DE3737652C2

DE3737652C2 -

Info

Publication number: DE3737652C2
Application number: DE19873737652
Authority: DE
Inventors: Ralf-Michael Dr. 6500 Mainz De Dreher
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1987-11-06
Filing date: 1987-11-06
Publication date: 1990-10-04
Also published as: DE3737652A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Prüfung auf hautreizende Eigenschaften von Substanzen oder Substanzge mischen in einem in-vitro-Zellkultursystem, wobei die zu testende Substanz bzw. das Substanzgemisch in Lösung mit der Zellkultur in Berührung gebracht und die Auswirkung der zu testenden Substanz oder des Substanzgemisches auf die Zell kultur bestimmt wird.

Es ist bereits allgemein bekannt, die lokale Verträglichkeit, d.h. die Haut-und die Schleimhautverträglichkeit im Rahmen der toxiologischen Charakterisierung und Bewertung festzustellen. Insbesondere bei Artikeln des täglichen Bedarfs, wie Haus halts- und Reinigungsmitteln oder Körperpflegeprodukten, ist es unverzichtbar, das Risiko von Haut- oder Schleimhautschädi gung beim Umgang mit diesen Erzeugnissen auszuschließen.

Untersuchungen zur lokalen Verträglichkeit sind daher unver zichtbarer Bestandteil verschiedener Prüfungsprogramme, wie sie z. B. das deutsche Chemikaliengesetz vorschreibt.

Die Prüfung der haut- und augenreizenden Eigenschaften von Chemikalien erfolgt in bekannter Weise an Versuchstieren mit Hilfe des Draize-Test (Draize, J. H., Woodward G., Calvery, H.O., 1944, Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied to the skin and mucous membranes, J. Pharmacol. Exp. Therap. 82, 377-390). Da diese Prüfung mit zum Teil erheblichen Belastungen für die Tiere verbunden ist, wurde frühzeitig versucht, Ersatzmethoden, die ohne bzw. mit geringen Tierzahlen oder Belastungen auskommen, zu etablieren. Diese Versuche sind zum Teil recht erfolgreich bearbeitet worden, teilweise befinden sie sich in der Phase der Validierung.

Eine Alternative zum Draize-Test stellt der Test an der Chorionallantoismembran (CAM) von befruchteten und bebrüte ten Hühnereiern dar. (Leighton, J., Nassauer, J., Tchao, R., 1985, The chick embryo in toxicology: An alternative to the rabbit eye, Fd. Chem. Toxic. 23, 293-298; Lüpke, N. P., Kem per, F.H., 1986, The HET CAM test: An alternative to the Draize eye test, Fd. Chem. Toxic. 24, 495-496). Dieses Testverfahren ist sehr zeitaufwendig und schwer zu standardisieren.

Weiter ist es bekannt, isolierte Organkulturen, wie Haut präparate von Nacktmäusen oder Augenexplantate aus Schlacht hofmaterial für toxiologische Untersuchungen zu verwenden. (Price, J. B., Andrews, I.J., 1985, The in vitro assessment of eye irritancy using isolated eyes, Fd. Chem. Toxic. 23, 313-315). Die Aussagekraft dieser Testergebnisse ist ebenfalls schwer zu standardisieren.

Eine weitere alternative Methode zum Draize-Test stellt eine andere toxiologische Untersuchung mit Zell- und Gewebekulturen mit verschiedenen permanenten Zellinien und primären Zellen dar. Die Auswertung kann mit dem Neutralrottest erfolgen. Bei diesem Test wird nur die Einwirkung der zu testenden Substanz auf Einzelzellen (zweidimensional) ermittelt, was die Über tragung der Ergebnisse auf in-vivo-Verhältnisse erschwert.

Diese Ersatzmethoden für den Draize-Test entsprechen weit gehend, aber nicht völlig, den Forderungen an eine ideale Alternativmethode, wie: Völliger Ersatz von Tierversuchen, die richtige Target-Zelle (humane Keratinozyten), dreidimen sionaler Zellverband, praktische Durchführbarkeit, geringe Kosten, Übertragbarkeit der Resultate auf in-vivo-Versuche.

