DE10151822B9

DE10151822B9 - Vorrichtung und Verfahren zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben

Info

Publication number: DE10151822B9
Application number: DE2001151822
Authority: DE
Inventors: Jürgen Dr. Heubach; Heinz Körber; Wolfgang Dr. Jenschke; Erich Dr. Wettwer; Ursula Prof Dr. Ravens; Carsten Dr. Werner
Original assignee: Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Current assignee: HEUBACH, JUERGEN, DR., 01309 DRESDEN, DE; Leibniz Institut fuer Polymerforschung Dresden eV
Priority date: 2001-10-17
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2021-10-18
Also published as: DE10151822A1; DE10151822B4

Abstract

Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben, bestehend aus einer Kulturkammer (4) zur Aufnahme von, mindestens einem Träger (5) und Kulturmedium (16), wobei die Kulturkammer (4) mit einer Gasphase (17) verbunden ist, und mindestens der Kammerboden (2) öder die Kammerdecke (3) aus einem durchsichtigen Material. besteht, aus mindestens zwei bewegbaren Klammern (6, 15) zur Fixierung des Trägers (6) in der Kammer (4), aus mindestens zwei in oder an der Kammerwandung positionierten Elektroden (9, 10), die mit dem Kulturmedium (16) und/oder den Klammern (6, 15) und/oder dem Träger (5) und/oder den Vorrichtungen zur Übertragung der mechanischen. Stimulierung (7, 12, 13) elektrisch kontaktiert sind, und aus mindestens einem Motor (8), der mit den Klamnern (6, 15) über eine Vorrichtung zur Übertragung der mechanischen. Stimulierung (7, 12, 13) verbunden ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Medizin, der Zellbiologie und des Gerätebaus und betrifft eine Vorrichtung, mit deren Hilfe beispielsweise Zellen und/oder Gewebe mit Gewebetypischen Reizen stimuliert werden und ein Verfahren zur Realisierung der Stimulierung.
Stand der Technik
Eine Vielzahl von biologischen Zellen und Geweben ist durch das Vorhandensein einer aktiven oder passiven mechanischen Funktion gekennzeichnet. Es sind zahlreiche Vorrichtungen und Verfahren bekannt, mit denen eine den physiologischen oder bestimmten pathologischen Verhältnissen angepasste mechanische Stimulierung von Zellen oder Geweben erzielt werden kann. Mit diesen Verfahren wird der Einfluß von mechanischen Reizen auf Zellen und Gewebe untersucht. Außerdem wird versucht, konstante Zell- und Gewebekulturbedingungen zu schaffen.
Dazu ist aus dem „Journal In vitro Cellular Developmental Biology", Vol. 24, No. 7, July 1988, S. 609–619 eine Vorrichtung bekannt, bei der eine dehnbare Silastic-Membran den Boden von 24 Kulturschalen mit einem Durchmesser von jeweils 15 mm bildet. Über 24 Schrittmotor-gesteuerte Stempel (Durchmesser 2 mm) wird die Zell-tragende Membran in jeder einzelnen Kulturschale zyklisch kegelförmig gedehnt, indem der Stempel von unten gegen die Membran drückt.
Nachteilig ist, dass die Zellen in dieser Anordnung nicht nur einer Dehnung sondern durch die Auslenkung der Membran in vertikaler Richtung auch einer Druckbelastung und Scherbewegung ausgesetzt sind, wodurch gleichzeitig mehrere verschiedenartige mechanische Reize appliziert werden. Die isolierte Untersuchung des Effekts einer einachsigen Dehnung/Entdehnung der Zellen ist deshalb nicht möglich: Weiterhin ist eine optische Beobachtung bei dieser Vorrichtung nicht möglich.
Die Firma Flexcell stellt kommerziell erhältliche Systeme für die mechanische Stimulierung von Zellen her. Eines des Systeme verwendet einen Exzentermotorbetriebenen vertikalen Stempel, der eine dehnbare Membran zyklisch nach oben und unten bewegt, wodurch die Membran radiär über den Stempel gleitet und dabei radiär gedehnt wird ( US 5,217,899 und US 5,348,879 ).
Bei weiteren Systemen dieser Firma (FX-4000T und „Tissue Train") wird die radiäre Dehnung der Membran durch eine Vakuumanordnung erreicht. Der zu dehnende zentrale Membrananteil wird gleitend auf einer kreisförmigen Tischunterlage aufgebracht. Der ringförmige Membranrand wird nicht durch die Tischunterlage gestützt. In diesem Bereich wird die Membran vielmehr durch das zyklische Anlegen von Unterdruck auf der Membranunterseite nach unten gezogen. Dadurch wird der zentrale Anteil auf der Tischunterlage radiär gedehnt. Ein spezifischer Nachteil der Flexcell-Systeme ist darin zu sehen, dass die Reibung der Membran auf der Tischunterlage durch ein Gleitmittel vermindert werden muß. Ein negativer Einfluss des Gleitmittels auf die Zellfunktionen durch Diffusion durch die Membran ist nicht ausgeschlossen.
