EP1421173A2 - Verfahren und vorrichtung zur in vitro vermehrung von zellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur in vitro vermehrung von zellen

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Publication number
EP1421173A2
EP1421173A2 EP02758026A EP02758026A EP1421173A2 EP 1421173 A2 EP1421173 A2 EP 1421173A2 EP 02758026 A EP02758026 A EP 02758026A EP 02758026 A EP02758026 A EP 02758026A EP 1421173 A2 EP1421173 A2 EP 1421173A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
culture
cells
area
cell
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02758026A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heribert Frei
Pierre Mainil-Varlet
Werner Müller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arbomedics GmbH
Original Assignee
Arbomedics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arbomedics GmbH filed Critical Arbomedics GmbH
Publication of EP1421173A2 publication Critical patent/EP1421173A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus

Definitions

  • the invention is in the field of in vitro cell cultures and relates to a method and a device according to the preambles of the corresponding independent claims.
  • the method and device according to the invention are used for the in vitro multiplication of cells that grow on a culture surface.
  • tissue equivalent can then form in vivo, which can take over the function of the original tissue.
  • Methods tissue engineering have also been developed with which a tissue equivalent from the expanded cells is still produced in vitro, which represents a more or less mature precursor of the functional tissue, and which is then implanted in the patient.
  • the cells are sown on the two-dimensional culture surface, cultivated for multiplication and then harvested for autotransplantation.
  • the three-dimensional frameworks in which the cells are also sown and propagated are usually used directly as so-called ex vivo organ units.
  • the bioreactors are equipped with control systems that keep the culture medium, gas exchange and other culture parameters within specified limits.
  • the culture medium is usually separated from the cell culture and replaced by an enzyme solution.
  • the enzyme treatment removes the cells from the culture surface to which they adhered during the culture and, if they adhered to neighboring cells, also separates them from one another, so that a suspension of individual cells is formed.
  • the suspended cells are then washed and, as a rule, sown again in a lower cell density on a new cultivated area, which is usually chosen to be larger than the previous one, and cultivated further in culture medium.
  • the invention is therefore intended to show a method and to create a device with which cells that grow on a cultivated area are cultivated and allow a high mass to be increased, in such a way that, compared to known cell cultures with manual passengers, the total load on the cells by passengers is lower and nevertheless the cell density on the culture surface can be kept within a narrow range.
  • the method and device are also intended to present a lower risk of contamination compared to known methods and devices and should be particularly suitable for the culture of epithelial and connective tissue cell types.
  • the cells to be cultivated are provided with a culture surface which is enlarged during the ongoing cell culture, the enlargement being adapted to the number of cells growing as a result of the cell multiplication, in the sense of passengers.
  • the cells that adhere to the culture area are not removed from the culture medium for enlarging the culture area.
  • the culture area is enlarged in the smallest steps in all its areas between the cells adhering to it, so that the reduction in cell spacing caused by cell multiplication can be continuously compensated, so to speak, and the cell density remains essentially constant or at least in a narrow band.
  • the cells are detached from the surface and brought into suspension continuously or at short time intervals, and further, not yet populated areas of the cultivated area are made available to these cells.
  • the same can also be achieved by detaching all cells from the culture area, using other means than replacing the culture medium with an enzyme solution (for example, by mechanical means), and by essentially simultaneously providing further, as yet unoccupied areas of the culture area be put.
  • the cells are therefore not detached from the culture area to which they adhere, or with more gentle measures, so that even if the detachment occurs relatively frequently, the cell load remains within a tolerable range.
  • the culture area to which the cells adhere can be increased in smaller steps or even essentially continuously, as a result of which the cell density varies significantly less than in the known methods of passenger travel. It has been shown that not only more cells survive in cell cultures which are carried out by the method according to the invention than when using known methods, but also that the cell differentiation is changed less with proliferation than is the case in cultures according to the prior art Technology is the case. Since the function and differentiation and other properties of the cells are known to be influenced by the cell density, the method according to the invention enables the production of cells by means of the device according to the invention which are in a defined state which can be predetermined via the cell density.
  • the spread of the properties from cell to cell is also less.
  • a lower spread of cell properties is a decisive experimental advantage or even an experimental prerequisite for the results of examinations to be of greater significance or to give any interpretable results based on the experimental noise.
  • the device according to the invention has a culture surface which can be positioned in a culture medium and is suitable for cell attachment, and means for enlarging this culture surface while it remains positioned in the culture medium.
  • the means for enlargement can be controlled in such a way that the culture area enlargement can be adapted to the number of cells growing as the number of cells increases.
  • the device has means for periodic or continuous renewal of the Culture medium.
  • the device may also have means for at least partially detaching cells from the culture surface.
  • the cells cultivated according to the method according to the invention are suitable for applications in cell biology and molecular biology, as well as for auto transplantations and for other applications.
  • the devices according to the invention can be combined with further technical devices by means of which the multiplication of the cells is determined directly on-line, for example by measuring scattered light, and / or indirectly by measuring culture parameters, for example the pH of the culture medium , measured and set to a predetermined value, or by which the culture medium is exchanged in a defined manner.
  • culture parameters for example the pH of the culture medium , measured and set to a predetermined value, or by which the culture medium is exchanged in a defined manner.
  • the devices according to the invention can be adapted very flexibly to the requirements in the most varied areas of application.
  • the devices according to the invention can be implemented in whole or in part as disposable devices or else as reusable devices in order to be able to use them in fields of use as diverse as cell proliferation in research, industry, diagnostics and clinics. This results in unexpectedly simple, safe and inexpensive solutions for cell proliferation in the various areas of application in cell and tissue culture.
  • the devices according to the invention now also open up the possibility of not only increasing or also reducing the culture area continuously or discontinuously during cell culture. This allows completely new cultural conditions to be set. For example, phases of organ and tissue development development of the multicellular organisms during which the cell density changes can be simulated in vitro. By influencing the cell density and thereby the distances between the cells, the cell-cell contacts and the mutual influencing of the cells by autocrine factors can be exploited for cell culture and tissue engineering.
  • the culture areas of the device according to the invention can be pretreated in a manner known per se for optimal cell attachment and / or for a desired cell or tissue differentiation, for example by means of glow discharges or plasma, by means of coating with molecules of the extracellular matrix or with mixtures of components of the extracellular Matrix, by means of biological deposition of layers of extracellular matrix by feeder cells, by chemical change in the charge density or by binding functional groups and / or signaling molecules for receptors of the cells, etc.
  • FIG. 1 shows a section through a first, exemplary embodiment of the device according to the invention with a culture surface on an expandable membrane
  • FIGS. 2A and 2B show a section through a further exemplary embodiment of the device according to the invention with a culture surface which is formed by a large number of small particles;
  • FIG. 3 shows a section through a further, exemplary embodiment of the device according to the invention, with a culture surface which is formed by the inner surface of a compressible, open-pore body;
  • FIG. 4 shows a section through a further exemplary embodiment of the device according to the invention, with means for generating a flow through which a part of the cells is detached from the culture surface, and with
  • FIG. 5 shows a section through a further exemplary embodiment of the device according to the invention with culture areas on semipermeable conducts for cell detachment by means of enzymes and with means for flooding further such conducts with culture medium for settling the detached cells;
  • FIG. 6 shows a section through a further exemplary embodiment of the device according to the invention with means for mechanically detaching the device
  • FIG. 7 shows a photomicrograph of cells according to Example 1 from a cell culture on an unstretched membrane (staining: Mayer's hemmalum);
  • FIG. 8 is a microphotograph of cells according to Example 1 from a cell culture on a stretched membrane (staining: Mayer's Hämalaun).
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of the device according to the invention, in which the culture surface 1 is the surface of a membrane 6 that is expandable in its surface.
  • the culture room 2, which is equipped with suitable supply and discharge lines 3 for the renewal of the culture medium, is located on one side of the membrane 6.
  • On the other side of the membrane there is another room 5 filled with gas or liquid, in which, for example, a Piston 7 the pressure can be reduced.
  • the membrane 6 is fastened in an essentially unstretched state between the culture space 2 and the further space 5.
