Größe der Zellkulturschalen sind für die Erfindung von unterge ordneter Bedeutung. Z.Zt. sind Glasschalen bevorzugt, aber auch Bechergläser oder sogenannte Uhrglasschalen sind ver wendbar. Die Gefäße sollten die Herstellung von Masken aus Silikon (reines Silikon) mit entsprechenden Ausnehmungen oder Ausstanzungen auf einfache Weise ermöglichen.

Als Halteteile sind entweder solche gemäß dem Patentanspruch 1 und seinen Unteransprüchen verwend bar. Diese Halteteile sind vorzugsweise mit selbstverhakendem Band(Klettband) versehen, die an den Halteteilen mittels Sili konkleber befestigt sind.

Die Abstandhalter bestehen aus gegenüber den Materialien, die beim Verfahren eingesetzt werden, indifferentem Metall, insbe sondere aus V2A-Stahl.

Die Aufhängevorrichtung für das Organbad enthält einen wasserab weisenden Synthetikfaden, einen dreieckigen Haken aus korro sionsbeständigem Stahl (z. B. V2A-Stahl) als Haltedraht, der sionsbeständigem Stahl (z. B. V2A-Stahl) als Haltedraht, der seitlich geöffnet ist, damit das obere Halteteil der Matrixkörper daran eingehängt werden kann, sowie die Stimulations- und Halteelektrode mit dem Haltedraht (siehe unten), an den das untere Halteteil der Matrixkörper eingehängt werden kann.

Die Stimulations- und Halteelektrode für den Kollagengelmatrixkör per besteht aus einem 10 × 3 mm starken und 100 mm langen Vierkantkörper aus Plexiglas, in den zwei 13 mm aus dem Vier kantkörper herausragende Platindraht-Elektroden und ein 13 × 1 mm starker Haltedraht z. B. aus V2A-Stahl eingelassen sind. Die beiden Platinelektroden sind mit je einem Kabel und je einem Stecker versehen, die zum Anschluß an einen Reizgenerator geeignet sind (vgl. Zeichnung Fig. 8 und 9).

Die einzelnen Verfahrenskomponenten sind oben unter Ziffern 1 bis 8, bzw. 9 im einzelnen erläutert.

In diesem "Versuchskit" können selbstverständlich andere Kollage nasearten oder Kollagenlösungen vorhanden sein, wesentlich ist das Prinzip, Kollagenase bzw. Kollagenlösung für die Herstellung der Matrixkörper und die Durchführung des Verfahrens einzusetzen.

Nachfolgend soll detaillierter über die Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung berichtet werden, um den Nutzen des neuentwickelten Systems darzulegen.

Bislang läßt sich die wichtigste Herzfunktion, nämlich die Kontrak tionskraft, zuverlässig nur am ganzen isolierten Herzpräparat (z. B. der Ratte, des Meerschweinchens oder des Frosches) oder an Gewe bestreifen aus explantierten Tierherzen messen. Um Tierversuche einzusparen und vor allem um die Bedeutung einzelner Proteine der Herzmuskelzelle für die Regulation der Kontraktionskraft besser untersuchen zu können, wird seit Jahren nach geeigneten Möglich keiten gesucht, die Kontraktionskraft auch an einzelnen kultivierten Zellen zu messen.

Die Messung der Kontraktionskraft an Einzelzellen ist aber nur an frisch isolierten Zellen erwachsener Herzen möglich und sehr auf wendig (vgl. Puceat et al. 1990, Circ. Res. 67: 517-524). Da man diese Zellen nur für Stunden in Kultur bringen kann, scheiden sie z. B. für gentechnische Versuche aus, da derartige Versuche Tage bis Wochen brauchen. Nur durch die gentechnische Manipulation von kultivierten Zellen ist es aber möglich, ganz gezielt einzelne Proteine in ihrer Funktion zu manipulieren. Man kann mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden im Prinzip jedes Protein, das bekanntermaßen im Herzen vorkommt, gentechnisch manipulieren. Das Problem war aber bisher, daß an den derartig manipulierten Zellen die Kontraktionskraft nicht meßbar war. Diese Lücke schließt die vorliegende Erfindung.

Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung auch erstmalig das genaue Studium der interaktiven Wirkung der verschiedenen Zelltypen im Herzen auf die Kontraktionskraft. Man weiß, daß 80% der Zellen im Herzen Nicht-Muskelzellen, d. h. zum Beispiel Bindegewebszellen, Gefäßzellen oder Nervenzellen, sind. Bisher ist nicht bekannt, wel chen Einfluß diese Zellen auf die Kraft haben. In dem durch die Er findung vorgestellten System kann man nun verschiedene Zellpopu lationen in verschiedenen Anteilen mischen und untersuchen, wel chen Einfluß dies auf die Kontraktionskraft hat.

Weiterhin kann man Mechanismen der Herzvergrößerung (Hypertro phie) durch das aus der Erfindung resultierende System untersu chen. Dabei ist daran zu denken, die Gele unterschiedlich lange und unterschiedlich stark vorzudehnen oder mit bestimmten Pharmaka zu inkubieren. Dies verursacht eine Vergrößerung der einzelnen Herzmuskelzellen. In dem System ist es jetzt aber erstmalig mög lich, auch die funktionelle Auswirkung der Vergrößerung unter den Versuchsbedingungen direkt und einfach zu messen.

Zusammengefaßt ermöglicht die Erfindung erstmalig die Messung der isometrischen Kontraktionskraft an embryonalen Muskelzellen, insbesondere an embryonalen Herzmuskelzellen, wohl aber auch all gemeiner an kultiviertem, vom Organismus separierten Muskelgewe be. Die Erfindung ermöglicht damit die gezielte Untersuchung von Auswirkungen bestimmter Manipulationen oder einer Herzmuskelver größerung auf die Kontraktionskraft. Derartige Fragestellungen ste hen im Mittelpunkt eines Großteils der experimentellen Forschung, d. h. der

- kardiovaskulären Grundlagenforschung und der
- angewandten Forschung mit dem Ziel der Entwicklung neu er herzwirksamer Pharmaka zur Therapie der Herzmuskel schwäche und Herzrhythmusstörungen.

Es soll hier nochmals hervorgehoben werden, daß die Herz-Kreis lauferkrankungen in der westlichen Welt für die meisten Todesfälle verantwortlich sind. Die Herzmuskelschwäche ist mit einer Häufig keit von etwa 3% der Bundesbevölkerung (=2,5 Millionen Menschen) eine der häufigsten Erkrankungen überhaupt. Die Behandlungsmög lichkeit sind besser geworden. Dennoch liegt die 5-Jahres-Sterblich keit auch heute noch bei über 50%. Das bedeutet, daß die Entwick lung von Medikamenten, die die Herzmuskelschwäche verbessern können, ein vorrangiges gesundheitspolitisches Ziel darstellt. Letzt lich leistet die vorliegende Erfindung einen Beitrag zur Lösung die ser Probleme.