Nach Fink et al., FASEB Journal. Vol. 14, No. 6, April 2000, S. 669–679 ist weiterhin eine Vorrichtung und ein Verfahren bekannt, mit deren Hilfe ringförmige Kulturen von künstlichem Herzgewebe (engineered heart tissue, EHT) erstellt werden können. Die mechanische Stimulierung des Gewebes, welches als wesentliche Komponenten neanatale Rattenzellen und Kollagen enthält, erfolgt über eine Exzentermotorbetriebene Anordnung, in der die ringförmigen EHT's zyklisch gedehnt und entdehnt werden. Die Ringe werden dazu zwischen jeweils zwei beweglichen Metallhaken aufgespannt. Eine optische Kontrolle der Dehnung/Entdehnung ist nicht möglich.
Bekannt ist nach der. älteren Anmeldung DE 100 61 704 A1 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von biologischem Gewebe in einer Wachstumskammer unter Einwirkung von mechanischen, elektrischen, magnetischen, chemischen, olfaktorischen, akustischen und optischen Reizen.
In DE 195 00 498 C2 werden Matrixkörper für die Messung isometrischer Kraftparameter von Zellgewebe, ein Verfahren zum Herstellen dieser Matrixkörper, Sets für dieses Verfahren und die Verwendung der Matrixkörper zum Kultivieren von Kardiomyozyten beschrieben. Die offenbarte Vorrichtung wird insbesondere bei der Analyse von Zellgewebe bzw. von Muskelkontraktionen verwendet.
Weiterhin ist nach US 6,281,007 B1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Ausbildung von bänderförmigen Ersatzgewebe bekannt. Insbesondere wird das Gewebe in einer Apparatur entlang seiner Längsachse gedehnt. Für eine solche Dehnung wird eine magnetische Vorrichtung wie ein ferromagnetischer röhrenförmiger Zylinder, der sich auf dem Gewebe befindet, eingesetzt und der dort während der Dehnung verbleibt.
In US 6,107,081 wird eine Vorrichtung zur linearen, mechanischen Belastung bzw. Dehnung von Gewebe von Säugetieren offenbart. Die Vorrichtung dient für Untersuchungen von mechanischen Belastungen menschlicher Gewebe, insbesondere des Skelettes sowie von Herzgewebe.
Darüber hinaus wird in US 4,940,853 eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Wachsen von Gewebepräparaten in vitro beschrieben. Die Vorrichtung beinhaltet dabei eine Membran und das Gewebepräparat, die während des Verfahrens gedehnt werden.
Bekannt sind nach WO 00/17 322 A2 auch elektroaktive Materialien zur Stimulation der biologischen Aktivität von Zellen. Die Stimulation erfolgt insbesondere elektromagnetisch mittels eines elektroaktivem Polymers, wobei die zu stimulierenden Zel len am elektroaktivem Polymer angebracht oder mit diesem verbunden sind.
Nachteilig bei allen bekannten Vorrichtungen und Verfahren ist die fehlende Möglichkeit zur elektrischen Stimulierung der kultivierten Zellen und/oder Gewebe.
Aufgabenstellung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung anzugeben, mit der Zellen und/oder Gewebe je nach Zielsetzung unter Anwendung von Gewebe-typischen Reizen unter optischer Kontrolle in Kultur gehalten werden können, und weiterhin ein Verfahren anzugeben, mit dem Zellen und/oder Gewebe unter Beobachtung Gewebe-typischen Reizen ausgesetzt werden können.
Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen angegebene Erfindung gelöst. Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die eine elektrische und mechanische Stimulierung von Zellen und/oder Geweben in zweidimensionaler oder dreidimensionaler Kulturanordnung erlaubt, und eine fortlaufende visuelle Kontrolle der Zellen und/oder Gewebe ermöglicht.
Dabei besteht die Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben aus einer Kulturkammer zur Aufnahme von mindestens einem Träger und Kulturmedium, wobei die Kulturkammer mit einer Gasphase verbunden ist, und mindestens der Kammerboden oder die Kammerdecke aus einem durchsichtigen Material besteht, aus mindestens zwei bewegbaren Klammern zur Fixierung des Trägers in der Kammer, aus mindestens zwei in oder an der Kammerwandung positionierten Elektroden, die mit dem Kulturmedium und/oder den Klammern und/oder dem Träger und/oder den Vorrichtungen zur Übertragung der mechanischen Stimulierung elektrisch kontaktiert sind, und aus mindestens einem Motor, der mit den Klammern über eine Vorrichtung zur Übertragung der mechanischen Stimulierung verbunden ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem kultivierte Zellen und/oder Gewebe durch frei programmierbare elektrische und mechanische Reize eine physiologischen oder pathologischen Verhältnissen angepasste Stimulierung erfahren, um je nach Einsatz die Entdifferenzierung differenzierter Zellen und/oder Geweben aufzuhalten, die Differenzierung von undifferenzierten Zellen und/oder Geweben zu unterstützen, künstliches Biogewebe funktionell zu konditionieren, oder den Einfluss der beiden Reize auf Zellen und/oder Gewebe zu untersuchen oder zu nutzen.