Gerade die Forderung des dreidimensionalen Zellverbandes bei toxiologischen Zellkulturtests ist für die Übertragbarkeit von in-vitro- auf in-vivo-Versuche sehr wichtig, was auch von der Arbeitsgruppe von Prof. Hülser bei der Erforschung von Multi- Zell-Sphäroiden gezeigt wurde (Hülser, D.F., Bräuner, T., Brümmer, F., 1986, Interzelluläre Kommunikation in dreidimen sional wachsenden Multizell-Sphäroiden, BMFT, Biotechnologie, 103-124), da bei dreidimensional wachsenden Zellaggregaten im Gegensatz zu zweidimensional wachsenden Zellkulturen Regulationsleistungen und Organisationsmerkmale nachzuweisen sind, wie man sie von intakten Organismen her kennt.

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, im Gegensatz zu zweidimensional wachsenden Zellkulturen eine Zellkulturhaut zur Verfügung zu stellen, bei der alle Regu lationsleistungen und Organisationsmerkmale nachzuweisen sind, wie man sie von intakten Organismen her kennt.

Diese Aufgabe ist durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruches 1 aufgeführten Merkmale gelöst. Durch die Zurver fügungstellung eines gezüchteten dreidimensionalen Zellver bandes, der einer menschlichen Haut sehr nahe kommt, ist es erstmals möglich, ein Verfahren zur Messung von haut reizenden oder hautätzenden Eigenschaften von Substanzen und Substanzgemischen zur Verfügung zu stellen, bei dem die Wirkung einer Substanz auf humane Zellkulturhaut gemessen wird. Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein in-vitro- Testsystem. Die aus menschlicher Haut gewonnenen Keratinozyten werden nach einem speziellen Kultivierungsverfahren, wie es in der deutschen Anmeldung P 37 16 907 beschrieben ist, kultiviert. Danach erfolgt die Ablösung der Zellkulturhaut mittels eines Enzyms (Dispase) aus einer Kulturflasche. In vorteilhafter Weise läßt sich die Zellkulturhaut nach den Merkmalen des Anspruches 2 portioniert (ca. 2 cm²) nach her kömmlichen Zellkulturmethoden kryokonservieren und lagern, so daß sie auch nach mehreren Wochen oder Monaten für in-vitro- Testverfahren zur Erfassung hautreizender Eigenschaften zur Verfügung gestellt werden kann. Durch die Tiefkühlung der Zellkulturhaut läßt sich diese auch ohne weiteres versenden und verschiedenen Testlabors zur Verfügung stellen.

Nach Auftauen und Waschen wird dieses humane Zellkulturhaut stückchen in Kontakt mit einer Lösung der Substanz gebracht und nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C die Wirkung der Testsubstanz auf die Zellkulturhaut untersucht. Zum Wachstum der Zellkulturhaut gemäß Anspruch 3 und 4 kann diese mit einem das Wachstum beschleunigenden Mittel in Be rührung gebracht werden, wobei dieses Mittel in vorteilhafter Weise aus Forskolin besteht. Forskolin bindet direkt das Enzym Adenylat-Zyklase, das für die Synthese von Zyklo-AMP verant wortlich ist, und stimuliert dieses permanent. Durch die Verwendung einer humanen Zellkulturhaut wurde erstmals eine Methode entwickelt, die zur Abschätzung der Reizwirkung von Chemikalien dient und die als eine Art zweite Generation von Ersatzmethoden zum Draize-Test angesehen werden kann. Zweck gemäß kann auch erstmalig auf die Prüfung der haut- oder augenreizenden Eigenschaften an Tieren verzichtet werden. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Testverfahren auch gegenüber dem Testverfahren an der Chorionallantoismembran von befruchteten und bebrüteten Hühnereiern wesentlich aus sagekräftiger, da die gezüchtete Zellkulturhaut der mensch lichen Haut bzw. der tierischen Haut weitgehend entspricht.