Ausführungsbeispiel

In einem sterilen Reagenzglas wird zunächst eine Kollagengelmatrix hergestellt, indem unter Kühlung mit Eis der Kollagenlösung Typ l Primärkulturlösung I (PKM I) im Verhältnis von einem Teil Kollagen lösung zu einem Teil PKM I, Alkalihydrogenlösung im Verhältnis von einem Teil Kollagenlösung zu 0,15 Teilen Alkali, sowie eine Sus pension aus Kardiomyozyten von 5 bis 11 Tage alten Hühnchen als Zellkulturen in Primärkulturmedium II im Verhältnis von einem Teil Kollagengelmatrix zu 2 Teilen Suspension zugefügt wird. Diese Mi schung wird in eine Maske, die sich in einer Zellkulturschale befin det, aus Silikon besteht und mehrere Ausstanzungen enthält, in de nen je zwei auf Distanz gehaltene Formkörper untergebracht sind, in den freien Raum zwischen den Formkörpern in den Ausstanzungen hineinpipettiert. Die so vorbereitete Maske wird für mindestens zwei Stunden in einem Brutschrank bei ca. 37°C inkubiert, wobei das Kollagen die Muskelzellmatrix bildend erstarrt. Wenigstens 5 Tage nach der Inkubation wird der entstandene Matrixkörper der Maske in bikonkaver Form entnommen und in einen konventionellen Kraftauf nehmer eingespannt, der sich in einem mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid begaster modifizierter Tyrode-Lösung gefüllten und auf 37°C beheizten Organbad befindet, wonach die isometrische Kon traktionskraft und weitere Parameter des "künstlichen Muskelgewe bes" gemessen werden können
Anhand der Figuren werden weitere Einzelheiten der Erfindung er läutert.

Die Fig. 1 bis 5 zeigen Diagramme.

Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Mechanogramm von spontan schla genden Kardiomyozyten unter Basalbedingungen (in modifizierter Tyrode Lösung) in einem Kollagengelmatrixkörper, der gemäß Aus führungsbeispiel hergestellt ist. Das Diagramm zeigt, daß das künstliche Gewebe spontan mit einer Frequenz von etwa 1,5 Hz (90/min) schlägt und dabei eine Kraft von 0,1 mN entwickelt. Die aktive Kraftentwicklung ist damit etwa fünfmal so groß wie das Hintergrundrauschen der Meßvorrichtung.

Fig. 2 zeigt ein repräsentatives Mechanogramm von elektrisch ge reizten (2 Hz) Kardiomyozyten in einem Kollagengelmatrixkörper nach verschieden starker Vordehnung. Die Zahlen oberhalb des Me chanogramms geben die entsprechende mathematisch bestimmte ak tive Kontraktionskraft in mg wieder. Die Zahlen unterhalb des Me chanogramms geben das Ausmaß der zusätzlichen Vordehnung an. Das Diagramm zeigt, daß das künstliche Gewebe wie intaktes Herz muskelgewebe auf zunehmende Vordehnung mit einer Zunahme der aktiven Kraftentwicklung reagiert. Dieser Effekt ist als "Frank- Starling- Mechanismus" bekannt und stellt eine der zentralen Auto regulationsmechanismen dar.

Fig. 3 stellt die quantitative Auswertung der Untersuchung dar, de ren Ergebnisse in Abb. 2 gezeigt sind. In dem untersuchten Bereich steigt die aktive Kontraktionskraft mit zunehmender Vorspannung bzw. Vordehnung (Frank-Starling-Mechanismus). Das Ausmaß der Kraftzunahme entspricht dem des intakten Herzmuskelgewebes.

Die Fig. 4A und 4B zeigen ein repräsentatives Mechanogramm von elektrisch gereizten (2 Hz) Kardiomyozyten in einem Kollagenma trixkörper (4A) unter Basalbedingungen modifizierte Tyrode Lösung und (4B) erhöhter extrazellulärer Kalziumkonzentration 14 mM. Das Diagramm zeigt, daß das künstliche Herzgewebe auf eine Erhöhung der extrazellulären Kalzium-Ionenkonzentration mit einer Zunahme der Kraftentwicklung reagiert. Auch dieses Phänomen gehört zu den Charakteristika des Herzmuskels.

Fig. 5 zeigt die Abhängigkeit der isometrischen Kontraktionskraft von der extrazellulären Kalziumkonzentration. Die Ordinate gibt die Kraft an, die Abszisse die Kalziumkonzentration in mmol/l. Mit stei gender Kalziumkonzentration steigt die isometrische Kontraktions kraft auf maximal 250% des Ausgangswertes. Das Ausmaß und die Konzentrationsabhängigkeit entsprechen dem intakten Hermuskelge webe.