Beim Verfahren zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben werden Zellen und/oder Gewebe auf einen Träger aufgebracht und/oder der Träger besteht aus Zellen und/oder Geweben, und Kulturmedium und mindestens ein Träger in eine Kulturkammer einer Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben eingebracht wird, wobei der Träger zyklisch einachsig entdehnt und gedehnt wird und über mindestens zwei Elektroden elektrische Reize auf die Zellen und/oder das Gewebe ausgeübt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben besteht im wesentlichen aus einer Kulturkammer, die mindestens einen Träger und Kulturmedium enthält. Im direkten oder indirekten Kontakt mit dem Kulturmedium befindet sich eine Gasphase, die vorteilhafterweise über dem Kulturmedium und von ihm durch eine Membran getrennt angeordnet ist und die aus einem Gasgemisch aus Sauerstoff und Kohlendioxid oder aus einem Sauerstoff und/oder Kohlendioxid enthaltenden Gasgemisch besteht.
Mindestens die Kammerdecke und/oder der Kammerboden bestehen aus einem durchsichtigen Material, welches vorteilhafterweise aus Glas bestehen kann.
Der Bereich der Kammer, in der sich das Kulturmedium befindet, kann temperierbar sein. Vorteilhafterweise ist der Kammerboden doppelwandig ausgeführt, und durch den Zwischenraum kann eine Temperierflüssigkeit hindurchgeleitet werden. Vorteilhafterweise kann die Temperierflüssigkeit ein erwärmtes Alkohol/Wasser-Gemisch sein. Die Temperierflüssigkeit ist dabei durch den Kammerboden und durch eine autoklavierbare Dichtung vom Kulturmedium getrennt.
In der Kammer sind mindestens zwei bewegbare Klammern vorhanden, in die der Träger eingespannt ist. Die Klammern dienen der Fixierung des Trägers und zur Übertragung der mechanischen Bewegung auf den Träger. Sie müssen so bewegbar sein, dass sie durch Übertragung der mechanischen Bewegung eine Dehnung und Entdehnung des Trägers realisieren können. Die Klammern sind vorteilhafterweise gegenläufig bewegbar. Die Bewegung wird durch einen oder mehrere Motoren, die über ein oder mehrere Getriebe und Wellen mit den Klammern verbunden sind, erzeugt.
Der Träger ist aus den zu stimulierenden Zellen und/oder Gewebe aufgebaut oder die Zellen und/oder das Gewebe werden bei der Herstellung des Trägers integriert oder auf einen Träger aufgebracht. Der Träger kann entweder selbst aus einem Biomaterial oder aus einem nichtbiologischen Material bestehen. Ein nichtbiologisches Material sollte vorteilhafterweise an den Oberflächen biofunktionalisierbar, d.h. mit Biomolekülen beschichtbar sein. Besonders vorteilhaft ist die Beschichtung mit Proteinen der extrazellulären Matrix und/oder mit Wachstumsfaktoren. Auch Biomaterialien können an den Oberflächen derart behandelt sein, dass sie verbesserte Bedingungen für die Zellfunktionen bieten. Es kann auch vorteilhaft sein, die Trägeroberflächen mit morpholo gischen Mikrostrukturen zu versehen, die sich besonders günstig auf die Zellfunktionen auswirken. [0026] Als Träger können zweidimensionale oder dreidimensionale Strukturen benutzt werden. Ein Träger für zweidimensionale Kulturanordnungen kann eine durchsichtige Folie sein. Er ist elastisch und kann aus einem Polymer bestehen, vorteilhafterweise aus Silikon oder Latex. Auch ist es von Vorteil, wenn der Träger am Rand eine ganz oder teilweise umlaufende Wulst, vorteilhafterweise aus trägereigenem Material, aufweist. Beispielsweise kann bei Einsatz einer rechteckigen Folie als Träger die Halterung mittels der Klammern an den langen Seiten erfolgen und die Kurzseiten sind mit einer Wulst versehen.
Ein Träger für dreidimensionale Kulturen besteht vorteilhafteiweise auch aus einer elastischen Struktur, die den Zellen ein möglichst günstiges Gerüst vorgibt. Dieser dreidimensionale Träger kann aus einem Polymer, beispielsweise Silikon oder Latex, aber auch aus einem textilen Gewebe oder im wesentlichen aus Kollagen oder Gelatine aufgebaut sein. Als Träger kann auch ein natürliches Gewebe, beispielsweise ein Stück Herzmuskelgewebe, oder auch ein künstliches Biogewebe dienen. Auch auf diese Gewebe können weitere Zellen und/oder Gewebe aufgebracht werden. Die Zellen und/oder Gewebe werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren elektrisch und mechanisch stimuliert, unabhängig davon, ob sich die Zellen und/oder Gewebe auf dem Träger befinden und/oder den Träger selbst bilden.