  • the cells 4 are sown on the membrane surface (culture area 1) facing the culture area 2 and covered with culture medium.
  • the medium is renewed continuously or periodically in a known manner.
  • the membrane 6 is expanded continuously or periodically in steps by continuous or periodic pressure reduction in the further space 5 during the culture. In this case, the membrane 6 is concavely deformed and the culture area 1 is thereby enlarged.
  • the membrane 6, the culture surface 1 and the piston 7 are each shown in an initial position in which they are designated by the reference numbers mentioned, and in a later stage of cell culture, in which the reference numbers for the membrane 6, the Culture area 1 and the piston 7 are each identified by the reference numbers mentioned and an additional apostrophe (1 ', 6', 7 ') -
  • the membrane 6 of the device according to FIG. 1 is, for example, a dental membrane (e.g. non-latex Dental Dam or Flexi Dam non latex from ROEKO, D-89122 Langenau, Germany), or any membrane on which cells cultivate and multiply let, and which is preferably more than four to ten times expandable.
  • the material and structure of the culture area must allow cells to attach and multiply on this area. Therefore, the membranes may have to be modified or coated using methods known per se, for example by coating with fibronectin, collagen, gelatin, etc.
  • the gassing can take place in the other room 5.
  • the culture room 2 can be closed and operated with systems known per se.
  • the culture medium is exchanged without opening the culture space 2 by using the inflow and outflow lines 3 for it.
  • measuring systems can also be integrated in order to record and regulate the culture parameters.
  • the exemplary embodiment of the device according to the invention can also be given a technically particularly suitable form.
  • FIGS. 2A and 2B show a further exemplary embodiment of the device according to the invention in a stage at the beginning of the culture (FIG. 2A) and during the culture (FIG. 2B).
  • the culture surface 1 is formed by the upper surface of a volume 13 filled with a large number of small particles, which is arranged in a container 12, the cross section of which increases towards the top.
  • this container 12 there is a suitable means (for example the slide 15) with which the particle volume 13 can be pushed upwards in such a way that its surface (culture surface 1) increases. ssert, by pushing further particles between the ready positioned particles on the surface.
  • supply and discharge lines 3 a pump 16, a storage container 17 and a waste container 18 are provided.
  • FIG. 2B shows the device in a state in which the culture surface 1 'is enlarged compared to the initial state (FIG. 2A: 1).
  • the slide 15 ' is in a correspondingly raised position.
  • the particles used in the device according to FIGS. 2A and 2B consist, for example, of glass, ceramic, plastics such as polyurethane, etc.
  • the shape of the particles can be spherical, rod-shaped, etc., for example, and typically has a size that does not exceed 5 mm in any direction ,
  • FIG. 3 shows a further exemplary embodiment of the device according to the invention.
  • the cultivated area corresponds to the inner surface of a compressible, open-pore body 22, for example a sponge.
  • This inner surface is small in an initial state by compression by means of a slide 15 (few pores open) and is enlarged during the culture by relaxation (enlargement of the lumen and the number of open pores, so that an enlargement of the inner surface results).
  • the compressible, open-pore body 22 (and 22 ') is arranged, for example, between two sieve-like, mutually displaceable support plates 23 (and 23') through which the culture medium can flow unhindered.
  • the culture medium is exchanged from the storage vessel 17 via the culture room 2 (and 2 ′) into the waste container 18.
  • 4 shows a further exemplary embodiment of the device according to the invention. This is based on the phenomenon that cells partially detach from the culture surface and take on a spherical shape when they prepare for division.
  • the adhesion of the cell to the culture surface is weaker during cell division and the area of attack for the shear forces is greater, so that the cells can be torn from the culture surface by low shear forces during the division phase, i.e. with shear forces with which cells that cannot are in division, cannot be replaced.
  • the detached cells are then sown on newly released cultivated areas.
  • this phenomenon is used to detach some of the cells from the culture surface. This gives the remaining cells more space for further multiplication steps and detached cells can be sown in new areas of the cultivated area, but neither the detached cell nor those that have remained stuck are burdened by enzymatic treatment because no enzyme solution is used in this process ,
  • the shear forces necessary for the detachment of the cells are generated by currents in the culture medium, which at the same time also serve to suspend and distribute the detached cells in such a way that they can settle on newly provided areas of the culture area.
  • the device according to the invention shown in FIG. 4 has, for example, a cylindrical culture chamber 2, in which in turn a compressible, open-pore body 22 is arranged, which can be compressed or relaxed between a support plate 23 which is permeable to the culture medium and a likewise permeable piston 30.
  • the resting position of the piston 30 which moves towards the top during the cell culture is selected, for example, such that the cell density in the compressible body 22 is always in a predetermined interval.
  • the flow necessary for the cell detachment is generated by impact movements of the piston 30, whereby the current state of compression of the compressible body 22 also temporarily increases somewhat intermittently.
  • Such push movements are at intervals of time that last at least as long as a cell in the culture in question for the entire cell division, i. H. from prophase to completion of the telophase.
  • its inner structure can be designed, for example, as a capillary filter with the preferred direction in the direction of the flow.
  • the efficiency of the piston 30 can be supported, for example, by valve mechanisms arranged therein, which close off when the flow is rapid (shock for cell detachment), but remain open when the flow is slow (exchange of the culture medium).
  • the device according to the invention shown in FIG. 4 can also be designed as follows, for example.
  • a non-compressible, open-pore body 22 is arranged, which is arranged between two support plates 23 and 24 which are permeable to the culture medium.
  • the shear force with which the cells are detached in division is generated, for example, via the large-lumen supply and discharge line 3 by means of the pump 16 or by means of the piston 30.
  • FIG. 5 shows a further exemplary embodiment of the device according to the invention.
  • the cultivated area 1 is formed here by a plurality of conductors 40 which run through the cultivated area 2 at different levels and the walls of which are permeable to aqueous enzyme solution.
  • the conductors 40 can be flowed through individually from an inlet side 41 to an outlet side 42, optionally with media with or without enzymes, in order to detach the cells of the cell culture on the conductors 40 from the culture surface with an enzyme solution by enzyme through the walls of the conductors 40 can reach the basal side of the cells and also cell-cell connections, while at the same time the contact of the cells with the enzyme solution on the side of the space 2 is minimal, because this side is not directly in contact with the wall of the conductors 40, and because furthermore, enzyme inhibitors can be added to the medium in room 2, for example specific enzyme inhibitors for the enzymes and / or serum used.
  • the cells 4 After the cells 4 have been detached from the conductors 40, the cells are essentially in an enzyme-free medium in which they can be suspended by increasing the flow and can be sown again over more conductors 40. Then the movement of the culture medium is stopped until the cells have settled on the culture surface 1 and have attached.
  • the level of the culture medium in room 2 is increased so that a second or further level of conductivity (additional culture area areas 1 ") is flooded, and the culture area (1 and 1") for the detached cells is enlarged. Then the movement of the culture medium is stopped until all cells have settled again on the flooded conduct 40 and have attached.
  • an enzyme solution for example a trypsin solution
  • a trypsin solution is used to detach the cells.
  • this essentially only hits the basal side of the cells adhering to the culture surface, while the other cell sides are still positioned in the culture medium, the load on the cells is significantly lower than when manual passengers are carried out.
  • FIG. 6 shows a further exemplary embodiment of the device according to the invention. This has means for mechanically detaching the cells from the culture area and means for enlarging the culture area.
  • the culture surface 1 is in the form of a hollow cylinder and the cells are detached with a correspondingly shaped blade 50 which is attached to the end face of a piston 51 which can be displaced axially in the hollow cylinder.
  • a blade 50 a brush or a rubber policeman can also be provided for the cell detachment.
  • the piston 51 is moved into the culture space 2. In order to enlarge the cultivated area 1 to further cultivated area areas 1 ′′, it is withdrawn therefrom (positions 50 ′ and 51 ′).
  • the invention is described below using the example of the multiplication of chondrocytes, but is not restricted to this cell type.
  • Example 1 relates to a cell culture in a device as shown in FIG. 1.
  • An expandable membrane from the dental field was used (Hygienic® NON-LATEX DENTAL DAM, Coltene / Whaledant Inc., USA). The remaining elements were standard materials from the cell culture laboratory.