Das in-vitro-Testverfahren zur Erfassung hautreizender Eigen schaften von Substanzen und Substanzgemischen ist nachfolgend näher erläutert.

Die Kultivierung der Epithelial-Zellen kann beispielsweise nach dem Verfahren, wie es im US-Patent 44 56 687 (Green) beschrieben worden ist, durchgeführt werden. Es ist jedoch auch möglich, die Epithelial-Zellen mit Forskolin in Berührung zu bringen, um dadurch die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen zu erhöhen. Bei der Substanz Forskolin handelt es sich um ein Diterpen, das aus der Pflanze Coleus forskohlii isoliert wird. Forskolin bindet direkt an das Enzym Andenylatzyklase, das für die Synthese von Zyklo-AMP verantwortlich ist, und stimu liert dieses permanent. In diesem Punkt unterscheidet sich Forskolin sehr stark von Substanzen, wie Cholera-Toxin oder Isoproterenol, die nicht direkt mit der Adenylatzyklase rea gieren, sondern indirekt, indem sogenannte G-Proteine akti viert werden, die wiederum die Adenylatzyklase aktivieren. Bei einer Konzentration von 10^-5M bzw. 5 × 10^-6M Forskolin, ist das beste Wachstum zu beobachten. Die aus menschlicher Haut gewonnenen Hautzellen (Keratinozyten) werden nach dem be schriebenen Kultivierungsverfahren mit Forskolin vermehrt und nach Erreichen der Konfluenz noch zwei Tage kultiviert. Danach erfolgt die Ablösung der Zellkulturhaut mittels eines Enzyms (Dispase). Die Zellkulturhaut kann anschließend in einer Größe von ca. 2 cm² portioniert und bei -70°C tiefgefroren wer den. Nach Auftauen und Waschen werden diese humanen Zell kulturhautstückchen in Kontakt mit einer Lösung der Testsub stanz gebracht und nach einer Inkubationszeit von ca. 24 h bei 37°C die Wirkung der Testsubstanz auf die Zellkulturhaut untersucht. Dieses kann durch verschiedene Methoden erfolgen.

a) Morphologische Beurteilung
Durch mikroskopische Beurteilung der einzelnen Zellen bzw. des Zellverbandes kann die schädigende Wirkung festgestellt werden.
b) Enzymaustritt aus den Zellen
Durch Schädigung der Zellen kommt es zur Lyse der Zellen. Dadurch treten Enzyme aus dem Cytoplasma der Zelle aus und können im Überstand der Zellen nachgewiesen werden. Je höher die Enzymkonzentration im Überstand ist, desto stärker ist auch die Schädigung der Zellen.
c) Farbstoffaufnahme
Bestimmte Farbstoffe (z. B. Neutralrot) werden von lebenden Zellen durch aktiven Transport aufgenommen. Tote Zellen bzw. geschädigte Zellen nehmen keinen Farbstoff auf. Durch an schließende Extraktion des von den noch lebenden Zellen auf genommenen Farbstoffes kann die Lösung photometrisch unter sucht werden. Je weniger Farbstoff extrahiert wird, desto stärker ist die Schädigung der Zellen.

Die Anwendung kann durch folgende Beispiele näher erläutert werden:

Beispiel 1

Vergleich der Neutralrot-Aufnahme bei eingefrorenen und nicht eingefrorenen Hautstückchen.

Es wurden je 10 Zellkulturhautstückchen mittels Einfriermedium I (90% fötales Kälberserum 10% DMSO), und Einfriermedium II (10% fötales Kälberserum 80% RPMI-Medium, 10% DMSO) kryokonserviert bei -70°C sowie 10 Zellkulturhautstückchen ohne vorherige Einfrierung sofort im Test eingesetzt. Die eingefrorenen Proben wurden nach 24 h aufgetaut und ebenfalls im Test eingesetzt.