Die Elektroden für die elektrische Stimulierung der Zellen und/oder Gewebe sind in oder an der Kammerwandung positioniert und befinden sich im direkten oder indirekten Kontakt mit mindestens dem Kulturmedium und/oder den Klammern und/oder dem Träger und/oder der Vorrichtung zur Übertragung der mechanischen Stimulierung. Vorteilhafterweise ragen sie in das Innere der Kulturkammer hinein. Die Elektroden sind an einen Stimulator angeschlossen und dienen zur Einbringung eines elektrischen Impulses in die Kammer und auf die Zellen und/oder Gewebe in der Kammer auf dem Träger. Vorteilhafterweise sind die Elektroden gegenüberliegend angebracht.
Ebenfalls vorteilhafterweise kann die gesamte Vorrichtung auf dem Objekttisch eines Mikroskopes, insbesondere eines Lichtmikroskopes, angebracht sein. Damit ist eine laufende optische Kontrolle der Vorgänge in der Kammer möglich. Alle im Kontakt mit dem Kulturmedium befindlichen Teile bestehen aus Materialien, die keinen nachteiligen Einfluss auf das Kulturmedium und die Zell- und/oder Gewebefunktionen haben, und sollen vorteilhafterweise autoklavierbar sein.
Die Vorrichtung kann modular aufgebaut sein, dass heißt, mehrere erfindungsgemäße Kammern können parallel geschaltet sein. Die Kammern können auch hintereinander geschaltet sein, um eine bessere Ausnutzung von Kulturmedium und Gasphase zu realisieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise in der erfindungsgemäßen Vorrichtung realisiert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens ein Träger zwischen mindestens zwei Klammern eingelegt und fixiert. Auf dem Träger können sich differenzierte oder undifferenzierte Zellen und/oder Gewebe befinden, oder der Träger selbst gesteht aus differenzierten oder undifferenzierte Zellen und/oder Geweben mit oder ohne aufgebrachten differenzierten oder undifferenzierten Zellen und/oder Gewebe. Der Träger kann in der Vorrichtung entspannt oder vorgedehnt fixiert werden. Die Zellen und/oder Gewebe können auf den entspannten oder vorgedehnten Träger aufgebracht werden.
Vor, vorteilhafterweise aber nach dem Einbringen des Trägers in die Kulturkammer, wird Kulturmedium in den Kulturkammerraum geleitet, wobei das Kulturmedium den Kammerraum ganz oder teilweise ausfüllt. Bei einer teilweisen Ausfüllung befindet sich in dem freien Raum die Gasphase, die auch über eine Membran vom Kulturmedium abgetrennt sein kann. Die Gasphase kann aber auch in einer separaten Kammer untergebracht sein, die mindestens über eine Membran oder über einen direkten Zugang mit dem Kulturmedium in Kontakt steht oder verbunden ist. Die Gasphase kann über eine Schlauchleitung mit einer Waschflasche und über eine weitere Schlauchleitung mit einer Druckflasche verbunden sein. Ein Gemisch aus Sauerstoff und Kohlendioxid oder ein Sauerstoff und/oder Kohlendioxid enthaltendes Gasgemisch wird vorteilhafterweise eingeleitet.
Das Kulturmedium soll vorteilhafterweise eine stabile Temperatur und Zusammensetzung mindestens in der Kulturkammer aufweisen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein kontinuierlicher aber auch diskontinuierlicher Wechsel des Kulturmediums realisiert werden.
Die Temperatur des Kulturmediums kann beispielsweise durch den Einsatz eines bereits temperierten Kulturmediums, das außerhalb der Kammer aufgeheizt worden ist, realisiert werden. Besonders günstig ist es aber, wenn weiterhin das Kulturmedium in der Kammer temperiert werden kann. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Kammer von außen beheizbar ist. Beispielsweise kann der Kammerboden doppelwandig ausgeführt sein und in dem Zwischenraum ein erwärmtes Temperiermedium, vorteilhafterweise ein Alkohol/Wasser-Gemisch durchgeleitet werden. Über eine Pumpe kann dies realisiert werden.
Nach dem sterilen Aufbau der Vorrichtung und Realisierung der Gas- und Flüssig-Phasen in der Kammer mit dem Träger wird über die vorteilhafterweise gegenläufige Bewegung der Klammern der Träger entdehnt und gedehnt. In Bezug auf die Länge des Trägers nach der Vordehnung kann ein Zyklus mit einer Dehnung oder mit einer Entdehnung beginnen. Erfindungswesentlich ist, dass die Entdehnung/Dehnung in Trägerebene einachsig erfolgt. Die se Anordnung bewirkt eine weitgehend gleichmäßige mechanische Stimulation aller Zellen und/oder Gewebeanteile. Es werden im wesentlichen Druck- und Scherbelastungen der Zellen und/oder Gewebe vermieden.
