DE3737652C2 - - Google Patents
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Prüfung auf
hautreizende Eigenschaften von Substanzen oder Substanzge
mischen in einem in-vitro-Zellkultursystem, wobei die zu
testende Substanz bzw. das Substanzgemisch in Lösung mit der
Zellkultur in Berührung gebracht und die Auswirkung der zu
testenden Substanz oder des Substanzgemisches auf die Zell
kultur bestimmt wird.
Es ist bereits allgemein bekannt, die lokale Verträglichkeit,
d.h. die Haut-und die Schleimhautverträglichkeit im Rahmen der
toxiologischen Charakterisierung und Bewertung festzustellen.
Insbesondere bei Artikeln des täglichen Bedarfs, wie Haus
halts- und Reinigungsmitteln oder Körperpflegeprodukten, ist
es unverzichtbar, das Risiko von Haut- oder Schleimhautschädi
gung beim Umgang mit diesen Erzeugnissen auszuschließen.
Untersuchungen zur lokalen Verträglichkeit sind daher unver
zichtbarer Bestandteil verschiedener Prüfungsprogramme, wie
sie z. B. das deutsche Chemikaliengesetz vorschreibt.
Die Prüfung der haut- und augenreizenden Eigenschaften von
Chemikalien erfolgt in bekannter Weise an Versuchstieren mit
Hilfe des Draize-Test (Draize, J. H., Woodward G.,
Calvery, H.O., 1944, Methods for the study of irritation and
toxicity of substances applied to the skin and mucous
membranes, J. Pharmacol. Exp. Therap. 82, 377-390). Da diese
Prüfung mit zum Teil erheblichen Belastungen für die Tiere
verbunden ist, wurde frühzeitig versucht, Ersatzmethoden, die
ohne bzw. mit geringen Tierzahlen oder Belastungen auskommen,
zu etablieren. Diese Versuche sind zum Teil recht erfolgreich
bearbeitet worden, teilweise befinden sie sich in der Phase
der Validierung.
Eine Alternative zum Draize-Test stellt der Test an der
Chorionallantoismembran (CAM) von befruchteten und bebrüte
ten Hühnereiern dar. (Leighton, J., Nassauer, J., Tchao, R.,
1985, The chick embryo in toxicology: An alternative to the
rabbit eye, Fd. Chem. Toxic. 23, 293-298; Lüpke, N. P., Kem
per, F.H., 1986, The HET CAM test: An alternative to the Draize
eye test, Fd. Chem. Toxic. 24, 495-496). Dieses Testverfahren
ist sehr zeitaufwendig und schwer zu standardisieren.
Weiter ist es bekannt, isolierte Organkulturen, wie Haut
präparate von Nacktmäusen oder Augenexplantate aus Schlacht
hofmaterial für toxiologische Untersuchungen zu
verwenden. (Price, J. B., Andrews, I.J., 1985, The in vitro
assessment of eye irritancy using isolated eyes, Fd. Chem.
Toxic. 23, 313-315). Die Aussagekraft dieser Testergebnisse
ist ebenfalls schwer zu standardisieren.
Eine weitere alternative Methode zum Draize-Test stellt eine
andere toxiologische Untersuchung mit Zell- und Gewebekulturen
mit verschiedenen permanenten Zellinien und primären Zellen
dar. Die Auswertung kann mit dem Neutralrottest erfolgen. Bei
diesem Test wird nur die Einwirkung der zu testenden Substanz
auf Einzelzellen (zweidimensional) ermittelt, was die Über
tragung der Ergebnisse auf in-vivo-Verhältnisse erschwert.
Diese Ersatzmethoden für den Draize-Test entsprechen weit
gehend, aber nicht völlig, den Forderungen an eine ideale
Alternativmethode, wie: Völliger Ersatz von Tierversuchen,
die richtige Target-Zelle (humane Keratinozyten), dreidimen
sionaler Zellverband, praktische Durchführbarkeit, geringe
Kosten, Übertragbarkeit der Resultate auf in-vivo-Versuche.