Der Test wurde folgendermaßen durchgeführt: Die Hautstückchen wurden 24 h im Kulturmedium mit der zu testenden Substanz bzw. einer Verdünnung der Substanz bei 37°C in 24-well-Platten inkubiert, und anschließend im Kulturmedium mit 0,4% Neutral rot inkubiert. Nach 3 h wurde das Zellkulturhautstück chen entnommen, in phosphatgepufferter Saline gewaschen und mit 0,2 ml essigsaurem Alkohol das von den lebenden Zellen aufgenommene Neutralrot extrahiert (20 min) und photometrisch bei 540 nm die Extinktion bestimmt.

Dabei zeigte sich, daß die Farbstoffaufnahme der eingefrorenen Zellstückchen im Vergleich zu den nicht eingefrorenen fast gleich war. Auch bei den beiden Einfriermedien waren keine Unterschiede festzustellen.

Die Versuche zeigten, daß die abgelösten Zellkulturhautsheets ohne Probleme durch Einfrieren bei -70°C kryokonserviert und je nach Bedarf aufgetaut und für Tests benutzt werden können. Diese Tatsache ist für einen breiten Einsatz der gezüchteten Haut für toxiologische bzw. pharmakologische Fragestellungen von entscheidender Bedeutung.

Beispiel 2

In diesem Versuch wurde die hautschädigende Wirkung des Tensides Natriumdodecylsulfat untersucht.

Eingefrorenen Zellkulturhautstückchen wurden nach Auftauen mit einer Natriumdodecylsulfatlösung bzw. Verdünnungen dieser Lösung in Kulturmedium 24 h bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Hautstückchen im Medium mit 0,4% Neutralrot für 3 h inkubiert und die aufgenommene Farbe nach Extraktion photome trisch bestimmt (siehe Abb. 1).

Als Modellsubstanz diente dabei das Anionentensid Natriumdode cylsulfat, das in verschiedenen Konzentrationen (20 µg/ml - 360 µg/ml) mit den Hautstückchen inkubiert wurde. Neben dem NR- 90-Wert (Reduktion der Vitalität der Zellen um 10% auf 90%), der 31 µg/ml betrug, wurde auch der NR-50-Wert ermittelt, nämlich 56 µg/ml. Der gleiche Versuch wurde auch statt mit abgelösten Zellkulturhautstückchen mit einem konfluenten Zellrasen aus humanen Keratinozyten in 24-Well-Platten durch geführt. Der Vergleich der beiden Versuche, der in der Ab bildung dargestellt ist, zeigt, daß die beiden Systeme ähnlich reagieren, wobei die Zellkulturhaut empfindlich rea giert. Der NR-90 Wert betrug 50 µg/ml und der NR-50-Wert 89 µg/ml.

Bestimmung des NR-90-Wertes bzw. NR-50-Wertes für Natrium dodecylsulfat mittels Zellkulturhautstückchen bzw. konfluenten Keratinozytenkulturen. (⚫) mittels Zellkulturhaut, (×) konfluente Keratinozytenkultur.

Claims

1. Verfahren zur Prüfung auf hautreizende Eigenschaften von Substanzen oder Substanzgemischen in einem in-vitro-Zellkultursystem, wobei die zu testende Substanz in Lösung mit der Zellkultur in Berührung gebracht und die Auswirkung der zu testenden Substanz oder des Substanzgemisches auf eine Zellkultur bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultur aus humaner oder tierischer Zellkulturhaut besteht, die gezüchtet wird und einen dreidimensionalen Zellverband ergibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die humane Zellkulturhaut nach ihrer Produktion eingefroren und für einen Test aufgetaut und sofort eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturhaut aus menschlichen oder tierischen Epithelial- Zellen besteht, die mit einem zu deren Produktion wachstumsbeschleunigenden Mittel in Berührung gebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Epithelial-Zellen mit Forskolin in Berührung gebracht werden.