Zu dieser einachsigen, gerichteten mechanischen Stimulierung wird weiterhin erfindungsgemäß eine elektrische Stimulierung ausgeführt. Diese elektrische Stimulierung wird über mindestens zwei Elektroden realisiert, die mindestens über das Kulturmedium und/oder die Klammern und/oder den Träger und/oder die Vorrichtungen zur Übertragung der mechanischen Stimulation die elektrischen Reize auf die Zellen und/oder Gewebe vermitteln. Vorteilhafterweise wird der elektrische Reiz über das Kulturmedium appliziert. Ebenso ist von Vorteil, wenn die Polarität der Elektroden nach jedem oder mehreren elektrischen Reizen gewechselt wird.
Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn für die Dauer des elektrischen Impulses ein lineares und möglichst homogenes elektrisches Feld um den Träger und insbesondere um die Zellen und/oder die Gewebe aufgebaut wird. Besonders vorteilhaft ist es weiterhin, wenn die Richtungen des elektrischen Feldes mit der Dehnungsrichtung übereinstimmt.
Die elektrischen und mechanischen Reize können unabhängig voneinander in Muster, Frequenz, Form, Dauer und Amplitude frei gewählt werden. Die Parameter des elektrischen Reizes sind in der Regel mit wenigen Versuchen ermittelbar. Die Reizparameter richten sich unter anderem nach der Reizantwort der Zellen und/oder des Gewebes. Beispielsweise wird ein überschwelliger elektrischer Reiz im Falle von Herzmuskelzellen durch eine Kontraktion beantwortet. Die Reizparameter richten sich auch nach den Gegebenheiten des Zielgewebes oder Zielorgans.
Elektrische und mechanische Reize können unkoordiniert auf die Zellen und/oder die Gewebe einwirken. Es ist jedoch besonders vorteilhaft, wenn die elektrischen und mechanischen Reize zeitlich aufeinander abgestimmt appliziert werden. Sie können gleichzeitig einwirken, aber auch zeitlich versetzt. Damit lassen sich Organ- oder Gewebetypische Reizmuster nachahmen und applizieren, um beispielsweise differenzierte Zellen gemäß ihrem Herkunftsorgan zu stimulieren. Mit diesem Verfahren lassen sich Entdifferenzierungsprozesse aufhalten und ganz allgemein die Wirkungen der verschiedenen Reizmuster auf die Zellen und/oder Gewebe untersuchen. Umgekehrt läßt sich durch die Anwendung von Organ- und/oder Gewebe-typischen Reizmustern auch die Differenzierung undifferenzierter Zellen auslösen, unterstützen oder beschleunigen. Die jeweilige Auswahl erfolgt nach dem gewünschten physiologischen und/oder pathologischen Ergebnis des Verfahrens.
Im Falle differenzierter Herzmuskelzellen. kann eine Stimulierung mit überschwelligen elektrischen Reizen entsprechend der natürlichen Herzfrequenz erfolgen, wobei jedem elektrischen Reiz eine Entdehnung und Rückdehnung des Trägers folgt, die ihrem zeitlichen Ablauf dem physiologischen Kontraktionsablauf einer einzelnen Herzmuskelzelle nachempfunden sind. Dies wäre für diesen Fall eine besonders vorteilhafte Abstimmung der Stimulierung. Ebenso läßt sich ein solches Herztypisches Reizmuster ausnutzen, um beispielsweise undifferenzierte Stammzellen in Richtung Herzgewebe zu differenzieren oder künstliches Herzgewebe funktionell zu konditionieren. Allgemein ist dieses Verfahren vorteilhaft, um künstliche Gewebe vor einer Implantation funktionell auf die Erfordernisse im Empfängerorganismus vorzubereiten.
In einigen Fällen kann es günstig sein, wenn nur jeder n-te elektrische Reiz von einem mechanischen Reiz gefolgt wird oder wenn nur jeder n-te mechanische Reiz von einem elektrischen Reiz begleitet wird (n = 1, 2, 3 ...). Ebenso können bei dem Verfahren beispielsweise Reizmuster angewendet werden, die sich besonders günstig auf die Kultur von Skelettmuskelzellen, glatten Muskelzellen oder deren Gewebe auswirken. Hierbei kann es von Vorteil sein, wenn einem mechanischen Reiz nicht nur ein einzelner elektrischer Reiz sondern eine Serie elektrischer Reize vorausgeht oder wenn zeitgleich eine Serie elektrischer Reize von einem mechanischen Reiz begleitet wird, gefolgt von einer Reizpause. Die Steuerung der elektrischen und mechanischen Impulse erfolgt vorteilhafterweise programmgesteuert.