  • the device used was made from a disposable syringe. The membrane was washed 3 times for 10 min. washed with sterile phosphate buffered saline, then 3x 10 min. placed with 70% ethanol and then dried in the sterile workbench. The device was assembled with sterile gloves in the sterile workbench. The membrane was attached to the cut cylinder of a plastic syringe with a piece of silicone tubing.
  • the assembled device was 2 times over 15 min. with 70% ethanol, then 2 times 10 min. with phosphate-buffered saline and before sowing the cells twice 10 min. treated with culture medium.
  • the space between the syringe plunger and the expandable membrane was filled with culture medium using a syringe via an injection needle, so that it was gas-free and the membrane formed a flat surface.
  • D-MEM / F12 1: 1 (Life Technologies, Basel, Switzerland) with L-glutamate and 10% fetal calf serum (HyClone, Utah, USA) was used as culture medium, in which the buffer concentration of HEPES (Life Technologies, Basel, Switzerland) was increased to 35 mM in order to be able to carry out cell culture without CO2 fumigation. The cells were detached from the culture area using trypsin (Life Technologies, Basel, Switzerland).
  • Chondrocytes from knee joints of 6-month-old calves were used as test cells.
  • the chondrocytes were isolated from the articular knot with pronase (2.5 mg / ml; Röche, Switzerland) and then with collagenase (2.5 mg / ml; Röche, Switzerland) and under 5% CO2 fumigation in culture medium D MEM / F12 propagated with 15 mM HEPES and 10% fetal calf serum in plastic culture bottles. When confluence was reached, the cells were detached from the culture area with trypsin, washed and sown again in new culture bottles. In this way, the cells were passaged three times before they were used in the experiment.
  • the chondrocytes were sown at 1.8 cm2 of the unextended culture area at a density of 100,000 cells / cm2.
  • D MEM / F12 with 35 mM HEPES and 10% fetal calf serum served as culture medium.
  • the apparatus was protected from infection with a small petri dish lid.
  • the piston rod was secured with an artery clamp to prevent unwanted displacement of the piston.
  • the apparatus was placed in a 37 ° C warming cabinet for culture.
  • the cells were sown manually and the culture medium was changed manually.
  • the flask of the 10 ml syringe was pulled down by 0.5 ml every day, which gradually increased the membrane area.
  • 0.5 ml of culture medium was added to the culture area to supplement the volume. added to mens.
  • 0.5 ml of culture medium was also added daily, but the flask was always left in the same position, ie the membrane was not stretched.
  • the cultures were washed with phosphate buffered saline.
  • the cells were then harvested with trypsin.
  • a part of the harvested cells was cultivated further under the same conditions as before the experiment and qualitatively morphologically evaluated under the inverted microscope for the next four days.
  • Another part of the harvested cells was stained with trypan blue and the number of vital and dead cells was counted in a hemocytometer.
  • other cultures were fixed in situ with 4% formaldehyde solution and stained with Mayer's haemalum.
  • the results show that the cells were able to multiply on the expandable membrane.
  • the morphology of the cells on the expanded membrane was comparable to the morphology of the cells on the unstretched membrane (control).
  • the number of cells that could be harvested from the stretched membrane was about five times greater than that of the cells from the unstretched membrane. If the cells from control and experiment were further cultivated in petri dishes for cell cultures, the two cell populations could not be differentiated with regard to cell morphology and cell density.

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Abstract

Zur in vitro Verrnehrung von Zellen, welche auf einer Kulturfläche wachsen, wird vorgeschlagen, die Zellen auf Kulturflächen (1) auszusäen und in Kulturmedium zu kultivieren, wobei die Kulturfläche kontinuierlich oder periodisch vergrössert wird, ohne dass sie aus dem Kulturmedium entfernt wird. Für diese Kulturflächenvergrösserung werden die Zellen nicht von der Kulturfläche abgelöst und wird die Kulturfläche zwischen den Zellen vergrössert. Es können aber auch mindestens ein Teil der Zellen abgelöst werden und die Kulturfläche durch Überflutung weiterer Kulturflächenbereiche vergrössert werden. Die Kulturfläche einer beispielhaften Vorrichtung für die genannte Zellvermehrung ist die eine Seite einer expandierbaren Membran (6), die dadurch vergrössert wird, dass auf ihrer anderen Seite der Druck verändert wird. Die Zellvermehrung kann ohne manuelles Passagieren durchgeführt werden. Sie belastet die Zellen weniger als bekannte Zellvermehrungsverfahren und ist einfacher automatisierbar.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR IN VITRO VERMEHRUNG VON ZELLEN
Die Erfindung liegt auf dem Gebiete von in vitro Zellkulturen und bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung nach den Oberbegriffen der entsprechenden, unabhängigen Patentansprüche. Verfahren und Vorrichtung gemäss Erfindung dienen der in vitro Vermehrung von Zellen, die auf einer Kulturfläche wachsen.
Es ist aus verschiedenen Publikationen (z.B. Fuss et al. "Characteristics of human chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts seeded onto a Type 1/111 collagen sponge under different culture conditions," Anat. Anz. 182:303-310 (2000); Chan et al. "A new technique to resurface wounds with composite biocompatible epidermal graft and ar ificial skin," J. Trauma 50:358-362 (2001); Roth et al. "Nonviral transfer of the gene encoding coagulation factor VIII in patients with severe hemophilia A," N. Engl. J. Med. 344:1735-1742 (2001)) bekannt, Zellen aus Geweben eines Patienten (autologe Zellen) zu entnehmen und nach der Vermehrung wieder in den Körper des Patienten zurückzutransferieren (Autotransplantation von Zellen). Die Hauptvorteile der Autotransplantation gegenüber der Organtransplantationen sind die folgenden: keine Übertragung von Krankheiten, weil die eigenen Zellen verwendet werden, und keine Einschränkung durch die Anzahl der Organspender und durch die Übereinstimmung der Histokompatibilitätseigenschaften zwischen Spender und Empfänger. Ferner können Operationstermine besser geplant werden. Zur Autotransplantation von Zellen wird bei einem ersten, kleinen Eingriff aus dem Körper des Patienten eine kleine Gewebeprobe entnommen. Daraus werden lebende Zellen isoliert und anschliessend in vitro vermehrt. Beim zweiten Eingriff werden dem Patienten die vermehrten Zellen als Suspension wieder implantiert. In vivo kann sich danach ein Gewebeäquivalent bilden, das die Funktion des ursprünglichen Gewebes übernehmen kann. Es sind auch Verfahren (tissue engineering) entwickelt worden, mit denen noch in vitro ein Gewebeäquivalent aus den vermehrten Zellen hergestellt wird, das eine mehr oder weniger reife Vorstufe des funktionellen Gewebes darstellt, und das dann dem Patienten implantiert wird.