Gerade die Forderung des dreidimensionalen Zellverbandes bei
toxiologischen Zellkulturtests ist für die Übertragbarkeit von
in-vitro- auf in-vivo-Versuche sehr wichtig, was auch von der
Arbeitsgruppe von Prof. Hülser bei der Erforschung von Multi-
Zell-Sphäroiden gezeigt wurde (Hülser, D.F., Bräuner, T.,
Brümmer, F., 1986, Interzelluläre Kommunikation in dreidimen
sional wachsenden Multizell-Sphäroiden, BMFT, Biotechnologie,
103-124), da bei dreidimensional wachsenden Zellaggregaten
im Gegensatz zu zweidimensional wachsenden Zellkulturen
Regulationsleistungen und Organisationsmerkmale nachzuweisen
sind, wie man sie von intakten Organismen her kennt.
Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, im
Gegensatz zu zweidimensional wachsenden Zellkulturen eine
Zellkulturhaut zur Verfügung zu stellen, bei der alle Regu
lationsleistungen und Organisationsmerkmale nachzuweisen sind,
wie man sie von intakten Organismen her kennt.
Diese Aufgabe ist durch die im kennzeichnenden Teil des
Anspruches 1 aufgeführten Merkmale gelöst. Durch die Zurver
fügungstellung eines gezüchteten dreidimensionalen Zellver
bandes, der einer menschlichen Haut sehr nahe kommt,
ist es erstmals möglich, ein Verfahren zur Messung von haut
reizenden oder hautätzenden Eigenschaften von Substanzen und
Substanzgemischen zur Verfügung zu stellen, bei dem die
Wirkung einer Substanz auf humane Zellkulturhaut gemessen
wird. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein in-vitro-
Testsystem. Die aus menschlicher Haut gewonnenen Keratinozyten
werden nach einem speziellen Kultivierungsverfahren, wie es
in der deutschen Anmeldung P 37 16 907 beschrieben ist,
kultiviert. Danach erfolgt die Ablösung der Zellkulturhaut
mittels eines Enzyms (Dispase) aus einer Kulturflasche. In
vorteilhafter Weise läßt sich die Zellkulturhaut nach den
Merkmalen des Anspruches 2 portioniert (ca. 2 cm2) nach her
kömmlichen Zellkulturmethoden kryokonservieren und lagern, so
daß sie auch nach mehreren Wochen oder Monaten für in-vitro-
Testverfahren zur Erfassung hautreizender Eigenschaften zur
Verfügung gestellt werden kann. Durch die Tiefkühlung der
Zellkulturhaut läßt sich diese auch ohne weiteres versenden
und verschiedenen Testlabors zur Verfügung stellen.
Nach Auftauen und Waschen wird dieses humane Zellkulturhaut
stückchen in Kontakt mit einer Lösung der Substanz gebracht
und nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C die
Wirkung der Testsubstanz auf die Zellkulturhaut untersucht.
Zum Wachstum der Zellkulturhaut gemäß Anspruch 3 und 4 kann
diese mit einem das Wachstum beschleunigenden Mittel in Be
rührung gebracht werden, wobei dieses Mittel in vorteilhafter
Weise aus Forskolin besteht. Forskolin bindet direkt das Enzym
Adenylat-Zyklase, das für die Synthese von Zyklo-AMP verant
wortlich ist, und stimuliert dieses permanent. Durch die
Verwendung einer humanen Zellkulturhaut wurde erstmals eine
Methode entwickelt, die zur Abschätzung der Reizwirkung von
Chemikalien dient und die als eine Art zweite Generation von
Ersatzmethoden zum Draize-Test angesehen werden kann. Zweck
gemäß kann auch erstmalig auf die Prüfung der haut- oder
augenreizenden Eigenschaften an Tieren verzichtet werden.
Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Testverfahren auch
gegenüber dem Testverfahren an der Chorionallantoismembran
von befruchteten und bebrüteten Hühnereiern wesentlich aus
sagekräftiger, da die gezüchtete Zellkulturhaut der mensch
lichen Haut bzw. der tierischen Haut weitgehend entspricht.