Besonders vorteilhaft ist die Möglichkeit einer fortlaufenden visuellen Kontrolle der Zellen und/oder Gewebe. Eine Regelung des Lichteinfalls auf die Zellen und/oder das Kulturmedium, beispielsweise durch eine Abdeckung der Kammer außerhalb der visuellen Kontrollen, ist ebenfalls von Vorteil.
Ausführungsbeispiel
Im weiteren wird die Erfindung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.
Eine Temperierkammer, eine Kulturkammer und eine obere Kammer zur Aufnahme der Gasphase werden auf einer Edelstahl-Halterung übereinander angeordnet, wobei zwei fest mit der Halterung verbundene Stäbe in der Mitte der kurzen Seiten die passgenaue Anordnung gewährleisten, und über ein Schraubengewinde die Anpressung der einzelnen Komponenten vermitteln. Die Abdichtung zwischen den verschiedenen Hohlräumen erfolgt mittels autoklavierbarer EPDM-Rundringe. Die Temperierkammer besteht aus zwei Glasobjektträgern (1 mm Dicke), durch deren Zwischenraum ein auf 37 °C vorgewärmtes Gemisch aus Alkohol und Wasser geleitet wird. Die Kulturkammer, bestehend aus PEEK mit den Innenabmessungen 67 × 19 × 19,5 mm (L × B × H) und einer Dicke der Wandungen von 6,5 mm, verfügt an den kurzen Seiten über sich gegenüberliegende, von außen zugängliche Luer-Anschlüsse für die Zu- und Ableitung des Kulturmediums. Über der Kulturkammer, und durch eine gasdurchlässige PET23-Membran (Porendurchmesser 1 μm) von dieser abgetrennt, befindet sich die obere Kammer (PEEK) für die Gasphase, die an ihren kurzen Seiten ebenfalls über jeweils einen Luer-Anschluss verfügt. Die beiden Anschlüsse sind mit von außen aufgesteckten Sterilfiltern der Porengröße 0,2 μm versehen. Über sie wird ein Gasgemisch bestehend aus 5 Vol.-% Kohlendioxid und 95 Vol.-% Luft, als Gasphase, durch die obere Kammer geleitet. Das Gasgemisch wird zuvor in einer Gaswaschflasche befeuchtet. Das Dach der oberen Kammer wird durch einen Glasobjektträger gebildet, so dass die gesamte Vorrichtung in vertikaler Richtung durchsichtig aufgebaut ist.
Die Kulturkammer wird in Längsrichtung von zwei Wellen durchzogen. Eine der Wellen ist über ein spielfreies Getriebe mit einem Elektromotor gekoppelt und überträgt die vorgegebenen Bewegungen durch ein Zahnrad-Getriebe gegenläufig auf die zweite Welle. An beiden Wellen sind Klammern befestigt, die nebeneinander zwei durchsichtige Silikonfolien mit den Maßen 18 × 6,5 mm (L × B) und einer Dicke von 50 μm aufnehmen. Die Silikonfolien sind von einer Wulst des selben Materials umgeben, die an den Klammerseiten einen Durchmesser von 1 mm und an den Querseiten einen Durchmesser von 0,5 mm hat. Die motorgetriebene Bewegung der Wellen bewirkt eine Entdehnung und Dehnung der beiden Silikonfolien. An den Längsseiten der Kulturkammer sind in Höhe der Silikonfolien zwei gegenüberliegende Plattenelektroden aus chloriertem Silber angebracht, die einen elektrischen Kontakt zum Kulturmedium herstellen.
Die Vorrichtung wird in vierfacher Ausführung parallel nebeneinander über einen Edelstahl-Rahmen auf dem Objekttisch eines Lichtmikroskopes eingeklinkt. Die Vorgänge im Inneren der Kulturkammer können über „long distance"-Objektive mit 5-fachen, 10-fachen und 20-fachen Vergrößerung kontinuierlich beobachtet und über eine Videokamera dokumentiert werden.
Das Zusammensetzen der Vorrichtung aus den zuvor autoklavierten Einzelteilen erfolgt unter einer Sterilarbeitsbank. Die Silikonfolien werden auf die Aufnahme von Zellen vorbereitet, indem ihre Oberflächen außerhalb der Vorrichtung biofunktionalisiert werden. Anschließend werden sie im entdehnten Zustand in die Kulturkammer eingebracht und mit den beiden Klammern fixiert. Die Folien werden nun auf 130% ihrer Ausgangslänge vorgedehnt (Länge I₀) und mit humanem Laminin beschichtet. Nach zweimaligem Spülen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung werden Herzmuskelzellen in Form einer Zellsuspension auf die beschichtete Silikonfolie aufgebracht. Nun wird die Vorrichtung verschlossen, indem die einzelnen Komponenten über einen Spannmechansimus aufeinander gepresst werden. Nach einer Stunde haben sich die Zellen an Laminin angeheftet, so dass die Vorrichtung aus der Sterilarbeitsbank genommen werden kann, um sie auf dem Lichtmikroskop zu fixieren.