Die in vitro Vermehrung von Gewebezellen, die nicht in Suspension, sondern nur an einer Kulturfläche anhaftend wachsen und sich vermehren können, wird gemäss dem Stande der Technik durchwegs von hochqualifiziertem Personal im wesentlichen manuell durchgeführt. Dabei werden die Zellen, wenn sie sich vermehrt haben, mit Trypsin oder anderen Enzymen von der Kulturfläche abgelöst, vom Enzym getrennt, in Medium ohne Enzym wieder suspendiert und mit geringerer Anzahl Zellen pro Kulturfläche wieder ausgesät. Die geringere Zelldichte, mit der die Zellen wieder ausgesät werden, ermöglicht dann auch eine weitere Vermehrung der Zellen. Diese Reihe von Arbeitsschritten ist als „Passagieren der Zellen" bekannt. Auch der notwendige periodische Austausch des Kulturmediums erfolgt üblicherweise manuell. Die Nachteile einer solchen Zellkultur nach dem Stand der Technik sind vielfältig. Besonders nachteilig für die Zellen ist die Behandlung mit Trypsin und Enzymen allgemein, weil dadurch die Zellen im allgemeinen irreversibel und in der Regel auch in unbekanntem Ausmass geschädigt werden. Ferner verursachen alle manuell durchgeführten Arbeitsschritte hohe Personalkosten und verlangen eine aufwendige Qualitätssicherung. Zusätzlich führen alle manuell durchgeführten Arbeitschritte immer auch zu einer Erhöhung des Infektionsrisikos für die Zellkulturen und damit indirekt im Fall einer klinischen Anwendung auch für den Patienten. Femer besteht bei allen manuellen Arbeiten mit humanen Zellkulturen ein Infektionsrisiko für das Laborpersonal. Zur Kultivierung von Zellen, die auf einer Kulturfläche wachsen, sind auch Bioreaktoren bekannt. In diesen Bioreaktoren steht den Zellen eine zweidimensionale Kulturfläche (z. B. beschrieben in WO-96/40860) oder ein dreidimensionales Gerüst (z. B. beschrieben in FR-2768783-A1 oder in WO-01/14517-A1) zur Verfügung. Die Zellen werden auf der zweidimensionalen Kulturfläche ausgesät, zur Vermehrung kultiviert und dann für die Autotransplantation geerntet. Die dreidimensionalen Gerüste, in welchen die Zellen ebenfalls ausgesät und vermehrt werden, werden üblicherweise direkt als sog. ex vivo Organeinheiten weiter verwendet. Die Bioreaktoren sind mit Regelsystemen ausgerüstet, welche das Kulturmedium, den Gasaustausch und andere Kulturparameter innerhalb von vorgegebenen Grenzwerten halten.
Mit den oben beschriebenen Bioreaktoren können gegenüber dem manuellen Vorgehen Kosten gespart werden, sowohl beim Personal als auch bei der Qualitätssicherung. Der für klinische Anwendungen entscheidende Nachteil dieser Bioreaktoren ist aber die Tatsache, dass die Vermehrung der Zellen durch die ihnen zur Verfügung stehende Kulturfläche begrenzt ist. Dasselbe gilt auch für die Bioreaktoren gemäss EP-0725134 und WO-0066706, die flexible Wände und Kulturflächen aufweisen, und für die Bioreaktoren gemäss WO-00/12676 mit elastischen Wänden. Sollen also die in derartigen Bioreaktoren nur beschränkt vermehrten Zellen weiter vermehrt werden, müssen die Zellen notwendigerweise passagiert werden. Diese Bioreaktoren können daher den Hauptnachteil für die Biologie der Zellen nicht beheben, weil die Zellen beim Passagieren mit Trypsin und/oder anderen Enzymen in Kontakt kommen und dadurch, wie oben beschrieben, unkontrolliert irreversibel geschädigt werden.
Für das Passagieren von Zellen, die auf einer Kulturfläche wachsen, wird üblicherweise das Kulturmedium von der Zellkultur getrennt und durch eine Enzymlösung ersetzt. Durch die Enzymbehandlung werden die Zellen von der Kulturfläche, an der sie während der Kultur anhafteten, gelöst und, falls sie an Nachbarzellen hafteten, auch voneinander getrennt, so dass eine Suspension von einzelnen Zellen entsteht. Die suspendierten Zellen werden dann gewaschen und in der Regel in geringerer Zelldichte auf einer neuen Kulturfläche, die meist auch grösser gewählt wird als die vorhergehende, wieder ausgesät und in Kulturmedium weiter kultiviert.
Es ist bekannt, dass die meisten Zelltypen, die auf einer Kulturfläche wachsen, sich optimal vermehren, wenn pro Kulturfläche eine bestimmte Anzahl von Zellen vorhanden ist, die sich nur innerhalb eines, insbesondere durch den Zelltypus vorgegebenen Zelldichtebereichs bewegt. Die Zellen sollen für eine gegenseitige günstige Beeinflussung nicht zu weit voneinander entfernt und für eine ungehinderte Vermehrung nicht zu nahe beieinander sein. Kulturen mit Zelldichten ausserhalb des ge- nannten Zelldichte-Bereichs führen zu Zellverlusten, verminderter Zellvermehrung und/oder beschleunigter Änderung der Zelldifferenzierung. Aus diesem Grunde sollten Zellkulturen insbesondere von Zellen mit einer niedrigen Dichte-Toleranz relativ oft passagiert werden.
Es ist aber auch bekannt, dass das Passagieren für die Zellen wegen der Enzymbe- handlung, wie oben beschrieben, eine grosse biologische Belastung der Zellen darstellt. Insbesondere irreversible Änderungen von Komponenten der Zelloberfläche können Funktion und Differenzierung der Zellen beeinflussen.
Aus den oben beschriebenen Kenntnissen von Zellkulturen geht hervor, dass zu deren Verbesserung vorteilhafterweise beim Passagieren der Zellen angegriffen werden sollte, derart, dass das Passagieren für die Zellen weniger belastend ist, so dass die Zellen infolge der geringeren Belastung eine höhere Anzahl von Passagierschritten durchmachen können, oder derart, dass ein Passagieren im herkömmlichen Sinne gar nicht mehr notwendig ist. Dies ist denn auch die Aufgabe, die sich die Erfindung stellt. Die Erfindung soll also ein Verfahren aufzeigen und eine Vorrichtung schaf- fen, mit denen sich Zellen, die auf einer Kulturfläche wachsen, kultivieren und in ei- nem hohen Masse vermehren lassen, derart, dass gegenüber bekannten Zellkulturen mit manuellem Passagieren die gesamte Belastung der Zellen durch Passagieren geringer ist und trotzdem die Zelldichte auf der Kulturfläche in einem engeren Bereich gehalten werden kann. Verfahren und Vorrichtung sollen zudem gegenüber bekannten Verfahren und Vorrichtungen ein kleineres Kontaminationsrisiko darstellen und sollen sich insbesondere eignen für die Kultur von epithelialen und bindegewebigen Zelltypen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren und die Vorrichtung, wie sie in den Patentansprüchen definiert sind.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird den zu kultivierenden Zellen eine Kulturfläche zur Verfügung gestellt, die während der laufenden Zellkultur vergrössert wird, wobei die Vergrösserung im Sinne des Passagierens an die durch die Zellvermehrung wachsende Zellenzahl angepasst wird. Die Zellen, die an der Kulturfläche haften, werden für die Kulturflächenvergrösserung nicht aus dem Kulturmedi- um entfernt. Die Kulturfläche wird in kleinsten Schritten in all ihren Bereichen zwischen den daran haftenden Zellen vergrössert, so dass die durch die Zellvermehrung bedingte Verkleinerung der Zellabstände sozusagen kontinuierlich kompensiert werden kann und die Zelldichte im wesentlichen konstant oder mindestens in einem engen Band bleibt. Oder es werden dauernd oder in kleinen Zeitabständen ein Teil der Zellen von der Oberfläche gelöst und in Suspension gebracht, und es werden diesen Zellen weitere, noch nicht besiedelte Kulturflächenbereiche zur Verfügung gestellt. Dasselbe kann auch erreicht werden, indem alle Zellen von der Kulturfläche abgelöst werden, wobei andere Mittel eingesetzt werden als der Austausch des Kulturmediums durch eine Enzymlösung (beispielsweise durch mechanische Mittel), und indem den Zellen im wesentlichen gleichzeitig weitere, noch nicht besiedelte Kulturflächenbereiche zur Verfügung gestellt werden. Die Zellen werden also gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren nicht oder mit schonenderen Massnahmen von der Kulturfläche, an der sie anhaften, abgelöst, so dass auch bei einer relativ häufigen derartigen Ablösung die Zellbelastung in einem tolerierbaren Rahmen bleibt. Dadurch kann die Kulturfläche, an der die Zellen an- haften, in kleineren Schritten oder sogar im wesentlichen kontinuierlich vergrössert werden, wodurch die Zelldichte bedeutend weniger variiert als bei den bekannten Methoden des Passagierens. Es zeigt sich, dass in Zellkulturen, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführt werden, nicht nur mehr Zellen überleben als bei der Anwendung von bekannten Methoden, sondern dass auch die Zelldifferenzie- rung bei starker Vermehrung weniger verändert wird als dies in Kulturen gemäss dem Stande der Technik der Fall ist. Da bekanntermassen die Funktion und Differenzierung sowie weitere Eigenschaften der Zellen durch die Zelldichte beeinflusst werden, ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren mittels der erfindungsgemässen Vorrichtung die Produktion von Zellen, die sich in einem definierten, über die Zell- dichte vorgebbaren Zustand befinden. Da femer die Zelldicht in der Kultur gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren weniger variiert ist als in einer Kultur nach dem Stand der Technik, ist auch die Streuung der Eigenschaften von Zelle zu Zelle geringer. Für viele Anwendungen ist eine geringere Streuung der Zelleigenschaften ein entscheidender experimenteller Vorteil oder sogar eine experimentelle Vorausset- zung dafür, dass die Resultate von Untersuchungen eine höhere Signifikanz erreichen oder auf dem Hintergrund des experimentellen Rauschens überhaupt interpretierbare Resultate ergeben.