Das in-vitro-Testverfahren zur Erfassung hautreizender Eigen
schaften von Substanzen und Substanzgemischen ist nachfolgend
näher erläutert.
Die Kultivierung der Epithelial-Zellen kann beispielsweise
nach dem Verfahren, wie es im US-Patent 44 56 687 (Green)
beschrieben worden ist, durchgeführt werden. Es ist jedoch
auch möglich, die Epithelial-Zellen mit Forskolin in Berührung
zu bringen, um dadurch die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen
zu erhöhen. Bei der Substanz Forskolin handelt es sich um ein
Diterpen, das aus der Pflanze Coleus forskohlii isoliert wird.
Forskolin bindet direkt an das Enzym Andenylatzyklase, das
für die Synthese von Zyklo-AMP verantwortlich ist, und stimu
liert dieses permanent. In diesem Punkt unterscheidet sich
Forskolin sehr stark von Substanzen, wie Cholera-Toxin oder
Isoproterenol, die nicht direkt mit der Adenylatzyklase rea
gieren, sondern indirekt, indem sogenannte G-Proteine akti
viert werden, die wiederum die Adenylatzyklase aktivieren. Bei
einer Konzentration von 10-5M bzw. 5 × 10-6M Forskolin, ist
das beste Wachstum zu beobachten. Die aus menschlicher Haut
gewonnenen Hautzellen (Keratinozyten) werden nach dem be
schriebenen Kultivierungsverfahren mit Forskolin vermehrt und
nach Erreichen der Konfluenz noch zwei Tage kultiviert. Danach
erfolgt die Ablösung der Zellkulturhaut mittels eines Enzyms
(Dispase). Die Zellkulturhaut kann anschließend in einer Größe
von ca. 2 cm2 portioniert und bei -70°C tiefgefroren wer
den. Nach Auftauen und Waschen werden diese humanen Zell
kulturhautstückchen in Kontakt mit einer Lösung der Testsub
stanz gebracht und nach einer Inkubationszeit von ca. 24 h bei
37°C die Wirkung der Testsubstanz auf die Zellkulturhaut
untersucht. Dieses kann durch verschiedene Methoden erfolgen.
- a) Morphologische Beurteilung
Durch mikroskopische Beurteilung der einzelnen Zellen bzw. des Zellverbandes kann die schädigende Wirkung festgestellt werden. - b) Enzymaustritt aus den Zellen
Durch Schädigung der Zellen kommt es zur Lyse der Zellen. Dadurch treten Enzyme aus dem Cytoplasma der Zelle aus und können im Überstand der Zellen nachgewiesen werden. Je höher die Enzymkonzentration im Überstand ist, desto stärker ist auch die Schädigung der Zellen. - c) Farbstoffaufnahme
Bestimmte Farbstoffe (z. B. Neutralrot) werden von lebenden Zellen durch aktiven Transport aufgenommen. Tote Zellen bzw. geschädigte Zellen nehmen keinen Farbstoff auf. Durch an schließende Extraktion des von den noch lebenden Zellen auf genommenen Farbstoffes kann die Lösung photometrisch unter sucht werden. Je weniger Farbstoff extrahiert wird, desto stärker ist die Schädigung der Zellen.
Die Anwendung kann durch folgende Beispiele näher erläutert
werden:
Vergleich der Neutralrot-Aufnahme bei eingefrorenen und nicht
eingefrorenen Hautstückchen.
Es wurden je 10 Zellkulturhautstückchen mittels Einfriermedium
I (90% fötales Kälberserum 10% DMSO), und Einfriermedium II
(10% fötales Kälberserum 80% RPMI-Medium, 10% DMSO)
kryokonserviert bei -70°C sowie 10 Zellkulturhautstückchen
ohne vorherige Einfrierung sofort im Test eingesetzt. Die
eingefrorenen Proben wurden nach 24 h aufgetaut und ebenfalls
im Test eingesetzt.