Im Folgenden werden der Temperierboden in Betrieb genommen, der Gasfluß wird auf 1 ml/min eingestellt und die Kulturkammer mit Kulturmedium gefüllt. Das Kulturmedium wird zuvor steril in 200 ml Spritzen aufgezogen und in eine Perfusionspumpe eingesetzt, die sich im Inneren eines Kühlschranks befindet. Die Zuleitung zur Vorrichtung wird über möglichst kurze, schwarze Infusionsschläuche gewährleistet. Als Kulturmedium wird „Dulbecco's modified Eagle's medium" mit 10% fetalem Kälberserum und einem Zusatz von 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin verwendet. Die Flußgeschwindigkeit des Kulturmediums beträgt 0,5 ml/h.
Die Herzmuskelzellen werden für 14 Tage in der Vorrichtung in Kultur gehalten und dabei mit einer Grundfrequenz von 1 Hz rechteckförmigen Stromimpulsen von 5 ms Dauer und 50 mA Amplitude ausgesetzt. Jedem elektrischen Reiz folgt mit einer Verzögerung von 5 ms eine Entdehnung und Rückdehnung der Silikonfolien in Form einer unsymmetrischen Cosinushalbwelle, einer Dauer von 0,4 s und einer maximalen Auslenkung von 5% von I₀.
Durch die aufeinander abgestimmte elektrische und mechanische Stimulierung konnte die unter serumhaltigen Kulturbedingungen stets nach wenigen Tagen auftretende Entdifferenzierung kultivierter Herzmuskelzellen deutlich verzögert werden.
Figuren (nachgereicht)
1 zeigt einen Querschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2 zeigt einen Längsschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In 1 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Gewebe dargestellt. Sie besteht aus einer Temperierkammer 1, einer Kulturkammer 4 und einer Kammer zur Aufnahme der Gasphase 17. Die Kammern 1, 4, 17 sind auf einer Halterung übereinander mittels Spannvorrichtungen 19 angeordnet, bei denen zwei fest mit der Halterung verbundene Stäbe in der Mitte der kurzen Seiten die passgenaüe Anordnung der Kammern 1, 4, 17 und über ein Schraubgewinde die Anpressung der Kammern bewerkstelligen.
Die Temperierkammer 1 beinhaltet die Kammerdecke 3 und den Kammerboden 2, die in dieser Ausführungsform aus Glas bestehen, sowie die Kammer zur Aufnahme des Temperiermediums 20, die sich zwischen Kammerboden 2 und Kammerdecke 3 befindet. Durch diese Kammer 20 wird die Temperierflüssigkeit hindurchgeleitet. Die Temperierflüssigkeit ist dabei durch die Kammerdecke 3 und durch eine autoklavierbare Dichtung vom Kulturmedium 16 getrennt.
Die Kulturkammer 4 enthält einen Träger 5 und ein Kulturmedium 16. In Kontakt mit dem Kultur medium 16 befindet sich eine Kammer zur Aufnahme einer Gasphase 17, die über der Kulturkammer 4 und von dieser durch eine Membran 18 getrennt angeordnet ist.
In der Kulturkammer 4 sind zwei bewegbare Klammern 6, 15 vorhanden, in die der Träger 5 eingespannt ist. Die Klammern 6, 15 dienen der Fixierung des Trägers 5 sowie zur Übertragung der mechanischen Bewegung auf den Träger 5. Die Klammern 6, 15 sind in dieser Ausführungsform gegenläufig bewegbar.
Der Träger 5 weist am Rand eine umlaufende Wulst 11 aus demselben Material wie der Träger 5 auf. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei 5, 11 um Silikon.
Die elektrische Stimulierung der Zellen und/oder des Gewebes wird mittels der Elektroden 9, 10 durchgeführt, die an der Kammerwandung positioniert sind und sich im direkten Kontakt mit dem Kulturmedium 16, den Klammern 6, 15, dem Träger 5 und den Vorrichtungen zur Übertragung der mechanischen Stimulierung 7 (in 2 dargestellt), 12, 13 befinden.
Die Elektroden 9, 10 sind gegenüberliegend befestigt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung befindet sich auf dem Objekttisch 14 eines Mikroskops.
In 2.
In 2, bei der es sich um einen Längsschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung handelt, wird der Teil der Vorrichtung gezeigt, der die mechanische Bewegung hervorruft. Dies geschieht mit Hilfe eines Motors 8, der über ein Getriebe 7 und den Wellen 12, 13 (in 1 zu sehen) mit den Klammern 6, 15 (beide in 1 zu sehen) verbunden ist.