Die erfindungsgemässe Vorrichtung weist eine in einem Kulturmedium positionierbare Kulturfläche auf, die für eine Anhaftung der Zellen geeignet ist, sowie Mittel zur Vergrösserung dieser Kulturfläche, während sie im Kulturmedium positioniert bleibt. Die Mittel zur Vergrösserung sind dabei derart steuerbar, dass die Kulturflä- chenvergrösserung im Sinne des Passagierens an die bei der Zellvermehrung wachsende Zahl der Zellen angepasst werden kann. Ferner weist die Vorrichtung wie bekannte Bioreaktoren Mittel zur periodischen oder kontinuierlichen Erneuerung des Kulturmediums auf. Gegebenenfalls weist die Vorrichtung femer Mittel zur mindestens teilweisen Ablösung von Zellen von der Kulturfläche auf.
Die gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren kultivierten Zellen eignen sich sowohl für Anwendungen in der Zellbiologie und der Molekularbiologie, als auch für Autotransplantationen und für weitere Anwendungen.
Die erfindungsgemässen Vorrichtungen können mit weiteren technische Einrichtungen kombiniert werden, durch welche die Vermehrung der Zellen direkt on-line bestimmt wird, beispielsweise über die Messung von Streulicht, und/oder indirekt über die Messung von Kulturparametern, beispielsweise den pH-Wert des Kulturmedi- ums, gemessen und auf einen vorgegebenen Wert eingestellt werden, oder durch die das Kulturmedium in definierter Weise ausgetauscht wird. Auf diese Weise können die erfindungsgemässen Vorrichtungen sehr flexibel an die Anforderungen in den verschiedensten Anwendungsgebieten angepasst werden.
Die erfindungsgemässen Vorrichtungen können ganz oder teilweise als Einwegvor- richtung oder aber auch als wiederverwendbare Apparaturen realisiert werden, um sie in so unterschiedlichen Anwendungsgebieten wie der Zellvermehrung in Forschung, Industrie, Diagnostik und Klinik einsetzen zu können. Dadurch ergeben sich unerwartet einfache, sichere und kostengünstige Lösungen für die Zellvermehrung in den verschiedenen Anwendungsgebieten der Zeil- und Gewebekultur.
Die erfindungsgemässen Vorrichtungen eröffnen neu auch die Möglichkeit, die Kulturfläche während der Zellkultur kontinuierlich oder diskontinuierlich nicht nur zu vergrössern, sondern auch zu verkleinern. Dadurch lassen sich ganz neue Kulturbedingungen einstellen. Beispielsweise können Phasen der Organ- und Gewebeent- wicklung der vielzelligen Organismen, während denen sich die Zelldichte ändert, in vitro simuliert werden. Durch Beeinflussung der Zelldichte und dadurch der Abstände zwischen den Zellen können die Zell-Zell-Kontakte und die gegenseitige Beeinflussung der Zellen durch autokrine Faktoren für die Zellkultur und das Tissue Engi- neering ausgenützt werden.
Die Kulturflächen der erfindungsgemässen Vorrichtung können in an sich bekannter Weise für ein optimales Anheften der Zellen und/oder für eine gewünschte Zeil- oder Gewebedifferenzierung vorbehandelt werden, beispielsweise mittels Glimmentladungen oder Plasma, mittels Beschichtung mit Molekülen der extrazellulären Matrix oder mit Gemischen von Komponenten der extrazellulären Matrix, mittels biologischer Ablagerung von Schichten extrazellulärer Matrix durch Feeder-Zellen, mittels chemischer Veränderung der Ladungsdichte oder mittels Bindung von funktionellen Gruppen und/oder Signalmolekülen für Rezeptoren der Zellen, usw.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von beispielhaften Ausführungsformen der erfindungsgemässen Vorrichtung dargestellt, ist aber nicht auf die gezeigten Ausführungsformen beschränkt. Dabei zeigen:
Figur 1 einen Schnitt durch eine erste, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung mit einer Kulturfläche auf einer expandierbaren Membran;
Figuren 2A und 2B einen Schnitt durch eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung mit einer Kulturfläche, die durch eine grosse Anzahl von kleinen Partikeln gebildet wird; Figur 3 einen Schnitt durch eine weiter, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung, mit einer Kulturfläche, die durch die innere Oberfläche eines komprimierbaren, offenporigen Körpers gebildet wird;
Figur 4 einen Schnitt durch eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfin- dungsgemässen Vorrichtung, mit Mitteln zur Erzeugung einer Strömung, durch die ein Teil der Zellen von der Kulturfläche abgelöst wird, und mit
Mitteln zur Überflutung weiterer Kulturflächenbereiche mit Kulturmedium zur Ansiedlung der abgelösten Zellen;
Figur 5 einen Schnitt durch eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfin- dungsgemässen Vorrichtung mit Kulturflächen auf semipermeablen Kondukten zur Zellablösung mittels Enzymen und mit Mitteln zur Überflutung weiterer derartiger Kondukte mit Kulturmedium zur Ansiedlung der abgelösten Zellen;
Figur 6 einen Schnitt durch eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfin- dungsgemässen Vorrichtung mit Mitteln zur mechanischen Ablösung der
Zellen von Kulturflächen und mit Mitteln zur Überflutung weiterer Kulturflächen mit Kulturmedium zur Ansiedlung der abgelösten Zellen;
Figur 7 eine mikrophotographische Aufnahme von Zellen gemäss Beispiel 1 aus einer Zellkultur auf ungedehnter Membran (Färbung: Mayer's Hämalaun);
Figur 8 eine mikrophotographische Aufnahme von Zellen gemäss Beispiel 1 aus einer Zellkultur auf gedehnter Membran (Färbung: Mayer's Hämalaun). Figur 1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung, bei der die Kulturfläche 1 die Oberfläche einer in ihrer Fläche expandierbaren Membran 6 ist. Der Kulturraum 2, der für die Erneuerung des Kulturmediums mit geeigneten Zu- und Wegleitungen 3 ausgerüstet ist, liegt auf der einen Seite der Membran 6. Auf der anderen Membranseite liegt ein weiterer, mit Gas oder Flüssigkeit gefüllter Raum 5, in dem beispielsweise durch einen Kolben 7 der Druck reduziert werden kann.
Die Membran 6 wird in im wesentlichen ungedehntem Zustand zwischen Kulturraum 2 und weiterem Raum 5 befestigt. Die Zellen 4 werden auf der dem Kulturraum 2 zugewandten Membranoberfläche (Kulturfläche 1) ausgesät und mit Kulturmedium überdeckt. Während der Kultur der Zellen wird das Medium in bekannter Weise kontinuierlich oder periodisch erneuert. Ferner wird während der Kultur die Membran 6 durch kontinuierliche oder periodische Druckreduktion im weiteren Raum 5 kontinuierlich oder periodisch in Schritten expandiert. Die Membran 6 wird dadurch in diesem Fall konkav verformt und die Kulturfläche 1 dadurch vergrössert.
In gleicher Weise ist auch eine konvexe Verformung und Vergrösserung der Kulturfläche 1 durch eine Druckerhöhung im weiteren Raum 5 realisierbar.