Der Test wurde folgendermaßen durchgeführt: Die Hautstückchen
wurden 24 h im Kulturmedium mit der zu testenden Substanz
bzw. einer Verdünnung der Substanz bei 37°C in 24-well-Platten
inkubiert, und anschließend im Kulturmedium mit 0,4% Neutral
rot inkubiert. Nach 3 h wurde das Zellkulturhautstück
chen entnommen, in phosphatgepufferter Saline gewaschen und
mit 0,2 ml essigsaurem Alkohol das von den lebenden Zellen
aufgenommene Neutralrot extrahiert (20 min) und photometrisch
bei 540 nm die Extinktion bestimmt.
Dabei zeigte sich, daß die Farbstoffaufnahme der eingefrorenen
Zellstückchen im Vergleich zu den nicht eingefrorenen fast
gleich war. Auch bei den beiden Einfriermedien waren keine
Unterschiede festzustellen.
Die Versuche zeigten, daß die abgelösten Zellkulturhautsheets
ohne Probleme durch Einfrieren bei -70°C kryokonserviert und
je nach Bedarf aufgetaut und für Tests benutzt werden können.
Diese Tatsache ist für einen breiten Einsatz der gezüchteten
Haut für toxiologische bzw. pharmakologische Fragestellungen
von entscheidender Bedeutung.
In diesem Versuch wurde die hautschädigende Wirkung des
Tensides Natriumdodecylsulfat untersucht.
Eingefrorenen Zellkulturhautstückchen wurden nach Auftauen mit
einer Natriumdodecylsulfatlösung bzw. Verdünnungen dieser
Lösung in Kulturmedium 24 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden
die Hautstückchen im Medium mit 0,4% Neutralrot für 3 h
inkubiert und die aufgenommene Farbe nach Extraktion photome
trisch bestimmt (siehe Abb. 1).
Als Modellsubstanz diente dabei das Anionentensid Natriumdode
cylsulfat, das in verschiedenen Konzentrationen (20 µg/ml -
360 µg/ml) mit den Hautstückchen inkubiert wurde. Neben dem NR-
90-Wert (Reduktion der Vitalität der Zellen um 10% auf 90%),
der 31 µg/ml betrug, wurde auch der NR-50-Wert ermittelt,
nämlich 56 µg/ml. Der gleiche Versuch wurde auch statt mit
abgelösten Zellkulturhautstückchen mit einem konfluenten
Zellrasen aus humanen Keratinozyten in 24-Well-Platten durch
geführt. Der Vergleich der beiden Versuche, der in der Ab
bildung dargestellt ist, zeigt, daß die beiden Systeme
ähnlich reagieren, wobei die Zellkulturhaut empfindlich rea
giert. Der NR-90 Wert betrug 50 µg/ml und der NR-50-Wert 89 µg/ml.
Bestimmung des NR-90-Wertes bzw. NR-50-Wertes für Natrium
dodecylsulfat mittels Zellkulturhautstückchen bzw. konfluenten
Keratinozytenkulturen. (⚫) mittels Zellkulturhaut, (×) konfluente
Keratinozytenkultur.
Claims (4)
1. Verfahren zur Prüfung auf hautreizende Eigenschaften von
Substanzen oder Substanzgemischen in einem in-vitro-Zellkultursystem,
wobei die zu testende Substanz in Lösung mit
der Zellkultur in Berührung gebracht und die Auswirkung der
zu testenden Substanz oder des Substanzgemisches auf eine
Zellkultur bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zellkultur aus humaner oder tierischer Zellkulturhaut besteht, die
gezüchtet wird und einen dreidimensionalen Zellverband ergibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
humane Zellkulturhaut nach ihrer Produktion eingefroren
und für einen Test aufgetaut und sofort eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zellkulturhaut aus menschlichen oder tierischen Epithelial-
Zellen besteht, die mit einem zu deren Produktion
wachstumsbeschleunigenden Mittel in Berührung gebracht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Epithelial-Zellen mit Forskolin in Berührung gebracht
werden.
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DE19873737652 DE3737652A1 (de) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | Verfahren zur pruefung auf hautreizende eigenschaften |
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Publications (2)
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DE19873737652 Granted DE3737652A1 (de) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | Verfahren zur pruefung auf hautreizende eigenschaften |
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