1: Temperierkammer
2: Kammerboden
3: Kammerdecke
4: Kulturkammer
5: Träger
6: Klammer
7: Zahnradgetriebe
8: Motor
9: Elektrode
10: Elektrode
11: Wulst
12: Welle
13: Welle
14: Objekttisch
15: Klammer
16: Kulturmedium
17: Kammer mit Gasphase
18: Memtiran
19: Spannvorrichtung
20: Kammer zur Aufnahme des Temperiermedi
: ums

Claims

Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben, bestehend aus einer Kulturkammer (4) zur Aufnahme von, mindestens einem Träger (5) und Kulturmedium (16), wobei die Kulturkammer (4) mit einer Gasphase (17) verbunden ist, und mindestens der Kammerboden (2) öder die Kammerdecke (3) aus einem durchsichtigen Material. besteht, aus mindestens zwei bewegbaren Klammern (6, 15) zur Fixierung des Trägers (6) in der Kammer (4), aus mindestens zwei in oder an der Kammerwandung positionierten Elektroden (9, 10), die mit dem Kulturmedium (16) und/oder den Klammern (6, 15) und/oder dem Träger (5) und/oder den Vorrichtungen zur Übertragung der mechanischen. Stimulierung (7, 12, 13) elektrisch kontaktiert sind, und aus mindestens einem Motor (8), der mit den Klamnern (6, 15) über eine Vorrichtung zur Übertragung der mechanischen. Stimulierung (7, 12, 13) verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5) elastisch ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5) lichtdurchlässig oder durchsichtig ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5) eine Folie ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der die Folie eine Wulst (11) aus dem Folienmaterial aufweist, die am Rande des Trägers (5) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Trä ger (5) eine dreidimensionale Gerüststruktur aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5) aus einem Polymer, aus einem beschichteten Polymer, oder aus einem textilen Gewebe oder einem beschichteten textilen Gewebe besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5) aus Kollagen oder. Gelatine besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger (5} ein natürliches Gewebe, ein Organteil, oder ein künstliches Biogewebe ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei des die Klammern (6, 15) über drehbar gelagerte Wellen (12, 13) bewegbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die Klammern (6, 15) drehbar ausgebildet und die Klammern insbesondere gegenläufig bewegbar sind.
Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der die gegenläufige Bewegung der Wellen (12, 13) über ein Zahnradgetriebe (7) und einen positionsprogrammgesteuerten Motor (8) realisiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Elektroden (9, 10) aus chloriertem Silber, Platin oder Kohlenstoff bestehen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Elektroden (9, 10) in die Kammer (4) hineinragen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Elektroden (9, 10) Rechteckplatten sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Vorrichtung auf. dem Objekttisch (14) eines Mikroskops angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Kammer (4), Wellen (12, 13), Klammern (6, 15) und Dichtungen aus autoklavierbaren Materialien bestehen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Kammern (1, 4, 17) aus einem wenig wärmeleitenden Material bestehen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Kulturkammerboden aus zwei Glasscheiben (2) und (3) mit einem Zwischenraum (20) besteht, die zur Kulturkammer (4) hin abgedichtet sind, und ein Temperiermedium im Zwischenraum vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der eine Membran (18) den Bereich der Gasphase (17) von der Kulturkammer (4) abtrennt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Kulturkammer (4), mit einer Kammer für eine Gasphase (17) und einer Kammer zur Aufnahme des Temperiermediums (20) über Spannvorrichtungen (19) übereinander verbunden sind.
Verfahren zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben, bei dem Zellen und/oder Gewebe auf einen Träger aufgebracht werden und/oder der Träger aus Zellen und/oder Geweben besteht, Kulturmedium und mindestens ein Träger in eine Kulturkammer einer Vorrichtung zur elektrischen und mechanischen Stimulierung von Zellen und/oder Geweben eingebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zyklisch einachsig entdehnt und gedehnt wird und über mindestens zwei Elektroden elektrische Reize auf die Zellen und/oder das Gewebe ausgeübt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Fixierung und Vordehnung des Trägers in der Kammer durch zwei über Wellen bewegbare Klammern realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Klammern gegenläufig bewegt werden.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem für die Dauer des elektrischen Impulses ein lineares, homogenes elektrisches Feld um den Träger aufgebaut wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Richtung des elektrischen Feldes mit der Richtung der Dehnung/Entdehnung übereinstimmt.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Polarität der Elektroden gewechselt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die elektrischen Impulse mit einer Frequenz von 0,0001 bis 10 Hz appliziert werden, die eine maximale Amplitude zwischen 1 mA und 10 A und eine Dauer von 1 ms bis 10 s aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die mechanischen Entdehnungen/Dehnungen mit einer Frequenz von 0,0001 bis 10 Hz erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Temperatur in der Kulturkammer über den Kammerboden eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem zwischen Kulturmedium und einer Gasphase ein Kontakt hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Zell- und/oder Gewebefunktionen mittels eines Lichtmikroskops fortlaufend kontrolliert werden.
Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 22 zum Aufhalten der Entdifferentierung bei differenzierten Zellen und/oder differenziertem Gewebe mittels organ- oder gewebetypischer elektrischer und mechanischer Stimulierung.