In der Figur 1 sind die Membran 6, die Kulturfläche 1 und der Kolben 7 je in einer Anfangsposition dargestellt, in der sie mit den genannten Bezugsziffern bezeichnet sind, und in einem späteren Stadium der Zellkultur, in dem die Bezugsziffern für die Membran 6, die Kulturfläche 1 und der Kolben 7 je mit den genannten Bezugsziffern und zusätzlichem Apostroph gekennzeichnet sind (1 ', 6', 7')- Die Membran 6 der Vorrichtung gemäss Figur 1 ist beispielsweise eine Dentalmembran (z. B. non-latex Dental Dam oder Flexi Dam non latex von ROEKO , D-89122 Langenau, Deutschland), oder irgend eine Membran, auf der sich Zellen kultivieren und vermehren lassen, und welche vorzugsweise mehr als vier- bis zehnfach expandierbar ist. Material und Struktur der Kulturfläche müssen Zellen erlauben, sich auf dieser Fläche anzuheften und zu vermehren. Daher müssen die Membranen gegebenenfalls mit an sich bekannten Methoden modifiziert bzw. beschichtet werden, beispielsweise durch Beschichtung mit Fibronectin, Kollagen, Gelatine, usw.
Bei Verwendung einer gasdurchlässigen Membran 6 und einer Flüssigkeit im weite- ren Raum 5 kann die Begasung über den weiteren Raum 5 erfolgen.
In der Vorrichtung gemäss Fig. 1 kann der Kulturraum 2 geschlossen sein und mit an sich bekannten Systemen betrieben werden. Beispielsweise wird das Kulturmedium ohne Öffnen des Kulturraumes 2 ausgetauscht, indem die Zu- und Abflussleitungen 3 dafür verwendet werden. In analoger Weise können auch Messsysteme integriert werden, um die Kultuφarameter aufzuzeichnen und zu regulieren. Der beispielhaften Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung kann auch eine technisch besonders geeignete Form gegeben werden.
Figuren 2A und 2B zeigen eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung in einem Stadium bei Kulturanfang (Figur 2A) und während der Kultur (Figur 2B). Die Kulturfläche 1 wird in dieser Ausführungsform durch die obere Oberfläche eines mit einer grossen Zahl von kleinen Partikeln gefüllten Volumens 13 gebildet, das in einem Behälter 12 angeordnet ist, dessen Querschnitt sich gegen oben vergrössert. In diesem Behälter 12 ist ein geeignetes Mittel (z. B. der Schieber 15) vorgesehen, mit dem das Partikel-Volumen 13 gegen oben geschoben werden kann, derart, dass seine Oberfläche (Kulturfläche 1) sich vergrö- ssert, dadurch, dass weitere Partikel zwischen die bereites an der Oberfläche positionierten Partikel hinein geschoben werden. Für die Erneuerung des Kulturmediums sind Zu- und Wegleitungen 3, eine Pumpe 16, ein Vorratsbehälter 17 und ein Abfallbehälter 18 vorgesehen.
In der Figur 2B ist die Vorrichtung in einem Zustand gezeigt, in dem die Kulturoberfläche 1' gegenüber dem Anfangszustand (Figur 2A:1) vergrössert ist. Der Schieber 15' ist in einer entsprechend angehobenen Position.
Die in der Vorrichtung gemäss Figuren 2A und 2B verwendeten Partikel bestehen beispielsweise aus Glas, Keramik, Kunststoffen wie Polyurethan, usw. Die Form der Partikel kann beispielsweise kugelförmig, stäbchenförmig, usw. sein und weist typischerweise eine Grosse auf, die 5mm in keiner Richtung übersteigt.
Figur 3 zeigt eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. Die Kulturfläche entspricht in diesem Ausführungsbeispiel der inneren Oberfläche eines kompressiblen, offenporigen Köφers 22, beispielsweise eines Schwammes. Diese innere Oberfläche ist in einem Anfangszustand durch Kompression mittels eines Schiebers 15 klein (wenige Poren offen) und wird während der Kultur durch Entspannung vergrössert (Vergrösserung des Lumens und der Anzahl der offenen Poren, so dass eine Vergrösserung der inneren Oberfläche resultiert).
Für die Kompression und Entspannung ist des kompressiblen, offenporigen Köφers 22 (und 22') ist dieser beispielsweise zwischen zwei siebartigen, gegeneinander verschiebbaren Trägeφlatten 23 (und 23') angeordnet, durch die das Kulturmedium ungehindert fliessen kann. Der Austausch des Kulturmediums erfolgt vom Vorratsge- fäss 17 über den Kulturraum 2 (und 2') in den Abfallbehälter 18. Fig. 4 zeigt eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. Diese basiert auf dem Phänomen, dass sich Zellen von der Kulturfläche teilweise lösen und eine kugelartige Form annehmen, wenn sie sich für die Teilung vorbereiten. Dadurch ist während der Zellteilung die Haftung der Zelle an der Kulturfläche schwächer und die Angriffsfläche für die Scherkräfte grösser, so dass die Zellen während der Teilungsphase schon durch niedrige Scherkräfte von der Kulturfläche abgerissen werden können, also mit Scherkräften, mit denen Zellen, welche sich nicht in Teilung befinden, nicht abgelöst werden können. Die abgelösten Zellen werden dann auf neu freigegebene Kulturflächen ausgesät.
Dieses Phänomen wird erfindungsgemäss ausgenutzt zur Loslösung eines Teils der Zellen von der Kulturfläche. Dadurch erhalten die verbleibenden Zellen wieder mehr Platz für weitere Vermehrungsschritte und abgelösten Zellen können auf neue Kulturflächenbereiche ausgesät werden, aber weder die losgelösten Zeil noch jene, die festsitzen geblieben sind, werden dabei durch enzymatische Behandlung belastet, weil keine Enzymlösung bei diesem Verfahren zum Einsatz kommt. Die für die Ablösung der Zellen notwendigen Scherkräfte werden durch Strömungen im Kulturmedium erzeugt, die gleichzeitig auch zur Suspendierung und Verteilung der abgelösten Zellen dient, derart, dass diese sich auf neu zur Verfügung gestellten Kulturflächenbereichen ansiedeln können.
Die in der Figur 4 dargestellte erfindungsgemässe Vorrichtung weist beispielsweise einen zylinderförmigen Kulturraum 2 auf, in dem wiederum ein komprimierbarer, offenporiger Köφer 22 angeordnet ist, der zwischen einer für das Kulturmedium permeablen Trägeφlatte 23 und einem ebenfalls permeablen Kolben 30 komprimierbar bzw. entspannbar ist. Je höher der Kolben 30 im Kulturraum 2 positioniert ist, desto entspannter ist der komprimierbare Köφer 22, das heisst, desto grösser ist die innere Kulturfläche. Die sich während der Zellkultur gegen oben verschiebende Ruheposition des Kolbens 30 wird beispielsweise so gewählt, dass die Zelldichte im komprimierbaren Köφer 22 immer in einem vorgegebenen Intervall liegt.
Die für die Zellablösung notwendige Strömung wird durch Stossbewegungen des Kolbens 30 erzeugt, wodurch sich auch der momentane Kompressionszustand des komprimierbaren Köφers 22 stossweise vorübergehend etwas erhöht. Solche Stossbewegungen werden in Zeitintervallen, die mindestens so lange dauern, wie eine Zelle in der betreffenden Kultur für die gesamte Zellteilung, d. h. von Prophase bis zum Abschluss der Telophase, braucht.
Um die für die Zellablösung notwendige Strömung im komprimierbaren Köφer 22 zu erreichen, kann seine innere Struktur beispielsweise als Kapillarfilter mit der Vorzugsrichtung in Richtung der Strömung ausgebildet sein. Weiter kann die Effizienz des Kolbens 30 beispielsweise durch darin angeordnete Ventilmechanismen unterstützt werden, welche bei schneller Strömung (Stoss für die Zellablösung) abschlie- ssen, bei langsamer Strömung (Austausch des Kulturmediums) dagegen offen bleiben.