Zusammengefaßt zeigen die dargestellten Untersuchungsergebnisse, daß sich das künstliche Gewebe in wesentlichen psychologischen Parametern wie intaktes Herzmuskelgewebe verhält. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Erfindung als Mo dell für den Herzmuskel.

Die Fig. 6 bis 10 zeigen den Matrixkörper, Teile der Vorrichtung, mit der der Matrixkörper hergestellt und das Verfahren durchgeführt werden kann, und die Meßvorrichtung.

In Fig. 6 ist der Matrixkörper für die Messung isometrischer Kraft parameter von Zellgewebe gezeigt. Er besteht aus zwei plattenför migen, parallel angeordneten, in eine Spann- und Meßvorrichtung einhängbaren Halteteilen 1, 2, einer dazwischen gespannten Matrix 3 aus erstarrtem Kollagengel 4 und darin eingebettetem, durch Kul tivierung entstandenen Zellgewebe 5. Die beiden plattenförmigen Halteteile 1, 2 bestehen aus nichtporösem Material und können vollmassiv oder hohl sein. Zum späteren Einhängen in die Spann- und Meßvorrichtung sind an den Halteteilen 1, 2 ring- oder röhr chenförmige Elemente 6, 7 befestigt. Für eine Verbindung hoher Zugfestigkeit der Matrix 3 mit den Halteteilen 1, 2 sind deren ihr zugewandte Oberflächen 8, 9 mit selbstverhakenden Teilen 10, 11 versehen. Die Matrix 3 aus ausgehärtetem Kollagengel 4 enthält als durch Kultivierung entstandenes Zellgewebe 5 Muskelgewebe. Zwi schen den Halteteilen 1, 2 sind Abstandhalter 12, 13 vorgesehen, die während der Herstellung den Abstand der Halteteile 1, 2 vonein ander konstant halten und für den späteren Meßvorgang entfernbar sind. Diese Abstandhalter sind im vorliegenden Beispiel miteinander zu einer Klammer verbunden. Es können aber auch andere Formen für die Abstandhalter gewählt werden, solange dadurch die abstand haltende Funktion gewahrt wird.

Die beiden Halteteile 1, 2 bestehen vorzugsweise aus Metall, insbe sondere aus V2A-Stahl, oder aus Glas. Die zum Einhängen in die Spann- und Meßvorrichtung vorgesehenen ring- oder röhrchenförmi gen Elemente 6, 7 sind vorzugsweise als selbständige Teile an den Halteteilen 1, 2 befestigt. Sie können aber auch selbst auf ihrer der Matrix 3 abgewandten Seite ring- oder röhrchenförmig ausgebildet sein. Für die Verbindung hoher Zugfestigkeit der Matrix 3 mit den Halteteilen 1, 2 sind deren ihr zugewandte Oberflächen 8, 9 mit selbstverhakendem Band - Klettband - versehen, das mittels Sili konkleber an den Halteteilen 1, 2 angeklebt ist. Für die Verbindung hoher Zugfestigkeit der Matrix 3 mit den Halteteilen 1, 2 können aber auch die ihr zugewandten Oberflächen 8, 9 stark aufgerauht sein. Die Matrix 3 aus ausgehärtetem Kollagengel 4 enthält als durch Kultivierung entstandenes Zellgewebe 5 Herzmuskelgewebe, insbesondere aus Kardiomyozyten von Hühnchen gewonnenes Herz muskelgewebe.

Fig. 7 zeigt perspektivisch eine Zellkulturschale 14, in der sich eine im vorliegenden Fall aus Silikon gebildete Maske 15 befindet, die mehrere Ausstanzungen 16 enthält. In jeder dieser Ausstanzungen befinden sich zwei Haltekörper 1, 2, an der selbstverhakende Bän der 10, 11 befestigt sind. In die röhrchenförmigen Elemente 6, 7 sind die Abstandhalter 12, 13 eingeführt. In die derart vorbereitete Maske wird die Mischung aus Kollagengelmatrix und Zellsuspension gefüllt, z. B. hineinpippetiert. Dann kommt die Zellkulturschale zum Inkubieren in einen Brutschrank, wobei sich die Matrixkörper bilden. Diese werden dann der Maske entnommen und in eine Meßvorrich tung gebracht.