Die in der Figur 4 dargestellte erfindungsgemässe Vorrichtung kann beispielsweise auch wie folgt ausgeführt werden. Im zylinderförmigen Kulturraum 2 ist ein nicht- komprimierbarer, offenporiger Köφer 22 angeordnet, der zwischen zwei für das Kulturmedium permeablen Trägeφlatten 23 und 24 angeordnet ist. Die Scherkraft, mit welcher die Zellen in Teilung abgelöst werden, wird beispielsweise über die gross-lumigen Zu- und Ableitung 3 mittels der Pumpe 16 erzeugt oder mittels des Kolbens 30. Figur 5 zeigt eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. Die Kulturfläche 1 wird hier gebildet durch eine Mehrzahl von Kondukten 40, die den Kulturraum 2 auf verschiedenen Niveaus durchziehen und deren Wandungen für wässerige Enzymlösung durchlässig sind. Die Kondukte 40 sind ein- zeln von einer Eingangsseite 41 zu einer Ausgangsseite 42 durchströmbar, wahlweise mit Medien mit oder ohne Enzyme, um die Zellen der Zellkultur auf den Kondukten 40 mit einer Enzymlösung von der Kulturfläche abzulösen, indem durch die Wände der Kondukte 40 Enzym die basale Seite der Zellen und auch Zell-Zell- Verbindungen erreichen kann, während gleichzeitig der Kontakt der Zellen mit der Enzymlösung auf der Seite des Raumes 2 minimal ist, weil diese Seite nicht direkt mit der Wand der Kondukte 40 in Kontakt ist, und weil ferner dem Medium im Raum 2 Enzymhemmer beigefügt werden können, beispielsweise spezifische Enzym-Inhibitoren für die eingesetzten Enzyme und/oder Serum. Nach dem Ablösen der Zellen 4 von den Kondukten 40 befinden sich die Zellen im wesentlichen in en- zymfreiem Medium, in dem sie durch Verstärkung der Strömung suspendiert und auf mehr Kondukte 40 verteil wieder ausgesät werden können. Dann wird die Bewegung des Kulturmediums gestoppt, bis die Zellen sich auf der Kulturfläche 1 abgesetzt und angeheftet haben.
Zu Beginn der Kultur werden auf den Kondukten 40 des untersten Niveaus Zellen ausgesät und wird nur dieses Kondukteniveau mit Kulturmedium überflutet. Wenn die Zellen auf diesen Kondukten eine gewünschte Zelldichte erreicht haben, werden die bewachsenen Kondukte vorübergehend mit der Enzymlösung durchströmt, die durch die Wandungen tritt und auf die Zellen trifft, die durch die Enzymwirkung mindestens teilweise ablöst werden. Unmittelbar nach der Zellablösung wird der Fluss der Enzymlösung gestoppt, beispielsweise indem an Stelle der Enzymlösung wieder Kulturmedium durch die Kondukte geleitet wird. Das Kulturmedium im Raum 2 wird zur Suspendierung der abgelösten Zellen und zur Inaktivie- rung/Neutralisation und Entfernung von gegebenenfalls in das Kulturmedium gelangten Enzymen schneller umgewälzt und mit grösserer Strömung bewegt. Dadurch dass das Niveau des Kulturmediums im Raum 2 erhöht wird, so dass ein zweites oder weitere Kondukteniveaus (zusätzliche Kulturflächenbereiche 1 ") überflutet werden, und wird die Kulturfläche (1 und 1 ") für die abgelösten Zellen vergrösserte. Dann wird die Bewegung des Kulturmediums gestoppt, bis sich alle Zellen wieder auf den überfluteten Kondukten 40 abgesetzt und angeheftet haben.
In der Vorrichtung gemäss Figur 5 wird zwar für die Ablösung der Zellen eine Enzymlösung (z. B. eine Trypsin-Lösung) verwendet. Da diese aber im wesentlichen nur die basale, an der Kulturoberfläche haftende Seite der Zellen trifft, während die anderen Zellseiten weiterhin im Kulturmedium positioniert sind, ist die Belastung der Zellen wesentlich geringer als beim manuellen Passagieren.
Figur 6 zeigt eine weitere, beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung. Diese weist Mittel zur mechanischen Ablösung der Zellen von der Kulturfläche und Mittel zur Vergrösserung der Kulturfläche auf.
Die Kulturfläche 1 ist hohlzylinderförmig und die Zellen werden mit einer entspre- chend geformten Klinge 50, die an der Stirnseite eines axial im Hohlzylinder verschiebbaren Kolbens 51 befestigt ist, abgelöst. Anstelle einer Klinge 50 kann auch eine Bürste oder ein Gummischaber (rubber policeman) für die Zellablösung vorgesehen werden.
Für die Zellablösung wird der Kolben 51 in den Kulturraum 2 bewegt. Für eine Ver- grösserung der Kulturfläche 1 auf weitere Kulturflächenbereiche 1 ' ' wird er daraus zurückgezogen (Positionen 50' und 51'). Die Erfindung wird im folgenden anhand des Beispiels der Vermehrung von Chon- drozyten beschrieben, ist aber nicht auf diesen Zelltyp beschränkt.
Beispiel 1
Beispiel 1 bezieht sich auf eine Zellkultur in einer Vorrichtung, wie sie in der Figur 1 dargestellt ist.
Es wurde eine expandierbare Membran aus dem Dentalbereich verwendet (Hygie- nic® NON-LATEX DENTAL DAM, Coltene/Whaledant Inc., USA). Die übrigen Elemente waren Standardmaterialien aus dem Zellkulturlabor. Die verwendete Einrichtung wurde aus einer Einwegspritze angefertigt. Die Membran wurde 3mal wäh- rend 10 min. mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, anschliessend 3x 10 min. mit 70 % Äthanol gelegt und dann in der sterilen Werkbank getrocknet. Die Einrichtung wurde mit sterilen Handschuhen in der sterilen Werkbank zusammengebaut. Die Membran wurde mit einem Stück Silikonschlauch auf dem abgeschnittenen Zylinder einer Plastikspritze befestigt.
Die zusammengebaute Einrichtung wurde 2mal während 15 min. mit 70% Äthanol, dann 2mal 10 min. mit phosphatgepufferter Salzlösung und vor der Aussaat der Zellen 2mal 10 min. mit Kulturmedium behandelt. Vor der Aussaat der Zellen wurde der Raum zwischen Spritzenkolben und expandierbarer Membran mittels einer Spritze über eine Injektionsnadel mit Kulturmedium gefüllt, so dass er gasfrei war und die Membran eine eben Fläche bildete. Als Kulturmedium wurde D-MEM/F12 = 1 : 1 (Life Technologies, Basel, Schweiz) mit L-Glutamat und 10 % fötalem Kälberserum (HyClone, Utah, USA) verwendet, bei dem die Pufferkonzentration von HEPES (Life Technologies, Basel, Schweiz) auf 35 mM erhöht wurde, um die Zellkultur ohne CO2-Begasung durchführen zu können. Die Zellen wurden mit Trypsin (Life Technologies, Basel, Schweiz) von der Kulturfläche abgelöst.
Als Testzellen wurden Chondrozyten aus Kniegelenken von 6 Monate alten Kälbern verwendet. Die Chondrocyten wurden mit Pronase (2,5 mg/ml; Röche, Schweiz) und anschliessend mit Kollagenase (2,5 mg/ml; Röche, Schweiz) aus dem Gelenkknoφel isoliert und unter 5 % CO2-Begasung in Kulturmedium D MEM / F12 mit 15 mM HEPES und 10 % fötalem Kälberserum in Plastikkulturflaschen vermehrt. Die Zellen wurden jeweils bei Erreichen der Konfluenz mit Trypsin von der Kulturfläche abgelöst, gewaschen und wieder in neue Kulturflaschen ausgesät. Auf diese Art wurden die Zellen dreimal passagiert, bevor sie im Versuch verwendet wurden.
Auf 1,8 cm2 der ungedehnten Kulturfläche wurden die Chondrocyten in einer Dichte von lO'OOO Zellen / cm2 ausgesät. Als Kulturmedium diente D MEM/F12 mit 35 mM HEPES und 10 % fötalem Kälberserum. Die Apparatur wurde mit einem kleinen Petrischalendeckel vor Infektionen geschützt. Um eine nicht gewollte Verschiebung des Kolbens zu verhindern, wurde die Kolbenstange mit einer Arterienklemme gesi- chert. Die Apparatur wurde zur Kultur in einen Wärmeschrank mit 37° C gestellt.
Bei dieser Ausführung der Erfindung für den Gebrauch im Labor wurden die Zellen manuell ausgesät und das Kulturmedium manuell gewechselt. Bei den Versuchskulturen wurde der Kolben der 10 ml-Spritze jeden Tag um 0,5 ml nach unten gezogen, wodurch die Membranfläche schrittweise zunehmend vergrössert wurde. Gleichzei- tig wurde jeweils 0,5 ml Kulturmedium in den Kulturraum zur Ergänzung des Volu- mens dazu gegeben. Bei den Kontrollen wurde ebenfalls täglich 0,5 ml Kulturmedium dazugegeben, der Kolben wurde aber immer in derselben Position belassen, d. h. die Membran wurde nicht gedehnt.
Nach 10 Tagen wurden die Kulturen mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Anschliessend wurden die Zellen mit Trypsin geemtet. Von den geernteten Zellen wurde ein Teil unter den gleichen Bedingungen wie vor dem Versuch weiterkultiviert und im Umkehrmikroskop während der nächsten vier Tagen qualitativ morphologisch evaluiert. Ein anderer Teil der geernteten Zellen wurde mit Trypanblau gefärbt und die Anzahl der vitalen und toten Zellen in einem Hämocytometer ausge- zählt. Weitere Kulturen wurden nach dem Waschen in situ mit 4 % Formaldehydlö- sung fixiert und mit Mayer's Hämalaun gefärbt. Dann wurde die expandierte Membran sorgfältig aus der Apparatur entnommen, wobei sie sich aber nur teilweise wieder auf die ursprüngliche Grosse verkleinerte und darum nicht mehr eben war, so dass sie teilweise aufgeschnitten werden musste, um sie auf einem Objektträger zu befestigen und mit einem Deckglas zu bedecken, um die Zellen auf der Membran im Auflichtmikroskop zu untersuchen und zu photographieren.
Qualitative Vergleiche der Zellmoφhologie in den Kulturen vor und nach dem Versuch, sowie nach Abschluss der Kontroll-Kultur (auf ungedehnter Membran; Fig. 7) und der Versuchs-Kultur (gedehnte Membranen; Fig. 8), ergaben keine auffälligen Unterschiede bezüglich der Moφhorgie der Zellen. Bei der Bestimmung der Zellzahl wurden keine toten Zellen beobachtet. Die Gesamtzahl der lebenden Zellen nach 10 Tagen wird in Tab. 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Resultate zeigen, dass sich die Zellen auf der expandierbaren Membran vermehren konnten. Die Moφhologie der Zellen auf der expandierten Membran (Versuch) war vergleichbar mit der Moφhologie der Zellen auf der ungedehnten Membran (Kontrolle). Die Anzahl der Zellen, die von der gedehnten Membran geerntet werden konnten, war etwa fünfmal grösser als jene der Zellen von der ungedehnten Membran. Wurden die Zellen aus Kontrolle und Versuch in Petrischalen für Zellkulturen weiter kultiviert, konnten die beiden Zellpopulationen nicht unterschieden werden bezüglich Zellmoφhologie und Zelldichte. Diese Resultate zeigten, dass sich Chon- drozyten in der gleichen Zeit deutlich stärker vermehren, wenn die Kulturfläche während der Kultur vergrössert wurde, als auf einer gleichen, aber nicht vergrösserten Kulturfläche.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur in vitro Vermehrung von Zellen (4), wobei die Zellen (4) auf einer Kulturfläche (1) ausgesät und an der Kulturfläche anhaftend in einem Kulturmedium kultiviert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Kulturfläche (1) während der Zellvermehrung kontinuierlich oder schrittweise vergrössert wird, wobei die Zellen (4) vor und während der Kulturflächenver- grösserung im Kulturmedium verbleiben und wobei die Kulturflächenvergrö- sserung im Sinne des Passagierens an die durch die Zellvermehrung wachsende Zahl der Zellen angepasst ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (4) für die Vergrösserung der Kulturfläche auf dieser belassen werden, und dass die Kulturfläche (1) durch Expansion vergrössert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (4) für die Vergrösserung der Kulturfläche auf dieser belassen werden, und dass die Kulturfläche durch Einschieben von weiteren Kulturflächenbereichen zwischen
Bereichen der Kulturfläche (1), an denen die Zellen anhaften, vergrössert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturfläche (1) aus einer Vielzahl von Partikeln besteht, an denen die Zellen anhaften, und dass sie durch Einschieben weiterer Partikel zwischen die Partikel, an denen die Zellen anhaften, vergrössert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturfläche (1) die innere Oberfläche eines komprimierten, offenporigen Köφers (22) ist, und dass die Kulturfläche vergrössert wird, indem die Kompression des Körpers (22) reduziert wird, so dass weitere Poren geöffnet und neue Flächenanteile freigegeben werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder während der Vergrösserung der Kulturfläche (1) mindestens ein Teil der Zellen (4) von der Kulturfläche losgelöst und in Suspension gebracht wird und dass die Kulturfläche durch Zufügen mindestens eines weiteren Kulturflächenbereichs (1 ' ') vergrössert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (4) durch Scherkräfte abgelöst werden, wobei die Scherkräfte derart dimensioniert sind, dass nur Zellen in einer Teilungsphase abgelöst werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Scherkräfte durch Strömungen im Kulturmedium erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen (4) mechanisch von der Kulturfläche (1, 1 ") abgelöst werden.
10. Vorrichtung zur in vitro Vermehrung von an einer Kulturfläche anhaftenden Zellen (4) in einem Kulturmedium, welche Vorrichtung eine von einem Kul- turmedium über- oder umflutete Kulturoberfläche (1) und Mittel zur Erneuerung des die Kulturfläche über- oder umflutenden Kulturmediums aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ferner Mittel zur kontinuierli- chen oder schrittweisen Vergrösserung der vom Kulturmedium über- oder umfluteten Kulturfläche (1) aufweist, welche Mittel für eine im Sinne des Passagierens an die bei der Zellvermehrung wachsende Zahl der Zellen angepasste Kulturflächenvergrösserung steuerbar sind.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturfläche (1) die eine Seite einer expandierbaren Membran (6) ist, und dass die Vorrichtung Mittel zur Expansion der Membran (6) aufweist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur
Expansion der Membran (6) einen auf der der Kulturfläche (1) gegenüberlie- genden Seite der Membran (6) angeordneten Raum (5) aufweisen, der mit einer
Flüssigkeit oder einem Gas gefüllt ist und in dem Mittel (7) zur Veräderung des Druckes vorgesehen sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kulturfläche (1) durch eine Vielzahl von Partikeln gebildet wird, und dass die Vorrich- tung femer Mittel zum Einschieben von weiteren Partikeln zwischen die Partikel der Kulturfläche (1) aufweist.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Einschieben aus einem Behälter (12) mit einem sich gegen oben vergrössern- den Querschnitt und aus einem Mittel (15) zum Aufwärtsschieben von Parti- kein in diesem Behälter (12) besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung Kulturflächenbereiche (1") aufweist, die vom Kulturmedium wahlweise überflutet sind, wobei zur Vergrösserung der Kulturfläche zusätzliche Kulturflächenbereiche (1") überflutbar sind und dass die Vorrichtung ferner Mittel zum mindestens teilweisen Ablösen von Zellen von der Kulturfläche (1, 1 ") und zum Suspendieren der abgelösten Zellen im Kulturmedium aufweist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Ablösen Mittel zur Erzeugung von Scherkräften sind.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Ablösen Kondukte (40) sind, deren Aussenseiten als Kulturflächen (1, 1") ausgerüstet sind, die mit einer Enzymlösung durchfliessbar sind und die in ih- ren Wandungen Öffnungen aufweisen, durch die die Enzymlösung mit anhaftenden Zellen in Berührung kommt.
18. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Ablösen Klingen (50) Bürsten oder Schaber sind, die entlang der Kulturfläche (1, 1") bewegbar sind.
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