Die Fig. 8 und 9 zeigen eine Stimulations- und Halteelektrode für die Messungen am Matrixkörper im Organbad. Dabei zeigt Fig. 8 die Elektrode in Seitenansicht und Fig. 9 die Elektrode in Draufsicht gemäß Pfeil X in Fig. 8.

Die Stimulations- und Halteelektrode 17 für den Kollagengelmatrix körper besteht aus einem 10 × 3 mm starken und 100 mm langen Vierkantkörper 18 aus Plexiglas, in den zwei 13 mm aus dem Vier kantkörper herausragende Platindraht-Elektroden 19 und 20 und ein 13 × 1 mm starker Haltedraht 21, z. B. aus V2A-Stahl, eingelassen sind. Die beiden Platinelektroden 19 und 20 sind mit je einem Kabel 22 und 23 verbunden, die mit je einem Stecker versehen sind (hier nicht gezeigt), die zum Anschluß an einen Reizgenerator (nicht dar gestellt) im Rahmen der Meßvorrichtung geeignet sind.

Fig. 10 zeigt schematisch die Meßvorrichtung, in der die isometri sche Kraft der Matrixkörper gemessen wird. Die beiden rohrchenför migen Elemente 6, 7 des Matrixkörpers (Fig. 6) sind oben in einen offenen Dreieck-Haken 24 und unten in den Haltedraht 21 der Halte elektrode 17 eingehängt. Der Dreieck-Haken 24 ist durch einen Fa den mit einem isometrischen Kraftaufnehmer 25 verbunden. Die Zellen 5 in der Matrix 3 des Matrixkörpers werden durch die beiden Platinelektroden 19,20 elektrisch stimuliert. Der Matrixkörper befin det sich im weiter oben erläuterten, begasten Organbad 26, das mit physiologischer Lösung 27 (Tyrode Lösung) gefüllt ist. Der isometri sche Kraftaufnehmer 25 ist über den Halter 28, die Stimulations- und Halteelektrode 17 ist über die Halter 29 und 30 und das Organ bad 26 ist über den Halter 31 mit dem Gestell 32 verbunden.

Claims

1. Matrixkörper für die Messung isometrischer Kraftparameter von Zellgewebe, bestehend aus zwei plattenförmigen, parallel ange ordneten, in eine Spann- und Meßvorrichtung einhängbaren Hal teteilen (1, 2), einer dazwischen gespannten Matrix (3) aus er starrtem Kollagengel (4) und darin eingebettetem, durch Kulti vierung entstandenen Zellgewebe (5), wobei die Matrix (3) mit den Halteteilen (1, 2) verbunden ist, gekennzeichnet durch die Merkmale:

a) die beiden plattenförmigen Halteteile (1, 2) bestehen aus nichtporösem Material und sind vollmassiv oder hohl,
b) zum Einhängen in die Spann- und Meßvorrichtung sind an den Halteteilen (1, 2) ring- oder röhrchenförmige Elemente (6, 7) ausgebildet,
c) für eine Verbindung hoher Zugfestigkeit der Matrix (3) mit den Halteteilen (1, 2) sind deren ihr zugewandte Oberflächen (8, 9) mit selbstverhakenden Teilen (10, 11) versehen,
d) die Matrix (3) aus ausgehärtetem Kollagengel (4) enthält als durch Kultivierung entstandenes Zellgewebe (5) Muskelgewe be,
e) zwischen den Halteteilen (1, 2) sind Abstandhalter (12, 13) vorgesehen, die während der Herstellung den Abstand der Halteteile (1, 2) voneinander konstant halten und für den Meßvorgang entfernbar sind.

2. Matrixkörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Halteteile aus Metall, insbesondere aus V2A-Stahl oder aus Glas, bestehen.

3. Matrixkörper nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Einhängen in die Spann- und Meßvorrichtung vorge sehenen ring- oder röhrchenförmigen Elemente (6, 7) als selb ständige Teile an den Halteteilen (1, 2) befestigt sind.

4. Matrixkörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß zum Einhängen der Halteteile (1, 2) in die Spann- und Meßvorrichtung die Halteteile (1, 2) selbst auf ihrer der Matrix (3) abgewandten Seite ring- oder röhrchenförmig aus gebildet sind.

5. Matrixkörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß für die Verbindung der Matrix (3) mit den Halteteilen (1, 2) deren ihr zugewandte Oberflächen (8, 9) mit selbstverhakendem Band (10, 11) versehen sind, das mittels Si likonkleber an den Halteteilen (1, 2) angeklebt ist.

6. Matrixkörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß für die Verbindung hoher Zugfestigkeit der Matrix (3) mit den Halteteilen (1, 2) deren ihr zugewandten Oberflächen (8, 9) stark aufgerauht sind.

7. Matrixkörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß die Matrix (3) aus ausgehärtetem Kollagengel (4) als durch Kultivierung entstandenes Zellgewebe (5) Herzmus kelgewebe enthält, insbesondere aus Kardiomyozyten von Hühn chen gewonnenes Herzmuskelgewebe.

8. Verfahren zur Herstellung eines Matrixkörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem zunächst eine Kollagengelmatrix hergestellt wird, indem in einem sterilen Gefäß auf Eis Kollagen lösung, 2 × konzentriertes Primärkulturmedium, das mit 20 Tei len Pferdeserum angereichert ist und 4 Teile Hühnchenembryo extrakt enthält, und 0,1 M Alkalihydroxid zusammengegeben werden, dadurch gekennzeichnet, daß der Kollagengelmatrix eine Zellsuspension aus Muskelzell gewebe in einem synthetischen Standardkulturmedium mit niedrigem Glukosegehalt (1000 mg/l) ohne Phenolrot mit Zusatz von 10 Teilen inaktiviertem Pferdeserum, 2 Teilen Hühnchenembryoextrakt und einem Teil einer Standardlösung von Stretomyzin (10 000 µg/ml) und Penicillin (10 000 U/ml) als Primärkulturmedium im Verhältnis von 1 Teil Kollagen gelmatrix zu 0,5 bis 2 Teilen Suspension zugefügt wird,
daß in eine Maske, die eine Zellkulturschale enthält und mit Si likon ausgegossen ist, welches mehrere Ausstanzungen ent hält, in denen je zwei auf Distanz gehaltene Formkörper un tergebracht sind, der freie Raum zwischen den Formkörpern in den Ausstanzungen mit der Mischung aus Kollagengelmatrix und Suspension ausgefüllt wird,
daß die so vorbereitete Maske für mindestens zwei Stunden in einem Brutschrank bei ca. 37°C inkubiert wird, wobei das Kollagen die Muskelzellmatrix bildend erstarrt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellkulturen Kardiomyozyten von 5 bis 11 Tage alten Hühnchen eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturenmatrix wenigstens fünf Tage nach der Inkubation der Maske in Form bikonkaver Körper entnommen wird.

11. Set zum Herstellen eines Matrixkörpers nach einem der Ansprü che 1 bis 8, gekennzeichnet durch folgende Bestandteile:

a) eine Zellkulturschale
b) thermoplastisches oder duroplastisches Material, insbesonde re Silikon, das in die Zellkulturschale zu Bildung einer Mas ke einbringbar ist, die mit Ausnehmungen für die Matrixkör per versehen werden kann,
c) als Halteteile dienende Platten oder Glasröhrchen, die mit Mitteln zur mechanischen Verankerung der Matrix an den ihr zugewandten Oberflächenteilen der Platten oder Glas röhrchen in den Ausnehmungen versehen sind,
d) Abstandhalter aus hochwertigem Metall, insbesondere aus V2A-Stahl, die zwischen den Formungskörpern in den Aus nehmungen der Maske einsetzbar sind,
e) eine Aufhängevorrichtung zum Halt der Matrix samt Formkör pern im Organbad, enthaltend Stimulations- und Halteelek troden aus Plexiglasvierkant und darin eingelassen zwei Pla tindraht-Elektroden, die mit Anschlüssen versehen sind, und einen dreieckigen Haltedraht zur Befestigung der Matrixkör per in der Meßvorrichtung,
f) eine ausreichende Menge Kollagenase für das Präparieren der Muskelzellgewebe,
g) Kollagenlösung: Kollagen Typ 1, gelöst in verdünnter schwa cher organischer Säure,
h) auf den pH-Wert von 7,4 phosphat-gepufferte Kochsalzlö sung,
i) Kollagenase Typ 2, gelöst in phosphat-gepufferter Kochsalz lösung,
j) Trypsin 0,25% und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure- Dinatriumsalz),
k) sterile 0,1 M Alkalihydroxidlösung,
l) Primärkulturmedium 1,2-fach konzentriertes synthetisches Kulturmedium,
m) Primärkulturmedium 11,
n) Stammlösungen für eine modifizierte Tyrode-Lösung.

12. Set nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die als Formkörper dienenden Platten oder Glasröhrchen gemäß Merk mal c) mit Klebeband versehen sind, das auf der der klebenden Seite abgewandten Seite Krallhaken aufweist.

13. Verwendung des Matrixkörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Kultivieren von Kardiomyozyten in Kollagengel.

14. Verwendung nach Anspruch 13 zum meßbaren Verfolgen der Kon traktion des Herzmuskelgewebes.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturenmatrix wenigstens fünf Tage nach der Inkubation der Maske in Form bikonkaver Körper entnommen und in einen kon ventionellen Kraftaufnehmer eingespannt wird, der sich in einem auf 37°C gewärmten Organbad befindet, das mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid begaste modifizierte Tyrode-Lösung ent hält, wonach die isometrische ,Kontraktionskraft des künstlichen Muskelgewebes gemessen wird.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15 gekennzeichnet durch Anwendung einer Vorrichtung zum Messen isometrischer Kraftpa rameter an einem Matrixkörper gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, enthaltend ein Vertikalgestell, einen Kraftübertrager, Stimulati onselektroden, ein Organbad und eine Meßeinrichtung, wobei

a) an dem Gestell (32) Halter (28, 29, 30, 31) vorhanden sind, an denen der isometrische Kraftaufnehmer (25), eine Stimulations- und Halteelektrode (17) und das begasbare Organbad (26) befestigt sind,
b) die Stimulations- und Halteelektrode (17) aus einem 10 × 3 mm starken und 100 mm langen Vierkantkörper (18) aus Ple xiglas besteht, in den zwei 13 mm aus dem Vierkantkörper (18) herausragende Platindraht-Elektroden (19, 20) und ein 13 × 1 mm starker Haltedraht (21) eingelassen sind, wobei die beiden Platindraht-Elektroden (19, 20) mit je einem Kabel (22, 23) verbunden sind, die je mit einem Stecker versehen sind, die zum Anschluß an einen Reizgeber im Rahmen der Meßvorrichtung dienen,
c) zum vertikalen Einhängen des Matrixkörpers mit sei nem oberen Haltelement (6) ein offener Dreieckshaken (24) vorhanden ist, der mit dem isometrischen Kraftaufnehmer (25) verbunden ist, der Haltedraht (21) der Stimulations- und Halteelektrode (17) zum Einhängen des Matrixkörpers mit seinem unteren Halteelement (7) vorhanden ist, die beiden Platindraht-Elektroden (19, 20) zum Stimulieren der Zellen (5) in der Matrix (3) im eingehängten Zustand des Matrixkör pers vorhanden sind.